EP1028977B1 - Bifidogene peptide und deren verwendung - Google Patents

Bifidogene peptide und deren verwendung Download PDF

Info

Publication number
EP1028977B1
EP1028977B1 EP98951420A EP98951420A EP1028977B1 EP 1028977 B1 EP1028977 B1 EP 1028977B1 EP 98951420 A EP98951420 A EP 98951420A EP 98951420 A EP98951420 A EP 98951420A EP 1028977 B1 EP1028977 B1 EP 1028977B1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptides
bifidogenic
diseases
microbially
bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
EP98951420A
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
EP1028977A2 (de
EP1028977A4 (de
Inventor
Wolf-Georg Forssmann
Hans-Dieter Zucht
Cornelia Liepke
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE19805385A external-priority patent/DE19805385C1/de
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP1028977A2 publication Critical patent/EP1028977A2/de
Publication of EP1028977A4 publication Critical patent/EP1028977A4/de
Application granted granted Critical
Publication of EP1028977B1 publication Critical patent/EP1028977B1/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
    • A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/06—Anti-spasmodics, e.g. drugs for colics, esophagic dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4732—Casein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/79—Transferrins, e.g. lactoferrins, ovotransferrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1013—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to bifidogenic peptides containing medicaments Peptides according to the invention and the use of the bifidogenic peptides.
  • Milk is known to be beneficial to the health of Infants work. This is often due to the influence of milk on training a typical infant intestinal flora, which is more than 90% Bifidobacterium bifidum exists.
  • WO 90/13642 A discloses the sequence of human lactoferrin.
  • the object of the present invention is to provide peptides which have a have a positive impact on the intestinal flora.
  • the peptides according to the invention have an antimicrobial action against bacteria which are in the natural baby intestinal flora does not occur or only occurs in small quantities and promote the growth of desired bacteria such as bifidobacteria, by promoting the growth of bifidobacteria more than other bacteria or only selectively inhibit the unwanted bacteria.
  • desired bacteria such as bifidobacteria
  • bifidogenic designated giving bifidobacteria a growth advantage is called bifidogenic designated.
  • the peptides according to the invention have the following amino acid sequence: R 1 -EVAARARVVW-R 2 , R 1 -ARRARVVWAAVG-R 2 , R 1 -ARRARVVWCAVGE-R 2 , wherein R 1 , R 3 independently of one another represent NH 2 , an amino acid or a peptide with up to 100 amino acids and R 2 , R 4 independently of one another represent COOH, CONH 2 , an amino acid or a peptide with up to 100 amino acids as well as the amidated, acetylated, sulfated, phosphorylated, glycosylated, oxidized derivatives or fragments with bifidogenic properties and peptides which can be obtained by combining the peptides, fragments or derivatives by means of chemical linkage.
  • R 1 , R 2 , R 3 , R 4 preferably have a length of up to 50, more preferably up to 20 and most preferably a length of up to 10 amino acids.
  • the peptides according to the invention can be purified from cow's milk or Human milk can be obtained. Alternatively, however, the expression is in genetically modified organisms or the production by chemical Peptide synthesis possible.
  • nucleic acids that are useful for the bifidogenic Encode peptides.
  • peptides and / or nucleic acids according to the invention can be used together with Pharmaceutical customary auxiliaries may be contained in pharmaceuticals.
  • Pharmaceutical customary auxiliaries may be contained in pharmaceuticals.
  • galenical preparations and application forms are preferred are selected in which the peptides reach the site of action in an undegraded manner.
  • the peptides according to the invention were preferably used in amounts of 0.1 to 100 mg / kg body weight used. Effective amounts of nucleic acid are for example 0.01 mg to 100 mg / kg body weight. The amount is preferably in the range of 1 to 10 mg / kg body weight for the peptides and nucleic acids.
  • the peptides according to the invention can also be combined with nutrients in Food may be included.
  • peptides according to the invention and / or those against Peptides directed antibodies along with other excipients also in Diagnostic agents may be included.
