DK173320B1 - Benzhydrylamin-derivater og fremgangsmåde til deres fremstilling - Google Patents

Description

i DK 173320 B1

Opfindelsen angår hidtil ukendte benzhydrylamin-derivater og en fremgangsmåde til deres fremstilling.

Disse benzhydrylamin-derivater er anvendelige til dannelse af syrelabile forankringsgrupper (spacere) ved syn-5 tese af peptidamider ved hjælp af en fastfasemetode.

Til fremstilling af peptidamider ved hjælp af fast-fasesyntese anvendes der almindeligvis benzhydrylamin- eller methylbenzhydrylaminharpikser, såsom beskrevet af J.P. Tam et al., Tetrahedron Lett. 22,, 2851 (1981). En yderligere 10 metode består i ammonolyse af bærer bundne peptidbenzylestere, jfr. C. Ressler et al., J. Am. Chem. Soc. 76, 3107 (1954).

Begge metoder er karakteriseret ved den til fraspaltning af forankringsgruppen nødvendige stærke syre (flydende hydrogenfluorid eller trifluormethansulfonsyre), sidereaktioner 15 eller ufuldstændig fraspaltning.

Den foreliggende opfindelse har således til formål at tilvejebringe hidtil ukepdte forankringsgrupper, som muliggør en mildere og bedre fraspaltning af peptidamider fra bærerharpiks. Dette formål opfyldes ifølge opfindelsen 20 med benzhydrylamin-derivaterne med den almene formel r2 r3 γ-s γ9 γ' γ2 25 , }={_ X. ·, (Ι) γ7 τ 6 γ5 γ4 30 hvor R1 betyder -alkyl, R2 betyder en beskyttelsesgruppe valgt blandt Fmoc, Ddz, Bpbc, Msc, Peoc, Pse og Tse, R3 betyder hydrogen eller C1_4-alkyl, Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8 og Y9 betyder hydrogen, C1-4-alkyl, C1_4-alkoxy eller v -O-(CH2)n-COOH, hvorhos grupperne er ens eller forskellige, 35 idet dog en af grupperne betyder -O* (CH2) n-COOH, eller Y1, Y2, Y5, Y6, Y7, Y8 og Y9 betyder hydrogen, C1_i-alkyl eller 2 DK 173320 B1

Ci_4-alk°xy, hvorhos grupperne er ens eller forskellige, Y3 betyder C^.g-alkoxy eller hydrogen, og Y4 betyder -(CH2)n-COOH eller -NH-CO- (CH2)n-COOH, og n er et helt tal fra l til 6.

5 Der foretrækkes forbindelser med den almene formel (I), hvor R1 betyder methyl, og n er et helt tal 1, 2 eller 3.

Foretrukket er ligeledes forbindelser med den almene formel (I), hvor R3 betyder hydrogen.

10 Desuden betyder grupperne Y^Y9 især methyl eller me- thoxy, idet dog én gruppe betyder -O-(CH2)n-COOH, og mindst 4 af disse grupper betyder hydrogen, eller grupperne Y1, Y2, Y5-Y9 betyder methyl eller methoxy, idet dog mindst 4 af disse grupper betyder hydrogen, Y3 betyder methyl, og Y4 15 betyder -(CH2)n-COOH.

Det foretrækkes, at én af grupperne Y1, Y3, Y5, Y7 eller Y8 betyder -O-(CH2)n-COOH.

I forbindelser, hvor Y4 betyder -(CH2)n-COOH, betyder Y3 Ci_4-alkoxy, især methoxy, og n er 2. Såfremt Y4 20 betyder -NH-CO-(CH2)n-C00H, betyder Y1 og Y3 fortrinsvis methoxy og n er 2.

Alkyl og alkoxy kan være ligekædet eller forgrenet.

De for R2 anførte beskyttelsesgrupper er følgende: 25 Fmoc 9-fluorenylmethyloxycarbonyl

Ddz a,a-dimethyl-3,5-dimethoxybenzyloxycarbonyl Bpoc 1-(4-biphenylyl)-1-methyl-ethoxycarbonyl Msc methylsulfonylethyloxycarbony1

Peoc 2-phosphonyl-ethyloxycarbonyl 30 Pse phenylsulfonylethoxycarbonyl

Tse toluensulfonylethoxycarbonyl DK patentansøgning nr. 1893/88 med prioritet fra 8.

2 april 1987 beskrives spacere med den almene formel I, hvori 35 R2 betyder hydrogen eller en aminosyrerest, som er beskyttet med en svagt surt eller basisk fraspaltelig aminobeskyttel- 3 DK 173320 B1 sesgruppe.

Den foreliggende opfindelse angår desuden en fremgangsmåde til fremstilling af benzhydrylamin-derivaterne med formlen (I) , hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, 5 at a) en forbindelse med formlen γΒ γ9 γΐ γ2 r1-0^3^h-^-y3 dl) γ7 γ6 γ5 γ^ 15 hvor R1 betyder -alkyl, Υ1, Υ2, Υ3, Υ4, Υ5, Υ6, Υ7, Υ8 og Υ9 betyder hydrogen, C1_4-alkyl, Ci_4-alkoxy eller -O-(CH2)n-COOH, hvorhos grupperne er ens eller forskellige, idet dog en af grupperne betyder -O-(CH2)n-COOH, eller Y1, 20 Υ2, Υ5, Υ^, γ7, yB Qg y9 betyder hydrogen, Cj.4-alkyl eller

Ci_4-alkoxy, hvorhos grupperne er ens eller forskellige, Y3 betyder C^.g-alkoxy eller hydrogen, og Y4 betyder -(CH2)n-COOH eller -NH-CO-(CH2) n-COOH, og n er et helt tal fra 1 til 6, omsættes med en forbindelse med formlen 25 R2 R3 \ / N (III)

