EA018687B1 - Фракция гликолипидов ферментированных экстрактов биологического пищевого материала и фармацевтическая композиция, содержащая указанную фракцию - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к фракции гликолипидов ферментированных экстрактов биологического пищевого материала, полученной ферментированием биологического пищевого материала, выбранного из пшеничной муки, сыворотки соевого творога, коричневой морской водоросли, в культуральном растворе с использованием Acetobacter aceti, смесей различных видов Acetobacter, Gluconobacter suboxydans, Xanthomonas campestris или Enterobacter cloacae, которая безопасна для добавления в фармацевтические препараты и продукты питания. Изобретение также относится к способу получения указанной фракции и фармацевтической композиции, содержащей указанную фракцию, обладающей анальгетическим и антиаллергическим действием.

Description

Изобретение касается способа ферментации биологического пищевого материала посредством грамотрицательных бактерий с получением фракции гликолипидов, которая безопасна для добавления в фармацевтические препараты, парафармацевтические средства, косметические средства, функциональные продукты питания, корма, удобрения и средства для ванны, используемые для растений и животных, таких как млекопитающие (в частности, домашние животные и комнатные домашние животные), включая людей, птиц (в частности, домашних кур и комнатных птиц), амфибий, рептилий, рыб (в частности, аквариумных рыб) и беспозвоночных животных, а также касается фракции гликолипидов и фармацевтической композиции, которая ее содержит.

Уровень техники изобретения

Разработка способов предотвращения или лечения болезней, которые включают в себя технологии защиты от инфекции, является неотложной проблемой для млекопитающих (в частности, домашних животных и комнатных животных), включающих в себя людей, птиц (в частности, домашних кур и комнатных птиц), амфибий, рептилий, рыб (в частности, аквариумных рыб), беспозвоночных животных и растений. Дополнительно, для их осуществления настоятельно требуются способы, в которых не применяются какие-либо химикаты, не происходит какое-либо экологическое загрязнение, отсутствуют устойчивые бактерии и не происходит накопления в организме человека. По вышеупомянутой проблеме авторы настоящего изобретения выявили, что эффект предотвращения и лечения болезней успешно достигается с иммуностимулятором, полученным из продукта природного происхождения (непатентная литература 1). В качестве одного из примеров такого продукта можно использовать липополисахарид, полученный из РаШоеа адд1ошегап8, которые являются резидентными бактериями пшеницы (непатентная литература 1). Известно, что Ь1ти1и8 - положительный гликолипид (по реакции с лизатом амебоцитов мечехвоста (Ь1ти1и8 ро1урНетп5)). обладает мощным иммуностимулирущим действием (непатентная литература 2). Так называемый липополисахарид также включен в эту категорию. Известно, что липополисахарид является основным компонентом наружной клеточной оболочки грамотрицательных бактерий, а также одним из основных компонентов вакцины Коли и обладает мощным иммуностимулирующим действием (непатентная литература 3).

Авторы настоящего изобретения выявили, что Ыти1и8-положительные гликолипиды присутствуют в пшенице, часть их представляет собой липополисахарид симбиотических бактерий пшеницы, и они мощно стимулируют врожденный иммунитет (непатентная литература 4). Вышеупомянутые гликолипиды и липополисахариды являются безопасными и мощными стимуляторами врожденного иммунитета при подкожном или пероральном введении и проявляют профилактическое и терапевтическое действие для широкого диапазона заболеваний, включающих в себя инфекционные заболевания (непатентная литература 5). Кроме того, авторы настоящего изобретения сообщают, что вместо антибиотических химических веществ защитный противоинфекционный эффект в области животноводства и аквакультуры в качестве безопасных и надежных материалов природного происхождения проявляет не только липополисахарид, полученный из РаШоеа адд1отегаи8, содержание которого повышено ферментацией пшеничной муки посредством РаШоеа адд1отегаи8, являющихся резидентными бактериями в пшеничной муке, но также экстракт ферментированной пшеницы, который является новым иммуностимулятором, содержащим компоненты, полученные из пшеницы.

Основную структуру липополисахарида составляет липид, называемый липидом А, и различные сахара (полисахарид), ковалентно связанные с липидом. Участок, следующий за липидом А, состоит из ядра Я, и у родственных бактерий он имеет относительно однородную структуру, и далее расположен участок антигена О полисахарида, структура которого отличается в зависимости от видов бактерий (непатентная литература 7). Антиген О также имеет повторяемую структуру того же олигосахарида, который является характерным для ЛПС (липополисахарида) (непатентная литература 1). Таким образом, липополисахарид обычно представляет собой смесь, где соединения имеют различный молекулярный вес. Также известно, что структура липополисахарида различается в зависимости от микроорганизма, из которого происходит липополисахарид. Например, липополисахарид, происходящий из 8а1тоие11а и липополисахарид, поисходящий из Е5с11епс1ва сой, различаются по структуре, а также по биологической активности. Вместе с тем, в силу обычно затрудненного определения структуры липополисахарида, неизвестны детали структуры и функции липополисахаридов, происходящих из грамотрицательных бактерий. Таким образом, описано, на основании функциональных различий, наличие у липополисахарида обычно новой структуры.

В то же время в последних исследованиях показано, что липополисахарид стимулирует врожденный иммунитет посредством То11-подобного рецептора 4 (ТЬК4) (непатентная литература 6). Было выявлено, что участок липида А липополисахарида является необходимым для связывания с ТЬК.4 и что полисахаридный участок в значительной степени влияет на эффективность внутриклеточной трансдукции сигнала ТЬК4. Исходя из вышеупомянутого, предполагается, что различия в клеточной реакции липополисахарида указывают на структурное различие.

Для установления полезности липополисахарида важно показать надежность и безопасность подкожного или перорального введения липополисахарида. Таким образом, особое значение имеют грамот

- 1 018687 рицательные бактерии, общепринято используемые в производстве и ферментации продуктов питания. В этой связи, если в грамотрицательных бактериях, используемых в производстве продуктов питания и представляемых в виде съедобных продуктов с ферментированными продуктами, присутствуют Ыиш1и5положительный гликолипид и липополисахарид, этот факт показывает, что существует опыт использования в пище Ы11'ш1и5-положительного гликолипида и липополисахарида. Выявлены убедительные доказательства, что подкожное или пероральное введение Ь1ти1и8-положительного гликолипида или липополисахарида является надежным и безопасным и что в то же время должна появиться возможность разрабатывать с использованием указанных веществ новые продукты для здоровья и фармацевтические препараты, такие как косметические средства и продукты питания.

Непатентная литература 1. С1пс КойсЫ с1 а1., Иа!ига1 йппшпйу гсди1а!огу асбоп оГ ГсгтсгИсб \\'йса1 схбас!, №\ν Еооб 1п6и8!гу (2006), Уо1. 48, р. 19-27.

Непатентная литература 2. И1тсг, Ά.Ι с! а1., Ыроройъассйапбс: 8бис!игс, Вюасбуйу, Вссср1ог5. апб 8щпа1 Ттапкбисбоп. Ттспбк ίη С1усо5с1спсс апб С1усо1ссйпо1оду (2002),Уо1. 14, р. 53-68.

Непатентная литература 3. 8!атс§, С.О., Со1су’8 1ох1п§ ίη рсгарссбус. Ыа1игс (1992), Уо1. 357, р. 1112.

Непатентная литература 4. ИщЫ/ата, Т. с! а1., Сйст. Рйагт. Ви11. (1992), Уо1. 40, р. 479-483.

Непатентная литература 5. 1падата Н. с! а1., ЕГГсс!8 оГ йроройъассйапбс (ЬР8те) бспусб Ггот \\'йса1 Г1оиг йаутд тасгорйадс асбуабпд сГГсс! оп бса!тсп! апб ргсуспбоп оГ уапоик б^сакск. ВюШстару (1991), Уо1. 5, р. 617-621.

Непатентная литература 6. Ктуобп Таксба1 с! а1., То11-бкс гссср!от8 ίη 1ппа!с йпишийу. 1п!сгпабопа1 1ттипо1оду, Уо1. 17, р. 1-14.

Непатентная литература 7. 8с1кадаки Л!сп 2п6 сбйюп (1990), Токуо Кадаки Оо]1п, р. 1949.

