EP0572641A1 - Mittel zur stimulierung der teilungsaktivität tierischer zellen - Google Patents

Mittel zur stimulierung der teilungsaktivität tierischer zellen

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EP0572641A1
EP0572641A1 EP19930902113 EP93902113A EP0572641A1 EP 0572641 A1 EP0572641 A1 EP 0572641A1 EP 19930902113 EP19930902113 EP 19930902113 EP 93902113 A EP93902113 A EP 93902113A EP 0572641 A1 EP0572641 A1 EP 0572641A1
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EP
European Patent Office
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cells
gene
recombinant
region
nucleotides
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP19930902113
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English (en)
French (fr)
Inventor
Michael Strauss
Andre Lieber
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Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
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    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates

Definitions

  • the invention relates to a means for stimulating the
  • Immortal cell lines can either be obtained directly from certain tumors or can be derived from primary cells that have been isolated from certain tissues.
  • the spontaneous emergence of an immortal cell line is an extremely rare event, since at least two mutations are probably required for this.
  • tumor viruses have therefore often been used as inducers of immortalization.
  • these had the disadvantage that they also caused a frequently undesirable tumorigenic change in the cells.
  • DD-WP 265165 it has already been proposed to use the recombinants with the gene for the large T antigen of the polyomavirus to improve the immortalization process. In principle, this solved the problem of effective immortalization without simultaneous tumorigenic changes.
  • the speed of cell division is usually not affected by this method.
  • REPLACEMENT LEAF Many animal and human cells have a dividing potential limited to approx. 50-60 cell divisions without immortalization.
  • the aim of the invention is to create and use an agent for the general stimulation of the division activity of animal and human cells in culture, both with regard to the utilization of the natural division potential and with regard to the speed of the cell cycle.
  • the agent according to the invention is characterized in that it contains as active substance one or more nucleotide sequences with a complementary sequence (antisense) to certain areas of the mRNA of tumor suppressor genes or other genes which have a negative effect on cell division activity.
  • the antisense nucleotide sequence preferably consists of a synthetic oligonucleotide with a length of at least 15 nucleotides, a length of 18-21 nucleotides being preferred.
  • the oligonucleotide must be in a nuclease resistant form, with the phosphothioate form being particularly useful.
  • Sequences which are complementary to a region of the 5 ′ end, the region around the start codon, a region of an exon or a region at an intron-exon junction of the gene in question are primarily used as antisense nucleotide sequences.
  • Complementary sequences to the tumor suppressor gene retinoblastoma gene, p53 gene or the E-cadherin are preferably selected.
  • Examples of specific sequences of the active substance in the agent according to the invention are 3'-CAGTACGGCGGGTTTTGG-5 'and 3'-AGCAAGTGAAAATGACTC-5'.
  • Oligonucleotides sterilized by alcohol precipitation, in sterile dist. Dissolved water and added in a concentration of 5 - 30 M in the culture medium without serum. The oligonucleotides can also be mixed with lipofectin in order to achieve an even more effective uptake by the cells. The cells are incubated with the oligonucleotide-containing medium for several days. The number of cells is checked daily in parallel batches
  • HEL primary human lung fibroblasts
  • Oligonucleotides for at least 7 days Within 10 days, at least 3 times the number of cells becomes with this cell type
  • Pairing with the antisense oligonucleotide is degraded.
  • the immunological protein detection shows that at the latest 3 days after the start of the treatment with oligonucleotides
  • the treated culture is left in the confluent for more than 7 days
  • the agent according to the invention makes it possible to significantly increase the number of cell divisions per unit time. Its application also enables the cultivation of cells that cannot otherwise be cultivated. This enables great progress in both biotechnological substance production and in basic biological medical research.
  • a further embodiment of the invention consists in not adding the antisense nucleotide sequence to stimulate cell growth, but in generating it in the cell to be cultivated. This is achieved in that a recombinant with an expressible antisense sequence is introduced into the cells by transfection.
  • the preferred sequence consists of 50-500 nucleotides.
  • the recombinant according to the invention contains the antisense nucleotide sequence in the reading direction after a strong promoter.
