EA019910B1

EA019910B1 - Способ очистки полимерной смеси

Info

Publication number: EA019910B1
Application number: EA201170881A
Authority: EA
Inventors: Йорди Лютен
Original assignee: Синтон Бв
Priority date: 2008-12-24
Filing date: 2009-12-24
Publication date: 2014-07-30
Also published as: ZA201104565B; PL2382233T3; CL2011001565A1; US20100160606A1; EA201170881A1; PT2382233T; KR20110112366A; BRPI0922337A2; WO2010072418A1; HUE028250T2; ECSP11011187A; EP2796463A1; EP2382233B1; EP2382233A1; ES2584529T3; US9617313B2; AR074881A1; AU2009331841A1; CO6382160A2; MX2011006677A

Abstract

Способ очистки сополимерных пептидов, таких как полипептиды СОП-1, в результате ультрафильтрации может быть улучшен обработкой раствора полипептида кислотой до или во время ранних ступеней ультрафильтрации. Добавление кислоты и/или получение кислотно-аддитивных солей полипептида до ультрафильтрации проводят для обеспечения более быстрой ультрафильтрации. Подобным образом добавление кислоты в способе ультрафильтрации, но до возникновения осаждения полипептида или закупоривания также может улучшить и эффективность/удобство стадии ультрафильтрации.

Description

Изобретение относится к способам очистки полипептидных сополимеров, в особенности полипептидов СОП-1.

Полимеризация натуральных или синтетических мономеров хорошо известна и описывается в опубликованных ранее учебниках, таких как, например, публикация Огдаше СйетщЬу Ьу Моггщоп апй Воуй, 3^гй ейШоп. 1980, еЬар!ег 32. Полипептиды представляют собой специфический класс полимеров, полученных в результате проведения полимеризации аминокислот.

Сополимерные полипептиды в общем случае получают в результате проведения статистической сополимеризации аминокислот. При такой сополимеризации несколько различных аминокислот, имеющих активированные карбокси- и/или аминогруппы, перемешивают друг с другом в условиях проведения реакции, при этом образование пептидных связей между различными аминокислотам, присутствующими в реакционной смеси, является статистическим. На современном уровне техники известно также и то, что реакционноспособные химические группы, которые не являются частью основной цепи полимера и должны оставаться неизмененными после полимеризации, должны быть защищены защитными группами. После завершения полимеризации данные защитные группы химически удаляют.

Способ получения сополимера, содержащего лейцин и фенилаланин, в результате проведения статистической полимеризации описывается в документе υδ 2657972.

В документе ϋδ 3849550 описывается способ получения сополимера, содержащего аланин (А), глутаминовую кислоту (Е), лизин (К) и тирозин (Υ), в результате проведения статистической полимеризации. В способе используют защитные боковые группы с последующим проведением двух стадий снятия защиты, но не указывают каких-либо стадий очистки. Согласно сообщению получающийся в результате сополимер, который впоследствии обозначили как сополимер-1 (СОП-1) (см., например, документ ϋδ 5800808), характеризовался молярным соотношением Α:Ε:Κ:Υ 6:2:4,5:1.

В документе ϋδ 5800808 описываются способы получения сополимера СОП-1, характеризующегося специфическим профилем молекулярной массы, с последующей очисткой в результате диализа или ультрафильтрации. Согласно сообщению сополимер СОП-1 характеризовался молярным соотношением Α:Ε:Κ:Υ 6:2:5:1. В патенте не упоминаются способы очистки, применимые в промышленности.

В документе \¥О 2006/083608 описываются способы получения СОП-1 и упоминается ультрафильтрация для удаления защитных групп и низкомолекулярных примесей. Молярное соотношение в СОП-1 Α:Ε:Κ:Υ соответствует ~4,49:~1,48:~3,56:1. В одном варианте осуществления (пример 3) для удаления низкомолекулярных примесей проводили ультрафильтрацию при использовании 5килодальтоновой мембраны. По завершении 6 циклов ультрафильтрации раствор подкисляли уксусной кислотой вплоть до достижения рН 4,0. Добавляли воду и раствор подвергали ультрафильтрации вплоть до достижения рН 5,5. Раствор концентрировали и лиофилизовали в течение 60 ч.

В документе ϋδ 2008/0021192 описываются способы получения СОП-1, а после этого очистки СОП-1 таким образом, как в результате диализа, хроматографии, фильтрации и т.п. Согласно сообщению сополимер СОП-1 характеризуется молярным соотношением Α:Ε:Κ:Υ, соответствующим ~4,49:~1,48:~3,56:1. В одном варианте осуществления (схема 5) СОП-1 очищают при использовании ультрафильтрации. Реакционную смесь, содержащую СОП-1, отфильтровывали для удаления каких-либо мелких нерастворимых материалов, а фильтрат перепускали через ультрафильтрацию при использовании 1-килодальтоновой мембраны сначала при циркуляции воды вплоть до наблюдения в пермеате рН 8, а после этого при циркуляции 0,3%-ного раствора уксусной кислоты в воде до достижения рН 5,5-6,0 в ретентате. Затем раствор лиофилизовали, по-видимому, до получения СОП-1 в виде соли уксусной кислоты в твердой форме.

