EP1150706A1 - UTILISATION D'UNE PROTEINE OmpA D'ENTEROBACTERIE ASSOCIEE A UN ANTIGENE POUR GENERER UNE REPONSE CYTOTOXIQUE ANTIVIRALE, ANTIPARASITAIRE OU ANTITUMORALE - Google Patents

UTILISATION D'UNE PROTEINE OmpA D'ENTEROBACTERIE ASSOCIEE A UN ANTIGENE POUR GENERER UNE REPONSE CYTOTOXIQUE ANTIVIRALE, ANTIPARASITAIRE OU ANTITUMORALE

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EP1150706A1
EP1150706A1 EP00906411A EP00906411A EP1150706A1 EP 1150706 A1 EP1150706 A1 EP 1150706A1 EP 00906411 A EP00906411 A EP 00906411A EP 00906411 A EP00906411 A EP 00906411A EP 1150706 A1 EP1150706 A1 EP 1150706A1
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EP
European Patent Office
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protein
antigen
fragments
ompa
hapten
Prior art date
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EP00906411A
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German (de)
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Toufic Renno
Jean-Yves Bonnefoy
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Pierre Fabre Medicament SA
Original Assignee
Pierre Fabre Medicament SA
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Publication date
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    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
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    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP

Definitions

  • the invention relates to the use of an enterobacterium OmpA membrane protein, in particular of Klebsiella pneumoniae, associated with an antigen or a hapten for the preparation of a pharmaceutical composition intended for generating or increasing a cytotoxic T response directed against a infectious agent or tumor cell.
  • the invention includes the use of these compounds for the prevention and treatment of infection or cancer, in particular cancers associated with a tumor antigen such as melanomas, as well as pharmaceutical compositions comprising some of these compounds.
  • Vaccination is an effective way to prevent or reduce viral or bacterial infections.
  • the success of vaccination campaigns in these fields has made it possible to extend the concept of vaccine previously used in the field of infectious diseases to the fields of cancer and autoimmune diseases.
  • Vaccine antigens administered alone in the host are often not immunogenic enough to induce an immune response, and must therefore be combined with an adjuvant or coupled to a carrier protein to induce (or increase) their immunogenicity. Under these conditions, only an immune response of the humoral type can be induced.
  • CTL cytotoxic T lymphocytes
  • CTL epitope peptide sequences interacting with class I molecules and presented to CD8 + T lymphocytes
  • the difficulty lies in the generation of CTL in vivo, due to the low immunogenicity of these peptides (Melief, 1992, Adv. Cancer Res., 58, 143-175; Nandaz and Sercaz, 1995, Cell, 82, 13-17).
  • the approaches consisted of loading the dendritic cells ex vivo with the antigen of interest (peptides or cell lysate) and reimplanting these cells in the patient.
  • Other approaches consist in transfecting the dendritic cells ex vivo with the gene coding for the antigen of interest and in reinjecting these transfected cells (Gilboa E. et al., 1998, Cancer Immunol. Immunother., 46, 82-87 ). These approaches have been successfully used in mice and recently in humans (Hsu FJ et al., 1996, Nat. Med., 2, 52-58) but nevertheless remain complex insofar as these cells must be treated ex vivo (transformation of cells or internalization of antigens) and transplanted into the host organism.
  • a compound which, associated with a molecule, in particular an antigen or hapten, is capable of generating CTL directed against said molecule could in particular be used for the preparation of a vaccine composition intended to induce a immune protection of the CTL type, antiviral, antibacterial, antifungal or antiparasitic, or antitumor.
  • a protein of the external membrane of gram-negative bacteria in particular an OmpA protein of enterobacterium such as the protein P40 of Klebsiella pneumoniae (protein described in WO 95/27787 and WO 96 / 14415), has the property of eliciting a CTL response against a molecule which is associated with it covalently or not, preferably without recourse to the addition of another adjuvant.
  • the present invention relates to the use of an enterobacterium OmpA protein, of one of its fragments or of a nucleic sequence coding for said OmpA protein or one of its fragments for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or increase a cytotoxic T response against an infectious agent or a tumor cell, in vitro or in vivo, preferably in vivo, as well as for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or increase said response Cytotoxic T.
  • protein will also be understood to denote the peptides or polypeptides and the term “OmpA” (for “Outer Membrane Protein”), the proteins of the outer membrane of type A.
  • fragment of an OmpA protein is intended to denote in particular any fragment of the amino acid sequence included in the amino acid sequence of the OmpA protein which, when associated with an antigen or hapten specific for an agent infectious or tumor cell, is capable of generating or increasing a cytotoxic T response directed against said infectious agent or said tumor cell, said fragment of the OmpA protein comprising at least 5 amino acids, preferably at least 10 amino acids or more preferably at least 15 amino acids.
  • specific antigen or hapten of an infectious agent or of a tumor cell is intended to denote in particular any compound expressed by an infectious agent, such as a virus, a bacterium, a yeast, a fungus or a parasite, by a tumor cell, or one of their structural analogues, which alone or in combination with an immunity adjuvant is capable of inducing a specific immune response of said infectious agent or of said tumor cell.
  • antigen or hapten analog is intended to denote in particular in the present description a compound having a structural analogy with said antigen or hapten capable of inducing an immunological response directed against said antigen or hapten in an organism previously immunized with said compound. similar.
  • the invention also relates to the use according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition further comprises, associated with said protein OmpA of enterobacterium, an antigen or a hapten specific for said infectious agent or said tumor cell.
  • the invention comprises the use according to the invention, characterized in that said infectious agent is a viral particle, a bacterium, a yeast, a fungus or a parasite.
  • the invention comprises the use of an enterobacterium OmpA protein or of a fragment thereof according to the invention, characterized in that said enterobacterium OmpA protein, or one of its fragments, is obtained by an extraction process from a culture of said enterobacterium.
  • the methods for extracting bacterial membrane proteins are known to those skilled in the art and will not be developed in the present description. Mention may be made, for example, but not limited to, of the extraction process described by Haeuw J.H. et al. (Eur. J. Biochem, 255, 446-454, 1998).
  • the invention also comprises the use of an enterobacterium OmpA protein or of a fragment thereof according to the invention, characterized in that said enterobacterium OmpA protein, or the one of its fragments is obtained recombinantly.
  • Biotechnology 4: 538-542 as well as animal cells, in particular mammalian cell cultures (Edwards CP and Aruffo A., 1993, Current applications of COS cell based transient expression Systems. Curr. Op. Biotechnology 4: 558-563) but also insect cells in which methods using, for example, baculoviruses can be used (Luckow NA, 1993, Baculovirus Systems for the expression of human gene products. Curr. Op. Biotechnology 4: 564-572).
  • the use according to the invention is characterized in that said enterobacterium is Klebsiella pneumoniae.
  • the invention relates to the use according to the invention, characterized in that the amino acid sequence of said OmpA protein of Klebsiella pneumoniae, or one of its fragments, comprises: a) the sequence d amino acids of sequence SEQ ID ⁇ ° 2; b) the amino acid sequence of a sequence having a homology of at least 80%, preferably 90% and 95%, after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 2; or c) the amino acid sequence of a fragment of at least 5 amino acids, preferably 10, 15, 20 and 25 amino acids, of a sequence as defined in a).
  • nucleic acid or amino acid sequence having a homology of at least 80% after optimal alignment with a determined nucleic acid or amino acid sequence is meant a sequence which after optimal alignment with said determined sequence includes a percentage identity of at least 80% with said determined sequence.
  • percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical nucleotides or amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed at random and over their entire length.
  • Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by "comparison window” to identify and compare the regions. sequence similarity locale.
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be achieved, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981) [Ad. App. Math.
  • the percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences per comparison window in which the region of the nucleic acid or amino acid sequence to be compared. may include additions or deletions with respect to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percent identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • BLAST 2 sequences available on the website ht ⁇ : //www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, the parameters used being those given by default (in particular for the parameters “open gap penaltie”: 5, and “extension gap penaltie”: 2; the chosen matrix being for example the “BLOSUM 62” matrix proposed by the program), the percentage of identity between the two sequences to be compared being calculated directly by the program.
  • sequences having at least 80% homology with the reference OmpA sequence the sequences of, or coding for, are preferred.
  • the invention further comprises the use according to the invention, characterized in that said antigen or hapten is chosen from proteins, lipopeptides, polysaccharides, oligosaccharides, nucleic acids, lipids or any compound capable of specifically directing the CTL response against said infectious agent or said tumor cell.
  • said antigen or hapten is chosen from proteins, lipopeptides, polysaccharides, oligosaccharides, nucleic acids, lipids or any compound capable of specifically directing the CTL response against said infectious agent or said tumor cell.
  • the present invention also relates to the use according to the invention, characterized in that said antigen or hapten is coupled or mixed with said OmpA protein or one of its fragments.
  • the invention also includes the use according to the invention, characterized in that said antigen or hapten is coupled by covalent bond, in particular by chemical coupling, with said protein OmpA or one of its fragments.
  • the use according to the invention is characterized in that one or more binding elements are introduced into said OmpA protein, or one of its fragments, and / or into said antigen or hapten to facilitate chemical coupling, preferably, said connecting element introduced is an amino acid.
  • the covalent coupling between the OmpA protein, or one of its fragments, and said antigen or hapten according to the invention can be carried out at the N- or C- terminal end of the OmpA protein, or one of its fragments .
  • the bifunctional reagents allowing this coupling will be determined according to the end of the OmpA protein, or one of its fragments, chosen to perform the coupling and the nature of said antigen or hapten to be coupled.
  • the use according to the invention is characterized in that the coupling between said antigen or hapten and said protein OmpA, or one of its fragments, is produced by genetic recombination, when said antigen or hapten is of peptide nature.
