CN1469872A - 6-羟基-3-(4-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]苯氧基)-2-(4-甲氧基苯基)苯并[b]噻吩盐酸盐的新晶形 - Google Patents

Abstract

本发明涉及6－羟基－3－(4－[2－(哌啶－1－基)乙氧基]苯氧基)－2－(4－甲氧基苯基)苯并[b]噻吩盐酸盐的非溶剂化、无水新晶形及其应用，包括抑制与雌激素缺乏有关的病症，包括心血管病、高血脂和骨质疏松症；和抑制其它病理学症状如子宫内膜异位、子宫纤维变性、雌激素依赖性癌(包括乳腺癌和子宫癌)、前列腺癌、良性前列腺增生、包括阿尔茨海默氏病在内的中枢神经障碍；预防乳腺癌以及上调ChAT。

Description

6-羟基-3-(4-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]苯氧基)-2- (4-甲氧基苯基)苯并[b]噻吩盐酸盐的新晶形

                      背景技术

美国专利5,510,357最早从类属上描述了6-羟基-3-(4-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]苯氧基)-2-(4-甲氧基苯基)苯并[b]噻吩盐酸盐(arzoxifene)，尔后美国专利5,723,474(’474)和欧洲专利申请0729956具体公开了这一化合物。Arzoxifene是一种非甾族混合型雌激素拮抗剂/激动剂，可特别用于降低血清胆固醇和用于抑制血脂过高、骨质疏松、包括乳腺癌和子宫癌在内的雌激素依赖性癌、子宫内膜异位、包括阿尔茨海默氏病在内的CNS障碍、主动脉平滑肌细胞增殖和再狭窄。

具体讲，arzoxifene可用于治疗受体阳性转移性乳腺癌(正在进行临床评估)；在适当的系统或局部治疗后对受体阳性患者进行辅助治疗；减少侵袭性和非侵袭性乳腺癌的复发；并降低侵袭性乳腺癌与原位管癌(DSCI)的发病率。Arzoxifene还可用于与放疗、芳香酶抑制剂、LHRH类似物、和乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂进行联合治疗。

对按照后者’474中教导的方法分离得到的大块arzoxifene进行的X-射线粉末衍射(XRD)、热解重量分析(TGA)、质子核磁共振(¹H NMR)和卡尔费歇尔(KF)分析表明，所得产物为水合物，结晶性差，并且其晶格中含有可变量的有机挥发物(乙酸乙酯)。

就制剂的配制而言，结晶性差和/或非晶形的物质与高结晶性物质相比通常是不可取的。非晶形化合物因易吸收大量水而导致其化学与物理性质欠稳定。例如，在明胶胶囊中，由于非晶形物质的吸水性，当水分从明胶转移到非晶形组分中后会导致胶囊萎缩或变形。另外，非晶形化合物还具有从包含它们的溶液中析出的倾向。如果非晶形药物物质从给药溶液中析出，则可能会对药物的溶解性与生物利用度产生负面影响。

另外，由于有机溶剂对用药者具有潜在的毒性，而且药物的效力会随这些溶剂而改变，因此通常也不宜配制含有大量有机溶剂(例如乙酸乙酯)的药物。另外还有，从制备角度来讲，不论何时所述的制备都涉及过滤收集终产物的过程，因此制备非晶形物质一般来讲都是不太可取的。在所收集的物质为非晶形物时这种过滤往往都难以进行。此外，就制备性而言，配制含有大量水(水合物)的药物通常也是不可取的，因为水合作用的水平通常与药物生产和贮存情形下的相对湿度有关。换言之，相对于其无水形式，水合物的效力变化性常常更具或然性。

虽然按照’474中教导的方法制得的arzoxifene可用作药物，但是仍特别需要寻找其晶格内不含水或有机溶剂、可以以工业规模再现以及高效率地制得结晶性更好的arzoxifene。

                      发明概述

本发明涉及6-羟基-3-(4-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]苯氧基)-2-(4-甲氧基苯基)苯并[b]噻吩盐酸盐的非溶剂化无水新晶形(F-V)，其中当用铜辐射源进行X-射线衍射时，所述晶形具有包含下述峰值之一的X-射线衍射图案(2θ)：7.3±0.2，15.5±0.2，15.9±0.2，和17.6±0.2°。

另外，本发明还涉及药物制剂，其包括F-V；一种或多种药物载体，稀释剂或赋形剂；和任选的选自蛋氨酸、乙酰半胱氨酸、半胱氨酸或半胱氨酸盐酸盐；以及任选的雌激素，任选的孕激素，任选的芳香酶抑制剂，任选的LHRH类似物和任选的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂。

此外，本发明还涉及使用F-V抑制如下所述病理学症状的方法：子宫纤维变性、子宫内膜异位、主动脉平滑肌细胞增殖、再狭窄、乳腺癌、子宫癌、前列腺癌、良性前列腺增生、骨损失、骨质疏松、心血管病、高血脂、CNS障碍和阿尔茨海默氏病，以及F-V在制备用于所述疾病的药物中的应用。

本发明进一步涉及使用F-V上调胆碱乙酰转移酶(ChAT)的方法，以及使用F-V制备用于上调胆碱乙酰转移酶的药物的方法。

本发明还涉及制备F-V的方法，该方法包括用选自甲醇或含水甲醇，乙醇或异丙醇的结晶溶剂结晶6-羟基-3-(4-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]苯氧基)-2-(4-甲氧基苯基)苯并[b]噻吩盐酸盐；随后干燥所得固体至恒重。

                      附图简述

附图1是F-V的代表性TGA曲线。

附图2是F-V的代表性DSC曲线。

附图3是V型结晶的代表性XRD图案。

                      发明祥述

F-V可通过在室温或略微升高的温度下干燥室温下用甲醇、乙醇或异丙醇或甲醇的含水混合物结晶arzoxifene(或其任何多晶型物/溶剂化物)分离得到的结晶固体来制备。当使用乙醇或异丙醇时，所述溶剂中的水含量优选低于0.2％(A.C.S.分光光度分析级)。优选甲醇的含水组合物含有低于30％体积的水。更优选F-V是在室温或略微升高的温度下，通过干燥用含水甲醇(其中水含量为20％-5％体积)结晶分离得到的固体来制备。最优选F-V是通过在50-70℃下真空干燥室温下用含水甲醇(其中水含量为15％体积)结晶arzoxifene(或其任何多晶型物/溶剂化物)分离得到的固体来制备。

通常是将arzoxifene溶于甲醇(约1g溶质/20ml溶剂)，任选加热以使arzoxifene起始物质溶解。一旦溶解完全，在溶液缓慢冷却到室温之前可以任选地通过例如蒸馏法将溶液浓缩至约1g溶质/5ml溶剂。一旦达到室温后，溶液可任选地进一步冷却(借助于冰浴或冰箱)到0-5℃。结晶足够长的时间后，可通过真空过滤收集F-V结晶，用冷(约0℃)甲醇洗涤，之后真空干燥至恒重。优选干燥在氮气冲洗下在略微增高的温度下进行(约50℃下干燥12-48小时)。当以工业规模合成F-V时，加入F-V晶种对结晶是有利的。

用于上述结晶方法的适当arzoxifene起始物质包括但不限于S-II、F-I、F-III(PCT专利申请PCT/US 00/16332和PCT/US 00/16333中描述的arzoxifene的溶剂化和非化学计量水合物的晶形，其内容在此并入引作参考)，按照’474中教导的方法制得的arzoxifene、或它们的任意混合物。用何种形式的arzoxifene作为起始物质并不重要，因为按照本发明方法用无水甲醇结晶都产生F-V结晶。