  • the sequence preferably consists of complementary sequences of the tumor suppressor gene retinoblastoma gene, p53 gene or E-cadherin.
  • a particularly suitable sequence consists of the first 360 nucleotides of the mRNA coding sequence of the retinoblastoma gene.
  • the T7 promoter in combination with its homologous RNA polymerase is particularly suitable as a promoter for the recombinant.
  • a recombinant is produced, a selected sequence, preferably 50-500 nucleotides long, being cloned from the relevant tumor suppressor gene in antisense orientation behind a strong promoter.
  • This recombinant is preferably transfected into the relevant cells together with a selection marker and the gene of T7 RNA polymerase according to methods known per se. After selection for the presence of the marker (e.g. pac), cells are obtained whose division activity is clearly stimulated.
  • the marker e.g. pac
  • oligonucleotide with the sequence 3'-rCAGTACGGCGGGTTTTGG-5 ' is synthesized as a phosphothioate by a known method on an automatic synthesizer (Applied Biosystems) and dried.
  • Approximately 100 OD units are dissolved in 100 l of H 2 O, adjusted to 0.3 M Na acetate and precipitated with 10 volumes of 96% ethanol at -70 ° C.
  • the precipitate is centrifuged off and dissolved in 0.5 ml of sterile water. After measuring the concentration, dilute to 1 ⁇ * -q / ⁇ by adding water.
  • This solution is diluted 60 ⁇ in 1 ml of cell culture medium, which corresponds to a concentration of 10 ⁇ cM. This solution is applied to the cells previously sown in a 5 cm culture dish.
  • Cells used at a density of 5 x 10 cells per dish There are 8 dishes with oligonucleotide and without (control). After one hour, 1 ml of medium with 10% serum is added. The following day, the cells are harvested from a dish and counted in a counting chamber. The results are shown graphically (see Figure 2) and show a much faster increase in the number of cells from the 2nd to the 10th day. After 10 days, a subculture is created, which is treated again with oligonucleotide in the manner described above. The renewed daily cell count results in basically the same curve, whereby the difference after the 1st and 2nd day is more clearly recognizable than in the first round.
  • An oligonucleotide with the sequence 3'-AGCAAGTGAAAATGACTC-5 ' is prepared as described under 1, prepared for use and added to the cell culture.
  • the inclusion of a growth curve by daily cell counting results in principle in the same curve as in Figure 2, but after 10 days there are not 3.5 times, but only 2.5 times more cells.
  • the oligonucleotides of Examples 1 and 2 are used in combination in a concentration of 5 M each, and the cell number is determined daily. This results in a steeper curve increase with a multiple of the number of cells compared to the control cells after 10 days.
  • Example 4
  • the gene of the T7 RNA polymerase modified by a nuclear localization signal with the poly (A) signal of the thymidine kinase gene was obtained as a BglII / PvuII fragment (3267 bp) from pMTT7N (Lieber et al. (1989) Nucl.Acids Res 17: 8485-8493) and inserted into the retroviral vector pM6pac.
  • the gene of T7 RNA polymerase is under the control of the "early" SV40 promoter. Cell clones expressing this recombinant can be selected with puromycin.
  • the plasmid can be packaged in a retrovirus. From several tested restriction fragments of the cDNA of the human retinoblastoma (Rb) gene a 360 bp fragment (Hpal / Asp718) was found, which encompasses the 5'-untranslated region and the l. Exon of the Rb gene covers, as suitable for cell division stimulation by means of anitsense Rb RNA expression. This fragment was cloned into the pBluescript KS vector cut with Asp718 / EcoRI and treated with phosphatase by ligation of the cohesive Asp718 ends and subsequent filling in of the 5 'protruding Hpal and EcoRI ends with Klenow polymerase and ring closure. A recombinant was selected by sequencing with T7 primer which contains the fragment of the Rb gene in the antisense (3 '5') direction behind the T7 promoter
  • T7asRbl Modified T7 RNA polymerase coexpressed in mammalian cells highly efficiently transcribes (? 25000 RNA molecules / cell) a gene under the T7 promoter (Lieber et al. (1993) Methods Enzymol. Vol. 217, in press). Both plasmids were cleaned using a CsCl gradient.
