SK4902003A3 - A novel crystalline form of 6-hydroxy-3-(4-[2-(piperidin-1- yl)ethoxy]phenoxy)-2-(4-methoxyphenyl)benzo[b]thiophene hydrochloride - Google Patents

Description

. KRYŠTALICKÁ FORMA 6-HYDROXY-3-(4-[2-(PIPERIDÍN-1YL)ETOXY]FENOXY)-2-(4-METOXYFENYL)BENZO[B]TIOFÉN HYDROCHLORIDU

Doterajší stav techniky

6-hydroxy-3-(4-[2-(piperidín-1-yl)etoxy]fenoxy-2-(4metoxyfenyl)benzo[b]tiofén hydrochlorid (arzoxifén) bol prvý krát všeobecne popísaný v US patente č. 5 510 357 a podrobne bol popísaný v US patente č. 5 723 474 (‘474) a európskej patentovej prihláške 0729956. Arzoxifén je nesteroidný zmiešaný antagonista/agonista estrogénu užitočný okrem iného pri znižovaní sérového cholesterolu a na inhibíciu hyperlipidémie, osteoporózy, estrogén dependentných karcínómov vrátane rakoviny prsníka a maternice, endometriózy, porúch CNS vrátane Alzheimerovej choroby, proliferácie aortálnych buniek hladkého svalstva a restenózy.

Špecificky je arzoxifén užitočný i klinicky vyskúšaný na liečenie receptor pozitívnej metastickej rakoviny prsníka, liečbu receptor pozitívnych pacientov po vhodnej systémovej alebo lokálnej liečbe; na zníženie recidívy invazívnej a neinvazívnej rakoviny prsníka; na zníženie recidívy odpadu invazívnej rakoviny prsníka a duktálneho karcinómu in situ (DCIS). Arzoxifén je tiež užitočný v kombinácii s inhibítormi aromatázy, analogmi LHRH a inhibítormi acetylcholinesterázy (AChE).

Analýza vzorky arzoxifénu izolovaného postupmi popísanými vo vyššie uvedenom US patente ‘474 práškovou metódou róntgenovej difraktometrie (XRD), termogravimetrickou analýzou (TGA), protónovou nukleárnou magnetickou rezonanciou (¹H NMR) a metódami podľa Karla Fischera (KF) ukázali, že táto látka bola hydratovaná, zle kryštalizovala a obsahovala premenné množstvo organickej prchavej látky (etylacetátu) vo svojej mriežke.

Zle kryštalické a/alebo amorfné materiály sú obvykle menej žiaduce oproti vysoko kryštalickým materiálom na výrobu prípravkov. Amorfné zlúčeniny

II 1 ΛΊ /Γ»

C f r !- r r ŕ ľ.

sú chemicky a fyzikálne menej stále, pretože majú tendenciu adsorbovať významné množstvo vody. Adsorpcia vody amorfným materiálom napríklad v želatínových kapsliach môže spôsobiť zmrštenie alebo pokrútenie kapsule, pretože vlhkosť prechádza z kapsule do amorfného komponentu. Okrem toho amorfné zlúčeniny majú tendenciu sa vyzrážať z roztokov, v ktorých sú obsiahnuté. V prípade, že amorfná látka sa vyzráža z transportného roztoku, môže byť negatívne ovplyvnené rozpustenie a biologická dostupnosť liečiva.

Ďalej nie je všeobecne žiaduce pripravovať farmaceutické prípravky obsahujúce podstatné množstvo organického rozpúšťadla, ako je napríklad etylacetát, z dôvodu možnej toxicity rozpúšťadla voči pacientovi a z dôvodu zmien účinnosti farmaceutického prípravku v závislosti na rozpúšťadle. Z hľadiska výroby je tiež všeobecne menej žiaduce pripravovať nekryštalické látky, lebo taká príprava zahrňuje zhromažďovanie konečného produktu prostredníctvom filtrácie. Takéto filtrácie sa vykonávajú ťažšie, ak zhromažďovaný materiál nie je kryštalický. Okrem toho je tiež z hľadiska výroby všeobecne menej žiaduce pripravovať farmaceutické prípravky obsahujúce značné množstvo vody (hydrátov), pretože stupeň hydratácie obvykle bude nejakou funkciou relatívnej vlhkosti, pri ktorej je farmaceutický prípravok vyrábaný alebo skladovaný. Inak povedané variabilita účinku je obvykle oproti bezvodej forme u hydrátu problematickejšia.

I keď arzoxifén pripravený postupmi popísanými v patentovom spise ‘474 môže byť použitý ako farmaceutický prípravok, i tak by bolo veľmi žiaduce a výhodné nájsť kryštalickejšiu formu arzoxifénu, ktorá by neobsahovala vodu ani organické rozpúšťadlo vo vnútri svojej kryštalickej mriežky a ktorá by mohla byť reprodukovateľné a efektívne pripravená v komerčnom meradle.

?] 107/R r r r r n r e r· r

Podstata vynálezu

Tento vynález sa týka nesolvátovanej bezvodej kryštalickej formy 6hydroxy-3-(4-[2-(piperidín-1-yl)etoxy]fenoxy-2-(4-metoxyfenyl)benzo[b]tiofén hydrochloridu (F-V) majúcej róntgenový dífraktogram, ktorý obsahuje aspoň jeden z nasledujúcich píkov: 7,3 ± 0,2, 15,5 ± 0,2, 15,9 ± 0,2, 17,6 ± 0,2°, pri 20 za použitie medeného radiačného zdroja.

Ďalej sa tento vynález týka farmaceutického prípravku obsahujúceho FV; jeden alebo viac farmaceutických nosičov, riedidiel alebo vehiklov; a prípadne stabilizátor vybraný z metionínu, acetylcysteínu, cysteínu alebo cysteín hydrochloridu; a prípadne estrogén, prípadne progestín, prípadne inhibítor aromatázy, prípadne analog LHRH a pripadne inhibítor acetylcholinesterázy (AChE).

Ďalej sa tento vynález týka spôsobov použitia F-V pri inhibícii patologických stavov ako je: fibróza maternice, endometrióza, proliferácia aortálnych buniek hladkého svalstva, restenóza, rakovina prsníka, rakovina maternice, rakovina prostaty, benígna prostatická hyperplazia, úbytok kostí, osteoporóza, kardiovaskulárne ochorenia, hyperlipidémia, poruchy CNS a Alzheimerova choroba a použitie F-V na výrobu liečiva na inhibíciu vyššie uvedených patologických stavov.

Tento vynález sa ďalej týka spôsobu použitia F-V na zvyšovanie enzymatickej aktivity cholínacetyltransferázy (ChAT) a použitie F-V na výrobu liečiva zvyšujúceho enzymatickú aktivitu cholínacetyltransferázy. .

Tento vynález sa tiež týka spôsobu prípravy F-V, ktorý zahrňuje kryštalizáciu 6-hydroxy-3-(4-[2-(piperidín-1-yl)etoxy]fenoxy)-2-(4metoxyfenyl)benzo[b]tiofén hydrochloridu z kryštalizačného rozpúšťadla vybraného zo skupiny pozostávajúcej z: metanolu alebo vodného metanolu, etanolu alebo izopropanolu; a následné sušenie výslednej tuhej látky do konštantnej hmotnosti.

Stručný popis obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 je typický TGA záznam F-V.

Obrázok 2 je typicky DSC záznam F-V.

Obrázok 3 je typický róntgenový difraktogram formy V.

Detailný popis vynálezu

F-V môže byť pripravená sušením, buď pri izbovej teplote alebo pri mierne zvýšenej teplote, kryštalickej tuhej látky izolovanej pri izbovej teplote kryštalizáciou arzoxifénu (alebo akéhokoľvek jeho polymorfu/solvátu) z metanolu, etanolu, izopropanolu alebo vodných zmesí metanolu. Pri použití etanolu a 2-propanolu je výhodne obsah vody v týchto rozpúšťadlách menší ako 0,2 % (spektrofotometrická kvalita). Výhodne vodný prostriedok v metanole obsahuje menej ako 30 objemových percent vody. Výhodnejšie je F-V pripravená sušením, buď pri izbovej teplote alebo pri mierne zvýšenej teplote, tuhej látky izolovanej kryštalizáciou z vodného metanolu, pričom objem vody je medzi 20 % a 5 %. Najvýhodnejšie je F-V pripravená sušením tuhej látky v prostredí vákua pri teplote 50 až 70° C izolovanej kryštalizáciou arzoxifénu (alebo akéhokoľvek jeho polymorfu/solvátu) pri izbovej teplote z vodného metanolu, pričom obsah vody je 15 objemových percent.

Obvykle môže byť arzoxifén rozpustený v metanole (asi 1 g rozpustenej látky/20 ml rozpúšťadla) a prípadne i zahrievaný z dôvodu rozpustenia východiskovej látky arzoxifénu. Po rozpustení môže byť tento roztok prípadne koncentrovaný na asi 1 g rozpustenej látky/5 ml rozpúšťadla napríklad destiláciou, a potom je vzniknutý roztok ponechaný, aby sa pomaly ochladil na izbovú teplotu. Po ochladení na izbovú teplotu môže byť tento roztok ďalej ochladený prostredníctvom ľadového kúpeľa alebo chladničky na teplotu medzi 0 až 5° C. Po ponechaní dostatočného času na kryštalizáciu môžu byť kryštály F-V zachytené vákuovou filtráciou a premyté chladným metanolom (asi 0° C), potom sú kryštály sušené v prostredí vákua do konštantnej hmotnosti. Výhodne c n ' c rf r r r c ^r sú použité mierne zvýšené teploty sušenia (asi 50° C po dobu 12 až 48 hodín) za použitia premývania dusíkom. Z komerčného hľadiska syntézy F-V môže byť výhodné zaočkovať kryštalizáciou kryštály F-V.

Medzi vhodný východiskový materiál arzoxifénu pre vyššie popísanú kryštalizáciu patrí napríklad S-ll, F-l, F-lll (solvátované a nestechiometricky hydratované kryštalické formy arzoxifénu popísané v PCT patentových prihláškach PCT/USOO/16332 a PCTUSOO/16333, na ktoré sa týmto odkazuje), arzoxifén pripravený postupmi popísanými v patentovom spise ‘474, alebo akékoľvek jeho zmesi. Nie je dôležité, ktorá východisková forma arzoxifénu je použitá, pretože kryštalizáciou z bezvodého metanolu za použitia postupov popísaných v tomto vynálezy sú pripravené kryštály F-V.

Charakterizácia F-V

Na charakterizáciu F-V boli použité nasledujúce metódy: diferenčná skenovacia kalorimetria/termogravimetrická analýza (DSC/TGA), sorpcia/desorpcia vlhkosti a prášková róntgenová difraktometria. TGA je meranie termálne indukovanej straty hmotnosti látky v závislosti na teplote. Je najbežnejšie používaná na štúdium desolvatačných procesov a kvantitatívne stanovuje celkový obsah prchavých látok v tuhej látke. DSC je technikou, ktorá je často používaná na screening polymorfie zlúčenín, lebo teplota, pri ktorej dochádza ku fyzikálnym zmenám v látke, je obvykle charakteristickou vlastnosťou tejto látky. Vlhkostné sorpčné izotermy poskytujú hodnotenie stupňa hydroskopicity danej látky a charakterizujú nehydráty a hydráty. XRD je technika, ktorá zisťuje usporiadanie v kryštalickej látke.

Typický TGA záznam je zobrazený na obrázku č. 1. Termogravimetrická analýza F-V neukázala žiaden úbytok hmotnosti, čo zodpovedá izolácii nesolvatovanej kryštalickej formy. DSC analýza F-V ukázala ostrú taviacu endotermu pri teplote 174 až 175° C, ako je zobrazené na obrázku 2, ktorá je významne vyššia ako endoterma pozorovaná pre F-lll.