                       F-V的表征

使用差示扫描量热法/热重量分析法(DSC/TGA)、吸湿/解吸法，以及X-射线粉末衍射(XRD)法表征F-V。TGA是一种测量物质的热诱导重量损失与温度之间的函数关系。最常用于研究固体的去溶剂化过程和定量测定固体的总挥发量。DSC是一种常用于筛析化合物多晶型形成的技术，因为物质发生物理变化时的温度通常是物质的特征。吸湿等温线用于评价与给定物质的吸湿度和表征非水合物和水合物。最后，XRD是检测晶体材料内部的长程序的技术。

F-V的代表性TGA曲线见图1所示。F-V的热重量分析法显示没有重量损失，这表明分离得到是非溶剂化晶形。F-V的DSC分析在174-175℃处显示一个尖的熔化吸热峰(见图2所示)，它明显高于F-III的观测峰。

F-V的吸湿/解吸等温曲线显示在0-95％RH的范围内重量增加了0.11％，这表明arzoxifene的稳定无水晶形吸附水或转化为水合物形式的倾向很低。

F-V的XRD图案特性是具有良好结晶性物质特征的尖峰和平坦基线。对于其强度等于或大于F-V最大峰10％的所有峰的角峰位置(2θ)和相应的I/Io数据列表在表1中。表1中的所有数据均以±0.2％的精度表示。虽然在与S-II，F-I和F-III所报道的类似衍射角处通常有许多强反射，但是每一种晶形都给出不同的粉末图案，使得S-II，F-I，F-III和F-V之间有明显区别。

F-V的变温X-射线粉末衍射分析显示在高达125℃的衍射图案范围内无明显变化，与DSC分布图一致，这表明其为稳定晶形。

在晶体学领域众所周知的是，对于任何给定的晶形，因为某些因素例如晶体形态和习性导致的优选定向，衍射峰的相对强度可能会发生变化。当存在优选定向作用时，峰强度会改变，但多晶型物的峰位置不会改变。参见例如《美国药典#23》(United States Pharmacopeia#23)，National Formulary #18，第1843-1844页，1995。此外，结晶学领域中还公知的是，对于任何给定晶形，角峰位置可能会发生微弱变化。例如，由于分析样品时的温度变化、样品移动、或内标的存在与否都可能导致峰位置发生移动。在本申请中，2θ的±0.2峰位置变异性已经将这些可能变化考虑进去，不会妨碍F-V的明确鉴定。

文献中研究晶形的公知可用方法为“Fink”方法。Fink方法使用四条最强的谱线进行初步研究，随后再使用下一组四条最强谱线。按照Fink方法，基于峰强度和峰位置，F-V可用下述角度处(2θ)存在的峰进行鉴定：7.3±0.2，15.5±0.2，15.9±0.2，和17.6±0.2°(图案由由铜辐射源获得)。F-V的存在可进一步根据下列角度处(2θ)的峰鉴定：17.9±0.2，18.2±0.2，18.9±0.2，和21.5±0.2°(对于由铜辐射源得到的图案)。

                                          表1

2θ角	I/Io(％)	2θ角	I/Io(％)	2θ角	I/Io(％)
						7.3	45	17.6	72	22.6	19
9.0	22	17.9	83	23.3	20
						10.0	10	18.2	56	24.4	46
12.8	39	18.9	82	25.8	38
						14.6	15	19.8	27	27.4	32
15.5	50	21.5	100	28.2	18
						15.9	64

与按照’474中公开的方法制得的arzoxifene的已有形式以及与前面引作参考的PCT申请中描述的F-I和F-III相比，F-V具有多种优点。相对于按照’474中公开的方法制得的arzoxifene，F-V在室温下更稳定，因此更适于药物应用，即更适于制成药物制剂。另外，与’474中公开的晶形不同，F-V具有更好的结晶性。与非晶形物质相比，结晶物质通常具有吸湿性低和稳定性高的性质(例如化学降解的趋势低，能保持始终一致的效力)。因此更适于制剂加工。此外，与按照’474中描述的方法制得的其晶格中含有乙酸乙酯和水的arzoxifene的形式相比，F-V中二者都不含。

与S-II，F-I和F-III不同，F-V是arzoxifene的真正无水形式，随着相对湿度的变化而不存在吸附水的倾向。而且，F-V的晶格能够稳定到其熔点温度。此外，与F-III相比，F-V大约具有10％的高水溶性，并且是arzoxifene的热动力学最稳定的已知形式。

表征方法

DSC分析采用配置有自动进样器和冷冻冷却装置的2920型TA仪进行。样品装在卷曲铝盘内，分析相对于空参比盘进行。热流量在30℃平衡后测量。以每分钟5℃的加热速率加热到300℃。求积分热流量-温度曲线以确定吸热或放热活动。

TGA分析采用配置有自动进样器的2950型TA仪进行。样品置于配衡铝盘中，以10℃/分钟的速度从室温升至300℃。求积分重量百分数-温度曲线以测定百分损失率。

吸湿等温曲线使用VTI SGA-100流量仪绘制。25℃下以5％RH的级差在0-95％相对湿度(RH)下对样品进行吸湿分析，并在95-5％的RH下进行解吸分析。吸附和解吸等温线绘制为％重量变化率与％RH的曲线。

X射线粉末衍射图案是在配置有在50kV和40mA下操作的CuKα源(λ＝1.54056)和Kevex固态Si(Li)检测器的D5000型Siemens X-射线粉末衍射仪上获得。样品在4-35°(2θ)范围内以0.04°步长扫描2.5秒钟。干燥粉末装填在凹穴式顶部加料样品架内，利用玻璃片获得光滑表面。

变温X-射线粉末衍射图案是在配置有在50kV和40mA下操作的CuKα源(λ＝1.54056)和闪烁检测器和镍滤片的D5000型Siemens X-射线粉末衍射仪上获得。粉末填充在顶部加料的凹穴式温控样品架内，并形成光滑表面用于衍射。样品在2.5秒内以0.04°步长从2°扫描到35°(2θ)，扫描在25℃平衡5分钟后开始进行。以25℃的增温幅度增加到最高125℃进行后继扫描。

下列实施例进一步说明制备F-V的方法。这些实施例不是、而且也不应当理解为以任何方式对本发明范围的限制。

                        实施例

                         实施例1

                 用甲醇结晶(非浓缩情形下)

混合20.00g arzoxifene样品与500ml无水甲醇(HPLC级)，加热到回流状态。所有固体都溶解，形成一浅黄色均相溶液。冷却溶液至回流温度之下，另加入5.00g arzoxifene。再加热溶液至回流以溶解所有固体。搅拌下缓慢冷却溶液。在50℃用数毫克先前制备的F-V盐引晶。1.25小时内将结晶浆液从50℃冷却到30℃。此时存在大量白色固体。将搅拌着的浆液浸入冰浴中，再搅拌3小时。浆液使用#1号Whatman滤纸过滤，白色固体用50ml预冷到0℃的甲醇洗涤。在N2缓流冲洗下50℃真空干燥湿滤饼约48小时。收率15.94g(63.8％收率)。HPLC效能：89.4％(按游离碱计)，总相关物质(TRS)0.28％。比较干燥前后产物的重量表明初始的湿滤饼含65％的溶剂。

                         实施例2

                 用甲醇结晶(浓缩情形下)

取25.00g arzoxifene样品与500m1无水甲醇(HPLC级)混合，加热到回流状态。所有固体都溶解后形成一浅黄色均相溶液。通过常压蒸馏除去375ml馏出液来浓缩溶液。此时反应混合物为一黄色均相透明溶液。停止回流，溶液用数毫克先前制备的F-V引晶。加入晶种后，在缓慢搅拌下于1小时内冷却混合物到室温。在此过程中有大量白色沉淀物形成。将浆液浸入冰浴中，另搅拌3小时。浆液使用#1号Whatman滤纸过滤，所得白色固体用50ml预冷至0℃的甲醇洗涤。在N₂缓流冲洗下50℃真空干燥湿滤饼约48小时。收率22.44g(89.8％收率)。HPLC效能：91.3％(按游离碱计)，TRS 0.26％。比较干燥前后产物的重量表明初始的湿滤饼含31.5％的溶剂。