  • the conjugates resulting from a coupling to said OmpA protein, or one of its fragments can be prepared by genetic recombination.
  • the cliimeric or hybrid protein (conjugate) can be produced by recombinant DNA techniques by insertion or addition to the DNA sequence coding for said OmpA protein, or one of its fragments, of a sequence coding for said antigen or protein hapten.
  • the methods of synthesizing hybrid molecules include the methods used in genetic engineering to construct hybrid polynucleotides encoding the desired polypeptide sequences.
  • the invention relates to the use according to the invention, characterized in that the pharmaceutical composition comprises a nucleic construct coding for said hybrid protein, or comprises a vector containing a nucleic construct coding for said hybrid protein or a cell transformed host containing said nucleic construct capable of expressing said hybrid protein.
  • the invention also includes the use according to the invention, for the preparation of a pharmaceutical composition intended for eliminating infectious agents or for inhibiting the growth of tumors.
  • the use according to the invention relates to the preparation of a pharmaceutical composition intended for preventing or treating infectious diseases or cancers, preferably cancers associated with a tumor antigen.
  • the subject of the invention is in particular the use of an enterobacterium protein OmpA or of a fragment thereof according to the invention, for the preparation of a pharmaceutical pharmaceutical composition intended for preventing or treating an infectious disease, in particular of viral, bacterial or fungal, or parasitic origin, or cancer, preferably associated with a tumor antigen, in particular melanomas.
  • the invention also includes the use according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition is conveyed in a form making it possible to improve its stability and / or its immunogenicity, in particular in the form of a liposome.
  • the invention comprises the use according to the invention, characterized in that said vehicle is a viral vector containing a nucleic construct coding for said protein OmpA or one of its fragments, said antigen or hapten, or said protein hybrid, or a transformed host cell capable of expressing said OmpA protein, or one of its fragments, said antigen or hapten, or said hybrid protein.
  • said invention also includes the use according to the invention, characterized in that said nucleic construct, or the nucleic construct contained in said vector or said transformed host cell, comprises a nucleic sequence chosen from the sequence SEQ ID No.
  • the invention comprises a pharmaceutical composition as defined above in the uses according to the present invention.
  • compositions are preferred, characterized in that they comprise in a pharmaceutically acceptable medium at least one OmpA protein of enterobacterium, or one of its fragments, associated by mixing or by coupling to at least one antigen or a hapten. associated or specific to a tumor cell.
  • the pharmaceutically acceptable medium is the medium in which the compounds of the invention are administered, preferably a medium injectable into humans. It can consist of water, an aqueous saline solution or an aqueous solution based on dextrose and / or glycerol.
  • composition according to the invention also contains a detergent.
  • compositions according to the invention can also contain a detergent, and in particular any type of pharmaceutically acceptable surfactant, such as for example anionic, cationic, nonionic or amphoteric surfactants.
  • a detergent such as for example anionic, cationic, nonionic or amphoteric surfactants.
  • Zwittergent 3-12 detergents and octylglucopyrannoside are used, and even more preferably Zwittergent 3-14.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is characterized in that said enterobacterium OmpA protein, or one of its fragments, is obtained by an extraction process from a culture of said enterobacterium or by recombinant.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is characterized in that said enterobacterium is Klebsiella pneumoniae.
  • the invention relates to a composition according to the invention, characterized in that the amino acid sequence of said OmpA protein, or one of its fragments, comprises: a) the acid sequence amines of sequence SEQ ID No. 2; b) the amino acid sequence of a sequence having at least 80% homology with the sequence SEQ ID No. 2; or c) the amino acid sequence of a fragment of at least 5 amino acids, preferably 10, 15, 20 and 25 amino acids, of a sequence as defined in a).
  • antigens or haptens included in the composition according to the invention those chosen from peptides, lipopeptides, polysaccharides, oligosaccharides, nucleic acids, lipids or any compound capable of specifically directing a CTL response against a cell are preferred. tumor.
  • the invention relates to a composition according to the invention, characterized in that said antigen or hapten is coupled by covalent bond with said protein OmpA or one of its fragments, in particular by coupling produced by synthesis chemical and for which, where appropriate, one or more linking elements, such as an amino acid, can be introduced into said OmpA protein, or one of its fragments, and / or into said antigen or hapten to facilitate said chemical coupling .
  • said antigen or hapten is coupled by covalent bond with said protein OmpA or one of its fragments, in particular by coupling produced by synthesis chemical and for which, where appropriate, one or more linking elements, such as an amino acid, can be introduced into said OmpA protein, or one of its fragments, and / or into said antigen or hapten to facilitate said chemical coupling .
  • the invention relates to a composition according to the invention, characterized in that the coupling between said antigen or hapten and said OmpA protein, or one of its fragments, is carried out by genetic recombination when said antigen or hapten is peptide in nature
  • the present invention further relates to a composition according to the invention, characterized in that the pharmaceutical composition comprises a nucleic construct coding for said hybrid protein, said nucleic construct possibly being contained in a vector, or in a transformed host cell capable of expressing said hybrid protein.
  • the invention relates to a composition according to the invention, characterized in that said nucleic construct comprises a nucleic sequence chosen from the sequence SEQ ID No 1, one of its fragments having at least 15 nucleotides consecutive of the sequence SEQ ID No. 1, or a sequence having at least 80% homology with one of said sequences.
  • compositions according to the invention preference is also given to pharmaceutical compositions conveyed in a form which makes it possible to improve their stability and / or their immunogenicity, in particular in the form of a liposome, a viral vector containing a nucleic construct encoding said OmpA protein, or one of its fragments, said antigen or hapten, or said hybrid protein, or of a transformed host cell capable of expressing said OmpA protein, or one of its fragments, said antigen or hapten, or said hybrid protein.
  • the composition according to the invention is characterized in that it contains no other adjuvant making it possible to induce a CTL response, apart from said enterobacterium protein OmpA, or one of its fragments, or a construction nucleic acid encoding said OmpA protein or one of its fragments, a characteristic element of the composition according to the invention making it possible to induce a CTL response.
  • the draining ganglion cells are stimulated with EL-4 A2 / Kb cells ( Figures 1A, IB, IC) or EL-4 ( Figure ID) irradiated and pre-pulsed with 1 ⁇ M of the peptide relevant before being evaluated for their capacity to kill pre-pulsed target cells (rectangle) or not (diamond) with the relevant peptide.
  • the abscissa of the reference marks of FIGS. 1A to ID correspond to the ratio of effector T cells (activated lymphocytes) brought into contact with the target cells (EL-4 A2 / Kb or EL-4).
  • Figures 2A. 2B. 2C and 2D Measurement of the anti-MELAN-A CTL activity of effector cells in the presence of the rP40 protein compared to the CTL activity obtained with a standard immunization protocol.
  • the draining lymph node cells are stimulated two weeks in vitro with EL-4 A2 / Kb cells irradiated and pre-pulsed with 1 ⁇ M of peptide relevant before being evaluated for their capacity to kill target cells EL-4 A2 / Kb pre-pulsed (rectangle) or not (diamond) with the peptide hELA.
  • Figures 3A. 3B, 3C and 3D CTL activity and antitumor effect of immunization with rP40 + TRP-2 peptide.
  • FIG. 3A Immunization with a mixture of the TRP-2 peptide with rP40 induces a CTL response specific to the peptide.
  • C57BL / 6 mice were injected in s.c. with 50 ⁇ g of the TRP-2 peptide mixed with 300 ⁇ g of rP40. 10 days later, the lymph nodes were dissociated and restimulated with irradiated EL-4 cells and pulsed (rectangles) or not (diamonds) with the TRP-2 peptide.
  • Figures 3B, 3Cet 3D C57BL / 6 mice received 2 x 10 3 autologous melanoma B16F10 cells sc in the flank. Simultaneously ( Figures 3B and 3D), or 4 days later ( Figure 3C), some of these mice were immunized in sc (at the base of the tail) with 50 ⁇ g of the TRP-2 peptide mixed with 300 ⁇ g of rP40 ( o), others were immunized with the P40 protein alone (1, for FIGS. 3B and 3C) or with the TRP-2 peptide alone (•, for FIG. 3D). From the 18th day after implantation, the volume of the tumors was measured.
  • Figures 4 A. 4B. and 4C Measurement of the anti-ONA CTL activity after immunization with the rP40 protein coupled to the ONA peptide p257-264.
  • mice received by subcutaneous injection at the base of the tail 200 ⁇ g of P40-Ova ("), beads coupled to Ova (O), solubilized Ova (D), Ova -BS 3 (A) (BS 3 for Bis (succinimidyl) Suberate), P40 ( ⁇ ), or DT-Ova (•) (DT for Diphtheria Toxoid).
  • Thymoma EL4 target cells pulsed with 50 ⁇ g / ml of OVA peptide (FIG. 4B) or not (FIG. 4C) or transfected with the ova gene (E.G7 line) (FIG. 4A) are incubated with 51 Cr at 37 ° C. and grown with effector cells.
  • Example 1 Cloning of the gene coding for the protein P40 of Klebsiella pneumoniae
  • the gene coding for the protein P40 was obtained by PCR amplification from the genomic DNA of Klebsiella pneumoniae D? 1145 (Nguyen et al., Gene, 1998). The gene fragment encoding this gene is inserted into various expression vectors under the control of different promoters, in particular that of the Trp operon.
  • the nucleotide sequence and the peptide sequence of the P40 protein are represented by the sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 below.
  • An E. coli K12 producing strain was transformed with an expression vector pvaLP40.
  • the recombinant protein P40 (called rP40) is produced in the form of inclusion bodies with a high yield (> 10% in g of protein / g of dry biomass).