  • the peptides and nucleic acids according to the invention are suitable for treatment diseases caused by microbial colonization, such as infections, Inflammation, microbially induced tumors, microbially induced degenerative diseases, diarrheal diseases, colic, deviation of the Oral, intestinal and vaginal flora, caries.
  • microbial colonization can for example through bacteria, fungi, yeasts, protists, viruses, mycoplasmas, Filaria and / or plasmodia.
  • the peptides according to the invention are also suitable as excipients in the Food preparation in the sense of fermentation aids.
  • two or more peptides be common are used or peptides are used that have two or more of have peptide sequences according to the invention.
  • the different Spectrum of action of the individual substances or substances, the individual sequences or Having peptides according to the invention allows, in the presence of Resistance of microorganisms through a suitable combination of Sequences or a combination of the individual substances To achieve inhibition of unwanted microorganisms.
  • HPLC fractions were used with E. coli K12. The test is carried out in 3 g / l Tryptic Soy broth (Sigma) as follows:
  • Peptides to be tested were made into a test solution consisting of 200 ml 50% Elliker broth are placed in 96-well cell culture plates and with an inoculum inoculated with 20 ml of a diluted bacterial suspension. The photometric Absorption of the inoculum was 0.05 measured at 550 nm. The growth the bacteria under the influence of the peptides was also removed after 16 hours determined photometrically in the ELISA reader and manually determined microscopically. N-acetylglucosamine served as a positive control. For this test only Bifidus cultures are used which react to N-acetylglucosamine. To In some passages, bifidobacteria lose this property, which can then are no longer used for this growth test.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft bifidogene Peptide, Arzneimittel enthaltend die erfindungsgemäßen Peptide sowie die Verwendung der bifidogenen Peptide.
Von Milch ist bekannt, dass sie fördernd auf den Gesundheitszustand von Säuglingen wirkt. Dies wird vielfach auf den Einfluss der Milch auf die Ausbildung einer säuglingstypischen Darmflora zurückgeführt, die zu mehr als 90% aus Bifidobacterium bifidum besteht.
WO 90/13642 A offenbart die Sequenz des humanen Lactoferrins.
In Bellamy e.a.: "Antibacterial spectrum of lactoferricin B, a potent bactericidal peptide derived from the N-terminal region of bovine lactoferrin", Journal of Applied Bacteriology, Bd. 73, Nr. 6, 1992, Seiten 472 bis 479 und Odell e.w. et al.: " Antibacterial activity of peptides homologous to a loop region in human lactoferrin", FEBS Letters, Bd. 382, Nr. 1 bis 2, 1996, Seiten 175 bis 178 wird die antibacterielle Aktivität der Peptide Lactoferricin B und H, die aus bovinen oder humanen Lactoferrinen stammen, offenbart.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es Peptide bereitzustellen, die einen positiven Einfluss auf die Darmflora haben.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch Peptide mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1.
Die erfindungsgemäßen Peptide wirken antimikrobiell gegen Bakterien, die in der natürlichen Säuglingsdarmflora nicht oder nur in geringen Mengen vorkommen und fördern das Wachstums von erwünschten Bakterien wie Bifidobakterien, indem sie die Bifidobakterien im Wachstum stärker als andere Bakterien fördern oder nur die nichterwünschten Bakterien selektiv hemmen. Diese Eigenschaft, Bifidobakterien einen Wachstumsvorteil zu verschaffen, wird als bifidogen bezeichnet.
Die erfindungsgemäßen Peptide weisen die folgende Aminosäuresequenz auf: R1-EVAARARVVW-R2, R1-ARRARVVWAAVG-R2, R1-ARRARVVWCAVGE-R2,
Figure 00020001
worin
R1, R3 unabhängig voneinander NH2, eine Aminosäure oder ein Peptid mit bis 100 Aminosäuren darstellen und
R2, R4 unabhängig voneinander COOH, CONH2, eine Aminosäure oder ein Peptid mit bis zu 100 Aminosäuren darstellen
sowie die amidierten, acetylierten, sulfatierten, phosphorylierten, glycosylierten, oxydierten Derivate oder Fragmente mit bifidogenen Eigenschaften und Peptide, die durch Kombination der Peptide, Fragmente oder Derivate mittels chemischer Verknüpfung erhältlich sind.
Bevorzugt weisen R1, R2, R3, R4 eine Länge von bis zu 50, mehr bevorzugt von bis zu 20 und am meisten bevorzugt eine Länge von bis zu 10 Aminosäuren auf.
Die erfindungsgemäßen Peptide können durch Aufreinigung aus Kuhmilch oder Humanmilch erhalten werden. Alternativ ist jedoch auch die Expression in gentechnisch veränderten Organismen oder die Herstellung durch chemische Peptidsynthese möglich.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind Nucleinsäuren, die für die bifidogenen Peptide kodieren.