                         实施例3

                用甲醇结晶(30加仑规模)

取3.08kg arzoxifene样品与60L无水甲醇(HPLC级)混合，加热到回流状态。所有固体都溶解后形成一浅黄色均相溶液。溶液通过常压蒸馏移出40L馏出液进行浓缩。此时反应混合物为一黄色均相透明溶液。中止回流，在约40℃开启人孔检测结晶情况。观测到有结晶形成，然后以每小时12℃的速率继续冷却至最终温度0℃。0℃搅拌浆液过夜，然后通过单板式压滤器过滤。为从结晶槽中移出所有产物，使用母液作为槽洗涤物，然后通过压滤器。湿滤饼之后用11.3L预冷至0℃的甲醇洗涤。通过对压滤器施加真空和50℃流动水通过压滤器夹套的情形下干燥湿滤饼。大约24小时后缓缓通入N₂流。总干燥时间约36小时。收率2.588kg(86.27％)。HPLC效能：92.7％(按游离碱计)，TRS 0.39％。

                         实施例4

                      用乙醇结晶

混合精制乙醇(250ml)与azroxifene(10.0g)，加热回流以完全溶解。在3小时内冷却溶液到室温，期间有结晶沉淀物形成。过滤分离固体物，并在N₂缓流冲洗下50℃真空干燥。收率5.50g，m.p.173℃(根据DSC)。测定该样品的X-射线粉末衍射光谱，发现与图3中公开的F-V图案基本相同。

                      实施例5

                   用异丙醇结晶

混合无水异丙醇(250ml)与azroxifene(10.0g)，加热回流以完全溶解。移去热源，溶液用数毫克F-V引晶。冷却反应混合物到室温，搅拌过夜，在次期间有白色沉淀物形成。过滤分离固体物，得12.11g湿滤饼。取4.01g湿滤饼样品在N₂缓流冲洗下于60℃真空干燥。收率2.72g；m.p.171.5℃(根据DSC)。测定该样品的X-射线粉末衍射光谱，发现与图3中公开的F-V图案基本相同。

                       实施例6

                由azroxifene游离碱制备

将azroxifene游离碱(5.07g)在65.0ml甲醇中制成浆液。向该反应混合物中加入1.41ml浓盐酸和10.0ml水。加热反应混合物到55℃保持15分钟以完全溶解。冷却反应混合物到30℃，用50mg F-V引晶。然后以1℃/hr的速度冷却反应混合物到10℃，在室温下搅拌8小时。过滤分离固体物，用预冷到10℃的甲醇洗涤，在N₂缓流冲洗下50℃真空干燥。收率4.42g(87.7％收率)；效能(HPLC)99.7％；TRS0.32％。测定该样品的X-射线粉末衍射光谱，发现与图3中公开的F-V图案基本相同。

应用

本说明书所用术语“有效量”是指能抑制本文所述病症或其有害影响的F-V的量。当F-V与雌激素、孕激素、芳香酶抑制剂、LHRH类似物、或AChE抑制剂联合给药时，术语“有效量”也指能产生其预定效果的这种药剂的量。

术语“抑制”包括其公认的含义，亦即预防、阻止、遏制、缓解、改善、减缓、终止或逆转本文所述病理学症状或其后遗症的进展或严重程度。

本说明书所用术语“预防”、“预防的”、“防止”和“阻止”是可互换的，并且是指降低F-V接受者罹患或发生本文所述病理学症状或其后遗症的可能性。

术语“缺乏雌激素”和“雌激素缺乏”是指天生或临床引起的女性不能产生足够量的内源性雌激素来维持雌激素依赖性功能例如月经、骨质内环境稳定、神经元功能、心血管疾病等的病症。这种雌激素缺乏情形是由于(但并不限于)下列原因引起的：绝经和外科或化学方法的卵巢切除术，包括其功能等同疗法，例如用芳香酶抑制剂、GnRH激动剂或拮抗剂、ICI 182780等进行的药物治疗。与雌激素缺乏症相关的病症包括但不限于：骨损失、骨质疏松、心血管病和高血脂。

本说明书所用术语“雌激素”包括具有雌激素活性的甾族化合物，例如17β-雌二醇、雌酮、轭合雌激素(Premarin^)、马雌激素17β-乙炔基雌二醇等。优选的雌激素类化合物是Premarin^和异炔诺酮。

本说明书所用术语“孕激素”包括具有促孕活性的化合物，例如孕酮、异炔诺酮、nongestrel、乙酸甲地孕酮、炔诺酮等。炔诺酮是优选的孕激素类药物。

本说明书所用术语“芳香酶抑制剂”包括能抑制芳香酶的化合物，例如市售抑制剂如氨鲁米特(aminoglutemide)(CYTANDREN^)、Anastrazole(ARIMIDEX^)、来曲唑(FEMARA^)、福美司坦(LENATRON^)、依锡美坦(AROMASIN^)等。

本说明书所用术语“LHRH类似物”是指能抑制绝经前妇女产生雌激素的黄体生成素释放激素类似物，包括例如性瑞林(ZOLADEX^)、亮丙瑞林(LUPRON^)等。

本说明书所用术语“AChE抑制剂”包括能抑制乙酰胆碱酯酶的化合物，例如水杨酸毒扁豆碱、盐酸他克林、盐酸多奈皮茨(donepezil)等。

术语“上调ChAT”是指提高ChAT的酶活性，即促进胆碱向乙酰胆碱的转化。这种促进作用包括提高ChAT和胆碱反应的效率和/或速率，和/或增加ChAT在反应位点存在的量。这种酶存在量的增多可能是由于基因调控或酶形成的其它合成步骤和/或该酶的失活和代谢下降所致。

选择的试验方法

通用的大鼠制备方法：75日龄(另有说明除外)雌性SpragueDawley大鼠(体重200-225g)自Charles River Laboratories(Portage，MI)获得。在Charles River Laboratories将大鼠两侧卵巢切除(OVX)，或进行Sham手术操作；然后在一周后用船运达。到达后，将它们分组置于金属悬挂笼内，每笼3或4只，自由进食(食物中钙含量约0.5％)和饮水一周。室温保持在22.2°±1.7℃，相对湿度40％。房间光照周期为12小时光照和12小时黑暗。

给药方案组织收集：经过一周的新环境适应期后(即OVX两周后)，开始每天给药F-V。除另有说明外，口服给药为1％羧甲基纤维素悬浮液或20％环糊精溶液形式的17α-乙炔基雌二醇或F-V。对大鼠每天给药，连续4天。该给药方案进行完后，称重大鼠，用氯胺酮：甲苯噻嗪(2∶1，v∶v)混合物麻醉，通过心脏穿刺采集血样。然后用CO₂窒息处死大鼠，通过中线切口取出子宫，测定子宫湿重。17α-乙炔基雌二醇购自Sigma化学公司(St.Louis，MO)。

心血管疾病/高血脂

将上述血样在室温下凝结2小时，以3000rpm离心10分钟后获得血清。采用Boehringer Mannheim Diagnostics高效胆固醇分析法测定血清胆固醇。简言之，就是将胆固醇氧化成胆甾-4-烯-3-酮和过氧化氢。过氧化氢然后在过氧化酶存在下与苯酚和4-氨基安替比林反应，生成对-苯醌亚胺染料，后者在500nm下用分光光度法读取。然后通过标准曲线计算胆固醇浓度。全部测定均是使用Biomek AutomatedWorkstation自动进行。

子宫嗜酸性细胞过氧化酶(EPO)分析

4℃保存上述子宫直至开始进行酶法分析。将子宫在50体积50mM含有0.005％曲通-100的Tris缓冲液(pH-8.0)中匀化。加入0.01％过氧化氢和在Tris缓冲液中的10mM邻苯二胺(终浓度)，在450nm处检测1分钟吸收度的增加。子宫中嗜酸性细胞的存在是化合物雌激素活性的指征。通过反应曲线的初始直线部分确定15秒间隔的最大速度。