  • TSB medium Tetracycline 8 ⁇ g / ml, Sigma
  • Ampicillin 100 ⁇ g / ml, Sigma
  • Tetracycline 8 ⁇ g / ml, Sigma
  • inoculate with the transformed E. coli strain. described above. Incubate overnight at 37 ° C and then 200 ml of this culture are used to seed 2 liters of culture medium in a fermenter (Biolafitte, France).
  • the culture medium can be composed of chemical agents, supplemented with vitamins, yeast extracts, known to promote the growth of high density bacterial cells.
  • the parameters controlled during fermentation are: pH, agitation, temperature, oxygenation rate, feeding of combined sources (glycerol or glucose).
  • the pH is regulated at 7.0, the temperature is fixed at 37 ° C.
  • Growth is controlled by feeding glycerol (87%) at a constant rate (12 ml / h) to maintain the voltage signal of dissolved oxygen at 30%.
  • the turbidity of the culture (measured at 580 nm) reaches the value of 80 (after approximately 24 hours of culture)
  • the production of the proteins is triggered by addition of indole acrylic acid (IAA) to the final concentration of 25 mg / 1.
  • IAA indole acrylic acid
  • the quantity of wet biomass obtained is approximately 200 g.
  • Example 3 Method of Extraction and Purification of the rP40 Protein Extraction of the rP40 After centrifugation of the culture broth (4000 rpm (revolutions per minute), 10 min, 4 ° C.), the cells are resuspended in a buffer Tris-HCl, 25 mM, pH 8.5. The insolubles, or inclusion bodies, are obtained after treatment with lysozyme (0.5 g / liter, 1 hour at room temperature with gentle stirring). The inclusion body pellet obtained by centrifugation (15 min at 10,000 g at 4 ° C) is taken up in a Tris-HCl buffer, 25 mM at pH 8.5 and 5 mM MgCl 2 and then centrifuged (15 min at 10 000 g).
  • the inclusion bodies are solubilized at 37 ° C. for 2 hours in a Tris-HCl buffer, 25 mM, pH 8.5 containing 7 M urea (denaturing agent) and 10 mM dithiothreitol (reduction of disulfide bridges). Centrifugation (15 min at 10,000 g) eliminates the insoluble particles.
  • Tris-HCl buffer 25 mM, pH 8.5 containing NaCl (8.76 g / 1) and Zwittergent 3-14 (0.1%, w / v). The solution is left overnight at room temperature with gentle stirring in contact with air (promoting the renaturation of the protein by dilution and reoxidation of the disulphide bridges).
  • the solution is dialyzed against a 25 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5 containing 0.1% Zwittergent 3-14 (100 X volumes of buffer) overnight at 4 ° C.
  • the dialysate is deposited on a column containing a support of the strong anion exchanger type (Biorad Macro Prop High Q gel) balanced in the buffer described above, at a linear flow rate of 15 cm / h. Proteins are detected at 280 nm.
  • the rP40 protein is eluted, with a linear flow rate of 60 cm / h, for a concentration of 0.2 M NaCl in the 25 mM Tris-HCl buffer, pH 8.5: 0.1% Zwittergent 3-14.
  • the fractions containing the rP40 protein are pooled and concentrated by ultrafiltration using an Amicon shaking cell system used with a Diaflo membrane of the YM10 type (cutoff threshold 10 kDa) for volumes of the order of 100 ml. , or using a Minitan Millipore tangential flow filtration system used with membrane plates with a cutoff threshold
  • the dialysate is deposited on a column containing a support of the strong cation exchanger type (Biorad Macro Prep High S gel) equilibrated in the 20 mM citrate buffer, pH 3.0, at 0.1% of Zwittergent 3-14.
  • the rP40 protein is eluted (speed 61 cm / h) for a 0.7 M NaCl concentration.
  • the electrophoretic profiles show a degree of purity of the order of 95%.
  • the state of the protein is followed by SDS-PAGE.
  • the P40 protein extracted from the membrane of Klebsiella pneumoniae, has a characteristic electrophoretic (migration) behavior.
  • the native form has a lower molecular weight than the denatured form ( ⁇ -helical structure) under the action of a denaturing agent, such as urea or guanidine hydrochloride, or by heating to 100 ° C. in the presence of SDS.
  • a denaturing agent such as urea or guanidine hydrochloride
  • the rP40 protein is not correctly renatured at the end of renaturation, whether this is carried out in the absence or in the presence of 0.1%; (w / v) Zwittergent 3-14.
  • total renaturation is obtained after dialysis against a 25 mM Tris / HCl buffer pH 8.5 containing 0.1% (w / v) Zwittergent 3-14.
  • this renaturation is only obtained when the dilution step and the treatment at ambient temperature are carried out themselves in the presence of Zwittergent 3-14 (negative results in the absence of detergent).
  • Example 4 CTL generation
  • the CTL anti-tumor responses directed against melanoma cells have been defined for several antigens. These antigens fall into one of three categories: a) melanoma-specific rejection antigens, such as those of the MAGE family (reviewed by van der Bruggen et al., Science 254: 1643); b) antigens resulting from the mutation of normal proteins. This group includes MUM-1 (Coulie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7976-7980 (1995); CDK4 (Wolfel et al., Science 296: 1281-1284 (1995) and HLA- A2 (Brandel et al., J. Exp. Med.
  • Mart-1 / MelanA appears to be the best candidate for use in immunotherapy, for several reasons.
  • this antigen was identified from the in vivo CTL response of melanoma infiltrating lymphocytes and not that, in vitro, from peripheral blood cells, which would suggest a greater relevance of this antigen in the natural response in vivo against melanoma (Kawakami et al., J. Exp. Med. 180: 347 (1994)).
  • Mart-1 / MelanA is expressed on all the melanomas examined, which makes it a prime target for immunotherapeutic intervention.
  • peptides derived from Mart-1 / MelanA are capable of inducing a specific CTL response in melanoma patients expressing the HLA-A2 histocompatibility antigen (Rivoltini et al., J. Immunol. 154: 2257 (1995 ); Valmori et al. J. Immunol. 160: 1750 (1998)).
  • HLA-A2 is the most frequently expressed allele in Caucasians.
  • the CTL epitopes of Mart-1 / MelanA have been defined for this allele.
  • the antigenic peptide recognized by the majority of human CTL lines includes amino acids 27-35 AAGIGILTN (Kawakami et al., J. Exp. Med. 180: 347 (1994)).
  • studies on the affinity of the binding with HLA-A * 0201 and the recognition by CTL clones have demonstrated that the optimal peptide for these two functions is the decapeptide 26-35 EAAGIGILTV (Romero et al, J Immunol. 159: 2366 (1997)).
  • hELA is an analogue of decapeptide 26-35 (EAAGIGILTV) of Melan- A MART-1, a protein expressed on melanocytes and melanomas.
  • the decapeptide 26-35 of Melan-A / MART-1 is capable of binding to the molecule HLA-A0201 (Romero et al., 1997, J. Immunol., 159, 2366-2374), it is weakly immunogenic in vitro and in vivo (Valmori et al., 1998, J. Immunol., 160, 1750-1758).
  • the analog hELA was generated by the substitution of the second amino acid of the decapeptide 26-35 of Melan-A MART-1 (an alanine) by a leucine.
  • HLA-A * 0201 / Kb (A2 / Kb) transgenic mice of strain C57B1 / 6 x BDA / 2 (Vitiello et al., 1991, J. Exp. Med., 173, 1007-1015) were used in this study to test ELA.
  • the MHC class I molecule expressed in these mice is a chimeric molecule formed from the ⁇ l and ⁇ 2 domains of the human molecule HLA-A0201 (most commonly found allotype) and from the ⁇ 3 domain of the murine molecule K b .
  • TRP-2 of sequence SEQ ID No. 4 is an octapeptide corresponding to amino acids 181-188 (VYDFFVWL) of tyrosinase-related protein 2 (TRP-2).
  • TRP-2 is expressed in melanocytes and melanomas. This has been shown to antigen induces protective CTL responses to melanoma in C57BL / 6 (H-2K b ) mice (Bloom et al., 1997, J. Exp. Med. 185, 453-459).
  • mice received by subcutaneous injection at the base of the tail were received by subcutaneous injection at the base of the tail:
  • lymphocytes of the draining ganglia are recovered to be stimulated in vitro with the relevant peptide.
  • These lymphocytes (4 to 5 10 6 ) are cultured in a 24-well plate in DMEM plus 10 mM HEPES, 10% FCS and 50 ⁇ M ⁇ -2-mercaptoethanol with 2 to 5 10 5 irradiated EL-4 A2 / Kb or EL4 cells ( 10 kRads) pre-pulsed 1 h at 37 ° C with 1 ⁇ M of the relevant peptide. After two weekly stimulations, the cells are tested for their cytotoxic activity.
  • TT tetanus toxoid
  • mice 10 days after the last immunization, the mice are sacrificed and the lymphocytes of the draining ganglia are recovered to be stimulated in vitro with the relevant peptide.
  • lymphocytes (4 to 5 10 6 ) are cultured in a 24-well plate in DMEM plus 10 mM HEPES, 10% FCS and 50 ⁇ M ⁇ -2-mercaptoethanol with 2 to 5 10 5 EL- 4 A2 / Kb cells (murine cells transfected with the HLA-A * 0201 / Kb gene) irradiated (10 kRads) pre-pulsed for 1 h at 37 ° C with 1 ⁇ M of the relevant peptide.
  • the cells are tested for their cytotoxic activity.
  • Anti-hELA CTL activity is measured after immunization with rP40 coupled with non-adjuvanted hELA comparable to that observed after immunization with hELA +
  • Example 5 Antitumor Effect of Immunization with a Mixture of rP40 and a Peptide Expressed by a Mouse Melanoma
  • VYDFFVWL protein Tyrosinase Related Protein 2
  • TRP-2 anti-peptide CTL response For the generation of a TRP-2 anti-peptide CTL response, a protocol identical to that described in Example 4 was used, except that here C57BL / 6 mice were used.
