DK171645B1

DK171645B1 - Adenosinderivater samt farmaceutisk præparat

Info

Publication number: DK171645B1
Application number: DK145289A
Authority: DK
Inventors: Michael L Edwards
Original assignee: Merrell Dow Pharma
Priority date: 1988-03-25
Filing date: 1989-03-22
Publication date: 1997-03-03
Also published as: US4996308A; EP0334361A2; PT90080B; FI90877C; DE68922235T2; AU606792B2; FI90877B; HUT49367A; PH26776A; DK145289A; NO891248D0; ES2074060T3; FI891339A0; NO171856B; IE67543B1; JP2829737B2; FI891339A; ATE121415T1; KR0135529B1; EP0334361A3

Description

DK 171645 B1

Opfindelsen angår et adenosinderivat som angivet i krav 1 og et farmaceutisk præparat som angivet i krav 3 indeholdende en effektiv mængde af et sådant derivat.

S-adenosyl-L-methionin (AdoMet)-afhængige transmethy-5 leringsreaktioner er involveret i flere forskellige biologiske processer, der har relation til vækst af virus og replikation af virus, viral omdannelse af celler, vækst af ondartetede celler og processer som kemotaksi og sekretion [se P.M. Ueland, Pharm. Reviews 34, 223 (1982)]. I alminde-10 lighed katalyseres disse transmethyleringsreaktioner af flere forskellige transmethylaser, der udnytter AdoMet som et methyldonor-substrat ved methyleringen af et antal methyl-acceptor-substrater, såsom catecholer, norepinephrin, histamin, serotonin, tryptamin, membranphospholipider, lysyl, 15 arginyl, histidyl, aspartyl, glutamyl og visse proteiners carboxylgrupper, tRNA og mRNA og DNA. Disse forskellige transmethylaser tilvejebringer S-adenosin-L-homocystein (AdoHcy) som et biprodukt ved overførsel af en methylgruppe fra AdoMet til det egnede methylacceptor-substrat.

20 AdoHcy har vist sig at være en virkningsfuld feedback inhibitor af AdoMet-afhængige transmethyleringsreaktioner. Denne feed-back-inhibering af transmethylaserne styres ved bionedbrydningen af AdoHcy ved hjælp af S-adenosyl-L-homocy-steinhydrolase, der tilvejebringer en homeostatisk kontrol 25 af AdoHcy-niveauerne i vævet. S-adenosyl-L-homocysteinhydro-lase-aktiviteten anses i almindeligehed af fagfolk for at spille en vigtig rolle ved reguleringen af niveauerne for AdoHcy i vævet og derved styre aktiviteten af AdoMet afhængige transmethyleringsreaktioner.

30 Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse er inhibitorer af S-adenosyl-L-homocysteinhydrolase. Disse forbindelser inhiberer derfor den naturligt forekommende bionedbrydning af AdeHcy og resulterer i forøgede niveauer af AdoHcy i vævet. Forhøjede niveauer af AdoHcy tilvejebring-35 er igen en endogen feed-back-inhibering af forskellige AdoMet -afhængige transmethyleringsreaktioner, som er forbundne DK 171645 B1 2 med biologiske processer, der har relation til virusvækst og -replikation, viral transformation af celler, vækst af ondartede celler og processer såsom chemotaxi og sekretion. Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse er 5 derfor anvendelige som inhibitorer af disse biologiske processer, og de er anvendelige ved en slutanvendelse som terapeutiske midler ved behandlingen af patienter, der lider af forskellige pathologiske tilstande, i hvilke disse processer er involverede, såsom virusinfektioner og neoplastiske syg-10 domstilstande. De her omhandlede forbindelsers kvantitative virkning og deres uventede virkning i forhold til strukturelt meget nært beslægtede forbindelser fremgår af de følgende data:

De nedenfor angivne forbindelser ifølge opfindelsen 15 er blevet afprøvet til bestemmelse af deres S-adenosyl-L-ho-mocystein-hydrolase (SAH-hydrolase)-inhiberende aktivitet og deres antivirale virkning.