抑制骨损失(骨质疏松)的测试方法

进行完上述常规制备操作后，每天处理大鼠，连续35天(每处理组包含6只大鼠)，在第36天通过用CO₂窒息处死大鼠。35天时间足以使按本说明书所述方法测定的骨密度发生最大减小。处死时取出子宫，剔除外部组织，在测定湿重之前将流体内容物排出，以确信形成与子宫完全切除有关的雌激素缺乏。由于子宫切除，子宫重量通常下降约75％。然后将子宫置于10％中性缓冲福尔马林中，以随后进行组织学分析。

切除右股骨，用X-射线进行数字化分析，在远侧干骨端通过影像分析程序(NIH影像)进行分析。也可以通过定量计算机断层扫描来扫描胫骨邻面。依据上述操作，将在20％羟丙基β-环糊精中的F-V或乙炔基堆二醇(EE₂)对测试大鼠口服给药。F-V还用于和雌激素或孕激素联合给药。

MCF-7增殖分析

将MCF-7乳腺癌细胞(ATCC HTB 22)保存在补加有10％胎牛血清(FBS)(V/V)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸钠(1mM)、HEPES{(N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸]10mM)、非必需氨基酸和牛胰岛素(1ug/ml)(维持培养基)的MEM(最低必需培养基，不含酚红，Sigma，St.Louis，MO)中。在分析前10天，将MCF-7细胞换成补加有10％用葡萄糖包被活性炭脱色的胎牛血清(DCC-FBS)的维持培养基来代替10％FBS，以耗尽甾体化合物内贮存。用细胞解离培养基(补加有10mMHEPES和2mM EDTA，不含Ca⁺⁺/Mg⁺⁺的HBSS(不含酚红))，将MCF-7细胞从保存瓶中移出。用测定培养基洗涤细胞2次，调节至80000细胞/ml。取大约100mL(8000个细胞)加到平底微量培养管(Costar 3596)内，在37℃、5％CO₂潮湿恒温箱中培养48小时，以使细胞转移后粘着和平衡。在测定培养基中制备系列稀释浓度药物或作为稀释剂对照物的DMSO，取50ml转移到微培养基中(一式三份)，然后加入50mL测定培养基，终体积为200mL。在5％CO₂潮湿恒温箱中于37℃再温育48小时后，将微培养基用氘化胸腺嘧啶核苷(1uCi/孔)脉冲4小时。通过在-70℃冷冻24小时终止培养，然后用Skatron Semiautomatic CellHarvester融解并收集微培养基。用Wallac BetaPlaceβ计数器通过液体闪烁方法计数样品。

对DMBA-诱导的乳腺癌抑制作用

在购自Harlan Industries，Indianapolis，Indiana的雌性Sprague-Dawley大鼠中产生雌激素依赖性的乳腺癌。对55日龄的大鼠单次口服给药20mg 7，12-二甲基苯并[a]蒽(DMBA)。投药DMBA约6周后，以每周一次的间隔触诊乳腺以确定肿块出现。每当出现一个或多个肿块时，用度量卡尺测定每一肿块的最长和最短直径，记录测量值，选择该大鼠进行实验。为了使治疗组和对照组中肿块大小均匀分配，将平均大小的肿块在测试组间均等地分布。对于每一实验，对照组和测试组包含5-9只大鼠。

腹膜内注射F-V在2％阿拉伯胶中的形式或口服给药F-V。口服给药的化合物或溶解或悬浮在0.2mL玉米油中。对每一测试动物每天给药一种处理物，包括阿拉伯胶和玉米油对照处理物。在测量初始肿块和选择测试动物之后，通过上述方法每周测量肿块。大鼠的处理和测量持续3-5周，在结束时测定肿决的最终面积。对于每一化合物和对照处理物，测定平均肿块面积的变化。

子宫纤维变性试验方法

试验1：对患有子宫纤维变性的3-20位妇女给药F-V。化合物的给药量为0.1-1000mg/天，给药期为3个月。在给药期间和停药后高达3个月内观察这些妇女，以确定对子宫纤维变性的影响。

试验2：采用与试验1相同的方法，只是给药期为6个月。

试验3：采用与试验1相同的方法，只是给药期为1年。

试验4：采用长期雌激素刺激诱导性成熟雌性豚鼠产生平滑肌瘤。给豚鼠每周注射3-5次雌二醇，连续注射2-4个月或者直至产生肿瘤。每天给药F-V或载体来进行治疗，连续给药3-16周，然后处死动物，取出子宫并分析肿瘤消退情况。

试验5：将人平滑肌瘤组织植入性成熟、去生殖腺的雌性裸鼠的腹膜腔和/或子宫肌层内。提供外源性雌激素诱导移植组织生长。在某些情况下，在移植前对获得的肿瘤细胞进行体外培养。每天通过胃灌法给药F-V治疗物或载体，连续给药3-16周，取出移植物，测定其生长或消退情况。处死动物取出子宫以评价该器官的情况。

试验6：收集人子宫纤维瘤组织并体外保存作为初始非转化培养物。将手术样本通过无菌网或筛，或者剔除周围组织，制备单细胞悬浮液。将细胞保存在含有10％血清和抗生素的培养基中。测定有或无雌激素存在下的生长速率。评价细胞产生补体组分C3的能力，和它们对生长因子和生长激素的反应。评价体外培养物用孕激素、GnRH、F-V、和赋形剂处理后的增殖反应。每周评定甾体激素受体的水平，以测定在体外是否能保持重要的细胞特性。使用取自5-25名患者的组织。

试验7：基本上按照Fuchs-Young等人“用选择性雌激素受体调节剂抑制雌激素刺激的子宫平滑肌瘤生长”，Mol.Car.，17(3)：151-159(1996)的方法(该文献引入本发明用作参考)，测定F-V抑制雌激素刺激的衍生自平滑肌瘤的ELT细胞系增殖的能力。

子宫内膜异位试验方法

试验1：使用12-30只成年CD种系雌性大鼠作为试验动物。将它们分成等数量的3组。监测所有动物的动情周期。在动情前期当天，对每只雌性大鼠进行手术。切除各组中雌鼠的子宫左侧角，切成小方块，将小方块在邻近肠系膜血流的不同位点宽松地缝合。此外，切除第2组雌鼠的卵巢。自手术后当天开始，对第1组和第2组雌鼠腹膜内注射水，连续注射14天，在相同期间内，给第3组雌鼠腹膜内注射1.0mg/kg体重的F-V。处理14天后，杀死雌鼠，取出子宫内膜外植体、肾上腺、剩余子宫、和卵巢(如果有的话)，并制成适于组织学检查的形式。称重卵巢和肾上腺。

试验2：使用12-30只成年CD种系雌性大鼠作为试验动物。将它们分成等数量的2组。监测所有动物的动情周期。在动情前期当天，对每只雌鼠进行手术。切除每一组雌鼠的子宫左侧角，切成小方块，将小方块在邻近肠系膜血流的不同位点宽松地缝合。手术约50天后，对第1组雌鼠腹膜内注射水，连续注射21天，在相同期间内，给第2组雌鼠腹膜内注射1.0mg/kg体重的F-V。治疗21天后，处死每只雄鼠，取出子宫内膜外植体和肾上腺并称重。测定外植体作为生长的指征。监测动情周期。

试验3：在大鼠和/或兔子中使用子宫内膜组织真迹复制术来诱导子宫内膜异位。将生殖成熟期的雌性动物进行两侧卵巢切除术，补充外源性雌激素以提供特定且恒定的激素水平。将自体子宫内膜异位组织移植到5-150只动物的腹膜内，补充雌激素以诱导该外植入组织生长。每天通过胃灌注用本发明化合物进行治疗，连续3-16周，取出移植体并测定其生长或消退情况。处死动物收集完整的子宫角，评价该完整子宫内膜的情况。