Раскрытие изобретения Задачи для решения согласно изобретению

Иммуностимулятор часто получают из полисахаридов грибов и морских водорослей или из полисахаридов грамположительных бактерий, таких как молочнокислые бактерии. Коммерчески доступные продукты полисахаридных экстрактов из грибов или морских водорослей являются чрезвычайно дорогими в силу трудности получения большого количества материала и высокой стоимости экстракции. При этом для культивирования грамположительных бактерий, таких как молочнокислые бактерии, используют материалы от животных. Таким образом, стоимость культивирования является высокой и существует проблема безопасности животных компонентов. С другой стороны, для получения иммуностимулятора из микроорганизма, который широко распространен и постоянно присутствует в растениях, является полезным эффективное культивирование микроорганизма в растительных компонентах и получение структурного компонента или его продукта. В качестве примера можно безопасно и с малыми затратами получать Рап!оса адд1отсгап8, находящиеся в пшенице, путем культивирования их с использованием в качестве среды пшеничной муки. При этом практически не существует опыта осознанного перорального употребления грамотрицательных бактерий. Таким образом, безопасность их продолжительного перорального употребления в общем является неизвестной.

Вместе с тем было выявлено, что пероральное введение экстракта Рап!оса адд1отстап8, культивированных с пшеничной мукой, является высокобезопасным. Человечество употребляет Рап!оса адд1отсгап8 с пищей на протяжении долгого времени с начала выращивания пшеницы, поскольку их присутствие в муке является постоянным. Т.е. существует продолжительный опыт употребления в пищу Рап!оса адд1отсгап8 и их компонентов. Фактически, необходимая для роста молочнокислых бактерий ржаного хлеба фолиевая кислота обеспечивается с помощью Рап!оса адд1отстап8, которые растут во время процесса ферментации. Таким образом, рост Рап!оса адд1отсгап§ является необходимым для производства ржаного хлеба. При употреблении ржаного хлеба поглощается значительное количество компонентов микробной клетки. Среди грамотрицательных бактерий, в отношении которых также существует опыт употребления их в пищу, и возможных для культивирования с растительными компонентами, доступными являются Асс!оЬас!ст ассб, используемые для производства уксусов, (1) Асс!оЬас!ст хуйпит, (2) 2утотопа§ тоЬ1118, (3) ХапФотопак сатрсЧгб и (4) Еп!сгоЬас!сг с1оасас, используемые для производства (1) десерта па!а бс сосо, (2) текилы, (3) ксантановой камеди, (4) салапао (ка1арао). Вместе с тем, в процессе их ферментации сложно культивировать много видов бактерий и не происходит рост единственного вида бактерий. Например, в процессе производства уксуса сначала АкрстдШик вырабатывают сахар, затем 8ассйаготусск вырабатывают этанол и после происходит рост Асс!оЬас!сг. При этом культивирование единственных Асс!оЬас!сг осуществляют в среде 8Н Шрамма Хестрина (Зсйгатт-Нсйпп) (20 г глюкозы, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г полипептона, 1,15 г лимонной кислоты, 2,7 г динатрия гидрофосфата и 1000 мл дистиллированной воды), которая является стандартной средой. При этом полипептон является продуктом расщепления казеина коровьего молока ферментом, который представляет собой дорогостоящий белок, полученный из рогатого скота, и также остаются проблемы относительно его безопасности.

В настоящее время доступно несколько типов грамотрицательных бактерий, известных для использования в ферментации пищевых продуктов или обеспечиваемых в виде съедобного продукта вместе с

- 2 018687 ферментированным продуктом. Примерами таких съедобных продуктов являются уксус, текила, йогурт и хлеб. При этом не сообщается о том, что ЫтШик-положительный гликолипид или липополисахарид присутствует в грамотрицательных бактериях (Асе1оЬас1ег, С1исопоЬас1сг. Рга1ешта, 2утотопак или 61исоиоЬас1ег киЬохубапк), используемых при ферментации пищи или обеспечиваемых в качестве съедобного продукта вместе с ферментированным продуктом.

С учетом вышеупомянутых проблем настоящее изобретение нацелено на идею, что пероральное введение грамотрицательных бактерий, опыт употребления в пищу которых существует продолжительное время, является высокобезопасным, и целью настоящего изобретения является обеспечение культурального раствора, полученного путем культивирования грамотрицательных бактерий, опыт употребления в пищу которых существует продолжительное время, и которые можно культивировать с растительными компонентами при малой стоимости способа, их экстракты, композиция экстракта, а также липополисахарид и способ получения липополисахарида.

Целью настоящего изобретения является фракция гликолипидов ферментированных экстрактов биологического пищевого материала, полученная ферментированием биологического пищевого материала в культуральном растворе с использованием Асе1оЬас1ег асей, смесей различных видов Асе1оЬас1ег, 61исоиоЬас1ег киЬохубапк, ХалШотопак сатрекйтк или Еи1егоЬас1ег с1оасае, которая безопасна в производстве продуктов питания, может быть представлена в виде съедобного продукта с ферментированными продуктами и обладает иммуностимулирующим действием. Считается, что происхождение указанного иммуностимулирующего действия обусловлено липополисахаридом, который присутствует в Асе1оЬас1ег. Поэтому считается, что Ьнтйик-положительный гликолипид или липополисахарид можно извлекать аналогичным способом из обладающих иммуностимулирующим действием грамотрицательных бактерий, отличных от Асе1оЬас1ег. Таким образом, очевидно, что настоящее изобретение не ограничено микроорганизмами, описанными в разделе примеров, и может быть адаптировано к другим микроорганизмам, таким как 2утотонак и С1исоиоЬас1ег, которые представляют собой грамотрицательные бактерии с иммуностимулирующим действием. Кроме того, поскольку фракция гликолипидов, представляемая настоящим изобретением, способна безопасно стимулировать иммунитет путем перорального или подкожного введения, ее можно включать в состав фармацевтических композиций и использовать в фармацевтических препаратах, пищевых продуктах, продуктах для ухода за кожей, кормах и продуктах для комнатных животных, которые широко используются с целью поддержания здоровья животных и растений.

Средства решения задачи

Способ получения фракции гликолипидов ферментированных экстрактов биологического пищевого материала настоящего изобретения включает ферментирование биологического пищевого материала, выбранного из пшеничной муки, сыворотки соевого творога, коричневой морской водоросли, в культуральном растворе, содержащем Асе1оЬас1ег асей, смеси различных видов Асе1оЬас1ег, 61исоиоЬас1ег киЬохубапк, ХалШотопак сатрекйтк или Еи1егоЬас1ег с1оасае, последующее экстрагирование твердого содержимого культуральных растворов горячей водой, охлаждение и отделение супернатанта, содержащего фракцию гликолипидов, и центрифугирование.

Фракцию гликолипидов настоящего изобретения, полученную указанным способом, вводят в состав фармацевтической композиции, обладающей анальгетическим действием и антиаллергическим действием.

Ферментированный растительный экстракт настоящего изобретения получают указанным способом ферментации и культивирования.

Порошок ферментированного растительного экстракта настоящего изобретения получают из ферментированного растительного экстракта.

Композиция ферментированного растительного экстракта настоящего изобретения содержит ферментированный растительный экстракт или порошок ферментированного растительного экстракта.

Композиция ферментированного растительного экстракта может представлять собой фармацевтический препарат, фармацевтический препарат для животных, парафармацевтическое средство, косметическое средство, пищевой продукт, функциональный пищевой продукт, корм или средство для ванны.

Композиция ферментированного растительного экстракта может проявлять противовоспалительное действие при болезни кишечника, антиаллергическое действие при аллергическом заболевании, анальгетическое действие, противораковое действие, действие снижения уровня холестерина, действие снижения уровня сахара в крови, действие повышения способности к естественному оздоровлению или иммуностимулирующее действие.

Липополисахарид настоящего изобретения получают из бактерии, культивируемой указанным способом ферментации и культивирования.

Способ получения липополисахарида настоящего изобретения содержит получение липополисахарида из бактерии, культивируемой указанным способом ферментации и культивирования.

Липополисахарид настоящего изобретения получают из Асе1оЬас1ег.

Способ получения липополисахарида настоящего изобретения содержит получение липополисахарида из Асе1оЬас1ег.

- 3 018687

Эффект изобретения

Согласно настоящему изобретению очевидно, что Ыти1и8-положительный гликолипид содержится в экстракте Асс1оЬас1сг ассй, в смеси экстракта Асс1оЬас1сг - экстракта С1нсопоЬас1сг киЬохубапк, и что липополисахарид содержится в Ыти1и8-положительном гликолипиде. Этим показано, что Ыти1и8положительный гликолипид или липополисахарид содержатся в грамотрицательных бактериях, используемых в пищевых продуктах, и в результате обеспечивается липополисахарид в Ыти1и8-положительном гликолипиде в качестве безопасного, надежного и недорогой иммуностимулятора, для которого существует опыт продолжительного употребления в пищу.