Die erfindungsgemäßen Peptide und/oder Nucleinsäuren können zusammen mit pharmazeutisch üblichen Hilfsstoffen in Arzneimitteln enthalten sein. Dazu werden bevorzugt galenische Zubereitungen eingesetzt und Applikationsformen gewählt, bei denen die Peptide undegradiert an den Wirkort gelangen.
Vorzugsweise wurden die erfindungsgemäßen Peptide in Mengen von 0,1 bis 100 mg/kg Körpergewicht eingesetzt. Wirksame Nucleinsäuremengen sind beispielsweise 0,01 mg bis 100 mg/kg Körpergewicht. Bevorzugt liegt die Menge im Bereich von 1 bis 10 mg/kg Körpergewicht für die Peptide und Nucleinsäuren.
Die erfindungsgemäßen Peptide können auch zusammen mit Nährstoffen in Nahrungsmittel enthalten sein.
Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Peptide und/oder die gegen die Peptide gerichteten Antikörper zusammen mit weiteren Hilfsstoffen auch in Diagnostikmittel enthalten sein.
Die erfindungsgemäßen Peptide und Nukleinsäuren eignen sich zur Behandlung von durch mikrobielle Fehlbesiedlungen bedingte Erkrankungen wie Infektionen, Entzündungen, mikrobiell induzierten Tumoren, mikrobiell bedingten degenerativen Erkrankungen, Durchfallerkrankungen, Koliken, Abweichung der Mund-, Darm- und Vaginalflora, Karies. Die mikrobielle Fehlbesiedlung kann beispielsweise durch Bakterien, Pilze, Hefen, Protisten, Viren, Mycoplasmen, Filarien und/oder Plasmodien bedingt sein.
Die erfindungsgemäßen Peptide eignen sich auch als Hilfsstoff in der Nahrungsmittelzubereitung im Sinne von Fermentationshilfen.
Es wird insbesondere bevorzugt, dass zwei oder mehr Peptide gemeinsam eingesetzt werden oder Peptide eingesetzt werden, die zwei oder mehr der erfindungsgemäßen Peptidsequenzen aufweisen. Das unterschiedliche Wirkungsspektrum der Einzelstoffe bzw. Stoffe, die Einzelsequenzen oder erfindungsgemäße Peptide aufweisen, erlaubt es, beim Vorliegen von Resistenzen von Mikroorganismen durch eine geeignete Kombination von Sequenzen oder durch eine Kombination der Einzelsubstanzen eine optimale Hemmung der unerwünschten Mikroorganismen zu erzielen.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern: Referenzbeispiel 1 Behandlung von Milch
Humane Milch wurde mit Pepsin (20 mg/g Protein) versetzt, nachdem sie mit HCl auf einen pH von 3,5 eingestellt wurde. Die enzymatische Reaktion wurde für zwei Stunden bei 37°C inkubiert und durch Kochen für fünf Minuten gestoppt. Anschließend wurde zentrifugiert (20 min, 60.000 g bei 4°C) und das Milchfett abgeschöpft. Die verbliebene Lösung wurde mit 0,1% TFA versetzt und erneut zentrifugiert, um ausgefallene hochmolekulare Proteine abzutrennen.
HPLC Reinigung eines bifidogenen Peptides aus Milch
Für die Reinigung von bifidogenen Peptiden aus Milch müssen verschiedene HPLC Trennverfahren miteinander kombiniert werden, um eine möglichst reine Darstellung über eine optimale Trennleistung zu erzielen und inaktive, unerwünschte Bestandteile abzutrennen. Die jeweiligen Proben, die nach jedem Trennungsschritt entstehen, müssen in zwei Testsystemen getestet werden, d.h. ein Wachstumstest mit Bifidobakterien in Kombination mit einem Wachstumstest mit E. coli als Target (siehe Beispiele 3 und 4). Notwendig für die Reinigung ist die Kombination von mindestens einem Reverse-Phase Chromatographieschritt (bevorzugt von zwei Reverse-Phase Chromatographischritten) und der Einsatz einer Kationenaustausch-HPLC-Trennung. In den Biotest muss die jeweilige Probe salzarm eingesetzt werden, um ein möglichst optimales Screeningergebnis zu erhalten.
Der erste Trennschritt wurde mit Hilfe einer Parcosil-C18 Säule (1 x 12,5 cm, 100 Å, Biotek, Heidelberg, Deutschland) durchgeführt.
Puffer A:
0,1% TFA
Puffer B:
Acetonitril mit 0,1% TFA
Gradient:
0 bis 60% B in 45 Minuten
Fluss:
2 ml / min
Detektion 280 nm (siehe Figur 1)
Rechromatografie von Fraktion 23 mit der gleichen Säule und einem flacheren Gradient (siehe Bild):
Puffer A:
0,1% TFA
Puffer B :
Acetonitril mit 0,1% TFA
Gradient:
0 bis 20% B in 5 Minuten 20 bis 50% B in 45 Minuten
Detektion:
214 nm (siehe Figur 2)
Rechromatografie von Fraktion 16 aus dem vorangegangenem Trennschritt mit der gleichen Säule, aber anderem Elutionsmittel, um die Selektivität bei der Trennung zu verändern.
Puffer A:
0,1% TFA
Puffer B:
0,1% TFA in Methanol
Gradient:
0 bis 40% B in 5 Minuten 40 bis 70% B in 45 Minuten
Detektion:
214 nm (siehe Figur 3)
Rechromatografie der aktiven Fraktion 21 mit einer Kationenaustausch HPLC:
Säule:
Parcosil Pepkat, 4 × 50 mm, 300 A, 5 mm, Biotek, Heidelberg
Puffer A:
10 mM Phosphatpuffer pH 4,5
Puffer B:
Puffer A mit 1 M NaCl