30 H

hvor R2 betyder en beskyttelsesgruppe valgt blandt Fmoc,

Ddz, Bpoc, Msc, Peoc, Pse og Tse, og R3 betyder hydrogen eller C1_4~alkyl, eller 35 4 DK 173320 B1 b) en forbindelse med formlen

yS y 9 y i y 2 γ7 γ6 γ5 YJ

10 omsættes med hydroxylamin til en forbindelse med formlen ch γθ γ9 I γΐ γ2 15 )_/ N \/ (v) γ7 γ6 γ5 γί 20 hvor R1, Y1, Y2, Υ3, Υ4, Υ5, Υ6, Υ7, Υ8 og Υ9 har den ovenfor anførte betydning, hvorpå oximet reduceres til amin, fortrinsvis med zink i iseddike eller med zink i ammoniakalsk ethanol, jfr. S. Gaehde, G. Matsueda, Int. J. Peptide Protein 25 Res. 18, 451 (1981), og aminen eventuelt med egnede reagenser, såsom chlormyresyrederivater eller carbonsyrederivater, omdannes til forbindelser med formlen (I), hvor R2 betyder en beskyttelsesgruppe valgt blandt Fmoc, Ddz, Bpoc, Msc,

Peoc, Pse og Tse, og R3 betyder hydrogen.

30 Omsætningen af en forbindelse med formlen (II) med en forbindelse med formlen (III) gennemføres fortrinsvis i et polært, protisk opløsningsmiddel, såsom eddikesyre, ved en temperatur mellem 0°C og reaktionsblandingens kogepunkt.

Forbindelser med formlen (II) fås f .eks. ved reduktion 35 af benzophenonderivater med formlen 5 DK 173320 B1 't 9 γ9 y i γ2 5 -otø-c.#* (IV) γ7 γ6 γ5 yj hvor R1, Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y^, Y7, Y8 og Y9 har den ovenfor 10 anførte betydning, med egnede, dvs. for ketogruppen selektive reduktionsmidler, såsom natrinmborhydrid.

Benzophenonderivater m$d formlen (IV) fremstilles a) ved omsætning af benzophenoner med formlen (IV) , hvor R1 har den ovenfor anførte betydning, og Y1, Y2, Y3, 15 Y4, Y5, Y8, Y7, Y8 og Y9 betyder hydrogen, .4-alkyl eller Ci_4-alkoxy, og en af grupperne Y-^-Y9 betyder hydroxyl, med ω-halogenfedtsyrer med formlen

Hal-(CH2)n-COOH (VI) 20 hvor Hal betyder halogen og n har den ovenfor anførte betydning, eller med estere deraf, hvorved der ved estere derpå gennemføres en alkalisk forsæbning af estergruppen f.eks. med natriumhydroxidopløsning, jfr. M. Prashad et al., Indian 25 J. Chem. 17B, 496-498 (1979), b) f.eks. ved omsætning af benzoesyrechlorider med formlen γθ γ9 \_( 0 30 , Λ /=Λ " r1~°“(\ /)— c-ci }-i( (VII) γ7 .6 35 med ω-phenoxyalkansyrer med formlen 6 DK 173320 B1 γ1 γ2 Η~^Γ~^~γ3 (VIII) 5 γ5 γ4' hvor R1, Υ1, Υ2, Υ5, Υ8, Υ7, Υ8 og Υ9 har den under a) anførte betydning, Υ3' betyder -O-(CH2)n-C00R4, og Y4' har 10 samme betydning som Y4 under a), eller Y3' har samme betydning som Y3 under a) , og Y4' betyder - (CH2) n-COOR4, n har samme betydning som anført under a) , og R4 betyder C^.g-alkyl, fortrinsvis methyl eller ethyl, under anvendelse af en Lewis-katalysator, såsom aluminiumtrichlorid eller titan-15 tetrachlorid, jfr. Organikum, 13. oplag, side 354 (1974), eller c) ved omsætning af de tilsvarende benzoesyrechlorider med formlen (VIi) med tilsvarende substituerede phenoler med formlen (IX) til de tilsvarende phenylestere med formlen 20 γ8 γ9 γ2 γ 1 <χ) 25 Υ7 Υ6 Υ4 Υ5 efterfulgt af Fries-omlejring med Lewis-syrer, såsom ti-tantetrachlorid, jfr. R. Martin et al., Monatsh. Chemie 110, 1057-1066 (1979) og videre omsætning med ω-halogen- 30 fedtsyrer med formlen (VI), hvor Hal og n har den ovenfor anførte betydning.

Forbindelser med formlen (VIII), hvor Y3 r betyder Ci_g-alkoxy eller hydrogen, og Y4' betyder -(CH2)n-C00R4, fremstilles f.eks. ved omsætning af de tilsvarende benzal-35 dehyder, hvor Y4' betyder CHO, med malonsyrehalvestere i pyridin/piperidin til de tilsvarende kanelsyreestere efter- 7 DK 173320 B1 fulgt af hydrogenering. Der få$ i dette tilfælde forbindelser med formlen (VIII), hvor n er 2.

Det er ligeledes muligt at omsætte de tilsvarende benzaldehyder med α-halogeneddikesyreestere i nærværelse af 5 zink, efterfulgt af dehydratisering til kanelsyreestrene og derpå hydrogenering.

Forbindelser med formlen (VIII), hvor Y3' betyder -O- (CH2) n-COOR4, og Y4' betyder Y4, fremstilles ved omsætning af de tilsvarende phenoler med formlen 10 γΐ y2

Hj^OH (IX) γ5 Y4* 15 med de tilsvarende ω-halogenalkansyreestere, f.eks. med natriumhydrid i dimethylformam;id (DMF) eller kaliumcarbonat i acetone.

2 0 De til den almene formel (I) svarende forbindelser med formlerne (VII), (VIII), (IX) og (X) kan fremstilles analogt.