Настоящее описание включает в себя содержание данного описания и/или фигуры Японской патентной заявки № 2005-342971, которая является основанием для приоритета настоящего изобретения.

Лучшие способы осуществления изобретения

Далее в настоящем изобретении будут подробно описаны предпочтительные примеры настоящего изобретения.

Пример 1.

Ферментированный растительный экстракт, содержащий Ыти1и8-положительный гликолипид Асс1оЬас1сг.

Ферментированный растительный иммуностимулирующий экстракт, полученный путем ферментации растительного компонента с использованием только единственных бактерий Асс1оЬас1сг.

(1) Ферментированный экстракт пшеницы.

A. Получение.

Культивирование разных видов Асс1оЬас1сг с мукой.

Пшеничную муку (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфат гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Асс1оЬас1сг ассО. или 0,1 мл смеси Асс1оЬас1сг. или одну колонию С1исопоЬас!ст киЬохубапк, затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30°С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90°С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли эндотоксин-специфическим Ыти1и8-тестом (спбокрссу).

B. Физические свойства и биологическая активность.

Ыти1и8-реакция.

В результате измерения тестом спбокрссу содержания гликолипидов в каждом ферментированном посредством Асс1оЬас1сг экстракте пшеницы было выявлено, что экстракцией получено около 18, 56 и 43 мкг гликолипидов соответственно на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта пшеницы, ферментированного посредством Асс1оЬас1сг ассй, экстракта пшеницы, ферментированного посредством смеси Асс!оЬас!сг, и экстракта пшеницы, ферментированного посредством С1исопоЬас!ст киЬохубапк.

Реакция крахмала с йодом.

Компоненты, происходящие из пшеницы, также содержатся в каждом ферментированном экстракте пшеницы, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Асс1оЬас1сг. Чтобы это продемонстрировать, применяли реакцию крахмала с йодом. Все ферментированные экстракты пшеницы давали положительную реакцию крахмала с йодом, однако очищенный липополисахарид, происходящий из Асс!оЬас!сг, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (N0) посредством разных ферментированных Асс1оЬас1сг экстрактов пшеницы, и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов разными ферментированными экстрактами пшеницы настоящего изобретения, путем измерения продукции ФНО или N0, в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта пшеницы, ферментированного Асс1оЬас1сг ассй, экстракта пшеницы, ферментированного смесью Асс!оЬас!сг, и экстракта пшеницы, ферментированного С1исопоЬас!ст киЬохубапк в пересчете на количество ЛПСр (липополисахарид из Рап!оса адд1отсгап8), пересчитанное на основании результата реакции Ытц1и8. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации в количестве 10 ед./мл или больше при добавлении экстракта пшеницы, ферментированного посредством Асс!оЬас!сг, в концентрации 100 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции N0, аналогично с ЛПСр, наблюдали зависевшую от концентрации про- 4 018687 дукцию N0 в концентрации 10 мкМ/мл или больше при добавлении экстракта пшеницы, ферментированного Асе1оЬас1ег асей, экстракта пшеницы, ферментированного смесью Аее1оЬае1ег, и экстракта пшеницы, ферментированного С1нсопоЬас1ег киЬохуйапк, в концентрации 100 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции N0 выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта пшеницы, ферментированного Асе1оЬас1ег асей, экстракта пшеницы, ферментированного смесью Асе1оЬас1ег и экстракта пшеницы, ферментированного С1нсопоЬас1ег киЬохуйапк, с полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция N0 почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении любого из тестовых ферментированных посредством Асе1оЬас1ег экстрактов пшеницы в концентрации 100 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(2) Ферментированный посредством Асе1оЬас1ег экстракт сыворотки соевого творога.

A. Получение.

Высушенную сыворотку соевого творога (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфата гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Асе1оЬас1ег асей, или 0,1 мл смеси Асе1оЬас1ег или одну колонию С1нсопоЬас1ег киЬохуйапк, затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30°С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90°С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом епйокресу.

B. Физические свойства и биологическая активность.

Ыти1и8-реакция.

В результате измерения тестом епйокресу содержания гликолипидов в каждом ферментированном посредством Асе1оЬас1ег экстракте сыворотки соевого творога было выявлено, что экстракцией получено около 4, 23 и 21 мкг гликолипидов соответственно на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного посредством Асе1оЬас1ег асей, экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного посредством смеси Асе1оЬас1ег и экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного посредством С1нсопоЬас1ег киЬохуйапк.

Ксантопротеиновая реакция.

Компоненты, происходящие из сыворотки соевого творога, также содержатся в ферментированном посредством Асе1оЬас1ег экстракте сыворотки соевого творога, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Асе1оЬас1ег. Чтобы это продемонстрировать, применяли ксантопротеиновую реакцию. Все ферментированные экстракты сыворотки соевого творога давали положительную ксантопротеиновую реакцию, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Асе!оЬас!ег, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (N0) посредством разных ферментированных Асе1оЬас1ег экстрактов сыворотки соевого творога, и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов разными ферментированными посредством Асе1оЬас1ег экстрактами сыворотки соевого творога настоящего изобретения путем измерения продукции ФНО или N0 в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Асе1оЬас1ег асей, экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного смесью Асе1оЬас1ег и экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного С1нсопоЬас1ег киЬохуйапк в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Ынш1и5. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации, составлявшая 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного посредством Асе1оЬас1ег в концентрации 100 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции N0, аналогично с ЛПСр, наблюдали продукцию N0 в концентрации 10 мкМ/мл или больше, зависевшую от концентрации, при добавлении экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Асе1оЬас1ег асей, экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного смесью Асе1оЬас1ег и экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного С1нсопоЬас1ег киЬохуйапк, в концентрации 100 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции N0 выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стиму

- 5 018687 лированных посредством экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Лсе1оЬае1ег асс11. экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного смесью Лсе1оЬас1ег, и экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного С1исопоЬас!ег киЬохубапк, с полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция N0 почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении любого из тестовых ферментированных посредством Асе1оЬас1ег экстрактов сыворотки соевого творога в концентрации 100 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(3) Ферментированный посредством Асе1оЬас1ег экстракт коричневой морской водоросли.

A. Получение.

Порошок сушеного мекабу (текаЬи) (спорофилл коричневой морской водоросли) (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфата гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Асе1оЬас1ег асей, или 0,1 мл смеси Асе1оЬас1ег, или одну колонию С1исопоЬас!ег киЬохубапк, затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30°С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90°С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом епбокресу.

B. Физические свойства и биологическая активность.

Ыти1и8-реакция.

В результате измерения тестом епбокресу содержания гликолипидов в каждом ферментированном посредством Асе1оЬас1ег экстракте коричневой морской водоросли было выявлено, что экстракцией получено около 17, 62 и 46 гликолипидов соответственно на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного посредством Асе1оЬас1ег асей, экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного посредством смеси Асе1оЬас1ег, и экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного посредством 61исопоЬас!ег киЬохубапк.

Реакция на β-гликан.

Компоненты, происходящие из коричневой морской водоросли, также содержатся в ферментированном Асе1оЬас1ег экстракте коричневой морской водоросли, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Асе1оЬас1ег. Чтобы это продемонстрировать, применяли реакцию на βгликан, с ипользованием теста Рипдйес 6 Тек! МК (8е1кадаки Согрогайоп). Все ферментированные Асе!оЬас!ег экстракты коричневой морской водоросли давали положительную реакцию на β-гликан, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Асе!оЬас!ег, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (N0) посредством разных ферментированных Асе!оЬас!ег экстрактов коричневой морской водоросли, и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов разными ферментированными экстрактами коричневой морской водоросли настоящего изобретения путем измерения продукции ФНО или N0 в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Асе!оЬас!ег асей, экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного смесью Асе!оЬас!ег, и экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного С1исопоЬас!ег киЬохубапк в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Ь1ти1ик. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации, составлявшая 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного посредством Асе!оЬас!ег, в концентрации 100 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции N0 наблюдали продукцию N0 в концентрации 10 мкМ/мл или больше, зависевшую от концентрации, при добавлении экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Асе!оЬас!ег асей, экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного смесью Асе!оЬас!ег, и экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного 61исопоЬас!ег киЬохубапк, в концентрации 100 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции N0 выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Асе!оЬас!ег

- 6 018687 аеск. экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного смесью Асе1оЬас1ег, и экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного С1исопоЬае1сг киЬохуйапк, с полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция N0 почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении любого из тестовых ферментированных посредством Лсс1оЬас1сг экстрактов коричневой морской водоросли в концентрации 100 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(4) Пример практического применения разных ферментированных посредством Асе1оЬас1ег асей растительных экстрактов в функциональных продуктах питания.

