EA005116B1 - НОВАЯ КРИСТАЛЛИЧЕСКАЯ ФОРМА ГИДРОХЛОРИДА 6-ГИДРОКСИ-3-(4-[2-(ПИПЕРИДИН-1-ИЛ)ЭТОКСИ]ФЕНОКСИ)-2-(4-МЕТОКСИФЕНИЛ)БЕНЗО[b]ТИОФЕНА - Google Patents

Abstract

Данное изобретение относится к новой несольватированной безводной кристаллической форме гидрохлорида 6-гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)бензо[b]тиофена и ее применениям, включая ингибирование болезненных состояний, связанных с депривацией эстрогена, включая сердечно-сосудистое заболевание, гиперлипидемию и остеопороз, и ингибирование других патологических состояний, таких как эндометриоз, фиброз матки, зависимый от эстрогена рак (включая рак молочной железы и матки), рак простаты, доброкачественная гиперплазия простаты, расстройства ЦНС, включая болезнь Альцгеймера, предупреждение рака молочной железы и апрегуляцию ChAT.

Description

Предпосылки изобретения

Г идрохлорид 6-гидрокси-3 -(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси] фенокси)-2-(4-метоксифенил) бензо [Ь]тиофена (арзоксифен) первоначально был описан в общих чертах в патенте США № 5510357 и конкретно был раскрыт в патенте США № 5723474 ('474) и в европейской патентной заявке 0729956. Арзоксифен является нестероидным смешанным антагонистом/агонистом эстрогена, применимым, наряду с прочим, для снижения содержания сывороточного холестерина и для ингибирования гиперлипидемии, остеопороза, зависимых от эстрогена раковых заболеваний, включая рак матки и молочной железы, эндометриоза, расстройств ЦНС, включая болезнь Альцгеймера, пролиферации клеток гладких мышц аорты и рестеноза.

Конкретно, арзоксифен применим и клинически оценен для лечения рецепторно позитивного метастатического рака молочной железы, вспомогательного лечения рецепторно позитивных пациентов, сопровождающего соответствующую системную или местную терапию, для уменьшения вероятности рецидива инвазивного и неинвазивного рака молочной железы и снижения заболеваемости инвазивным раком молочной железы и карциномой из эпителия протоков ίη кйи (ИСК). Арзоксифен применим также в сочетании с радиотерапией, ингибиторами ароматазы, аналогами ЬНКН и ингибиторами ацетилхолинэстеразы (АСЬЕ).

Порошковый рентгеноструктурный анализ (ХКЭ), термогравиметрический анализ (ТСА), протонный ядерный магнитный резонанс (¹Н ЯМР) и анализ Карла Фишера (КБ) арзоксифена в массе, выделенного процедурами, указанными в '474, позднее показали, что указанный материал был гидратированным, слабо кристаллическим и содержал переменные количества органического летучего вещества (этилацетата) в своей кристаллической решетке.

Слабо кристаллические и/или аморфные материалы обычно менее желательны для приготовления препаратов, чем материалы с высокой степенью кристаллизации. Аморфные соединения химически и физически менее стабильны, так как они склонны адсорбировать значительные количества воды. Адсорбция воды аморфным материалом в желатиновой капсуле, например, может вызывать сжатие или деформирование капсулы, когда влага переносится из капсулы к аморфному компоненту. Кроме того, аморфные соединения имеют тенденцию выпадать в осадок из содержащих их растворов. Если аморфное лекарственное вещество осаждается из доставляющего раствора, это может негативно влиять на свойства растворения и биодоступности лекарства.

Кроме того, обычно нежелательно готовить фармацевтические препараты, содержащие существенные количества органического растворителя (например, этилацетата) из-за потен циальной токсичности растворителя для его реципиента и изменений действенности фармацевтического препарата как функции растворителя. В дополнение, с точки зрения перспектив производства, обычно также менее желательно получать некристаллические материалы, когда указанное получение предусматривает сбор конечного продукта посредством фильтрования. Такие фильтрования часто более трудно осуществлять, когда собранный материал является некристаллическим. Более того, обычно также менее желательно, с точки зрения перспектив производства, готовить фармацевтические препараты, содержащие существенные количества воды (гидраты), потому что степень гидратации обычно будет в некоторой степени зависеть от относительной влажности, при которой фармацевтический препарат производят и хранят. Иными словами, изменчивость действенности обычно более проблематична с гидратированной, чем с безводной формой.

Хотя арзоксифен, полученный процедурами, описанными в '474 может быть использован в качестве фармацевтического препарата, было бы очень желательно и выгодно найти более кристаллическую форму арзоксифена, которая не содержала бы ни воды, ни органического растворителя внутри своей кристаллической решетки, которая могла бы быть воспроизводима и эффективно получена в промышленных масштабах.

Краткое описание изобретения

Данное изобретение относится к несольватированной безводной кристаллической форме гидрохлорида 6-гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1ил)этокси] фенокси)-2-(4-метоксифенил)бензо [Ь] тиофена (Е-У), имеющей рентгенограмму, которая имеет, по меньшей мере, один из следующих пиков: 7,3±0,2, 15,5±0,2, 15,9±0,2 и

17,6±0,2° в 2θ, когда ее получают от медного источника радиации.

В дополнение, данное изобретение относится к фармацевтическому составу, содержащему Е-У, один или несколько фармацевтических носителей, разбавителей или наполнителей и, необязательно, стабилизирующий агент, выбранный из метионина, ацетилцистеина, цистеина или гидрохлорида цистеина, и, необязательно эстроген, необязательно, прогестин, необязательно ингибитор ароматазы, необязательно, аналог ЬНКН и, необязательно, ингибитор ацетилхолинэстеразы (АСЬЕ).

В дополнение, данное изобретение относится к способам применения Е-У для ингибирования патологических состояний, таких как: фиброз матки, эндометриоз, пролиферация клеток гладких мышц аорты, рестеноз, рак молочной железы, рак матки, рак простаты, доброкачественная гиперплазия простаты, потеря костной массы, остеопороз, сердечно-сосудистое заболевание, гиперлипидемия, расстройства ЦНС и болезнь Альцгеймера и применения Е-У для производства медикамента для ингибирования вышеупомянутых состояний.

Данное изобретение, кроме того, относится к способам применения Р-У для ап-регуляции холин-ацетилтрансферазы (С11АТ) и применения Р-У для производства медикамента для такой ап-регуляции.

Данное изобретение также относится к способу получения Р-У, который включает кристаллизацию гидрохлорида 6-гидрокси-3-(4-[2(пиперидин-1-ил)этокси] фенокси)-2-(4-метоксифенил)бензо[Ь]тиофена из растворителя для кристаллизации, выбранного из группы, состоящей из метанола или водного метанола, этанола или изопропанола, и последующую сушку полученного твердого вещества до постоянной массы.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет типичный график ТГА Р-У;

фиг. 2 - типичный график ДСК Р-У;

фиг. 3 - типичную рентгенограмму для формы У.

Подробное описание изобретения

Р-У может быть получен сушкой, либо при температуре окружающей среды, либо при слегка повышенной температуре, кристаллического твердого вещества, изолированного при температуре окружающей среды при кристаллизации арзоксифена (или какого-либо его полиморфа/сольвата) из метанола, этанола или изопропанола или из водных смесей метанола. Когда используют этанол или изопропанол, содержание воды в указанных растворителях предпочтительно менее чем 0,2% (спектрофотометрическая оценка А.С.8.). Предпочтительно, водный состав в метаноле содержит менее чем 30% по объему воды. Более предпочтительно Р-У получают сушкой, либо при температуре окружающей среды, либо при слегка повышенной температуре, твердого вещества, изолированного при кристаллизации из водного метанола, где объем воды между 20% и 5%. Наиболее предпочтительно Р-У получают сушкой при 50-70°С в вакууме твердого вещества, изолированного при температуре окружающей среды при кристаллизации арзоксифена (или какого-либо его полиморфа/сольвата) из водного метанола, где содержание воды по объему составляет 15%.

Обычно арзоксифен может быть растворен в метаноле (около 1 г растворенного вещества/20 мл растворителя) и необязательно нагрет для того, чтобы осуществить растворение исходного материала арзоксифена. Как только будет достигнуто растворение, прежде чем позволить раствору медленно охлаждаться до комнатной температуры, раствор необязательно может быть сконцентрирован до около 1 г растворенного вещества/5 мл растворителя, например, путем перегонки. Как только раствор достигнет комнатной температуры, он необязательно может быть охлажден дополнительно (с по мощью ледяной бани или замораживания) до температуры между 0 и 5°С. По истечении времени, необходимого для кристаллизации, кристаллы Р-У могут быть собраны вакуумным фильтрованием и промыты холодным (около 0°С) метанолом перед сушкой в вакууме до постоянной массы. Предпочтительны слегка повышенные температуры сушки (около 50°С в течение 12-48 ч) при продувке азотом. Для синтеза Р-У в промышленных масштабах может быть выгодно вносить затравку Р-У для кристаллизации.

Подходящий исходный материал арзоксифена для указанной кристаллизации включает, но без ограничения перечисленным, 8-ΙΙ, Р-Ι, РIII (сольватированные и нестехиометрически гидратированные кристаллические формы арзоксифена, описанные в патентных заявках РСТ РСТ/И8 00/16332 и РСТ/ϋδ 00/16333, описания которых включены в данную заявку в качестве ссылки), арзоксифен, полученный процедурами, описанными в '474, или любая их смесь. Неважно, с какой формы арзоксифена следует начинать, потому что кристаллизация из безводного метанола, согласно процедурам, описанным здесь, имеет результатом кристаллы Р-У.