Forbindelserne med formlen (I) er anvendelige til fastfasesyntese af forbindelser med formlen 25 P-R2-NH-R3 (XI) hvor P betyder en peptidrest fra q s p+1 a-aminosyrer, og R2 og R3 har den ovenfor anførte- betydning. Herved kobles en 30 forbindelse med formlen (I) med inden for peptidkemien gængse koblingsreagenser over -O- (CH2) n-COOH-, - ((2¾)n-COOH- eller-NH-CO-(CH2)n-COOH-grupperingen til en harpiks, og beskyttelsesgruppen R2 fraspaltes, og q-p med baselabile eller over for svage syrer labile aminobeskyttelsesgrupper temporært 35 beskyttede a-aminosyrer eventuelt i form af deres aktiverede derivater tilkobles trinvis, og frigøres fra harpiksen efter 8 DK 173320 B1 endt opbygning af peptidet med formlen (XI) ved behandling med en middelstærk syre, hvorved samtidig eller med egnede midler til disse i forbindelse hermed temporært indførte sidekædebeskyttelsesgrupper igen fraspaltes.

5 Såfremt det er nødvendigt for at hindre sidereaktioner eller til syntese af specielle peptider, er de funktionelle grupper i aminosyrernes sidekæder yderligere beskyttet med egnede beskyttelsesgrupper, jfr. f.eks. T.W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", New York, John Wiley 10 & Sons, 1981, idet der først og fremmest anvendes Arg(Tos),

Arg(Mts), Arg(Mtr), Asp(OBzl), Asp(OBut), Cys (4-MeBzl) , Cys(Acm), Cys(SBut), Glu(OBzl), Glu(OBut), His(Tos), His(Fmoc), His(Dnp), His(Trt), Lys(Cl-2), Lys(Boc), Met(O), Ser(Bzl), Ser (But) , Thr(Bzl), Thr(But).

15 De som bærermateriale anvendte harpikser er kommer cielt tilgængelige eller kan fremstilles på stedet, såsom f.eks. alkoxybenzylalkoholharpikser, aminomethylharpikser eller benzhydrylaminoharpikser. Der foretrækkes aminomethyl-, benzhydrylamino- (BHA) og methylbenzhydrylaminoharpikser 20 (MBHA). Fyldningen bestemmes ved aminosyreanalyse og/eller elementaranalyse.

Som koblingsreagens til forbindelsen med formlen (I) og de yderligere aminosyrederivater kan der anvendes alle mulige inden for peptidsyntesen anvendte aktiveringsreagen-25 ser, jfr. f.eks. Houben-Weyl, Methoden der organischen Che-mie, bind 15/2, men især carbodiimider, såsom N,N1-dicyclo-hexylcarbodiimid, N,N' -diisopropylcarbodiimid eller N-ethyl-N'- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid. Koblingen kan herved ske direkte ved addition af aminosyrederivat til harpiksen 30 ved hjælp af aktiveringsreagenset og eventuelt et middel, der undertrykker racemi seringen, såsom 4-dimethylaminopyri-din, l-hydroxybenzotriazol (HOBt), jfr. W. K6nig, R. Geiger,

Chem. Ber. 103. 708 (1970), eller 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihy-drobenzotriazin (HOObt), jfr. W. Konig, R. Geiger, Chem.

35 Ber. 103. 2054 (1970) , eller foraktiveringen af aminosyre- derivatet som symmetrisk anhydrid eller HOBt- eller HOObt- 9 DK 173320 B1 ester kan ske separat, og opløsningen af de aktiverede forbindelser i et egnet opløsningsmiddel kan sættes til den koblingsduelige peptidharpiks.

Koblingen eller aktiveringen af forbindelsen med 5 formlen (I) og af aminosyrederivaterne med et af de ovenfor anførte aktiveringsreagenser kan gennemføres i dimethylformamid eller methylenchlorid eller en blanding deraf. Det aktiverede aminosyrederivat anvendes sædvanligvis i et 1,5-til 4-gange overskud. I de tilfælde, hvor der indtræder en 10 ufuldstændig kobling, gentages koblingsreaktionen uden først at gennemføre den for koblingen af den næstfølgende aminosyre nødvendige deblokering af peptidharpiksens α-aminogruppe.

Et godt forløb for koblingsreaktionen kan kontrolleres ved hjælp af ninhydrin-reaktionen, såsom f.eks. beskrevet 15 E. Kaiser et al.. Anal. Biochem. 21 595 (1970. Syntesen kan også gennemføres automatisk, f.eks. ved hjælp af et peptid-synteseapparat model 43OA fra Applied Biosystems, hvorved der kan anvendes enten det af fabrikanten leverede synteseprogram, eller der kan anvendes af et brugeren selv opstillet 20 program. Sidstnævte anvendes især ved anvendelse af amino-syrederivater beskyttet med en Fmoc-gruppe.

Fraspaltningen af peptidamidet fra harpiksen sker ved behandling med de inden for peptidsyntesen på gængs måde anvendte middelstærke syrer (f.eks. trif luoreddikesyre), 25 hvorved der som kationacceptor tilsættes stoffer, såsom phenol, cresol, thiocresol, anisol, thioanisol, ethandithiol, dimethylsulfid, ethylmethylsulfid eller tilsvarende inden for fastfasesyntesen gængse kationacceptorer enkeltvis eller som en blanding af to eller flere af disse hjælpemidler.

30 Trifluoreddikesyre kan i denne forbindelse også anvendes fortyndet med egnede opløsninger, såsom methylenchlorid.

Ved fraspaltningen af forankringsgruppen fra harpiksen sker der samtidig en fraspaltning af sidekædebeskytteises-grupperne.