  • NIH 3T3 cells embryonic cells
  • 225 __l ⁇ are in a 15 ml Falcon tube. 2 .0 with S / * q pT7asRbl and 2 9 pM6SVT7N presented. 25 / ⁇ . 2.5 M CaCl 2 . are added and with vortex mixing 250 ⁇ -1 2xHBS buffer pH 6.96 in the DNA
  • antisense RNA which is generated by a human Rb gene in mouse cells, has an expression-inhibiting effect.

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Description

Mittel zur Stimulierung der Teilungsaktivität tierischer Zellen
1. Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Mittel zur Stimulierung der
Teilungsaktivität tierischer und menschlicher Zellen sowie ein
Verfahren zur Anwendung dieses Mittels. Sie ist sowohl in der biologisch-medizinischen Grundlagenforschung als auch in der Biotechnologie und der pharmazeutischen Industrie einsetzbar.
Sowohl für die Aufklärung grundlegender biologischer Prozesse als auch für die Verwendung tierischer Zellen für biotechnologische Zwecke werden Zellen benötigt, die für eine beliebige Dauer in künstlichen Medien kultivierbar sind. Die unbegrenzte Zellteilungsfähigkeit ist ein Kriterium von Tumorzellen. Aber auch Zellen im "prämalignen11 Zustand können unsterblich (immortal) sein. Prinzipiell basiert die Entwicklung einer immortalen Zelle auf genetischen Veränderungen, die zur Veränderung der Funktion eines oder mehrerer Proteine führen, die für die negative Regulation der Zellteilung wesentlich sind.
Immortale Zellinien können entweder aus bestimmten Tumoren direkt gewonnen werden oder über Umwege aus Primärzellen entstehen, die aus bestimmten Geweben isoliert wurden. Das spontane Entstehen einer immortalen Zellinie ist ein extrem seltenes Ereignis, da vermutlich mindestens zwei Mutationen dafür erforderlich sind. In der Vergangenheit wurden daher häufig Tumorviren als Induktoren der Immortalisierung verwendet. Diese hatten aber den Nachteil, daß sie auch eine vielfach unerwünschte tumorigene Veränderung der Zellen hervorriefen. In DD-WP 265165 wurde bereits vorgeschlagen, zur Verbesserung der Immortalisierungsverfahren die Rekombinanten mit dem Gen für das große T-Antigen des Polyomavirus anzuwenden. Dadurch wurde das Problem der effektiven Immortalisierung ohne gleichzeitige tumorigene Veränderung prinzipiell gelöst. Allerdings wird die Geschwindigkeit der Zellteilung in der Regel bei diesem Verfahren nicht beeinflußt.
ERSATZBLATT Viele tierische und menschliche Zellen haben ein auf ca. 50-60 Zellteilungen beschränktes Tei.lungspotential ohne Immortalisierung.
Die längere Lebensfähigkeit ist häufig wünschenswert, aber nicht unbedingt erforderlich. Allerdings ist die Ausschöpfung des tatsächlichen Teilungspotentials auch bei vielen Zelltypen schwierig, da dies von einer optimalen Versorgung mit Wachstumsfaktoren abhängig ist. So wird bei vielen Zelltypen eine Begrenzung der Teilungsaktivität in vitro auf nur wenige Zyklen gefunden. Eine vordringliche Problemstellung für die biotechnologische Nutzung von Zellkulturen besteht in einer Prinziplösung zur Etablierung von Zellen unterschiedlichster Organe unter maximaler Ausschöpfung ihres natürlichen Teilungspotentials und möglichst zusätzlicher Stimulierung der Zellteilung hinsichtlich ihrer Geschwindigkeit.