Описывавшиеся выше способы ультрафильтрационной очистки СОП-1 предшествующего уровня техники представляют собой многостадийные методики, подходящие для проведения экспериментов лабораторного масштаба. Однако сохраняется потребность в более легком и/или в большей мере применимом в промышленности способе ультрафильтрации для очистки сложных реакционных смесей, содержащих полипептиды, в особенности СОП-1.

Краткое изложение изобретения

Настоящее изобретение базируется на наблюдении того, что способам ультрафильтрации предшествующего уровня техники зачастую свойственны закупоривание мембраны фильтра и/или осаждение сополимерного полипептида во время ультрафильтрации. Настоящее изобретение отчасти базируется на открытии того, что подача кислоты и/или получение кислотно-аддитивной соли полипептида на ранней стадии способа могут уменьшить или предотвратить возникновение таких проблем с закупориванием и/или осаждением и, соответственно, могут быть уменьшены количество стадий ультрафильтрации и/или требуемое время.

В соответствии с этим первый аспект настоящего изобретения относится к способу ультрафильтрации, который включает объединение реакционной смеси, характеризующейся значением рН, равным 10 и более и содержащей разнообразие сополимерных полипептидов, которые в совокупности содержат больше основных аминокислот, чем кислотных аминокислот, с водным раствором кислоты для получения модифицированной реакционной смеси; и проведение для указанной модифицированной реакцион

- 1 019910 ной смеси ультрафильтрации для получения очищенной реакционной смеси. Использующаяся кислота может быть органической или неорганической кислотой и обычно является органической кислотой, содержащей от 1 до 8 атомов углерода, более часто от 1 до 4 атомов углерода, такой как уксусная кислота. В общем случае полипептиды получают из аминокислот аланина; глутаминовой кислоты и/или аспарагиновой кислоты; лизина и/или аргинина и тирозина.

В одном конкретном аспекте вышеупомянутый способ может быть использован для получения очищенного сополимера СОП-1. Говоря более конкретно, сополимерный полипептид в таком способе представляет собой полипептид СОП-1, а ультрафильтрация указанной модифицированной реакционной смеси приводит к получению очищенных кислотно-аддитивных солей СОП-1. Обычно способ включает: (ί) добавление водного раствора кислоты к реакционной смеси, содержащей незащищенные полипептиды СОП-1, для получения кислотно-аддитивных солей СОП-1 в модифицированной реакционной смеси и (ίί) ультрафильтрацию указанной модифицированной реакционной смеси, содержащей указанные кислотно-аддитивные соли СОП-1, для получения очищенных кислотно-аддитивных солей СОП-1; где стадию (ί) предпочтительно проводят перед проведением для указанной реакционной смеси, содержащей незащищенные полипептиды СОП-1, какой-либо ультрафильтрации. Кислота может быть органической или неорганической, как это упоминалось выше, и обычно является уксусной кислотой. Модифицированная реакционная смесь, содержащая указанные соли СОП-1 и уксусной кислоты, в общем случае характеризуется значением рН, которое отличается от средней изоэлектрической точки незащищенных полипептидов СОП-1 по меньшей мере на одну единицу значения рН. Обычно реакционная смесь, содержащая указанные незащищенные полипептиды СОП-1, перед указанным добавлением стадии (ί) характеризуется значением рН, большим или равным приблизительно 12. В обычном случае добавление раствора уксусной кислоты уменьшает значение рН реакционной смеси от ее типичного исходного значения, равного приблизительно 12-13 до 10 и менее. Концентрация указанного водного раствора уксусной кислоты обычно находится в диапазоне от 0,05 до 0,5 об.% уксусной кислоты, таком как приблизительно от 0,1 до 0,3%.

Один дополнительный аспект изобретения относится к использованию кислоты в таком способе ультрафильтрации. Говоря конкретно, в способе очистки полипептидов СОП-1, который включает проведение для незащищенных полипептидов СОП-1 в реакционной смеси ультрафильтрации, может быть сделано усовершенствование, включающее стадию добавления кислоты, в частности уксусной кислоты, к щелочной реакционной смеси или ретентату до или во время или и до, и во время реализации способа ультрафильтрации, но не позднее, чем ретентат достигнет значения рН 10.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу очистки сополимерных полипептидов, таких как полипептиды СОП-1, в результате проведения ультрафильтрации раствора полипептидов в присутствии кислоты и/или формы полипептидов в виде кислотно-аддитивной соли. Как было обнаружено, добавление кислоты и/или получение кислотно-аддитивных солей сополимерных полипептидов на ранней стадии ультрафильтрации, в том числе до начала ультрафильтрации, уменьшают или предотвращают закупоривание мембраны фильтра и/или осаждение сополимерных полипептидов во время ультрафильтрации. В результате подачи кислоты до возникновения осаждения сополимерного полипептида и/или закупоривания способ может быть реализован быстро и эффективно. В дополнение к этому, может быть уменьшено количество стадий ультрафильтрации, например отсутствует потребность в неоднократном обмене технологических жидкостей во время ультрафильтрации, и требуется меньше измерений (например, измерений значения рН) для определения конечной точки очистки при ультрафильтрации.