Fluss:
0,75 ml/min
Gradient:
0 bis 15% B in 5 Minuten 15 bis 50% B in 35 Minuten
Detektion:
214 nm (siehe Figur 4)
Die erhaltenen Fraktionen wurden jede einzeln in einem kurzen Reverse Phase HPLC Lauf entsalzt, bevor sie zum Test auf antimikrobielle und bifidogene Aktivität zugeführt wurde.
Durch Massenspektrometrie und Aminosäuresequenzierung wurden die folgenden Peptide identifiziert:
  • Fraktion 9 enthielt die reine, bifidogene Komponente
    Figure 00060001
  • (caseinK-63-117)
  • Fraktion 10 enthält die bifidogene Komponente
    Figure 00060002
  • (neutrophil-lactoferrin-20-67)
    • und Fraktion 11 enthält die bifidogene Komponente mit einer Adduktmasse von +16 was darauf hindeutet, dass es sich um ein Oxidationsprodukt handelt (vermutlich ist ein Methionin oxidiert).
    Beide Peptide und das Oxidationsprodukt haben eine bifidogene Aktivität.
    Referenzbeispiel 2 Nachweis der wachstumsregulierenden Aktivität auf E. coli
    Fraktionen aus der HPLC wurden mit E. coli K12 eingesetzt. Der Test wird in 3 g/l Tryptic Soy broth (Sigma) folgendermaßen durchgeführt:
    Für jeden Assay wurden Kulturen von E. coli K12 frisch in Tryptic Soy broth (Firma Sigma, Deisenhofen, Deutschland, Bestellnummer T8907) angeimpft (Difco Manual, 10th Ed., S. 1027). Die Inkubation dieser Bakterien erfolgte immer unter aeroben Bedingungen bei 37°C für 16 Stunden. Zu testende Peptide wurden zu einer Testlösung, bestehend aus 200 ml 3 g/l Tryptic Soy broth, in 96-Loch Zellkulturplatten gegeben und mit einem Inokulum von 20 ml einer verdünnten Bakteriensuspension angeimpft. Die photometrische Absorption des Inokulums betrug 0,05, gemessen bei 500 nm. Das Wachstum der Bakterien unter dem Einfluss der Peptide wurde nach 16 Stunden ebenfalls photometrisch im ELISA-Reader bestimmt und manuell mikroskopisch bestimmt.
    Referenzbeispiel 3 Nachweis der wachstumsregulierenden Aktivität auf Bifidobacterium bifidum
    Für jeden Assay wurden Kulturen von Bifidobacterium bifidum ATCC 29521 frisch in Elliker broth (Difco, Detroit, USA) (Tryptone 20 g, Yeast Extract (Hefeextrakt) 5 g, Gelatin (Gelatine) 2,5 g, Dextrose 5 g, Lactose (Laktose) 5 g, Saccharose 5 g, Sodium Chloride (NaCl) 4 g, Sodium-Acetate (Natriumacetat) 1,5 g, Ascorbic Acid (Ascorbinsäure) 0,5 g) angeimpft. Die Inkubation dieser Bakterien erfolgte immer unter anaeroben Bedingung bei 37°C für 16 bis 18 Stunden. Zu testende Peptide wurden zu einer Testlösung bestehend aus 200 ml 50% Elliker broth in 96-Loch Zellkulturplatten gegeben und mit einem Inokulum von 20 ml einer verdünnten Bakteriensuspension angeimpft. Die photometrische Absorption des Inokulums betrug 0,05 gemessen bei 550 nm. Das Wachstum der Bakterien unter dem Einfluss der Peptide wurde nach 16 Stunden ebenfalls photometrisch im ELISAReader bestimmt und manuell mikroskopisch bestimmt. Als Positivkontrolle diente N-acetylglucosamin. Für diesen Test können nur Bifidus-Kulturen eingesetzt werden, die auf N-Acetylglucosamin reagieren. Nach einigen Passagen verlieren Bifidobakterien diese Eigenschaft, diese können dann für diesen Wachstumstest nicht mehr eingesetzt werden.
    SEQUENZPROTOKOLL
  • (1) ALLGEMEINE ANGABEN:
  • (i) ANMELDER:
  • (A) NAME: Wolf-Georg Forssmann
  • (B) STRASSE: Feodor-Lynen-Strasse 31
  • (C) ORT: Hannover
  • (E) LAND: Deutschland
  • (F) POSTLEITZAHL: 30625
  • (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Bifidogene Peptide
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 24
  • (iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG:
  • (A) DATENTRÄGER: Floppy disk
  • (B) COMPUTER: IBM PC compatible
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPA)
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 10 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: nicht bekannt
  • (D) TOPOLOGIE: nicht bekannt
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
    Figure 00080001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: nicht bekannt
  • (D) TOPOLOGIE: nicht bekannt
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
    Figure 00080002
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 13 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: nicht bekannt
  • (D) TOPOLOGIE: nicht bekannt
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
    Figure 00090001
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 22:
  • (i) SEQUENZKENNZEICHEN:
  • (A) LÄNGE: 12 Aminosäuren
  • (B) ART: Aminosäure
  • (C) STRANGFORM: nicht bekannt
  • (D) TOPOLOGIE: nicht bekannt
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: Peptid
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 22:
    Figure 00090002