35 Rensningen af det således fremkomne råpeptid sker ved hjælp af chromatografi på "Sephadex" ionbytterharpikser 10 DK 173320 B1 eller ved HPLC.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen.

Af disse eksempler illustrerer eksempel 5, 6 og 19 5 forbindelserne ifølge opfindelsen, eksempel 1-4 og 8-18 illustrerer fremstillingen af forstadier for forbindelserne ifølge eksempel 5, 6 og 19, og eksempel 7 og 20-23 illustrerer anvendelsen af forbindelserne ifølge eksempel 5 og 19.

10 Eksempel 1 4-Phenoxvsmorsvremethvlester

Til 160 ml isafkølet, tør methanol sættes der dråbevis 15 16 ml thionylchlorid, hvorpå der tilsættes 36 g phenoxysmør- syre portionsvis. Derpå omrøres der i l time ved 40°C. Derefter fjernes overskydende methanol, og den tilbageblivende remanens omkrystalliseres fra petroleumsether (afkøling til -20°C).

20 Udbytte: 34,5 g, smeltepunkt: 25,5-26,5°C.

Eksempel 2 4-(41-Methoxvbenzovl)-phenoxvsmørsvremethvlester 25 25,6 g vandfrit aluminiumtrichlorid opløses i 64 ml 1,2-dichlorethan, og der tilsættes 28,6 g 4-methoxybenzoyl-chlorid. Derpå tilsættes der langsomt under kraftig omrøring 31 g 4-phenoxysmørsyremethylester. Der omrøres i yderligere 30 4 timer ved 50°C, hvorpå man lader blandingen afkøle, og reaktionsblandingen hældes på isvand. Det olieagtige organiske lag og vandfasen adskilles, og den organiske fase vaskes med vand og krystalliseres ved tilsætning af lidt methanol. Det udfældede produkt skilles fra ved sugning og 35 omkrystalliseres fra ethylacetat.

Udbytte: 41 g, smeltepunkt: 117-118°C.

DK 173320 B1

Eksempel 3

XI

4-(41-Methoxvbenzovl)-phenoxvsmørsvre 5 41 g 4-(4 1-methoxybenzoyl)-phenoxysmørsyremethylester fra eksempel 2 opløses i 600 ml dimethoxyethan/vand (4:1), og der tilsættes 63 ml 2 N natriumhydroxidopløsning. Der omrøres i 4 timer ved stuetemperatur, hvorpå der syrnes med 3 N saltsyre til en pH-værdi på 3, og det organiske opløslo ningsmiddel fjernes under formindsket tryk.

Den udfældede syre skilles fra ved filtrering og tørres under formindsket tryk over phosphorpentoxid.

Udbytte: 38,7 g, smeltepunkt: 141-142°C.

15 Eksempel 4 (4-Carboxvlatopropvloxvphenvl)-41-methoxvphenylcarbinol 18,9 g 4-(41-methoxybenzoyl)-phenoxysmørsyre (eksem-20 pel 3) opløses i 600 ml methanol ved 40°C, og der tilsættes portionsvis 60 ml 1 N natriumhydroxidopløsning og 3,4 g natriumborhydrid. Der omrøres i endnu 1 time ved 40°C, hvorpå der reduceres til et lille rumfang, og der indstilles til en pH-værdi på 2,8 med 3 N saltsyre. Derefter fjernes metha-25 nolen på en rotationsfordamper, hvorpå den vandige blanding ekstraheres med ethylacetat, og den organiske opløsning vaskes med mættet natriumchloridopløsning. Efter tørring over natriumsulfat fjernes opløsningsmidlet. Der fås 18,2 g amorft stof, som straks omsættes videre.

30 Almen fremgangsmåde til kobling af Fmoc-amid (9-fluo- renylmethylcarbamat) til carbinolderivater.

20 mmol Fmoc-amid og 2Q mmol frisk fremstillet car-binol opløses i 50 ml varm iseddike. Derpå tilsættes der 5 dråber koncentreret svovlsyre, og der omrøres ved stuetempe-35 ratur eller ved 40°C. Reaktionens fremadskriden kontrolleres ved hjælp af tyndtlagschromatpgrafi. Efter endt reaktion 12 DK 173320 B1 hældes iseddikeopløsningen på isvand, hvorpå det udfældede produkt skilles fra ved sugning og omkrystalliseres.

Eksempel 5 5 N-Fmoc- (4 -carboxvlatopropvloxvphenvl-4 ’ -methoxvphenvl) methyl amid

Ved at følge den ovenfor anførte fremgangsmåde omsæt-10 tes den under eksempel 4 fremstillede (4-carboxylatopropyl-oxyphenyl)-4'-methoxyphenylcarbinol.

Udbytte: 91%, smeltepunkt: 186-187°C.

Analyse beregnet for C33H31N06: C 73,73 H 5,81 N 2,61

Fundet: C 73,6 H6,0 N2,6 15

Eksempel 6 N-Fmoc- (4 -carboxvlatomethvloxvphenyl-4 1 -methoxvphenvl) me-thvlamid 20

Ved anvendelse af ovennævnte fremgangsmåde omsættes den i tysk patentansøgning P 37 11 866.8 eksempel 3 beskrevne (4-carboxylatomethyloxyphenyl) -4 ' -methoxyphenylcarbinol.

Udbytte: 60%, smeltepunkt: 176-179°C.

25 Analyse beregnet for C3iH27NOg: C 73,15 H 5,35 N 2,75

Fundet: C 73,3 H 5,3 N 2,95

Eksempel 7 30 Syntese af H-Leu-Gly-Gly-Gly-Gln-Gly-Lys-Val-Leu-Gly-NH2 under anvendelse af den i eksempel 5 beskrevne ankerforbindelse. Syntesen gennemføres i et peptidsynteseapparat fra Labotec.