Сополимерные полипептиды, очищаемые в изобретении, представляют собой смесь различных полипептидов, которые в совокупности содержат больше основных аминокислот, чем кислотных аминокислот. Зачастую сополимерные полипептиды получают из аланина, глутаминовой кислоты и/или аспарагиновой кислоты, лизина и/или аргинина и тирозина. Также могут присутствовать и дополнительные аминокислоты, но обычно сополимерные полипептиды ограничиваются данными 4-6 аминокислотами. Сополимерные полипептиды имеют различные длины цепей, последовательности и молекулярные массы и в совокупности имеют среднюю молекулярную массу, которая обычно находится в диапазоне от 2 до 40 кДа.

Один предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения относится к очистке сополимерных полипептидов, обозначаемых как СОП-1. Термин СОП-1 (сополимер-1) относится к смеси полипептидов, полученных из аминокислот аланина (А), глутаминовой кислоты (Е), лизина (К) и тирозина (Υ). О молярном соотношении Α:Ε:Κ:Υ в сополимере СОП-1 имелись различные сообщения. Например, следующая далее таблица иллюстрирует различные молярные соотношения, описываемые как присущие сополимеру СОП-1:

- 2 019910

Источник ϋ5 3849550

Молярное соотношение Ά:Ε:Κ:ΐ

6:2:4,5:1

5800808

6:2:5:1

НО

2006/083608 из -4,49:-1,48:-3,56:1

2008/0021192

Ν0Α #020622 для СОРАХОЫЕ®

4,5:1,5:3,5:1

Для целей данной заявки термин полипептиды СОП-1 предполагает включение всех таких вариаций молярных соотношений Α:Ε:Κ:Υ.

Ультрафильтрация в общем случае представляет собой хорошо известную методику очистки/разделения, при которой раствор вводят в контакт с ультрафильтрационной мембраной при приложенном давлении. Приложенным давлением могут быть, например, осмотическое давление или гидростатическое давление. Приложенное давление продавливает растворитель и более мелкие молекулы через мембрану, в то время как более крупные молекулы мембраной удерживаются исходя из величины отсечения по молекулярной массе для мембраны. Раствор, проходящий через мембрану, называют пермеатом. Раствор, содержащий удержанные молекулы, называют ретентатом. Ультрафильтрационная мембрана может удерживать частицы в диапазоне от 1 до 1000 кДа. Ультрафильтрационная мембрана должна быть инертной по отношению к реакционной смеси. Критерии выбора легко доступны у поставщиков мембран. Мембрана предпочтительно характеризуется величиной отсечения по молекулярной массе в диапазоне от 1 до 10 кДа, такой как 3 или 5 кДа. Обычно объем ретентата во время ультрафильтрации сохраняют постоянным в результате добавления к ретентату питающего раствора. Это делает возможным лучший контроль процесса ультрафильтрации и степени чистоты ретентата.

Ультрафильтрация, использующаяся в изобретении, обычно включает прохождение реакционной смеси, содержащей сополимерные полипептиды, такие как СОП-1, через мембрану, характеризующуюся величиной отсечения по молекулярной массе в диапазоне, например, от 1 до 10 кДа, в результате чего сополимерные полипептиды удерживаются в ретентате и очищаются, в то время как более низкомолекулярные структуры проходят через мембрану. Сополимерные полипептиды очищаются в том смысле, что из/от удержанных сополимерных полипептидов удаляют/отделяют, по меньшей мере, некоторое количество нежелательного остатка реакционной смеси. Удаление небольших молекул, таких как основания и их соли, в ходе ультрафильтрации в общем случае приводит к уменьшению значения рН первоначально щелочной реакционной смеси или ретентата.