    • Claims (5)

    1. Peptide ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: R1-EVAARARVVW-R2, R1-ARRARVVWAAVG-R2, R1-ARRARVVWCAVGE-R2,
      Figure 00100001
      worin
      R1, R3 unabhängig voneinander NH2, eine Aminosäure oder ein Peptid mit bis 100 Aminosäuren darstellen und
      R2, R4 unabhängig voneinander COOH, CONH2, eine Aminosäure oder ein Peptid mit bis zu 100 Aminosäuren darstellen
      sowie die amidierten, acetylierten, sulfatierten, phosphorylierten, glycosylierten, oxydierten Derivate oder Fragmente mit bifidogenen Eigenschaften und Peptide, die durch Kombination der Peptide, Fragmente oder Derivate mittels chemischer Verknüpfung erhältlich sind.
    2. Peptide gemäß Anspruch 1 mit den Seq. ID Nr. 8, 14, 16 und 22.
    3. Arzneimittel enthaltend mindestens ein Peptid gemäß Anspruch 1 oder 2.
    4. Verwendung von Peptiden gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von durch mikrobielle Fehlbesiedlungen bedingten Erkrankungen beispielsweise durch Bakterien, Pilze, Hefen, Protisten, Viren, Mycoplasmen, Filarien, Plasmodien, wie Infektionen, Entzündungen, mikrobiell induzierten Tumoren, mikrobiell bedingten degenerativen Erkrankungen, Durchfallerkrankungen, Koliken, Abweichung der Mund-, Darm- und Vaginalflora, Karies.
    5. Verwendung von Nukleinsäuren kodierend für die im Anspruch 1 oder 2 genannten Peptide zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von durch mikrobielle Fehlbesiedlungen bedingten Erkrankungen beispielsweise durch Bakterien, Pilze, Hefen, Protisten, Viren, Mycoplasmen, Filarien, Plasmodien, wie Infektionen, Entzündungen, mikrobiell induzierten Tumoren, mikrobiell bedingten degenerativen Erkrankungen, Durchfallerkrankungen, Koliken, Abweichung der Mund-, Darm- und Vaginalflora, Karies.
    EP98951420A 1997-09-16 1998-09-16 Bifidogene peptide und deren verwendung Expired - Lifetime EP1028977B1 (de)