35 Fra 1,5 g Boc-Val-harpiks (fyldning 0,76 mmol/g) fjernes først beskyttelsesgruppen med trifluoreddikesyre i 13 DK 173320 B1 methylenchlorid. Efter vaskning med dichlormethan og ethyl-diisopropylamin og igen dichlormethan tørres harpiksen.

Derpå tilsættes der 2,1 mmol af den i eksempel 5 fremstillede ankerforbindelse sammen med 3,15 mmol HOBt opløst i 20 ml 5 tørt DMF til harpiksen, og der tilsættes derefter 2,3 mmol diisopropylcarbodiimid. Under langsom blanding får reaktionsblandingen lov at reagere natten over ved stuetemperatur. Reaktionens fuldstændighed kontrolleres med ninhydrin-reaktionen (Kaiser-test). Derpå skilles harpiksen fra ved 10 sugning, hvorpå der vaskes med DMF, og peptidet derefter opbygges på harpiksen (til syntesen anvendes der 1 g af den ovenfor fremstillede harpiks), hvorved følgende trin gennemløbes cyclisk: fraspaltning af Fmoc-beskyttelsesgruppen med 20%

15 piperidin i DMF

vaskning af harpiksen med DMF

påkobling af Fmoc-aminosyren under in situ aktivering som HOBt-ester under anvendelse af diisopropylcarbodiimid som aktiveringsreagens (1,5 mmol aminosyre, 20 2,25 mmol HOBt og 1,6 mmol diisopropylcarbodiimid) Såfremt koblingen er ufuldstændig (Kaiser-test), gentages koblingstrinet.

Som sidste aminosyre anvendes der Boc-Leu-OH.

25 Efter endt syntese vaskes harpiksen med DMF og iso- propanol og tørres i højvakuum. Fraspaltningen sker over et tidsrum på 2,5 timer ved stuetemperatur med en blanding af 20 ml trifluoreddikesyre/15 ml dichlormethan/5 ml thioani-sol/0,5 ml ethandithiol. Derpå skilles der fra ved sugning 30 i diethylether, og der eftervaskes med 50% trifluoreddikesyre i dichlormethan. Det udfældede råpeptid skilles fra ved sugning og vaskes 3 gange med diethylether og tørres i høj -vakuum.

Udbytte: 91% råpeptid 35 Aminosyreanalyse: Gly 5,1, Glu 0,98, Leu 1,78, Val 0,81,

Lys 1,01.

Eksempel 8 14 DK 173320 B1 2.4- dimethoxvkanelsvreethvlester 5 83 g 2,4-dimethoxybenzaldehyd og 66 g malonsyremono- ethylester opløses i 100 ml tør pyridin, og efter tilsætning af 1 ml piperidin og 40 g molekylarsigte opvarmes der under tilbagesvaling, indtil CO2-udviklingen er ophørt. Reaktionsblandingen hældes efter afkøling på knust is og indstilles 10 til en pH-værdi på 1 til 2 med koncentreret saltsyre under omrøring. Der efterrøres i yderligere 20 minutter, hvorpå det udfældede produkt skilles fra ved sugning, vaskes med 1 ΚΓ saltsyre og vand og tørres i en ekssikkator.

Udbytte: 100,2 g, smeltepunkt: 58°C.

15

Eksempel 9 2.4- Dimethoxvhvdrokanelsvreethvlester 20 100,2 g 2,4-dimethoxykanelsyreethylester opløses i 400 ml methanol og hydrogeneres med palladium/carbon ved normal tryk. Katalysatoren skilles fra ved sugning, og der koncentreres under formindsket tryk.

Udbytte: 94,7 g gullig olie.

25

Eksempel 10 3- f2,4 -Dimethoxv -5- (4-methoxvbenzovl)phenvllpropionsvre-ethvlester 30 52 g aluminiumtrichlorid suspenderes i 200 ml 1,2-dichlorethan og afkøles til 0°C. Derpå tilsættes der dråbevis ved denne temperatur 66,5 g 4-methoxybenzoylchlorid efterfulgt af 94,7 g 2,4-dimethoxyhydrokanelsyreethylester i 35 30 ml 1,2-dichlorethan. Derpå opvarmes der til 50°C under fugtighedsudelukkelse, indtil reaktionen er bragt til ende.

15 DK 173320 B1

Derefter hældes reaktionsblandingen på isvand, hvorpå den organiske fase skilles fra og efter fortynding med 200 ml methylenchlorid ekstraheres med natriumhydrogencarbonatop-løsning og vand. Der tørres over magnesiumsulfat og kon-5 centreres. Der fås et gråbrunt fast stof, som omsættes direkte videre.

Udbytte: 128,9 g, smeltepunkt? 89°C.

Eksempel n 10 3-Γ2.4-Dimethoxv-5-(4-methoxvbenzovl>ohenvllpropionsvre 55,8 g 3-[2,4-dimethoxy-5-(4-methoxybenzoyl)phenyl]-propionsyreethylester tilsættes 300 ml 2 N natriumhydroxid-15 opløsning og 300 ml dioxan og omrøres natten over. Derpå fjernes dioxanen, og den alkaliske vandige opløsning ekstraheres én gang med 100 ml ethylacetat. Vandfasen indstilles til en pH-værdi på 2 med koncentreret saltsyre, hvorved en del af produktet udfælder. Der ekstraheres tre gange med hver 20 gang 200 ml ethylacetat, hvorpå den organiske fase vaskes med vand, tørres over natriumsulfat og koncentreres. Remanensen omkrystalliseres fra ethylacetat/acetone/hexan.

Udbytte: 37 g, smeltepunkt: 177-180°C.