Kinetiske data, der viser inhiberingen af SAH-hydrolase, er indsamlet for de følgende forbindelser. Kj og 2 0 kinakt beregnes for forbindelserne 1 og 2, der begge ud viser tidsafhængig inhibering.

Rottelever-SAH-hydrolase-assay: SAH-hydrolase renses fra rottelever i det væsentlige som beskrevet af Fujioka og Taketa (J .Biol. Chem. 256. 1631 (1981)) og bestemmes i den 25 hydrolytiske retning ved kontinuerlig overvågning i nærværelse af substrat og inhibitor. Dannelsen af L-homocystein følges spektrofotometrisk i det væsentlige ved metoden ifølge Wolfson et al. (J.Biol.Chem. 261. 4492 (1986)). For tidsafhængige inhibitorer tilpasses fremadskridende kurver til 3 0 eksponentialer, og pseudo - første ordens konstanterne (k^g) bestemmes ved forskellige inhibitorkoncentrationer. Kj og kinakt. f^s U(^ fra en afsætning af l/k0]-,s vs. 1/[inhibitor] .

35 DK 171645 B1 3

Kinetiske konstanter for SAH-hydrolase-inhibering

Forbindelse Tidsafhængig Rottelever- Rottelever- inhibering SAH-hydrolase SAH-hydrolase3 5 Kj (μΜ) ^inakt.

(min._1) 10 1 Ja 8,4 0,7 2 Ja 0,1 0,1 3 Bestemt i den hydrolytiske retning.

15 Forbindelse 1 = 9-[5',5’,6',6'-tetradehydro-5',6’-dideoxy- -β-D-ribohexofuranosyl)-9H-purin-6-amin. Forbindelse 2 = 9-(β-D-ribofuranylnitril)-9H-purin-6-amin.

Antiviral virkning bedømmes ved plaque-reduktionsassay 20 under anvendelse af DNA-virus vaccinia. Den minimale inhi-berende koncentration til en 50%'s reduktion af plaquedan-nelse (IC50) i nærværelse af vaccinia-virus bestemmes.

Plaque-assays udføres i VERO-celler. Ved bestemmelsen aspireres mediet fra hvert celle-monolag, og 0,2 ml virus, 25 fortyndet i vedligeholdelsesmedium til at give 20-80 plaque--dannende enheder (PFU), får lov at adsorbere i 60-80 minutter ved 37°C i en fugtiggjort C02-inkubator. Herefter aspireres overskuddet af virus, og hvert monolag vaskes én gang med 1,0 ml vedligeholdelsesmedium. Hvert VERO-celle-monolag 30 modtager derpå 2 ml overlejring fremstillet ved blanding af lige dele 2x testforbindelse i agarfrit plaque-medium og plaque-medium sammensat af EMEM suppleret med 50 μg/ml penicillin G, 50 μg/ml streptomycin-sulfat, 100 μg/ml neomycin-sulfat (1% PSN, GIBCO), 1,5% HIFCS, 0,002% DEAE-dextran, 30 35 nM MgCl2 og 0,7% Ionagar (Oxoid USA, Inc., Columbia, MO) . IC50 for testforbindelse 1 (se ovenfor) bestemmes til 0,05 μΜ sammenlignet med 76,6 μΜ for virazol (Ι-β-D-ribofurano-syl-1,2,4-triazol-3-carboxamid).

Fra Biochim. et Biophys. Acta 829. 150-155 (1985), 40 jf. C.A. 103, 67293m (1985), er det kendt, at den til forbindelse 2 (se ovenfor) svarende cyanomethyl-forbindelse har DK 171645 B1 4 en Kj-værdi for hamsterlever-SAH-hydrolase på 5 μΜ (medens forbindelse 2, som det fremgår af det ovenstående har en Kj-værdi for rottelever-SAH-hydrolase på kun 0,1). Det er hermed sandsynliggjort, at cyanoforbindelsen er uventet 5 mere virksom end den tilsvarende, kendte cyanomethylforbin-delse.