    Applications Claiming Priority (5)

    Application Number Priority Date Filing Date Title
    DE19740604 1997-09-16
    DE19740604 1997-09-16
    DE19805385A DE19805385C1 (de) 1998-02-11 1998-02-11 Bifidogene Peptide
    DE19805385 1998-02-11
    PCT/EP1998/005899 WO1999014231A2 (de) 1997-09-16 1998-09-16 Bifidogene peptide und deren verwendung

    Publications (3)

    Publication Number Publication Date
    EP1028977A2 EP1028977A2 (de) 2000-08-23
    EP1028977A4 EP1028977A4 (de) 2001-06-20
    EP1028977B1 true EP1028977B1 (de) 2003-11-26

    Family

    ID=26040009

    Family Applications (1)

    Application Number Title Priority Date Filing Date
    EP98951420A Expired - Lifetime EP1028977B1 (de) 1997-09-16 1998-09-16 Bifidogene peptide und deren verwendung

    Country Status (7)

    Country Link
    US (1) US6849593B1 (de)
    EP (1) EP1028977B1 (de)
    JP (1) JP2001516570A (de)
    AT (1) ATE255130T1 (de)
    DE (1) DE59810294D1 (de)
    ES (1) ES2212357T3 (de)
    WO (1) WO1999014231A2 (de)

    Families Citing this family (9)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    US6399570B1 (en) * 1999-02-05 2002-06-04 Agennix, Inc. Antimicrobial/endotoxin neutralizing polypeptide
    SE9901773D0 (sv) * 1999-05-17 1999-05-17 Nicklas Stroemberg Förebyggande av karies i tänderna
    AU4486501A (en) * 2000-03-27 2001-10-08 Pharming Intellectual Property Bv High dosage parenteral administration of lactoferrin
    PL363153A1 (en) 2000-06-16 2004-11-15 Hercules Incorporated Chemically-modified antimicrobial peptides, compositions and methods of production and use
    US20040235788A1 (en) * 2003-04-04 2004-11-25 Aliakbar Mobasseri Prebiotic compositions comprising fructans
    EP2382874A1 (de) * 2003-06-23 2011-11-02 Nestec S.A. Aminosäureergänzung für ein gesundes mikrobiotisches Ökosystem
    DE102007030904A1 (de) * 2007-07-03 2009-02-05 Pharis Biotec Gmbh Humanes zirkulierendes antivirales Albumin-Fragment (ALB-408) und seine Verwendung
    ES2671009T3 (es) 2011-12-19 2018-06-04 Morinaga Milk Industry Co., Ltd. Promotor de la proliferación de bifidobacterium
    RU2700881C2 (ru) * 2014-08-04 2019-09-23 Онкотерапи Сайенс, Инк. Пептид, полученный из urlc10, и содержащая его вакцина

    Family Cites Families (3)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Publication number Priority date Publication date Assignee Title
    IL94183A (en) 1989-05-05 2003-09-17 Baylor College Medicine cDNA SEQUENCE CODING FOR HUMAN LACTOFERRIN PROTEIN OR PORTION THEREOF AND LACTOFERRIN PROTEIN PRODUCED FROM SAID SEQUENCE
    JPH06239888A (ja) * 1993-02-18 1994-08-30 Kanebo Ltd 新規ペプチド及び鎮静剤並びに精神安定用食品
    JPH10505828A (ja) * 1994-09-16 1998-06-09 アボツト・ラボラトリーズ ヒトロタウイルス感染の阻害

    Non-Patent Citations (1)