Vlhkostná sorpčná/desorpčná izoterma nameraná pre F-V ukázala nárast hmotnosti o 0,11 % v rozsahu od 0 do 95 % relatívnej vlhkosti, čo ukazuje na stálu bezvodú kryštálovú formu s malou tendenciou adsorbovať vodu alebo sa premenovať na hydratovanú formu arzoxifénu.

Rôntgenový difraktogram D-V sa vyznačuje ostrými píkmi a rovnou základnou líniou, čo je znak vysoko kryštalických látok. Uhlové polohy píkov pri 2Θ a zodpovedajúce údaje l/l_a pre všetky piky s intenzitami zhodnými alebo väčšími ako 10 % z najväčšieho piku sú uvedené v tabuľke 1 (stanovenie F-V). Všetky údaje v tabuľke 1 sú vyjadrené s presnosťou ± 0,2 %.

I keď mnoho z týchto intenzívnych odrazov má všeobecne podobné difrakčné uhly v porovnaní s S-ll, F-l a F-lll, každá z týchto foriem má rozdielne práškové difraktogramy, čo umožňuje jasné rozlíšenie medzi S-ll, F-l, F-lll a FV.

Priemerná teplota pri práškovej róntgenovej difraktometrii F-V neukázala žiadnu významnú zmenu v difraktograme až do teploty 125° C, čo sa zhoduje s DSC profilom a označuje stálou kryštálovou formou.

V kryštalografii je známe, že v akejkoľvek kryštálovej forme sa môžu líšiť relatívne intenzity difrakčných píkov z dôvodu výhodnej orientácie spôsobenej takými faktormi, ako je morfológia kryštálu a tvar. V prípade prítomnosti účinkov výhodnej orientácie dochádza ku zmene intenzít píkov, ale polohe charakteristických píkov polymorfu sú nezmenené. Viď napríklad The United States Pharmacopeia # 23. , National Formulary # 18, s, 1843-1844, 1995. Ďalej je tiež v kryštalografii dobre známe, že pre akúkoľvek kryštálovú formu sa môžu mierne odlišovať uhlové polohy píkov. Napríklad polohy píkov sa môžu posúvať z dôvodu rozdielnosti teploty, pri ktorej je vzorka analyzovaná, odchýlenie vzorky a prítomnosti alebo neprítomnosti vnútorného štandardu. V tomto prípade bude vzatá do úvahy variabilita polohy piku ± 0,2 pri 2Θ, aby potenciálna variácia nezabránila jednoznačnej identifikácii F-V.

in?/R

Dobre známou a uznávanou metódou skúmania kryštálových foriem v literatúre je „Finkova“ metóda. Finkova metóda používa 4 najintenzívnejšie čiary na počiatočné skúmanie a ďalej skúma ďalšie 4 najintenzívnejšie čiary. V súlade s Finkovou metódou, na základe intenzity píkov a rovnako i polohy pika môže byť F-V indentikovaná prítomnosťou píkov v 7,3 ± 0,2, 15,5 ± 0,2, 15,9 ± 0,2 a 17,6 ± 0,2° pri 2Θ za použitia medeného radiačného zdroja. Prítomnosť FV môže byť ďalej potvrdená píkmi v 17,9 ± 02, 18,2 ± 0,2, 18,9 ± 0,2 a 21,5 ± 0,2° pri 2Θ za použitia medeného radiačného zdroja.

Tabuľka 1

Uhol 2Θ	l/lo (%)	Uhol 2Θ	l/lo (%)	Uhol 2Θ	l/lo (%)
7,3	45	17,6	72	22,6	19
9,0	22	17,9	83	23,3	20
10,0	10	18,2	56	24,4	46
12,8	39	18,9	82	25,8	38
14,6	15	19,8	27	27,4	32
15,5	50	21,5	100	28,2	18
15,9	64

F-V má niekoľko výhod oproti predchádzajúcej forme arzoxifénu popísanej v ‘474 a oproti F-l a F-lll, ktoré boli popísané v PCT prihláškach, na ktoré sa týmto odkazuje. Vo vzťahu k arzoxifénu vyrobenom podľa postupov popísaných v ‘474 je F-V stabilnejšia pri izbovej teplote a preto je i dostupnejší pre farmaceutický vývoj, t.j. pre vývoj dávkovacieho prípravku. Ďalej na rozdiel od formy popísanej v ‘474 je F-V vysoko kryštalická. Kryštalické látky sú všeobecne menej hygroskopické a sú stabilnejšie (napríklad sú menej náchylné k chemickej degradácii, udržujú zhodnú účinnosť) oproti amorfným materiálom

Ί 1 1 ΛΊID a preto sú vhodnejšie na výrobu prípravku. Ďalej na rozdiel od formy arzoxifénu vyrobené podľa postupov popísaných v ‘474, ktorá obsahovala etylacetát a vodu vo svojej mriežke, F-V neobsahuje žiadnu z týchto látok.

Na rozdiel od S-ll, F-l a F-lll je F-V skutočne bezvodou formou

I . ' arzoxifénu, ktorá nemá žiadnu tendenciu adsorbovať vodu pri zmenách relatívnej vlhkosti. Ďalej kryštálová mriežka F-V je stála až k jej bodu topenia. FV má približne o 10 % vyššiu rozpustnosť vo vode oproti F-lll a je termodynamicky najstabilnejšou známou formou arzoxifénu.

Metódy na stanovenie charakteristických vlastností F-V

DSC analýza bola vykonáva na prístroji TA Instruments 2920 vybavenom automatickým vzorkovačom a chladiacim zariadením. Vzorka bola umiestnená v obrúbenej hliníkovej miske a bola analyzovaná oproti prázdnej referenčnej miske. Tok tepla bol meraný po ekvilibrácii pri teplote 30° C. Rýchlosť ohrevu bola 5° C za minútu až do teploty 300° C. Graf toku tepla proti teplote bol integrovaný z dôvodu zistených akýchkoľvek endotermických alebo exotermických javov.

TGA analýza bola vykonaná na prístroji TA Instruments 2950 vybavenom automatickým vzorkovačom. Vzorka bola vložená do vyváženej hliníkovej misky a teplota bola zvyšovaná od izbovej teploty až po teplotu 300° C pri rýchlosti 10° C za minútu. Graf hmotnostného percenta proti teplote bol integrovaný z dôvodu stanovenia percentuálneho úbytku.

Vlhkostné sorpčné izotermy boli vytvorené za použitia prietokového prístroja VTI SGA-100. Vzorky boli analyzované pri teplote 25° C a relatívnej vlhkosti v rozsahu do 0 do 95 % pre adsorpciu a v rozsahu od 95 do 5 % pre desorpciu pri krokoch 5 % relatívnej vlhkosti. Adsorpčné a desorpčné izotermy boli vytvorené ako graf zmeny hmotnostného percenta proti percentám relatívnej vlhkosti.

*>11 Λ~» /Γ» r - r r

C r ^r ft C r r

Rontgenové práškové difraktogramy boli namerané na róntgenovom digraktometri Siemens D5000 práškovou metódou a prístroj bol vybavený zdrojom CuKa (λ= 1,54056), ktorý bol prevádzkovaný pri 50 kV a 40 mA s kremíkovým polovodičovým detektorom dotovaným lítiom Kevex. Vzorky boli snímané od 4 do 35° pri 2Θ za 2,5 s s veľkosťou kroku 0,04°. Suché prášky boli plnené do držiakov vzoriek s vybraním a horným plnením a hladký povrch bol vytvorený skleneným podložením sklíčkom.

Rontgenové práškové difraktogramy s premennou teplotou boli namerané na róntgenovom difraktometri Siemens D500 práškovou metódou a prístroj bol vybavený zdrojom CuKa (λ = 1,54056), ktorý bol prevádzkovaný pri 50 kV a 40 mA so scintilačným detektorom a niklovým filtrom. Prášok bol plnený do držiaka s reguláciou teploty a horným plnením a následne bol upravený hladký povrch na meranie difrakcie. Vzorka bola snímaná od 2 do 35° pri 20 za 2,5 s s veľkosťou kroku 0,04° so začiatkom pri teplote 25° C po ekvilibrácii trvajúcej 5 minút. Následné záznamy boli namerané pri vzrastajúcej teplote s krokom 25° C až do maximálnej teploty 125° C.

Nasledujúce príklady ďalej obsahujú pracovné postupy na prípravu F-V. Príklady nemajú obmedzovať rozsah týchto postupov v žiadnom ohľade a nemali by takto byť chápané.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Kryštalizácia z metanolu bez koncentrácie

20,0 g vzorky arzoxifénu bolo zmiešaných s 500 ml bezvodého metanolu (čistoty pre HPLC) a varené pod spätným chladičom. Po rozpustení všetkých tuhých častíc vznikol homogénny svetlo žltý roztok. Tento roztok bol ochladený pod bod varu a bolo pridaných 5,00 g ďalšieho arzoxifénu. Roztok bol opäť

102/B e c r · r r f p I· ff varený pod spätným chladičom do rozpustenia všetkých tuhých častíc. Potom bol roztok za miešania ponechaný, aby sa voľne ochladil. Pri teplote 50° C bol roztok zaočkovaný niekoľkými miligramami skôr pripravenej soli F-V. Potom počas 1,25 hodiny bola kryštalická suspenzia ponechaná, aby sa ochladila z teploty 50° C na teplotu 30°. V tomto okamžiku bolo v suspenzii prítomné veľké množstvo bielej tuhej látky. Miešaná suspenzia bola ponorená do ľadového kúpeľa a miešaná po dobu ďalších 3 hodín. Suspenzia bola filtrovaná za použitia filtračného papiera Whatman #1 a biela tuhá látka bola premytá 50 ml vopred ochladeného metanolu na teplotu 0° C. Vlhký koláč bol sušený po dobu asi 48 hodín pri teplote 50° C v prostredí vákua s miernym premývaním dusíkom. Výťažok bol 15,94 g (63,8 %). HPLC sila 89,4 % (ako voľná báza), celkovej príbuznej látky (TRS) 0,28 %. Porovnaním hmotnosti produktu pred a po sušení ukázalo, že pôvodný vlhký koláč obsahoval 65 % rozpúšťadla.

Príklad 2

Kryštalizácia z metanolu s koncentráciou

25,00 g vzorky arzoxifénu bolo zmiešaných s 500 ml bezvodého metanolu (čistoty pre HPLC) a varené pod spätným chladičom. Po rozpustení všetkých tuhých častíc vznikol homogénny svetlo žltý roztok. Tento roztok bol zahustený destiláciou za atmosférického tlaku oddestilovaním 375 ml destilátu. V tomto okamžiku reakčná zmes bola čírym homogénnym žltým roztokom. Var pod spätným chladičom bol prerušený a roztok bol zaočkovaný niekoľkými miligramami skôr pripravenej F-V. Po zaočkovaní bola zmes ponechaná, aby sa ochladila na izbovú teplotu za pomalého miešania po dobu 1 hodiny. Počas tejto doby sa tvorilo veľké množstvo bielej zrazeniny. Suspenzia bola potom ponorená do ľadového kúpeľa a miešaná po dobu ďalších 3 hodín. Suspenzia bola filtrovaná za použitia filtračného papiera Whatman #1 a biela tuhá látka bola premytá 50 ml vopred ochladeného metanolu na teplotu 0° C. Vlhký koláč bol sušený po dobu asi 48 hodín pri teplote 50° C v prostredí vákua s miernym premývaním dusíkom. Výťažok bol 22,44 g (89,8 %). HPLC sila 91,3 % (ako

102/B voľná báza), TRS 0,26 %. Porovnaním hmotnosti produktu pred a po sušení ukázalo, že pôvodný vlhký koláč obsahoval 31,5 % rozpúšťadla.