25 Eksempel 12 2.4-Dimethoxvkanelsvremethvlester

En blanding af 105,6 g 2,4-dimethoxybenzaldehyd, 30 93,6 g malonsyremonomethylestér-kaliumsalt, 200 ml pyridin (tørret over KOH), 1,2 ml piperidin, 36 ml eddikesyre og 48 g molekylarsigte 3 k opvarmes til 150°C, indtil C02-udvik-1ingen er ophørt.

Opløsningen hældes varm på is, syrnes med koncentreret 35 saltsyre til en pH-værdi på 1-2 og efterrøres i yderligere 20 minutter i et isbad. Bundfaldet skilles fra ved sugning, 16 DK 173320 B1 eftervaskes med 1 N HCl og vand og tørres.

Udbytte: 113,8 g, smeltepunkt: 78°C.

Eksempel 13 5 2.4-Dimethoxvkanelsvre

Der gås ud fra 180 ml tør pyridin i en 1 liter tre-halset kolbe med magnetrører, tilbagesvaler og indvendig 10 termometer, og heri opløses der 124,9 g malonsyre under omrøring. Derpå tilsættes der portionsvis 166,18 g 2,4-di-methoxybenzaldehyd, hvorved den indre temperatur synker til 25°C. Til den fremkomne blanding sættes der 9,9 ml tør pi-peridin, og der opvarmes derefter langsomt.

15 Badtemperaturen indstilles til 130°C. Efter 1,5 timer er CO2-udviklingen ophørt, og blandingen koger ved 107°C.

Derpå hældes blandingen varm på 1 kg is. Der syrnes til en pH-værdi på 1 med koncentreret HCl under omrøring, hvorpå der efterrøres i yderligere 20 minutter under isaf-20 køling, og bundfaldet skilles fra ved sugning. Der eftervaskes endnu hver tre gange med hver 200 ml 2 N HCl og vand og tørres. Det tilbageblivende aldehyd fjernes ved suspension af bundfaldet i 600 ml varm cyclohexan og fornyet frasugning.

Derpå eftervaskes med 100 ml varm cyclohexan og tørres i en 25 ekssikkator. Af filtratet udkrystalliserer aldehydet ved afkøling.

En yderligere mulighed for rensning består i omkrystallisation fra methanol/vand. Hertil opløses produktet varm i så lidt methanol som mulig og tilsættes vand til 30 uklarhed. Efter afkøling udfælder kanelsyren, medens aldehydet forbliver i opløsning.

Udbytte: kanelsyre 181,4 g (behandlet med cyclohexan), aldehyd 14,5 g (udfældet fra cyclohexan)

Smeltepunkt: 182-184°C.

35

Eksempel 14 17 DK 173320 B1 3-(2.4-Dimethoxvphenvl)propionsvremethvlester 5 20,8 g 2,4-dimethoxykanelsyre opløses varm i en blan ding af 500 ml methanol og 100 ml ethylacetat og hydrogeneres efter tilsætning af 1 g katalysator (10% Pd/C) ved normaltryk. Hydrogenoptagelsen skulle være tilendebragt efter 3 timer. Såfremt hydrogeneringen ikke er fuldstændig, til-10 sættes der endnu engang frisk katalysator. Efter endt reaktion skilles katalysatoren fra, opløsningen koncentreres til ca. 200 ml, og der tilsættes 20 ml af en ca. 2,4 M methano-lisk saltsyreopløsning, hvorpå blandingen henstår i 2 dage ved stuetemperatur. Forestringen er derpå fuldstændig. Me-15 thanolen fjernes under formindsket tryk, og remanensen optages i 200 ml ethylacetat, hvprpå den organiske fase vaskes med NaHC03-opløsning og mættet NaCl-opløsning (hver 3 gange 50 ml), hvorefter der tørres over Na2S04 og koncentreres. Udbytte: 20,0 g olie.

20

Eksempel 15 3-(2.4-Dimethoxvphenvl)propionsvremethvlester 25 113,8 g 2,4-dimethoxykanelsyremethylester opløses under opvarmning i 1,5 liter methanol og hydrogeneres med 5 g katalysator (10% Pd/C) . Efter fjernelsen af katalysatoren ved filtrering koncentreres der. Der fås 113 g olie, som anvendes direkte ved den følgende Friedel-Crafts-acylering.

30 Udbytte: 113 g olie.

35

Eksempel 16 18 DK 173320 B1 3 - 12.4 -Dimethoxv-5-(4-methoxvbenzovl)phenvll propionsvreme-thvlester 5 36,6 g aluminiumtrichlorid opløses i 130 ml 1,2-di-chlorethan, og der tilsættes 42,65 g 4-methoxybenzoylchlorid til den til 0°C afkølede opløsning. Ved denne temperatur tilsættes der derpå dråbevis 56 g 3-(2,4-dimethoxyphenyl)-10 propionsyremethylester (eksempel 17) opløst i 30 ml 1,2-dichlorethan, hvorpå der under fugtighedsudelukkelse indtil endt reaktion (ca. 36 timer) omrøres ved 50eC. Den afkølede reaktionsblanding tilsættes 200 ml vand, hvorpå den fortyndes med 400 ml CH2C12, ekstraheres med hydrogencarbonat og vand, 15 tørres over natriumsulfat og koncentreres. Der opløses i diisopropylether og fældes med hexan. Efter frasugning fås der 62,1 g, og fra moderluden yderligere 10,5 g produkt.

Udbytte: 72,6 g, smeltepunkt: 114-117°C.

20 Eksempel 17 3 -Γ 2,4-Dimethoxv-5-f 4-methoxvbenzovl)phenvl 1 propionsvre 60,9 g 3-[2,4-dimethoxy-5-(4-methoxybenzoyl)phenyl]-25 propionsyremethylester tilsættes 300 ml 2 N natriumhydroxidopløsning og 300 ml dioxan og omrøres natten over. Derpå fjernes dioxanen, og den alkaliske vandige opløsning ekstraheres én gang med 100 ml ethylacetat. Vandfasen indstilles til en pH-værdi på 2 med koncentreret saltsyre, hvorved en 30 del af produktet udfælder. Der ekstraheres tre gange med hver gang 2 00 ml ethylacetat, hvorpå den organiske fase vaskes med vand, tørres over natriumsulfat og koncentreres. Remanensen omkrystalliseres fra ethylacetat/acetone/hexan. Udbytte: 51,3 g, smeltepunkt: 177-180°C.