Ziel der Erfindung sind die Schaffung und die Anwendung eines Mittels zur generellen Stimulierung der Teilungsaktivität tierischer und menschlicher Zellen in der Kultur sowohl hinsichtlich der Ausschöpfung des natürlichen Teilungspotentials als auch bezüglich der Geschwindigkeit des Zellzyklus. Das erfindungsgemäße Mittel ist dadurch gekennzeichnet, daß es als wirksame Substanz eine oder mehrere Nukleotidseguenzen mit komplementärer Sequenz (antisense) zu bestimmten Bereichen der mRNA von Tu orsuppressorgenen oder anderen negativ auf die Zellteilungsaktivität wirkenden Genen enthält. Die Antisense- Nukleotidsequenz besteht vorzugsweise aus einem synthetischen Oligonukleotid einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden, wobei eine Länge von 18 - 21 Nukleotiden bevorzugt ist. Das Oligonukleotid muß in nukleaseresistenter Form vorliegen, wobei die Phosphothioatform besonders zweckmäßig ist.
Als Antisense-Nukleotidsequenzen werden vor allem Sequenzen eingesetzt, die komplementär zu einer Region des 5'-Endes, der Region um das Startcodon, einer Region eines Exons oder einer Region an einem Intron-Exon-Übergang des betreffenden Gens ist. Bevorzugt werden komplementäre Sequenzen zu den Tumorsuppressorgenen Retinoblastomgen, p53-Gen oder das E-cadherin ausgewählt. Beispiele für konkrete Sequenzen der wirksamen Substanz im erfindungsgemäßen Mittel sind 3'-CAGTACGGCGGGTTTTGG-5' und 3'-AGCAAGTGAAAATGACTC-5'. Zur Herstellung des Mittels wird die Antisense-Nukleotidsequenz gemäß der Erfindung in Lösung, vorzugsweise in wäßrige Lösung, gebracht.
Zum Einsatz des Mittels zur Stimulierung der Zellteilungsaktivität * werden die folgenden näheren Angaben gemacht: i ' Es werden Oligonukleotide nach bekannten Verfahren synthetisiert.
Um eine Zellkultur in ihrer Zellteilungsaktivität zu stimulieren, werden die bevorzugt adhärent auf Plastik wachsenden Zellen mit den ausgewählten Antisense-Nukleotiden behandelt. Dazu werden die
Oligonukleotide durch Alkohol-Fällung sterilisiert, in sterilem dest. Wasser gelöst und in einer Konzentration von 5 - 30 M in das Kulturmedium ohne Serum gegeben. Die Oligonukleotide können zusätzlich mit Lipofectin gemischt werden, um eine noch effektivere Aufnahme durch die Zellen zu erreichen. Die Zellen werden mit dem oligonukleotidhaltigen Medium über mehrere Tage inkubiert. Die Zellzahl wird in Parallelansätzen täglich im
Vergleich zu einer unbehandelten Kultur bestimmt.
Bei primären menschlichen Lungenfibroblasten (HEL) zeichnet sich nach drei Tagen ein rascherer Zuwachs der Zellzahl im Vergleich zur Kontrolle ab. Diese Tendenz hält bei einmaliger Gabe von
Oligonukleotiden für mindestens 7 Tage an. Innerhalb von 10 Tagen wird bei diesem Zelltyp mindestens di«= 3fache Zahl von Zellen mit
Behandlung im Vergleich zu den nichtbehandelten Zellen erzielt.
Hybridisierung zeigt eindeutig, daß die mRNA im Bereich der
Paarung mit dem Antisense-Oligonukleotid degradiert wird.
Der immunologische Proteinnachweis zeigt, daß spätestens 3 Tage nach dem Beginn der Behandlung mit Oligonukleotiden die
Neusynthese von pRb vollständig eingestellt ist.
Läßt man die behandelte Kultur länger als 7 Tage im konfluenten
Zustand, dann entstehen dichte Inseln von Zellen, die an transformierte Foci erinnern, aber tatsächlich keine transformierten Zellen enthalten. Nach etwa 14 Tagen sind die
Kulturgefäße gleichmäßig mit einer " ultilayer" von Zellen bewachsen. Werden die Zellen passagiert und dabei erneut mit
Oligonukleotid (5 - 30 __) behandelt, dann hält das beschleunigte
Wachstum weiter an, bis die natürliche Grenze von etwa 60
Zellteilungen erreicht ist. Im Einzelfall können auch etwa 80
Teilungen erreicht werden. Da sich die behandelten Zellen aber mehr als doppelt so schnell teilen wie die Kontrollzellen, beenden sie ihre Lebensspanne erheblich früher.