  • C57BL / 6 mice received 2 x 10 3 autologous melanoma B 16F 10 cells by subcutaneous injection (sc) in the flank.
  • mice were immunized in s.c.
  • TRP-2 and RP40 protein is capable of generating a CTL response specific to this peptide, which confirms the results obtained with the hELA peptide (described in Example 4).
  • this CTL response is associated with an inhibition of the growth of melanoma B16F10 ( Figures 3B, 3C and 3D). It is interesting to note that this protection is significant not only when the immunization with the peptide TRP-2 + rP40 is made simultaneously with the implantation of the tumor (FIGS. 3B and 3D), but also 4 days the implantation (FIG. 3C).
  • the ova peptide p257-264 is an octapeptide corresponding to the fragment of the consensus sequence of ovalbumin comprised between the amino acids in position 257 to 264 of the sequence of ovalbumin (ends included).
  • Ovalbumin is used as a protective peptide against tumor cells expressing ovalbumin.
  • mice 7 days after immunization, the mice are sacrificed and the spleens are recovered.
  • the spleen cells (4.10 7 ) are cultured flask in DMEM with 1.5 ⁇ 10 6 of irradiated E.G7 cells (4kRads).
  • the thymoma EL4 cells whether or not pulsed with the OVA peptide or transfected with the ova gene (line E.G7) are incubated with 51 Cr at 37 ° C. and cultured with the effector cells obtained above. The percentage of specific lysis is calculated as described in Example 4A. Results
  • mice with the rP40 protein coupled or mixed with the OVA peptide induces a strong specific CTL response.
  • This response is similar to that observed after immunization with the positive control, namely the beads coupled to ovalbumin (see FIGS. 4 A and 4B).
  • immunization with soluble ovalbumin, ova-BS 3 and DT-Ova is not effective.

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Description

UTILISATION D'UNE PROTEINE OmpA DΕNTEROBACTERIE ASSOCIEE A UN ANTIGENE POUR GENERER UNE REPONSE CYTOTOXIQUE ANTINIRALE, AΝTIPARASITAIRE OU AΝTITUMORALE.
L'invention concerne l'utilisation d'une protéine de membrane OmpA d'entérobactérie, notamment de Klebsiella pneumoniae, associée à un antigène ou un haptène pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse T cytotoxique dirigée contre un agent infectieux ou une cellule tumorale. L'invention comprend l'utilisation de ces composés pour la prévention et le traitement d'infection ou du cancer, notamment les cancers associés à un antigène tumoral tels que les mélanomes, ainsi que des compositions pharmaceutiques comprenant certains de ces composés.
La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire les infections virales ou bactériennes. Le succès des campagnes de vaccination dans ces domaines a permis d'étendre le concept de vaccin jusqu'alors utilisé dans le domaine de l'infectiologie aux domaines du cancer et des maladies auto-immunes. Les antigènes vaccinaux administrés seuls chez l'hôte ne sont souvent pas assez immunogéniques pour induire une réponse immunitaire, et doivent donc être associés à un adjuvant ou couplés à une protéine porteuse pour induire (ou augmenter) leur irnmunogénicité. D∑ins ces conditions, seule une réponse immune de type humorale peut être induite. Or, dans le cadre d'une thérapie antivirale, la génération de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de reconnaître et de détruire le virus est de toute importance (Bachmann et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24, 2228-2236 ; Borrow P., 1997, J. Nirol. Hepat., 4, 16-24), comme l'attestent de nombreuses études montrant, in vivo, le rôle protecteur des réponses dirigées contre les épitopes viraux (Arvin AM, 1992, J. Inf. Dis., 166, S35-S41 ; Koszinowski et al., 1987 Immunol. Lett. , 16, 185- 192).
L'importance des réponses CTL a aussi été fortement documentée dans les réponses antitumorales notamment celles dirigées contre les cellules de mélanome (revue dans Rivoltini et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18, 55-63). Le ou les épitopes CTL (séquences peptidiques interagissant avec les molécules de classe I et présentés aux lymphocytes T CD8+) ont été définis pour plusieurs antigènes. Cependant, la difficulté réside dans la génération de CTL in vivo, due à la faible immunogénicité de ces peptides (Melief, 1992, Adv. Cancer Res., 58, 143-175 ; Nandaz et Sercaz, 1995, Cell, 82, 13-17).
Des recherches s'orientent par conséquent vers l'identification de nouveaux adjuvants, ou de système de délivrance d'antigènes («delivery System»), permettant d'induire des CTL. Grâce à leur efficacité à présenter les antigènes et à stimuler le système immunitaire, les cellules dendritiques, par exemple, ont été utilisées pour générer des réponses CTL antivirales (Ludewig B et al., 1998, J. Viral., 72, 3812- 3818 ; Brassard P. et al., 1997, J. Immunol., 158, 3270-3276) ou anticancéreuses (Nestlé F.O. et al., 1998, Nat. Med., 4, 328-332). Les approches ont consisté à charger les cellules dendritiques ex vivo avec l'antigène d'intérêt (peptides ou lysat cellulaire) et réimplanter ces cellules chez le patient. D'autres approches consistent à transfecter ex vivo les cellules dendritiques avec le gène codant pour l'antigène d'intérêt et à réinjecter ces cellules transfectées (Gilboa E. et al., 1998, Cancer Immunol. Immunother., 46, 82-87). Ces approches ont été utilisées avec succès chez la souris et récemment chez l'homme (Hsu F.J. et al. , 1996, Nat. Med., 2, 52-58) mais restent néanmoins complexes dans la mesure où ces cellules doivent être traitées ex vivo (transformation des cellules ou internalisation des antigènes) et transplantées dans l'organisme hôte. De même, l'utilisation de particules de type viral (Layton G.T. et al., 1993, J. Immunol., 151, 1097-1107) ou de l'adjuvant incomplet de Freund (IFA) (Valmori et al., Eur. J. Immunol., 1994, 24, 1458-1462) permet de générer des réponses CTL. Toutefois, une vaccination antivirale ou antitumorale réalisée avec des peptides correspondant à des épitopes CTL et en présence d'un tel adjuvant peuvent conduire à un état de tolérance spécifique qui peut conduire dans certains cas à l'effet contraire recherché, c'est-à-dire à une diminution de la réponse immune (Toes et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 7855-7860).
Ainsi, il existe aujourd'hui un grand besoin de disposer d'un composé qui, associé à une molécule, notamment un antigène ou haptène, soit capable de générer des CTL dirigés contre ladite molécule. Un tel composé pourrait en particulier être utilisé pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à induire une protection immunitaire de type CTL antiviral, antibactérien, antifongique ou antiparasitaire, ou antitumoral.
De manière surprenante, il a été mis en évidence qu'une protéine de la membrane externe de bactérie à gram négatif, notamment une protéine OmpA d'entérobactérie telle que la protéine P40 de Klebsiella pneumoniae (protéine décrite dans WO 95/27787 et WO 96/14415), a la propriété d'éliciter une réponse CTL contre une molécule qui lui est associée de manière covalente ou non, de préférence sans recours à l'addition d'un autre adjuvant.
Ainsi, la présente invention est relative à l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie, d'un de ses fragments ou d'une séquence nucléique codant pour ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale, in vitro ou in vivo, de préférence in vivo, ainsi que pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou à accroître ladite réponse T cytotoxique.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme « protéine » également les peptides ou les polypeptides et par le terme « OmpA » (pour « Outer Membrane Protéin »), les protéines de la membrane externe de type A.
Par fragment d'une protéine OmpA, on entend désigner en particulier tout fragment de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés de la protéine OmpA qui, lorsqu'il est associé à un antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'une cellule tumorale, est capable de générer ou accroître une réponse T cytotoxique dirigée contre ledit agent infectieux ou ladite cellule tumorale, ledit fragment de la protéine OmpA comprenant au moins 5 acides aminés, de préférence au moins 10 acides aminés ou de manière plus préférée au moins 15 acides aminés.
Par « antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'une cellule tumorale », on entend désigner en particulier tout composé exprimé par un agent infectieux, tel qu'un virus, une bactérie, une levure, un champignon ou un parasite, par une cellule tumorale, ou un de leurs analogues structuraux, qui seul ou en association avec un adjuvant de l'immunité est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale.
Par analogue d'un antigène ou haptène, on entend désigner en particulier dans la présente description un composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène ou haptène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène ou haptène dans un organisme préalablement immunisé avec ledit composé analogue.
L'invention a également pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre, associé à ladite protéine OmpA d'entérobactérie, un antigène ou un haptène spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale.
De préférence, l'invention comprend l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit agent infectieux est une particule virale, une bactérie, une levure, un champignon ou un parasite. Dans un mode de réalisation particulier, l'invention comprend l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments selon l'invention, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie. Les procédés d'extraction de protéines de membrane bactériennes sont connus de l'homme de l'art et ne seront pas développés dans la présente description. On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter le procédé d'extraction décrit par Haeuw J.H. et al. (Eur. J. Biochem, 255, 446-454, 1998).
Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention comprend également l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments selon l'invention, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par voie recombinante.
Les méthodes de préparation de protéines recombinantes sont aujourd'hui bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description, on pourra néanmoins se référer à la méthode décrite dans les exemples. Parmi les cellules utilisables pour la production de ces protéines recombinantes, il faut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins P.O. et Lee S.C., 1993, Récent advances in heterologous gène expression in E. coli. Curr. Op. Biotechnology 4:520-525), mais également les cellules de levure (Buckholz R.G. , 1993, Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gène Products. Curr. Op. Biotechnology 4:538-542), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifère (Edwards C.P. et Aruffo A., 1993, Current applications of COS cell based transient expression Systems. Curr. Op. Biotechnology 4:558-563) mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus (Luckow N.A., 1993, Baculovirus Systems for the expression of human gène products. Curr. Op. Biotechnology 4:564-572).