Характеристика Р-У

Методы дифференциальной сканирующей калориметрии/термогравиметрического анализа (ДСК/ТГА), сорбции/десорбции влаги и порошкового рентгеноструктурного анализа (ХКП) используют, чтобы характеризовать Р-У. ТГА является мерой, вызванной теплом потери массы материала как функции температуры. Его наиболее часто используют для исследования процессов десольватации и количественного определения общего содержания летучих веществ в твердом веществе. ДСК является методикой, которую часто используют для скрининга соединений при полиморфизме, потому что температура (температуры), при которой происходит физическое изменение материала, обычно является характеристикой этого материала. Изотермы сорбции влаги обеспечивают оценку степени гигроскопичности, связанной с данным материалом, и характеристику негидратов и гидратов. И, наконец, ХЯИ является методикой, которая определяет перспективную упорядоченность в кристаллическом материале.

Типичный график ТГА Р-У показан на фиг. 1. Термогравиметрический анализ Р-У показал отсутствие потери массы, указывающее на изоляцию несольватированной кристаллической формы. Анализ ДСК Р-У показал резкую эндотерму плавления при 174-175°С, как показано на фиг. 2, которая значительно выше, чем наблюдаемая для Р-ΙΙΙ.

Изотерма сорбции/десорбции влаги, достигнутая для Р-У, показала увеличение массы на 0,11% в диапазоне 0-95 ЯН, указывающее на стабильную безводную кристаллическую форму с малой склонностью адсорбировать воду или превращаться в гидратированную форму арзоксифена.

Рентгенограмма Р-У показывает резкие пики и ровную базовую линию, показательную для высоко кристаллических материалов. Угловые положения пиков в 2θ и соответствующие данные 1/1_о для всех пиков с интенсивностями, равными или большими, чем 10% наибольшего пика для Р-У приведены в табл. 1. Все данные в табл. 1 выражены с точностью ±0,2%. Хотя многие из интенсивных отражений находятся, как правило, при углах дифракции, подобных тем, о которых сообщается для 8-ΙΙ, Р-Ι, Р-ΙΙΙ и Р-У, каждая из форм дает отличающуюся порошковую рентгенограмму, позволяя более четко различать между собой 8-ΙΙ, Р-Ι, Р-ΙΙΙ и Р-У.

Порошковый рентгеноструктурный анализ Р-У при переменной температуре не показал заметного изменения в картине дифракции вплоть до 125°С, что согласуется с профилем ДСК, указывая на стабильную кристаллическую форму.

В кристаллографии хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы относительные интенсивности пиков дифракции могут изменяться из-за предпочтительной ориентации, являющейся результатом таких факторов, как морфология и габитус кристалла. Когда присутствуют эффекты предпочтительной ориентации, интенсивности пиков изменяются, но положения характерных пиков полиморфа неизменны. См., например, Т11С Ипйеб 81а1с5 Рйаттасоре1а #23, Ναΐίοηαΐ Рогти1агу #18, стр. 1843-1844, 1995. Более того, в кристаллографии хорошо известно, что для любой данной кристаллической формы угловые положения пиков могут слегка изменяться. Например, положения пиков могут сдвигаться из-за изменения температуры, при которой образец анализируют, замены образца или присутствия или отсутствия внутреннего стандарта. В данном случае, изменчивость положения пика ±0,2 в 2θ будет учитывать указанные возможные изменения, не затрудняя недвусмысленную (однозначную) идентификацию Р-У.

Хорошо известным и принятым методом исследования кристаллических форм в литературе является метод Ршк. Р1пк метод использует четыре наиболее интенсивные линии для первоначального поиска, сопровождаемые следующими четырьмя наиболее интенсивными линиями. Согласно Р1пк методу, основанному на интенсивностях пиков, а также на положении пика, Р-У может быть идентифицирован по наличию пиков при 7,3±0,2, 15,5±0,2, 15,9±0,2 и 17,6±0,2° в 2θ, когда картину получают от медного источника радиации. Присутствие Р-У может быть дополнительно проверено по пикам при 17,9±0,2, 18,2±0,2, 18,9±0,2 и 21,5±0,2° в 2θ, когда картину получают от медного источника радиации.

Таблица 1

Угол 2θ	Ι/Ιο (%)	Угол 2θ	Ι/Ιο (%)	Угол 2θ	Ι/Ιο (%)
7,3	45	17,6	72	22,6	19
9,0	22	17,9	83	23,3	20
10,0	10	18,2	56	24,4	46
12,8	39	18,9	82	25,8	38
14,6	15	19,8	27	27,4	32
15,5	50	21,5	100	28,2	18
15,9	64

Р-У имеет несколько преимуществ по сравнению с формой арзоксифена предшествующего уровня техники, описанной в '474 и по сравнению с формами Р-Ι и Р-ΙΙΙ, описанными в РСТ заявках, включенных в данное описание в качестве ссылок. По сравнению с арзоксифеном, полученным в соответствии со способом, раскрытым в '474, Р-У более стабилен при температуре окружающей среды и является поэтому более пригодным для фармацевтической разработки, т.е. разработки дозированного состава. Кроме того, в отличие от формы, раскрытой в '474, Р-У является высоко кристаллическим. Кристаллические материалы, как правило, менее гигроскопичны и более стабильны (например, менее склонны к химическому разложению, обеспечивают стойкую действенность), чем аморфные материалы и являются поэтому более желательными для получения препаратов. Кроме того, в отличие от формы арзоксифена, полученной процедурами, описанными в '474, которая содержит этилацетат и воду в своей решетке, Р-У не содержит ни того, ни другого.

В отличие от 8-ΙΙ, Р-Ι и Р-ΙΙΙ, Р-У является действительно безводной формой, которая не проявляет склонности адсорбировать воду при изменениях относительной влажности. Кроме того, кристаллическая решетка Р-У устойчива вплоть до ее температуры плавления. Более того, Р-У имеет растворимость в воде приблизительно на 10% выше по сравнению с Р-ΙΙΙ и является термодинамически наиболее стабильной известной формой арзоксифена.

Методы идентификации

Анализ ДСК проводят, используя ТА инструменты 2920, снабженные автодозаторомпробоотборником и охлажденным охлаждающим устройством. Пробу заключают в обжимаемый алюминиевый поддон и анализируют против пустого сосуда сравнения. Тепловой поток измеряют после установления равновесия при 30°С. Скорость нагревания 5°С в минуту до 300°С. График теплового потока против температуры интегрируют для идентификации какихлибо эндотермических или экзотермических случаев.

Анализ ТГА проводят, используя ТА инструменты 2950, снабженные автодозаторомпробоотборником. Пробу загружают на тарированный алюминиевый поддон и температуру повышают от температуры окружающей среды до 300°С со скоростью 10°С в минуту. График процента по массе против температуры интегрируют, чтобы определить процентную потерю.

Изотермы сорбции влаги получают, используя проточный инструмент νΤΙ 8СА-100. Пробы анализируют при 25°С от 0 до 95% относительной влажности (ВИ) для адсорбции и от 95 до 5% КН для десорбции при ступенчатом изменении влажности на 5% КН. Изотермы адсорбции и десорбции получают в виде графика % изменения массы против % КН.

Порошковые рентгенограммы получают на рентгеновском порошковом дифрактометре §1етеп8 Ό5000, который снабжен источником СиКа (λ=1,54056), работающим при 50 кВ и 40 мА, с детектором твердого состояния 81(Ь1) Кеуех. Пробы сканируют от 4 до 35° в 2θ при 2,5 с на шаг размером 0,04°. Сухие порошки набивают в имеющие углубление держатели проб с верхней загрузкой и гладкую поверхность получают с помощью стеклянного слайда.

Порошковые рентгенограммы при переменной температуре получают на рентгеновском порошковом дифрактометре 81етеп§ Ό5000, который снабжен источником СиКа (λ=1,54056), работающим при 50 кВ и 40 мА, со сцинтилляционным детектором и никелевым фильтром. Порошок набивают в имеющий углубление держатель проб с верхней загрузкой и контролируемой температурой и поверхность делают гладкой для дифракции. Пробу сканируют от 2 до 35° 2θ при 2,5 с на шаг размером 0,04°, начиная при 25°С после 5-минутного периода времени установления равновесия. Последовательные развертки изображения получают при приращениях повышающейся температуры от 25°С до максимума 125°С.

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют способы получения Ρ-ν. Примеры не предназначены для ограничения рамок указанных процессов в каком-либо отношении и не должны так восприниматься.

Примеры

Пример 1. Кристаллизация из метанола без концентрирования.

Пробу 20,00 г арзоксифена объединяют с 500 мл безводного метанола (сорта для ЖХВР) и нагревают до кипения с возвращением флегмы. Все твердые вещества растворяют, чтобы получить гомогенный бледно-желтый раствор. Раствор охлаждают ниже температуры кипения с возвращением флегмы и добавляют 5,00 г дополнительного арзоксифена. Раствор повторно нагревают до кипения с возвращением флегмы, чтобы способствовать растворению всех твердых веществ. Раствору позволяют медленно остывать при перемешивании. При 50°С в раствор вносят затравку из нескольких миллиграммов предварительно полученной соли Ρ-ν. Кристаллической суспензии позволяют остыть с 50 до 30°С в течение периода 1,25 ч. В этот момент присутствует большое количество белого твердого вещества. Перемешиваемую суспензию погружают в ледяную баню и перемешивают еще в течение 3 ч. Суспензию фильтруют, используя фильтровальную бумагу Ватман № 1, и белое твердое вещество промывают 50 мл метанола, предварительно охлажденного до 0°С. Влажный осадок на фильтре сушат в течение около 48 ч при 50°С в вакууме со слабой продувкой Ν₂. Выход - 15,94 г (выход - 63,8%). Содержание действующего вещества по ЖХВР 89,4% (как свободного основания), общее количество сопутствующих веществ (ТК8) - 0,28%. Сравнение массы продукта до и после сушки показывает, что первоначальный влажный осадок на фильтре содержит 65% растворителя.

Пример 2. Кристаллизация из метанола с концентрированием.