Производство леденцов, содержащих разные растительные экстракты, ферментированные посредством Асе1оЬас1ег асей.

Смешивали такие материалы, как сахарный песок, густой мальтозный сироп, воду и каждый из ферментированных Асе1оЬас1ег асей растительных экстрактов (пшеничный экстракт Асе1оЬас1ег асей, экстракт сыворотки соевого творога, или ферментированный экстракт коричневой морской водоросли), полученных в указанном примере, в соотношении 5:5:5:1, полученную смесь нагревали до температуры от 120 до 160°С для уваривания. Уваренную смесь охлаждали на стальном листе для охлаждения, вытягивали в виде стержня и формовали в виде гранул весом около 1 г для получения леденцов.

Подходящее количество этих леденцов помещали в 20 мл воды и растворяли нагреванием. В полученном растворе измеряли количество липополисахарида в качестве активного компонента растительного экстракта, ферментированного Асе1оЬас1ег, и количество составляло соответственно 3,5, 3,1 и 2,4 мкг/г для ферментированного Асе1оЬас1ег асей экстракта пшеницы, ферментированного Асе1оЬас1ег асей экстракта сыворотки соевого творога и ферментированного Асе1оЬас1ег асей экстракта коричневой морской водоросли. Эти леденцы употребляли 6 мужчин и женщин, страдающие болью в горле по причине простуды. Сразу после применения леденцов проводили осмотр больного горла. В отношении боли в горле, все 6 человек чувствовали облегчение боли в горле при приеме каждого ферментированного Асе1оЬас1ег асей растительного экстракта (один образец критерия знаков: р<0,03).

(5) Пример эффективности лекарственных препаратов разных ферментированных Асе1оЬас1ег асей растительных экстрактов.

Действие ингибирования атопического дерматита каждого растительного экстракта, ферментированного посредством Асе1оЬас1ег асей.

Для изучения действия при атопическом дерматите каждого из растительных экстрактов, ферментированных посредством Асе1оЬас1ег асей, использовали модели аллергии I типа. Крысиное моноклональное антитело к антидинитрофенилу (1 мкг/на мышь) внутривенно вводили одной группе из 5 самцов мышей ВАЬВ/с. Через 1 ч внутрикожно в брюшную стенку вводили полученные в этом примере ферментированный Асе1оЬас1ег асей экстракт пшеницы, ферментированный Асе1оЬас1ег асей экстракт сыворотки соевого творога или ферментированный Асе1оЬас1ег асей экстракт коричневой морской водоросли (каждый экстракт в дозе 50 мкл/на мышь). Еще через 1 ч 20 мкл смеси раствора 0,25% ацетона, содержащего динитрофторбензол, и оливкового масла (4:1) в качестве аллергена наносили на поверхностную и заднюю сторону наружного уха мышей. Толщину наружного уха измеряли через 1, 2, 24 и 48 ч после нанесения, используя калибр толщины, и степень отека отражена в разнице (Δ) полученной толщины с толщиной уха непосредственно перед нанесением аллергена. Эффективность введения препарата оценивали по коэффициенту ингибирования=(1^ отек наружного уха после введения препарата/Δ отек наружного уха в контрольной группе)х100, полученному для ранней реакции, наблюдаемой через 1 ч после введения аллергена, и отсроченной реакции, индуцированной через 24 ч. Результаты показаны в табл. 1. Из табл. 1 очевидно, что наблюдается ингибирование аллергической реакции с ферментированным Асе1оЬас1ег асей экстрактом пшеницы, ферментированным Асе1оЬас1ег асей экстрактом сыворотки соевого творога и ферментированным Асе1оЬас1ег асей экстрактом коричневой морской водоросли.

Таблица 1

Действие ингибирования аллергической реакции разных растительных экстрактов, ферментированных посредством Асе1оЬас1ег асей

Способ введения экстракта	Коэффициент ингибирования (%) (через один час)	Коэффициент ингибирования (%) (через 24 часа)
Ферментированный экстракт пшеницы	83,3	85,3
Ферментированный экстракт сыворотки соевого творога	89, 4	78, 9
Ферментированный экстракт коричневой морской водоросли	75, 1	98,2

- 7 018687

Пример 2.

Ферментированный растительный экстракт, содержащий ЬтиШк-положительный гликолипид из Хайкотопак.

Ферментированный растительный иммуностимулирующий экстракт, полученный путем ферментации растительного компонента единственными ХаШНотопак.

(1) Ферментированный экстракт пшеницы.

A. Получение.

Культивирование ХапШотопак с пшеницей.

Пшеничную муку (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфат гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию ХапОютопак сатреЧпк, затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30°С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90°С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом епбокресу.

B. Физические свойства и биологическая активность.

Ь1тц1ик-реакция.

В результате измерения тестом епбокресу содержания гликолипидов в каждом ферментированном посредством Хапбютопак экстракте пшеницы было выявлено, что экстракцией получено около 2,2 мг гликолипидов на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта пшеницы, ферментированного Хапбютопак сатрекбгк.

Реакция крахмала с йодом.

Компоненты, происходящие из пшеницы, также содержатся в каждом ферментированном экстракте пшеницы, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из ХапШошопак. Чтобы это продемонстрировать, применяли реакцию крахмала с йодом. Ферментированный экстракт пшеницы давал положительную реакцию крахмала с йодом, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из ХаиШотопак, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (N0) посредством ферментированных Хапбютопак экстрактов пшеницы и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов экстрактами пшеницы, ферментированными Xаηΐйошоиак, путем измерения продукции ФНО или N0 в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта, ферментированного Хапбютопак сатреЧпк, в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции ЫтиШк. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации в количестве 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта пшеницы, ферментированного посредством Хапбтотопак, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции N0, аналогично с ЛПСр, наблюдали зависевшую от концентрации продукцию N0, в концентрации 10 мкМ/мл или больше, при добавлении экстракта пшеницы, ферментированного Хапбютопак, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции N0 выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта пшеницы, ферментированного Xаиΐйошоηак, полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция N0 почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении ферментированного посредством Ха^^тошк экстракта пшеницы в концентрации 10 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(2) Ферментированный посредством Хапбютопак экстракт сыворотки соевого творога.

А. Получение.

Сухой экстракт сыворотки соевого творога (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфат гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Хапбютопак сатреЧпк и затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30°С в течение 5 дней.

- 8 018687

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90°С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом епбокресу.

В. Физические свойства и биологическая активность.

Ь1тц1ик-реакция.

В результате измерения тестом епбокресу содержания гликолипидов в ферментированном посредством ХапШотопак экстракте сыворотки соевого творога было выявлено, что экстракцией получено около 1,6 мг гликолипидов на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта, ферментированного ХаШйотопак сатрекйтк.

Ксантопротеиновая реакция.

Компоненты, происходящие из сыворотки соевого творога, также содержатся в ферментированном экстракте сыворотки соевого творога, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Хапбютопак. Чтобы это продемонстрировать, применяли ксантопротеиновую реакцию. Ферментированный экстракт сыворотки соевого творога давал положительную ксантопротеиновую реакцию, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Хапбютопак. не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (N0) посредством ферментированных Хапбтотопак экстрактов сыворотки соевого творога и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов экстрактами сыворотки соевого творога, ферментированными Хаййотопак, путем измерения продукции ФНО или N0, в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта, ферментированного ХапЙютопак сатрек!пк, в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Ь1ти1ик. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации в количестве 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного посредством Хаййотопак, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции N0, аналогично с ЛПСр, наблюдали зависевшую от концентрации продукцию N0, в концентрации 10 мкМ/мл или больше, при добавлении экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Хаййотопак, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции N0 выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного ХапШотопак, полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция N0 почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении ферментированного посредством Хапйютопак экстракта сыворотки соевого творога в концентрации 10 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(3) Ферментированный посредством Хапйютопак экстракт коричневой морской водоросли.

A. Получение.

Порошок сушеного мекабу (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфат гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию ХапЙютопак сатрекйтк, и затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30°С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90°С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом епбокресу.