De manière tout à fait préférée, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que ladite entérobactérie est Klebsiella pneumoniae.
En particulier, l'invention est relative à l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae, ou l'un de ses fragments, comprend : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID Ν° 2 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80 %, de préférence 90 % et 95 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID N° 2 ; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés, de préférence 10, 15, 20 et 25 acides aminés, d'une séquence telle que définie en a).
Par séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés présentant une homologie d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés déterminée, on entend désigner une séquence qui après alignement optimal avec ladite séquence déterminée comprend un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec ladite séquence déterminée.
Par «pourcentage d'identité» entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par «fenêtre de comparaison» pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l' algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2:482], au moyen de ralgorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucleotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, «BLAST 2 séquences», disponible sur le site htφ://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres «open gap penaltie» : 5, et «extension gap penaltie» : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice «BLOSUM 62» proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme. Parmi lesdites séquences présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence OmpA de référence, on préfère les séquences de, ou codant pour des, peptides capables d'induire une activité CTL dirigée spécifiquement contre l'antigène ou haptène qui lui est associée, telle que l'activité CTL mesurée au moyen des techniques standards décrites dans les exemples ci-après.
L'invention comprend en outre l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est choisi parmi les protéines, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques, les lipides ou tout composé capable de diriger spécifiquement la réponse CTL contre ledit agent infectieux ou ladite cellule tumorale.
La présente invention a aussi pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé ou mélangé avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments.
L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé par liaison covalente, notamment par couplage chimique, avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments. Dans un mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit antigène ou haptène pour faciliter le couplage chimique, de préférence, ledit élément de liaison introduit est un acide aminé. Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et ledit antigène ou haptène. Le couplage covalent entre la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et ledit antigène ou haptène selon l'invention peuvent être réalisés à l'extrémité N- ou C- terminale de la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité de la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, choisie pour effectuer le couplage et de la nature dudit antigène ou haptène à coupler.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que le couplage entre ledit antigène ou haptène et ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, est réalisé par recombinaison génétique, lorsque ledit antigène ou haptène est de nature peptidique.
Les conjugués issus d'un couplage à ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, peuvent être préparés par recombinaison génétique. La protéine cliimérique ou hybride (conjugué) peut être produite par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, d'une séquence codant pour ledit antigène ou haptène de nature protéique.
Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des polynucleotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D.N. Goeddel (Gène expression technology, Methods in
Enzymology, vol. 185, 3-187, 1990). Sous un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride, ou comprend un vecteur contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride ou une cellule hôte transformée contenant ladite construction nucléique capable d'exprimer ladite protéine hybride.
L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à éliminer les agents infectieux ou à inhiber la croissance de tumeurs.
De préférence, l'utilisation selon l'invention est relative à la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter les maladies infectieuses ou les cancers, de préférence les cancers associés à un antigène tumoral.
Parmi les cancers dont les tumeurs expriment un antigène tumoral associé pouvant être prévenus ou traités par les utilisations selon la présente invention, on peut citer en particulier, mais sans s'y limiter : • le cancer du sein, du poumon, du colon, et le carcinome gastrique (Kawashima et al. , 1999, Cancer Res. 59:431-5) ; • le mésothéliome, l'ostéosarcome, les cancers du cerveau (Xie et al., 1999, J. Natl. Cancer. Inst. 91:169-75) ;
• le mélanome (Zheuten et al., 1998, Bratilsl. Lek. Listy 99:426-34) ;
• l'adénome cystique du pancréas (Hammel et al., 1998, Eur. J. gastroenterol. Hepatol. 10:345-8) ;
• le cancer colorectal (Ogura et al., 1998, Anticancer Res. 18:3669-75) ;
• le carcinome des cellules rénales (Jantzer et al., 1998, Cancer Res. 58:3078-86) ; et
• le cancer de l'ovaire et du cervix (Sonoda et al., 1996, Cancer. 77:1501-9). L'invention a en particulier pour objet l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments selon l'invention, pour la préparation d'une composition pharmaceutique vaccinale destinée à prévenir ou à traiter une maladie infectieuse, notamment d'origine virale, bactérienne ou fongique, ou parasitaire, ou un cancer, de préférence associé à un antigène tumoral, en particulier les mélanomes. L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité, notamment sous la forme d'un liposome.
De préférence, l'invention comprend l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit véhicule est un vecteur viral contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments, ledit antigène ou haptène, ou ladite protéine hybride, ou une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit antigène ou haptène, ou ladite protéine hybride. L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite construction nucléique, ou la construction nucléique contenue dans ledit vecteur ou ladite cellule hôte transformée, comprend une séquence nucléique choisie parmi la séquence SEQ ID N° 1, l'un de ses fragments présentant au moins 15 nucléotides, de préférence 20, 25, 30, 40 et 50 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N° 1, ou une séquence présentant une homologie d'au moins 80 %, de préférence 90 % et 95 %, après alignement optimal avec l'une desdites séquences. Sous un autre aspect, l'invention comprend une composition pharmaceutique telle que définie précédemment dans les utilisations selon la présente invention.
Parmi ces compositions, on préfère les compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles comprennent dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins une protéine OmpA d'entérobactérie, ou un de ses fragments, associée par mélange ou par couplage à au moins un antigène ou un haptène associé ou spécifique d'une cellule tumorale.
Au sens de la présente invention, le milieu pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de l'invention sont administrés, préférentiellement un milieu injectable chez l'homme. Il peut être constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention contient en outre un détergent.
Les compositions selon l'invention peuvent contenir en outre un détergent, et notamment tout type de tensioactif pharmaceutiquement acceptable, comme par exemple des tensioactif s anioniques, cationiques, non-ioniques ou amphotères. On utilise préférentiellement les détergents Zwittergent 3-12 et l'octylglucopyrannoside et encore plus préférentiellement le Zwittergent 3-14.
De préférence, la composition pharmaceutique selon l'invention est caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie ou par voie recombinante.
De préférence également, la composition pharmaceutique selon l'invention est caractérisée en ce que ladite entérobactérie est Klebsiella pneumoniae. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne une composition selon l'invention, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, comprend : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N° 2 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID N° 2 ; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés, de préférence 10, 15, 20 et 25 acides aminés, d'une séquence telle que définie en a).
Parmi les antigènes ou haptènes entrant dans la composition selon l'invention, on préfère ceux choisis parmi les peptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques, les lipides ou tout composé capable de diriger spécifiquement une réponse CTL contre une cellule tumorale.
Dans un mode de réalisation également préféré, l'invention concerne une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé par liaison covalente avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments, notamment par couplage réalisé par synthèse chimique et pour lequel, le cas échéant, un ou plusieurs éléments de liaison, tel un acide aminé, peut être introduit dans ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit antigène ou haptène pour faciliter ledit couplage chimique.
Dans un mode de réalisation également préféré, l'invention concerne une composition selon l'invention, caractérisée en ce que le couplage entre ledit antigène ou haptène et ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, est réalisé par recombinaison génétique lorsque ledit antigène ou haptène est de nature peptidique
(expression d'une protéine hybride).
Ainsi, la présente invention concerne en outre une composition selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride, ladite construction nucléique pouvant être contenue dans un vecteur, ou dans une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine hybride.
Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite construction nucléique comprend une séquence nucléique choisie parmi la séquence SEQ ID N° 1, l'un de ses fragments présentant au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N° 1, ou une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec l'une desdites séquences.
Parmi les compositions selon l'invention, on préfère également les compositions pharmaceutiques véhiculées sous une forme permettant d'améliorer leur stabilité et/ou leur immunogénicité, notamment sous forme d'un liposome, d'un vecteur viral contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit antigène ou haptène, ou ladite protéine hybride, ou d'une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit antigène ou haptène, ou ladite protéine hybride. Sous un dernier aspect, la composition selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle ne contient aucun autre adjuvant permettant d'induire une réponse CTL, hormis ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, ou une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments, élément caractéristique de la composition selon l'invention permettant d'induire une réponse CTL.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Légendes des figures : Figures 1A. IB. IC et ID : Mesure de l'activité CTL anti-MELAN-A et anti-TRP-2 de cellules effectrices.
Après immunisation avec 50 μg hELA mélangé avec 3 μg rP40 (figure 1A), 50 μg hELA mélangé avec 300 μg rP40 (figure IB), 50 μg hELA couplé à rP40 (figure IC), ou 50 μg du peptide TRP-2 mélangé avec 300 μg rP40 (figure ID), les cellules de ganglions drainants sont stimulées avec des cellules EL-4 A2/Kb (figures 1A, IB, IC) ou EL-4 (figure ID) irradiées et pré-pulsées avec 1 μM du peptide relevant avant d'être évaluées pour leur capacité à tuer des cellules cibles pré-pulsées (rectangle) ou non (losange) avec le peptide relevant.
Les abscisses des repères des figures 1A à ID correspondent au rapport des cellules T effectrices (lymphocytes activés) mises en présence sur les cellules cibles (EL-4 A2/Kb ou EL-4).
Figures 2A. 2B. 2C et 2D : Mesure de l'activité CTL anti-MELAN-A de cellules effectrices en présence de la protéine rP40 comparée à l'activité CTL obtenue avec un protocole standard d'immunisation.