Пробу 25,00 г арзоксифена объединяют с 500 мл безводного метанола (сорта для ЖХВР) и нагревают до кипения с возвращением флегмы. Все твердые вещества растворяют, чтобы получить гомогенный бледно-желтый раствор. Раствор концентрируют удалением 375 мл дистиллята путем перегонки при атмосферном давлении. В этот момент реакционная смесь является прозрачным гомогенным желтым раствором. Нагревание до кипения с возвращением флегмы прерывают и в раствор вносят затравку из нескольких миллиграммов предварительно полученного Ρ-ν. После затравки смеси позволяют остыть до температуры окружающей среды при слабом перемешивании в течение периода 1 час. В течение этого времени образуется большое количество белого осадка. Суспензию погружают в ледяную баню и перемешивают еще в течение 3 ч. Суспензию фильтруют, используя фильтровальную бумагу Ватман № 1, и белое твердое вещество промывают 50 мл метанола, предварительно охлажденного до 0°С. Влажный осадок на фильтре сушат в течение около 48 ч при 50°С в вакууме со слабой продувкой Ν2. Выход - 22,44 г (выход - 89,8%). Содержание действующего вещества по ЖХВР 91,3% (как свободного основания), ТК8 - 0,26%. Сравнение массы продукта до и после сушки показывает, что первоначальный влажный осадок на фильтре содержит 31,5% растворителя.

Пример 3. Кристаллизация из метанола в масштабе 30 галлонов (галлон США = 3,7853 л).

Пробу 3,08 кг арзоксифена объединяют с 60 л безводного метанола (сорта для ЖХВР) и нагревают до кипения с возвращением флегмы. Все твердые вещества растворяют, чтобы получить гомогенный бледно-желтый раствор. Раствор концентрируют удалением 40 л дистиллята путем перегонки при атмосферном давлении. В этот момент реакционная смесь является прозрачным гомогенным желтым раствором. Реакционную смесь охлаждают, чтобы прервать кипение с возвращением флегмы и люк открывают при около 40°С, чтобы контролировать кристаллизацию. Кристаллы наблюдают и охлаждение продолжают со скоростью 12°С в час до конечной температуры 0°С. Кристаллизационную суспензию перемешивают в течение ночи при 0°С и затем фильтруют через однопластинчатый фильтр-пресс. Для того чтобы удалить весь продукт из резервуара кристаллизатора, маточную жидкость используют для промывки резервуара и затем направляют через пресс. Влажный осадок на фильтре затем промывают 11,3 л безводного метанола, предварительно охлажденного до 0°С. Влажный осадок на фильтре сушат подведением вакуума к прессу и пропусканием воды с температурой 50°С через рубашку пресса. Спустя приблизительно 24 ч, применяют слабую продувку Ν₂. Общее время сушки около 36 ч. Выход - 2,588 кг (86,27%). Содержание действующего вещества по ЖХВР - 92,7% (как свободного основания), ТК8 0,39%.

Пример 4. Кристаллизация из этанола.

Точные количества этанола (250 мл) и арзоксифена (10,0 г) объединяют и нагревают до кипения с возвращением флегмы для осуществления растворения. Раствору позволяют остыть до температуры окружающей среды в течение 3часового периода, в ходе чего образуется белый кристаллический осадок. Твердое вещество изолируют фильтрованием и сушат в вакууме в течение ночи при 50°С со слабой продувкой Ν₂. Выход - 5,50 г, т.пл. 173°С (по ДСК). Для этой пробы получают рентгеновский порошковый дифракционный спектр, и он по существу идентичен картине для Р-У, показанной на фиг. 3.

Пример 5. Кристаллизация из изопропанола.

Безводный изопропанол (250 мл) и арзоксифен (10,0 г) объединяют и нагревают до кипения с возвращением флегмы для осуществления растворения. Тепло отводят и в раствор вносят затравку из нескольких миллиграммов Р-У. Реакционной смеси позволяют остыть до температуры окружающей среды и перемешивают в течение ночи, за это время образуется белый осадок. Твердое вещество изолируют фильтрованием, чтобы получить 12,11 г влажного осадка на фильтре. Пробу 4,01 г влажного осадка сушат в течение ночи при 60°С в вакууме со слабой продувкой Ν₂. Выход - 2,72 г, т.пл.171,5°С (по ДСК). Для этой пробы получают рентгеновский порошковый дифракционный спектр, и он по существу идентичен картине для Р-У, показанной на фиг. 3.

Пример 6. Получение из свободного основания арзоксифена.

Свободное основание арзоксифена (5,07 г) суспендируют в 65,0 мл метанола. Раствор 1,41 мл концентрированной хлористоводородной кислоты и 10,0 мл воды добавляют к реакционной смеси. Реакционную смесь нагревают до 55°С в течение 15 мин для осуществления растворения. Реакционную смесь охлаждают до

30°С и вносят затравку из 50 мг Р-У. Реакционную смесь охлаждают до 10°С со скоростью 1°С/ч и перемешивают при этой температуре в течение 8 ч. Твердое вещество изолируют фильтрованием, промывают метанолом, предварительно охлажденным до 10°С, и сушат в вакууме при 50°С в течение ночи со слабой продувкой Ν₂. Выход - 4,42 г (выход - 87,7%), содержание действующего вещества (ЖХВР) 99,7%, ТКБ - 0,32%. Для этой пробы получают рентгеновский порошковый дифракционный спектр, и он по существу идентичен картине для Р-У, показанной на фиг. 3.

Используемая терминология

Используемый здесь термин «эффективное количество» означает количество Р-У, которое способно ингибировать состояния или его вредные эффекты, описанные здесь. Когда Р-У вводят совместно с эстрогеном, прогестином, ингибитором ароматазы, аналогом ЬНКИ или ингибитором АСКЕ, термин «эффективное количество» также означает количество такого агента, способное давать надлежащий эффект.

Термины «ингибирование» и «ингибировать» включают их общепринятые значения, т.е. предотвращение, препятствование, ограничение, ослабление, облегчение, замедление, прекращение или обратное развитие прогрессирования или тяжести описанного здесь патологического состояния или его осложнения.

Термины «предотвращение», «предупреждение», «профилактики», «профилактический» и «предотвращать» используются здесь взаимозаменяемо и относятся к уменьшению вероятности того, что реципиент, принимающий Р-У, не будет излечен или у него разовьется какое-либо из патологических состояний или их осложнений, описанных здесь.

Термины «утратившая эстроген» и «недостаточность эстрогена» относятся к состоянию, либо возникшему естественным путем, либо вызванному клинически, когда женщина не может достаточно продуцировать эндогенные эстрогенные гормоны, чтобы поддерживать зависимые от эстрогена функции, например, менструацию, гомеостаз костной массы, функцию нейронов, сердечно-сосудистое состояние и т. п. Такие ситуации утраты эстрогена возникают в результате, но без ограничения указанным, менопаузы и хирургической или химической овариэктомии, включая их функциональный эквивалент, например, лечение ингибитором ароматазы, агонистами или антагонистами СпВН. 1С1 182780 и тому подобное. Болезненные состояния, связанные с состоянием утраты эстрогена, включают, но без ограничения указанным, разрежение костной массы, остеопороз, сердечнососудистое заболевание и гиперлипидемию.

Используемый здесь термин «эстроген» включает стероидные соединения, имеющие эстрогенную активность, такие как, например, 17в-эстрадиол, эстрон, конъюгированный эст роген (Ргетапп®), лошадиный эстроген 17βэтинил-эстрадиол и тому подобное. Предпочтительным соединением на основе эстрогена является Ргетапп® и норэтилнодрел.

Используемый здесь термин «прогестин» включает соединения, имеющие прогестиновую активность, такие как, например, прогестерон, норэтилнодрел, нонгестрел, ацетат мегестрола, норэтиндрон и тому подобное. Норэтиндрон является предпочтительным агентом на основе прогестина.

Используемый здесь термин «ингибитор ароматазы» включает соединения, способные ингибировать ароматазу, например коммерчески доступные ингибиторы, такие как аминоглутемид (ΟΥΤΑΝΌΒΕΝ®) , Анастразол (ΑΚΙΜΙΌΕΧ®) , Летрозол (ΡΕΜΑΚΑ®), Форместан (ΕΕΝΑΤΚΌΝ®), Экземестан (ΑΚΟΜΑ8ΙΝ®) и тому подобное.

Используемый здесь термин «аналог ЬНКП» относится к аналогу гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон, который ингибирует продуцирование эстрогена у женщин в предклимактерический период, включая, например, госерлин (ΖΘΕΑΌΕΧ®), лейпролид (ΕυΡΚΌΝ®) и тому подобное.

Используемый здесь термин «ингибитор АСЙЕ» включает соединения, которые ингибируют ацетилхолин-эстеразу, например салицилат физостигмина, гидрохлорид такрина, гидрохлорид донепезила и тому подобное.

Термин «ап-регуляция СЙАТ» относится к усилению ферментативной активности СЙАТ, т.е. промотированию превращения холина в ацетилхолин. Это промотирование может включать увеличение эффективности и/или скорости реакции СЙАТ и холина и/или увеличение количества СЙЛТ. присутствующего на месте действия. Это увеличение количества присутствующего фермента может происходить из-за генной регуляции или другой синтетической стадии образования фермента и/или уменьшения дезактивации и метаболизма фермента.

Выбранные процедуры испытания

Общая процедура препарирования крыс. Самок крыс 8ргадие ИаМеу (масса в пределах от 200 до 225 г) в возрасте семидесяти пяти дней (если не указано иначе) получают из Сйаг1ех Ртуег БайогаЮпех (Ройаде, ΜΙ). Животных подвергают либо билатеральной овариэктомии (ОУХ), либо имитационной хирургической операции в Сйаг1ех Ртуег БайогаЮпех и затем, спустя одну неделю, отгружают. По прибытии их помещают в металлические подвесные клетки группами из 3 или 4 на клетку, и они имеют свободный доступ к пище (содержание кальция приблизительно 0,5%) и воде в течение одной недели. Комнатную температуру поддерживают на уровне 22,2°±1,7°С с минимальной относительной влажностью 40%. Фотопериод в комнате составляет 12 ч свет и 12 ч темнота.