Príklad 3

Rekryštalizácia z metanolu v rozsahu 30 galónov

3,08 kg vzorky arzoxifénu bolo zmiešaných so 60 I bezvodého metanolu (čistoty pre HPLC) a varené pod spätným chladičom. Po rozpustení všetkých tuhých častíc vznikol homogénny svetlo žltý roztok. Tento roztok bol zahustený destiláciou za atmosférického tlaku oddestilovaním 40 I destilátu. V tomto okamžiku reakčná zmes bola čírym homogénnym žltým roztokom. Reakčná zmes bola ochladená k prerušeniu varu pod spätným chladičom odvzdušňovací otvor bol otvorený pri teplote 40° C z dôvodu kontroly kryštalizácie. V reakčnej nádrži boli pozorované kryštály a ochladzovanie pokračovalo rýchlosťou 12° C z dôvodu kontroly kryštalizácie. V reakčnej nádrži bolí pozorované kryštály a ochladzovanie pokračovalo rýchlosťou 12° C za hodinu až do konečnej teploty 0° C. Kryštalizačná suspenzia bola miešaná cez noc pri teplote 0° C a potom bola filtrovaná cez jednodoskový kalolis. Z dôvodu odstránenia celého produktu z kryštalizačnej nádrže bol materský luh použitý ako vymývací roztok a potom bol filtrovaný na kalolise. Vlhký koláč bol potom premytý 11,3 I bezvodého metanolu vopred ochladeného na teplotu 0° C. Vlhký koláč v kalolise bol sušený za použitia vákua a cirkulácie vody o teplote 50° C v plášti kalolisu. Po dobu 24 hodín bolo aplikované i mierne premývanie dusíkom. Celková doba sušenia bola si 36 hodín. Výťažok bol 2,588 kg (86,27 %); HPLC sila 92,7 % (ako voľná báza), TRS 0,39 %.

a i 1 m/D r f.

r r f r < r r

Príklad 4

Kryštalizácia z etanolu

Veľmi čistý etanol (250 ml) a arzoxifén (10,0 g) boli zmiešané a varené pod spätným chladičom z dôvodu rozpustenia. Roztok bol ponechaný, aby sa ochladil na izbovú teplotu po dobu 3 hodín, počas ktorej sa vytvorila biela kryštalická zrazenina. Tuhé častice boli izolované filtráciou a sušené cez noc v prostredí vákua pri teplote 50° C s miernym premývaním dusíka. Výťažok 5,50 g, bod topenia bol 173° C (stanovené DSC). Nameraný práškový rôntgenový difraktogram tejto vzorky bol v podstate totožný s rontgenovým difraktogramom F-V zobrazeným na obrázku 3.

Príklad 5

Kryštalizácia z 2-propanolu

Bezvodý 2-propanol (250 ml) a azroxifén (10,0 g) boli zmiešané a varené pod spätným chladičom z dôvodu rozpustenia. Ohrev bol ukončený a roztok bol zaočkovaný niekoľkými miligramami F-V. Reakčná zmes bola ponechaná, aby sa ochladila na izbovú teplotu a bola miešaná cez noc, počas tejto doby sa vytvorila biela zrazenina. Tuhé častice boli izolované filtráciou s výťažkom 12,11 g vlhkého koláča. 4,01 g vzorky vlhkého koláča boli sušené cez noc pri teplote 60° C v prostredí vákua s miernym premývaním dusíkom. Výťažok 2,72 g, bol topenia 171,5° C (stanovené DSC). Nameraný práškový rôntgenový difraktogram tejto vzorky bol v podstate totožný s rontgenovým difraktogramom F-V zobrazeným na obrázku 3.

3l 102/B

Príklad 6

Príprava z voľnej báze azroxifénu

Voľná báze azroxifénu (5,07 g) bola prevedená do suspenzie v 65,0 ml metanolu. K reakčnej zmesi bolo pridaných 1,41 ml koncentrovaného roztoku kyseliny chlorovodíkovej a 10,0 ml vody. Z dôvodu rozpustenia bola reakčná zmes zahrievaná pri teplote 55° C po dobu 15 minút. Reakčná zmes bola ochladená na teplotu 30° C a zaočkovaná 50 mg F-V. Reakčná zmes bola ochladená na teplotu 10° C pri rýchlosti 1° Cl hod. a bola miešaná 8 hodín pri tejto teplote. Tuhé častice boli izolované filtráciou, premyté vopred ochladeným metanolom na teplotu 10° C a vákuovo sušené pri teplote 50° C cez noc za mierneho premývania dusíkom. Výťažok 4,42 g (87,7 %); účinnosť (HPLC) 99,7; TRS 0,32 %. Nameraný práškový rontgenový difraktogram tejto vzorky bol v podstate totožný s róntgenovým difraktogramom F-V zobrazeným na obrázku 3.

Definície použitých pojmov

Výraz „účinné množstvo“, ako je tu použitý označuje množstvo F-V, ktoré je schopné inhibovať zdravotné stavy alebo ich škodlivé účinky, ktoré sú popísané v tomto texte. V prípade, že F-V je podávaná spoločne s estrogénom, progestínom, inhibítorom aromatázy, analogom LHRH alebo inhibítorom AChE, potom výraz „účinné množstvo“ tiež znamená množstvo takého činidla schopného vytvoriť jeho zamýšľaný účinok.

Výrazy „inhibícia“ a „inhibovať zahrňujú ich všeobecne prijímaný význam, t.j. zabránenie, odrazenie, obmedzovanie, tíšenie, zlepšenie, spomalenie, zastavenie alebo obrátenie postupu alebo intenzity patologického stavu alebo ich následkov popísaných v tomto texte.

102/B r r ' r r r r r rf c f c c r f e *· e e f r p <

Výrazy „prevencia, „profylaxia, „profylaktický, a „pôsobiť prevenčne“ sú použité zameniteľné a označujú zníženie pravdepodobnosti, že u príjemcu F-V sa vyvinú akékoľvek patologické stavy alebo ich následky popísané v tomto texte.

Výrazy „estrogénová deprivácia a estrogénovo deprivovaný“ označujú stav, buď sa prirodzene vyskytujúci alebo klinicky vyvolaný, kedy žena nemôže produkovať dostatočné množstvo endogénnych estrogénnych hormónov na udržanie estrogén-dependentných funkcií ako je napríklad menštruácia, homeostáza kostnej hmoty, neurónová funkcia, kardiovaskulárny stav atď. Takéto situácie s nedostatkom estrogénu sú napríklad spôsobené menopauzou, chirurgickou alebo chemickou ovariektómiou vrátane ich funkčných ekvivalentov, ako je liečba inhibítorom aromatázy, agonistov alebo antagonistov GnRH, ICI 182780 a podobne. Medzi ochorenia spájané s nedostatkom estrogénu napríklad patrí úbytok kostí, osteoporóza, kardiovaskulárne ochorenia a hyperlipidémia.

V tomto texte použitý výraz „estrogén“ zahrňuje steroidné zlúčeniny majúce estrogénnu aktivitu, ako je napríklad 17p-estradiol, estrón, konjugovaný estrogén (Premarin®), konský estrogén 17p-etynylestradiol a podobne. Výhodnou zlúčeninou na báze estrogénu je Premarin® a noretylnodrel.

V tomto texte použitý výraz „progestin“ zahrňuje zlúčeniny majúce progestačnú aktivitu ako je napríklad progesteron, noretylnodrel, nongestrel, megestrolacetát, noretindron a podobne. Noretrindron je činidlom na báze progestínu.

V tomto texte použitý výraz „inhibítor aromatázy“ zahrňuje zlúčeniny schopné inhibovať aromatázu, ako sú napríklad komerčne dostupné inhibítory: aminoglutemid (CYTANDREN®), Anastrazol (ARIMIDEX®), Letrozol (FEMARA®), Formestan (LENATRON®), Exemestan (AROMASIN®) a podobne.

V tomto texte použitý výraz „analóg LHRH“ sa týka analogu spúšťacieho hormónu luteinizačného hormónu, ktorý inhibuje produkciou estrogénu u žien

I02/R

v období pred menopauzou, ako je napríklad goserlin (ZOLADEX®), leuprolid (LUPRON®) a podobne.

V tomto texte použitý výraz „inhibítor AChE zahrňuje zlúčeniny, ktoré inhibujú acetylcholinesterázu, ako je napríklad fyzostigiminsalicylát, takrinhydrochlorid, donepezilhydrochlorid a podobne.

Výraz „zvyšovať aktivitu ChAT“ sa týka zvyšovania enzymatickej aktivity ChAT, t.j. napomáhaniu konverzie cholínu na acetylcholín. Toto pôsobenie by zahrňovalo zvýšenie výťažku a/alebo rýchlosti reakcie ChAT a cholínu a/alebo zvýšeniu množstva ChAT prítomného v mieste pôsobenia. Toto zvýšenie množstva prítomného enzýmu môže byť spôsobené reguláciou génu alebo iným syntetickým krokom pri tvorbe enzýmu a/alebo znížením deaktivácie a metabolizmu enzýmu.

Vybrané testovacie postupy

Všeobecný postup prípravy pokusu s potkanmi: Potkanie samice rodu Sprague Dawley vo veku 75 dní (ak nie je uvedené inak) o hmotnosti v rozpätí 200 až 225 g boli získané z Charles River Laboratories (Portage, Ml). Zvieratám boli buď obojstranne odobraté vaječníky (OVX) alebo boli vystavené Shamovej chirurgickej procedúre v Charles River Laboratories; a potom boli dodané po jednom týždni. Po dodaní boli umiestnené v kovových závesných klietkach v skupinách po 3 až 4 zvieratách a mali prístup k potrave podľa ľubovoľnosti (obsah vápnika bol približne 0,5 %) a vodu mali na jeden týždeň. Teplota miestnosti bola udržovaná v teplotnom rozpätí 22,0 ± 1,7° C s minimálnou relatívnou vlhkosťou vo výške 40 %. Fotoperióda v miestnosti bola 12 hodín svetla a 12 hodín tmy.

Dávkovacia schéma pri odobratí tkaniva: Po jednom týždni aklimatizácie (2 týždne po OVX) bolo začaté s denným dávkovaním F-V. 17a-etynylestradiol alebo F-V boli podávané orálne, ak nie je uvedené inak, ako suspenzia v 1 % karboxymetylcelulóze alebo boli rozpustené v 20 % cyklodextrine. Zvieratám ii ino/n /· r r r r boli podávané dávky denne po dobu 4 dní. Po ukončení dávkovacieho režimu boli zvierané znecitlivené zmesou ketamín: Xylazín (2:1, obj. : obj.) a vzorka krvi bola odobratá srdcovou punkciou. Zvieratá boli potom usmrtené zadusením CO₂, maternica bola odobratá cez stredový rez a bola stanovená hmotnosť maternice v surovom stave. 17a-etynylestradiol bol získaný od firmy Sigma Chemical Co., St. Louis,, MO.

Kardiovaskulárne ochorenie/hyperlipidémia

Vzorky krvi podľa vyššie uvedeného postupu boli ponechané koagulovať pri izbovej teplote po dobu 2 hodín a sérum bolo získané následným odstredením po dobu 10 minút pri 3000 ot./min. Sérový cholesterol bol stanovený za použitia vysoko rozlišovacej skúšky na cholesterol od firmy Boeringer Mannheim Diagnostics. Cholesterol bol oxidovaný na cholest-4-en-3on a peroxid vodíka. Peroxid vodíka potom reaguje s fenolom a 4amínofenazonom za prítomnosti peroxidázy za vzniku p-chinonimínového farbiva, ktoré je stanovené spektrofotometricky pri 500 nm. Koncentrácia cholesterolu je potom vypočítaná z kalibračnej krivky. Celá skúška je automatizovaná za použitia prístroja Biomek Automated Woekstation.