Один аспект изобретения относится к объединению реакционной смеси, характеризующейся первоначальным значением рН, равным 10 и более, предпочтительно 12 и более, и содержащей разнообразие сополимерных полипептидов (т.е. тех, которые в совокупности содержат больше основных аминокислот, чем кислотных аминокислот), с водным раствором кислоты для получения модифицированной реакционной смеси. Значение рН модифицированной реакционной смеси в общем случае составляет 10 и менее, а иногда 8 и менее и обычно находится в диапазоне от 4 до 8 или от 5 до 7. Модифицированную реакционную смесь подвергают ультрафильтрации для получения очищенной реакционной смеси. Для ясности от очищенной смеси не требуется иметь почти абсолютную степень чистоты, а скорое требуется только быть более чистой, чем исходная реакционная смесь. То есть в результате удаления некоторых из небольших молекул оставшиеся полипептиды являются более чистыми и, таким образом, будут считаться очищенными. Реакционная смесь обычно представляет собой результат синтеза полипептидов, но в общем случае включает любую жидкость, содержащую сополимерные полипептиды, для которых очистка в определенной степени является желательной. Например, перед проведением стадии объединения с кислотой реакционную смесь можно концентрировать или подвергать фильтрации, в том числе ультрафильтрации. Но реакционная смесь во время стадии объединения характеризуется значением рН, большим чем 10. Водный раствор кислоты может базироваться на органических или неорганических кислотах. Кислоты обычно необходимо растворять в растворе на водной основе. Обычно используют органические кислоты, содержащие от 1 до 8 атомов углерода, более часто от 1 до 4 атомов углерода; т.е. муравьиную кислоту, уксусную кислоту, пропионовую кислоту или масляную кислоту. Несмотря на упоминание в настоящем документе в единственном числе термин кислота также подразумевает и включение формы во множественном числе; т.е. в растворе могут быть использованы одна или несколько кислот. В общем случае вода является единственным растворителем, хотя при получении водного раствора кислоты не запретным является и использование низших спиртов или других органических растворителей, смешиваемых с водой.

Две стадии зачастую проводят последовательно, где кислоту объединяют с реакционной смесью до начала ультрафильтрации. Но стадии могут быть проведены и одновременно. То есть в то время, как реакционную смесь подвергают ультрафильтрации, с ней может быть объединен водный раствор кислоты для получения модифицированной реакционной смеси по месту. До тех пор пока модифицированную реакционную смесь будут получать до того, как значение рН реакционной смеси или в более надлежащем случае ретентата будет меньшим чем 10, обе стадии будут считаться проведенными. Данная стадия

- 3 019910 одновременных объединения и ультрафильтрации в удобном случае может быть проведена в случае использования в качестве питающего раствора в способе ультрафильтрации водного раствора кислоты.

Вследствие отнесения одного предпочтительного аспекта изобретения к способу очистки полипептидов СОП-1 при использовании кислоты изобретение будет дополнительно описываться в отношении данного варианта осуществления, где кислотой является уксусная кислота. Необходимо понимать то, что вместо уксусной кислоты могут быть использованы и другие вышеупомянутые кислоты. Способ включает добавление водного раствора уксусной кислоты к реакционной смеси, содержащей незащищенные полипептиды СОП-1, для получения солей СОП-1 и уксусной кислоты в модифицированной реакционной смеси и ультрафильтрацию указанной модифицированной реакционной смеси, содержащей указанные соли СОП-1 и уксусной кислоты, для получения очищенных солей СОП-1 и уксусной кислоты, где водный раствор уксусной кислоты добавляют (и получают соли СОП-1 и уксусной кислоты) до проведения для реакционной смеси, содержащей незащищенные полипептиды СОП-1, какой-либо ультрафильтрации.

Водный раствор уксусной кислоты обычно содержит от 0,05 до 0,5 об.% уксусной кислоты в воде, так как приблизительно от 0,1 до 0,3 об.% уксусной кислоты в воде.

Фраза реакционная смесь, содержащая незащищенные полипептиды СОП-1 относится к раствору, содержащему полипептиды СОП-1, по существу, или практически не имеющие боковых групп аминокислоты, защищенных защитной группой. Например, в случае получения полипептидов СОП-1 в результате проведения статистической полимеризации (например, как это описывалось в документе И8 3849550) после снятия защиты с боковых групп аминокислоты получающаяся в результате смесь и будет реакционной смесью, содержащей незащищенные полипептиды СОП-1. В рамках еще одного примера в случае получения полипептидов СОП-1 по методикам рекомбинантной ДНК (например, как это описывалось в документе ЕР 0383620) после экспрессии рекомбинантных полипептидов СОП-1 в Е. со11 и отщепления их от белка слияния белок А/рСОП-1 получающаяся в результате смесь также будет реакционной смесью, содержащей незащищенные полипептиды СОП-1. Таким образом, термин незащищенные полипептиды СОП-1 относится как к полипептидам СОП-1, которые подвергали воздействию стадий создания и снятия защиты (так как при статической полимеризации), так и к полипептидам СОП-1, которые не подвергали воздействию стадии создания защиты (так как в методиках рекомбинантной ДНК).