Den foreliggende opfindelse angår således hidtil ukendte adenosinderivater, der er anvendelige som inhibitorer af S-adenosyl-L-homocysteinhydrolase, og som kan anvendes 10 som antivirus- og anti-neoplastiske midler.

Adenosinderivatet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det har formlen kh2 15 1

Nn'n HC I (I)

Ri „ x A

^ 0 ^ n sy

20 ^\J N

\H 3 / H \| /

— ' H

OH OH

25 i hvilken R1 betyder ethynyl eller cyano, eller er et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

Opfindelsen angår således 9-(5',5',61,6’-tetradehydro-5',6'-dideoxy-S-D-ribohexofura-30 nosyl)-9-H-purin-6-amin eller 9-(β-D-ribofuranylnitril)-9-H-purin-6-amin eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

Opfindelsen angår også et farmaceutisk præparat, der er ejendommeligt ved, at det indeholder en effektiv mængde 35 af en forbindelse ifølge opfindelsen.

Til inhibering af Ado-Met-afhængig transmethylerings- DK 171645 B1 5 aktivitet hos en patient med behov derfor indgives der således en effektiv inhibitorisk mængde af en forbindelse med formlen (I) eller et salt deraf.

Adenosinderivaterne med formlen (I) kan fremstilles 5 ved at anvende fremgangsmåder og teknikker, der er kendte af fagfolk.

En syntesemetode til fremstilling af en forbindelse med formlen (I) , hvor betyder ethynyl, er vist i reaktionsskema A. I det følgende reaktionsskema er alle sub-10 stituenter, med mindre andet er anført, defineret som tidligere .

Reaktionsskema A 15 HC I HC II , oh OH trin a qb 0b (II) (III> 25 O HC i 30 -► B X_ft - trin b trin c

OB 0B

(IV) 35 DK 171645 B1 6

Reaktionsskema A, fortsat nh2b , N /k * n HC i

5 (H)(C1)C-CH o \K ^ NH2B

' /'Λ HC=C \ l Λ OB 0B \ ^ ° \ N \ S'

-OB 0B

(V) trin d (VI) 15 nh2

HC I

^ HC=C 0 -k ^ -► trin e \ ^ \ n trin f

OB 0B

(VII) 25 nh2 M.

OH OH

35 (VIII) (=1) DK 171645 B1 7

Ved trin a blokeres reaktive hydroxy- og aminogrupper andre end 51-hydroxygruppen i det egnede udgangsmateriale med formlen (II) med standard-blokeringsmidler, der er kendte af fagfolk. Disse blokeringsgrupper er konventionelle amino-5 beskyttelsesgrupper og konventionelle hydroxybeskyttelses-grupper. OB og NH2B i reaktionsskema A betyder en hydroxy-resp. aminogruppe, der er blokeret med en blokeringsgruppe, hvor det er passende.

Udvælgelsen og anvendelsen af særlige blokeringsgrup-10 per er kendte af fagfolk. I almindelighed bør sådanne blokeringsgrupper vælges, der beskytter de aktuelle amino- eller hydroxygrupper passende ved de efterfølgende syntesetrin, og som let kan fjernes under betingelser, der ikke forårsager nedbrydning af det ønskede produkt.

IB Eksempler på egnede hydroxybeskyttelsesgrupper er C]_-

Cg alkyl, tetrahydropyranyl, methoxymethyl, methoxyethoxy-methyl, tert.-butyl, benzyl og triphenylmethyl. Betegnelsen Ci-Cg alkyl betyder en mættet carbonhydridgruppe med 1 til 6 carbonatomer, og som har ligekædet, forgrenet eller cyklisk 20 konfiguration. De foretrukne blokeringsgrupper for hydroxygrupper omfatter 2', 3'-O-isopropyliden (der er dannet ved omsætning af den ikke-blokerede forbindelse med acetone) og alkoxymethyliden (der er dannet ved omsætning af den ikke-blokerede forbindelse med trialkylorthoformiat).