Схема введения лекарственного средства и сбор ткани после его введения. После недельного периода акклиматизации (следовательно, через две недели после ОУХ) начинают суточное дозирование Р-У. 17а-Этинил-эстрадиол или РУ дают перорально, если не установлено иначе, в виде суспензии в 1% карбоксиметилцеллюлозе или растворенным в 20% циклодекстрине. Животные получают дозы ежедневно в течение 4 дней. После завершения схемы введения лекарственного средства животных взвешивают и анестезируют смесью кетамин:ксилазин (2:1, объем:объем) и отбирают пробу крови пункцией сердца. Животных затем умерщвляют путем удушения СО2, матку удаляют через разрез по срединной линии и определяют массу влажной матки. 17а-этинил-эстрадиол получают от

81дта Сйет1са1 Со., 81. Ьошх, МО.

Сердечно-сосудистое заболевание/ гиперлипидемия

Пробы крови, взятые, как указано выше, выдерживают до свертывания при комнатной температуре в течение 2 ч и после центрифугирования в течение 10 мин при 3000 об./мин получают сыворотку. Сывороточный холестерин определяют путем количественного холестеринового анализа высокого разрешения Воейппдег Μаηηйе^т 0|адпох11С5. Кратко, холестерин окисляют до холест-4-ен-3-она и пероксида водорода. Пероксид водорода затем подвергают реакции с фенолом и 4-аминофеназоном в присутствии пероксидазы, чтобы получить краситель пхинонимин, который спектрофотометрически считывают при 500 нм. Концентрацию холестерина рассчитывают затем против стандартной кривой. Весь анализ автоматизируют, используя автоматизированную рабочую станцию Вютек.

Анализ эозинофилов матки с применением пероксидазы (ЕРО)

Матки, извлеченные, как указано выше, выдерживают при 4°С до ферментативного анализа. Матки затем гомогенизируют в 50 объемах 50 мМ буфера Трис (рН - 8,0), содержащего 0,005% Тритона Х-100. После добавления 0,01% перекиси водорода и 10 мМ О-фенилиендиамина (конечные концентрации) в буфер Трис, отслеживают увеличение оптической плотности в течение одной минуты при 450 нм. Наличие эозинофилов в матке является показателем эстрогенной активности соединения. Максимальную скорость 15-секундного интервала определяют над первоначальным линейным участком кривой реакции.

Процедура испытания ингибирования потери костной массы (остеопороза)

После общей процедуры препарирования, описанной выше, крыс обрабатывают ежедневно в течение 35 дней (6 крыс на группу обработки) и умерщвляют удушением диоксидом углерода на 36-й день. Период времени 35 дней достаточен для достижения максимального уменьшения плотности костной ткани, измеренной, как описано здесь. Во время умерщвления матки удаляют, отсекая постороннюю ткань, и жидкое содержимое удаляют перед определением влажной массы для того, чтобы подтвердить дефицит эстрогена, связанный с полной овариэктомией. Масса матки обычно уменьшается приблизительно на 75% в ответ на овариэктомию. Затем матки помещают в 10% нейтральный забуференный формалин, чтобы сделать возможным последующий гистологический анализ.

Правые бедра ампутируют и с помощью рентгеновских лучей воссоздают изображение в цифровой форме и анализируют, используя программу анализа изображения (ΝΙΗ инадс). на дистальном метафизе. Проксимальный аспект большеберцовой кости от этих животных также сканируют путем количественной компьютерной томографии. В соответствии с указанными выше процедурами, Р-У или этинил-эстрадиол (ЕЕ₂) в 20% гидроксипропил-в-циклодекстрине перорально вводят подопытным животным. Р-У также применим в сочетании с эстрогеном или прогестином.

Анализ пролиферации МСР-7

Клетки аденокарциномы молочной железы МСР-7 (АТСС НТВ 22) поддерживают в МЕМ (минимальная поддерживающая среда, феноловый красный-свободный, 31дта, 31. Ьошк. МО), обогащенной 10% фетальной телячьей сывороткой (РВ3) (об./об.), Ь-глутамином (2 мМ), пируватом натрия (1 мМ), НЕРЕ3 ((N-[2гидроксиэтил]пиперазин-№-[2-этансульфоновая кислота] 10 мМ), несущественными аминокислотами и бычьим инсулином (1 мкг/мл) (поддерживающая среда). За десять дней до анализа клетки МСР-7 переключают на поддерживающую среду, обогащенную 10% фетальной телячьей сывороткой, десорбированной древесным углем, покрытым декстраном (ИСС-РВ3) (среда для анализа) вместо 10% РВ3, чтобы истощить внутренние запасы стероидов. Клетки МСР-7 удаляют из склянок, в которых их поддерживали, используя среду для диссоциации клеток (Са++/Мд++ свободный НВ 33 (феноловый красный-свободный), обогащенной 10 мМ НЕРЕ3 и 2 мМ ЕОТЛ). Клетки промывают дважды средой для анализа и доводят до 80000 клеток/мл). Приблизительно 100 мл (8000 клеток) добавляют в плоскодонные лунки для микрокультур (Сок1аг 3596) и инкубируют при 37°С в 5% СО₂ увлажненном инкубаторе в течение 48 ч, чтобы дать возможность клеткам прикрепиться и прийти в состояние равновесия после переноса. Последовательные разбавления лекарств или ДМСО в качестве контроля разбавителя готовят в среде для анализа и 50 мл переносят на микрокультуры в трех копиях с последующими 50 мл среды для анализа до конечного объема 200 мл. Спустя дополнительные 48 ч при 37°С в 5% СО₂ увлажненном инкубаторе, мик рокультуры подвергают пульсирующему воздействию тритированным тимидином (1 мкКи/лунка) в течение 4 ч. Культивирование прекращают замораживанием при -70°С в течение 24 ч с последующим оттаиванием и сбором микрокультур с помощью полуавтоматического сборщика клеток 3ка1гоп. Пробы подсчитывают путем жидкостной сцинтилляции с помощью βсчетчика \Уа11ас Ве1аР1асе.

Ингибирование опухоли молочной железы, индуцированной ИМЕЛ

Зависимые от эстрогена опухоли молочных желез вызывают у самок крыс 3ргадиеИаМеу, которых приобретают у Наг1ап 1пбик1пек, Индианаполис, Индиана. В возрасте около 55 дней крысы получают единственное пероральное кормление 20 мг 7,12-диметилбенз [а] антрацена (ИМВА). Примерно через 6 недель после введения ИМВА молочные железы пальпируют с недельными интервалами для выявления опухолей, самый длинный и самый короткий диаметры каждой опухоли измеряют штангенциркулем, измерения записывают и это животное отбирают для экспериментирования. Делают попытку равномерно распределить различные размеры опухолей в обрабатываемой и контрольной группах так, что опухоли среднего размера эквивалентно распределяют между подопытными группами. Контрольные группы и подопытные группы для каждого эксперимента содержат 5-9 животных.

Р-У вводят либо путем интраперитонеальных инъекций в 2% камеди акации, либо перорально. Перорально вводимые соединения растворяют или суспендируют в 0,2 мл кукурузного масла. Каждую обработку, включая контрольные обработки камедью акации и кукурузным маслом, вводят раз в день каждому подопытному животному. После первоначального измерения опухоли и отбора подопытных животных опухоли измеряют каждую неделю указанным выше методом. Обработка и измерения животных продолжаются от 3 до 5 недель, за это время определяют конечные площади опухолей. Для каждой обработки соединением и контрольной обработки определяют изменение средней площади опухоли.

Процедуры испытания при фиброзе матки

Испытание 1. От 3 до 20 женщинам, имеющим фиброз матки, вводят Р-У. Количество вводимого соединения - от 0,1 до 1000 мг/день, и период введения - 3 месяца. Женщин наблюдают в течение периода введения и вплоть до 3 месяцев после прекращения введения для выявления воздействия на фиброз матки.

Испытание 2. Используют такую же процедуру как в испытании 1 за исключением того, что период введения равен 6 месяцам.

Испытание 3. Используют такую же процедуру как в испытании 1 за исключением того, что период введения равен 1 году.

Испытание 4. Продолжительную эстрогеновую стимуляцию используют, чтобы индуцировать лейомиому у половозрелых самок морских свинок. Животным вводят инъекцией эстрадиол 3-5 раз в неделю в течение 2-4 месяцев или до тех пор, пока не появятся опухоли. Обработку введением Е-У или носителя проводят ежедневно в течение 3-16 недель и затем животных умерщвляют и матки собирают и анализируют на предмет регрессии опухоли.

Испытание 5. Ткань лейомиом человека имплантируют в перитонеальную полость и/или в миометрий матки половозрелой кастрированной самки голой мыши. Экзогенный эстроген применяют, чтобы индуцировать рост эксплантированной ткани. В некоторых случаях собранные опухолевые клетки культивируют ίη νίΐτο перед имплантацией. Обработку введением Е-У или носителя проводят путем орошения желудка ежедневно в течение 3-16 недель и имплантаты удаляют и измеряют для выявления роста или регрессии. Во время умерщвления матки собирают, чтобы оценить состояние органа.