试验4：将人子宫内膜损伤组织植入到性成熟、去生殖腺的雌性裸鼠腹膜内。补充外源性雌激素以诱导该外植入组织的生长。在某些情况下，在植入前体外培养所收集的子宫内膜细胞。每天通过胃灌注给药F-V处理物，连续给药3-16周，取出移植体并测定其生长或消退情况。处死动物取出子宫，评价该完整子宫内膜的情况。

试验5：收集人子宫内膜损伤组织并体外保存作为初始非转化组织。将手术样本通过无菌网或筛，或者剔除周围组织，以制备单细胞悬浮液。将细胞保存在含有10％血清和抗生素的培养基中。测定有或无雌激素存在时的生长速度。测定细胞产生补体组分C3的能力，和它们对生长因子和生长激素的反应。评定用孕激素、GnRH、F-V、和载体处理后体外组织的增殖反应。每周评价甾体激素受体的水平，以测定在体外是否能保持重要的细胞特性。使用得自5-25名患者的组织。

包括阿尔茨海默氏病在内的CNS障碍

雌激素例如17β-雌二醇通过与存在于一些细胞胞质内的雌激素受体(ER)结合来调控基因转录。对于复合物的核转运，当与13碱基对回文DNA共有序列(雌激素反应单元，或ERE)结合并开始装配在适当靶基因的活化中达到顶峰的转录装置时，ER的配体活化是先决条件。已经鉴定了多种通过雌激素调控的基因。这些基因包括细胞骨架蛋白、神经递质生物合成和代谢酶与受体、以及其它的激素和神经肽。已经在包括卵黄生成素、c-fos、催乳素和促黄体素在内的多种雄激素反应性基因中鉴定出ERE。

在中枢神经系统中非常重要的是，已经在p75^ngr和trkA中鉴定出类ERE序列，对于下述神经营养蛋白，p75^ngr和trkA二者都起信号传导分子的作用：神经生长因子(NGF)、脑神经衍生生长因子(BDNGF)、和神经营养营养蛋白。

已经证明BDNF和NGF促进了组织内胆碱能神经元的存活。据假定，如果神经营养蛋白和雌激素之间的相互作用对于基底前脑神经元(其在阿尔茨海默氏病中退化)的发展和存活很重要，则其中存在雌激素缺乏(例如绝经后)的临床病症可能促进这些神经元损失。

在切除卵巢的大鼠(如上所述制备)中进行下述实验以测定F-V和雌激素在影响不同脑区域中基因表达方面的相似性和/或不同性。将6周龄的大鼠每日皮下注射雌二醇苯甲酸酯(0.03mg/kg)、F-V或载体(对照物)。处理5周后，杀死动物，将它们的脑取出，通过显微解剖收集海马组织。将海马组织在液氮中迅速冷冻，-70℃贮存。用得自适当处理组和对照组的汇集组织制备总RNA，用3’低聚核苷酸引物(根据特异性mRNA(poly-A+)群体进行选择)进行逆转录。在由下述组分构成的鸡尾酒中进行聚合酶链式反应(PCR)：随机5’低聚核苷酸(长度为10个碱基对；总共150)、反应缓冲液、Taq聚合酶、和³²PdTCP。

扩增40轮后，将反应产物通过6％TBE-尿素凝胶进行大小分级，干燥并置于X-射线薄膜上。比较处理组之间的所得mRNA显示图案。

F-V与雌激素的联合应用

绝经期间和绝经后妇女通常要接受激素替代治疗(HBT)来对抗与循环内源性雄激素下降有关的不利后果，例如治疗热潮红。然而，HRT会使患有包括子宫癌和乳腺癌在内的一些癌症的危险性增加。可以联合使用F-V与HRT来抑制这些危险。

F-V与芳香酶抑制剂联合应用

按照定义，绝经后妇女的卵巢不能行使其功能。她们仅有的雌激素来源是通过外周组织(包括脂肪、肌肉和自身乳腺肿瘤)中存在的芳香酶将肾上腺雄激素转化成雌激素。因此，抑制芳香酶的药物(芳香酶抑制剂)能使绝经后妇女的循环雌激素耗尽。对于患有转移性乳腺癌的患者，通过抑制芳香酶来导致雌激素缺乏是重要的治疗选择。在用芳香酶抑制剂治疗期间，缺乏循环雌激素可能会导致消极、不利的副作用，例如对血清脂质水平有影响。可以使用F-V来抑制这些不利作用。

F-V与LHRH类似物的联合应用

连续地给予LHRH(黄体生成素释放激素)类似物能通过脱敏垂体，使垂体不再能刺激卵巢产生雄激素来抑制绝经前妇女产生雌性激素。临床效应是“药物卵巢切除术”，停止使用MRH类似物后，这种效应是可逆的。在用LHRH治疗期间，缺乏循环雌激素可能会导致消极、不利的副作用，例如血清脂质水平。可使用F-V来抑制这些不利作用。

提高乙酰胆碱水平

已知与没患阿尔茨海默氏病的人相比，阿尔茨海默氏病患者海马中的胆碱能神经元水平要显著下降。在这些患者中，这些胆碱能神经元的渐进性损失似乎是记忆和认识功能损失的反映。据认为这些神经元减少的一个原因是神经递质乙酰胆碱的功能损失或下降。

神经元内乙酰胆碱的水平基本上是由其生物合成和生物降解之间的平衡决定的。胆碱乙酰转移酶(ChAT)主要负责其合成，乙酰胆碱酯酶(AChE)主要负责其降解。

为了确定F-V对ChAT水平的影响，进行下述实验：进行完上述常规大鼠制备操作之后，每日对40只大鼠皮下注射或口服给予在含10％环糊精的赋形剂中的3mg/kg/日F-V、0.03或0.3mg/kg/日雌二醇苯甲酸酯、或赋形剂对照物。处理大鼠3天或10天。每一给药方案包含20只大鼠。在适当时间间隔，处死大鼠并解剖其脑。匀浆脑的特定部分并进行分析。处理海马和前皮层的匀浆物，通过放射标记分析乙酰胆碱的生物合成来测定ChAT的活性。Schoepp等人(J.NeuralTransmiss.，78：183-193，1989)已经描述了这一方法，该文献内容在此引入用作参考。

正如所预期的那样，与假操作对照大鼠相比，OVx大鼠中的ChAT水平下降了50％以上(p＜0.001)。

在本发明的另一实施方案中，将F-V与AChE抑制剂联合使用。使用AChE抑制剂能通过抑制AChE来阻断乙酰胆碱降解而提高乙酰胆碱水平。

良性前列腺增生(BPH)

对于雌激素作用与BPH和前列腺癌的治疗之间联系的背景技术，参见PCT申请WO 98/07247，国际公布日期：1998年10月15日。

在下述试验中，使用若干人前列腺癌细胞系评价F-V与结合雌激素受体结合的能力。

在包含50nM Tris·HCl pH7.4、1.5mM乙二胺四乙酸(EDTA)、0.4M KCl、10％甘油、0.5mM 2-ME、和10mM钼酸钠、以及还含有蛋白酶抑制剂胃蛋白酶抑制剂(1mg/mL)、亮抑蛋白酶肽(2mg/mL)、抑蛋白酶肽(5mg/mL)和苯甲磺酰氟(PMSF，0.1mM)的TEG培养基(TEGP)中制备LNCaP、DH-45和PC-3人前列腺癌细胞系的裂解产物。

离心细胞裂解产物，将沉淀物再重悬在冷的TEGP中(1mL TEGP/100mg沉淀物)，用450型Branson超声波发生器超声处理30秒钟(占空度(duty cycle)70％，排出量1.8)。在40℃以10000xG离心来沉淀裂解产物，之后移出上清液，随即使用或-70℃贮存。

