HRP20030296A2 - A NOVEL CRYSTALLINE FORM OF 6-HYDROXY-3-(4-[2-(PIPERIDIN-1-YL)ETHOXY]PHENOXY)-2-(4-METHOXYPHENYL)BENZO[b]THIOPHENE HYDROCHLORIDE - Google Patents

Description

Pozadina izuma

6-Hidroksi-3-(4-[2-(piperidin-1-il)etoksi]fenoksi)-2-(4-metoksifenil)benzo[b]tiofen hidroklorid (arzoksifen) generički je prvi put opisan u U. S. Patent No. 5,510,357 a specifično je naznačen u U. S. Patent No. 5,723,474 (474) i Europskoj Patentnoj Prijavi 0729956. Arzoksifen je nesteroidni miješani antagonist/agonist estrogena, koristan za, između ostalog, snižavanje razine kolesterola iz seruma i za inhibiciju hiperlipidemije, osteoporoze, estrogen ovisnih tumora koji uključuju rak dojke i maternice, endometrioze, poremećaja CNS-a koji uključuju Alzheimerovu bolest, proliferaciju glatkih mišićnih stanica aorte, i restenoze.

Posebice je arzoksifen koristan, te se klinički ispituje, za tretman receptor pozitivnog metastatskog raka dojke; kao dodatni tretman receptor pozitivnih pacijenata nakon prikladne sistemske ili lokalne terapije; smanjenje ponovne pojave invazivnog i neinvazivnog raka dojke; i smanjenje incidencije invazivnog raka dojke i duktalnog karcinoma in situ (DCIS). Arzoksifen je također koristan u kombinaciji sa terapijom zračenjem, inhibitorima aromataze, LHRH analozima, i inhibitorima acetilkolin esteraze (AChE).

Difrakcija rendgenskih zraka metodom praha (XRD), termogravimetrijska analiza (TGA), nuklearna magnetska rezonanca protona (1H NMR) i Karl Fischer (KF) analiza ukupnog arzoksifena izoliranog u skladu s procedurama koje su dane u '474, kasnije su pokazale da je rečeni materijal bio hidratiran, slabo kristalan, i da je sadržavao varijabilne količine lako hlapljive organske tvari (etil acetata) u svojoj kristalnoj rešetki.

Slabo kristalni i/ili amorfni materijali su tipično manje poželjni od visoko kristalnih materijala za pripravu lijekova. Amorfni spojevi su kemijski i fizički manje stabilni jer imaju tendenciju adsorbiranja značajnih količina vode. Adsorpcija vode od amorfnog materijala u želatinoznoj kapsuli, na primjer, može uzrokovati da se kapsula stisne ili raširi jer se vlaga prenosi sa kapsule na amorfnu komponentu. Uz to, amorfni spojevi imaju tendenciju da precipitiraju iz otopina koje ih sadrže. Ukoliko amorfna supstanca lijeka precipitira iz otopine za primjenu, to može negativno utjecati na otapanje i osobine brzine apsorpcije te djelovanja lijeka u tijelu.

Uz to, općenito nije poželjno da se formuliraju lijekovi koji sadrže značajne količine organskog otapala (npr., etil acetat) zbog moguće toksičnosti otapala za njegovog recipijenta i promjene u učinkovitosti lijeka zbog utjecaja otapala. Uz to, iz perspektive proizvodnje, također je općenito manje poželjno pripraviti ne kristalne materijale kada god rečena priprava uključuje sakupljanje konačnog produkta putem filtracije. Takove filtracije je često mnogo teže izvesti kada materijal koji se sakuplja nije kristalan. Štoviše, također je općenito manje poželjno, iz perspektive proizvodnje, formulirati lijekove koji sadrže značajne količine vode (hidrate) jer će stupanj hidratacije obično biti u određenom stupnju funkcija relativne vlažnosti pri kojoj je lijek proizveden i skladišten. Drugim riječima, variranje učinkovitosti je tipično problematičnije sa hidratom u odnosu na njegov bezvodni oblik.

Iako se arzoksifen pripravljen na način objašnjen u '474 može koristiti kao lijek, bilo bi vrlo poželjno i korisno pronaći više kristalan oblik arzoksifena koji ne sadrži vodu niti organsko otapalo unutar svoje kristalne rešetke, koji može biti reproducibilno i učinkovito proizveden na komercijalnom nivou.

Bit izuma

Predmetni izumi odnosi se na nesolvatirani bezvodni kristalni oblik 6-hidroksi-3-(4-[2-(piperidin-1-il)etoksi] fenoksi)-2-(4-metoksifenil)benzo[b]tiofen hidroklorida (F-V) koji ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka koji uključuje barem jedan od slijedećih maksimuma: 7,3 ± 0,2, 15,5 ± 0,2, 15,9 ± 0,2, i 17,6 ± 0,2º u 2θ kada je dobiven sa bakrom kao izvorom zračenja.

Uz to, predmetni izum se odnosi na farmaceutske pripravke koji uključuju F-V; jedan ili više farmaceutskih prijenosnika, nosača, razrjeđivača, ili ekscipijenata; i moguće tvar za stabilizaciju koja je odabrana između metionina, acetilcisteina, cisteina ili cistein hidroklorida; i moguće estrogena, moguće progestina, moguće inhibitora aromataze, moguće LHRH analoga i moguće inhibitora acetilkolin esteraze (AChE).

Uz to, predmetni izum se odnosi na metode za upotrebu F-V za inhibiciju patoloških stanja kao što su: fibroza maternice, endometrioza, proliferacija glatkih mišićnih stanica aorte, restenoza, rak dojke, rak maternice, rak prostate, benigna hiperplazija prostate, gubitak koštane mase, osteoporoza, kardiovaskularna bolest, hiperlipidemija, poremećaji središnjeg živčanog sustava (CNS), i Alzheimerova bolest i za upotrebu F-V za proizvodnju lijeka za inhibiciju istih.

Predmetni izum se nadalje odnosi na metode za upotrebu F-V za pojačavanje aktivnosti kolin acetiltransferaze (ChAT) i za korištenje F-V za proizvodnju lijeka za pojačavanje aktivnosti iste.

Predmetni izum se također odnosi na postupke za pripravu F-V koji uključuju kristalizaciju 6-hidroksi-3-(4-[2-(piperidin-1-il) etoksi]fenoksi)-2-(4-metoksifenil)benzo[b]tiofen hidroklorida iz otapala za kristalizaciju odabranog iz skupine koja se sastoji od: metanola ili vodenog metanola, etanola ili izopropanola; i nakon toga sušenja dobivene krutine do konstantne težine.

Kratki opis slika

Slika 1 predstavlja TGA signal F-V.

Slika 2 predstavlja DSC signal F-V.

Slika 3 predstavlja XRD obrazac za Forme V.

Detaljan opis izuma

F-V se može pripraviti sušenjem, ili pri temperaturi okoliša ili pri malo povišenoj temperaturi, gdje je kristalna krutina izolirana pri temperaturi okoliša kristalizacijom arzoksifena (ili njegovog bilo kojeg polimorfa/otopljene tvari) iz metanola, etanola ili izopropanola ili vodene smjese metanola. Kada se koristi etanol ili izopropanol, sadržaj vode u rečenim otapalima poželjno je manji od 0.2 % (A. C. S. spektrofotometrijski stupanj). Vodeni sastojak u metanolu poželjno sadrži manje od 30% vode po volumenu. Još poželjnije, F-V se pripravlja sušenjem, ili na temperaturi okoliša ili pri malo povišenoj temperaturi, gdje je kristalna krutina izolirana iz kristalizacije iz vodenog metanola gdje je volumen vode između 20% i 5%. Najpoželjnije je F-V pripravljen sušenjem pri 50 do 70ºC, u vakuumu, gdje je krutina izolirana na temperaturi okoliša kristalizacijom arzoksifena (ili bilo kojeg njegovog polimorfa/otopljene tvari) iz vodenog metanola pri čemu je sadržaj vode 15% volumena.

Tipično, arzoksifen može biti otopljen u metanolu (otprilike 1 g otopljene tvari/20 ml otapala) i moguće zagrijan kako bi se utjecalo na otapanje arzoksifen početnog materijala. Kada je postignuto otapanje, otopina se po mogućnosti može koncentrirati na oko 1 g otopljene tvari/5 ml otopine, na primjer, destilacijom, prije nego što se dopusti da se otopina polagano ohladi na sobnu temperaturu. Nakon što je na sobnoj temperaturi, otopina može po mogućnosti biti nadalje ohlađena (uz pomoć ledene kupke ili hladnjaka) do oko 0 i 5ºC.

Nakon što je prošlo dovoljno vremena kako bi se dogodila kristalizacija, F-V kristali mogu se prikupiti vakuumskom filtracijom i oprati s hladnim (oko 0ºC) metanolom prije sušenja do konstantne težine u vakuumu.

Lagano povišene temperature sušenja (otprilike 50ºC za vrijeme 12 do 48 sati) se u prisustvu dušikovog pročišćivača (nitrogen purge) preferiraju.

Za sintezu F-V na komercijalnoj razini, može biti korisno započeti kristalizaciju s F-V.

Prikladni arzoksifen početni materijal za gore opisanu kristalizaciju uključuje, no nije ograničen na, S-II, F-I, F-III (solvatirani i nestehiometrijski hidratirani kristalni oblici arzoksifena opisani u PCT Patentoj Prijavi PCT/US00/16332 i PCT/US00/16333, čija učenja su ovdje navedena po referenci), arzoksifen pripravljen po procedurama danima u '474, ili bilo koja njihova smjesa.

Nije bitno sa kojim oblikom arzoksifena se započne jer kristalizacija iz bezvodnog metanola, u skladu s ovdje opisanim postupcima, rezultira s F-V kristalima.

Karakterizacija F-V

Diferencijalna pretražna kalorimetrija/termogravimetrijska analiza, (DSC/TGA), sorpcija/desorpcija vlage, i difrakcija rendgenskih zraka (XRD) su metode koje su korištene kako bi se okarakterizirao F-V. TGA je mjera za termalno inducirani gubitak težine materijala kao funkcija temperature. Ova metoda se najčešće koristi kako bi se proučavali procesi desolvatacije i kvantitativno odredio ukupni isparivi sadržaj krutine. DSC je tehnika koja se često koristi kako bi se pronašli polimorfizmi u spojevima jer su temperature pri kojima dolazi do fizičke promjene u materijalu obično karakteristične za pojedini materijal. Izoterme sorpcije vlage daju procjenu stupnja hidroskopnosti povezane s danim materijalom i karakterizaciju nehidrate i hidrata. Na kraju, XRD je tehnika koja detektira red dugog dosega u kristalnom materijalu.

Reprezentativni TGA signal F-V dan je u Slici 1.

Termogravimetrijska analiza F-V nije pokazala gubitak težine što ukazuje da je izoliran nesolvatirani kristalni oblik. DSC analiza F-V pokazala je oštru endotermu taljenja pri 174 - 175°C kako je prikazano na Slici 2, koja je značajno viša nego ona koja je opažena za F-III.