Stanovenie peroxidázy z matrenicových eozinofilov

Maternice podľa vyššie uvedeného postupu boli uchované pri teplote 4° C až do doby enzymatickej analýzy. Potom boli maternice homogenizované v 50 objemoch 50 mM Tris pufre (pH = 8,0) obsahujúceho 0,005 % Triton X100. Po pridaní 0,01 % peroxidu vodíka a 10 mM o-fenyléndiamínu (konečnej koncentrácie) v Tris pufre bol zaznamenávaný nárast absorbacie po dobu 1 minúty pri 450 nm. Prítomnosť eozinofilov v maternici je indikácia estrogénnej aktivity zlúčeniny. Maximálna rýchlosť v 15 sekundovom intervale bola stanovená v počiatočnej lineárnej časti reakčnej krivky.

102/R rrtr r r

- t : r **

Testovacia procedúra inhibície úbytku kostí (osteoporózy)

Po vyššie popísanom všeobecnom postupe prípravy boli potkany kŕmené , l . ¹ denne po dobu 35 dní (6 potkanov v jednej skupine) a 36. deň boli usmrtené zadusením oxidom uhličitým. Doba 35 dní je dostatočná na prejavenie sa maximálneho zníženia hustoty kosti, čo bolo merané spôsobom popísaným v tomto texte. Po usmrtení boli maternice vyňaté, oddelené od vonkajšieho tkaniva a kvapalný obsah bol odstránený pred stanovením hmotnosti v surovom stave z dôvodu potvrdenia deficitu estrogénu spojovaného s úplným odňatím vaječníkov. Hmotnosť maternice bola bežne znížená na asi 75 % v reakcii na ovariektomii. Maternice boli potom vložené do 10 % neutrálneho pufrovaného formalínu na následnú histologickú analýzu

Pravé kosti stehenné boli vyrezané a analyzované v mieste distálnej metafýzy róntgenovou analýzou, výsledné snímky boli digitalizované a analyzované programom na obrazovú analýzu (NIH image). Proximálna strana holenných kostí z týchto zvierat bola tiež snímaná kvantitatívne počítačovou tomografiou. V súlade s vyššie uvedenými postupmi boli testovaným zvieratám podávané orálne F-V alebo etynyl estradiol (EE₂) v 20 % hydroxypropyl βcyklodextrínu. F-V je tiež užitočná v kombinácii s estrogénom alebo progestínom.

Proliferančná skúška MCF-7

MCF-7 bunky prsného adenokarcinómu (ATCC HTB 22) boli udržované v médiu MEM (minimálnom esenciálnom médiu, bez fenolovej červenej, Sigma, St. Louis, MO) doplnenom 10 % fetálnym hovädzím sérom (FBS) (V/V), Lglutamínom (2 mM), pyruvátom sodným (1mM), HEPES {(N-[2hydroxyetyl]piperazín-N’-[2-etansulfónová kyselina ] 10 mM), neesenciálnymi aminokyselinami a hovädzím inzulínom (1 μς/ιηΙ) (uchovávacie médium). Desať

102/B dní pred skúškou boli MCF-7 bunky prevedené do uchovávacieho média doplneného 10 % FBS z dôvodu vyčerpania interných zásob steroidov. MCF-7 bunky boli odobraté zo zásobných baniek za použitia uvoľňovacieho média (Ca²⁺/Mg²⁺, bez HBSS, bez fenolovej červenej) doplneného 10 mM HEPES a 2 mM EDTA). Bunky boli premyté 2 krát skúšobným médiom a ich koncentrácia bola upravená na 80 000 buniek/ml. Približne 100 μΙ (8000 buniek) bolo pridaných do mikrokultivačných jamiek s plochým dnom (Costar 3596) a boli inkubované pri teplote 37° C vo zvlhčovanom inkubátore s prídavkom 5 % CO₂ po dobu 48 hodín, aby sa bunky prichytili k povrchu jamky a rovnako došlo i k ekvilibrácii po presune. Postupné riedenie liečiv alebo DMSO (kontrola s riedidlom) bola pripravená v skúšobnom médiu a 50 μΙ bolo prenesených (3 x) k mikrokultúram a potom bolo pridaných 50 ml μΙ skúšobného média, čím bol konečný objem 200 μΙ. Po ďalších 48 hodinách pri teplote 37° C vo zvlhčovanom inkubátore s tymidínom značeným tritiom (1 pCí/jamka) po dobu 4 hodín. Kultivácie boli ukončené zmrazením na teplotu -70° C po dobu 24 hodín. Potom boli mikrokultúry rozmrazené a zozbierané za použitia prístroja Skatron Semiautomatic Celí Harvester. Vzorky boli merané detektorom s kvapalným scintilátorom za použitia čítača Wallac BetaPlace β.

DMBA-indukovaná inhibícia prsníkového nádoru

Estrogén-dependentné prsníkové nádory boli vyvolané u samíc potkanov rodu Sprague-Dawley, ktoré boli zakúpené od Harlan Industries, Indianapolis, Indiana. Asi vo veku 55 dní dostávali potkany jednorázovo 20 mg 7,12dimetylbenz[a]antracénu (DMBA). Asi 6 týždňov po podaní DMBA boli u zvierat v týždennom intervale vyšetrované pohmatom prsné žľazy z dôvodu výskytu nádoru. U každého zisteného nádoru bol meraný najdlhší a najkratší priemer pomocou metrického kalibra, merania boli zaznamenávané a toto zviera bolo vybraté pre ďalšie pokusy. Zvieratá boli do testovacích skupín zaraďované tak, aby boli rovnomerne rozdelené rôzne veľkosti nádorov v ošetrovaných i ti ino/n

P c * f· 19 e n » · r p · p p e t r f

P ' r o f e t • 9 t P

P r

C p kontrolných skupinách. Kontrolné skupiny a testovacie skupiny v každom pokuse obsahovali 5 až 9 zvierat.

F-V bola podávaná bucf prostredníctvom intraperitoneálnych injekcií v 2 % živici alebo orálne. Orálne podávané zlúčeniny boli buď rozpustené alebo suspendované v 0,2 ml kukuričného oleja. Každé ošetrenie, vrátane kontrolných ošetrení živicou a kukuričným olejom, bolo aplikované jedenkrát denne každému testovanému zvieraťu. Po začiatočnom meraní nádoru a výberu testovacích zvierať boli nádory merané každý týždeň spôsobom popísaným vyššie. Ošetrovanie a meranie zvierat pokračovalo 3 až 5 týždňov , až do doby, kedy boli stanovené konečné plochy nádorov. Pre každú zlúčeninu a kontrolné ošetrenie bola stanovená zmena priemernej plochy nádora.

Testovacie postupy na stanovenie fibrózy maternice

Test 1: Trom až dvadsiatim ženám majúcim fibrózu maternice bola podávaná F-V. Množstvo podávanej zlúčeniny bolo v rozpätí od 0,1 do 1000 mg/deň a doba podávania bola 3 mesiace. Ženy boli sledované počas doby podávania a potom až 3 mesiace po skončení podávania z dôvodu zistenia účinku liečby na fibrózu maternice.

Test 2: Bol použitý rovnaký postup ako v teste 1 s tou výnimkou, že doba podávania bola 6 mesiacov.

Test 3: Bol použitý rovnaký postup ako v teste 1 s tou výnimkou, že doba podávania bola 1 rok.

Test 4: Predĺžená stimulácia estrogénu bola použitá na vyvolanie leiomyomov u sexuálne dospelých samíc morčiat. Zvieratám bol dávkovaný estradiol 3 až 5-krát týždenne injekciou po dobu 2 až 4 mesiacov alebo dokiaľ nevznikli nádory. Liečivo skladajúce sa z F-V alebo vehikula bolo podávané denne po dobu 3 až 16 týždňov a potom boli zvieratá usmrtené, maternice boli vybraté a analyzované na zistenie regresie nádora.

II 107/R

Test 5: Tkanivo z ľudských leiomyomov bolo implantované do dutiny brušnej a/alebo do maternicovej svaloviny sexuálne dospelých, kastrovaných samíc holých myší. Exogénny estrogén bol dodávaný z dôvodu vyvolania rastu explantovaného tkaniva. V niektorých boli získané nádorové bunky kultivované in vitro pred implantáciou. Liečivo skladajúce sa z F-V alebo vehikula bolo aplikované denne žalúdočným výplachom po dobu 3 až 16 týždňov, potom boli implantáty odstránené a bol meraný ich rast alebo regresia. V dobe usmrtenia boli odobraté maternice na hodnotenie stavu orgánu.

Test 6: Tkanivo z ľudských deložných fibroidných nádorov bolo odobraté a uchované in vitro ako primárne netrasformované kultúry. Chirurgické vzorky boli pretlačené cez sterilnú sieť alebo sito alebo alternatívne boli separované od okolitého tkaniva za vzniku jednobunkovej suspenzie. Bunky boli uchovávané v médiách obsahujúcich 10 % sérum a antibiotikum. Boli stanovené rýchlosťou rastu za prítomnosti a neprítomnosti estrogénu. Bunky boli testované na ich schopnosť produkovať komplementárnu zložku C3 a na ich odozvu na rastové faktory alebo rastový hormón. In vitro kultúry boli testované na ich proliferačnú odozvu na ošetrenie progestíny, GnRH, F-V a vehikulom. Koncentrácia receptorov steroidných hormónov bola testovaná týždenne na určenie, či sú udržované in vitro dôležité charakteristické vlastnosti buniek. V teste bolo použité tkanivo od 5 až 25 pacientok.

Test 7: Schopnosť F-V inhibovať estrogénom stimulovanú proliferáciu ELT bunkových línií odvodených od leiomyomov bola nameraná v podstate tak, ako je popísané v článku Fuchs-Young, et al., „Inhibition of Estrogen-Stimulated Growth of Uterine Leimyomas by Selective Estrogén Receptor Modulators“, Mol. Car., 17(3): 151-159 (1996), na ktorý sa týmto odkazuje.

TI 1Í19/R r - C.

Postupy na stanovenie endometriózy

Test 1: Na testovanie bolo použitých 12 až 30 dospelých potkaních samíc línie CD. Boli rozdelené do 3 skupín s rovnakým počtom. U všetkých zvierat bol sledovaný estrálny cyklus. V deň proestra bol na každej samici vykonaný chirurgický zákrok. Samice v každej skupiny mali odstránený ľavý maternicový roh, ten bol rozrezaný na malé štvorce a tieto štvorce boli voľne prišité na rôzne miesta priliehajúce k mezenterickému krvnému toku. Okrem toho mali samice v skupine 2 odstránené vaječníky. Od nasledujúceho dňa po chirurgickom zákroku boli zvieratám v skupine 1 a 2 po dobu 14 dní aplikované intraperitoneálne injekcie s vodou, zatiaľ čo zvieratám v skupine 3 boli aplikované po rovnakú dobu intraperitoneálne injekcie obsahujúce 1,0 mg FV/kg telesnej hmotnosti. Po 14-dennom pôsobení bola každá samica usmrtená a boli odobraté endometriálne explantáty, nadľadviny, zvyšná maternica a vaječníky, kde to bolo možné a vzorky boli pripravené na histologické vyšetrenie. Vaječníky a nadľadviny boli zvážené.

Test 2: Na testovanie bolo použitých 12 až 30 dospelých potkaních samíc línie CD. Boli rozdelené do 2 skupín s rovnakým počtom. U všetkých zvierat bol sledovaný estrálny cyklus. V deň proestra bol na každej samici vykonaný chirurgický zákrok. Samice v každej skupine mali odstránený ľavý maternicový roh, ten bol rozrezaný na malé štvorce a tieto štvorce boli voľne prišité na rôzne miesta priliehajúce k mezentrickému krvnému toku. Asi 50 dní po chirurgickom zákroku boli zvieratám v skupiny 1 po dobu 21 dní aplikované intraperitoneálne injekcie s vodou, zatiaľ čo zvieratám v skupiny 2 boli aplikované po rovnakú dobu intraperitoneálne injekcie obsahujúce 1,0 mg FV/kg telesnej hmotnosti. Po 14-dňovom pôsobení bola každá samica usmrtená a boli odobraté a zvýšené endometriálne explantáty a nadľadviny. Tieto explantáty boli merané ako indikácie rastu. Boli sledované estrálne cykly.