B. Физические свойства и биологическая активность.

Ь1ти1ик-реакция.

В результате измерения тестом епбокресу содержания гликолипидов в ферментированном посредством Хап1йотопак экстракте коричневой морской водоросли было выявлено, что экстракцией получено около 2,2 мг гликолипидов на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта коричневой морской водоросли,

- 9 018687 ферментированного ХапОютопах сатрехШх.

Реакция на β-глюкан.

Компоненты, происходящие из коричневой морской водоросли, также содержатся в ферментированном ХаШкотопах экстракте коричневой морской водоросли, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Хаййотопак. Чтобы это продемонстрировать, применяли реакцию на βглюкан, с использованием теста Рипдйес 6 Тех1 МК (8е1кадаки Сотротайоп). Ферментированный ХапОтотопах экстракт коричневой морской водоросли давал положительную реакцию на β-глюкан, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Хаййотопау не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (N0) посредством ферментированных ХапОютопах экстрактов коричневой морской водоросли и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов экстрактами коричневой морской водоросли, ферментированными ХаШкотопах. путем измерения продукции ФНО или N0, в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта, ферментированного ХапПотопам сатрехйтх, в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Ыти1их. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации в количестве 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного посредством ХапОютопа^ в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции N0, аналогично с ЛПСр, наблюдали зависевшую от концентрации продукцию N0, в концентрации 10 мкМ/мл или больше, при добавлении экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного ХаиШошопау в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции N0 выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Xаиΐйошоиах, полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция N0 почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении ферментированного посредством ХапОютопах экстракта коричневой морской водоросли в концентрации 10 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(4) Пример практического применения разных ферментированных посредством Хапйютопах растительных экстрактов в функциональных продуктах питания.

Производство леденцов, содержащих разные растительные экстракты, ферментированные посредством Хап11тотопах.

Смешивали такие материалы как сахарный песок, густой мальтозный сироп, воду и каждый из ферментированных посредством ХапОютопах растительных экстрактов (пшеничный экстракт Xаиΐйошоиах, экстракт сыворотки соевого творога, или ферментированный экстракт коричневой морской водоросли), полученных в указанном примере, в соотношении 5:5:5:1, полученную смесь нагревали до температуры от 120 до 160°С для уваривания. Уваренную смесь охлаждали на стальном листе для охлаждения, вытягивали в виде стержня и формовали в виде гранул весом около 1 г для получения леденцов.

Подходящее количество этих леденцов помещали в 20 мл воды и растворяли нагреванием. В полученном растворе измеряли количество липополисахарида в качестве активного компонента растительного экстракта, ферментированного Xаиΐйошоиах, и это количество составляло соответственно 3,5, 3,1 и 2,4 мкг/г для ферментированного ХапФотопах экстракта пшеницы, ферментированного ХапФотопах экстракта сыворотки соевого творога и ферментированного ХапОютопах экстракта коричневой морской водоросли. Эти леденцы употребляли 6 мужчин и женщин, страдающие болью в горле по причине простуды. Сразу после применения леденцов проводили осмотр больного горла. В отношении боли в горле, все 6 человек чувствовали облегчение боли в горле при приеме каждого ферментированного ХапОютопах растительного экстракта (один образец критерия знаков: р<0,03).

(5) Пример эффективности лекарственных препаратов разных ферментированных ХапОютопах растительных экстрактов.

Действие ингибирования атопического дерматита каждого растительного экстракта, ферментированного посредством ХапОютопах.

Для изучения действия при атопическом дерматите каждого из растительных экстрактов, ферментированных посредством Ха^кото^х, использовали модели аллергии I типа. Крысиное моноклональное антитело к антидинитрофенилу (1 мкг/на мышь) внутривенно вводили одной группе из 5 самцов мышей ВАЬВ/с. Через 1 ч внутрикожно в брюшную стенку вводили полученные в этом примере ферментированный ХапОютопах экстракт пшеницы, ферментированный ХапОютопах экстракт сыворотки соевого творога и ферментированный ХапОютопах экстракт коричневой морской водоросли (каждый экстракт в дозе 50 мкл/на мышь). Еще через 1 ч 20 мкл смеси раствора 0,25% ацетона, содержащего динитрофтор

- 10 018687 бензол, и оливкового масла (4:1) в качестве аллергена наносили на поверхностную и заднюю сторону наружного уха каждой мыши. Толщину наружного уха измеряли через 1, 2, 24 и 48 ч после нанесения, используя калибр толщины, и степень отека отражается в разнице (Δ) полученной толщины с толщиной уха непосредственно перед нанесением аллергена. Эффективность введения препарата оценивали по коэффициенту ингибирования=(1^ отек наружного уха после введения препарата/Δ отек наружного уха в контрольной группе)х100, полученному для ранней реакции, наблюдаемой через 1 ч после введения аллергена, и отсроченной реакции, индуцированной через 24 ч. Результаты показаны в табл. 2. Из табл. 2 очевидно, что наблюдается ингибирование аллергической реакции с ферментированным ХапШотоиак экстрактом пшеницы, ферментированным ХаШйошопак экстрактом сыворотки соевого творога и ферментированным ХапФошопак экстрактом коричневой морской водоросли.

Таблица 2

Действие ингибирования аллергической реакции разных растительных экстрактов, ферментированных посредством ХаиШотоиак

Способ введения экстракта	Коэффициент ингибирования (%) (через один час)	Коэффициент ингибирования (%) (через 24 часа)
Ферментированный экстракт пшеницы	77,0	95,3
Ферментированный экстракт сыворотки соевого творога	85, 2	100
Ферментированный экстракт коричневой морской водоросли	90, 3	88, 4

Пример 3.

Ферментированный растительный экстракт, содержащий ЫтиШк-положительный гликолипид из Еи1егоЬас1ег.

Ферментированный растительный иммуностимулирующий экстракт, полученный путем ферментации растительного компонента единственными Еи1етоЬас1ег.

(1) Ферментированный экстракт пшеницы.

A. Получение.

Культивирование Еи1етоЬас1ег с пшеницей.

Пшеничную муку (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфат гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Еи1етоЬас1ег с1оасае, и затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30°С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90°С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом епбокресу.

B. Физические свойства и биологическая активность.

ЫтиЫк-реакция.

В результате измерения тестом епбокресу содержания гликолипидов в каждом ферментированном посредством Еп1етоЬас1ет экстракте пшеницы было выявлено, что экстракцией получено около 1,9 мг гликолипидов на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта пшеницы, ферментированного Еп1етоЬас1ет с1оасае.

Реакция крахмала с йодом.

Компоненты, происходящие из пшеницы, также содержатся в каждом ферментированном Еп1етоЬас1ет экстракте пшеницы, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Еп1етоЬас1ет. Чтобы это продемонстрировать, применяли реакцию крахмала с йодом. Ферментированный экстракт пшеницы давал положительную реакцию крахмала с йодом, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Еп1етоЬас1ет, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (N0) посредством ферментированных Еп1етоЬас1ет экстрактов пшеницы, и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов экстрактами пшеницы, ферментированными Еп1етоЬас1ет, путем измерения продукции ФНО или N0, в качестве индикаторов. Кроме

- 11 018687 того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта, ферментированного Еи1егоЬас1ег с1оасае, в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Ыти1и8. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, наблюдалась продукция ФНО, зависимая от концентрации в количестве 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта пшеницы, ферментированного посредством Еи1егоЬас1ег, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции N0, аналогично с ЛПСр, наблюдали зависевшую от концентрации продукцию N0, в концентрации 10 мкМ/мл или больше, при добавлении экстракта пшеницы, ферментированного Еи1егоЬас1ег, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции N0 выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта пшеницы, ферментированного Еи1егоЬас1ег, полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция N0 почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении ферментированного посредством Еи1егоЬас1ег экстракта пшеницы в концентрации 10 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(2) Ферментированный посредством Еи1егоЬас1ег экстракт сыворотки соевого творога.

A. Получение.

Сухой экстракт сыворотки соевого творога (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфата гептагидрат

1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Еи1егоЬас1ег с1оасае и затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30°С в течение 5 дней.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90°С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом епбокресу.

B. Физические свойства и биологическая активность.

Ыти1и8-реакция.

В результате измерения тестом епбокресу содержания гликолипидов в ферментированном посредством Еп1егоЬас1ег экстракте сыворотки соевого творога было выявлено, что экстракцией получено около 5 60 мкг гликолипидов на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта, ферментированного Еп1егоЬас1ег с1оасае.