Der Vergleich verschiedener Oligonukleotide mit Komplementarität zu unterschiedlichen Bereichen der Rb-mRNA zeigt, daß mit vielen ein annähernd gleicher Effekt zu erreichen ist. Generell erweist sich aber ein Oligonukleotid mit folgender Sequenz 3'- CAGTACGGCGGGTTTTGG-5' , das komplementär zur Region um das Start- Codon ist, als besonders effektiv. Dies bedeutet, daß bei relativ niedriger Konzentration (10/£__M) des Oligonukleotids ein maximaler Stimulierungseffekt und vollständige Ausschaltung der pRb-Synthese erreicht werden. Eine Kombination von zwei Oligonukleotiden, z.B. gegen die Region des Start-Codons und gegen eine Exon-Sequenz erweist sich bei halber Konzentration (je 5 /_/-M) als ähnlich effektiv. Dagegen sind bei Verwendung von Oligonukleotiden gegen andere Regionen der mRNA höhere Konzentrationen (30 t_. M) er orderlich.
Frisch angelegte Zellen anderer Organe, z.B. der Leber, die ohne Behandlung nur 1 - 2 Zellteilungen durchlaufen, können nach Behandlung mit einem Rb-antisense-Oligonukleotid signifikant länger kultiviert werden, wobei die Zellteilung deutlich stimuliert ist.
Das erfindungsgemäße Mittel ermöglicht, die Zahl der Zellteilungen pro Zeiteinheit deutlich zu erhöhen. Seine Anwendung ermöglicht auch die Kultivierung von Zellen, die sonst nicht kultivierbar sind. Damit wird sowohl in der biotechnologischen StoffProduktion als auch in der biologisch medizinischen Grundlagenforschung ein großer Fortschritt ermöglicht.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, die Antisense-Nukleotidsequenz zur Stimulierung des Zellwachstums nicht zuzusetzen, sondern in der zu kultivierenden Zelle selbst zu erzeugen. Das wird dadurch erreicht, daß eine Reko binante mit expremierbarer Antisense-Sequenz durch Transfektion in die Zellen eingebracht wird. In diesem Falle besteht die bevorzugte Sequenz aus 50 - 500 Nukleotiden. Die erfindungsgemäße Rekombinante enthält die Antisense- Nukleotidsequenz in Leserichtung nach einem starken Promoter. Die Sequenz besteht bevorzugt aus komplementären Sequenzen der Tumorsuppressorgene Retinoblastomgen, p53-Gen oder E-cadherin. Eine besonders geeignete Sequenz besteht aus den ersten 360 Nukleotiden der mRNA-kodierenden Sequenz des Retinoblastomgens. Als Promoter für die Rekombinante eignet sich besonders der T7- Promoter in Verbindung mit seiner homologen RNA-Polymerase.
Ein Beispiel für die erfindungsgemäße Rekombinante ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt.
Sie besteht aus einem 360 bp Fragment des humanen Rb-Gen mit dem 5' untranstranslatierten Bereich.und dem l. Exon, das in antisense Richtung hinter den T7-Promoter in den Vektor pBluescript KS kloniert ist.