102/B

Test 3: Autotransplantáty endometriálneho tkaniva boli použité na vyvolanie endometriózy u potkanov a/alebo u králikov. Samiciam zvierat v reprodukčnej zrelosti boli obojstranne chirurgicky odobraté vaječníky a estrogén bol dodávaný exogénne tak, aby bola zvieratám dodávaná špecifická a konštantná hladina hormónu. Autologné endometriálne tkanivo bolo implantované do peritonea 5 až 15 zvierat a estrogén bol dodávaný na vyvolanie rastu explantovaného tkaniva. Liečivo obsahujúce zlúčeninu podľa tohto vynálezu bolo aplikované denne gastrickým vymývaním po dobu 3 až 16 týždňov. Potom boli implantáty odobraté a merané z hľadiska rastu či regresie. V dobe usmrtenia bol odobratý celý roh maternice z dôvodu vyhodnotenia stavu endometria (maternicová sliznica).

Test 4: Tkanivo z ľudských endometriálnych lézií bolo implantované do peritonea sexuálne zrelých, kastrovaných samíc holých myší. Exogénny estrogén bol dodávaný na vyvolanie rastu explantovaného tkaniva. V niektorých prípadoch boli získané endometriálne bunky kultivované in vitro pred implantáciou. Liečivo obsahujúce F-V bolo aplikované denne gastrickým výplachom po dobu 3 až 16 týždňov. Potom boli implantáty odobraté a merané z hľadiska rastu či regresie. V dobe usmrtenia boli odobraté maternice z dôvodu hodnotenia stavu neporušenosti endometria.

Test 5: Tkanivo z ľudských endometriálnych lézii boli odobraté na uchované in vitro ako primárne netransformované kultúry. Chirurgické vzorky boli pretlačené cez sterilnú sieť alebo sito alebo alternatívne boli separované od okolitého tkaniva za vzniku jednobunkovej suspenzie. Bunky boli uchovávané v médiách obsahujúcich 10 % sérum a antibiotikum. Boli stanovené rýchlosti rastu za prítomnosti a neprítomnosti estrogénu. Bunky boli testované na ich schopnosť produkovať komplementárnu zložku C3 a na ich odozvu na rastové faktory alebo rastový hormón. In vitro kultúry boli testované na ich proliferačnú odozvu po šetrení progestíny, GnRH, F-V a vehikulom. Koncentrácie receptorov stroidných hormónov boli testované týždenne z dôvodu určenia, či boli udržované in vitro dôležité charakteristické vlastnosti buniek. V teste bolo použité tkanivo od 5 až 25 pacientok.

102/B

Poruchy CNS vrátane Alzheimerovej choroby

Estrogény, ako je 17p-estradiol, regulujú génovú transkripciu väzbou na receptory estrogénov (ER), ktoré sa vyskytujú v cytoplazme určitých bunkových populácii. Aktivácia ligandov je bezpodmienečne nutná na jadrový transport tohto komplexu, väzbou 13 párov báz konvenčnej sekvencie palindromickej DNA (estrogén-odozvový element, ERE) začína zhromažďovanie transkripčného aparátu, ktoré vrcholí aktiváciou vhodných cieľových génov. Bolo identifikovaných mnoho génov, ktoré sú regulované estrogénom. Medzi ne patria cytoskeletové proteíny, neuroprenášace biosyntetických a metabolických enzýmov a receptorov, a rovnako i ďalšie hormóny a neuropeptidy. ERE boli identifikované u mnohých estrogénresponzívnych génov vrátane vitellogenínu, c-fos, prolatínu a luteinizačného hormónu.

Boli identifikované sekvencie podobajúce sa ERE v p75^n9ľ a trkA, obidve slúžia ako signalizačné molekuly pre neurotrofíny: nervový rastový faktor (NGF), nervový rastový faktor odvodený z mozgu (BDNGF) a neurotrofín-3.

Bolo ukázané, že BDNF a rovnako i NGF napomáhajú prežívaniu cholinergických neurónov v kultúre. Predpokladá sa, že interakcie medzí neurotrofíny a estrogény boli dôležité pre vývoj a prežitie bazálnych neurónov predného mozgu (tie degradujú za vzniku Alzheimerovej choroby), potom klinické stavy, pri ktorých existuje nedostatok estrogénu (ako po menopauze), môžu prispievať ku strate týchto neurónov.

Nasledujúci pokus bol vykonávaný na potkanoch s odobranými vaječníkmi, ktoré boli pripravené vyššie popísaným spôsobom, na stanovenie podobností a/alebo rozdielov medzi F-V a estrogénom pri ovplyvňovaní génovej expresie v rôznych oblastiach mozgu. Potkanom vo veku 6 týždňov boli denne aplikované podkožné injekcie estradiol benzoatu (0,03 mg/kg), F-V alebo vehikula (kontrola). Po 5 týždňoch ošetrovania boli zvieratá usmrtené, ich mozgy boli odobraté a hippocampy boli zhromaždené mikrodisekciou.

102/B r r r

Hippocampy boli rýchle zmrazené v kvapalnom dusíku a boli skladované pri teplote - 70° C. Z odobratého tkaniva jednotlivých skupín (kontrolných, testovacích) bola pripravená celková RNA a bola reverzne prepísaná za použitia 3’oligonukleotidového priemeru, ktorý bol vybratý pre špecifické mRNA (poly-A+) populácie. Polymerázová reťazová reakcia bola vykonaná v zmesi skladajúcej sa z náhodných 5’oligonukleotidov (dĺžka 10 párov báz; celkovo 150), reakčného pufra, Tag polymerázy a ³²PdTCP.

Po 40 kolách amplifikácie boli reakčné produkty frakcionované podľa veľkosti na 6 % TBE-močovina gélu, boli vysušené a róntgenovo snímané na film. Výsledné zobrazené obrazce mRNA boli porovnané medzi jednotlivými ošetrovanými skupinami.

Použitie F-V spoločne s estrogénom

Ženy okolo menopauzy a po menopauze často podstupujú náhradnú hormonálnu liečbu (hormone replacement therapy HRT) z dôvodu potlačenia negatívnych dôsledkov spojených s poklesom cirkulujúceho endogénneho estrogénu, ako je napríklad liečba návalov tepla. Avšak HRT bola spájaná so zvýšenými rizikami určitých karcinómov vrátane rakoviny maternice a prsníka. F-V môže byť použitá spoločne s HRT na zamedzenie týchto rizík.

Použitie F-V spoločne s inhibítorom aromatázy

Vaječníky ženy po menopauze nie sú funkčné. Jediný zdroj estrogénu týchto žien pochádza z premeny andrenálnych androgénov na estrogény prostredníctvom enzýmu aromatázy, ktorá sa nachádza v periférnych tkanivách (vrátane tuku, svalu a samotného nádoru prsníka). Preto liečivá, ktoré inhibujú aromatázu (inhibítory aromatázy), znižujú hladinu cirkulujúceho estrogénu u žien po menopauze. Nedostatok estrogénu z dôvodu inhibície aromatázou bol dôležitým liečebným variantom u pacientov s metastatickou rakovinou prsníka. Počas liečby s inhibítorom aromatázy môže nedostatok cirkulujúceho estrogénu

102/B spôsobiť negatívne neočakávané vedľajšie účinky ako napríklad na hladiny sérových lipidov. F-V môže byť použitá na inhibíciu týchto negatívnych účinkov.

Použitie F-V spoločne s analogom LHRH

Nepretržitá expozícia analogom LHRH (uvoľňujúcemu hormónu luteínizačného hormónu) inhibuje produkciu estrogénu pred menopauzou znížením citlivosti podvesku mozgového, ktorý potom už nestimuluje vaječníky na tvorbu estrogénu. Klinickým účinkom je „medicínske odňatie vaječníkov“, tento účinok je reverzibilný na prerušenie príjmu analogu LHRH. Počas liečby s analogom LHRH môže nedostatok cirkulujúceho estrogénu spôsobiť negatívne neočakávané vedľajšie účinky, ako napríklad na hladiny sérových lipidov. F-V môže byť použitá na inhibíciu týchto negatívnych účinkov.

Zvýšenie hladín acetylcholínu

Je známe, že pacienti trpiaci Alzheimerovou chorobou majú zjavne nižšiu hladinu cholinergných neurónov v hippocampe oproti zdravým jedincom. Zdá sa, že postupná strata týchto cholinergných neurónov zodpovedá postupnej strate pamäti a rozpoznávacej funkcie u týchto pacientov. Predpokladá sa, že jediným dôvodom poklesu týchto neurónov je strata alebo zhoršenie funkcie neuroprenášača, acetylcholínu.

Hladina acetylcholínu v neuróne je v podstate určená polohou rovnováhy medzi jeho biosyntézou a biodegradáciou. Enzým cholinacetyltransferáza (ChAT) je najmä zodpovedný za jeho syntézu a acetylcholinesteráza (AchE) za jeho degradáciu.

Nasledujúci pokus bol vykonaný na stanovenie účinku F-V na hladinu ChAT. Po všeobecnom postupe prípravy potkanov popísanom vyššie bol 40 potkanom denne dávkovaná podkožnou injekciou alebo orálnou žalúdočnou sondou F-V o koncentrácii 3 mg/kg/deň vo vehikule obsahujúcom 10 % cyklodextrín, estradiol benzoat o koncentrácii 0,03 alebo 0,3 mg/kg/deň alebo vehikulom pre kontrolnú skupinu. Zvieratá boli ošetrované po dobu 3 alebo 10

102/B

C C i C f t ( t n

dní. V každej dávkovacej schéme bolo 20 zvierat. Vo vhodných časových intervaloch boli zvieratá usmrtené a ich mozgy boli vybraté. Určité časti mozgov boli homogenizované a testované. Boli spracované homogenáty z hippocampu a čelnej kôry a stanovenie ChAT aktivity bolo vykonané rádioaktívnou skúškou počas biosyntézy acetylcholínu. Tento postup bol uvedený v článku Schoepp et al., J. Neural Transmiss., 78: 183 - 193,1989, na ktorý sa týmto odkazuje.

Ako sa očakávalo, u OVX zvierat boli hladiny ChAT znížené o viac ako 50 % (p < 0,001) v porovnaní s kontrolnými skupinami.

V ďalšom uskutočnení tohto vynálezu bola F-V použitá v kombinácii s inhibítorom AChE. Použitie AChE inhibítora zvyšuje hladiny acetylcholínu zabránením jeho degradácie prostredníctvom inhibície AchE.

Benígna prostatická hyperplazia

Na získanie základných informácií o súvislosti medzi pôsobením estrogénu a liečbou BPH a rakovinou prostaty viď PCT prihláška č. WO 98/07274, dátum medzinárodnej publikácie: 15. októbra 1998.

V pokusoch popísaných nižšie bola hodnotená schopnosť F-V sa viazať na receptory estrogénu u niekoľkých ľudských prostatických rakovinných bunkových línií.

Lyzáty LNCaP, DU-45 a PC-3 ľudskej prostatickej rakovinnej bunkovej línie boli pripravené v TEG médiu obsahujúcom 50 nM TrisHCI, pH 7,4, 1,5 mM etyléndiamintetraoctovú kyselinu (EDTA), 0,4 M Kel, 10 % glycerol, 0,5 mM 2-Me, a 10 mM molybdenan sodný, ďalej obsahujúce inhibítory proteinázy: pepstatín (1 mg/ml), leupeptín (2 mg/ml), aprotinín (5 mg/ml) a fenylmetylsulfonyl fluorid (PMSF, 0,1 mM)(TEGP).