Izoterma sorpcije/desorpcije vlage dobivena za F-V pokazala je povećanje težine od 0.11% u rasponu od 0 - 95% RH što ukazuje na stabilni bezvodni kristalni oblik sa malom tendencijom adsorbiranja vode ili prevođenja u hidratirani oblik arzoksifena.

XRD obrazac F-V daje oštre maksimume i ravnu osnovnu liniju, što je indikativno za visoko kristalne materijale. Kutni signalni položaji u 2θ i pripadajući I/Io podaci za sve maksimume sa intenzitetima jednakim ili većima od 10% najvećeg maksimuma za F-V dani su u Tabeli 1. Svi podaci u Tabeli 1 izraženi su sa točnošću od ± 0.2%.

Iako su mnoge od intenzivnih refleksija općenito pri sličnim difrakcijskim kutovima kao one koji su dane za S-II, F-I i F-III, svaki oblik daje različiti obrazac signala za prah, što omogućuje jasno razlikovanje između S-II, F-I, F-III i F-V. Rendgenska difrakcijska analiza praha F-V pri varijabilnoj temperaturi nije pokazala značajnu promjenu u difrakcijskom signalu do 125°C što je u skladu sa DSC profilom koji ukazuje na stabilni kristalni oblik.

U kristalografskoj struci dobro je poznato da, za bilo koji kristalni oblik, relativni intenziteti difrakcijskih maksimuma mogu varirati zbog preferirane orijentacije koja je posljedica čimbenika kao što su morfologija kristala i građa. Ukoliko postoje efekti preferirane orijentacije, intenziteti maksimuma su promijenjeni, no karakteristični položaji maksimuma polimorfa nisu promijenjeni. Vidi, na primjer, The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, stranice 1843-1844, 1995. Nadalje, također je dobro poznato u kristalografskoj struci da, za svaki dani kristalni oblik položaji kutnog maksimuma mogu malo varirati. Na primjer, položaji maksimuma se mogu pomaknuti zbog razlika u temperaturi pri kojoj je uzorak analiziran, pomaku uzorka, ili prisutnosti ili odsutnosti unutrašnjeg standarda. U predmetnom slučaju, varijabilnost položaja maksimuma od ± 0.2 u 2θ uzeti će u obzir ove moguće varijacije bez da se omete nesumnjiva identifikacija F-V.

Dobro poznata i prihvaćena metoda za pretraživanje kristalnih oblika u literaturi je "Fink" metoda. Fink metoda koristi četiri najintenzivnije linije za ishodišno pretraživanje nakon čega slijedi pretraživanje po slijedeće četiri najintenzivnije linije. U skladu s Fink metodom, utemeljeno na intenzitetima maksimuma kao i položaju maksimuma, F-V se može identificirati po prisustvu maksimuma na 7.3 ± 0.2, 15.5 ± 0.2, 15.9 ± 0.2, i 17.6 ± 0.2° u 2θ; kada je rezultat dobiven iz bakrenog izvora zračenja. Prisustvo F-V može biti nadalje potvrđeno s maksimumima na 17.9 ± 0.2, 18.2 ± 0.2, 18.9 ± 0.2, i 21.5 ± 0.2° in 2θ; kada je rezultat dobiven iz bakrenog izvora zračenja.

Tabela 1

[image]

F-V ima nekoliko prednosti u odnosu na prije opisani oblik arzoksifena opisan u '474 i na F-I i F-III koji su opisani u prije, ovdje po referenci uključenim, PCT prijavama. U odnosu na arzoksifen proizveden u skladu s postupcima danima u '474, F-V je stabilniji pri temperaturi okoliša te je, stoga, više pristupačan u farmaceutskom razvoju, na primjer, razvoju formulacija za primjenu. Uz to, za razliku od oblika opisanog u '474, F-V je visoko kristalan. Kristalni materijali su općenito manje higroskopni te stabilniji (to jest, manje podložni kemijskoj degradaciji, zadržavaju konzistentnu potentnost) nego što su amorfni materijali te su, stoga, poželjniji za pripravu formulacija. Nadalje, za razliku od oblika arzoksifena pripravljenog u skladu s postupcima danima u '474, koji su sadržavali etil acetat i vodu u svojoj kristalnoj rešetki, F-V ne sadrži niti jedno niti drugo.

Za razliku od S-II, F-I i F-III, F-V je uistinu bezvodni oblik arzoksifena koji ne pokazuje sklonost tome da adsorbira vodu kod promjene relativne vlažnosti. Nadalje, kristalna rešetka F-V stabilna je do svoje temperature taljenja. Štoviše, F-V ima otprilike 10% višu topivost u vodi u odnosu na F-III te je termodinamički najstabilniji poznati oblik arzoksifena.

Metode karakterizacije

DSC analiza je izvedena pomoću uređaja TA Instruments 2920 opremljenog s automatskim uzimanjem uzoraka i prethodno ohlađenim uređajem za hlađenje. Uzorak je zatvoren u kompresivnu aluminijsku posudu i analiziran u odnosu na praznu referentnu posudu. Protok topline je mjeren nakon ekvilibracije pri 30°C. Stopa zagrijavanja bila je 5°C po minuti do 300°C. Graf protoka topline u odnosu na temperaturu integriran je kako bi se identificirali bilo koji endotermni ili egzotermni događaji.

TGA analiza je izvedena pomoću uređaja TA Instruments 2950 opremljenog s automatskim uzimanjem uzoraka. Uzorak je stavljen u tariranu alumnijsku posudu i temperatura je povišena od temperature okoliša do 300°C brzinom od 10°C po minuti. Graf postotka težine u odnosu na temperaturu integriran je kako bi se odredio postotak gubitka.

Izoterme sorpcije vlage dobivene su koristeći VTI SGA-100 protočni instrument. Uzorci su analizirani pri 25°C od 0 - 95% relativne vlažnosti (RH) za adsorpciju i od 95 - 5% RH za desorpciju u koracima od 5% RH. Izoterme adsorpcije i desorpcije su generirane kao graf % promjene težine u odnosu na % RH.

Obrasci difrakcije rendgenskih zraka metodom praha dobiveni su na uređaju Siemens D5000 X-ray powder difraktometer koji je bio opremljen s CuKα izvorom (λ = 1.54056), koji je radio pri 50 kV i 40 mA sa Kevex Si (Li) detektorom u krutom stanju. Uzorci su skenirani od 4 do 35° u 2θ pri 2,5 sekunde po koraku veličine 0,04°. Suhi prašci su pakirani u užlijebljene držače uzoraka koji se pune odozgo te je glatka površina dobivena pomoću staklenog pomičnog zaklopca.

Obrasci difrakcije rendgenskih zraka pri promjenjivoj temperaturi metodom praha dobiveni su na uređaju Siemens D5000 X-ray powder difraktometer koji je bio opremljen s CuKα izvorom (λ = 1,54056), koji je radio pri 50kV i 40 mA sa scintilacijskim detektorom i nikal filtrom. Prah je bio pakiran u užlijebljeni držač sa kontroliranom temperaturom koji se puni odozgo, te je površina zaglađena za difrakciju. Uzorak je skeniran od 2 do 35° 2θ pri 2,5 sekundi po koraku veličine 0,04° počevši na 25°C, nakon ekvilibracijskog vremena u trajanju od 5 minuta. Nakon toga su mjerenja dobivena pri povećavanoj temperaturi, prirasta od 25°C do maksimuma od 125°C.

Slijedeći primjeri dalje ilustriraju postupke za pripravu F-V. Primjeri nisu namijenjeni da ograniče opseg ovih postupaka u bilo kojem smislu, i ne smiju biti kao takvi shvaćeni.

Primjeri

Primjer 1

Kristalizacija iz metanola bez koncentriranja

20,00 g uzorka arzoksifena pomiješano je s 500 ml bezvodnog metanola (HPLC čistoća) i zagrijano do refluksa. Sve krutine su se otopile kako bi se dobila homogena blijedo žuta otopina. Otopina je ohlađena do ispod refluksa i dodano je 5,00 g dodatnog arzoksifena. Otopina je ponovno zagrijana do refluksa kako bi se utjecalo na potpuno otapanje svih krutina. Otopina je puštena da se polagano ohladi uz miješanje. Pri 50°C otopina je zasijana sa nekoliko miligrama prije pripravljene F-V soli. Kristalična gusta otopina je ostavljena da se ohladi od 50°C do 30°C u periodu od 1,25 sata. U ovom trenutku je bila prisutna velika količina bijelih krutina. Miješana gusta otopina je uronjena u ledenu kupku i miješana dodatnih 3 sata. Gusta otopina je filtrirana koristeći Whatman #1 filter papir i bijela krutina je oprana s 50 ml metanola prethodno ohlađenoga na 0°C. Mokri kolač je osušen u trajanju od otprilike 48 sati pri 50°C u vakuumu s laganim N2 pročiščavanjem. Prinos je 15,94 g (63,8% iskorištenje). HPLC jakost 89,4% (kao slobodna baza), ukupne povezane supstance (TRS) 0,28%.

Usporedba težine produkta prije i poslije sušenja pokazala je da je početni mokri kolač sadržavao 65% otapala.

Primjer 2

Kristalizacija iz metanola sa koncentriranjem

25,00 g uzorka arzoksifena pomiješano je s 500 ml bezvodnog metanola (HPLC čistoće) i zagrijano do refluksa. Sva krutine su se otopile kako bi se dobila homogena blijedo žuta otopina. Otopina je koncentrirana uklanjanjem 375 ml destilata pomoću atmosferske destilacije. U ovom trenutku, reakcijska smjesa je bistra homogena žuta otopina. Refluks je prekinut i otopina je zasijana sa nekoliko miligrama prije pripravljenog F-V. Nakon zasijavanja, smjesa je ostavljena da se ohladi na temperaturu okoliša uz polagano miješanje u periodu od 1 sata. Za to vrijeme formirala se velika količina bijelog precipitata. Gusta otopina je uronjena u ledenu kupelj i miješana za vrijeme još 3 sata. Gusta otopina filtrirana je pomoću Whatman #1 filter papira i bijela krutina je oprana s 50 ml metanola prethodno ohlađenog na 0°C. Mokri kolač je osušen u trajanju od otprilike 48 sati pri 50°C u vakuumu s laganim N2 pročišćavanjem. Prinos je 22,44 g (89,8% iskorištenje).

HPLC jakost 91,3% (kao slobodna baza), TRS 0,26%. Usporedba težine produkta prije i poslije sušenja pokazala je da je početni mokri kolač sadržavao 31,5% otapala.