25 Eksempler på egnede aminobeskyttelsesgrupper er ben zoyl, formyl, acetyl, trifluoroacetyl, phthalyl, tosyl, benzensulfonyl, benzyloxycarbonyl, substitueret benzyloxy-carbonyl (f.eks. p-chlor, p-brom, p-nitro, p-methoxy, o-chlor, 2,4-dichlor- og 2,6-dichlorderivater) , tert.-butyloxy-30 carbonyl (Boc), tert.-amyloxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, 2- (p-biphenyl) -isopropyloxycarbonyl, allyloxycarbonyl, cyclo-pentyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl, adamantyloxycar-bonyl, phenylthiocarbonyl og triphenymethyl. Den foretrukne aminobeskyttelsesgruppe er det di-benzoylderivat, der er 35 fremstillet ved at omsætte den ikke-blokerede forbindelse med benzoylchlorid.

DK 171645 Bl 8 I trin b oxideres det passende blokerede 5' -hydroxyde-rivat (III) til det tilsvarende aldehyd (IV). Det foretrukne oxidationsmiddel er dicyclohexylcarbodiimid, methylphosphon-syre eller dichloreddikesyre og dimethylsulfoxid.

5 Aldehydet (IV) kan eventuelt derivatiseres således, at anvendelseskarakteristika for forbindelsen forbedres, eller således at oprensningen deraf gøres lettere ved hjælp af fremgangsmåder og teknikker, der er kendte af fagfolk.

F.eks. kan 5',5(N,N1-diphenylethylendiamino)-derivatet 10 fremstilles ved hjælp af den fremgangsmåde, der er beskrevet af Ranganathan et al. [J. Org. Chem. 39., 290 (1974)] .

I trin c dannes vinylchloridderivatet (V) ved at omsætte det tilsvarende aldehyd (IV) med chlormethyltriphe-nylphosphoniumchlorid eller et lignende alkyleringsmiddel.

15 Chlormethyltriphenylphosphoniumchlorid foretrækkes.

I trin d dehydrohalogeneres vinylchloridderivatet (V) til dannelse af et ethynylderivat (VI). Det foretrukne middel til at udvirke dehydrohalogeneringen er lithiumdiisopropyl-amid.

20 I trin e fjernes aminobeskyttelsesgruppen under anvendelse af fremgangsmåder og teknikker, der er kendte af fagfolk. F.eks. kan benzoylaminoblokeringsgrupper fjernes ved hydrolyse med ammoniak.

I trin f fjernes hydroxybeskyttelsesgrupperne efter 25 gængse fremgangsmåder og teknikker, der er kendte af fagfolk. F.eks. kan 2', 3'-O-isopropylidenblokeringsgruppen fjernes ved at omsætte forbindelsen med formlen (VII) med vandig trifluoreddikesyre.

Udgangsmaterialet, der kan anvendes ved den syntese-30 fremgangsmåde, der er skitseret i reaktionsskema A, er let tilgængeligt for fagfolk.

Det følgende eksempel viser en typisk syntese som illustreret i reaktionsskema A.

DK 171645 B1 9

Eksempel 1 9-(51.5'.6' .6'-Tetradehvdro-51 . 6 1-dideoxv-S-D-ribo-hexofuranosvl)-9-H-Purin-6-Amin 5 Trin a: N^-benzovl-2'.31-O-isopropvliden-adenosin.

Adenosin omdannes til dets 2',3'-acetonid, hvorefter der benzoyleres til -benzoylderivatet ifølge den fremgangsmåde, der er beskrevet af Smrt et al. [Coll. Czech. Chem. Comm. 29, 224 (1964)].