Bunkové lyzáty boli odstredené a pelety boli resuspendované v chladnom TEGP (1 ml TEGP/100 mg peliet) a sonikované po dobu 30 sekúnd (pracovný cyklus 70 %, výkon 1,8) na prístroji Branson Model 450 Sonifier. Lyzáty boli peletizované odstredením pri 10000 x G po dobu 15 minút pri

102/B r r r f r ^r

teplote 4° C, následne boli supernatanty odobraté a boli buď okamžite použité alebo boli skladované pri teplote -70° C.

Kompetitívna väzobná skúška: Väzobným pufrom bol TEG, v ktorom bol 0,4 M Kel nahradený 50 mM NaCI a ku ktorému bol ďalej pridaný vaječný albumín o koncentrácii 1 mg/ml (TEGO). F-V bola zriedená na 20 nM v TEGO, z takto pripraveného roztoku bol pripravené 3 násobné postupné riedenie. Testy boli vykonávané na polypropylénových mikrodoštičkách s rovným dnom v mikrojamkách v trojitom prevedení. Do každej jamky bolo odpipetovaných 35 ml 17p-estradiolu značeného tritiom (0,5 nM, špecifická aktivita 60,1 Ci/nmol, DuPont, New England Nuclear, Boston, MA) a 35 ml chladnej kompetitívnej testovacej zlúčeniny 0,1 nM - 5) alebo TEGO, a nasledujúcou inkubáciou po dobu 5 minút pri teplote 4° C za trepania, 70 ml MCF-7 lyzátu bunkovej línie.

Dosky boli inkubované po dobu 24 hodín pri 4° C, potom bolo do každej jamky pridaných 70 ml dextránu potiahnutého aktívnym uhlím (DCC) a doska bola dôkladne trepaná 8 minút pri 4° C. Dosky boli potom odstredené pri 1500 x G po dobu 10 minút a 4° C. Supernatant z každej jamky bol odobratý do pružnej polystyrénovej mikrodoštičky pre scintilačné detekovanie na čítači Wallac Micobeta Model 1450. Rádioaktivita je vyjadrená ako počet rozpadov za minútu (DPM) po korekcii na účinnosť detekcie (35-40 %) a pozadie. Ďalšími kontrolami bola celková početnosť pulzov a celková početnosť pulzov + DCC z dôvodu definovania spodného limitu DCC početnosti pulzov. Výsledky z týchto kompetitívnych väzobných testov boli vyjadrené ako priemerná percentuálna väzba (% väzby) +/- smerodatná odchýlka za použitia vzorca:

DPM testovacia zlúčenina DPM celková početnosť pulzov + DCC % väzby = x 100

DPMžiadna testovacia zlúčenina DPMcelková početnosť pulzov + DCC

102/B r f r r • ♦ · · • · o ♦ eíP e * c

r ŕ r r c ' ^r

Prevencia rakoviny prsníka

Tento vynález sa tiež týka podávania F-V príjemcovi, u ktorého existuje nebezpečenstvo vyvinutia rakoviny prsníka de novo. Výraz „de novo“ použitý v tomto texte znamená nedostatok transformácie alebo premeny normálnych prsných buniek na rakoviné alebo zhubné. K takejto transformácii môže dochádzať v štádiách rovnakých alebo dcériných buniek prostredníctvom vývojového procesu alebo k nej môže dochádzať v jednotlivom kľúčovom prípade. Tento de novo proces sa líši od metastázy, kolonizácie alebo šírenia už transformovaných alebo zhubných buniek z pôvodného miesta tumoru do nových miest.

Osoba, u ktorej nie je žiadne zvláštne riziko vyvinutia rakoviny prsníka je osobou, u ktorej sa môže vyvinúť rakovina prsníka de novo, nie je u nej dôkaz alebo podozrenie potenciálneho ochorenia nad normálne riziko a ktorá nikdy nemala diagnózu tohto ochorenia. Najväčší rizikový faktor prispievajúci k vývoju rakoviny prsníka je anamnéza osoby alebo skorší výskyt tejto choroby, i keď dochádza k dočasnému vymiznutiu prejavov choroby. Ďalším rizikovým faktorom je rodinná anamnéza tejto choroby.

Indukcie prsných nádorov u potkanov po podaní karciongénu N-nitrosoN-metylmočoviny je uznávaným živočíšnym modelom na štúdium rakoviny prsníka a je vhodný na analyzovanie účinkov chemopreventívnych činidiel.

V dvoch samostatných štúdiách bola podávaná potkaním samcom rodu Sprague-Dawley vo veku 55 dní intravenózna (štúdia 1) alebo intraperitoneálna (štúdia 2) dávka 50 mg N-nitroso-N-metylmočoviny na kg telesnej hmotnosti jeden týždeň pred kŕmením potravy po ľubovoľnosti, v ktorej bolo primiešané premenné množstvo F-V (Z)-2-[4-(1,2-difenyl-1-butenyl)fenoxy]-N,Ndimetyletanamínová báza (tamoxifén-báza) alebo kontrola.

102/B

V štúdii 1 diétnej dávky 60 mg/kg potravy a 20 mg/kg potravy zhruba zodpovedajú porovnateľným dávkam 3 a 1 mg/kg telesnej hmotnosti u testovaných zvierat.

V štúdii 2 diétne dávky 20, 6,2 a 0,6 mg/kg potravy zhruba zodpovedajú porovnateľným dávkam 1, 0,3, 0,1 a 0,03 mg/kg telesnej hmotnosti u testovaných zvierat.

Potkany boli pozorované z hľadiska toxicity, bola zisťovaná ich hmotnosť a jedenkrát týždenne boli vyšetrované pohmatom z dôvodu zistenia tvorby nádorov. Zvieratá boli usmrtené po 13 týždňoch (štúdia 1) alebo 18 týždňoch (štúdia 2), kedy boli pri pitve potvrdené i zvážené nádory.

Prípravky

Výraz „farmaceutický“ použitý v tomto texte ako prídavné meno znamená v podstate neškodný pre príjemcov (cicavce). Výrazom „farmaceutický prípravok“ je myslené, že nosič, riedidlo, vehikula a aktívna zložka (y) musia byť kompatibilné s ďalšími zložkami prípravku a nesmú škodiť jeho príjemcovi.

F-V je výhodne pripravovaná pred podávaním. Výber prípravku by mal vykonať ošetrujúci lekár berúci do úvahy rovnaké faktory, ktoré sú zahrnuté pri stanovení účinného množstva.

Celkové aktívne zložky v takýchto prípravkoch zahrňujú od 0,1 % do 99,9 % hmotnosti prípravku. Výhodne v tomto prípravku nie sú obsiahnuté viac ako 2 aktívne zložky. To znamená, že je výhodné vytvárať F-V s druhou aktívnou zložkou vybranou zo skupiny zahrňujúcej: estrogén, progestín, inhibítor aromatázy, analog LHRH a inhibítor AChE. Najvýhodnejšími prípravkami sú tie, kde F-V je jedinou aktívnou zložkou.

Farmaceutické prípravky podľa tohto vynálezu sú pripravené pracovnými postupmi známymi v obore za použitia dobre známych a ľahko dostupných zložiek. Napríklad F-V, buď samotný alebo v kombinácii s estrogénom, progestinom, inhibítorom aromatázy, analogom LHRH alebo inhibítorom AChE je pripravovaný s bežnými vehikulmi, riedidlami alebo nosičmi a je spracovaný

3l 102/B do tabliet, kapslí, suspenzií, roztokov, injektovateľných foriem, aerosolov, práškov a podobne.

Farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu na parenterálne podávanie obsahujú sterilné vodné alebo nevodné roztoky, disperzie,

I suspenzie alebo emulzie, a rovnako i sterilné prášky, ktoré sú rekónštituované bezprostredne pred použitím v sterilných roztokoch alebo suspenziách. Medzi príklady vhodných sterilných vodných a nevodných nosičov, riedidiel, rozpúšťadiel alebo vehikul patrí voda, fyziologický roztok, etanol, polyoly (ako je glycerol, propylénglykol, poly(etylénglykol) a podobne), a ich vhodné zmesi, rastlinné oleje (ako je olivový olej) a injektovateľné organické estery, ako je etyloleát. Vhodná tekutosť je udržovaná napríklad použitím poťahových materiálov, ako je licitin, udržovaním vhodnej veľkosti častíc v prípade disperzií a suspenzií a použitím povrchovo aktívnych látok.

Parenterálne prostriedky môžu tiež obsahovať adjuvans, ako sú stabilizačné látky, zmáčadlá, emulgátory a dispergačné prostriedky. Zamedzenie pôsobenia mikroorganizmov je zaistené použitím antibakteriálnych a antifungálnych látok, ako je napríklad paraben, chlórbutanol, fenolsorbová kyselina a podobne. Tiež môže byť vhodné použiť izotonické činidlá, ako sú cukry, chlorid sodný a podobne. Dlhotrvajúce absorpcie injektovateľných prípravkov môže byť spôsobené použitím činidiel, ktoré predlžujú absorpciu, ako je alumíniummonostearát a želatína.

V niektorých prípadoch z dôvodu predĺženia účinku liečiva je žiaduce spomaliť absorpciu liečiva po podkožnej a vnútrosvalovej injekcii. Toto môže byť dosiahnuté použitím kvapalnej suspenzie kryštalickej látky s nízkou rozpustnosťou vo vode alebo rozpustením alebo suspendovaním liečiva v olejovitom vehikule. V tomto prípade podkožnej alebo vnútrosvalovej suspenzie obsahujú formu liečiva s nízkou rozpustnosťou vo vode, rýchlosť absorpcie liečiva závisí na jeho rýchlosti rozpustenia.

Injektovateľné depotné prípravky F-V sú pripravované vytváraním mikrozapúzdrených matríc liečiva v biodegradovateľných polyméroch, ako je poly(mliečna kyselina), poly(kyselina glykolová), kopolyméry kyseliny mliečnej a

102/B

Γ ' ^{r C} , r· f Γ f ^{r r} -r , r C r ( ^r glykolovej, poly(ortoestery) a poly(anhydridy) a ďalej tie látky, ktoré sú popísané v odbore. V závislosti na pomere liečiva k polyméru a charakteristických vlastnostiach jednotlivých použitých polymérov môže byť riadená rýchlosť uvoľňovania liečiva.

Injektovateľné prípravky sú sterilizované napríklad filtráciou cez filtre zadržujúce baktérie alebo predsterilizáciou zložiek zmesi pred jej zmiešaním buď v dobe výroby alebo tesne pred podaním (ako v prípade injekčného balenia s dvormi komorami).

Medzi tuhé dávkovacie formy na orálne podávanie patria kapsle, tablety, pilulky, prášky a granule. V takých tuhých dávkovacích formách je F-V zmiešaná s aspoň jedným farmaceutických nosičom ako je citrát sodný, pyrofosforečnan vápenatý a/alebo (a) plnivá a nastavovadlá, ako sú škroby, cukry vrátane laktózy a glukózy, manitol a kyselina ortokremičitá, (b) spojivá, ako je karboxymetyl celulóza a ďalšie deriváty celulózy, algináty, želatína, poly(vinylpyrolidin), sacharóza a arabská guma, (c) zvlhčovadlá, ako je glycerol, (d) bobtnadlá, ako je agar, uhličitan vápenatý, hydrogénuhličitan sodný, zemiakový alebo tapiokový škrob, kyselina alginová, silikáty a uhličitan sodný, (e) zvlhčovadlá ako je glycerol, (f) retardačnými činidlami ako je parafín, (g) absorpčnými urýchlovačmi, ako sú kvartérne amóniové zlúčeniny, (h) zmáčadlami, ako je cetylalkohol a glycerolmonostearát, (i) adsorbenty, ako je kaolín a bentonitový íl, (j) mazivá, ako je mastok, stearát vápenatý, stearát horečnatý, tuhé poly(etylénglykoly), laurylsulfát sodný, a ich zmesi. V prípade kapslí, tabliet a piluliek môže dávkovacia forma tiež obsahovať pufrovacie činidlá.