Primjer 3

Rekristalizacija iz metanola u mjerilu od 30 galona

3,08 kg uzorka arzoksifena pomiješano je s 60 l bezvodnog metanola (HPLC čistoće) i zagrijan do refluksa. Sve krutine su otopljene kako bi se dobila blijedo žuta homogena otopina. Otopina je koncentrirana uklanjanjem 40 l destilata atmosferskom destilacijom. U tom trenutku, reakcijska smjesa je bila bistra homogena žuta otopina. Reakcija je ohlađena kako bi se prekinuo refluks i glavni odvod otvoren je pri otprilike 40°C kako bi se provjerila kristalizacija. Opaženi su kristali te je hlađenje nastavljeno pri brzini od 12°C po satu do konačne temperature od 0°C. Kristalizacijska gusta otopina je miješana preko noći pri 0°C i zatim filtrirana kroz filter prešu s jednom pločom. Kako bi se uklonio sav produkt iz kristalizacijskog tanka, taj je tank ispran sa tekućinom koja je preostala nakon što je iz nje iskristalizirao produkt, te je tekućina zatim puštena kroz prešu. Mokri kolač je zatim opran s 11,3 l bezvodnog metanola prethodno ohlađenog na 0°C. Mokri kolač je osušen tako što je na prešu primijenjen vakuum, te je kroz vanjski plašt preše puštena tekuća voda pri temperaturi od 50°C. Lagani N2 pročišćivač je primijenjen nakon otprilike 24 sata. Ukupno vrijeme sušenja bilo je oko 36 sati. Prinos je 2,588 kg (86,27%); HPLC jakost 92,7 (kao slobodna baza); TRS 0,39%.

Primjer 4

Kristalizacija iz etanola

Čisti etanol (250 ml) i arzoksifen (10,0 g) su pomiješani i zagrijani do refluksa kako bi se utjecalo na otapanje. Otopina je puštena da se ohladi na temperaturu okoliša u periodu od 3 sata za koje vrijeme se formirao bijeli kristalni precipitat. Krutine su izolirane filtracijom i osušene pod vakuumom preko noći pri 50°C sa laganim N2 pročišćavanjem. Prinos je 5,50 g, t. t. 173°C (po DSC). Spektar rendgenske difrakcije praha dobiven je za ovaj uzorak i bio je u osnovi jednak F-V spektru danom u Slici 3.

Primjer 5

Kristalizacija iz izopropanola

Bezvodni izopropanol (250 ml) i azroksifen (10,0 g) su pomiješani i zagrijani do refluksa kako bi se utjecalo na otapanje. Uklonjena je toplina te je otopina zasijana s nekoliko miligrama F-V. Reakcijska smjesa je puštena da se ohladi na temperaturu okoliša i miješana je preko noći, za koje se je vrijeme formirao bijeli precipitat. Krutine su izolirane filtracijom te je dobiveno 12,11 g mokrog kolača. 4,01 g uzorka mokrog kolača osušeno je preko noći pri 60°C u vakuumu sa laganim N2 pročišćavanjem. Prinos je 2,72 g; t. t. 171,5°C (po DSC). Spektar rendgenske difrakcije metodom praha dobiven je za ovaj uzorak i bio je u osnovi jednak F-V spektru danom u Slici 3.

Primjer 6

Priprava iz azroksifen slobodne baze

Azroksifen slobodna baza (5,07 g) je stavljena u gustu otopinu u 65,0 ml metanola. Otopina 1,41 ml koncentrirane klorovodične kiseline i 10,0 ml vode je dodana u reakcijsku smjesu. Reakcijska smjesa je zagrijana na 55°C u trajanju od 15 minuta kako bi se utjecalo na otapanje. Reakcijska smjesa je ohlađena na 30°C i zasijana s 50 mg F-V. Reakcijska smjesa je ohlađena na 10°C brzinom od 1°C/hr i miješana na toj temperaturi 8 sati. Krutine su izolirane filtracijom, oprane s metanolom prethodno ohlađenim na 10°C i posušene u vakuumu pri 50°C preko noći s laganim N2 pročišćavanjem. Prinos je 4,42 g (87,7% iskorištenje); jakost (HPLC) 99,7%; TRS 0,32%. Spektar rendgenske difrakcije praha dobiven je za ovaj uzorak i bio je u osnovi jednak F-V spektru danom u Slici 3.

Pomoćne informacije

Kako se ovdje koristi, pojam "učinkovita količina" znači količinu F-V koja ima sposobnost inhibiranja stanja, ili njihovih štetnih učinaka, koja su ovdje opisana. Kada je F-V primijenjen zajedno sa estrogenom, progestinom, inhibitorom aromataze, LHRH analogom, ili AChE inhibitorom, pojam "učinkovita količina" također znači količinu takve tvari koja je sposobna ostvariti svoj namjeravani učinak.

Pojmovi "inhibirajući" i "inhibirati" uključuju njihovo općenito prihvaćeno značenje, to jest, prevenciju, prohibiciju, obuzdavanje, ublažavanje, poboljšanje, usporavanje, zaustavljanje, ili obrnuće progresije ili ozbiljnosti patološkog stanja, ili njegovih posljedica, ovdje opisanih.

Pojmovi "sprječavanje", "prevencija", "profilaksa", "profilakcijski" i "spriječiti" ovdje se koriste tako da se mogu zamjenjivati i odnose se na smanjenje vjerojatnosti da će se recipijent spoja F-V izložiti ili razviti bilo koje od patoloških stanja, ili njihovih posljedica, opisanih ovdje.

Pojmovi "estrogen depriviran" i "estrogen deprivacija" odnose se na stanje, ili nastalo prirodno ili klinički inducirano, u kojemu žena ne može proizvesti dovoljnu količinu endogenih estrogenih hormona kako bi održala estrogen ovisne funkcije, na primjer, menstruaciju, homeostazu koštane mase, neuronalnu funkciju, kardiovaskularni status, itd. Takve estrogen deprivirane situacije izlaze iz, no nisu limitirane samo na, menopauzu i operativnu ili kemijski ovariektomiju, uključujući i njihov funkcionalni ekvivalent, npr., liječenje s inhibitorom aromataze, GnRH agonista ili antagonista, ICI 182780, i sličnima. Bolesna stanja povezana s estrogen depriviranim stanjem uključuju, no nisu ograničena samo na: gubitak koštane mase, osteoporozu, kardiovaskularnu bolest i hiperlipidemiju.

Kako se ovdje koristi, pojam "estrogen" uključuje steroidne spojeve koji imaju estrogenu aktivnost kao što su, na primjer, 17β-estradiol, estron, konjugirani estrogen (Premarin®), konjski estrogen 17β-etinil estradiol, i slični. Preferirani na estrogenu utemeljeni spoj je Premarin®, i noretilnodrel.

Kako se ovdje koristi, pojam "progestin" uključuje spojeve koje imaju progesteronsku aktivnost kao što su, na primjer, progesteron, noretilnodrel, nongestrel, megestrol acetat, noretindron, i slični. Noretindron je preferirani progestin utemeljeni spoj.

Kako se ovdje koristi, pojam " inhibitor aromataze" uključuje spojeve koji imaju sposobnost inhibiranja aromataze, na primjer komercijalno dostupni inhibitori kao što su aminoglutemid (CYTANDREN®), Anastrazol (ARIMIDEX®), Letrozol (FEMARA®), Formestan (LENATRON®), Exemestan (AROMASIN®), i slični.

Kako se ovdje koristi, pojam "LHRH analog" se odnosi na analoge lutenizrajući hormon otpuštajućeg hormona koji inhibira proizvodnju estrogena u žena u premenopauzi uključujući na primjer, goserlin (ZOLADEX®) leuprolid (LUPRON®) i slične.

Kako se ovdje koristi, pojam "AChE inhibitor" uključuje spojeve koji inhibiraju acetilkolin esterazu, na primjer, fizostigmin salicilat, takrin hidroklorid, donepezil hidroklorid i slične.

Pojam "povećavati aktivnost ChAT" odnosi se na povećanje enzimatske aktivnosti ChAT, to jest, poticanje konverzije kolina u acetilkolin. Takvo poticanje bi uključivalo povećanje u učinkovitosti i/ili brzini reakcije ChAT i kolina i/ili povećanje količine ChAT prisutne u mjestu reakcije. Ovo povećanje u količini prisutnog enzima može nastati zbog regulacije gena ili drugog sintetskog koraka u formaciji enzima i/ili smanjenje deaktivacije enzima i metabolizma.

Odabrani postupci za testiranje

Procedura za općenitu pripremu štakora: Sedamdeset i pet dana stari (ukoliko nije drugačije naznačeno) ženski Sprague Dawley štakori (raspon težine od 200 do 225 g) dobiveni su iz Charles River Laboratories (Portage, MI). Životinjama su bili ili bilateralno uklonjeni jajnici (OVX) ili su bile izložene lažnom operativnom postupku u Charles River Laboratories, i zatim, nakon jednog tjedna poslani. Nakon dolaska, smješteni su u metalne viseće kaveze u grupama od 3 ili 4 po kavezu te su imale po želji pristup hrani (sadržaj kalcija otprilike 0,5%) i vodi za vrijeme jednog tjedna. Sobna temperatura je održavana na 22,2º ± 1,7ºC uz minimalnu relativnu vlažnost od 40%. Fotoperiod u prostoriji bio je 12 sati svjetla i 12 sati tame.

Režim doziranja prikupljanja tkiva: Nakon perioda aklimatizacije za vrijeme jednog tjedna (stoga, dva tjedna nakon OVX) započeto je dnevno davanje doze F-V. 17α-etinil estradiol ili F-V je davan oralno, ukoliko nije drugačije naznačeno, u obliku suspenzije 1% karboksimetilceluloze ili otopljeno u 20% ciklodekstrinu.

Životinjama su doze davane dnevno za vrijeme 4 dana. Nakon perioda davanja doza spoja, životinje su izvagane i anestezirane s ketamin: ksilazin (2:1, v:v) smjesom i uzorak krvi je uzet punkcijom srca. Životinje su zatim žrtvovane ugušenjem u CO2, maternica je uklonjena kroz središnji rez, i izmjerena je težina mokre maternice. 17α-etinil estradiol nabavljen je od Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.

Kardiovaskularna bolest/hiperlipidemija

Uzorci krvi od gore ostavljeni su da se zgrušaju na sobnoj temperaturi za vrijeme 2 sata, i serum je dobiven nakon centrifugiranja u trajanju od 10 minuta pri 3000 rpm. Kolesterol u serumu je određen pomoću testa Boehringer Mannheim Diagnostics high performance kolesterol assay. Ukratko, kolesterol je oksidiran do kolest-4-en-3-ona i vodik peroksida. Vodik peroksid je zatim reagirao s fenolom i 4-aminofenazonom u prisustvu peroksidaze kako bi se dobila p-quinon imin boja, koja je spektrofotemetrijski očitana na 500 nm. Koncentracija kolesterola je zatim izračunata u odnosu na standardnu krivulju. Cijeli test je automatiziran pomoću Biomek Automated Workstation.