Ксантопротеиновая реакция.

Компоненты, происходящие из сыворотки соевого творога, также содержатся в ферментированном Еп1егоЬас1ег экстракте сыворотки соевого творога, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Еп1егоЬас1ег. Чтобы это продемонстрировать, применяли ксантопротеиновую реакцию. Ферментированный экстракт сыворотки соевого творога давал положительную ксантопротеиновую реакцию, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Еп1сгоЬас1сг. не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (N0) посредством ферментированных Еп1егоЬас1ег экстрактов сыворотки соевого творога, и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов экстрактами сыворотки соевого творога, ферментированными Еп1егоЬас1ег, путем измерения продукции ФНО или N0, в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта, ферментированного Еп1егоЬасЮг с1оасае, в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции ЫтиШк. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации, в количестве 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного посредством Еп1егоЬас1ег, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции N0, аналогично с ЛПСр, наблюдали зависевшую от концентрации продукцию N0, в концентрации 10 мкМ/мл или больше, при добавлении экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Еп1егоЬас1ег, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции N0 выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта сыворотки соевого творога, ферментированного Еп1егоЬас1ег, поли

- 12 018687 миксином В, представляющий собой ингибитор липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция N0 почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении ферментированного посредством Еп!егоЬас!ег экстракта сыворотки соевого творога в концентрации 10 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(3) Ферментированный посредством Еп!егоЬас!ег экстракт коричневой морской водоросли.

A. Получение.

Порошок сушеного мекабу (0,5 г) и соли (динатрия гидрофосфат гептагидрат 1,28 г, калия дигидрофосфат 0,3 г, натрия хлорид 50 мг, аммония хлорид 100 мг, 0,2 мл водного раствора 1М магния сульфата, 0,01 мл водного раствора 1М хлорида кальция) смешивали и добавляли воду для получения общего объема 100 мл. Смесь стерилизовали с использованием автоклава. К смеси добавляли одну колонию Еп!егоЬас!ег с1оасае, и затем смесь оставляли для отстаивания и культивировали при 30°С в течение 5 дней.

B. Физические свойства и биологическая активность.

Экстракция горячей водой (экстракт).

Из каждого культурального раствора путем центрифугирования собирали твердое содержимое, к этому твердому осадку добавляли равный объем дистиллированной воды и смесь нагревали при 90°С в течение 30 мин, используя нагревательный блок. После охлаждения до комнатной температуры каждый супернатант отделяли центрифугированием со скоростью 10000 об/мин в течение 10 мин, используя микроцентрифугу. Содержание гликолипидов, содержащихся в этом супернатанте, измеряли тестом епбокресу.

ЫшЫик-реакция.

В результате измерения тестом епбокресу содержания гликолипидов в ферментированном посредством Еп!егоЬас!ег экстракте коричневой морской водоросли было выявлено, что экстракцией получено около 910 мкг гликолипидов на 1 г сырого веса твердого осадка экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Еп!егоЬас!ег с1оасае.

Реакция на β-глюкан.

Компоненты, происходящие из коричневой морской водоросли, также содержатся в ферментированном Еп!егоЬас!ег экстракте коричневой морской водоросли, и они отличаются от очищенного липополисахарида, получаемого из Еп!егоЬас!ег. Чтобы это продемонстрировать, применяли реакцию на βглюкан, с использованием теста Еипдйес С Тек! МК (8е1кадаки Согрогабоп). Ферментированный Еп!егоЬас!ег экстракт коричневой морской водоросли давал положительную реакцию на β-глюкан, при этом очищенный липополисахарид, происходящий из Еп!егоЬас!ег, не проявлял указанной реакции. Таким образом, указанные объекты не являются идентичными.

Продукция фактора некроза опухоли (ФНО) и продукция окиси азота (N0) посредством ферментированных Еп!егоЬас!ег экстрактов коричневой морской водоросли, и их ингибирование полимиксином.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов экстрактами коричневой морской водоросли, ферментированными Еп!егоЬас!ег, путем измерения продукции ФНО или N0, в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества экстракта, ферментированного Еп!егоЬас!ег с1оасае, в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Ыши1ик. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации в количестве 10 ед./мл или больше, при добавлении экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного посредством Еп!егоЬас!ег, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

В отношении продукции N0, аналогично с ЛПСр, наблюдали зависевшую от концентрации продукцию N0, в концентрации 10 мкМ/мл или больше, при добавлении экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Еп!егоЬас!ег, в концентрации 10 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции N0 выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, стимулированных посредством экстракта коричневой морской водоросли, ферментированного Еп!егоЬас!ег, полимиксином В, который является ингибитором липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция N0 почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении ферментированного посредством Еп!егоЬас!ег экстракта коричневой морской водоросли в концентрации 10 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

(4) Пример практического применения разных ферментированных посредством Еп!егоЬас!ег растительных экстрактов в функциональных продуктах питания.

Производство леденцов, содержащих разные растительные экстракты, ферментированные посредством Еп!егоЬас!ег.

Смешивали такие материалы как сахарный песок, густой мальтозный сироп, воду и каждый из ферментированных посредством Еп!егоЬас!ег растительных экстрактов (пшеничный экстракт Еп!егоЬас!ег, экстракт сыворотки соевого творога, или ферментированный Еп!егоЬас!ег экстракт коричневой морской

- 13 018687 водоросли), полученных в указанном примере, в соотношении 5:5:5:1, полученную смесь нагревали до температуры от 120 до 160°С для уваривания. Уваренную смесь охлаждали на стальном листе для охлаждения, вытягивали в виде стержня и формовали в виде гранул весом около 1 г для получения леденцов.

Подходящее количество этих леденцов помещали в 20 мл воды и растворяли нагреванием. В полученном растворе измеряли количество липополисахарида в качестве активного компонента растительного экстракта, ферментированного Еп1егоЬас1ег. и это количество составляло соответственно 10,1, 8,4 и 6,8 мкг/г для ферментированного Еи1егоЬас1ет экстракта пшеницы, ферментированного Еи1егоЬас1ет экстракта сыворотки соевого творога и ферментированного Еи1егоЬас1ет экстракта коричневой морской водоросли. Эти леденцы употребляли 6 мужчин и женщин, страдающие болью в горле по причине простуды. Сразу после применения леденцов проводили осмотр больного горла. В отношении боли в горле, все 6 человек чувствовали облегчение боли в горле при приеме каждого ферментированного Еи1егоЬас1ет растительного экстракта (один образец критерия знаков: р<0,03).

(5) Пример эффективности лекарственных препаратов разных ферментированных Еи1егоЬас1ет растительных экстрактов.

Действие ингибирования атопического дерматита каждого растительного экстракта, ферментированного посредством Еи1егоЬас1ет.

Для изучения действия при атопическом дерматите каждого из растительных экстрактов, ферментированных посредством Еп1егоЬас1ег. использовали модели аллергии I типа. Крысиное моноклональное антитело к антидинитрофенилу (1 мкг/на мышь) внутривенно вводили одной группе из 5 самцов мышей ВАЬВ/с. Через 1 ч внутрикожно в брюшную стенку вводили полученные в этом примере ферментированный Еи1егоЬас1ет экстракт пшеницы, ферментированный Еи1егоЬас1ет экстракт сыворотки соевого творога или ферментированный Еи1егоЬас1ет экстракт коричневой морской водоросли (каждый экстракт в дозе 50 мкл/на мышь). Еще через 1 ч 20 мл смеси раствора 0,25% ацетона, содержащего динитрофторбензол, и оливкового масла (4:1) в качестве аллергена наносили на поверхностную и заднюю сторону наружного уха каждой мыши. Толщину наружного уха измеряли через 1, 2, 24 и 48 ч после нанесения, используя калибр толщины, и степень отека отражается в разнице (Δ) полученной толщины с толщиной уха непосредственно перед нанесением аллергена. Эффективность введения препарата оценивали по коэффициенту ингибирования=(1А отек наружного уха после введения препарата/Δ отек наружного уха в контрольной группе)х100, полученному для ранней реакции, наблюдаемой через 1 ч после введения аллергена, и отсроченной реакции, индуцированной через 24 ч. Результаты показаны в табл. 3. Из табл. 3 очевидно, что наблюдается ингибирование аллергической реакции с ферментированным ЕЩегоЬасЮг экстрактом пшеницы, ферментированным Еи1егоЬас1ет экстрактом сыворотки соевого творога и ферментированным Еи1егоЬас1ет экстрактом коричневой морской водоросли.