Испытание 6. Ткань из фиброидных опухолей матки человека собирают и поддерживают ίη νίίτο как первичные нетрансформированные культуры. Операционные препараты продавливают через стерильное решето или сито или, в качестве варианта, препарируют при помощи иглы для отделения от окружающей ткани, чтобы получить одноклеточную суспензию. Клетки поддерживают в среде, содержащей 10% сыворотку и антибиотик. Определяют скорости роста в присутствии и в отсутствие эстрогена. Клетки анализируют на их способность продуцировать комплементарный компонент С3 и их отклик на факторы роста и гормон роста. Культуры ίη νίίτο оценивают по их пролиферативному отклику, следующему после обработки прогестинами, ΟηΚΉ, Е-У и носителем. Уровни рецепторов стероидного гормона оценивают еженедельно, чтобы определить, все ли важные характеристики клеток поддерживаются ίη νίίτο. Используют ткань от 5-25 пациентов.

Испытание 7. Способность Е-У ингибировать стимулированную эстрогеном пролиферацию линий клеток ЕЬТ, выделенных из лейомиомы, измеряют по существу, как описано в публикации Ειιοίικ-Υοιιημ и др., «Ингибирование стимулированного эстрогеном роста лейомиом матки селективными модуляторами рецептора эстрогена», (ΙηΗίόίίίοη ο£ Εκΐιτ^η-δΐίιηιιία^ά Сго\\111 ο£ Шетше ^е^οтуοтаκ Ьу 8с1сс11ус Εκίτοдеи КесерЮг ΜοάιιΙαΙοίΈ. ΜοΙ.Οατ., 17(3):151159 (1996)), содержание которой включено в описание в качестве ссылки.

Процедуры испытания при эндометриозе

Испытание 1. В качестве подопытных животных используют от двенадцати до тридцати взрослых самок крыс штамма СИ. Их делят на три группы равной численности. Эстральный цикл всех животных отслеживают. В день проэструса проводят хирургическую операцию на каждой самке. У самок каждой группы удаляют левый рог матки, иссекают на небольшие квадраты и квадраты свободно пришивают в различных местах вблизи брыжеечного кровотока. Кроме того, у самок группы 2 удаляют яичники. Через день после хирургической операции животные групп 1 и 2 получают интраперитонеальные инъекции воды в течение 14 дней, тогда как животные в группе 3 получают интраперитонеальные инъекции 1,0 мг Е-У на килограмм кассы тела в течение такого же периода времени. После 14 дней обработки каждую самку умерщвляют и эндометриальные эксплантаты, надпочечники, остающуюся матку и яичники, где применимо, удаляют и препарируют для гистологического исследования. Яичники и надпочечники взвешивают.

Испытание 2. В качестве подопытных животных используют от двенадцати до тридцати взрослых самок крыс штамма СИ. Их делят на две равные группы. Эстральный цикл всех животных отслеживают. В день проэструса проводят хирургическую операцию на каждой самке. У самок каждой группы удаляют левый рог матки, иссекают на небольшие квадраты и квадраты свободно пришивают в различных местах вблизи брыжеечного кровотока. Приблизительно через 50 дней после хирургической операции животные, приписанные к группе 1, получают интраперитонеальные инъекции воды в течение 21 дня, тогда как животные в группе 2 получают интраперитонеальные инъекции 1,0 мг Е-У на килограмм массы тела в течение такого же периода времени. После 21 дня обработки каждую самку умерщвляют и внутриматочные эксплантаты и надпочечники удаляют и взвешивают. Эксплантаты измеряют в качестве критерия роста. Эстральные циклы отслеживают.

Испытание 3. Аутотрансплантаты внутриматочной ткани используют, чтобы вызвать эндометриоз у крыс и/или кроликов. Самок животных репродуктивной зрелости подвергают билатеральной овариэктомии и экзогенно питают эстрогеном, обеспечивая таким образом конкретный и постоянный уровень гормона. Аутогенную эндометриальную ткань имплантируют в брюшину 5-150 животных и питают эстрогеном, чтобы вызвать рост эксплантированной ткани. Обработку соединением по данному изобретению проводят орошением желудка ежедневно в течение 3-16 недель и имплантаты удаляют и измеряют, чтобы выявить рост или регрессию. Во время умерщвления интактный рог матки отбирают, чтобы оценить состояние эндометрия.

Испытание 4. Ткань из патологических внутриматочных изменений имплантируют в брюшину половозрелой кастрированной самки голой мыши. Экзогенный эстроген доставляют, чтобы вызвать рост эксплантированной ткани. В некоторых случаях собранные клетки эндометрия культивируют ίη νίίτο перед имплантацией. Обработку введением Р-У проводят орошением желудка ежедневно в течение 3-16 недель и имплантаты удаляют и измеряют, чтобы выявить рост или регрессию. Во время умерщвления матки собирают, чтобы оценить состояние интактного эндометрия.

Испытание 5. Ткань из патологических внутриматочных изменений собирают и поддерживают ίη νίίτο как первичные нетрансформированные культуры. Операционные препараты продавливают через стерильное решето или сито или, в качестве варианта, препарируют при помощи иглы для отделения от окружающей ткани, чтобы получить одноклеточную суспензию. Клетки поддерживают в среде, содержащей 10% сыворотку и антибиотик. Определяют скорости роста в присутствии и в отсутствие эстрогена. Клетки анализируют на их способность продуцировать комплементарный компонент С3 и их отклик на факторы роста и гормон роста. Культуры ίη νίίτο оценивают по их пролиферативному отклику, следующему после обработки прогестинами, ОпКН, Р-У и носителем. Уровни рецепторов стероидного гормона оценивают еженедельно, чтобы определить, все ли важные характеристики клеток поддерживаются ίη νίίτο. Используют ткань от 5-25 пациентов.

Расстройства ЦНС, включая болезнь Альцгеймера

Эстрогены, такие как 17в-эстрадиол, регулируют генную транскрипцию связыванием с рецепторами эстрогена (ЕК), которые находятся в цитоплазме некоторых клеточных популяций. Активация лиганда ЕК является предпосылкой для ядерного переноса комплекса, где связывание с согласованной последовательностью палидромной ДНК из 13 пар оснований (чувствительный к эстрогену элемент или ЕКЕ) начинает сборку аппарата транскрипции, который кульминирует в активации соответствующих целевых генов. Идентифицированы разнообразные гены, которые регулируются эстрогеном. Они включают цитоскелетные белки, нейротрансмиттерные биосинтетические и метаболические ферменты и рецепторы, а также другие гормоны и нейропептиды. ЕКЕ идентифицированы во многих чувствительных к эстрогену генах, включая вителлогенин, с-ίοκ, пролактин и лютеинизирующий гормон.

Что касается значимости в центральной нервной системе, ЕКЕ-подобные последовательности идентифицированы в р75п§г и 1гкА. которые служат в качестве сигнальных молекул для нейротрофинов: фактора роста нервов (ΝΟΡ), выделяемого головным мозгом фактора роста нервов (ΒΌΝΟΡ) и нейротрофина-3.

Было показано, что ΒΌΝΟΡ так же, как и ΝΟΡ, промотирует выживание холинергических нейронов в культуре. Принимается без доказательства, что, если взаимодействия между нейротрофинами и эстрогенами важны для развития и выживания базальных нейронов переднего мозга (которые дегенерируют при болезни Альцгеймера), тогда клинические состояния, при которых существует дефицит эстрогена (как после менопаузы), могут вносить свой вклад в потерю указанных нейронов.

Следующий эксперимент проводят на крысах с удаленными яичниками (препарированных, как описано выше), чтобы определить сходства и/или различия между Р-У и эстрогеном при воздействии на генную экспрессию в различных отделах головного мозга. Крысам в возрасте шесть недель ежедневно делают подкожные инъекции бензоата эстрадиола (0,03 мг/кг), Р-У или носителя (контроль). После пяти недель обработки животных умерщвляют и их головной мозг удаляют и гиппокамп отбирают путем микрорассечения. Гиппокамп быстро замораживают в жидком азоте и хранят при -70°С. Общую РНК получают из объединенной ткани из групп соответствующей обработки и контроля и подвергают обратной транскрипции с использованием 3' олигонуклеотидного праймера, который выбирают для (поли-А+) популяций специфической мРНК. Цепные реакции полимеразы (РСК) проводят в смеси, состоящей из статистических 5' олигонуклеотидов (длиной 10 пар оснований, всего 150), буфера реакции, Тад полимеразы и ³²Р6ТСР.

После 40 раундов амплификации продукты реакции фракционируют по размеру на геле 6% ТВЕ-мочевина, сушат и экспонируют на рентгеновской пленке. Полученные в результате проявленные картины мРНК сравнивают между группами обработки.

Применение Р-У в сочетании с эстрогеном

Женщины в пери- и постклимактерическом периоде часто подвергаются гормонозамещающей терапии (НКТ) для борьбы с негативными последствиями, связанными с падением в циркуляции эндогенного эстрогена, например для лечения приливов. Однако НКТ связана с повышенными рисками некоторых раковых заболеваний, включая рак матки и молочной железы. Р-У может быть использован в сочетании с НКТ, чтобы ингибировать эти риски.

Применение Р-У в сочетании с ингибитором ароматазы

По определению, яичники женщины в постклимактерическом периоде не функционируют. Ее единственным источником эстрогена является превращение андрогенов надпочечников в эстрогены ферментом ароматазой, которую обнаруживают в периферических тканях (жир, мышцы и сама по себе опухоль молочной железы). Поэтому лекарства, которые ингибируют ароматазу (ингибиторы ароматазы), ис черпывают запасы циркулирующего эстрогена женщины в постклимактерическом периоде. Депривация эстрогена посредством ингибирования ароматазы является важным выбором лечения для пациентов с метастатическим раком молочной железы. Во время лечения ингибитором ароматазы дефицит циркулирующего эстрогена может вызвать негативные непредусмотренные побочные эффекты, например, в отношении уровней липидов в сыворотке. Р-У может быть использован для ингибирования указанных негативных эффектов.