Test eozinofilne peroksidaze iz maternice (EPO)

Maternice od gore držane su na 4ºC dok nije izvršena enzimatska analiza. Maternice su zatim homogenizirane u 50 volumena 50 mM Tris pufera (pH – 8,0) koji je sadržavao 0,005% Triton X-100. Nakon dodatka 0,01% vodikovog peroksida i 10 mM O-fenilendiamina (konačne koncentracije) u Tris puferu, praćeno je povećanje u absorbanciji u trajanju od jedne minute na 450 nm. Prisustvo eozonofila u maternici ukazuje na estrogenu aktivnost spoja. Maksimalna brzina od 15 sekundnog intervala određena je u inicijalnom, linearnom dijelu reakcijske krivulje.

Procedura testa inhibicije gubitka koštane mase (osteoporoze)

Slijedeći općenite postupke priprave opisane gore, štakori su dnevno tretirani u trajanju od trideset i pet dana (6 štakora po tretiranoj grupi) i žrtvovani asfiksijom u ugljičnom dioksidu 36-tog dana. Period vremena od trideset i pet dana dovoljan je da dođe do maksimalne redukcije u gustoći kostiju, izmjerene kako je ovdje opisano. U vrijeme žrtvovanja, uklonjene su maternice, disekcijom su oslobođene od okolnog tkiva, te su tekući sadržaji izdvojeni prije određivanja mokre težine kako bi se potvrdila deficijencija estrogena povezana s potpunom ovariektomijom.

Težina maternica je redovito reducirana za oko 75% kao posljedica ovariektomije. Maternice su zatim stavljene u 10% neutralni puferirani formalin kako bi se nakon toga omogućila histološka analiza.

Izrezani su desni femuri, napravljene su digitalizirane rendgenske snimke te su analizirane programom za analizu slika (NIH image) na distalnom metafizisu. Proksimalni dijelovi tibija ovih životinja su također pretraženi kvantitativnom kompjuterskom tomografijom. U skladu s gornjim postupcima, pokusnim životinjama su oralno dani F-V ili etinil estradiol (EE2) u 20% hidroksipropil β-ciklodekstrinu. F-V je također koristan u kombinaciji sa estrogenom ili progestinom.

Test proliferacije MCF-7 stanica

Stanice adenokarcinoma dojke MCF-7 (ATCC HTB 22) uzgajane su u mediju MEM (minimalni esencijalni medij, bez fenol crvenog, Sigma, St. Louis, MO) sa pridodanim 10% fetalnim goveđim serumom (FBS) (V/V), L-glutaminom (2 mM), natrij piruvatom (1 mM), HEPES {(N-[2-hidroksietil]piperazin-N'-[2- etansulfonska kiselina] 10 mM}, neesencijanlim amino kiselinama i goveđim inzulinom (1 ug/ml) (medij za uzgajanje). Deset dana prije testa, MCF-7 stanice su prebačene u medij za uzgajanje u koji je dodano 10% dekstranom presvučenim ugljenom osiromašenog fetalnog goveđeg seruma (DCC-FBS) testnog medija) umjesto 10% FBS kako bi se osiromašile unutrašnje zalihe steroida. MCF-7 stanice su uklonjene iz posuda za uzgajanje pomoću medija za disocijaciju stanica (HBSS bez Ca++/Mg++ (bez fenol crveno) kojem je dodano 10 mM HEPES i 2 mM EDTA). Stanice su dva puta oprane s testnim medijem i podešene na 80,000 stanica/ml. Otprilike 100 ml (8,000 stanica) dodano je u bunariće za mikrokulturu s ravnim dnom (Costar 3596) i inkubirano je pri 37°C u 5% CO2 vlažnom inkubatoru u trajanju od 48 sati kako bi se stanice mogle prihvatiti i ustaliti nakon presađivanja.

Serijska razrjeđenja lijekova ili DMSO kao kontrola razrjeđenja pripravljeni su u testnom mediju, te je 50 ml prebačeno u tri seta za mikrokulture te je dodano 50 ml testnog medija do konačnog volumena od 200 ml. Nakon još dodatnih 48 sati pri 37°C u vlažnom inkubatoru s 5% CO2, mikrokulturama je dan puls timidina s tricijem (1 �Ci/bunarić) za vrijeme 4 sata. Kulture su uništene zamrzavanjem na -70°C za vrijeme 24 sata nakon čega su otopljene te su mikrokulture prikupljene pomoću poluautomatskog uređaja za prikupljanje stanica Skatron Semiautomatic Cell Harvester. Uzorci su prebrojeni scintilacijom u tekućini pomoću brojača Wallac BetaPlace β counter.

DMBA-inducirana inhibicija tumora mliječne žlijezde

Estrogen-ovisni tumori mliječne žlijezde dobiveni su u ženkama Sprague-Dawley štakora koji su kupljeni od Harlan Industries, Indianapolis, Indiana. Kod otprilike 55 dana starosti, štakori su dobili jedno oralno hranjenje s 20 mg 7,12dimetilbenz[a]antracena (DMBA). Otprilike 6 tjedana nakon davanja DMBA, mliječne žlijezde su palpatirane u tjednim intervalima kako bi se ustanovio nastanak tumora. Svaki put kada se pojavio jedan ili više tumora, izmjereni su najduži i najkraći promjer svakog tumora pomoću metričkog šestara za mjerenje tjelesnih šupljina, mjerenja su zabilježena, i ta je životinja odabrana za eksperiment. Učinjen je pokušaj da se različite veličine tumora jednoliko rasporede u tretiranima i kontrolnim skupinama tako da su tumori srednje veličine jednoliko raspoređeni između testnih skupina. Kontrolne skupine i testirane skupine su za svaki pokus imale od 5 do 9 životinja.

F-V je davan ili putem intraperitonealnih injekcija u 2% akaciji, ili oralno. Oralno davani spojevi su ili otopljeni ili suspendirani u 0,2 ml kukuruznog ulja. Svaki tretman, uključujući kontrolne tretmane s akacijom i kukuruznim uljem, davani su jednom svaki dan svakoj pokusnoj životinji.

Nakon početnog mjerenja tumora te odabira pokusnih životinja, tumori su mjereni svaki tjedan pomoću gore opisanih metoda. Tretman i mjerenja životinja nastavljena su 3 do 5 tjedana, kada su određena konačna područja tumora. Određena je promjena u srednjoj veličini tumora za svaki spoj i za kontrolni tretman.

Postupci testa fibroze maternice

Test 1: F-V je davan svakoj od, između 3 i 20 žena, koje imaju fibrozu maternice. Količina spoja koja je davana je od 0,1 do 1000 mg/dan, i period davanja je bio 3 mjeseca. Žene su praćene za učinke na fibrozu maternice, za vrijeme perioda davanja, te do 3 mjeseca nakon prekida davanja.

Test 2: Isti postupak kao što je bio u Testu 1, osim što je period primjene 6 mjeseci.

Test 3: Isti postupak kao što je bio u Testu 1, osim što je period primjene 1 godina.

Test 4: Produžena estrogen stimulacija se koristila kako bi se inducirali leiomiomi u spolno zrelim ženkama zamorca. Životinjama je davan estradiol 3-5 puta na tjedan injekcijom, za vrijeme 2-4 mjeseca ili dok ne nastane tumor. Tretman koji se sastojao od F-V ili nosača davan je dnevno za vrijeme 3-16 tjedana te su zatim životinje žrtvovane te su prikupljene maternice i analizirane za regresiju tumora.

Test 5: Tkivo iz ljudskih leiomioma usađeno je u peritonealnu šupljinu i/ili miometrij maternice spolno zrelih, kastriranih, ženskih, golih (nude) miševa. Egzogeni estrogen dodan je da se potakne rast eksplantiranog tkiva. U nekim slučajevima, prikupljene tumorske stanice su uzgajane in vitro prije implantacije. Tretman koji se sastojao od F-V ili nosača dan je ispiranjem želuca svaki dan za vrijeme 3-16 tjedana i implantati su uklonjeni te je izmjeren rast ili regresija. U trenutku žrtvovanja, maternice su prikupljene kako bi se procijenio status organa.

Test 6: Tkivo iz ljudskih fibroidnih tumora maternice je prikupljeno i održavano, in vitro, kao primarne, netransformirane kulture. Operativno dobiveni uzorci su protisnuti kroz sterilnu mrežicu ili sito, ili alternativno izgrebeni iz okolnog tkiva kako bi se dobila suspenzija pojedinačnih stanica. Stanice su održavane u mediju koji je sadržavao 10% serum i antibiotik. Određene su brzine rasta u prisustvu i odsustvu estrogena. Stanice su određene po svojoj sposobnosti da proizvedu komponentu komplementa C3 i njihov odgovor na faktore rasta i hormon rasta. In vitro kulture procijenjene su po svojem proliferativnom odgovoru nakon čega slijedi tretman s progestinima, GnRH, F-V, i nosačem. Razina receptora steroidnog hormona procjenjivana je tjedno kako bi se odredilo da li su bitne odlike stanica održane i in vitro. Korišteno je tkivo od 5 - 25 pacijenata.

Test 7: Sposobnost F-V da inhibira estrogen-stimuliranu proliferaciju iz leiomioma izvedenih ELT staničnih linija u osnovi je izmjerena kako je opisano u Fuchs-Young, i sur., "Inhibition of Estrogen-Stimulated Growth of Uterine Leiomyomas by Selective Estrogen Receptor Modulators", Mol. Car., 17 (3): 151-159 (1996), čije učenje je ovdje uključeno po navodu.

Procedura testa endometrioze

Test 1: Dvanaest do trideset odraslih ženki štakora CD linije korištene su kao pokusne životinje. Podijeljene su u tri skupine jednakog broja. Praćen je estrus ciklus svih životinja. Na dan proestrusa, operacija je izvedena na svakoj ženki. Ženkama u svakoj grupu je uklonjen lijevi rog maternice, razdijeljen u male kvadrate, i kvadrati su lagano zašiveni na različita mjesta u blizini mezenterijskog krvnog toka. Uz to, ženkama u Skupini 2 su uklonjeni jajnici. Na dan koji je slijedio nakon operacije, životinje u Skupinama 1 i 2 su primile intraperitonealne injekcije vode za vrijeme 14 dana dok su životinje u Skupini 3 primile intraperitonealne injekcije 1,0 mg F-V po kilogramu tjelesne težine u istom trajanju. Nakon 14 dana tretmana, svaka ženka je žrtvovana i eksplantati endometrija, nadbubrežne žlijezde, preostala maternica, i jajnika, gdje se to moglo primijeniti, su uklonjeni i pripravljeni za histološki pregled. Jajnici i nadbubrežne žlijezde su izvagane.

Test 2: Dvanaest do trideset odraslih ženki štakora CD linije korištene su kao pokusne životinje. Podijeljene su u dvije jednake skupine. Praćen je estrus ciklus svih životinja. Na dan proestrusa, operacija je izvedena na svakoj ženki. Ženkama u svakoj grupu je uklonjen lijevi rog maternice, razdijeljen u male kvadrate, i kvadrati su lagano zašiveni na različita mjesta u blizini mezenterijskog krvnog toka. Nakon otprilike 50 dana nakon operacije, životinje dodijeljene Skupini 1 primile su intraperitonealne injekcije vode za vrijeme 21 dana dok su životinje u Skupini 2 primile intraperitonealne injekcije 1,0 mg F-V po kilogramu tjelesne težine u istom trajanju. Nakon 21 dana tretmana, svaka ženka je žrtvovana te su eksplantati endometrija i nadbubrežnih žlijezda uklonjeni i izvagani. Eksplantati su izmjereni kao indikacija rasta. Praćeni su estrus ciklusi.