В одной предпочтительной форме данного варианта осуществления модифицированная реакционная смесь, содержащая соли СОП-1 и уксусной кислоты, до проведения для солей СОП-1 и уксусной кислоты ультрафильтрации характеризуется значением рН, меньшим или равным приблизительно 10. В случае демонстрации реакционной смесью, содержащей незащищенные полипептиды СОП-1, значения рН, большего чем 10, такого как значение рН, большее или равное приблизительно 12, добавление водного раствора уксусной кислоты уменьшает значение рН до желательной величины рН, меньшей или равной приблизительно 10. Однако такое высокое исходное значение рН строго не требуется. То есть перед добавлением водного раствора уксусной кислоты исходная реакционная смесь, содержащая незащищенные полипептиды СОП-1, может характеризоваться и значением рН, меньшим чем 10. Тем не менее, в типичном варианте осуществления изобретения действительно используют реакционную смесь, характеризующуюся значением рН, равным приблизительно 13, и добавление к ней уксусной кислоты уменьшает значение рН до приблизительно 10 и менее. В некоторых из данных вариантов осуществления значение рН модифицированной реакционной смеси перед ультрафильтрацией является меньшим чем 8, таким как значение рН в диапазоне от приблизительно 4 до приблизительно 8 или даже от приблизительно 5 до приблизительно 7. После этого получающуюся в результате модифицированную реакционную среду, характеризующуюся таким пониженным значением рН, подвергают ультрафильтрации для очистки солей СОП-1 и уксусной кислоты.

Ультрафильтрации полипептидов может быть свойственно наличие концентрационного градиента в направлении межфазной поверхности мембраны, известное как концентрационная поляризация. Концентрационная поляризация оказывает негативное воздействие на величину потока (массопереноса через мембрану). Кроме того, на величину потока оказывает воздействие ионная сила ретентата. Потоки в общем случае являются большими при низкой ионной силе и меньшими вблизи от изоэлектрического значения рН подвергаемого ультрафильтрации полипептида (полипептидов). Высокая ионная сила также в результате приводит к получению высокого осмотического давления, что может вносить свой вклад в меньшую величину потока. Изоэлектрическая точка аминокислоты представляет собой значение рН, при котором аминокислота находится в своей диполярной форме - при полной ионизации, но при нулевом результирующем электрическом заряде. Изоэлектрическая точка полипептида представляет собой значение рН, при котором полипептид имеет нулевой результирующий электрический заряд. Средняя изоэлектрическая точка смеси полипептидов представляет собой среднее значение для изоэлектрических точек полипептидов, содержащихся в смеси.

Полипептиды СОП-1 в совокупности содержат больше основных аминокислот, чем кислотных аминокислот, и средняя изоэлектрическая точка для полипептидов СОП-1 обычно является большей чем приблизительно 7, например находится в диапазоне от приблизительно 8 до приблизительно 11, является

- 4 019910 такой как приблизительно 9 или приблизительно 10, в зависимости от фактического соотношения между основными и кислотными аминокислотами, в совокупности присутствующими в полипептидах СОП-1. В выгодном случае модифицированная реакционная смесь, содержащая соли СОП-1 и уксусной кислоты, характеризуется значением рН, которое отличается от средней изоэлектрической точки незащищенных полипептидов СОП-1 по меньшей мере на одну единицу значения рН, поскольку массоперенос через мембрану (поток) является наименьшим при изоэлектрическом значении рН. По-видимому, присутствие анионов уксусной кислоты в модифицированной реакционной смеси/ретентате предотвращает или уменьшает осаждение полипептидов при прохождении смесью/ретентатом через значение рН, соответствующее изоэлектрической точке или другой точке осаждения незащищенных полипептидов СОП-1.

Во время ультрафильтрации обычно используют питающий раствор. При подаче питающим раствором обычно является водный раствор той же самой кислоты, что и использовавшийся для регулирования значения рН, например водный раствор уксусной кислоты. Для ясности в других предпочтительных вариантах осуществления изобретения питающий раствор используют в качестве водного раствора кислоты на стадии объединения или добавления. Предпочтительно концентрация питающего раствора в виде водного раствора уксусной кислоты находится в диапазоне от приблизительно 0,05 до 0,5 об.%, таком как приблизительно от 0,1 до 0,3 об.%. Более высокие концентрации уксусной кислоты могут в результате привести к менее эффективному удалению уксусной кислоты во время последующих стадий выделения (лиофилизации). Необязательно на более поздних стадиях способа ультрафильтрации питающий раствор может быть заменен на воду для удаления избыточной уксусной кислоты; например, как только значение рН будет меньшим, чем 6. Концентрация уксусной кислоты в реакционной смеси обычно не превышает концентрации уксусной кислоты в питающем растворе.