Zum Einsatz des Mittels werden folgende Angaben gemacht:
Es wird eine Rekombinante hergestellt, wobei eine ausgewählte Sequenz, bevorzugt 50 - 500 Nukleotide lang, aus dem betreffenden Tumorsuppressor-Gen in antisense-Orientierung hinter einen starken Promoter kloniert wird. Diese Rekombinante wird bevorzugt zusammen mit einem Selektionsmarker und dem Gen der T7-RNA-Polymerase nach an sich bekannten Verfahren in die betreffenden Zellen transfiziert. Nach Selektion auf Vorhandensein des Markers (z.B.pac) werden Zellen erhalten, deren Teilungsaktivität deutlich stimuliert ist.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
Beispiel 1
Ein Oligonukleotid mit der Sequenz 3'-rCAGTACGGCGGGTTTTGG-5' wird als Phosphothioat nach bekanntem Verfahren am automatischen Syntheseapparat (Applied Biosystems) synthetisiert und getrocknet. Ca. 100 O.D.-Einheiten werden in 100 l H20 gelöst, auf 0,3 M Na- Azetat eingestellt und mit 10 Volumen 96% Äthanol bei -70°C gefällt. Das Präzipitat wird abzentrifugiert und in 0,5 ml sterilem Wasser gelöst. Nach Messung der Konzentration wird auf 1 Λ*-q/ ^, durch Zugabe von Wasser verdünnt. Von dieser Lösung werden 60^ in 1 ml Zellkulturmedium verdünnt, was einer Konzentration von lO^cM entspricht. Diese Lösung wird auf die zuvor in einer 5 cm- Kulturschale eingesäten Zellen gegeben. Im Beispiel werden HEL-
Λ_
Zellen in einer Dichte von 5 x 10 Zellen pro Schale verwendet. Es werden je 8 Schalen mit Oligonukleotid und ohne (Kontrolle) angesetzt. Nach einer Stunde wird 1 ml Medium mit 10% Serum zugesetzt. An jedem folgenden Tag werden die Zellen von jeweils einer Schale geerntet und in einer Zählkammer gezählt. Die Ergebnisse werden graphisch dargestellt (siehe Abbildung 2) und zeigen einen deutlich schnelleren Anstieg der Zellzahl vom 2. - 10. Tag. Nach 10 Tagen wird eine Subkultur angelegt, die in oben beschriebener Weise erneut mit Oligonukleotid behandelt wird. Die erneute tägliche Zellzählung ergibt einen prinzipiell gleichen Kurvenverlauf, wobei die Differenz nach dem 1. und 2. Tag deutlicher erkennbar ist als bei der ersten Runde.
Beispiel 2
Ein Oligonukleotid mit der Sequenz 3'-AGCAAGTGAAAATGACTC-5' wird wie unter 1 beschrieben hergestellt, zur Verwendung vorbereitet und der Zellkultur zugesetzt. Die Aufnahme einer Wachstumskurve durch tägliche Zellzählung ergibt einen prinzipiell gleichen Kurvenverlauf wie in Abbildung 2, wobei nach 10 Tagen nicht 3,5- mal, sondern nur 2,5- mal mehr Zellen vorhanden sind.
Beispiel 3
Die Oligonukleotide der Beispiele 1 und 2 werden in Kombination in einer Konzentration von jeweils 5 M eingesetzt, und die Zellzahl wird täglich bestimmt. Dabei ergibt sich ein steilerer Kurvenanstieg mit einer Sfachen Zellzahl im Vergleich zu den Kontrollzellen nach 10 Tagen. Beispiel 4
Herstellung der rekombinanten Plasmide:
Das Gen der durch ein Kernlokalisierung_.signalmodifizierten T7- RNA-Polymerase mit dem poly(A)-Signal des Thymidinkinase-Gens wurde als Bglll/ PvuII-Fragment (3267 bp) aus pMTT7N (Lieber et al.(1989) Nucl.Acids Res. 17: 8485-8493) entnommen und in den retroviralen Vektor pM6pac eingesetzt. In der entstandenen Rekom¬ binante pM6SVT7N (Abb.l) steht das Gen der T7-RNA-Polymerase unter Kontrolle des "frühen" SV40-Promotors. Zeilklone, die diese Rekombinante expremieren, können mit Puromycin selektiert werden. Das Plasmid kann bei Bedarf in einen Retrovirus verpackt werden. Aus mehreren getesteten Restriktionsfragmenten der cDNA des humanen Retinoblastoma(Rb)-Gens erwies sich ein 360 bp Fragment (Hpal / Asp718), das den 5'-untranslatierten Bereich und das l. Exon des Rb-Gens überdeckt, als geeignet zur Zellteilungsstimulation mittels anitsense Rb-RNA-Expression. Dieses Fragment wurde in den mit Asp718 / EcoRI gespaltenen und mit Phosphatase behandelten Vektor pBluescript KS kloniert, und zwar durch Ligation der kohäsiven Asp718-Enden und nachfolgendem Auffüllen der 5 'überstehenden Hpal- und EcoRI-Enden mit Klenow- Polymerase und Ringschluß. Durch Sequenzierung mit T7-Primer wurde eine Rekombinante ausgewählt, die das Fragment des Rb-Gens in antisense (3' 5')- Richtung hinter dem T7-Promoter enthält
(pT7asRbl, Abb.l). In Säugerzellen koexpremierte modifizierte T7- RNA-Polymerase transkribiert hocheffektiv ( ? 25000 RNA- Moleküle/Zelle) ein Gen unter T7-Promoter (Lieber etal. (1993) Methods Enzymol. vol.217, in press). Beide Plasmide wurden über einen CsCl-Gradienten gesäubert.