Après immunisation avec hELA (50μg) seul (ELA, Figure 2A), hELA mélangé à 300 μg rP40 (ELA + P40, figure 2B), hELA couplé à 300 μg rP40 (ELA/P40, figure 2C) ou hELA mélangé avec 50μg de peptide P30 adjuvé avec IFA (ELA + IFA + TT, figure 2D) (IFA pour Adjuvant Incomplet de Freund et TT pour Tetanus Toxoïd), les cellules de ganglions drainants sont stimulées deux semaines in vitro avec des cellules EL-4 A2/Kb irradiées et pré-pulsées avec 1 μM du peptide relevant avant d'être évaluées pour leur capacité à tuer des cellules cibles EL-4 A2/Kb pré-pulsées (rectangle) ou non (losange) avec le peptide hELA.
Figures 3A. 3B, 3C et 3D : Activité CTL et effet antitumoral de l' immunisation avec rP40 + peptide TRP-2.
Figure 3 A : L'immunisation avec un mélange du peptide TRP-2 avec rP40 induit une réponse CTL spécifique au peptide. Des souris C57BL/6 ont été injectées en s.c. avec 50 μg du peptide TRP-2 mélangés avec 300 μg de rP40. 10 jours plus tard, les ganglions ont été dissociés et restimulés avec des cellules EL-4 irradiées et puisées (rectangles) ou non (losanges) avec le peptide TRP-2.
Figures 3B, 3Cet 3D : Des souris C57BL/6 ont reçu 2 x 103 cellules du mélanome autologue B16F10 en s.c. dans le flanc. Simultanément (figures 3B et 3D), ou 4 jours plus tard (figure 3C), certaines de ces souris ont été immunisées en s.c. (à la base de la queue) avec 50 μg du peptide TRP-2 mélangés à 300 μg de rP40 (o), d'autres ont été immunisées avec la protéine P40 seule (1, pour figures 3B et 3C) ou avec le peptide TRP-2 seul (•, pour figure 3D). A partir du 18ème jour postimplantation, le volume des tumeurs a été mesuré. Figures 4 A. 4B. et 4C : Mesure de l'activité CTL anti-ONA après immunisation par la protéine rP40 couplée au peptide ONA p257-264.
Des souris C57BL/6 ont reçu par injection sous-cutanée à la base de la queue 200 μg de P40-Ova ("), de billes couplées à l'Ova (O), d'Ova solubilisée (D), d'Ova-BS3 (A) (BS3 pour Bis (succinimidyl) Subérate), de P40 (<), ou de DT-Ova (•) (DT pour Diphtérique Toxoïd).
Les cellules cibles thymomes EL4 puisées avec 50 μg /ml de peptide OVA (figure 4B) ou non (figure 4C) ou transfectées avec le gène ova (lignée E.G7) (figure 4A) sont incubées avec du 51Cr à 37° C et cultivées avec les cellules effectrices. Exemple 1 : Clonage du gène codant pour la protéine P40 de Klebsiella pneumoniae
Le gène codant pour la protéine P40 a été obtenu par amplification par PCR à partir de l'ADN génomique de Klebsiella pneumoniae D? 1145 (Nguyen et col., Gène, 1998). Le fragment de gène codant de ce gène est inséré dans divers vecteurs d'expression sous contrôle de différents promoteurs, en particulier celui de l'opéron Trp. La séquence nucléotidique et la séquence peptidique de la protéine P40 sont représentées par les séquences SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 2 ci-après. Une souche productrice E. coli K12, a été transformée par un vecteur d'expression pvaLP40. La protéine recombinante P40 (dénommée rP40) est produite sous forme de corps d'inclusion avec un rendement important (> 10 % en g de protéine/g de biomasse sèche).
Cet exemple n'est qu'une illustration de l'expression de la protéine rP40, celle- ci pouvant être étendue à d'autres souches bactériennes ainsi qu'à d'autres vecteurs d'expression. Exemple 2 : Procédé de fermentation de protéines de fusion rP40
Dans un erlenmeyer contenant 250 ml de milieu TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) renfermant de l' Ampicilline (100 μg/ml, Sigma) et de la Tétracycline (8 μg/ml, Sigma) on inocule avec la souche E. coli transformée décrite ci-dessus. On incube pendant une nuit à 37 °C puis, 200 ml de cette culture sont utilisés pour ensemencer 2 litres de milieu de culture dans un fermenteur (Biolafitte, France). De manière assez classique, le milieu de culture peut être composé d'agents chimiques, supplémentés par les vitamines, des extraits de levure, connus pour favoriser une croissance de cellules bactériennes à densité élevée.
Les paramètres contrôlés durant la fermentation sont : le pH, l'agitation, la température, le taux d'oxygénation, l'alimentation de sources combinées (glycérol ou glucose). De manière générale, le pH est régulé à 7,0, la température est fixée à 37°C. La croissance est contrôlée en alimentant en glycérol (87 %) à un débit constant (12 ml/h) pour maintenir le signal de tension de l'oxygène dissous à 30 %. Lorsque la turbidité de la culture (mesurée à 580 nm) atteint la valeur de 80 (après environ 24 heures de culture), la production des protéines est déclenchée par addition de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de 25 mg/1. Environ 4 heures après induction, les cellules sont récoltées par centrifugation. La quantité de biomasse humide obtenue est d'environ 200 g.
Exemple 3 : Procédé d'extraction et de purification de la protéine rP40 Extraction de la rP40 Après centrifugation du bouillon de culture (4000 rpm (tours par minute), 10 min, 4°C), les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 8,5. Les insolubles, ou corps d'inclusion, sont obtenus après un traitement par le lysozyme (0,5 g/litre, 1 heure à température ambiante sous agitation douce). Le culot de corps d'inclusion obtenu par centrifugation (15 min à 10 000 g à 4°C) est repris dans un tampon Tris-HCl, 25 mM à pH 8,5 et 5 mM MgCl2 puis centrifugé (15 min à 10 000 g).
On solubilise les corps d'inclusion à 37°C pendant 2 heures dans un tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 8,5 contenant 7 M urée (agent dénaturant) et 10 mM de dithiothréitol (réduction des ponts disulfures). Une centrifugation (15 min à 10 000g) permet d'éliminer les particules non solubles.
On resuspend ensuite dans 13 X volumes de tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 8,5 contenant du NaCl (8,76 g/1) et du Zwittergent 3-14 (0,1 %, p/v). La solution est laissée pendant une nuit à température ambiante sous agitation douce au contact de l'air (favoriser la renaturation de la protéine par dilution et réoxydation des ponts disulfures).
Purification de la protéine rP40
- Etape de chromatographie d'échange d'anions.
Après une nouvelle centrifugation, la solution est dialysée contre un tampon Tris-HCl, 25 mM, pH 8,5 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 (100 X volumes de tampon) pendant une nuit à 4°C.
Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur d'anions forts (gel Biorad Macro Prop High Q) équilibrée dans le tampon décrit ci- dessus, à un débit linéaire de 15 cm/h. Les protéines sont détectées à 280 nm. La protéine rP40 est éluée, avec un débit linéaire de 60 cm/h, pour une concentration de 0,2 M en NaCl dans le tampon Tris-HCl 25 mM, pH 8,5 : 0,1 % Zwittergent 3-14.
- Etape de chromatographie d'échange de cations. Les fractions contenant la protéine rP40 sont poolées et concentrées par ultrafiltration à l'aide d'un système de cellule à agitation Amicon utilisé avec une membrane Diaflo de type YM10 (seuil de coupure 10 kDa) pour des volumes de l'ordre de 100 ml, ou à l'aide d'un système de filtration à flux tangentiel Minitan Millipore utilisé avec des plaques de membranes possédant un seuil de coupure
10 kDa pour des volumes supérieurs. La fraction ainsi concentrée est dialysée pendant une nuit à 4°C contre un tampon citrate 20 mM pH 3,0, à 0,1 % de Zwittergent 3-14.
Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur de cations forts (gel Biorad Macro Prep High S) équilibrée dans le tampon citrate 20 mM, pH 3,0, à 0,1 % de Zwittergent 3-14. La protéine rP40 est éluée (vitesse 61 cm/h) pour une concentration 0,7 M en NaCl. Les profils électrophorétiques montrent un degré de pureté de l'ordre de 95 %. L'état de la protéine est suivi par SDS-PAGE. Selon sa forme dénaturée ou native, la protéine P40, extraite de la membrane de Klebsiella pneumoniae, possède un comportement électrophorétique (migration) caractéristique. La forme native (structure en feuillets β) présente en effet une masse moléculaire plus faible que la forme dénaturée (structure en hélices α) sous l'action d'un agent dénaturant, tel que l'urée ou le chlorhydrate de guanidine, ou par chauffage à 100°C en présence de SDS. La protéine rP40 n'est pas correctement renaturée en fin de renaturation, que celle-ci soit réalisée en absence ou en présence de 0,1 % ; (p/v) Zwittergent 3-14. En revanche, une renaturation totale est obtenue après dialyse contre un tampon Tris/HCl 25 mM pH 8,5 contenant 0,1 % (p/v) Zwittergent 3-14. Toutefois, il faut noter que cette renaturation n'est obtenue que, lorsque l'étape de dilution et le traitement à température ambiante, sont réalisés eux- mêmes en présence de Zwittergent 3-14 (résultats négatifs en absence de détergent). Exemple 4 : Génération de CTL
Les réponses CTL antitumorales dirigées contre les cellules de mélanome ont été définies pour plusieurs antigènes. Ces antigènes sont compris dans l'une de trois catégories : a) les antigènes de rejet spécifiques du mélanome, tels que ceux de la famille des MAGE (revu par van der Bruggen et al. , Science 254 : 1643) ; b) les antigènes résultant de la mutation de protéines normales. Ce groupe inclut MUM-1 (Coulie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7976-7980 (1995) ; CDK4 (Wolfel et al., Science 296:1281-1284 (1995) et HLA-A2 (Brandel et al., J. Exp. Med. 183:2501-2508 (1996) ; c) les antigènes de différentiation, exprimés par les mélanomes et les mélanocytes. Ce groupe inclut la tyrosinase (Wolfel et al., Eur J. Immunol. 4:759 (1994) et Brichard et al., Eur. J. Immunol. 26:224 (1996)) ; gp 100 (Kang et al., J. Immunol. 155:1343 (1995), Cox et al., Science 264:716 (1994), et Kawakami et al., J. Immunol. 155:3961 (1995)) ; gp75 (Wang et al., J. Exp. Med. 183: 1131 (1996)), et Mart-1/MelanA (voir brevet US 5,620,886).