Объем/скорость добавления питающего раствора обычно регулируют для достижения во время ультрафильтрации концентрации солей СОП-1 и уксусной кислоты в ретентате в диапазоне приблизительно от 1 до 50 г на 1 л, зачастую от 20 до 50 г на 1 л, хотя могут быть использованы и более высокие концентрации. Во время ультрафильтрации концентрация в общем случае должна быть не больше, чем приблизительно 100 г на 1 л, и концентраций, равных приблизительно 250 г на 1 л и более, необходимо избегать. Данные более высокие концентрации могут оказывать негативное воздействие на величину потока.

По завершении стадии ультрафильтрации ретентат (модифицированная реакционная смесь), содержащий очищенные полипептиды СОП-1 (очищенные соли СОП-1 и уксусной кислоты), характеризуется значением рН в диапазоне от 5 до 7, таком как от приблизительно 5,5 до приблизительно 6. В выгодном случае ультрафильтрация может быть проведена в течение 20 ч и менее, предпочтительно 10 ч и менее, а более предпочтительно 5 ч и менее. Концентрация очищенных полипептидов СОП-1 в ретентате после завершения обычно находится в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 50 г на 1 л, в общем случае от 20 до 50 г на 1 л, хотя могут быть получены и более высокие концентрации, такие как 75 г на 1 л.

В одном предпочтительном варианте осуществления очищенные полипептиды СОП-1 имеют среднюю молекулярную массу в диапазоне от 4 до 11 кДа (таком как от 5 до 9 кДа или от 6 до 10 кДа) или от 7 до 12 кДа. Обычно молекулярную массу, большую чем 40 кДа, имеют менее чем 5 мас.% очищенных полипептидов СОП-1. Предпочтительно молярная доля полипептидов СОП-1, имеющих молекулярную массу в диапазоне от 2 до 20 кДа, в указанных очищенных полипептидах СОП-1 составляет по меньшей мере 0,75. Термин молярная доля представляет собой количество молей вещества компонента в смеси, деленное на совокупное количество молей в смеси.

Полипептиды СОП-1, подходящие для использования в способе очистки настоящего изобретения, могут быть получены при использовании известных способов. Например, полипептиды СОП-1, в том числе полипептиды СОП-1, характеризующиеся специфическим профилем молекулярной массы, обычно получают в результате проведения статистической полимеризации таким образом, как это продемонстрировано в документах И8 5800808 и И8 2008/0021192. Однако также известен и способ получения полипептидов СОП-1 при использовании технологии рекомбинантной ДНК, что описывалось в документе ЕР 0383620.

Таким образом, способ очистки настоящего изобретения может дополнительно включать стадии, направленные на получение незащищенных полипептидов СОП-1 в результате проведения статистической полимеризации. В частности, способ очистки может дополнительно включать полимеризацию смеси Ν-карбоксиангидридов аланина, защищенной глутаминовой кислоты, защищенного лизина и тирозина для получения защищенных полипептидов СОП-1 и обработку защищенных полипептидов СОП-1 по меньшей мере одним агентом снятия защиты для получения незащищенных полипептидов СОП-1. Защищенная глутаминовая кислота может быть получена при использовании, например, защитной группы бензила или метокси. С другой стороны, защищенный лизин может быть получен при использовании, например, защитной группы циклического имида или трет-бутоксикарбонила.

На молекулярно-массовое распределение полипептидов СОП-1 оказывают воздействие несколько факторов, таких как концентрация инициатора полимеризации, температура реакции и время реакции. После обрыва реакции полимеризации получающаяся в результате полипептидная смесь может быть подвергнута, например, кислотному или щелочному гидролизу для получения меньшей средней молекулярной массы при более широком молекулярно-массовом распределении, так как в случае полипептидов

- 5 019910

СОП-1, характеризующихся описывавшимися выше профилями молекулярной массы. На современном уровне техники известны и различные другие способы получения желательного профиля молекулярной массы.

Агенты снятия защиты, подходящие для использования совместно с соответствующими агентами создания защиты, на современном уровне техники известны. Например, защитная группа бензилового сложного эфира после полимеризации может быть удалена с защищенной глутаминовой кислоты под действием подходящих кислот, таких как 33%-ная бромисто-водородная кислота в уксусной кислоте, которая предпочтительно не содержит брома. Такая стадия кислотного снятия защиты в удобном случае также может быть использована и в качестве стадии деполимеризации, так что снятие защиты и деполимеризацию объединяют в одну стадию. В рамках еще одного примера защитные группы трифторацетила могут быть удалены с защищенного лизина под действием органического основания, такого как пиперидин. Обычно первый агент снятия защиты используют для удаления защитных групп с остатков глутаминовой кислоты (так как в случае 33%-ной бромисто-водородной кислоты), а после этого используют второй агент снятия защиты для удаления защитных групп с остатков лизина (так как в случае пиперидина). Фраза обработка указанных защищенных полипептидов СОП-1 по меньшей мере одним агентом снятия защиты для получения указанных незащищенных полипептидов СОП-1 включает несколько стадий снятия защиты при использовании различных агентов снятия защиты, а также одну стадию снятия защиты или несколько стадий снятия защиты при использовании одного и того же агента снятия защиты.