Tuhé prostriedky podobného typu môžu tiež obsahovať výplň v mäkkých alebo tvrdých želatínových kapsliach za použitia vehiklu, ako je laktóza, a rovnako i vysokomolekulárne poly(etylénglykoly) a podobne.

Tuhé dávkovacie formy, ako sú tablety, dražé, kapsle, pilulky a granule môžu tiež byť pripravené s poťahmi alebo obalmi, ako sú enterosolventné poťahy alebo iné poťahy dobre známe vo farmaceutickom priemysle. Poťahy môžu obsahovať kalidlá alebo činidlá, ktoré uvoľňujú aktívnu zložku/zložky v

102/B určitej časti zažívacieho traktu, ako napríklad kyselinami rozpustné poťahy uvoľňujú aktívnu zložku (alebo zložky) v žalúdku alebo bázický rozpustné poťahy uvoľňujú aktívnu zložku (y) v črevnom trakte.

Aktívna zložka (alebo zložky) môžu tiež byť mikroopúzdrené v trvaleuvoľňujúcom poťahu s mikrokapslami, ktoré sú súčasťou pilulky kapsľového prípravku.

Medzi kvapalné dávkovacie formy F-V na orálne podávanie patria roztoky, emulzie, suspenzie, sirupy aelixíry. Okrem aktívnych zložiek môžu kvapalné prípravky obsahovať inertné riedidlá bežne používané v odbore, ako je voda alebo iné farmaceutické rozpúšťadlá, sol u bilizátory a emulgátory ako je etanol, 2-propanol, etylkarbonát, etylacetát, benzylalkohol, benzylbezoát, propylénglykol, 1,3-butylénglykol, dimetylformamid, oleje (najmä bavlníkový, podzemnicový, kukuričný, klíčkový, olivový, ricínový a sézamový), glycerol, tetrahydrofurfurylalkohol, poly(etylénglykoly), estery mastných kyselín so sorbitolom a ich zmesi.

Okrem inertných riedidiel môžu kvapalné orálne prípravky tiež obsahovať adjuvans, ako sú zvlhčovadlá, emulgátory, stabilizátory suspenzií, sladidlá, aromatizačné prostriedky a parfémovacie činidlá.

Kvapalné suspenzie okrem aktívnej zložky/zložiek môžu tiež obsahovať stabilizátory suspenzií, ako sú etoxylované izostearylalkoholy, polyoxyetylénsorbitol a sorbitanové estery, mikrokryštalická celulóza, alumíniummetahydroxid, benonitrový íl, agar, tragant a ich zmesi.

Prostriedky na rektálne alebo intravaginálne podávanie sa pripravujú zmiešaním F-V s vhodnými nedráždivými vehikuly, ako je kakaové mlieko, polyetylénglykol alebo akýkoľvek čipkový vosk, ktorý je tuhý pri izbovej teplote, ale kvapalný pri teplote tela a preto sa rozpustí v konečníku a pošve za uvoľnenia aktívnej zložky/zložiek. Zlúčeniny sú rozpustené v roztavenom vosku, vytvarované do požadovaného stavu a ponechané, aby stuhli do konečného čipkového prípravku.

102/B

F-V môže tiež byť podávaná vo forme lipozómov. Ako je známe v odbore, lipozómy sú všeobecne odvodené od fosfolipidov alebo iných tukových látok. Lipozómové prípravky sú tvorené mono- alebo multilamelárnymi hydratovanými kvapalnými kryštálmi, ktoré sú dispergované vo vodnom prostredí. Na tvorbu lipozómov môže byť použitý akýkoľvek farmaceutický metabolizovateľný lipid. Lipozomálne prostriedky podľa tohto vynálezu môžu obsahovať okrem F-V stabilizátory, vehikula, konzervačné látky a podobne. Výhodnými lipidmi sú fosfolipidy a fosfatidylcholíny (lecitíny) ako prírodné, tak i syntetické.

Spôsoby prípravy lipozómov sú dobre známe v odbore, ako je popísané napríklad v publikácii Prescott, Ed., Methods in Celí Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), str. 33 a násl.

Nasledujúce príklady prípravy sú len vysvetľujúce a nemajú obmedzovať rozsah tohto vynálezu.

102/B

Prípravok 1:

Tablety obsahujúce približne 10 a 50 mg (s) F-V môžu byť pripravené nasledovne:

Zložka	Množstvo (mg/tableta)	Množstvo (mg/tableta)
F-V	11,3	56,5
Bezvodá laktóza	176,8	128,2
Sprayovo sušená laktóza- špeciál	44,2	32,0
Povidin	11,0	13,0
Polysorbat 80	2,5	2,6
Krospovidin (vo vnútri)	6,25	6,24
Krospovidin (vonku)	6,25	6,5
Stearát horečnatý	1,5	1,7
Mikrokryštalická celulóza (vonku)	0,0	13,0

Zložky boli zmiešané a lisované za vzniku tabliet.

Alternatívne sa pripravujú tablety, každá obsahujúca 2,5 až 1000 mg Ρν, nasledovne:

102/B r r r r r e

Prípravok 2: Tablety

Zložka	Množstvo (mg/tableta)
F-V	25-1000
Škrob	45
Celulóza, mikrokryštalická	35
Polyvinylpyrolidon (ako 10 % roztok vo vode)	4
Nátrimkarboxymetylcelulóza	4,5
Stearát horečnatý	0,5
Mastenec	1

F-V, škrob a celulóza boli preosiate cez sito (U.S.) s veľkosťou ok č. 45 a dôkladne premiešané. Roztok polyvinylpyrolidonu sa zmieša s výslednými práškami, ktoré boli preosiate cez sito (U.S.) s veľkosťou ok č. 14. Takto vytvorené granule boli sušené pri teplote 50 až 60° C a boli preosiate cez sito (U.S.) s veľkosťou ok 18.

Nátriumkarboxymetylškrob, stearát horečnatý a mastenec boli preosiate cez sito (U.S.) s veľkosťou ok 60 a potom boli pridané ku granulám, z ktorých po zmiešaní a lisovaní na tabletovacom stroji vznikajú tablety.

Suspenzie, každá obsahujúca 0,1 až 1000 mg liečiva v 5 ml dávke, sa pripravujú nasledovne:

102/B * · · e c e e · · e e r e » _e « n c » e r ^r Γ ft f! r

O r r. Γ· r r n c c

Prípravok 3: Suspenzie

Zložka 1	Množstvo (mg/5 ml)
F-V	0,1-1000 mg
Nátrimkarboxymetylcelulóza	50 mg
Sirup	1,25 mg
Roztok kyseliny benzoovej	0,10 ml
Príchuť	q.v.
Farbivo	q.v.
Prečistená voda	5 ml

Liečivo bolo preosiate cez sito (U.S.) s veľkosťou ok č. 45 a zmiešané s nátriumkarboxymetylcelulózou a sirupom za vzniku jemnej pasty. Roztok kyseliny benzoovej, príchuť a farbivo boli zriedené trochou vody a za miešania boli pridané k sirupu. Potom bola pridaná voda na požadovaný objem.

Prípravok 4: Intravenózny roztok

Zložka	Množstvo1
F-V	25 mg
Fyziologický roztok	1000 ml

Roztok z vyššie uvedených zložiek sa intravenózne podáva pacientovi rýchlosťou asi 1 ml/min.

102/B

Prípravok 5: Tablety obsahujúce cystein hydrochlorid

Jadrá tabliet vážiace približne 250 mg a obsahujúce približne 10 mg alebo 20 mg F-V boli pripravené všeobecne nasledovne. F-V, riedidlá rozpustné vo vode (laktóza, monohydrát a bezvodá laktóza) a časť bobtnadla (krospovidon) boli zmiešané vo vysokostrihovom granulátore. Táto zmes bola potom zvlhčovaná v granulátore vhodným roztokom povidonu a polysorbatu 80. Cystein hydrochlorid bol tiež rozpustený v granulačnom roztoku a bol pridaný počas zvlhčovania prostredníctvom granulačného roztoku. Na udržanie konštantnej hmotnosti výplne tablety bolo znížené množstvo laktózy (laktóza monohydrát a bezvodá laktóza) zodpovedajúcim spôsobom k pridanému množstvu cystein hydrochloridu. Po úprave veľkosti za vlhka v rotačnom lopatkovom mlyne, boli granule sušené za použitia sušiarne s fluidnou vrstvou. Sušené granule sú upravené na vhodnú veľkosť v rotačnom lopatkovom mlyne. Zostávajúce zložky (mikrokryštalická celulóza, stearát horečnatý a zvyšok krospovídidonu boli pridané k sušeným granulám a zmes bola zamiešaná. Táto zmes bola následne lisovaná do tabliet Oválneho tvaru za použitia bežného rotačného tabletovacieho lisu. Zloženie tabliet pre každú z týchto šarží sú uvedené v tabuľke č. 2, ktorá obsahuje množstvo (mg/tabletu) a typ použitého vehikula v každom prípade. Ako je vidieť z tabuľky, na jadrá tabliet u šarží C a D bol aplikovaný filmový povlak, ktorý bol aplikovaný prostredníctvom vodnej disperzie v poťahovacej panvy s bočným vývodom napojeným na ventilátor.

102/B

Tabuľka 2:

Zloženie tabliet (mg/tableta)

Zložka	Šarža A	Šarža B	Šarža C	Šarža D
F-V (vzťahujúc na základ)	11,31 (10)	11,31 (10)	22,73 (20)	22,73 (20)
L-Cystein Hcl monohydrát	0,10	0,50	0,50	0,75
Povidon	12,50	12,50	12,50	12,50
Polysorbat 80	1,25	1,25	1,25	1,25
Bezvodá laktóza	148,67	148,35	139,22	139,22
Laktóza monohydrát	37,17	37,09	34,22	34
Krospovidon	12,50	12,50	12,50	75
Mikrokryštalická celulóza	25,00	25,00	25,00	12,5025,0 0
Stearát horečnatý	1,50	1,50	1,50	1,50
Farbivá - žltá	—	—	10,00	10

Prípravok 6: Tablety obsahujúce metionín

Jadrá tabliet vážiacich približne 250 mg a obsahujúce približne 1 mg F-V boli pripravené v podstate nasledovne. F-V, riedidlá rozpustné vo vode (laktóza monohydrát a bezvodá laktóza) a časť bobtnadla (krospovidon) boli miešané vo vysokostrihovom granulátore. Táto zmes bola potom zvlhčovaná v granulátore vodným roztokom povidonu a polysorbátu 80. Metionin bol tiež rozpustený v granulačnom roztoku a bol pridaný počas zvlhčovania prostredníctvom granulačného roztoku. Na udržanie konštantnej hmotnosti výplne tablety bolo

102/B r e r znížené množstvo laktózy (laktóza monohydrát a množstvo stabilizátora. Po kroku úpravy veľkosti za vlhka v rotačnom lopatkovom mlyne boli granule sušené za použitia sušiarne s fluidnou vrstvou. Sušené granule boli upravené na vhodnú veľkosť v rotačnom lopatkovom mlyne. Zostávajúce zložky (mikrokryštalická celulóza, stearát horečnatý a zvyšok krospovidonu boli pridané k sušeným granulám a zmes bola zamiešaná. Táto zmes bola následne lisovaná do tabliet oválneho tvaru za použitia bežného rotačného tabletovacieho lisu. Zloženie pre každú z týchto šarží sú uvedené v tabuľke č. 3, ktorá obsahuje množstvo (mg/tableta) a typ použitého vehikula v každom prípade.