Test 3: Autografi tkiva endometrija upotrebljeni su kako bi uzrokovali endometriozu u štakora i/ili zečeva. Ženke životinja u reproduktivnoj zrelosti podvrgnute su obostranom uklanjanju jajnika, te je estrogen dodavan egzogeno, na taj način pružajući specifičnu i konstantnu razinu hormona. Autologno tkivo endometrija usađeno je u periotoneum 5 - 150 životinja i estrogen je dodavan kako bi potaknuo rast eksplantiranog tkiva. Tretman koji se sastojao od spoja iz predmetnog izuma koji je davan ispiranjem želuca svakog dana za vrijeme 3 - 16 tjedana, te su implantati uklonjeni i izmjereni kako bi se odredio rast ili regresija. U vrijeme žrtvovanja, nedirnuti rog maternice je uzet kako bi se procijenio status endometrija.

Test 4: Tkivo iz ljudskih lezija endometrija usađeno je u peritoneum spolno zrelih, kastriranih, ženki, golih miševa. Egzogeni estrogen dodavan je kako bi potaknuo rast eksplantiranog tkiva. U nekim slučajevima, prikupljene stanice endometrija uzgajane su in vitro prije implantacije. Tretman se sastojao od F-V davanog ispiranjem želuca svakog dana za vrijeme 3 - 16 tjedana, te su implantati uklonjeni i izmjereni kako bi se odredio rast ili regresija. U vrijeme žrtvovanja, maternice su prikupljene kako bi se procijenio status nedirnutog endometrija.

Test 5: Tkivo iz ljudskih lezija endometrija je prikupljeno i održavano in vitro kao primarne, netransformirane kulture. Operacijski uzorci su protisnuti kroz sterilnu mrežicu ili sito,, ili alternativno izgrebeni iz okolnog tkiva kako bi se dobila suspenzija pojedinačnih stanica. Stanice su uzgajane u mediju koji je sadržavao 10% seruma i antibiotik. Određena je brzina rasta u prisustvu i odsustvu estrogena. Stanice su procijenjene po svojoj sposobnosti da proizvode komponentu komplementa C3 i svoj odgovor na faktore rasta i hormon rasta. In vitro kulture procijenjene su po svojem proliferativnom odgovoru nakon tretmana s progestinima, GnRH, F-V, i nosačem. Razina receptora steroidnih hormona određivana je svaki tjedan kako bi se odredilo da li su bitne odlike stanice sačuvane in vitro.

Korišteno je tkivo od 5 - 25 pacijenata.

CNS poremećaji uključujući Alzheimerovu bolest

Estrogeni, kao što je 17β-estradiol, reguliraju transkripciju gena tako što se vežu na estrogenske receptore (ER) koji se nalaze u citoplazmi određenih staničnih populacija. Aktivacija ER-a ligandom je preduvjet za transport kompleksa u jezgru gdje vezanjem za palindromsku DNA konsenzus sekvencu od 13 parova baza (estrogen response element, ili ERE) započinje sastavljanje transkripcijskog aparata što kulminira aktivacijom prikladnih ciljnih gena. Identificirano je mnoštvo gena koji su regulirani estrogenom. Oni uključuju proteine citoskeleta, neurotransmiterske biosintetičke i metaboličke enzime i receptore, kao i druge hormone i neuropeptide. ERE sekvence su identificirane u mnogim genima koji odgovaraju na estrogen, uključujući vitelogenin, c-fos, prolaktin, i luteinizirajući hormon.

Od važnosti za središnji živčani sustav, identificirane su sekvence slične ERE sekvencama u p75ngr i trkA, koji oba služe kao signalne molekule za neurotrofine: nervni faktor rasta (NGF), iz mozga izvedeni nervni faktor rasta (BDNGF), i neurotrofin-3.

Pokazano je da BDNF kao i NGF potiču preživljavanje kolinergičkih neurona u kulturi. Rečeno je da ukoliko su međudjelovanja između neurotrofina i estrogena važna za razvoj i preživljavanje bazalnih neurona prednjeg mozga (koji degeneriranju u Alzheimerovoj bolesti) tada klinička stanja u kojima postoji deficijencija estrogena (kao poslije menopauze) mogu doprinijeti gubitku ovih neurona.

Slijedeći eksperiment je izveden na štakorima kojima su odstranjeni jajnici (pripravljeni kako je gore opisano) kako bi se odredile sličnosti i/ili razlike između F-V i estrogena u utjecanju na ekspresiju gena u različitim regijama mozga. Štakorima starim šest tjedana dnevno su davane subkutane injekcije estradiol benzoata (0,03 mg/kg), F-V ili nosača (kontrola). Nakon pet tjedana tretmana, životinje su žrtvovane i njihovi mozgovi su uklonjeni te su hipokampusi sakupljeni mikrodisekcijom. Hipokampusi su brzo smrznuti u tekućem dušiku i spremljeni na -70°C. Ukupna RNA je izolirana iz tkiva sakupljenog u prikladnom tretmanu i kontrolnih skupina i reverzno prepisana pomoću 3' oligonukleotidnog primera koji je odabran za specifične mRNA (poly-A+) populacije. Lančane reakcije polimerazom (PCR) izvedene su u mješavini koja se sastojala od: nasumičnog 5' oligonukleotida (dugačak 10 parova baza; ukupno 150), reakcijskog pufera, Taq polimeraze, i 32PdTCP.

Nakon 40 ciklusa amplifikacije, produkti reakcije su razdvojeni po veličini na 6% TBE-urea gelu, osušeni i izloženi rendgenskom filmu. Nastali signali mRNA uspoređeni su između tretiranih skupina.

Upotreba F-V zajedno sa estrogenom

Peri- i postmenopauzalne žene često se podvrgavaju hormonalnoj zamjenskoj terapiji (HRT) kako bi se spriječile negativne posljedice povezane sa smanjenjem cirkulirajućih endogenih estrogena npr., kako bi se liječili valunzi. Unatoč tome, HRT je povezan s povećanim rizikom određenih tumora uključujući rak maternice i dojke. F-V se može koristiti zajedno s HRT kako bi se spriječili takvi rizici.

Upotreba F-V zajedno sa inhibitorom aromataze

Po definiciji, jajnici žene u postmenopauzi ne funkcioniraju. Njezin jedini izvor estrogena je putem pretvorbe androgena nadbubrežne žlijezde u estrogene enzimom aromatazom, koji se nalazi u perifernim tkivima (uključujući masno tkivo, mišić i sam tumor dojke). Stoga lijekovi koji inhibiraju aromatazu (inhibitori aromataze) oduzimaju cirkulirajući estrogen ženi u postmenopauzi. Oduzimanje estrogena pomoću inhibicije aromataze je bitna mogućnost u liječenju za pacijente sa metastazirajućim rakom dojke.

Za vrijeme terapije sa inhibitorom aromataze, nedostatak cirkulirajućih estrogena može uzrokovati negativne, nenamjeravane nuspojave, na primjer na razinu lipida u serumu. F-V se može upotrijebiti kako bi inhibirao ove negativne učinke.

Upotreba F-V zajedno sa LHRH analogom

Trajno izlaganje LHRH (hormon za otpuštanje lutenizirajućeg hormona) analogu inhibira proizvodnju estrogena kod premenopauzalnih žena tako da učini neosjetljivom hipofizu, koja tada više ne stimulira jajnike da proizvode estrogen. Klinički učinak je "lijekovima uzrokovano deaktiviranje jajnika" koje je reverzibilno nakon prestanka davanja LHRH analoga. Za vrijeme terapije s LHRH analogom, nedostatak cirkulirajućeg estrogena može uzrokovati negativne, nenamjeravane nuspojave, na primjer na razinu lipida u serumu. F-V se može upotrijebiti kako bi inhibirao ove negativne učinke.

Povećana razina acetil kolina

Poznato je da pacijenti koji boluju od Alzheimerove bolesti imaju značajno smanjenu razinu kolinergičkih neurona u hipokampusu nego jednako stare osobe koje nemaju Alzheimerovu bolest. Progresivni gubitak tih kolinergičkih neurona izgleda da odražava progresivni gubitak u pamćenju i kognitivnim funkcijama kod ovih pacijenata.. Vjeruje se da je jedan razlog za smanjenje broja ovih neurona, gubitak ili smanjena funkcija neurotransmitera, acetilkolina.

Razina acetilkolina u neuronu je u osnovi određena položajem ravnoteže između njegove biosinteze i biodegradacije. Enzim kolin acetiltransferaza (ChAT) je primarno odgovoran za njegovu sintezu i acetilkolin esteraza (AChE) za njegovu razgradnju.

Kako bi se odredio učinak F-V na nivo ChAT, izveden je slijedeći pokus: Slijedeći općenite procedure za postupke s štakorima opisane gore, 40 štakora je dnevno davana doza F-V od 3 mg/kg/dan u nosaču koji je sadržavao 10% ciklodekstrin, estradiol benzoat od 0,03 ili 0,3 mg/kg/dan, ili kontrola samo s nosačem, putem subkutane injekcije ili putem oralne sonde. Životinje su tretirane u trajanju od 3 ili 10 dana. Po svakom režimu doziranja bilo je dvadeset životinja. U prikladnim vremenskim intervalima, životinje su žrtvovane i njihovi mozgovi su disecirani. Pojedini dijelovi mozgova su homogenizirani te testirani. Homogenati iz hipokampusa i prednjeg režnja su procesirani te je određena aktivnost ChAT putem radioaktivno označenog testa biosinteze acetilkolina. Ove procedure se mogu pronaći u Schoepp i sur., J. Neural Transmiss., 78: 183-193, 1989, čije učenje je ovdje uključeno po referenci.

Kako je očekivano, u OVX životinja, razine ChAT su smanjene > 50% (p < 0,001) uspoređeno sa kontrolama na kojima je učinjena lažna operacija.

U drugom vidu predmetnog izuma, F-V je korišten u kombinaciji sa AChE inhibitorom. Upotreba AChE inhibitora povećava razinu actilkolina tako da blokira njegovu degradaciju putem inhibicije AChE.

Benigna hiperplazija prostate (BPH)

Za pozadinu veze između djelovanja estrogena i tretmana BPH-a i karcinoma prostate, vidi PCT PrijavuNo. WO 98/07274, Međunarodni datum publikacije: oktobar 15, 1998.

U pokusima opisanim dolje, određena je sposobnost F-V da se veže na receptore za estrogen u nekoliko staničnih linija raka prostate ljudi.