Необязательно очищенные полипептиды СОП-1 могут быть выделены из ретентата. Например, способ очистки настоящего изобретения может дополнительно включать лиофилизацию очищенных полипептидов СОП-1 в солевой форме после ультрафильтрации. Данным образом могут быть получены твердые ацетаты полипептидов СОП-1. Лиофилизация также делает возможным и удаление избыточной уксусной кислоты, использующейся при ультрафильтрации.

Вышеупомянутый предпочтительный вариант осуществления относится к последовательному проведению стадий объединения кислоты с полипептидом с последующей ультрафильтрацией, необязательно совместно с дополнительной кислотой в качестве питающего раствора. Но в еще одном предпочтительном варианте осуществления данные стадии могут быть проведены одновременно или в режиме перекрывания. Раствор уксусной кислоты может быть объединен с реакционной смесью в качестве питающего раствора в начале ультрафильтрации или во время ультрафильтрации. В данном варианте осуществления кислота должна быть объединена с реакционной смесью не позже, чем при изоэлектрической точке или другой точке рН, при которой происходит осаждение полипептида, т.е. добавлена до осаждения полипептида, а в общем случае не позже, чем при рН 10. В случае реакционной смеси на основе СОП-1 кислоту обычно объединяют не позже, чем при значении рН, равном приблизительно 12. К данному варианту осуществления равным образом относятся и другие выраженные выше условия.

Несмотря на фокусирование приведенного выше описания главным образом на очистке полипептидов СОП-1 при использовании уксусной кислоты и ее солей настоящее изобретение таким образом не ограничивается, и выраженные выше стадии и условия ультрафильтрации, включающие питающий раствор и тому подобное, в общем случае могут быть применены ко всем аспектам изобретения. Подобным образом полипептиды СОП-1 могли бы также быть очищены и при использовании растворов других кислот и их соответствующих кислотно-аддитивных солей. Подобным образом по способу, подобному описывавшемуся для СОП-1, помимо СОП-1 могут быть очищены и другие полипептиды, как это описывалось прежде в настоящем документе.

Изобретение будет дополнительно описываться при обращении к следующим далее неограничивающим примерам.

Примеры

Пример 1.

Полипептид получали в соответствии с описанием в документе И8 3849550. Получающуюся в результате реакционную смесь - 50 мл раствора (пиперидин при 1 моль/л), содержащего 1,0 г полимера, защищенного трифторацетилом - разбавляли до 500 мл при использовании раствора уксусной кислоты в деминерализованной воде с концентрацией 0,3 об.%. Значение рН получающегося в результате раствора составляет приблизительно 10. Разбавленный раствор помещали в резервуар системы Мййроге ЬаЬ5са1е ТЕЕ, снабженной мембраной (РЬССС 5, 50 см²) фильтра 5 кДа РеШсои ХЬ. В выбранных условиях (давление впускного отверстия 30 фунт/дюйм² (207 кПа), давление выпускного отверстия 10 фунт/дюйм²(68,9 кПа), скорость течения пермеата 100 мл/ч) для очистки полимера в качестве питающего раствора использовали 0,3%-ную уксусную кислоту в деминерализованной воде. По истечении 16 ч ретентат характеризовался значением рН, равным приблизительно 5, подачу питающего раствора прекращали и ретентат подвергали ультрафильтрации в течение еще 4 ч для увеличения концентрации полипептида в ретентате до приблизительно 20 г на 1 л. Совокупное время работы составляло 20 ч.

Пример 2 (сравнительный пример).

В рамках сравнительного примера следовали той же самой методике, что и в примере 1, но реакционную смесь разбавляли деминерализованной водой и во время ультрафильтрации деминерализованную воду использовали в качестве питающего раствора. По истечении приблизительно 2 или 3 ч формирова

- 6 019910 лись полимерные агрегаты при достижении значением рН ретентата приблизительно 8 или 9. Данные агрегаты, по-видимому, блокировали фильтр, что в результате приводило к повышенному давлению на мембрану, большему чем 4 бар, что превышало требования по технике безопасности, указанные поставщиком. После этого питающий раствор немедленно переключали на уксусную кислоту с концентрацией 0,3 об.% и ультрафильтрацию продолжали вплоть до достижения значения рН ретентата, равного приблизительно 5. Совокупное время работы увеличивалось от 20 до 24 ч.