    * Cited by examiner, † Cited by third party
    Title
    ODELL E.W. ET AL: "Antibacterial activity of peptides homologous to a loop region in human lactoferrin", FEBS LETTERS, vol. 382, no. 1-2, 1996, pages 175 - 178 *

    Also Published As

    Publication number Publication date
    WO1999014231A3 (de) 1999-07-08
    WO1999014231A2 (de) 1999-03-25
    DE59810294D1 (de) 2004-01-08
    EP1028977A2 (de) 2000-08-23
    US6849593B1 (en) 2005-02-01
    ATE255130T1 (de) 2003-12-15
    JP2001516570A (ja) 2001-10-02
    EP1028977A4 (de) 2001-06-20
    ES2212357T3 (es) 2004-07-16

    Similar Documents

    Publication Publication Date Title
    DE69220679T2 (de) Antibakterielles mittel und behandlung von gegenständen mit diesem
    DE3856588T2 (de) Biologisch-aktive Bakterizide/permeabilitätserhöhende Proteinbruchstücke
    DE60215461T2 (de) Serpin von bifidobakterien
    DE69129395T2 (de) Antimikrobielle Peptide
    DE69732871T2 (de) Basisches Protein Zusammensetzung, basisches Peptid Zusammensetzung und deren Verwendung
    DE69520088T2 (de) Interferon-gamma-induzierendes Polypeptid monoklonal Antikörper, und Zusammensetzung für Interferon-gamma gebunden Krankheiten
    DE68916932T2 (de) Antimikrobielle peptide, zusammensetzungen, die diese enthalten, und verwendungen daraus.
    DE69920877T2 (de) Antimikrobiell wirksame peptide
    DE69224524T2 (de) Antimikrobielle breitspektrum-verbindungen und verfahren zu deren verwendung
    DE3877547T2 (de) Basisches protein phospholipase a2 aus dem gift der schlangen aus der familie der elapiden, deren aminosaeuresequenz, derivate und fragmente dieses proteins, verfahren um es zu erhalten, therapeutische kompositionen und diagnosemittel, alle dieses protein enthaltend und/oder dessen derivate und/oder dessen fragmente.
    DE69007831T2 (de) Bioaktives Produkt; Zusammensetzungen und Stoffe, die dieses bioaktive Produkt enthalten.
    DE69733097T2 (de) Mittel zur Verbesserung der Knochenbildung und zur Inhibierung der Knochenresorption
    EP0151246A2 (de) Neue Polypeptide mit alpha-Amylase-hemmender Wirkung, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und pharmazeutische Präparate
    DE60219808T2 (de) Ein löslicher toll-ähnlicher rezeptor
    DE60034879T2 (de) Lantibiotikum
    DE3587526T2 (de) Serinproteaseinhibitoren und isolierungsverfahren dazu.
    DE602004005203T2 (de) Antibiotikum 107891, dessen Faktoren A1 und A2, pharmazeutisch annehmbare Salzeund Zusammensetzungen und Verwendung davon
    EP1028977A2 (de) Bifidogene peptide und deren verwendung
    DE602004008051T2 (de) Aus einer bifidobakterien-kultur gewonnener immunomodulator und diesen enthaltende zusammensetzungen
    EP0250000B1 (de) Neue Polypeptide, ihre Herstellung und ihre Verwendung
    DD222895A5 (de) Verfahren zur herstellung eines hypotriglyceridemisch aktiven polysaccharids
    DE19805385C1 (de) Bifidogene Peptide
    EP0286869A1 (de) Verfahren zur Herstellung von Zellwandkomponenten aus Halobakterien und deren Verwendung als Arzneimittel
    DE69518934T2 (de) Antibiotikum WAP-8294A, Verfahren zu seiner Herstellung und antibakterielle Zusammensetzung
    DE4444753C2 (de) Antibiotisch wirksame Peptide aus der bovinen Milch, deren Gewinnung und Verwendung

    Legal Events

    Date Code Title Description
    PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

    Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

    17P Request for examination filed

    Effective date: 20000311

    AK Designated contracting states

    Kind code of ref document: A2

    Designated state(s): AT BE CH DE ES FR GB IE IT LI NL

    RTI1 Title (correction)

    Free format text: BIFIDUS STIMULATING PEPTIDES AND THEIR USES

    RTI1 Title (correction)