竞争性结合分析：结合缓冲液是其中用50mM NaCl替代0.4MKCl、并且还加有1mg/mL卵清蛋白的TEG(TEGO)。将F-V在TEGO中稀释至20nM，用该稀释液制备3重系列稀释液。分析在园底聚丙烯微量板中以一式三微孔方式进行。每孔中加入35mL氘化17β-雌二醇(0.5nM，比活性60.1 Ci/mmol，DuPont-New England Nuclear，Boston，MA)和35ml冰冷竞争测试化合物(0.1nM-5mM)或TEGO，然后在振摇下4℃培养5分钟，加入70ml MCF-7细胞系裂解物。

4℃温育平板24小时，然后向每孔中加入70ml葡聚糖包被活性炭(DCC)，之后在4℃剧烈振摇8分钟。然后在4℃以1500xG离心10分钟。把每孔中的上清液收集到可弯曲的聚苯乙烯微量板中，用1450型Wallac Microbota计数器进行闪烁计数。放射活性用校正计数效率(35-40％)和本底后的每分钟衰变次数(DPM)表示。其它对照是总计数和总计数+DCC定义DCC可推断计数的下限。使用下述公式，以平均百分结合率(％结合)+/-标准偏差表示这些竞争性结合分析的结果：

％结合＝(DPM_{测试化合物}-DMP_{总计数+DCC})/(DPM_{无测试化合物}-DMP_{总计数+DCC})×100

预防乳腺癌

本发明还涉及对具有患从头(de novo)乳腺癌危险的个体给药。本文所用术语“从头”是表示，在第一次情况中没有正常乳腺细胞转化成或变质成癌细胞或恶性细胞。这种转化可能在相同细胞或子细胞中经过发展过程在多个阶段发生，或者可能发生于单一关键事件中。这种从头(do novo)过程与已经转化或恶化的细胞从初始肿瘤部位向新部位转移、移生、或扩展的过程不同。

发展成乳腺癌没有特别危险的人是可能发展从头(de novo)乳腺癌、没有任何证据或疑点表明该疾病超过正常危险、和从来没有被诊断出患有这种疾病的个体。发展成乳腺癌的最大危险因素是患有该疾病的个人病史、或该疾病的早期发生，甚至当没有任何证据表明存在该疾病时也是如此。另一危险因素是这种疾病的家族史。

通过给予致癌物N-亚硝基-N-甲基脲在大鼠中诱导乳腺癌是研究乳腺癌的广为接受的动物模型，并且已经发现其适于对化学预防剂的作用进行分析。

在两个独立的试验中，对55日龄雌性Sprague-Dawley大鼠静脉内(试验1)或腹膜内(试验2)给药50mg N-亚硝基-N-甲基脲/kg体重，1周后使这些大鼠自由进食混合有不同量的F-V、(Z)-2-[4-(1，2-二苯基-1-丁烯基)苯氧基]-N，N-二甲基乙胺碱(他莫昔芬碱)、或对照物的饲料。

在试验1中，60mg/kg饲料和20mg/kg饲料的进食剂量大约相当于3和1mg/kg测试动物体重的可比剂量。

在试验2中，20、6、2、和0.6mg/kg饲料的饮食剂量大约相当于1、0.3、0.1、和0.03mg/kg测试动物体重的可比剂量。

每周一次观察大鼠中的毒性迹象、并称重和触诊肿瘤形成。13周(试验1)或18周(试验2)后处死大鼠，在尸检时确认肿瘤并称重。

                        制剂

在说明书中，当术语“药物的”作为形客词使用时，其基本上是指对接受哺乳动物无害。“药物制剂”是指载体、稀释剂、赋形剂和活性成分必须与该制剂中的其它组分相容，并且对其接受者无害。

优选在给用前将F-V加以配制。制剂的选择应当由主治医师考虑涉及确定有效剂量相同的因素来决定。

在这类制剂中，活性成分总量占所述制剂重量的0.1％-99.9％。在所述制剂中，优选包含不超过2种活性成分。也就是说，优选将F-V与选自雌激素、孕激素、芳香酶抑制剂、LHRH类似物和AChE抑制剂的另一种活性成分一起配制。最优选的制剂是其中F-V是唯一活性成分的制剂。

本发明药物制剂是通过本领域已知方法、用众所周知且易获得的成分制得的。例如，可将F-V单独或者和雌激素、孕激素、芳香酶抑制剂、LHRH类似物或AChE抑制剂一起与常规赋形剂、稀释剂、或载体配制成片剂、胶囊剂、悬浮剂、溶液剂、注射剂、气雾剂和粉剂等剂型。

用于非胃肠道给药的本发明药物组合物包含无菌的水性或非水性溶液、分散液、悬浮液、或乳液，以及在使用前随即再配成无菌溶液或悬浮液的无菌粉末。适当的无菌水性或非水性载体、稀释剂、溶剂或赋形剂的实例包括水、生理盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚(乙二醇)等)、和它们的适当混合物、植物油(例如橄榄油)、可注射有机酯例如油酸乙酯。通过例如使用包衣材料如卵磷脂、对于分散剂和悬浮剂通过维持适当粒径、和通过使用表面活性剂来保持适当流动性。

非胃肠道给药组合物还含有辅料例如防腐剂、湿润剂、乳化剂、和分散剂，通过加入抗菌和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等来抑制微生物体的作用。还可以加入等渗剂例如蔗糖、氯化钠等。通过加入延缓吸收的物质例如硬脂酸铝和明胶可制得缓释注射剂。

在某些情况下，为了延长药物的作用，需要在皮下或肌内注射后减缓药物的吸收。这可通过使用低水溶性结晶材料的液体悬浮液或通过把药物溶解或悬浮在油性载体中来实现。当皮下或肌内注射含有低水溶性药物的悬浮剂时，药物的吸收速率取决于其溶解速率。

F-V的“贮库”性注射制剂可通过将药物在生物可降解聚合物例如聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、乳酸和乙醇酸的共聚物、聚(原酸酯)、和聚(酸酐)等本领域已知聚合物中形成微囊体来制得。根据药物与聚合物的比例和所用特定聚合物的特性，可控制药物的释放速率。

通过例如经由细菌截留滤器过滤、或通过在混合前将混合物组分预灭菌将注射剂在生产过程中或刚好给药前灭菌(例如在双室注射器包装的实例中)。

口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、粉剂、和颗粒剂。在这类固体剂型中，F-V与下述物质混合：至少一种惰性药物载体例如柠檬酸钠、或磷酸氢二钙；和/或(a)填充剂或增量剂例如淀粉、包括乳糖和葡萄糖在内的糖、甘露糖醇、和硅酸，(b)粘合剂例如羧甲基纤维素和其它纤维素衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(c)湿润剂例如甘油，(d)崩解剂例如琼脂、碳酸钙、碳酸氢钠、土豆淀粉或木薯淀粉、藻酸、硅酸盐和碳酸钠，(e)润湿剂例如甘油，(f)溶液阻滞剂例如石蜡，(8)吸收促进剂例如季铵化合物，(h)湿润剂例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯，(i)吸附剂例如高龄土和膨润土，和(j)润滑剂例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠、和它们的混合物。对于胶囊、片剂、和丸剂，这些剂量形式还可以含有缓冲剂。

相似类型的固体组合物还可包含用赋形剂例如乳糖以及高分子量聚乙二醇等在软或硬明胶胶囊中的填充物。

固体剂型例如片剂、糖锭剂、胶囊、丸剂和颗粒剂还可用包衣物或外壳物例如肠溶衣或其它制药领域众所周知的包衣物制备。包衣可含有不透明剂、或在尤其是部分消化道内释放活性组分的物质例如用于在胃中释放活性组分的酸溶性包衣、或用于在肠道内释放活性组分的碱溶性包衣。