Stanični ekstrakti LNCaP, DU-45 i PC-3 staničnih linija ljudskoj raka prostate pripravljeni su u TEG mediju koji se sastoji od 50 nM Tris-HCl pH 7,4, 1,5 mM etilendiamin tetraoctene kiseline (EDTA) 0,4 M KC1, 10% glicerola, 0,5 mM 2-ME, i 10 mM natrij molibdata nadalje sadržavajući inhibitore proteaze pepstatin (1 mg/ml), leupeptin (2 mg/ml), aprotinin (5 mg/ml) i fenilmetilsulfonil fluorid (PMSF, 0,1 mM) (TEGP).

Stanični ekstrakti su centrifugirani i peleti su resuspendirani u hladnom TEGP (1 ml TEGP/100 mg peleta) i tretirani ultrazvukom 30 sekundi (operativni ciklus 70%, izlaz 1,8) na uređaju Branson Model 450 Sonifier. Ekstrakti su istaloženi pomoću centrifuge na 10,000 x G, 15 minuta pri 4°C nakon čega su izvučeni supernatanti te su ili odmah upotrebljeni ili pohranjeni na -70°C.

Test kompetitivnog vezanja: Pufer za vezanje je TEG u kojem je 0,4 M KCl zamijenjeno sa 50 mM NaCl i kojem je još dodano 1 mg/ml ovalbumina (TEGO). F-V je razrijeđen na 20 nM u TEGO-u u kojem su pripravljena još trostruka serijska razrjeđenja. Testovi su izvedeni na polipropilenskim mikropločicama s zaobljenim dnom u mikrobunarićima u triplikatu. U svaki bunarić je dodano 35 ml 17β�estradiola s tritijem (0,5 nM, specifična aktivnost 60,1 Ci/mmol, DuPont-New England Nuclear, Boston, MA) i 35 ml hladnog kompetitivnog testnog spoja (0,1 nM - 5 mM) ili TEGO, i nakon inkubacije u trajanju od 5 minuta pri 4°C uz tresenje, 70 ml ekstrakta MCF-7 stanične linije.

Pločice su inkubirane 24 sata pri 4°C nakon kojeg vremena je u svaki bunarić dodano 70 ml dekstranom presvučenog ugljena (DCC) nakon čega je slijedilo snažno tresenje za vrijeme 8 minuta pri 4°C. Pločice su onda centrifugirane pri 1500 x G za vrijeme 10 minuta pri 4°C. Supernatant je prikupljen iz svakog bunarića u fleksibilnu polistirensku mikropločicu za scintilacijsko brojanje u brojaču Wallac Micobeta Model 1450 counter. Radioaktivnost je izražena kao dezintegracije po minuti (DPM) nakon korekcije za efikasnost brojenja (35 - 40%) i pozadinu.

Dodatne kontrole su ukupni broj i ukupni broj + DCC kako bi se definirala donja granica brojeva izvedenih iz DCC. Rezultati ovih kompetitivnih testova vezanja izraženi su kao srednja vrijednost postotka vezanog (% vezano) +/- standardna devijacija pomoću formule:

[image]

Prevencija raka dojke

Ovaj izum se također odnosi na davanje F-V primatelju koji je u riziku da razvije de novo rak dojke. Pojam "de novo", kako se ovdje koristi, znači nedostatak transformacije ili metamorfoze normalnih stanica dojke u karcinozne ili maligne stanice u prvom slučaju. Takve transformacije mogu nastati u koracima u istoj ili stanici kćeri putem evolucijskog procesa ili može nastati u jednom, centralnom događaju. Takav de novo proces je u kontrastu metastazi, kolonizaciji, ili širenju već transformiranih ili malignih stanica iz primarnog mjesta tumora na nova mjesta.

Osoba koja nema posebni rizik da razvije rak dojke je ona koja može razviti de novo rak dojke, za koju nema dokaza ili sumnje na mogućnost bolesti iznad normalnog rizika, i koja nikad nije bila dijagnosticirana da ima bolest. Najveći faktor rizika koji pridonosi razvoju karcinoma dojke je osobna povijest obolijevanja od bolesti, ili ranija pojava bolesti, i ako je u remisiji bez i jednog dokaza o svojoj prisutnosti. Drugi faktor rizika je obiteljska povijest pojave bolesti.

Indukcija tumora mliječne žlijezde u štakora davanjem kancerogena N-nitroso-N-metilurea je dobro prihvaćeni model na životinjama za proučavanje raka dojke i smatra se prikladnim za analizu učinka kemopreventivnih tvari.

U dvije odvojene studije, 55 dana starim ženkama Sprague Dawley štakora dana je intravenozna (Studija 1) ili intraperitonealna (Studija 2) doza od 50 mg N-nitroso-N-metilureje po kilogramu tjelesne težine tjedan dana prije nego su hranjene hranom koliko su željele, u kojoj su se nalazile umiješane različite količine F-V, (Z)-2-[4-(1,2-difenil-1-butenil)fenoksi]-N,N-dimetiletanamin baze (tamoksifen baza), ili kontrole.

U Studiji 1, doze u hrani od 60 mg/kg hrane i 20 mg/kg hrane ugrubo se odnose na usporedive doze od 3 i 1 mg/kg tjelesne težine pokusnih životinja.

U Studiji 2, doze u hrani od 20, 6, 2, i 0,6 mg/kg hrane ugrubo se odnose na usporedive doze od 1, 0,3, 0,1 i 0,03 mg/kg tjelesne težine pokusnih životinja.

Štakori su promatrani kako bi se otkrili dokazi za toksičnost te su vagani i opipavani jednom tjedno kako bi se otkrila formacija tumora. Životinje su žrtvovane nakon trinaest tjedana (Studija 1) ili osamnaest tjedana (Studija 2) i tumori su potvrđeni i izvagani pri autopsiji.

Pripravci

Pojam "farmaceutski" kada se ovdje koristi kao pridjev znači značajno neškodljiv za sisavca koji ga prima. Pod pojmom "farmaceutski pripravak" misli se na nosač, razrjeđivač, ekscipijent i aktivni sastojak(e) koji mora biti kompatibilan sa ostalim sastojcima iz pripravka, i neškodljiv njihovom primaocu.

F-V je poželjno formuliran prije davanja. O odabiru pripravka mora odlučiti odgovorni liječnik koji u obzir uzima iste čimbenike koji su uključeni u određivanje učinkovite količine.

Ukupni aktivni sastojci u takvim pripravcima čine od 0,1% do 99,9% po težini pripravka. Poželjno, rečeni pripravak ne sadrži više od dva aktivna sastojka. To znači, poželjno je da se F-V kombinira s drugim aktivnim sastojkom koji je odabran između estrogena, progestina, inhibitora aromataze, LHRH analoga i AChE inhibitora. Najpreferiraniji pripravci su oni gdje je F-V jedini aktivni sastojak.

Farmaceutski pripravci iz predmetnog izuma pripravljeni su po procedurama poznatima u ovoj struci, koristeći dobro poznate i lako dostupne sastojke. Na primjer, F-V, ili sam, ili u kombinaciji sa estrogenom, progestinom, inhibitorom aromataze, LHRH analogom, ili AChE inhibitornim spojem, formulirani su sa uobičajenim ekscipijentima, razrjeđivačima, ili nosačima, i formirani u tablete, kapsule, suspenzije, otopine, pripravke za injiciranje, aerosole, praške, i slično.

Farmaceutski pripravci iz ovog izuma za parenteralnu primjenu uključuju sterilne vodene ili bezvodne otopine, disperzije, suspenzije, ili emulzije, kao i sterilne praške koji se neposredno prije upotrebe otapaju u sterilnim otopinama ili suspenzijama. Primjeri prikladnih sterilnih vodenih i bezvodnih nosača, razrjeđivača, otapala ili prijenosnika uključuju vodu, fiziološku otopinu, etanol, polihidroksi alkohole (kao što je glicerol, propilen glikol, poli(etilen glikol), i slične), i njihove prikladne smjese, biljna ulja (kao što je maslinovo ulje), i organske estere za injiciranje kao što je etil-oleat. Prikladna fluidnost se postiže, na primjer, upotrebom materijala za presvlačenje kao što je lecitin, održavanjem prikladne veličine čestica u slučaju disperzija i suspenzija, i upotrebom surfaktanata.

Parenteralni pripravci mogu također sadržavati adjuvante kao što su konzervansi, tvari za vlaženje, emulgatore, i tvari za disperziju. Prevencija djelovanja mikroorganizama je osigurana uključivanjem antibakterijskih i antimikotskih tvari, na primjer, parabena, klorobutanola, fenol sorbinske kiseline, i sličnog. Također može biti poželjno uključiti izotonične tvari kao što su šećeri, natrij klorid, i slično. Produžena apsorpcija injekcijskih formulacija može se postići uključivanjem tvari koje odlažu apsorpciju kao što su aluminij monostearat i želatina.

U nekim slučajevima, kako bi se produžio učinak lijeka, poželjno je da se apsorpcija lijeka uspori nakon subkutane ili intramuskularne injekcije. To se može postići upotrebom tekuće suspenzije kristalnog materijala slabe topivosti u vodi ili otapanjem ili suspendiranjem lijeka u uljni prijenosnik. U slučaju subkutane ili intramuskularne injekcije suspenzije koja sadrži formu lijeka koji ima slabu topljivosti u vodi, brzina apsorpcije lijeka ovisi o brzini otapanja lijeka.

Injektabilni "depo" pripravci F-V pripravljaju se formiranjem mikroenkapsuliranih jezgri lijeka u biorazgradivim polimerima kao što su poli(mliječna kiselina), poli(glikolna kiselina), kopolimeri mliječne i glikolne kiseline, poli (ortoesteri), i poli (anhidridi) onih materijala koji su opisani u primjeni. Ovisno o omjeru lijeka nasuprot polimeru i karakteristikama pojedinog korištenog polimera, može se kontrolirati brzina otpuštanja lijeka.

Formulacije za injiciranje se steriliziraju, na primjer, filtracijom kroz filtere koji zadržavaju bakterije, ili prethodnom sterilizacijom komponenti smjese prije njihovog zajedničkog miješanja, ili u trenutku proizvodnje ili neposredno prije primjene (kao u primjeru pakovanja šprica sa dvojnom komorom).