Применение Р-У в сочетании с аналогом Ι.ΙΙΒΙΙ

Непрерывное воздействие аналогом ЬНКН (гормона, высвобождающего лютеинизирующий гормон) ингибирует продуцирование эстрогена у женщины в предклимактерическом периоде путем десенсибилизации гипофиза, который затем больше не стимулирует яичники продуцировать эстроген. Клиническим эффектом является «медикаментозная овариэктомия», которая является обратимой при отказе от аналога ЬНКН. Во время лечения аналогом ЬНКН дефицит циркулирующего эстрогена может вызвать негативные непредусмотренные побочные эффекты, например, в отношении уровней липидов в сыворотке. Р-У может быть использован для ингибирования указанных негативных эффектов.

Повышение уровней ацетилхолина

Известно, что пациенты, страдающие от болезни Альцгеймера, имеют заметно более низкий уровень холинергических нейронов в гиппокампе, чем их ровесники без болезни Альцгеймера. Прогрессирующая потеря этих холинергических нейронов, по-видимому, отражает прогрессирующую потерю памяти и познавательной способности этих пациентов. Предполагается, что одной из причин упадка указанных нейронов является потеря или снижение функции нейротрансмиттера, ацетилхолина.

Уровень ацетилхолина в нейроне определяют, в основном, тогда, когда устанавливается равновесие между его биосинтезом и биоразложением. Фермент холин-ацетилтрансфераза (СПАТ) является, главным образом, ответственным за его синтез, и ацетилхолинэстераза (АСПЕ) - за его разложение.

Для того чтобы определить влияние Р-У на уровни СПАТ, проводят следующий эксперимент: После общей процедуры препарирования крыс, описанной выше, 40 крысам вводят ежедневно путем подкожной инъекции или кормлением через зонд Р-У в дозе 3 мг/кг/день в носителе, содержащем 10% циклодекстрина, бензоат эстрадиола в дозе 0,03 или 0,3 мг/кг/день или носитель в качестве контроля. Животных обрабатывают от 3 до 10 дней. На каждый режим дозирования отводят по двадцать животных. Через соответствующие промежутки времени животных умерщвляют и вырезают у них головной мозг. Конкретные части головного мозга гомогенизируют и анализируют. Гомогенаты из гиппокампа и лобной коры обрабатывают и определяют активность СПАТ анализом с применением радиоактивной метки биосинтеза ацетилхолина. Описание этой процедуры можно найти в публикации 8сйоерр с1 а1., 1. №ига1 Тгаикшщк., 78:183-193, 1989, содержание которой включено в описание в качестве ссылки.

Как и предполагалось, у ОУХ животных уровни СПАТ снижаются >50% (р<0,001) по сравнению с фиктивно оперированными контролями.

В другом варианте воплощения данного изобретения Р-У используют в сочетании с ингибитором АСПЕ. Применение ингибитора АСПЕ повышает уровни ацетилхолина, блокируя его разложение ингибированием АСПЕ.

Доброкачественная гиперплазия простаты (ВРН)

По поводу обоснования связи между действием эстрогена и лечением ВРН и карциномы простаты см. международную публикацию АО 98/07274, дата международной публикации 15 октября 1998 г.

В экспериментах, описанных ниже, способность Р-У связывать рецепторы эстрогена оценивают в различных линиях раковых клеток простаты человека.

Лизаты из линий раковых клеток простаты человека ЕИСаР, Όυ-45 и РС-3 готовят в среде ТЕС, содержащей 50 нМ Трис.НС1 рН 7,4, 1,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЕБТА), 0,4М КС1, 10% глицерина, 0,5 мМ 2МЕ и 10 мМ молибдата натрия, дополнительно содержащей ингибиторы протеазы пепстатин (1 мг/мл), лейпептин (2 мг/мл), апротинин (5 мг/мл) и фенилметилсульфонилфторид (РМ8Р, 0,1 мМ) (ТЕСР).

Лизаты клеток центрифугируют и осадки повторно суспендируют в холодной ТЕСР (1 мл ТЕСР/100 мг осадка) и обрабатывают ультразвуком в течение 30 с (рабочий цикл 70%, выход 1,8) на ультразвуковом дезинтеграторе Вгаикои модель 450. Лизаты осаждают центрифугированием при 10000 х С в течение 15 мин при 4°С, после чего супернатанты отделяют и либо используют сразу, либо хранят при -70°С.

Конкурентно-связывающий анализ. Связывающим буфером служит ТЕС, в которой 0,4М КС1 заменен 50 мМ ЫаС1 и к которой дополнительно добавляют 1 мг/мл овальбумина (ТЕСО). Р-У разбавляют до 20 нМ в ТЕСО, из чего готовят 3-кратные последовательные разбавления. Анализы проводят в круглодонных полипропиленовых микропланшетах в микролунках в трех экземплярах. В каждую лунку помещают 35 мл тритированного 17βэстрадиола (0,5 нМ, удельная активность 60,1 Ки/ммоль, ПиРоШ-Ыете Еид1аиб Ыискаг, Во81ои, МА) и 35 мл холодного конкурентного испы туемого соединения (0,1 нМ - 5 мМ) или ΤΕ60 и, после инкубирования в течение 5 минут при 4°С при взбалтывании, 70 мл лизата линии клеток МСЕ-7.

Планшеты инкубируют в течение 24 ч при 4°С, после чего в каждую лунку добавляют 70 мл покрытого декстраном угля (ОСС) с последующим энергичным взбалтыванием в течение 8 мин при 4°С. Планшеты затем центрифугируют при 1500 х 6 в течение 10 мин при 4°С. Супернатант собирают из каждой лунки на гибкий полистироловый микропланшет для сцинтилляционного подсчета счетчиком \Уа11ас МюоЬс1а модель 1450. Радиоактивность выражают как дезинтеграции в минуту (ΌΡΜ) после коррекции эффективности подсчета (35-40%) и фона. Дополнительными контролями являются общие конты и общие конты + ОСС, чтобы определить нижний предел контов, извлекаемых ОСС. Результаты этих конкурентно-связывающих анализов выражают как среднее процентное связывание (% связывания) +/- стандартное отклонение, используя формулу:

ΌРМиошстувиов соедкмехме ~ ОР^обеий коит + ВСС к связывания = _____________________________________ χ 100 испытуемого соединения ~ ОРМэбгосй конт *

ОСС

Предотвращение рака молочной железы

Данное изобретение относится также к введению Е-У реципиенту при риске развития у него йе ηονο рака молочной железы. Используемый здесь термин «йе ηονο» означает отсутствие превращения или метаморфоза нормальных клеток молочной железы в раковые или злокачественные клетки вначале. Такое превращение может происходить по стадиям в тех же самых или дочерних клетках посредством эволюционного процесса или как единственное кардинальное событие. Этот процесс йе ηονο является противоположностью метастазу, колонизации или распространению уже трансформированных или злокачественных клеток из места первичной опухоли в новые места.

Персоной, которая не подвергается особому риску развития рака молочной железы, является та, у которой может развиться йе ηονο рак молочной железы, у нее нет свидетельств или подозрения на возможность болезни сверх нормального риска и ей никогда не ставили диагноз такого заболевания. Фактором наибольшего риска, вносящим свой вклад в развитие рака молочной железы, является персональная история болезни или более раннее проявление болезни, даже если в период ремиссии нет очевидности ее наличия. Другим фактором риска является семейная история болезни.

Вызывание опухолей молочной железы у крыс введением канцерогена Ы-нитрозо-Ыметилмочевины является вполне приемлемой животной моделью для изучения рака молочной железы и найдено подходящим для анализа эффекта химиопрофилактических агентов.

В двух отдельных исследованиях самкам крыс 8ргадие-0а\\'1еу в возрасте 55 дней вводят внутривенно (исследование 1) или интраперитонеально (исследование 2) дозу 50 мг Νнитрозо-Ы-метилмочевины на килограмм массы тела за одну неделю до кормления со свободным доступом к пище по рациону, в который вводят переменные количества Е-У, основания (Ζ)-2-[4-(1, 2-дифенил-1 -бутенил)фенокси] -Ν,Νдиметилэтанамина (основания тамоксифена) или контроля.

В исследовании 1 диетические дозы 60 мг/кг пищи и 20 мг/кг пищи переводят в грубо сравнимые дозы 3 и 1 мг/кг массы тела для подопытных животных.

В исследовании 2 диетические дозы 20, 6, 2 и 0,6 мг/кг пищи грубо переводят в сравнимые дозы 1, 0,3, 0,1 и 0,03 мг/кг массы тела для подопытных животных.

Крыс наблюдают на случай проявления токсичности и взвешивают и пальпируют на случай образования опухоли один раз в неделю. Животных умерщвляют через тринадцать недель (исследование 1) или восемнадцать недель (исследование 2) и подтверждают наличие опухолей и взвешивают их при вскрытии.

Технологии приготовления лекарственного средства

Термин «фармацевтический», когда используется здесь в качестве прилагательного, означает по существу невредный для млекопитающего-реципиента. Под «фармацевтическим составом» подразумевается, что носитель, разбавитель, наполнители и активный (активные) ингредиент(ы) должны быть совместимы с другими ингредиентами состава и не должны быть вредными для их реципиента.

Е-У предпочтительно готовят в виде состава перед введением. Выбор состава должен определяться штатным врачом больницы, принимающим во внимание те же самые факторы, которые учитываются при определении эффективного количества.

Все активные ингредиенты в таких составах составляют от 0,1 до 99,9% по массе состава. Предпочтительно не более чем два активных ингредиента входят в указанный состав. То есть предпочтительно Е-У вводить в состав со вторым активным ингредиентом, выбранным из эстрогена, прогестина, ингибитора ароматазы, аналога ЬНКН и ингибитора АСКЕ. Наиболее предпочтительными составами являются те, где Е-У является единственным активным ингредиентом.