35 19 DK 173320 B1

Eksempel 18 5-Carboxvlatoethvl-2,4-dimethoxv-4'-methoxvbenzophenonoxim 5 37 g 3-[2,4-dimethoxy-5-(4-methoxybenzoyl) phenyl] pro- pionsyre, 22,4 g hydroxylamin-hydrochlorid og 21 g natriumacetat (vandfrit) sættes til 300 ml absolut ethanol, og under fugtighedsudelukkelse ojpvarmes der i 24 timer under tilbagesvaling. Uopløste bestanddele skilles fra ved sugning, 10 hvorpå der koncentreres, og remanensen tilsættes vand. Derefter indstilles der til en pH-værdi på 2 med 1 N saltsyre, hvorefter der ekstraheres med ethylacetat. Den organiske fase vaskes med vand, tørres over magnesiumsulfat og koncentreres. Remanensen omkrystalliseres fra ethylacetat/hexan.

15 Udbytte: 34,3 g, smeltpunkt: I24-128°C.

Eksempel 19 N-(9-Fluorenvlmethoxvcarbonvl)-Γ(5-carbovlatoethvl-2.4-djme-20 thoxvphenvl)-41-methoxvphenvll methvlamin 34 g 5-carboxylatoethyl-2,4-dimethoxy-4'-methoxyben-zophenonoxim sættes til en blanding af 100 ml ethanol og 500 ml 25% ammoniakopløsning, hvorpå der tilsættes 29,5 g 25 zinkpulver, og blandingen omrores natten over ved 50°C.

Derpå tilsættes der yderligere! 30 g zink og 260 ml 25% ammoniak og der omrøres i yderligere 24 timer ved 50°C. Zinken skilles fra ved sugning i varm tilstand, og ethanolen fjer nes. Den afkølede vandige fase gøres neutral med koncentreret 30 saltsyre og ekstraheres én gang med ethylacetat.

Den fremkomne amin isoleres ikke, men den vandige opløsning omsættes direkte videre. Hertil indstilles opløsningen til en pH-værdi på 8 med fast natriumhydrogencarbonat, hvorpå der fortyndes med 2 50 ml tetrahydrofuran, og der 35 tilsættes 31 g 9-fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat, hvorefter der omrøres natten over. Derpå skilles uopløste be- 20 DK 173320 B1 standdele fra ved filtrering, tetrahydrofuranen fjernes under formindsket tryk, og den vandige fase gøres sur med 1 N svovlsyre. Der ekstraheres med ethylacetat, hvorpå den organiske fase vaskes med mættet natriumchloridopløsning, 5 hvorefter der tørres over magnesiumsulfat og koncentreres. Remanensen opløses varm i ethylacetat, og efter kort afkøling tilsættes der ether og derpå indtil uklarhed hexan. Blandingen får lov at henstå natten over i et kølerum, hvorpå det udfældede produkt skilles fra sugning og krystalliseres 10 endnu engang på den beskrevne måde.

Udbytte: 37,1 g, smeltepunkt: 149-151°C.

Alternativt kan produktet også fås som beskrevet ovenfor ved katalytisk hydrogenering af oximet på 10% pal-ladium/carbon i ammoniakalsk ethanol og efterfølgende omsæt-15 ning med 9-fluorenylmethylsuccinimidylcarbonat.

Eksempel 20

Fremstilling af Fmoc-amid-harpiks 20 30,7 g aminomethyleret polystyrenharpiks (fyldning 1,04 mmol NH2/g) og 28 g (49,5 mmol) N-(9-fluorenylmethyl-oxycarbonyl) - ((5-carboxylatoethyl-2,4-dimethoxyphenyl) -4 1 -methoxyphenyljmethylamin suspenderes i blanding af 210 ml 25 dimethylformamid og 90 ml dichlormethan. Der tilsættes 6,4 g HOObt og 23 ml diisopropylcarbodiimid, og blandingen omrystes natten over. Derefter er reaktionen bragt til ende, og harpiksen skilles fra ved sugning, vaskes med DMF, DCM og MTB-ether. Efter tørring i højvakuum fås der 46,5 g pro-30 dukt med en fyldning på 0,57 mmol/g (bestemt ved elemen-taranalyse) eller 0,54 mmol/g (bestemt ved testfraspaltning af Fmoc-NH2 °9 kvantificering på HPLC).

35 21 DK 173320 B1

Peptid-syntese

Til peptidsyntesen anvendes der følgende reaktionsskema : 5 Fraspaltning af Fmoc-beskyttelsesgruppen med 20% piperidin i DMF, vaskning med NMP, tilkobling af den efterfølgende Fmoc-aminosyre som HQObt-ester opløst i NMP eller som i DMF eller NMP med diisopropylcarbodiimid in situ foraktiveret HOObt-ester, vaskning med NMP. Denne cyclus gen-10 nemløbes, indtil peptidet er opbygget på harpiksen. Koblings-effektiviteten kan følges ved hjælp af ninhydrin-test.

Eksempel 21 15 pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2

Peptidet syntetiseres på 877 mg af den ovenfor fremstillede harpiks. Fraspaltningen af råpeptidet sker ved hjælp af TFA/ethandithiol/thioanisol (90:5:5) ved stuetempe-20 ratur i løbet af 1 time. Der fås 450 mg råprodukt, som er identisk med en autentisk prøve i HPLC.