Таблица 3

Действие ингибирования аллергической реакции разных растительных экстрактов, ферментированных посредством Еи1егоЬас1ет

Способ введения экстракта	Коэффициент ингибирования (%) (через один час)	Коэффициент ингибирования (%) (через 24 часа)
Ферментированный экстракт пшеницы	64,3	87,5
Ферментированный экстракт сыворотки соевого творога	58,7	82, 7
Ферментированный экстракт коричневой морской водоросли	73,2	90, 1

Пример 4.

Липополисахариды из Асе1оЬас1ет (Асе1оЬас1ет асей, смеси Асе1оЬас1ет, 61исоиоЬас1ег киЬохубаик).

Виды Асе1оЬас1ет, представляющие собой грамотрицательные, широко распространенные во всем мире бактерии, часто употребляются в пищу и необходимы для производства уксуса. При этом практически ничего не известно о липополисахаридах из Асе1оЬас1ет, культивированных с животным материалом или растительным материалом. Их биологическая активность также отличается от биологической активности известных липополисахаридов.

(1) Липополисахариды из Асе1оЬас1ет, полученные общепринятым способом культивирования Асе1оЬас1ет.

А. Получение.

Асе1оЬас1ет асей или 61исоиоЬас1ег киЬохубаик высевали на агаровую среду (полипептон 5,0 г, дрожжевой экстракт 5,0 г, глюкоза 5,0 г, магния сульфата гептагидрат 1,0 г и агар 15,0 г/л) и культивировали при 30°С в течение двух дней. В культуральный флакон добавляли одну колонию Асе1оЬас1ет асей, или 61исоиоЬас1ег киЬохуйаик, или 0,1 мл смеси Асе1оЬас1ет, в которую было добавлено 50 мл стерилизованной жидкой среды (полипептон 5,0 г, дрожжевой экстракт 5,0 г, глюкоза 5,0 г и магния сульфата геп

- 14 018687 тагидрат 1,0 г/л), оставляли для отстаивания и культивировали при 30°С в течение 5 дней. После культивирования в течение 5 дней, в 30 культуральных флаконов добавляли 1 мл раствора культуры бактерий, в эти флаконы было также добавлено 50 мл среды, их оставляли для отстаивания и культивировали при 30°С в течение 5 дней.

Экстракция.

В качестве способа экстракции применяли способ Вестфаля (\Ме81рНа1).

К влажным микробным клеткам Лсе1оЬас1ег асей, или С1исопоЬас1ег киЬохубаик, или смеси Лсе1оЬас1ег добавляли дистиллированную воду для получения конечной концентрации 100 мг/мл и делали суспензию микробных клеток. К указанной суспензии добавляли равный объем 90% раствора фенола и полученную смесь перемешивали при температуре от 65 до 68°С в течение 20 мин. После этого раствор охлаждали до 10°С или ниже и центрифугировали со скоростью 10000 об/мин при 4°С в течение 20 мин, используя высокоскоростную охлаждающую центрифугу. После центрифугирования в другую пробирку переносили только верхний водный слой, а промежуточный слой и нижний слой фенола возвращали назад в исходную пробирку, в которую добавляли дистиллированную воду в количестве, равном количеству собранного водного слоя. Получаемый раствор снова перемешивали при 65-68°С в течение 20 мин. Затем раствор охлаждали до 10°С или ниже, и центрифугировали со скоростью 10000 об/мин при 4°С в течение 20 мин, используя высокоскоростную охлаждающую центрифугу. После центрифугирования собирали только верхний водный слой и соединяли с ранее собранным водным слоем. Этот собранный водный слой подвергали ультрафильтрации или диализу с целью удаления фенола. Содержание гликолипида, содержавшегося в каждом экстракте раствора, измеряли тестом еибокресу.

В. Физические свойства и биологическая активность.

Липополисахариды, происходящие из Лсе1оЬас1ег, получали из микробных клеток Лсе1оЬас1ег способом Вестфаля. В этом анализе задействовали три вида Лсе1оЬас1ег крещек, т.е. Лсе1оЬас1ег асей, которые являются представителем видов Лсе1оЬас1ег крещек, смесь Лсе1оЬас1ег, применяемая в производстве уксусов, и С1исопоЬас1ег киЬохубаиз. В результате измерения содержания гликолипидов тестом еибокресу было выявлено, что экстракцией получено около 5, 12,5 и 10 мг гликолипидов на 1 г влажных микробных клеток Лсе1оЬас1ег асей, смеси Лсе1оЬас1ег и 61исоиоЬас1ег киЬохубаик соответственно. Для изучения биологической активности были предприняты попытки дополнительной очистки раствора, полученного фенольной экстракцией. Поскольку основными компонентами экстракта раствора, кроме гликолипидов, являлись нуклеиновые кислоты, вначале раствор обрабатывали ДНКазой, и затем РНКазой. Затем добавляли равный объем 90% фенола. Получаемый раствор перемешивали в течение 10 мин со скоростью 10000 об/мин при 4°С в течение 20 мин, используя высокоскоростную охлаждающую центрифугу. Собирали только верхний водный слой. Этот собранный водный слой подвергали ультрафильтрации или диализу для удаления фенола.

Реакция Ыти1и8.

Изучали присутствие Ыти1и8-положительных гликолипидов в Лсе1оЬас1ег асе11, смеси Лсе1оЬас1ег и в 61исоиоЬас1ег киЬохубаик, используя набор еибокресу для обнаружения липополисахаридспецифической реакции, коммерчески доступный от 8е1кадаки Согрогайои. В результате было выявлено, что экстракцией получено около 5, 12,5 и 10 мг Ыти1и8-положительных ликолипидов на 1 г влажных микробных клеток Лсе1оЬас1ег асей, смеси Лсе1оЬас1ег и 61исоиоЬас1ег киЬохубаик. Этим показано, что Ыти1и8-положительные гликолипиды содержатся в Лсе1оЬас1ег асей, смеси Лсе1оЬас1ег и 61исоиоЬас1ег киЬохубаик.

Молекулярная масса.

Проводили анализ 8Ό8-ΡΆ6Ε электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия для определения молекулярной массы Ыти1и8-положительного гликолипида (липополисахарида) происходящего из Лсе1оЬас1ег асей или смеси Лсе1оЬас1ег. В отношении ЛПСр выявлена полоса около 5000, что свидетельствует о низкой молекулярной массе. У липополисахаридов, происходящих из Лсе1оЬас1ег асей или смеси Лсе1оЬас1ег, выявлена полоса около 5000, и предполагается, что эти Ыти1и8положительные ликолипиды (липополисахариды) являются низко молекулярными.

Продукция ФНО и продукция N0 и их ингибирование полимиксином В.

Изучали стимуляцию культивируемой клеточной линии макрофагов липополисахаридами, происходящими из Лсе1оЬас1ег асей, липополисахаридами, происходящими из С1исопоЬас1ег киЬохубаик, и липополисахаридами, происходящими из смеси Лсе1оЬас1ег, путем измерения продукции ФНО или N0 в качестве индикаторов. Кроме того, изучали возможность ингибирования указанной стимуляции полимиксином В, который представляет собой ингибитор липополисахарида.

Представлены числовые значения добавляемого количества липополисахаридов из Лсе1оЬас1ег асе11, липополисахаридов из 61исоиоЬас1ег киЬохубаик и липополисахаридов из смеси Лсе1оЬас1ег в пересчете на количество ЛПСр, пересчитанное на основании результата реакции Ыти1и5. В отношении продукции ФНО, аналогично с определением ЛПСр, выявлена продукция ФНО, зависимая от концентрации в количестве 10 ед./мл или больше, при добавлении липополисахаридов из Лсе1оЬас1ег асей, липополисахаридов из 61исоиоЬас1ег киЬохубаик или липополисахаридов из смеси Лсе1оЬас1ег в концентрации 1000 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

- 15 018687

В отношении продукции N0 наблюдали зависевшую от концентрации продукцию N0, в концентрации 20 мкМ/мл или больше, при добавлении липополисахаридов из Асе1оЬас1ег асей, липополисахаридов из С1нсопоЬас1ег киЬохуйаик или липополисахаридов из смеси Асе1оЬас1ег в концентрации 10000 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр.