Фармацевтические составы по данному изобретению готовят процедурами, известными в технике, с использованием хорошо известных и легко доступных ингредиентов. Например, ЕУ, либо как единственный активный ингредиент, либо в сочетании с эстрогеном, прогестином, ингибитором ароматазы, аналогом ЬИКИ и ингибитором АСКЕ вводят в состав с обычными наполнителями, разбавителями или носителями, и придают форму таблеток, капсул, суспензий, растворов для инъекций, аэрозолей, порошков и тому подобного.

Фармацевтические составы по данному изобретению для парентерального введения содержат стерильные водные или неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии, а также стерильные порошки, которые непосредственно перед использованием восстанавливают в стерильные растворы или суспензии. Примеры подходящих стерильных водных и неводных носителей, разбавителей, растворителей или носителей включают воду, физиологический солевой раствор, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, поли(этиленгликоль) и тому подобное) и их подходящие смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Подходящую текучесть поддерживают, например, используя кроющие материалы, такие как лецитин, поддерживая подходящие размеры частиц в случае дисперсий и суспензий и используя поверхностно-активные вещества.

Парентеральные составы могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие вещества, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предотвращение действия микроорганизмов гарантируют включением в состав антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола, фенолсорбиновой кислоты и тому подобного. Может быть также желательно включать в состав изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и тому подобное. Абсорбция вводимых инъекцией составов может быть продлена включением в состав агентов, которые замедляют абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.

В некоторых случаях, для того чтобы продлить срок действия лекарства, желательно замедлить абсорбцию лекарства после подкожной или внутримышечной инъекции. Это может быть осуществлено за счет использования жидкой суспензии кристаллического материала со слабой растворимостью в воде или за счет растворения лекарства в маслянистом носителе. В случае подкожной или внутримышечной инъекции суспензии, содержащей форму лекарства со слабой растворимостью в воде, скорость абсорбции лекарства зависит от скорости его растворения.

Составы Е-У для инъекций замедленного всасывания беро! получают формированием микроинкапсулированных матриц лекарства в биоразложимых полимерах, таких как поли(молочная кислота), поли(гликолевая кислота), сополимеры молочной и гликолевой кислот, сложные поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды) указанных материалов, которые описаны в литературе. В зависимости от отношения лекарст ва к полимеру и характеристик конкретного используемого полимера степень высвобождения лекарства может быть регулируемой.

Составы для инъекций стерилизуют, например, фильтрованием через задерживающие бактерии фильтры или предварительной стерилизацией компонентов смеси перед их смешиванием либо во время производства, либо непосредственно перед введением (как например в упаковке двухкамерного шприца).

Твердые лекарственные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких лекарственных формах Е-У смешан, по меньшей мере, с одним инертным фармацевтическим носителем, таким как цитрат натрия или фосфат дикальция, и/или с (а) наполнителями или расширителями, такими как крахмалы, сахара, включая лактозу и глюкозу, маннит и кремниевая кислота, (Ь) связующими агентами, такими как карбоксиметилцеллюлоза и другие производные целлюлозы, альгинаты, желатин, поли(винилпирролидин), сахароза и камедь акации, (с) увлажнителями, такими как глицерин, (б) дезинтегрирующими агентами, такими как агар-агар, карбонат кальция, бикарбонат натрия, крахмал картофеля или тапиоки, альгиновая кислота, силикаты и карбонат натрия, (е) увлажняющими агентами, такими как глицерин, (Е) задерживающими растворение агентами, такими как парафин, (д) ускоряющими абсорбцию агентами, такими как соединения четвертичного аммония, (11) смачивающими агентами, такими как цетиловый спирт и моностеарат глицерина, (ί) абсорбентами, такими как каолин и бентонитовая глина, и (]) смазками, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые поли(этиленгликоли), лаурилсульфат натрия, и с их смесями. В случае капсул, таблеток и пилюль, лекарственная форма может также содержать буферные агенты.

Твердые составы подобного типа могут также содержать заполнитель мягких или твердых желатиновых капсул с использованием наполнителей, таких как лактоза, а также высокомолекулярные поли(этиленгликоли) и тому подобное.

Твердые лекарственные формы, такие как таблетки, драже, капсулы, пилюли и гранулы, могут быть также получены с покрытиями или оболочками, такими как энтеросолюбильные покрытия или другие покрытия, хорошо известные в технике приготовления фармацевтических составов. Покрытия могут содержать агенты, придающие непрозрачность, или агенты, которые высвобождают активный (активные) ингредиент(ы) в конкретной части пищеварительного тракта, как например, растворимые в кислоте покрытия для высвобождения активного ингредиента (активных ингредиентов) в желудке, или растворимые в основании покрытия для высво бождения активного ингредиента (активных ингредиентов) в кишечном тракте.

Активный ингредиент(ы) может быть также микроинкапсулирован в задерживающем высвобождение покрытии, причем микрокапсулы являются частью пилюли состава капсулы.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения Р-У включают раствор, эмульсии, суспензии, сиропы и эликсиры. В дополнение к активным компонентам жидкие составы могут включать инертные разбавители, традиционно используемые в данной области, такие как вода или другие фармацевтические растворители, солюбилизирующие агенты и эмульгаторы, такие как этанол, изопропанол, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3бутиленгликоль, диметилформамид, масла (в частности хлопковое, арахисовое, кукурузное, зародышевое, оливковое, касторовое и кунжутное масла), глицерин, тетрагидрофуриловый спирт, поли(этиленгликоли), сложные эфиры жирных кислот и сорбита и их смеси.

Помимо инертных разбавителей, жидкие пероральные составы могут также включать адъюванты, такие как смачивающие агенты, эмульгирующие и суспендирующие агенты и подслащивающие, вкусовые и ароматизирующие агенты.

Жидкая суспензия, в дополнение к активному ингредиенту (активным ингредиентам), может содержать суспендирующие агенты, такие как этоксилированные изостеариловые спирты, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбита и сорбитана, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонитовая глина, агар-агар и трагакант и их смеси.

Составы для ректального или интравагинального введения получают смешиванием Р-У с подходящими нераздражающими наполнителями, такими как какао-масло, полиэтиленгликоль или какой-либо воск для суппозитория, который является твердым при комнатной температуре, но жидким при температуре тела и поэтому плавится в ректуме или в вагинальной полости с высвобождением активного компонента (активных компонентов). Соединения растворяют в расплавленном воске, придают желательную форму и дают затвердеть до превращения в конечный состав суппозитория.

Р-У может быть также введен в форме липосом. Как известно в данной области, липосомы обычно получают из фосфолипидов или других жировых веществ. Липосомные составы образованы моно- или мультиламеллярными гидратированными жидкими кристаллами, которые диспергированы в водной среде. Может быть использована любая нетоксичная фармацевтическая и метаболизируемая жидкость, способная образовывать липосомы. Данные составы в липосомной форме могут содержать, в дополнение к Р-У, стабилизаторы, наполнители, консерванты и тому подобное. Предпочтительными липидами являются фосфолипиды и фосфатидил-холины (лецитины), как натуральные, так и синтетические.

Способы формирования липосом, известные в данной области, как описано, например, в публикации Ргексо!!, Ей., Ме11юйк ίη Се11 Βίοίοβν. Уо1υте XIV, Асайетю Ргекк, №\ν Уогк, Ν.Υ. (1976), р.33 е! кед.

Следующие примеры приготовления лекарственного средства являются только иллюстративными и не предназначены для ограничения объема данного изобретения.

Приготовление 1. Таблетки, содержащие приблизительно 10 и 50 мг, соответственно Р-У, могут быть получены следующим образом.

Ингредиент	Количество, мг/таблетка	Количество, мг/таблетка
Р-У	11,3	56,5
Лактоза безводная	176,8	128,2
Лактоза специальная, высушенная распылением	44,2	32,0
Повидон	11,0	13,0
Полисорбат 80	2,5	2,6
Кросповидон (внутри)	6,25	6,24
Кросповидон (снаружи)	6,25	6,5
Стеарат магния	1,5	1,7
Микрокристаллическая целлюлоза(снаружи)	0,0	13,0

Компоненты смешивают и прессуют в форме таблеток. Альтернативно, таблетки, каждая из которых содержит 2,5-1000 мг Р-У, получают следующим образом.

Приготовление 2. Таблетки.

Ингредиент	Количество, мг/таблетка
Р-У	25-1000
Крахмал	45
Целлюлоза, микрокристаллическая	35
Поливинилпирролидон (как 10% раствор в воде)	4
Натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы	4,5
Стеарат магния	0,5
Тальк	1

Р-У, крахмал и целлюлозу пропускают через сито № 45 меш США и тщательно перемешивают. Раствор поливинилпирролидона смешивают с полученными в результате порошками, которые затем пропускают через сито № 14 меш США. Полученные таким образом гранулы сушат при 50-60°С и пропускают через сито № 18 меш США. Натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы, крахмал, стеарат магния и тальк, предварительно пропущенные через сито № 60 США, затем добавляют к гранулам, которые после смешивания прессуют на таблетировочной машине, чтобы получить таблетки.

Суспензии, каждая из которых содержит 0,1-1000 мг медикамента на дозу 5 мл, получают следующим образом:

Приготовление 3. Суспензии.

Ингредиент	Количество, мг/5 мл
Р-У	0,1-1000 мг
Натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы	50 мг
Сироп	1,25 мг
Раствор бензойной кислоты	0,10 мл
Вкусовая добавка	ς.ν.
Краситель	ς.ν.
Очищенная вода до	5 мл

Медикамент пропускают через сито № 45 меш США и смешивают с натриевой солью карбоксиметилцеллюлозы и сиропом до образования гладкой пасты. Раствор бензойной кислоты, вкусовую добавку и краситель разбавляют некоторым количеством воды и добавляют при перемешивании. Затем добавляют достаточное количество воды, чтобы получить необходимый объем.

Приготовление 4. Раствор для внутривенного вливания.