Kruti oblici za davanje za oralnu primjenu uključuju kapsule, tablete, pilule, praške, i granule. U takvim krutim oblicima za davanje, F-V je miješan sa barem jednim inertnim, farmaceutskim nosačem kao što su natrij-citrat, ili dikalcijev fosfat, i/ili (a) punilima ili ekstenderima kao što su škrob, šećeri uključujući laktozu i glukozu, manitol, i silicijevu kiselinu, (b) tvarima za povezivanje kao što su karboksimetil-celuloza i drugi derivati celuloze, alginati, želatin, poli(vinilpirolidin), saharoza i akacija, (c) tvarima za održavanje vlažnosti kao što je glicerol, (d) tvarima za dezintegraciju kao što je agaragar, kalcij karbonat, natrij bikarbonat, krumpirov ili škrob tapioke, algininska kiselina, silikati i natrij karbonat, (e) tvarima za vlaženje kao što je glicerol; (f) tvarima za usporavanje otapanja kao što je parafin, (g) tvarima za ubrzavanje apsorpcije kao što su kvaternarni amonijevi spojevi, (h) tvarima za vlaženje kao što je cetil alkohol i glicerin monostearat, (i) absorbentima kao što je kaolin i bentonit glina, i (j) lubrikantima kao što su talk, kalcij stearat, magnezij stearat, kruti poli(etilen glikoli), natrij lauril-sulfat, i njihove smjese. U slučaju kapsula, tableta i pilula, oblik za davanje može također sadržavati tvari za puferiranje.

Kruti pripravci sličnoga tipa mogu također uključivati punjenje u mekoj ili tvrdoj želatinoznoj kapsuli koristeći ekscipijente kao što su laktoza i poli(etilen glikoli) visoke molekulske mase i slično.

Kruti oblici za davanje kao što su tablete, dražeje, kapsule, pilule i granule mogu se također pripraviti sa prevlakama ili ljuskama kao što su enteričke prevlake ili druge prevlake dobro poznate u struci farmaceutskog formuliranja. Prevlake mogu sadržavati tvari za zatamnjivanje ili tvari koje otpuštaju aktivni sastojak(e) u posebni dio probavnog trakta, kao na primjer, prevlake topive u kiselini za otpuštanje aktivnog sastojaka(e) u želudac, ili prevlake topive u bazi za otpuštanje aktivnog sastojaka(e) u probavni trakt.

Aktivni sastojak(ci) mogu također biti mikroenkapsulirani u prevlaku sa polaganim otpuštanjem, kada je mikrokapsula učinjena dijelom pilule formulacije kapsule.

Tekući oblici za davanje za oralnu primjenu F-V uključuju otopine, emulzije, suspenzije, sirupe i eliksire. Uz aktivne sastojke, tekuće formulacije mogu uključivati inertne razrjeđivače uobičajeno korištene u ovoj primjeni kao što je voda ili druga farmaceutska otapala, tvari za poticanje otapanja i emulgatore kao što su etanol, izopropanol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, 1,3-butilen glikol, dimetil formamid, ulja (naročito, ulje sjemenki pamuka, smrvljenog koštunjavog voća, kukuruza, klica, maslinovo, ricinusovo, i sezamovo ulje), glicerol, tetrahidrofurfuril alkohol, poli(etilen glikoli), sorbitol esteri masnih kiselina, i njihove smjese.

Osim inertnih razrjeđivača, tekući oralni pripravci mogu također uključivati adjuvante kao što su tvari za vlaženje, emulgatori i tvari za suspenziranje, i tvari za zaslađivanje, arome, i miris.

Tekuće suspenzije, uz aktivni sastojak(e) mogu sadržavati i tvari za suspenziranje kao što su etoksilirani izostearil alkoholi, polioksietilen sorbitol i sorbitan esteri, mikrokristalna celuloza, aluminij metahidroksid, bentonit glina, agar-agar, i tragakant, i njihove smjese.

Pripravci za rektalnu ili intravaginalnu primjenu pripravljaju se miješanjem F-V sa prikladnim neiritirajućim ekscipijentima kao što su kakao maslac, polietilen glikol ili bilo koji supozitorni vosak koji je krut na sobnoj temperaturi, no tekuć na tjelesnoj temperaturi i koji se stoga topi u rektumu ili vaginalnoj šupljini kako bi otpustio aktivni sastojak(e). Spojevi su otopljeni u rastopljenom vosku, uobličeni u željeni oblik, i ostavljeni da se skrutnu u konačnu supozitornu formulaciju.

F-V se također može primijeniti u obliku liposoma. Kako je poznato u ovom području, liposomi su općenito izvedeni iz fosfolipida ili drugih lipidnih supstancija. Liposomalni pripravci tvore se tako da se mono- ili multilamelarni hidratirani tekući kristali dispergiraju u vodenom mediju. Može se koristiti bilo koji lipid koji je neotrovan, farmaceutski, i koji se može metabolizirati, a može tvoriti liposome. Predmetni pripravci u obliku liposoma mogu sadržavati, uz F-V, stabilizatore, ekscipijente, konzervanse, i slične. Preferirani lipidi su fosfolipidi i fosfatidil-kolini (lecitini), kako prirodni tako i sintetički.

Metode za formiranje liposoma poznate su u ovoj struci, kako je opisano u, na primjer, Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N. Y. (1976),. str. 33 i slijedeće.

Slijedeći primjeri pripravaka su samo ilustrativni i nisu namijenjeni da ograniče doseg predmetnog izuma.

Sastojak Količina (mg/tableta) Količina (mg/tableta)

F-V 11,3 56,5

Laktoza bezvodna 176,8 128,2

Laktoza sprej osušena specijalna 44,2 32,0

Povidon 11,0 13,0

Polisorbat 80 2,5 2,6

Crosspovidon (unutra) 6,25 6,24

Crosspovidon (izvana) 6,25 6,5

Magnezij stearat 1,5 1,7

Mikrokristalna celuloza (izvana) 0,0 13,0

Pripravak 1: Tablete koje sadrže otprilike 10 odnosno 50 mg, F-V mogu se pripraviti kako slijedi:

Sastojci su izmiješani i komprimirani kako bi tvorili tablete.

Alternativno, tablete koja svaka sadrži 2,5 - 1000 mg F-V pripravljene su kako slijedi:

Pripravak 2: Tablete

Sastojak Količina (mg/tableta)

F-V 25 - 1000

Škrob 45

Celuloza, mikrokristalna 35

Polivinilpirolidon (kao 10%-tna otopina u vodi) 4

Natrij karboksimetil-celuloza 4,5

Magnezij stearat 0,5

Talk 1

F-V, škrob, i celuloza propušteni su kroz U. S. sito veličine otvora No. 45 i temeljito promiješani. Otopina polivinilpirolidona pomiješana je sa nastalim prašcima što je zatim propušteno kroz U. S. sito veličine otvora No. 14. Tako dobivene granule osušene su pri 50° - 60°C i protisnute kroz U. S. sito veličine otvora No. 18. Natrij-karboksimetil škrob, magnezij stearat, i talk, prije toga protisnuti kroz U. S. sito No. 60, dodani su zatim granulama, koje su, nakon miješanja, komprimirane u aparatu za proizvodnju tableta kako bi se dobile tablete.

Suspenzije koje su svaka sadržavale 0,1 - 1000 mg lijeka po 5 ml doze napravljene su kako slijedi:

Pripravak 3: Suspenzije

Sastojak Količina (mg/5 ml)

F-V 0,1-1000 mgNatrij-karboksimetil celuloza 50 mgSirup 1,25 mgOtopina benzojeve kiseline 0,10 mlAroma q. v.Boja q. v.Pročišćena voda do 5 ml

Lijek je propušten kroz U. S. sito otvora No. 45 i pomiješan s natrij-karboksimetil celulozom i sirupom kako bi se dobila glatka pasta. Otopina benzojeve kiseline, aroma, i boja razrijeđeni su u nešto vode i dodani unutra, uz miješanje. Zatim je dodano dovoljno vode da se dobije traženi volumen.

Pripravak 4: Intravenozna otopina

Sastojak Količina

F-V 25 mg

Izotonična fiziološka otopina 1000 ml

Otopina gore navedenih sastojaka je intravenozno dana pacijentu brzinom od oko 1 ml po minuti.

Pripravak 5: Tablete koje sadrže cistein hidroklorid

Osnova tableta koje teže otprilike 250 mg i sadrže otprilike 10 mg ili 20 mg F-V generalno su pripravljene kako slijedi. F-V, razrjeđivači topljivi u vodi (laktoza monohidrat i bezvodna laktoza), i dio dezintegratora (crospovidona) pomiješani su zajedno u granulatoru visoke snage. Ova mješavina je zatim mokro uobličena u granulatoru visoke snage sa vodenom otopinom povidona i polisorbata 80. Cistein hidroklorid je također otopljen u otopini za granuliranje i dodan u koraku mokre mase putem otopine za granuliranje. Kako bi se održala konstantna težina tabletnog punjenja, količina laktoze (laktoza monohidrat i bezvodna laktoza) je smanjenja u iznosu koji je odgovarao količini dodanog cistein hidroklorida. Nakon koraka za mokro podešavanje veličine u mlinu s rotirajućim potisnikom, granule su osušene pomoću sušilice. Osušene granule su smanjene na prikladnu veličinu pomoću mlina s rotirajućim potisnikom. Preostali sastojci (mikrokristalna celuloza, magnezij stearat, i ostatak crospovidona) dodani su osušenim granulama i pomiješani. Ova smjesa je zatim komprimirana u tablete okruglog oblika pomoću konvencionalne rotacione preše za tablete. Jedinične formule za svaku od ovih šarži sažete su u Tabeli 2 što uključuje količine (mg/tableta) i vrstu ekscipijenta korištenog u pojedinom slučaju. Kako je vidljivo iz tabele, osnove tableta iz šarži C i D uključuju nanošenje film prevlake koja se nanosi putem vodene disperzije u posudi za prevlačenje koja ima sa strane otvor koji je spojen na komercijalni uređaj za rukovanje zrakom.

Tabela 2

Jedinične formule tablete (mg/tableta)

[image]

Pripravak 6: Tablete koje sadrže metionin

Osnova tableta koje teže otprilike 250 mg i sadrže otprilike 1 mg F-V generalno su pripravljene kako slijedi. F-V, razrjeđivači topivi u vodi (laktoza monohidrat i bezvodna laktoza), i dio dezintegratora (crospovidona) pomiješani su u granulatoru visoke snage. Ova smjesa je mokro oblikovana u jednu masu u granulatoru visoke jačine sa vodenom otopinom povidona i polisorbata 80. Metionin je također otopljen u otopini za granuliranje i dodan za vrijeme koraka s mokrim amorfnim materijalom putem otopine za granuliranje. Kako bi se održala konstantna težina tabletnog punjenja, količina laktoze (laktoza monohidrat i bezvodna laktoza) smanjena je za toliko da odgovara količini dodanog stabilizatora. Nakon koraka za mokro određivanje veličine kroz mlin sa rotirajućim potisnikom, granule su osušene pomoću sušilice. Osušene granule su smanjenje do prikladne veličine pomoću mlina sa rotirajućim potisnikom. Preostali sastojci (mikrokristalna celuloza, magnezij stearat, i ostatak crospovidona) dodani su suhim granulama i pomiješani. Ova smjesa je zatim komprimirana u tablete okruglog oblika pomoću konvencionalne rotirajuće preše za tablete. Jedinične formule za svaku od ovih šarži sažete su u Tabeli 3 što uključuje količine (mg/tableta) i tip ekscipijenta korištenog u pojedinom slučaju.