Tabuľka 3:

Zloženie tabliet (mg/tableta)

Zložka	Šarža E	Šarža F	Zložka	Šarža E	Šarža F
Šerm III HCI (vzťahujúc na základ)	1,12 (1.0)	1,12 (1,0)	Laktóza monohydrát	38,88	38,78
Metionin	0,50	1,00	Krospovidon	12,50	12,50
Povidon	12,50	12,50	Mikrokryštalic ká celulóza	25,00	25,00
Polysorbát 80	2,50	2,50	Stearát horečnatý	1,50	1,50
Bezvodá laktóza	155,5	155,1

102/B

I c c c r • « * C r r

Dávkovanie

Špecifická dávka F-V podávaná podľa tohto vynálezu je určená určitými okolnosťami v závislosti na situácii. Medzi tieto okolnosti patrí spôsob podávania, skoršia anamnéza príjemcu, patologický stav alebo symptóm, ktorý je liečený, závažnosť daného stavu/liečeného príznaku a vek a pohlavie príjemcu.

Všeobecne účinná minimálna denná dávka F-V je asi 1, 5, 10, 15 alebo 20 mg. Obvyklá účinná maximálna dávka je asi 800, 100, 60, 50 alebo 40 mg. Najčastejšie sa táto dávka pohybuje v rozpätí od 15 mg do 60 mg. Presná dávka môže byť určená v súlade so štandardnou praxou určovania dávok v lekárstve u pacienta, t.j. zo začiatku podávania nízke dávky tejto zlúčeniny a postupné zvyšovanie dávky, dokiaľ nie je pozorovaný požadovaný terapeutický účinok.

I keď môže byť nevyhnutné uspôsobiť dávku u pacienta so zreteľom na kombináciu terapií diskutovaných vyššie, typické dávky aktívnych zložiek iných ako F-V sú nasledujúce: etynylestrogén (0,01 až 0,03 mg/deň), mestranol (0,05 až 0,15 mg/deň), konjugované estrogénne hormóny (napríklad Premarin®, Wyeth-Ayerst; 0,3 až 2,5 mg/deň, medroxyprogesteron (2,5 až 10 mg/deň), noretylnodrel (1,0 až 10,0 mg/deň), nonetindron (0,5 až 2,0 mg/deň), aminoglutemid (250 až 1250 mg/deň, výhodne 250 mg 4 krát denne), anastrazol (1 až 5 mg/deň, výhodne 1 mg, 1 krát denne), letrozol (2,5 až 10 mg/deň, výhodne 2,5 ml 1 krát denne), formestan (250 až 1250 mg/týždeň, výhodne 250 mg 2 krát týždenne), exemestan (25 až 100 mg/deň, výhodne 25 mg 1 krát denne), goserlin (3 až 15 mg/3 mesiace, výhodne 3,6 až 7,2 mg 1 krát za 3 mesiace) a leuprolid (3 až 15 mg/mesiac, výhodne 3,75 až 7,5 mg 1 krát za mesiac).

102/B

ter,Spôsob podávania

F-V môže byť podávaná mnohými spôsobmi vrátane orálneho, rektálneho, transdermálneho, subkutánneho, intravenózneho, intramuskulárneho a intranazálneho. Spôsob podávania každého činidla na báze estrogénu alebo progestínu zodpovedá tomu, čo je známe v odbore. F-V samotná alebo v kombinácii s estrogénom, progestínom alebo inhibítorom AChE bude podávaná vo vhodnom prípravku.

Farmaceutické prostriedky podľa tohto vynálezu môžu byť podávané ľuďom alebo iným cicavcom (ako sú napríklad psy, mačky, kone, prasatá a podobne) orálne, rektálne, intravaginálne, parenterálne, miestne, bukálne, sublingválne alebo nazálne. Výraz „parenterálne podávanie“ označuje v tomto texte spôsoby podávania, ako je intravenózne, intramuskulárne, intraperitoneálne, intrasternálne, subkutánne podávanie alebo intraartikulárne injekcie alebo infúzie.

Spôsob/dfžka podávania

Pre väčšinu spôsobov podľa tohto vynálezu je F-V podávaná kontinuálne jedenkrát až 3 krát denne alebo ako často je potreba podávať účinné množstvo F-V pacientovi. Cyklická terapia môže byť obzvlášť užitočná pri liečbe endometriózy alebo môže byť použitá akútne počas bolestivých záchvatov tohto ochorenia. V prípade restenózy môže byť terapia obmedzená na krátke intervaly v trvaní od 1 do 6 mesiacov následne po lekárskych procedúrach ako je angioplastika.

Claims (35)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Kryštalický 6-hydroxy-3-(4-[2-(piperidín-1-yl)etoxy]fenoxy)-2-(4metoxyfenyl)benzo[b]tiofén hydrochlorid (F-V) majúci rôntgenový difraktogram, ktorý obsahuje aspoň jeden z nasledujúcich píkov: 7,3 ± 0,2, 15,5 ± 0,2, 15,9 ± 0,2 a 17,6 ± 0,2° pri 2Θ za použitia medeného radiačného zdroja.
2. 2. Kryštalický F-V podľa nároku 1, kde uvedené rôntgenový difraktogram ďalej obsahuje aspoň jeden z nasledujúcich píkov: 17,9 ± 0,2, 18,2 ± 0,2, 18,9 ± 0,2 a 21,5 ± 0,2 pri 2Θ za použitia medeného radiačného zdroja.
3. 3. Farmaceutický prípravok obsahujúci kryštalickú zlúčeninu podľa nároku 1; jeden alebo viac farmaceutických nosičov, riedidiel alebo vehikúl; a prípadne stabilizátor vybraný z metioninu, acetylcysteinu, cysteinu alebo cystein hydrochloridu: a pripadne estrogén, prípadne progestin, prípadne inhibítor aromatázy, prípadne analog LHRH a prípadne inhibítor acetylcholinesterázy (AChE).
4. 4. Prípravok podľa nároku 3, ktorý obsahuje kryštalickú zlúčeninu podľa nároku 1; alebo viac farmaceutických nosičov, riedidiel alebo vehikúl; a estrogén.
5. 5. Prípravok podľa nároku 4, kde estrogénom je Premarin®.
6. 6. Prípravok podľa nároku 3, ktorý obsahuje kryštalickú zlúčeninu podľa nároku 1; jeden alebo viac farmaceutických nosičov, riedidiel alebo vehikúl; a progestin.

   31 102/B
7. 7. Prípravok podľa nároku 6, kde progestín je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z noretylnodrelu a noretindronu.
8. 8. Prípravok podľa nároku 3, ktorý obsahuje kryštalickú zlúčeninu podľa nároku 1; jeden alebo viac farmaceutických nosičov, riedidiel alebo vehikúl; a inhibítor AChE.
9. 9. Prípravok podľa nároku 8, kde inhibítor AChE je vybraný zo skupiny pozostávajúcej z fyzostigminsalicilátu, takrin hydrochloridu a donepezil hydrochloridu.
10. 10. Prípravok podľa nároku 3, ktorý obsahuje kryštalickú zlúčeninu podľa nároku 1; jeden alebo viac farmaceutických nosičov, riedidiel alebo vehikúl; estrogén a progestin.
11. 11. Spôsob inhibície patologického stavu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z: fibrózy maternice, endometriózy, proliferácie aortáinych buniek hladkého svalstva, restenózy, rakoviny prsníka, rakoviny maternice, rakoviny prostaty, benígnej prostatickej hyperplazie, úbytku kostí, osteoporózy, kardiovaskulárneho ochorenia, hyperlipidémie, porúch CNS a Alzheimerovej choroby, ktorý zahrňuje podávanie účinného množstva zlúčeniny podľa nároku 1 cicavcovi, ktorý to potrebuje.
12. 12. Spôsob podľa nároku 11, kde patologickým stavom je rakovina prsníka.
13. 13. Spôsob podľa nároku 12, kde spôsob inhibície je profylaktický.

    31 102/B * « e r r r
14. 14. Spôsob podľa nároku 11, kde patologickým stavom je rakovina vaječníka.
15. 15. Spôsob podľa nároku 11, kde patologickým stavom je rakovina maternicovej sliznice.
16. 16. Spôsob podľa nároku 11, kde patologickým stavom je osteoporóza.
17. 17. Spôsob zvyšovania enzymatickej aktivity cholinacetyltransferázy (ChAT) u cicavcov, ktorý zahrňuje podávanie účinného množstva zlúčeniny podľa nároku 1 a prípadne inhibítora acetylcholinesterázy (AChE) cicavcovi, ktorý to potrebuje.
18. 18. Spôsob prípravy zlúčeniny podľa nároku 1, ktorý zahrňuje kryštalizáciu 6hydroxy-3-(4-[2-(piperidín-1-yl)etoxy]fenoxy)-2-(4-metoxyfenyl)benzo[b]tiofén hydrochloridu z kryštalizačného rozpúšťadla vybraného zo skupiny pozostávajúcej z: metanolu alebo vodného metanolu, etanolu alebo izopropanolu; a následné sušenie výslednej tuhej látky do konštantnej hmotnosti.
19. 19. Spôsob podľa nároku 18, kde uvedeným rozpúšťadlom je vodný metanol.
20. 20. Spôsob podľa nároku 19, kde pomer vody k metanolu (obj. : obj.) je medzi 20 % a 5 %.

    31 102/B
21. 21. Spôsob podlá nároku 20, kde uvedený pomer je 15 %.
22. 22. Zlúčenina podľa nároku 1 na inhibíciu patologického stavu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z: fibrózy maternice, endometriózy, proliferácie aortálnych buniek hladkého svalstva, restenózy, rakoviny prsníka, rakoviny maternice, rakoviny prostaty, benígnej prostatickej hyperplazie, úbytku kostí, osteoporózy, kardiovaskulárneho ochorenia, hyperlipidémie, porúch CNS a Alzheimerovej choroby.
23. 23. Zlúčenina podľa nároku 22 na inhibíciu rakoviny prsníka.
24. 24. Zlúčenina podľa nároku 23, kde spôsob inhibície je profylaktický.
25. 25. Zlúčenina podľa nároku 24 na inhibíciu rakoviny vaječníkov.
26. 26. Zlúčenina podľa nároku 22 na inhibíciu rakoviny maternicovej sliznice.
27. 27. Zlúčenina podľa nároku 22 na inhibíciu osteoporózy.
28. 28. Zlúčenina podľa nároku 1 na zvyšovanie enzymatickej aktivity cholinacetyltransferázy (ChAT) u cicavcov.
29. 29. Použitie zlúčeniny podľa nároku 1 na výrobu liečiva na inhibíciu patologického stavu vybraného zo skupiny pozostávajúcej z: fibrózy maternice, endometriózy, proliferácie aortálnych buniek hladkého svalstva, restenózy, rakoviny prsníka, rakoviny maternice, rakoviny prostaty, benígnej prostatickej

    31 102/B r r

    r. r r r hyperplazie, úbytku kostí, osteoporózy, kardiovaskulárneho ochorenia, hyperlipidémie, porúch CNS a Alzheimerovej choroby.
30. 30. Použitie podľa nároku 29, kde uvedené liečivo je na inhibíciu rakoviny prsníka.
31. 31. Použitie podľa nároku 30, kde spôsob inhibície je profylaktický.
32. 32. Použitie podľa nároku 29, kde uvedené liečivo je na inhibíciu rakoviny vaječníkov.
33. 33. Použitie podľa nároku 29, kde uvedené liečivo je na inhibíciu rakoviny maternicovej sliznice.
34. 34. Použitie podľa nároku 29, kde uvedené liečivo je na inhibíciu osteoporózy.
35. 35. Použitie zlúčeniny podľa nároku 1 na výrobu liečiva na zvyšovanie enzymatickej aktivity cholínacetyltransferázy (ChAT) u cicavcov.