При изучении продукции N0 выявляли наличие или отсутствие ингибирования макрофагов, которые стимулированы посредством липополисахаридов из Асе1оЬас1ег полимиксином В, представляющий собой ингибитор липополисахарида. Аналогично ЛПСр продукция N0 почти полностью ингибировалась добавлением полимиксина В, при добавлении липополисахаридов из Асе1оЬас1ег асей, липополисахаридов из С1исоиоЬас1ег киЬохуйаик или липополисахаридов из смеси Асе1оЬас1ег в концентрации 10000 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр.

Продукция ФНО с использованием макрофагов с делецией ТЬК4.

При использовании макрофагальных клеток с делецией ТЬК4, являющегося рецептором для липополисахаридов, было выявлено ослабление активирующей функции макрофагов, индуцируемой липополисахаридом из Асе1оЬас1ег асей, липополисахаридом из С1исоиоЬас1ег киЬохуйапк или липополисахаридом из смеси Асе1оЬас1ег. Липополисахарид передает сигнал на макрофагальные клетки посредством ТЬК4, который является его рецептором на поверхности клетки. При этом зимозан, представляющий собой компонент оболочки дрожжевой клетки, передает сигнал для активации макрофагов посредством ТЕК2. Поэтому считается, что, если субстанцией, содержащейся в Асе1оЬас1ег которая активирует макрофаги, является липополисахарид, сигнал не передается в макрофаги с делецией ТЕК4, и в результате ослабляется активация макрофагов, что уменьшает продукцию ФНО и N0.

В макрофагальных клетках с делецией ТБК4 отсутствовала продукция ФНО, если липополисахарид из Асе1оЬас1ег асей, липополисахарид из С1исоиоЬас1ег киЬохуйапк или липополисахарид из смеси АсеЮЬас1ег добавляли в концентрации 1000 нг/мл или больше в пересчете на концентрацию ЛПСр. Этот результат означает ослабление активации макрофагов, что уменьшает продукцию ФНО и N0. Таким образом, было показано, что ТЬК4 вовлечен в активацию макрофагов посредством липополисахарида из Асе1оЬас1ег асей, липополисахарида из С1исоиоЬас1ег киЬохуйапз или липополисахарида из смеси АсеЮЬас1ег.

Функциональные различия между липополисахаридом из Асе1оЬас1ег и известными липополисахаридами.

Липополисахарид из Асе1оЬас1ег асей и липополисахарид из смеси Асе1оЬас1ег полностью отличаются от известных липополисахаридов, а именно от липополисахарида из ЕксйейсЫа сой и липополисахарида из РапЮеа адДотеппъ дозозависимой продукцией ФНО и N0. Известные липополисахариды, например липополисахарид из ЕксйейсЫа сой и липополисахарид из РапЮеа адд1отегаи8 в концентрации 10 нг/мл (в пересчете на концентрацию ЛПСр, на основе реакции Ыти1и8), показали продукцию ФНО в концентрации 10 ед./мл или больше В зависимом от концентрации образом. Аналогично, в отношении продукции N0, указанные липополисахариды в концентрации 10 нг/мл или больше показали продукцию N0 в концентрации 20 мкМ/мл или большезависимым от концентрации образом. С другой стороны, липополисахарид из Асе1оЬас1ег асей и липополисахарид из смеси Асе1оЬас1ег в концентрации 100 нг/мл (в пересчете на концентрацию ЛПСр, на основании реакции Ыти1и8), не показали продукции ФНО. В случае продукции N0 также не выявлено индуцирования продукции N0 липополисахаридом из Асе1оЬас1ег асей и липополисахаридом из смеси Асе1оЬас1ег в концентрации 1000 нг/мл в пересчете на концентрацию ЛПСр. Таким образом, это указывает на различия в биологической активности липополисахаридов из Асе1оЬас1ег и известных липополисахаридов, и на то, что липополисахарид из Асе1оЬас1ег можно считать новым веществом.

(2) Пример практического применения липополисахаридов из Асе1оЬас1ег в функциональных продуктах питания.

Производство леденцов, содержащих липополисахариды из Асе1оЬас1ег.

Смешивали такие материалы, как сахарный песок, густой мальтозный сироп, воду и липополисахарид из Асе1оЬас1ег асе11, полученный в примере 2, в соотношении 5:5:5:1, полученную смесь нагревали до температуры от 120 до 160°С для уваривания. Уваренную смесь охлаждали на стальном листе для охлаждения, вытягивали в виде стержня и формовали в виде гранул весом около 1 г для получения леденцов.

Подходящее количество этих леденцов помещали в 20 мл воды и растворяли нагреванием. В полученном растворе измеряли количество липополисахарида из Асе1оЬас1ег асе11 в качестве активного компонента, составившее 2,1 мкг/г. Эти леденцы употребляли 6 мужчин и женщин, страдающие болью в горле по причине простуды. Сразу после применения леденцов проводили осмотр больного горла. В отношении боли в горле все 6 человек чувствовали облегчение боли в горле при приеме каждого ферментированного Асе1оЬас1ег асей растительного экстракта (один образец критерия знаков: р<0,03).

(3) Пример эффективности лекарственного препарата липополисахарида из Асе1оЬас1ег.

Действие ингибирования атопического дерматита липополисахаридом из Асе1оЬас1ег.

Для изучения действия липополисахарида из Асе1оЬас1ег при атопическом дерматите использовали модели аллергии I типа. Крысиное моноклональное антитело к антидинитрофенилу (1 мкг/на мышь) внутривенно вводили одной группе из 5 самцов мышей ВАЕВ/с. Через 1 ч внутрикожно в брюшную

- 16 018687 стенку вводили полученные в указанном примере липополисахарида из Асе)оЬас)ег асеД (в дозе 50 мкл/на мышь). Еще через 1 ч 20 мкл смеси раствора 0,25% ацетона, содержащего динитрофторбензол, и оливкового масла (4:1) в качестве аллергена наносили на поверхностную и заднюю сторону наружного уха мышей. Толщину наружного уха измеряли через 1, 2, 24 и 48 ч после нанесения, используя калибр толщины, и степень отека отражена в разнице (Δ) полученной толщины с толщиной уха непосредственно перед нанесением аллергена. Эффективность введения препарата оценивали по коэффициенту ингибирования=(Ж отек наружного уха после введения препарата/Δ отек наружного уха в контрольной группе)х100, полученному для ранней реакции, наблюдаемой через 1 ч после введения аллергена, и отсроченной реакции, индуцированной через 24 ч. Результаты показаны в табл. 4. Из табл. 4 очевидно, что липополисахарид из Асе1оЬас1ег асе11 ингибирует аллергическую реакцию как при подкожном введении, так и при пероральном введении.

Таблица 4 Ингибирующее действие липополисахарида из Асе1оЬас1ег асеД на аллергическую реакцию

Способ введения липополисахарида	Доза (на 1 мышь)	Коэффициент ингибирования (%) (через один час)	Коэффициент ингибирования (%) (через 24 часа)
Подкожное введение	4 мкг	85,2	100
Пероральное введение	100 мкг	55,3	58,4

Все публикации, патенты и патентные заявки, процитированные в настоящем изобретении, включены в него со ссылкой во всей их полноте.

Claims (4)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Фракция гликолипидов ферментированных экстрактов биологического пищевого материала, полученная ферментированием биологического пищевого материала, выбранного из пшеничной муки, сыворотки соевого творога, коричневой морской водоросли, с использованием Асе1оЬас1ег асе11. смесей различных видов Асе1оЬас1ег. С1исопоЬас1ег киЬохубапк, ХапДютопак сатрекДтк или Еп1егоЬас1ег с1оасае в культуральном растворе, с последующим экстрагированием твердого содержимого культуральных растворов горячей водой, охлаждением и отделением супернатанта, содержащего фракцию гликолипидов, центрифугированием.
2. 2. Способ получения фракции гликолипидов ферментированных экстрактов биологического пищевого материала, включающий ферментирование биологического пищевого материала, выбранного из пшеничной муки, сыворотки соевого творога, коричневой морской водоросли, в культуральном растворе, содержащем Асе1оЬас1ег асеД, смеси различных видов Асе1оЬас1ег, С1исопоЬас1ег киЬохубапк, ХаШ1ютопак сатрек!пк или Еп1егоЬас1ег с1оасае, последующее экстрагирование твердого содержимого культуральных растворов горячей водой, охлаждение и отделение супернатанта, содержащего фракцию гликолипидов, центрифугирование.
3. 3. Фармацевтическая композиция, содержащая фракцию гликолипидов по п.1.
4. 4. Фармацевтическая композиция по п.3, обладающая анальгетическим и антиаллергическим действием.