FAB-MS (G, TFA): 1182 (Μ + H+)

Eksempel 22 25 H-Leu-Leu-Gln-Gly-Leu-Val-NH2

Peptidet syntetiseres på 877 mg af den ovenfor fremstillede harpiks. Fraspaltningen af råpeptidet sker ved 30 hjælp af TFA/vand (95:5 ved stuetemperatur i løbet af 1 time. Der fås fra 100 mg harpiks 38 mg råprodukt, som er identisk med en autentisk prøve.

FAB-MS (3-NBA): 641 (M + H+) 35

Eksempel 23 22 DK 173320 B1

H-Ile-Pro-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

5 Syntesen af dette peptid sker som beskrevet ovenfor på 877 mg harpiks. Som første aminosyre tilkobles Fmoc-Glu-OtBu. Dette giver efter fraspaltning af harpiksen med 95% TFA/vand peptidet med C-terminal glutamin.

Claims (9)

1. Benzhydrylamin-derivat, kendetegnet ved, at det har den almene formel r2 r3 nn/ γΒ γ9 γ 1 γ2 10 γ7 γ6 γ5 γ4 · hvor Ri betyder C^.g-alkyl, R2 betyder en beskyttelsesgruppe valgt blandt Fmoc, Ddz, Bpoc, Msc, Peoc, Pse og Tse, R3 15 betyder hydrogen eller £^.4-alkyl, Y3, Y2, Y3, Y4, Y^, Y8, Y7, Y8 og Y9 betyder hydrogen, Ci_4-alkyl, C^_4~alkoxy eller -O-(CH2)n-COOH, hvorhos grupperne er ens eller forskellige, idet dog en af grupperne betyder -0-(CH2)n-COOH, eller Y1, Y2, Y5, Y8, Y7, Y8 og Y9 betyder hydrogen, C^_4-alkyl eller 20 C1_4~alkoxy, hvorhos grupperne er ens eller forskellige, Y3 betyder C^.g-alkoxy eller hydrogen, og Y4 betyder -(CH2)n-COOH eller -NH-CO- (CH2) n-COOH, og n er et helt tal fra 1 til 6.

2. Benzhydrylamin-derivat med formlen (I) ifølge 25 krav 1, kendetegnet ved, at R1 betyder methyl, og n er et helt tal 1, 2 eller 3.

3. Benzhydrylamin-derivat med formlen (I) ifølge et eller flere af kravene 1-2, kendetegnet ved, at R3 betyder hydrogen.

4. Benzhydrylamin-derivat med formlen (I) ifølge et eller flere af kravene 1-3, kendetegnet ved, at grupperne Y1-Y9 betyder methyl eller methoxy, hvorved dog én af grupperne betyder -O-(CH2)n-COOH, og mindst fire af grupperne betyder hydrogen, eller grupperne Y1, Y2, Y5-Y9 35 betyder methyl eller methoxy, idet dog mindst fire af disse grupper betyder hydrogen, Y3 betyder methyl og Y4 betyder DK 173320 B1 -(CH2)n-C00H·

5. Benzhydrylamin-derivat med formlen (I) ifølge et eller flere af kravene 1-4, kendetegnet ved, at en af grupperne Y1, Y3, Y5, Y7 og Y8 betyder -O- (CH2)n-COOH.

6. Benzhydrylamin-derivat med formlen (I) ifølge et eller flere af kravene 1-4, kendetegnet ved, at Y4 betyder -(CH2)n-COOH, Y3 betyder Ci_4-alkoxy, og n er 2, eller Y4 betyder -NH-CO-(CH2)n-COOH, Y1 og Y3 betyder meth-oxy, og n er 2.

7. Fremgangsmåde til fremstilling af et benzhydryl amin-derivat med formlen (I) ifølge et eller flere af kravene 1-6, kendetegnet ved, at a) en forbindelse med formlen 15 Xs y9 γΐ y2 (ID

20 V7 Yé yS γΟ hvor R1 betyder C^.g-alkyl, Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, Y8 og Y9 betyder hydrogen, Ci_4-alkyl, Ci_4-alkoxy eller -O-25 (CH2)n-COOH, hvorhos grupperne er ens eller forskellige, idet dog en af grupperne betyder -O-(CH2)n-COOH, eller Y1, Y2, Y®, Y8, Y7, Y8 og Y9 betyder hydrogen, Cj_4-alkyl eller Ci_4-alkoxy, hvorhos grupperne er ens eller forskellige, Y3 betyder Cj.g-alkoxy eller hydrogen, og Y4 betyder -(CH2)n-30 COOH eller -NH-CO- (CH2) n-C00H, og n er et helt tal fra l til 6, omsættes med en forbindelse med formlen R2 R3 \ /

35 N (III) H hvor R2 betyder en beskyttelsesgruppe valgt blandt Fmoc, DK 173320 B1 Ddz, Bpoc, Mse; Peoc, Pse og Tse, og R3 betyder hydrogen eller Ci_4-alkyl, eller b) en forbindelse med formlen 5 γΒ γ9φ γΐ γ2 Rl"0^-^-ø-Y3 (IV) Υ7 Y 6 γ5 γ4 10 omsættes med hydroxylamin til en forbindelse med formlen OH γθ γ9 ^ γΐ γ2 15 κ,'°^ΐ^^Γ^-γ3 w γ7 γ6 γ5 γ4 hvor R1, Υ1, Υ2, Υ3, Υ4, Υ5, γ5, Υ7, Υ8 og Υ9 har den ovenfor 20 anførte betydning, hvorpå oximen reduceres til aminen, aminen eventuelt omdannes til forbindelser med formlen (I), hvor R2 betyder en beskyttelsesgruppe valgt blandt Fmoc, Ddz, Bpoc, Mse, Peoc, Pse og Tse, og R3 betyder hydrogen.