还可以将活性组分微囊包封在缓释包衣中，其中微胶囊构成胶囊制剂药丸的一部分。

F-V的口服液体剂型包括溶液剂、乳剂、悬浮剂、糖浆剂和酏剂。除了活性组分以外，液体制剂还可包含本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它药用溶剂，增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(尤其是棉籽油、坚果油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油、和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、山梨醇脂肪酸酯、和它们的混合物。

除了惰性稀释剂以外，液体口服制剂还可包含助剂例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、以及甜味剂、矫味剂、和香料。

除了活性组分以外，液体悬浮制剂还可包含悬浮剂例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminum metahydroxide)、膨润土、琼脂、和黄芪胶、以及它们的混合物。

直肠或阴道内给药用组合物是这样制得的：将F-V与适当非刺激赋形剂例如椰子油、聚乙二醇、或在空温是固体但是在体温是液体并因此在直肠或阴道腔内熔化以释放活性组分的所有栓剂蜡混合。将化合物溶解在熔化的蜡中，塑成所需形状、使其变硬以形成最终的栓剂。

F-V还可以以脂质体形式给药。正如本领域已知的那样，脂质体通常是用磷脂或其它脂类制得的。脂质体制剂是通过将分散在水介质中的液体晶体进行单层或多层水合而形成的。可使用所有能形成脂质体的无毒、可药用、以及可代谢脂类物质。除了F-V以外，本发明脂质体剂型组合物还可含有稳定剂、赋形剂、防腐剂等。优选的脂类物质是磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，二者都是天然和合成的。

形成脂质体的方法在本领域内是已知的，例如见Prescott编辑的《细胞生物方法》(Methods in Cell Biology)，第XIV卷，AcademicPress，New York，N.Y.(1976)，p.33中描述的方法。

下述制剂实施例仅为说明性的，不得认作是对本发明范围的限制。

制剂1：如下所述制备分别含有约10和55mg F-V的片剂：

组分                  用量(mg/片)         用量(mg/片)

F-V                     11.3                56.5

无水乳糖                176.8               128.2

喷雾干燥乳糖            44.2                32.0

聚维酮                  11.0                13.0

聚山梨醇酯80            2.5                 2.6

交联聚维酮(内部)        6.25                6.24

交联聚维酮(外部)        6.25                6.5

硬脂酸镁                1.5                 1.7

微晶纤维素(外部)        0.0                 13.0

混合上述各组分，压制成片。

或者，如下所述制备分别含有2.5-1000mg F-V的片剂：

制剂2：片剂

组分                                     用量(mg/片)

F-V                                        25-100

淀粉                                       45

微晶纤维素                                 35

聚乙烯吡咯烷酮(20％水溶液)                 4

羧甲基纤维素钠                             4.5

硬脂酸镁                                   0.5

滑石                                       1

将F-V、淀粉和纤维素过45目美国筛析，并充分混合。将所得粉末与聚乙烯吡咯烷酮溶液混合，之后过14目美国筛筛析。将由此制得的颗粒在50-60℃下干燥，并通过18目美国筛筛析。然后向这种颗粒物中加入预先过60目美国筛筛析的羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石，混合后用制片机压制成片。

如下所述制备每5ml剂量分别含有0.1-1000mg药物的悬浮剂：

制剂3：悬浮剂

组分                                     用量(mg/5ml)

F-V                                      0.1-1000mg

羧甲基纤维素钠                           50mg

糖浆                                     1.25mg

苯甲酸溶液                               0.10mL

矫味剂                                   适量

着色剂                                   适量

纯化水                                   至5mL

将所述药物过45目美国筛筛析，并与羧甲基纤维素钠和糖浆混合以形成均匀糊状物。将苯甲酸溶液、矫味剂及着色剂用一些水稀释，并在搅拌下加入。然后加入足量水获得所需体积。

制剂4：静脉溶液

组分                                 用量

F-V                                  25mg

等渗盐水                             1,000mL

将上述组分制成的溶液以约1mL/分钟的速度静脉内给药于患者。

制剂5：包含盐酸半胱氨酸的片剂

通常如下所述制备重约250mg且大约含10mg或20mg F-V的内芯片剂。在高速剪切制粒机中掺合F-V、水溶性稀释剂(乳糖一水合物和无水乳糖)以及一部分崩解剂(交联聚维酮)。然后将此掺合物在高剪切制粒机中利用聚维酮和聚山梨醇酯80的水溶液湿法成团。将半胱氨酸盐酸盐也溶于制粒溶液内，并通过制粒溶液在湿法成团步骤过程中加入。为保持恒定的片剂添加重量，对应于半胱氨酸的加入量需要相应地减少乳糖(乳糖一水合物和无水乳糖)的量。在通过转动式叶轮磨湿法筛析步骤之后，用流化床干燥器干燥颗粒物。干燥颗粒用转动式叶轮磨研磨至适当粒度。向干燥颗粒中加入剩余组分(微晶纤维素、硬脂酸镁和剩余的交联聚维酮)，并进行掺合。然后用常规的转动式压片机将这种混合物压制成圆形片剂。表2中概述了每一批片剂的单位组成，包括各组分的用量(mg/片)和所用赋形剂的类型。正如从表中所看到的那样，C批和D批的片芯包括包覆的薄膜衣，这种薄膜衣是在安装在市售加工装置中的侧面排出(side-vented)包衣盘内利用水性分散液包衣。

                            表2

                    片剂单位组成(mg/片)

组分	A批	B批	C批	D批
					F-V(基本当量)	11.31(10)	11.31(10)	22.73(20)	22.73(20)
L-半胱氨酸HCl一水合物	0.10	0.50	0.50	0.75
					聚维酮	12.50	12.50	12.50	12.50
聚山梨醇酯80	1.25	1.25	1.25	1.25
					无水乳糖	148.67	148.35	139.22	139.02
乳糖一水合物	37.17	37.09	34.80	34.75
					交联聚维酮	12.50	12.50	12.50	12.50
微晶纤维素	25.00	25.00	25.00	25.00
					硬脂酸镁	1.50	1.50	1.50	1.50
着色混合物黄色	--	--	10.00	10.00

制剂6：包含蛋氨酸的片剂

通常如下所述制备重约250mg且大约含1mg F-V的内芯片剂。在高速剪切制粒机中掺合F-V、水溶性稀释剂(乳糖一水合物和无水乳糖)以及一部分崩解剂(交联聚维酮)。然后将此掺合物在高剪切制粒机中用聚维酮和聚山梨醇酯80的水溶液湿法成团。将蛋氨酸也溶于制粒溶液内，并通过制粒溶液在湿法成团步骤过程中加入。为保持恒定的片剂添加重量，对应于稳定剂的加入量需要相应地减少乳糖(乳糖一水合物和无水乳糖)的量。在通过转动式叶轮磨湿法筛析步骤之后，用流化床干燥器干燥颗粒物。干燥颗粒用转动式叶轮磨研磨至适当粒度。向干燥颗粒中加入剩余组分(微晶纤维素、硬脂酸镁和剩余的交联聚维酮)，并进行掺合。然后用常规的转动式压片机将这种混合物压制成圆形片剂。表3中概述了每一批片剂的单位组成，包括各组分的用量(mg/片)和所用赋形剂的类型。

                        表3：片剂单位组成(mg/片)

组分	E批	F批	组分	E批	F批
						Serm III HCl(基本当量)	1.12(1.0)	1.12(1.0)	乳糖一水合物	38.88	38.78
蛋氨酸	0.50	1.00	交联聚维酮	12.50	12.50
						聚维酮	12.50	12.50	微晶纤维素	25.00	25.00
聚山梨醇酯80	2.50	2.50	硬脂酸镁	1.50	1.50
						无水乳糖	155.5	155.1