Transfektion mittels Kalzium-Phosphat-Kopräzipitation:
16 Stunden vor der Transfektion werden NIH 3T3-Zellen (embryonale
Maus-Fibroblasten) in einer Zelldichte von 2,5x105 Zellen pro 6 cm
Schale (25 cm2) ausgesät. 3 Stunden vor Transfektion wird das
Zellkulturmedium (5 ml) gewechselt.
In einem 15 ml Falcon-Röhrchen werden 225 __l Ε.2.0 mit S/* q pT7asRbl und 2 9 pM6SVT7N vorgelegt. 25 / Δ. 2,5 M CaCl2. werden zugegeben und unter Vortex-Mischen 250 ^-1 2xHBS Puffer pH 6,96 in die DNA-
Ca-Lösung eingetropft (2xHBS: 280 mM NaCL, 50 mM HEPES, 1,5 mM Das entstandene Präzipitat wird sofort auf die Zellen ins Kulturmedium gegeben und dort 12-16 h belassen. Danach wird Medium gewechselt.
Nach 48 h werden 3000 Zellen/6cm Schale ausgesät. Am 7. Tag nach Transfektion sind auf einem spärlichen Rasen von nichttransfizierten 3T3 Zellen sehr kompakte Zellfoci zu sehen, die antisense-Rb-RNA (T7-Polymerase abhängig) expremieren. Die Verdopplungszeit dieser Zellen ist um ein Drittel verkürzt, so daß sie schnell die nichtexprimierenden Zellen überwachsen. Auffallend ist auch die Stress-Resistenz (z.B. Serumhunger) dieser Zellen. In einem anderen Protokoll mit Selektion wurden 48 h nach Transfektion 50000 Zellen/6cm Schale ausgesät und dem Zellkulturmedium 2 uuq/ml Puromycin zugesetzt. Das Selektionsmedium wurde alle drei Tage gewechselt. Der Großteil der- sich bildenen Kolonien besaß die gezeigte Morphologie mit Focibildung. Eine dieser Foci wurde isoliert und expandiert. Im Westernplot des Zellysates konnte kein Rb-Protein nachgewiesen werden. Interessanterweise wirkt antisense RNA, generiert von einem humanen Rb-Gen in Mauszellen expressionshemmend. Zwischen der Mensch- und Maus-Rb-cDNA besteht 80%ige Homologie. Die antisense Rb-RNA expre ierenden 3T3-Zellen besitzen Merkmale transformierter Zellen; sie bilden bei Kultivierung im Weichagar mit einer Frequenz von 10 ~ Kolonien (nichttransfizierte Kontrollzellen: 10_=>) .

Claims

2. Patentansprüche
1. Mittel zur Stimulierung der Teilungsaktivität tierischer Zellen, gekennzeichnet dadurch, daß es als wirksame Sub¬ stanz eine oder mehrere Nukleotidsequenzen mit komple¬ mentärer Sequenz (antisense) zu bestimmten Bereichen der mRNA von Tumorsuppressorgenen oder anderen negativ auf die Zellteilungsaktivität wirkenden Genen enthält.
2. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Nukleotidsequenzen synthetische Oligonukleotide einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden, bevorzugt 18-21 Nukleotiden, sind.
3. Mittel nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die synthetischen Oligonukleotide in nukleaseresistenter Form vorliegen, bevorzugt als Phosphothioat-Oligonukleotide.
4. Mittel nach Anspruch 1 - 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Nukleotidsequenz komplementär zu einer Region des 5'-En¬ des, der Region um das Startcodon, einer Region eines Exons oder einer Region an einem Intron-Exon-Übergang des betref¬ fenden Gens ist.
5. Mittel nach Anspruch 1 -4, gekennzeichnet dadurch, daß als Nukleotidsequenzen bevorzugt komplementäre Sequenzen der Tumorsuppressorgene Retinoblasto gen, p53-Gen und E-cadherin ausgewählt werden.
6. Mittel nach Anspruch 1 - 5, gekennzeichnet durch die Oligo- kleotidsquenzen der Retinoblastom-mRNA mit folgender Bau¬ steinreihenfolge:
3'-CAGTACGGCGGGTTTTGG-5' und 3'-AGCAAGTGAAAATGACTC-5'.
7. Mittel nach Anspruch 1 - 6, gekennzeichnet dadurch, daß die wirksame Substanz in Lösung, vorzugsweise in wäßriger Lösung vorliegt.
8. Verwendung des Mittels nach den Ansprüchen 1 - 6 zur Stimu¬ lierung der Teilungsaktivität tierischer Zellen.
9. 3'-CAGTACGGCGGGTTTTGG-5'
10. 3'-AGCAAGTGAAAATGACTC-5'
11. Verfahren zur Stimulierung der Zellteilung von tierischen und menschlichen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel nach Anspruch 1 - 6 dem Kulturmedium beim Ansetzen der Subkultur in einer Konzentration von 5 - 30 iM zugesetzt wird, ständig im Kulturmedium vorhanden ist und bei Subkultivierung erneut in dieser Konzentration zugesetzt wird.
12. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die antisense-Nukleotidsequenz als RNA von einer Rekombinante in der zu kultivierenden Zelle synthetisiert wird, bevorzugt als Teilsequenz von 50 - 500 Nukleotiden.
13. Mittel nach Anspruch 1 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß die Rekombinante eine antisense-RNA kodiert, die komplemen¬ tär zu einem bestimmten Bereich der mRNA ist, der bevorzugt im kodierenden Bereich und in einer Region mit fehlender Selbstkomplementarität liegt.
14. Rekombinante nach Anspruch 12 und 13, gekennzeichnet dadurch, daß sie die antisense-Nukleotidsequenz in Leserichtung nach einem starken Promoter enthält.
15. Rekombinante nach Anspruch 12 - 14 , gekennzeichnet dadurch, daß sie als antisense-Nukleotidsequenz komplementäre Se¬ quenzen der Tumorsuppressorgene Retinoblastomgen, p53-Gen oder E-cadherin enthält.
16. Rekombinante nach Anspruch 12 - 15, gekennzeichnet dadurch, daß als antisense-Nukleotidsequenz die ersten 365 Nukleotide der mRNA-kodierenden Sequenz des Retinoblastomgens enthält.
17. Rekombinante nach Anspruch 12 - 16, gekennzeichnet dadurch, daß sie den T7-Promoter enthält.
18. Verfahren zur Stimulierung der Zellteilung in tierischen und menschlichen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Rekombi¬ nante nach Anspruch 14 - 17 und ggf. ein Selektionsplasmid durch Standard-Transfektionsverfahren wie Elektroporation, Lipofektion oder Calciumphosphat-Kopräzipitation in die zu kultivierenden Zellen eingebracht wird, die transfizierten Zellen selektiert und nachfolgend in an sich bekannter Weise kultiviert werden.
19. Verfahren zur Stimulierung der Zellteilung in tierischen und menschlichen Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Rekombi¬ nante nach Anspruch 14 - 17 gemeinsam mit dem Gen der T7-RNA- Polymerase transfiziert wird.
E
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