    Free format text: BIFIDUS STIMULATING PEPTIDES AND THEIR USES

    17Q First examination report despatched

    Effective date: 20010720

    GRAH Despatch of communication of intention to grant a patent

    Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOS IGRA

    RTI1 Title (correction)

    Free format text: BIFIDUS STIMULATING PEPTIDES AND THEIR USES

    RIC1 Information provided on ipc code assigned before grant

    Ipc: 7A 61P 31/00 B

    Ipc: 7A 61K 38/47 B

    Ipc: 7A 61K 38/38 B

    Ipc: 7A 61K 38/40 B

    Ipc: 7A 61K 38/17 B

    Ipc: 7A 61K 38/08 B

    Ipc: 7A 61K 38/07 B

    Ipc: 7G 01N 33/68 B

    Ipc: 7C 12N 15/12 B

    Ipc: 7C 07K 16/04 B

    Ipc: 7C 07K 7/06 B

    Ipc: 7C 07K 5/103 B

    Ipc: 7A 23L 1/305 B

    Ipc: 7C 12N 9/36 B

    Ipc: 7C 07K 14/705 B

    Ipc: 7C 07K 14/765 B

    Ipc: 7C 07K 14/47 B

    Ipc: 7C 07K 14/79 A

    RTI1 Title (correction)

    Free format text: BIFIDUS STIMULATING PEPTIDES AND THEIR USES

    GRAS Grant fee paid

    Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR3

    GRAA (expected) grant

    Free format text: ORIGINAL CODE: 0009210

    AK Designated contracting states

    Kind code of ref document: B1

    Designated state(s): AT BE CH DE ES FR GB IE IT LI NL

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: NL

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

    Effective date: 20031126

    Ref country code: IE

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

    Effective date: 20031126

    REG Reference to a national code

    Ref country code: GB

    Ref legal event code: FG4D

    Free format text: NOT ENGLISH

    REG Reference to a national code

    Ref country code: CH

    Ref legal event code: EP

    REF Corresponds to:

    Ref document number: 59810294

    Country of ref document: DE

    Date of ref document: 20040108

    Kind code of ref document: P

    REG Reference to a national code

    Ref country code: IE

    Ref legal event code: FG4D

    Free format text: GERMAN

    GBT Gb: translation of ep patent filed (gb section 77(6)(a)/1977)

    Effective date: 20040310

    NLV1 Nl: lapsed or annulled due to failure to fulfill the requirements of art. 29p and 29m of the patents act
    REG Reference to a national code

    Ref country code: IE

    Ref legal event code: FD4D

    REG Reference to a national code

    Ref country code: ES

    Ref legal event code: FG2A

    Ref document number: 2212357

    Country of ref document: ES

    Kind code of ref document: T3

    ET Fr: translation filed
    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: AT

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20040916

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: LI

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20040930

    Ref country code: CH

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20040930

    Ref country code: BE

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20040930

    PLBE No opposition filed within time limit

    Free format text: ORIGINAL CODE: 0009261

    STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

    Free format text: STATUS: NO OPPOSITION FILED WITHIN TIME LIMIT

    26N No opposition filed

    Effective date: 20040827

    BERE Be: lapsed

    Owner name: *FORSSMANN WOLF-GEORG

    Effective date: 20040930

    REG Reference to a national code

    Ref country code: CH

    Ref legal event code: PL

    PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: GB

    Payment date: 20050902

    Year of fee payment: 8

    PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: FR

    Payment date: 20050920

    Year of fee payment: 8

    PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: ES

    Payment date: 20050927

    Year of fee payment: 8

    PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: DE

    Payment date: 20051026

    Year of fee payment: 8

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: DE

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20070403

    GBPC Gb: european patent ceased through non-payment of renewal fee

    Effective date: 20060916

    REG Reference to a national code

    Ref country code: FR

    Ref legal event code: ST

    Effective date: 20070531

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: GB

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20060916

    REG Reference to a national code

    Ref country code: ES

    Ref legal event code: FD2A

    Effective date: 20060918

    BERE Be: lapsed

    Owner name: *FORSSMANN WOLF-GEORG

    Effective date: 20040930

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: ES

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20060918

    PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: IT

    Payment date: 20070925

    Year of fee payment: 10

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: FR

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20061002

    PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

    Ref country code: IT

    Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

    Effective date: 20080916