                         剂量

本发明F-V的具体给药剂量取决于每一种情况下的具体因素。这些因素包括给药途径、受治疗者的以前病史、受治疗的病症/症状的严重程度、以及受治疗者的年龄与性别。

一般来讲，F-V的最低有效日剂量是大约1、5、10、15、或20mg。最大有效剂量通常是大约800、100、60、50、或40mg。最常见的剂量为15mg-60mg。准确剂量可依据医学领域受治疗者“剂量逐步确定”的标准原则确定；也就是说，先给予小剂量的本发明化合物，然后逐渐提高剂量直至观察到理想治疗效果。

对于上述联合疗法，虽然可能需要逐步确定受治疗者的给药剂量，但是除F-V之外的其它活性组分的典型剂量通常如下：乙炔基雌激素(0.01-0.03mg/天)、美雌醇(0.05-0.15mg/天)、共轭雌激素(例如Premarin^，Wyeth-Ayerst；0.3-2.5mg/天)、甲羟孕酮(2.5-10mg/天)、异炔诺酮(1.0-10.0mg/天)、炔诺酮(0.5-2.0mg/天)，氨鲁米特(250-1250mg/天，优选250mg/天，分四次给药)、anastrazole(1-5mg/天，优选1mg/天，每天给药1次)、来曲唑(2.5-10mg/天，优选2.5mg，每天给药1次)、福美司坦(250-1250mg/周，优选250mg/周，分两次给药)、依西美坦(25-100mg/天，优选25mg，每天给药一次)、性瑞林(3-15mg/3个月，优选3.6-7.2mg，每三个月给药1次)、和亮丙瑞林(3-15mg/月，优选3.75-7.5mg，每月给药1次)。

                        给药途径

F-V可通过多种途径给药，包括口服、直肠、透皮、皮下、静脉内、肌内和鼻内途径。各种雌激素和孕激素类药剂的给药方法与本领域已知的给药方法一致。F-V单独或与雌激素、孕激素、或AChE抑制剂的联合给药通常是以常规制剂形式完成。

本发明的药物组合物可通过口服、直肠、阴道内、非肠道、局部、经颊或舌下、或鼻内等途径给予人类及其它哺乳动物(例如狗、猫、马、猪等)。在本说明书中，术语“非肠道给药”是指包括静脉内、肌内、腹膜内、胸骨内、皮下、或关节内注射或输注在内的给药方式。

                    给药方式/时间

对于本发明的主要给药方法，可以连续给药F-V，每天给药1-3次，或者按需要市常给药以便将有效量的F-V给予受治疗者。当治疗子宫内膜异位时，周期疗法可能特别适用，或者在疾病的头痛发作过程中可急速使用这种周期疗法。对于再狭窄，在医疗手术如血管成形术之后，治疗可限制在短的(1-6个月)时间间隔内。

Claims (35)

1. 6-羟基-3-(4-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]苯氧基)-2-(4-甲氧基苯基)苯并[b]噻吩盐酸盐晶体(F-V)，当用铜辐射源进行X-射线衍射时，其在2θ范围内具有包含至少一个下述峰值的X-射线衍射图案：7.3±0.2，15.5±0.2，15.9±0.2，和17.6±0.2°。

2.根据权利要求1的晶体F-V，其中当用铜辐射源进行X-射线衍射时，所述X-射线衍射图案在2θ范围内进一步包括至少一个下述峰值：17.9±0.2，18.2±0.2，18.9±0.2，和21.5±0.2°。

3.药物制剂，其包含权利要求1的晶体化合物；一种或多种可药用的载体、稀释剂、或赋形剂；和任选的选自以下的稳定剂：蛋氨酸、乙酰半胱氨酸、半胱氨酸或半胱氨酸盐酸盐；以及任选的雌激素，任选的孕激素，任选的芳香酶抑制剂，任选的LHRH类似物和任选的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂。

4.权利要求3的制剂，其包括权利要求1的晶体化合物；一种或多种可药用的载体、稀释剂、或赋形剂；以及雌激素。

5.权利要求4的制剂，其中所述雌激素是轭合雌激素。

6.权利要求3的制剂，其包括权利要求1的晶体化合物；一种或多种可药用的载体、稀释剂、或赋形剂；以及孕激素。

7.权利要求6的制剂，其中所述孕激素选自异炔诺酮和炔诺酮。

8.权利要求3的制剂，其包括权利要求1的晶体化合物；一种或多种可药用的载体、稀释剂、或赋形剂；以及AChE抑制剂。

9.权利要求8的制剂，其中所述AChE抑制剂选自水杨酸毒扁豆碱、盐酸他克林、盐酸多奈皮茨。

10.权利要求3的制剂，其包括权利要求1的晶体化合物；一种或多种可药用的载体、稀释剂、或赋形剂；雌激素；以及孕激素。

11.抑制选自下述疾病的病理学症状的方法：子宫纤维变性、子宫内膜异位、主动脉平滑肌细胞增殖、再狭窄、乳腺癌、子宫癌、前列腺癌、良性前列腺增生、骨损失、骨质疏松、心血管病、高血脂、CNS障碍和阿尔茨海默氏病；该方法包括对需要的哺乳动物给药有效量的权利要求1的化合物。

12.权利要求11的方法，其中所述的病理学症状是乳腺癌。

13.权利要求12的方法，其中所述抑制方式是预防性的。

14.权利要求11的方法，其中所述病理学症状是卵巢癌。

15.权利要求11的方法，其中所述病理学症状是子宫内膜癌。

16.权利要求11的方法，其中所述病理学症状是骨质疏松症。

17.用于上调哺乳动物胆碱乙酰转移酶(ChAT)的方法，该方法包括对需要的哺乳动物给药有效量的权利要求1的化合物和任选的乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂。

18.制备权利要求1的化合物的方法，该方法包括用选自甲醇或含水甲醇、乙醇或异丙醇的结晶溶剂结晶6-羟基-3-(4-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]苯氧基)-2-(4-甲氧基苯基)苯并[b]噻吩盐酸盐；随后干燥所得固体至恒重。

19.权利要求18的方法，其中所述溶剂是含水甲醇。

20.根据权利要求1 9的方法，其中水与甲醇之比(v∶v)为20％-5％。

21.根据权利要求20的方法，其中所述比例为15％。

22.用于抑制选自下述疾病的病理学症状的权利要求1的化合物：子宫纤维变性、子宫内膜异位、主动脉平滑肌细胞增殖、再狭窄、乳腺癌、子宫癌、前列腺癌、良性前列腺增生、骨损失、骨质疏松、心血管病、高血脂、CNS障碍和阿尔茨海默氏病。

23.用于抑制乳腺癌的权利要求22的化合物。

24.权利要求23的方法，其中所述抑制方式是预防性的。

25.用于抑制卵巢癌的权利要求24的化合物。

26.用于抑制子宫内膜癌的权利要求22的化合物。

27.用于抑制骨质疏松症的权利要求22的化合物。

28.用于上调哺乳动物胆碱乙酰转移酶(ChAT)的权利要求1的化合物。

29.权利要求1的化合物在制备用于抑制选自下述疾病的病理学症状的药物中的应用：子宫纤维变性、子宫内膜异位、主动脉平滑肌细胞增殖、再狭窄、乳腺癌、子宫癌、前列腺癌、良性前列腺增生、骨损失、骨质疏松、心血管病、高血脂、CNS障碍和阿尔茨海默氏病。

30.权利要求29的用途，其中所述药物是用于抑制乳腺癌。

31.权利要求30的用途，其中所述的抑制方式是预防性的。

32.权利要求29的方法，其中所述药物是用于抑制卵巢癌。

33.权利要求29的用途，其中所述药物是用于抑制子宫内膜癌。

34.权利要求29的用途，其中所述药物是用于抑制骨质疏松症。

35.权利要求1的化合物在制备用于上调哺乳动物胆碱乙酰转移酶(ChAT)的药物中的应用。

Images