De tous ces antigènes, Mart-1/MelanA apparaît comme le meilleur candidat dans une utilisation en immunothérapie, et ce pour plusieurs raisons. D'abord, cet antigène a été identifié à partir de la réponse CTL in vivo des lymphocytes infiltrant le mélanome et non celle, in vitro, des cellules du sang périphérique, ce qui suggérerait une plus grande pertinence de cet antigène dans la réponse naturelle in vivo contre le mélanome (Kawakami et al., J. Exp. Med. 180:347 (1994)). De plus, Mart-1/MelanA est exprimé sur tous les mélanomes examinés, ce qui en fait une cible privilégiée d'une intervention immunothérapique. Enfin, des peptides dérivés de Mart-1/MelanA sont capables d'induire une réponse CTL spécifique chez les patients du mélanome exprimant l'antigène d'histocompatibilité HLA-A2 (Rivoltini et al., J. Immunol. 154:2257 (1995) ; Valmori et al. J. Immunol. 160:1750 (1998)).
HLA-A2 est l'allèle le plus fréquemment exprimé chez les Caucasiens. Les épitopes CTL de Mart-1/MelanA ont été définis pour cet allèle. Le peptide antigénique reconnu par la majorité des lignées CTL humaines comprend les acides aminés 27-35 AAGIGILTN (Kawakami et al., J. Exp. Med. 180:347 (1994)). D'autre part, des études sur l'affinité de la liaison avec HLA-A*0201 et la reconnaissance par des clones CTL ont démontré que le peptide optimal pour ces deux fonctions est le décapeptide 26-35 EAAGIGILTV (Romero et al, J. Immunol. 159:2366 (1997)). Cependant, il apparaît que ces peptides sont faiblement immunogéniques in vitro (Valmori et al. J. Immunol. 160:1750 (1998)) et in vivo (Jaeger et al., Int. J. Cancer 66:162 (1996)). En comparant la séquence des acides aminés des épitopes T de Mart-1/MelanA avec les motifs peptidiques de A*0201 (Rammensee et al., Immunogenetics 41:178 (1995)), il apparaît que les peptides 26-35 et 27-35 ont des résidus d'ancrage non dominants à la position 2 et lient donc faiblement la molécule HLA-A*0201 (Kawakami et al., J. Immunol. 154:3961 (1995)), ce qui pourrait expliquer leur faible immunogénicité. La demande internationale de brevet publiée sous le numéro WO 98/58951 décrit un analogue au peptide 26-35 où l'Alanine en position 2 a été remplacée par une Leucine (séquence que l'on appellera ELA de séquence SEQ ID N° 3). Le peptide hELA, utilisé dans les expériences ci-dessous, est l'objet de la demande de brevet WO 98/58951 propriété de l'Institut Ludwig de Recherche sur le Cancer. hELA est un analogue du décapeptide 26-35 (EAAGIGILTV) de Melan- A MART-1, une protéine exprimée sur les mélanocytes et les mélanomes. Bien que le décapeptide 26-35 de Melan-A/MART-1 soit capable de se lier à la molécule HLA- A0201 (Romero et al., 1997, J. Immunol., 159, 2366-2374), il est faiblement immunogène in vitro et in vivo (Valmori et al., 1998, J. Immunol., 160, 1750-1758). L'analogue hELA a été généré par la substitution du second acide aminé du décapeptide 26-35 de Melan-A MART-1 (une alanine) par une leucine. Le résultat de cette substitution, qui est basée sur une analyse des résidus nécessaire à l'ancrage des peptides à la molécule HLA-A0201, est une reconnaissance plus efficace par les CTL de patients de mélanome et une meilleure immunogénicité in vitro (Valmori et al., 1998, J. Immunol. 160, 1750-1758). Des souris transgéniques HLA-A* 0201/Kb (A2/Kb) de souche C57B1/6 x BDA/2 (Vitiello et al., 1991, J. Exp. Med., 173, 1007- 1015) ont été utilisées dans cette étude pour tester ELA. La molécule MHC de classe I exprimée chez ces souris est une molécule chimérique formée des domaines αl et α2 de la molécule humaine HLA-A0201 (allotype le plus fréquemment retrouvé) et du domaine α3 de la molécule murine Kb.
Le peptide TRP-2 de séquence SEQ ID N° 4 est un octapeptide correspondant aux acides aminés 181-188 (VYDFFVWL) de la tyrosinase-related protein 2 (TRP-2). TRP-2 est exprimé dans les mélanocytes et les mélanomes. Il a été démontré que cet antigène induit des réponses CTL protectrices du mélanome dans les souris C57BL/6 (H-2Kb) (Bloom et al., 1997, J. Exp. Med. 185, 453-459).
A : Génération de CTL anti-Melan-A et anti-TRP-2 après immunisation par rP40 mélangé à un peptide analogue au Melan-A ou TRP-2 Protocole expérimental
Des souris A2/Kb ont reçu par injection sous-cutanée à la base de la queue :
- 50 μg ELA mélangés à 3 ou 300 μg rP40 ;
- 50 μg ELA couplés de façon covalente à 300 μg rP40.
Des souris C57BL/6 ont reçu par injection sous-cutanée à la base de la queue : - 50 μg du peptide TRP-2 (181-188) mélangés à 300 μg rP40. Génération de cellules cytotoxiques effectrices
10 jours après immunisation, les souris sont sacrifiées et les lymphocytes des ganglions drainants sont récupérés pour être stimulés in vitro avec le peptide relevant. Ces lymphocytes (4 à 5 106) sont cultivés en plaque 24 puits en DMEM plus 10 mM HEPES, 10 % SVF et 50 μM β-2-mercaptoéthanol avec 2 à 5 105 cellules EL- 4 A2/Kb ou EL4 irradiées (10 kRads) pré-pulsées 1 h à 37°C avec 1 μM du peptide relevant. Après deux stimulations hebdomadaires, les cellules sont testées pour leur activité cytotoxique. Mesure de l'activité cytotoxique Les cellules EL-4 A2/Kb ou EL4 sont incubées 1 h avec du 51Cr en présence ou non du peptide relevant, lavées puis co-incubées avec les cellules effectrices à différents ratio en plaque 96 puits dans un volume de 200 μl pendant 4 à 6h à 37 °C. Les cellules sont ensuite centrifugées et le relargage de 51Cr est mesuré dans 100 μl de surnageant. Le pourcentage de lyse spécifique est calculé comme suit : % lyse spécifique = (relargage expérimental-relargage spontané) / (relargage total - relargage spontané) X 100. Résultats
Comme le montrent les figures 1A à ID, l' immunisation de souris avec une dose optimale de rP40 (300 μg) en mélange avec hELA (figure IB) ou TRP-2 (figure ID) induit une forte réponse CTL spécifique. Une telle réponse est également observée après immunisation avec rP40 couplée à hELA (figure IC). Par contre, l'immunisation avec le peptide seul ou rP40 seule (résultats non montrés) ou avec le peptide hELA en mélange avec une dose sous-optimale de rP40 (3 μg) n'induit aucune activité CTL (figure 1A). Ces résultats démontrent que la molécule rP40 mélangée ou couplée à des peptides immunogenes permet d'induire une réponse CTL spécifique in vivo, et ce sans l'ajout d'adjuvant.
B : Génération de CTL anti-Melan-A après immunisation par rP40 mélangé à un peptide analogue au Melan-A comparée à un protocole standard d'immunisation Protocole expérimental
Des souris A2/Kb ont reçu : - 50μl d'IFA (adjuvant incomplet de Freud) en injection sous-cutanée à la base de la queue puis 3 semaines après 50μg de hELA en présence de 50μg d'un peptide p30 T helper dérivé de tétanus toxoid (TT) (Panina-Bordignon et al., Eur. J. Immunol., 1989, 19, 2237) adjuvé en IFA. Ce protocole a été décrit pour permettre de générer des CTL anti-peptide (Valmori et al., Eur. J. Immunol. , 1994, 24, 1458) et sert de contrôle positif.
- 50μg de hELA seul ou 300μg de rP40 mélangé ou couplé à 50 μg hELA
Génération de cellules cytotoxiques effectrices
10 jours après la dernière immunisation, les souris sont sacrifiées et les lymphocytes des ganglions drainants sont récupérés pour être stimulés in vitro avec le peptide relevant.
Ces lymphocytes (4 à 5 106) sont cultivés en plaque 24 puits en DMEM plus 10 mM HEPES, 10% SVF et 50 μM β-2-mercaptoethanol avec 2 à 5 105 cellules EL- 4 A2/Kb (cellules murines transfectées avec le gène HLA-A* 0201/Kb) irradiées (10 kRads) pré-pulsées 1 h à 37°C avec lμM du peptide relevant.
Après une, deux ou trois stimulations hebdomadaires, les cellules sont testées pour leur activité cytotoxique.
La mesure de l'activité cytotoxique est effectuée selon la méthode décrite précédemment. Résultats
Une activité CTL anti-hELA est mesurée après immunisation par rP40 couplée à hELA non adjuvé comparable à celle observée après immunisation avec hELA +
P30/IFA (cf. figures 2C et 2D). De même, le mélange rP40 + peptide hELA lui aussi non adjuvé génère des CTL de manière similaire à ce qui est obtenu avec un protocole classique de génération de CTL (cf. figures 2B et 2D).