Ингредиент	Количество
Р-У	25 мг
Изотонический солевой раствор	1000 мл

Раствор указанных выше ингредиентов внутривенно вводят пациенту со скоростью около 1 мл в минуту.

Приготовление 5. Таблетки, содержащие гидрохлорид цистеина.

Таблетки с ядром, весящие приблизительно 250 мг и содержащие приблизительно 10 мг или 20 мг Р-У, получают, как правило, следующим образом. Р-У, растворимые в воде разбавители (моногидрат лактозы и безводную лактозу) и часть дезинтегрирующего агента (кросповидона) смешивают в грануляторе с высоким усилием сдвига. Эту смесь затем пластицируют во влажном состоянии в грануляторе с высоким усилием сдвига с водным раствором повидона и полисорбата 80. Гидрохлорид цистеина также растворяют в растворе для гранулирования и добавляют во время стадии влажного пластицирования посредством раствора для гранулирования. Чтобы обеспечить постоянную массу содержимого таблетки, количество лактозы (моногидрата лактозы и безводной лактозы) уменьшают в соответствии с количеством добавленного гидрохлорида цистеина. После стадии шлихтования во влажном состоянии в мельнице с вращающейся мешалкой, гранулы сушат, используя сушилку с псевдоожиженным слоем. Высушенные гранулы уменьшают до подходящего размера в мельнице с вращающейся мешалкой. Остальные ингредиенты (микрокристаллическую целлюлозу, стеарат магния и остальной кросповидон) добавляют к высушенным гранулам и смешивают. Эту смесь затем прессуют в таблетки круглой формы с помощью обычного вращающегося пресса для таблетирования. Состав единицы для каждой из указанных серий суммирован в табл. 2, которая включает количество (мг/таблетка) и тип наполнителя, используемого в каждом случае. Как видно из таблицы, ядра таблеток для серий С и Ό включают нанесение пленочного покрытия, которое наносят посредством водной дисперсии в вентилируемом сбоку резервуаре для покрытия, который связан с коммерческой, подающей воздух установкой.

Таблица 2

Состав одной таблетки (мг/таблетка)

Ингредиент	Серия А	Серия В	Серия С	Серия Б
Р-У (эквивалент основания)	11,31 (10)	11,31 (10)	22,73 (20)	22,73 (20)
Ь-цистеин НС1 моногидрат	0,10	0,50	0,50	0,75
Повидон	12,50	12,50	12,50	12,50
Полисорбат 80	1,25	1,25	1,25	1,25
Безводная лактоза	148,67	148,35	139,22	139,02
Моногидрат лактозы	37,17	37,09	34,80	34,75
Кросповидон	12,50	12,50	12,50	12,50
Микрокристаллическая целлюлоза	25,00	25,00	25,00	25,00
Стеарат магния	1,50	1,50	1,50	1,50
Смесь красителей желтая	-	-	10,00	10,00

Приготовление 6. Таблетки, содержащие метионин.

Таблетки с ядром, весящие приблизительно 250 мг и содержащие приблизительно 1 мг РУ, получают, как правило, следующим образом. Р-У, растворимые в воде разбавители (моногидрат лактозы и безводную лактозу) и часть дезинтегрирующего агента (кросповидона) смешивают в грануляторе с высоким усилием сдвига. Эту смесь затем пластицируют во влажном состоянии в грануляторе с высоким усилием сдвига с водным раствором повидона и полисорбата 80. Метионин также растворяют в растворе для гранулирования и добавляют во время стадии влажного пластицирования посредством раствора для гранулирования. Чтобы обеспечить постоянную массу содержимого таблетки, количество лактозы (моногидрата лактозы и безводной лактозы) уменьшают в соответствии с количеством добавленного стабилизатора. После стадии шлихтования во влажном состоянии в мельнице с вращающейся мешалкой гранулы сушат, используя сушилку с псевдоожи женным слоем. Высушенные гранулы уменьшают до подходящего размера в мельнице с вращающейся мешалкой. Остальные ингредиенты (микрокристаллическую целлюлозу, стеарат магния и остальной кросповидон) добавляют к высушенным гранулам и смешивают. Эту смесь затем прессуют в таблетки круглой формы с помощью обычного вращающегося пресса для таблетирования. Состав единицы для каждой из указанных серий суммирован в табл. 3, которая включает количества (мг/таблетка) и тип наполнителя, используемого в каждом случае.

Таблица 3

Состав одной таблетки (мг/таблетка)

Ингредиент	Серия Е	Серия Е	Ингредиент	Серия Е	Серия Е
8егт III НС1 (экв. основания)	1,12 (1,0)	1,12 (1,0)	Моногидрат лактозы	38,88	38,78
Метионин	0,50	1,00	Кроспови- дон	12,50	12,50
Повидон	12,50	12,50	Микрокристаллическая целлюлоза	25,00	25,00
Полисорбат 80	2,50	2,50	Стеарат магния	1,50	1,50
Безводная лактоза	155,5	155,1

Дозирование

Конкретную дозу Е-У, вводимого согласно данному изобретению, определяют по конкретным условиям, сопровождающим каждую ситуацию. Эти условия включают путь введения, предварительную медицинскую историю реципиента, патологическое состояние или симптом, требующий лечения, тяжесть состояния/симптома, требующего лечения, и возраст и пол реципиента.

Как правило, эффективная минимальная суточная доза Е-У составляет около 1, 5, 10, 15 или 20 мг. Обычно эффективная максимальная доза составляет около 800, 100, 60, 50 или 40 мг. Наиболее обычные пределы доз находятся в интервале между 15 мг и 60 мг. Точная доза может быть определена в соответствии со стандартной практикой в области медицины «титрования доз» реципиента; то есть, первоначального введения низкой дозы соединения и постепенного увеличения до тех пор, пока не будет наблюдаться желательный терапевтический эффект.

Хотя может быть необходимо титровать дозу реципиента с учетом комбинированных терапий, обсуждавшихся выше, типичные дозы активных ингредиентов, иных чем Е-У, следующие: этинил-эстроген (0,01-0,03 мг/сутки), местранол (0,05-0,15 мг/сутки), конъюгированные эстрогеновые гормоны (например, Ргетапп®, ХУусЙ-АусгУ; 0,3-2,5 мг/сутки), медроксипрогестерон (2,5-10 мг/сутки), норэтилнодрел (1,0-10,0 мг/сутки), норэтиндрон (0,5-2,0 мг/сутки), аминоглутемид (250-1250 мг/сутки, предпочтительно 250 мг четыре раза в сутки), анастразол (1-5 мг/сутки, предпочтительно 1 мг один раз в сутки), летрозол (2,5-10 мг/сутки, предпочтительно 2,5 мг один раз в сутки), форместан (250-1250 мг в неделю, предпочтительно 250 мг дважды в неделю), экземестан (25-100 мг/сутки, предпочтительно 25 мг один раз в сутки), госерлин (3-15 мг/три месяца, предпочтительно 3,6-7,2 мг один раз каждые три месяца) и лейпролид (3-15 мг/месяц, предпочтительно 3,75-7,5 мг один раз каждый месяц).

Путь введения

Е-У может быть введен различными путями, включая пероральный, ректальный, трансдермальный, подкожный, внутривенный, внутримышечный и интраназальный. Способ введения каждого агента на основе эстрогена и прогестина согласуется с тем, который известен в этой области. Е-У, один или в сочетании с эстрогеном, прогестином или ингибитором АСЬЕ, обычно следует вводить в обычном составе.

Фармацевтические составы по данному изобретению могут быть введены людям и другим млекопитающим (например, собакам, кошкам, лошадям, свиньям и тому подобное) перорально, ректально, интравагинально, парентерально, местно, буккально или сублингвально или назально. Термин «парентеральное введение» относится здесь к способам введения, которые включают внутривенную, внутримышечную, интраперитонеальную, интрастернальную, подкожную или внутрисуставную инъекцию или вливание.

Способ/продолжительность введения

Для большинства способов по данному изобретению Е-У вводят постоянно от 1 до 3 раз в сутки или так часто, как необходимо для доставки эффективного количества Е-У реципиенту. Циклическая терапия может быть особенно применима при лечении эндометриоза или может быть использована экстренно во время болевых приступов болезни. В случае рестеноза, терапия может быть ограничена короткими (1-6 месяцев) интервалами после медицинских процедур, таких как ангиопластика.

Claims (8)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Несольватированный безводный кристаллический гидрохлорид 6-гидрокси-3-(4-[2(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)бензо[Ь]тиофена, имеющий рентгенограмму, которая содержит по меньшей мере один из следующих пиков: 7,3±0,2, 15,5±0,2, 15,9±0,2 и 17,6±0,2° в 2θ, когда она получена от медного источника радиации (СиКа; λ=1,54056 А).
2. 2. Кристаллическое соединение по п.1, где указанная рентгенограмма дополнительно содержит, по меньшей мере, один из следующих пиков: 17,9±0,2, 18,2±0,2, 18,9±0,2 и 21,5±0,2° в 2θ.
3. 3. Фармацевтический состав, содержащий кристаллическое соединение по п.1 и один или несколько фармацевтических носителей, разбавителей или наполнителей.
4. 4. Способ получения соединения по п.1, который включает кристаллизацию гидрохлорида 6-гидрокси-3-(4-[2-(пиперидин-1-ил)этокси]фенокси)-2-(4-метоксифенил)бензо[Ь]тиофена из растворителя для кристаллизации, выбранного из группы, состоящей из метанола или водного метанола, этанола или изопропанола, и последующую сушку полученного твердого вещества до постоянной массы.
5. 5. Способ по п.4, где указанным растворителем является водный метанол, в котором содержание воды находится в интервале между 20 и 5 об.%.
6. 6. Способ по п.5, где содержание воды равно 15 об.%.
7. 7. Соединение по п.1 для ингибирования остеопороза.
8. 8. Применение соединения по п.1 для получения медикамента для ингибирования остеопороза.