Сопоставление примеров демонстрирует преимущества способа, соответствующего изобретению. Помимо опускания одного изменения питающего раствора совокупное время работы значительно уменьшалось вследствие уменьшения или предотвращения осаждения полипептида. Как это ни удивительно, но при прохождении ретентата через изоэлектрическую точку полипептида в примере 1 не наблюдали ни осаждения, ни агрегирования. Кроме того, в примере 1 уменьшали или исключали риск повреждения мембраны. Это выгодно, поскольку в случае эксплуатации мембраны вне указанных пределов безопасного давления ее требуется проверять по завершении прогона ультрафильтрации. При наличии повреждения прогон ультрафильтрации необходимо повторить.

Каждый документ из вышеупомянутых патентов, патентных заявок и брошюр посредством ссылки включается в настоящий документ. Как должно быть очевидно после описания изобретения, оно может варьироваться по многим способам, и все такие модификации предполагаются попадающими в объем изобретения, определенного в следующей далее формуле изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ ультрафильтрации, который включает объединение реакционной смеси, характеризующейся значением рН, равным 10 и более, и содержащей разнообразие сополимерных полипептидов, которые в совокупности имеют больше основных аминокислот, чем кислотных аминокислот, с водным раствором кислоты для получения модифицированной реакционной смеси и подвергание указанной модифицированной реакционной смеси ультрафильтрации для получения очищенной реакционной смеси, причем водный раствор кислоты объединяют с указанной реакционной смесью в качестве питающего раствора во время указанной ультрафильтрации.
2. Способ по п.1, где указанный водный раствор кислоты содержит кислоту, выбранную из группы, состоящей из органических кислот, имеющих от 1 до 8 атомов углерода, предпочтительно уксусной кислоты, и неорганических кислот.
3. Способ по п.1 или 2, где указанные полипептиды образованы из аланина, глутаминовой кислоты и/или аспарагиновой кислоты, лизина и/или аргинина и тирозина.
4. Способ по пп.1-3, где указанное значение рН указанной реакционной смеси перед указанной стадией объединения составляет по меньшей мере 12.
5. Способ по пп.1-4, где (ί) реакционная смесь содержит незащищенные полипептиды СОП-1, и (и) ультрафильтрация указанной модифицированной реакционной смеси приводит к получению очищенных кислотно-аддитивных солей СОП-1.
6. Способ по п.5, где указанная кислота в указанном водном растворе кислоты представляет собой уксусную кислоту и указанные кислотно-аддитивные соли СОП-1 представляют собой кислотноаддитивные соли СОП-1 и уксусной кислоты.
7. Способ по п.5 или 6, где указанная модифицированная реакционная смесь характеризуется значением рН, которое отличается от средней изоэлектрической точки указанных незащищенных полипептидов СОП-1 по меньшей мере на одну единицу значения рН.
8. Способ по пп.1-7, где указанная ультрафильтрация включает прохождение указанной модифицированной реакционной смеси, предпочтительно содержащей указанные кислотно-аддитивные соли СОП1, такие как соли уксусной кислоты, через мембрану, где мембрана характеризуется величиной отсечения по молекулярной массе в диапазоне от 1 до 10 кДа.
9. Способ по п.8, где указанная ультрафильтрация дополнительно включает добавление водного питающего раствора кислоты, предпочтительно водного питающего раствора уксусной кислоты, к указанной модифицированной реакционной смеси, предпочтительно содержащей указанные соли СОП-1 и уксусной кислоты, во время указанной стадии прохождения.
10. Способ по пп.5-9, где указанную ультрафильтрацию проводят до тех пор, пока модифицированная реакционная смесь, предпочтительно содержащая соли СОП-1 и уксусной кислоты, не обладает значением рН в диапазоне от приблизительно 5,5 до приблизительно 6,0.
11. Способ по пп.5-10, где указанную ультрафильтрацию проводят в течение не более чем 20 ч и концентрация солей СОП-1 и уксусной кислоты в указанной модифицированной реакционной смеси после указанной ультрафильтрации находится в диапазоне от приблизительно 2 до приблизительно 50 г на 1 л.
12. Способ по пп.5-11, где указанные очищенные полипептиды СОП-1 имеют среднюю молекулярную массу в диапазоне от 4 до 11 кДа.
13. Способ по пп.5-12, который дополнительно включает:

- 7 019910

a) полимеризацию смеси Ν-карбоксиангидридов аланина, защищенной глутаминовой кислоты, защищенного лизина и тирозина для получения защищенных полипептидов СОП-1; и

b) обработку указанных защищенных полипептидов СОП-1 по меньшей мере одним агентом снятия защиты для получения указанных незащищенных полипептидов СОП-1.
14. Способ по п.13, где указанная защищенная глутаминовая кислота имеет защитную группу бензила или метокси, а указанный защищенный лизин имеет защитную группу циклического имида или 1бутоксикарбонила.
15. Способ по пп.1-14, который дополнительно включает лиофилизацию указанной очищенной реакционной смеси, предпочтительно указанных очищенных полипептидов СОП-1.

Евразийская патентная организация, ЕАПВ

Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2