Aucune activité CTL n'a été détectée après immunisation avec le peptide seul
(cf. figure 2A), ou la protéine rP40 seule (non montrée) indépendamment du jour de stimulation des cellules effectrices. Exemple 5 : Effet antitumoral de l'immunisation par un mélange de rP40 et d'un peptide exprimé par un mélanome de souris
Pour évaluer la capacité de rP40 à générer une réponse CTL antitumorale, la capacité de la protéine rP40 à induire une réponse CTL dirigée contre le peptide de séquence SEQ ID No. 4 (VYDFFVWL) a été testée. Le peptide de séquence SEQ ID N° 4 (VYDFFVWL) est dérivé de la protéine Tyrosinase Related Protein 2 (TRP-2) qui est exprimée par le mélanome B 16F 10 issu de la souris C57BL/6. Ce peptide est immunogène dans cette souche. La croissance des cellules B 16F 10 implantées dans des souris C57BL/6 qui ont été immunisées ou pas avec un mélange de rP40 et du peptide TRP-2 a été ensuite testée. Protocole expérimental
Pour la génération d'une réponse CTL anti-peptide TRP-2, un protocole identique à celui décrit dans l'exemple 4 a été utilisé, sauf qu'ici des souris C57BL/6 ont été utilisées.
Pour les expériences de protection, des souris C57BL/6 ont reçu 2 x 103 cellules du mélanome autologue B 16F 10 en injection sous-cutanée (s.c.) dans le flanc.
Simultanément, ou 4 jours plus tard, certaines de ces souris ont été immunisées en s.c.
(à la base de la queue) avec 50 μg du peptide TRP-2 mélangés à 300 μg de rP40. La croissance de la tumeur a ensuite été mesurée à intervalles réguliers.
Résultats Comme le montre la figure 3 A, l'immunisation avec un mélange de peptide
TRP-2 et de la protéine RP40 est capable de générer une réponse CTL spécifique à ce peptide, ce qui confirme les résultats obtenus avec la peptide hELA (décrits dans l'exemple 4). De plus, cette réponse CTL est associée à une inhibition de la croissance du mélanome B16F10 (figures 3B, 3C et 3D). Il est intéressant de noter que cette protection est significative non seulement quand l'immunisation avec le peptide TRP-2 + rP40 est faite simultanément avec l'implantation de la tumeur (figures 3B et 3D), mais aussi 4 jours l'implantation (figure 3C).
Ces résultats montrent clairement l'effet thérapeutique de l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie, telle que la protéine OmpA de K. pneumoniae associée à un peptide tumoral antigénique pour induire une réponse spécifique de type CTL efficace pour la prévention ou le traitement de cancer, tel que les mélanomes.
Exemple 6 : Génération de CTL anti-OVA après immunisation par rP40 couplée au peptide Ova p257-264
Le peptide Ova p257-264 est un octapeptide correspondant au fragment de la séquence consensus de l'ovalbumine compris entre les acides aminés en position 257 à 264 de la séquence de l'ovalbumine (extrémités comprises). L'ovalbumine est utilisé comme un peptide protecteur vis-à-vis de cellules tumorales exprimant l'ovalbumine.
Protocole expérimental
Des souris C57BL/6 ont reçu par injection sous-cutanée à la base de la queue
200 μg de P40-Ova (β), de billes couplées à l'Ova (O), d'Ova solubilisée (D), d'Ova-BS3 (A) (BS3 pour Bis (succinimidyl) Subérate), de P40 ( ), ou de DT-Ova (•)
(DT pour Diphtérique Toxoïd).
Génération de cellules cytotoxiques effectrices
7 jours après immunisation, les souris sont sacrifiées et les rates sont récupérées. Les cellules de rate (4.107) sont cultivées en flasque en DMEM avec 1,5.106 de cellules E.G7 irradiées (4kRads).
Mesure de l'activité cytotoxique
Les cellules thymomes EL4 puisées ou non avec le peptide OVA ou transfectées avec le gène ova (lignée E.G7) sont incubées avec du 51Cr à 37°C et cultivées avec les cellules effectrices obtenues ci-dessus. Le pourcentage de lyse spécifique est calculé comme décrit à l'exemple 4A. Résultats
Comme le montrent les figures 4 A à 4C, l' immunisation de souris avec la protéine rP40 couplée ou en mélange avec le peptide OVA induit une forte réponse CTL spécifique. Cette réponse est similaire à celle observée après immunisation avec le témoin positif, à savoir les billes couplées à l'ovalbumine (voir figures 4 A et 4B). Par contre, l'immunisation avec l'ovalbumine soluble, ova-BS3 et DT-Ova n'est pas efficace. Ces résultats démontrent que la molécule rP40 couplée à un peptide immunogène permet d'induire une réponse CTL spécifique in vivo, et ce sans l'ajout d'adjuvant.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse T cytotoxique contre un agent infectieux ou une cellule tumorale.
2/ Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre, associé à ladite protéine OmpA d'entérobactérie, un antigène ou un haptène spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale.
3/ Utilisation selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que ledit agent infectieux est une particule virale, une bactérie ou un parasite.
4/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie.
5/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par voie recombinante.
6/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ladite entérobactérie est Klebsiella pneumoniae.
Il Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, comprend : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N° 2 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID N° 2 ; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés d'une séquence telle que définie en a).
8/ Utilisation selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est choisi parmi les peptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques, les lipides ou tout composé capable de diriger spécifiquement la réponse CTL contre ledit agent infectieux ou ladite cellule tumorale.
9/ Utilisation selon l'une des revendications 2 à 8, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé ou mélangé avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments.
10/ Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé par liaison covalente avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments.
11/ Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que le couplage par liaison covalente est un couplage réalisé par synthèse chimique.
12/ Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit antigène ou haptène pour faciliter le couplage chimique. 13/ Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que ledit élément de liaison introduit est un acide aminé.
14/ Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que le couplage entre ledit antigène ou haptène et ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, est réalisé par recombinaison génétique lorsque ledit antigène ou haptène est de nature peptidique.
15/ Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride.
16/ Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que ladite construction nucléique est contenue dans un vecteur, ou dans une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine hybride.
17/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 16, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à éliminer les agents infectieux ou à inhiber la croissance de tumeurs. 18/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 17, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter les maladies infectieuses comprenant les infections virales, bactériennes, fongiques et parasitaires.
19/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 17, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter les cancers.
20/ Utilisation selon la revendication 19, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter les cancers associés à un antigène tumoral.
21/ Utilisation selon les revendications 19 et 20, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir les mélanomes.
22/ Utilisation selon l'une des revendications 1 à 21, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité.
23/ Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que ledit véhicule est un liposome, un vecteur viral contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit antigène ou haptène, ou ladite protéine hybride, ou une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit antigène ou haptène, ou ladite protéine hybride. 24/ Utilisation selon l'une des revendications 15, 16 et 23, caractérisée en ce que ladite construction nucléique ou la construction nucléique contenue dans ledit vecteur ou ladite cellule hôte transformée, comprend une séquence nucléique choisie parmi la séquence SEQ ID N° 1, l'un de ses fragments présentant au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N° 1, ou une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec l'une desdites séquences.
25/ Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins une protéine OmpA d'entérobactérie, ou un de ses fragments, associée par mélange ou par couplage à au moins un antigène ou un haptène associé ou spécifique d'une cellule tumorale. 26/ Composition selon la revendication 25, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie.
27/ Composition selon la revendication 25, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par voie recombinante.
28/ Composition selon l'une des revendications 25 à 27, caractérisée en ce que ladite entérobactérie est Klebsiella pneumoniae.
29/ Composition selon la revendication 28, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, comprend : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N° 2 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID N° 2 ; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés d'une séquence telle que définie en a).
30/ Composition selon l'une des revendications 25 à 29, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est choisi parmi les peptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques, les lipides ou tout composé capable de diriger spécifiquement une réponse CTL contre ladite cellule tumorale.
31/ Composition selon l'une des revendications 25 à 30, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé par liaison covalente avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments. 32/ Composition selon la revendication 31, caractérisée en ce que le couplage par liaison covalente est un couplage réalisé par synthèse chimique.
33/ Composition selon la revendication 32, caractérisée en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit antigène ou haptène pour faciliter le couplage chimique. 34/ Composition selon la revendication 33, caractérisée en ce que ledit élément de liaison introduit est un acide aminé.
35/ Composition selon la revendication 31, caractérisée en ce que le couplage entre ledit antigène ou haptène et ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, est réalisé par recombinaison génétique lorsque ledit antigène ou haptène est de nature peptidique.
36/ Composition selon la revendication 35, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour la protéine hybride obtenue après ledit couplage. 37/ Composition selon la revendication 36, caractérisée en ce que ladite construction nucléique est contenue dans un vecteur, ou dans une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine hybride.
38/ Composition selon l'une des revendications 36 et 37, caractérisée en ce que ladite construction nucléique comprend une séquence nucléique choisie parmi la séquence SEQ ID N° 1, l'un de ses fragments présentant au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ I D N° 1, ou une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence SEQ I D N° 1.
39/ Composition selon l'une des revendications 25 à 38, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité.
40/ Composition selon la revendication 39, caractérisée en ce que ledit véhicule est un liposome, un vecteur viral contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit antigène ou haptène, ou ladite protéine hybride, ou une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit antigène ou haptène, ou ladite protéine hybride.
41/ Composition selon l'une des revendications 25 à 40, caractérisée en ce que ledit milieu pharmaceutiquement acceptable est constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol. 42/ Composition selon l'une des revendications 25 à 41, caractérisée en ce que ladite composition contient en outre un détergent. 43/ Composition selon l'une des revendications 25 à 42, sans autre adjuvant permettant d'induire une réponse CTL.
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