Tabela 3: Jedinične formule tablete (mg/tableta)

[image]

Doziranje

Specifična doza F-V danog u skladu s ovim izumom određena je sa pojedinačnim okolnostima koje se odnose na pojedinu situaciju. Te okolnosti uključuju, put primjene, prijašnju povijest bolesti recipijenta, patološko stanje ili simptom koji se liječi, težinu stanja/simptoma koji se liječi, i dob i spol recipijenta.

Općenito, učinkovita minimalna dnevna doza F-V je oko 1, 5, 10, 15, ili 20 mg. Karakteristično, učinkovita maksimalna doza je oko 800, 100, 60, 50, ili 40 mg. Najkarakterističnije, doza varira između 15 mg i 60 mg. Točna doza se može odrediti, u skladu sa standardnom praksom u medicinskoj struci "titriranjem doze" recipijenta; to znači, inicijalno davanje niske doze spoja, te postepeno povećavanje doze do uočavanja željenoga terapeutskog učinka.

Iako može biti nužno titrirati dozu za recipijenta u odnosu na kombinirane terapije o kojima se raspravljalo gore, tipične doze aktivnih sastojaka koji nisu F-V su kako slijedi: etinil estrogen (0,01-0,03 mg/dan), mestranol (0,05-0,15 mg/dan), konjugirani estrogenski hormoni (npr., Premarin®, Wyeth-Ayerst; 0,3 – 2,5 mg/dan), medroksiprogesteron (2,5 - 10 mg/dan), noretilnodrel (1,0 – 10,0 mg/dan), nonethindron (0,5 – 2,0 mg/dan), aminoglutemid (250 - 1250 mg/dan, poželjno 250 mg četiri puta na dan), anastrazole (1 - 5 mg/dan, poželjno 1 mg jedanput na dan), letrozol (2,5 - 10 mg/dan, poželjno 2,5 mg jedanput na dan), formestan (250 - 1250 mg po tjednu, poželjno 250 mg dva puta tjedno), exemestan (25 - 100 mg/dan, poželjno 25 mg jedanput na dan), goserlin (3 - 15 mg/tri mjeseca, poželjno 3,6 – 7,2 mg jednom svaka tri mjeseca) i leuprolide (3 - 15 mg/mjesec, poželjno 3,75 - 7,5 mg jedan put svaki mjesec).

Put primjene

F-V se može primijeniti nizom putova, uključujući oralno, rektalno, transdermalno, subkutano, intravenozno, intramuskularno, i intranazalno. Metoda primjene svake tvari temeljene na estrogenu i progestinu konzistentna je sa onom poznatom u struci. F-V, sam ili u kombinaciji sa estrogenom, progestinom, ili AChE inhibitorom općenito će se primijeniti u prikladnom pripravku.

Farmaceutski pripravci iz ovog izuma mogu se primijeniti na ljudima i ostalim sisavcima (npr., psima, mačkama, konjima, svinjama i ostalima) oralno, rektalno, intravaginalno, parenteralno, topikalno, bukalno ili sublingvalno, ili nazalno. Pojam "parenteralna primjena " ovdje se odnosi na metode primjene koje uključuju intravenoznu, intramuskularnu, intraperitonealnu, instrasternalnu, subkutanu, ili intraartikularnu injekciju ili infuziju.

Način/dužina primjene

U većini metoda iz predmetnog izuma, F-V se primjenjuje kontinuirano, od 1 do 3 puta na dan ili tako često koliko je potrebno da se recipijentu pruži učinkovita količina F-V. Klinička terapija može biti posebno korisna u tretmanu endometrioze ili se može koristiti akutno za vrijeme bolnih napada bolesti.

U slučaju restenoze, terapija može biti ograničena na kratke (1-6 mjeseci) periode nakon medicinskih zahvata kao što je angioplastika.

Claims (35)

1. Kristalni 6-hidroksi-3-(4-[2-(piperidin-1-il)etoksi]fenoksi)-2-(4-metoksifenil)benzo[b]tiofen hidroklorid (F-V), naznačen time, da ima obrazac difrakcije rendgenskih zraka koji sadržava barem jedan od slijedećih maksimuma: 7,3 ± 0,2, 15,5 ± 0,2, 15,9 ± 0,2, i 17,6 ± 0,2º u 2θ kada je dobiven sa bakrom kao izvorom zračenja.

2. Kristalan F-V u skladu s Zahtjevom 1, naznačen time, da rečeni obrazac difrakcije rendgenskih zraka nadalje sadržava barem jedan od slijedećih maksimuma: 17,9 ± 0,2, 18,2 ± 0,2, 18,9 ± 0,2, i 21,5 ± 0,2 u 2θ kada je dobiven sa bakrom kao izvorom zračenja.

3. Farmaceutski pripravak naznačen time, da sadrži kristalni spoj iz Zahtjeva 1; jedan ili više farmaceutskih nosača, razrjeđivača, ili eksipijenata; i moguće tvar za stabiliziranje odabranu između metionina, acetilcisteina, cisteina ili cistein hidroklorida; i moguće estrogen, moguće progestin, moguće inhibitor aromataze, moguće LHRH analog i moguće inhibitor acetilkolin esteraze.

4. Pripravak iz Zahtjeva 3, naznačen time, da sadrži kristalni spoj iz Zahtjeva 1; jedan ili više farmaceutskih nosača, razrjeđivača ili ekscipijenata; i estrogen.

5. Pripravak iz Zahtjeva 4, naznačen time, da je estrogen Premarin®.

6. Pripravak iz Zahtjeva 3, naznačen time, da sadrži kristalni spoj iz Zahtjeva 1; jedan ili više farmaceutskih nosača, razrjeđivača, ili ekscipijenata; i progestin.

7. Pripravak iz Zahtjeva 6, naznačeni time, da je progestin odabran iz skupine koja se sastoji od noretilnodrela i noretindrona.

8. Pripravak iz Zahtjeva 3, naznačen time, da sadrži kristalni spoj iz Zahtjeva 1; jedan ili više farmaceutskih nosača, razrjeđivača, ili ekscipijenata; i inhibitora AchE.

9. Pripravak iz Zahtjeva 8, naznačen time, da je AchE inhibitor odabran iz skupine koja se sastoji od: fizostigmin salicilata, tacrin hidroklorida, i donepezil hidroklorida.

10. Pripravak iz Zahtjeva 3, naznačen time, da sadrži kristalni spoj iz Zahtjeva 1; jedan ili više farmaceutskih nosača, razrjeđivača, ili ekscipijenata; estrogen; i progestin.

11. Metoda za inhibiranje patološkog stanja, naznačenu time, da je stanje odabrano iz skupine koja se sastoji od: fibroze maternice, endometrioze, proliferacije glatkih mišićnih stanica aorte, restenoze, raka dojke, raka maternice, raka prostate, benigne hiperplazija prostate, gubitak koštane mase, osteoporoze, kardiovaskularne bolesti, hiperlipidemije, poremećaji CNS-a, i Alzheimerove bolesti; koji uključuju primjenu učinkovite količine spoja iz Zahtjeva 1 na sisavcima koji imaju potrebu za time.

12. Metoda iz Zahtjeva 11, naznačena time, da je patološko stanje rak dojke.

13. Metoda iz Zahtjeva 12, naznačena time, da je način inhibicije profilakcijski.

14. Metoda iz Zahtjeva 11, naznačena time, da je patološko stanje rak jajnika.

15. Metoda iz Zahtjeva 11, naznačena time, da je patološko stanje rak endometrija.

16. Metoda iz Zahtjeva 11, naznačena time, da je patološko stanje osteoporoza.

17. Metoda za pojačavanje aktivnosti kolin acetiltransferaze (ChAT) u sisavcima naznačena time, da se sastoji od davanja učinkovite količine spoja iz Zahtjeva 1 sisavcu koji ima potrebu za time, i po izboru inhibitor acetilkolin esteraze (AChE).

18. Proces za pripravu spoja iz Zahtjeva 1, naznačen time, da uključuje kristalizaciju 6-hidroksi-3-(4-[2-(piperidin-1-il)etoksi]fenoksi)-2-(4-metoksifenil)benzo[b]tiofen hidroklorida iz otopine za kristalizaciju koja je odabrana iz skupine koja se sastoji od: metanola ili vodenog metanola, etanola ili izopropanola; te nakon toga sušenje nastale krutine do konstantne težine.

19. Proces iz Zahtjeva 18, naznačen time, da je rečeno otapalo vodeni metanol.

20. Proces u skladu sa Zahtjevom 19, naznačen time, da je omjer vode i metanola (v:v) između 20% i 5%.

21. Proces u skladu sa Zahtjevom 20, naznačen time, da je omjer 15%.

22. Spoj iz Zahtjeva 1 naznačen time, da služi za inhibiranje patološkog stanja koje je odabrano iz skupine koja se sastoji od: fibroze maternice, endometrioze, proliferacije glatkih mišićnih stanica aorte, restenoze, raka dojke, raka maternice, raka prostate, benigne hiperplazije prostate, gubitka koštane mase, osteoporoze, kardiovaskularne bolesti, hiperlipidemije, poremećaja CNS-a, i Alzheimerove bolesti.

23. Spoj iz Zahtjeva 22, naznačen time, da inibira rak dojke.

24. Spoj iz Zahtjeva 23, naznačen time, da je način inhibicije profilaktički.

25. Spoj iz Zahtjeva 24, naznačen time, da inibira rak jajnika.

26. Spoj iz Zahtjeva 22, naznačen time, da inibira rak endometrija.

27. Spoj iz Zahtjeva 22, naznačen time, da inibira osteoporozu.

28. Spoj iz Zahtjeva 1, naznačen time, da pojačava aktivnost kolin acetiltransferaze (ChAT) u sisavaca.

29. Upotreba spoja iz Zahtjeva 1 naznačena time, da služi za proizvodnju lijeka za inhibiranje patoloških stanja, odabrana iz skupine koja se sastoji od: fibroze maternice, endometrioze, proliferacije glatkih mišićnih stanica aorte, restenoze, raka dojke, raka maternice, raka prostate, benigne hiperplazije prostate, gubitka koštane mase, osteoporoze, kardiovaskularne bolesti, hiperlipidemije, poremećaja CNS-a, i Alzheimerove bolesti.

30. Upotreba iz Zahtjeva 29, naznačena time, da rečeni lijek služi za inhibiranje raka dojke.

31. Upotreba iz Zahtjeva 30, naznačena time, da je način inhibicije profilaktički.

32. Upotreba iz Zahtjeva 29, naznačena time, da rečeni lijek služi za inhibiranje raka jajnika.

33. Upotreba iz Zahtjeva 29, naznačena time, da rečeni lijek služi za inhibiranje raka endometrija.

34. Upotreba iz Zahtjeva 29, naznačena time, da rečeni lijek služi za inhibiranje osteoporoze.

35. Upotreba spoja iz Zahtjeva 1, naznačena time, da služi za proizvodnju lijeka za pojačavanje aktivnosti kolin acetiltransferaze (ChAT) u sisavaca.