10 Trin b: N-ii.N^-Bisbenzovl-5 1-deoxv-2 1 . 3 1-O-isopropvliden- 5'-.51 -(N.N1-diphenvlethvlendiamino)adenosin.

N6-benzoyl- 2' ,3 ' -0-isopropylidenadenosin omdannes til Ns-benzoyl-5'-deoxy-2',3',-0-isopropyliden-5',51 -(Ν,Ν1-diphenylethylendiamino)adenosin efter den fremgangsmåde, 15 der er beskrevet af Ranganathan et al. [J.Org.Chem. 3.9, 2 90 (1974)] . Til 2,96 g af dette produkt i 10 ml pyridin, der er afkølet i et isbad, sættes 1,15 ml (9,9 mmol) benzoyl-chlorid. Blandingen omrøres natten over ved stuetemperatur, hvorefter den hældes over i isvand. Herefter extraheres 20 produktet i 100 ml chloroform, hvorefter der tørres med magnesiumsulfat. Opløsningen inddampes herefter på en rotationsfordamper, hvorefter der tilsættes toluen. Inddampning-en gentages under vakuum, hvorefter der opsamles 4,07 g af et gult skum. Produktet tillades herefter at trænge igennem 25 en 40 mm x 10 mm flash-silikagelkolonne med 4% ethyl acetat/96% dichlormethan. De egnede fraktioner samles og inddampes, hvorefter der opsamles en gul olie. Olien opløses i ethanol og inddampes 3 gange, hvorved fås et fast stof. Herefter tritureres det faste stof med 50 ml ethanol, hvoref-30 ter der filtreres. Det faste stof tørres under vakuum, hvorved fås 2,67 g af titelforbindelsen (smp. 135-138 °C) .

NMR (CDC13, 90 MHz): δ1,30 (3H, S), 1,50 (3H, S), 3,3-3,7 (4H, m), 4,55 (IH, m), 5,1 (2H, d, J = 2), 5,65 (IH, d, J = 35 2), 6,1 (IH, S), 6,3-7,8 (21H, M), 8,40 (IH, S).

DK 171645 B1 10

Trin b fortsat: n£. ité-Bis benzovl-2 ' . 3 ' -0-isopropvliden- adenosin-5'-aldehyd.

Til 2,64 g (3,73 mmol) N6,N6-Bisbenzoyl-51-deoxy-2 ' , 3 ' -O-isopropyliden-5 1 - , 5 ' - (N,N' -diphenylethylendiamino) a-5 denosin i 370 ml dichlormethan ved 0°C sættes en opløsning af 1,56 g (8,2 mmol) p-toluensulfonsyre-monohydrat i 180 ml acetone. Herefter omrøres blandingen i 1,5 time, hvorefter der filtreres. Filtratet inddampes på en rotationsfordamper og remanensen fordeles mellem 200 ml dichlormethan og vand.

10 Dichlormethanopløsningen tørres med magnesiumsulfat og inddampes til dannelse af et skum. 2,10 g af dette skum opløses i 200 ml benzen, hvorefter der tilbagesvales i et Dean-Stark-apparat i én time. Herefter inddampes opløsningsmidlet hvorved fås 2,06 g af titelforbindelsen (NMR-spektra viser, at 15 mere end 80% af produktet forekommer som aldehyd).

NMR (CDC13, 90 MHz): δ 1,40 (3H, S), 1,70 (3H, S), 4,65 (IH, m) , 5,3 (IH, d, J = 7) , 5,45 (IH, bred d, J = 7) , 6,2 (IH, S), 7,2-7,8 (10H, m), 8,10 (IH, S), 8,45 (hovedtop) og 8,55 20 (IH sammen, 2 S), 9,3 (IH, S, CHO).

Trin c: N^·, N^-Bisbenzovl-2'3 '-O-isopropvliden-9-(6 1-chlor- 5 ' , 6 1 -dideoxv-iS-D-ribohex-5 ' -enofuranosvl) -9-H-purin-6-amin.

Til en opløsning af 20 mmol lithiumdiisopropylamid 25 i 500 ml tetrahydrofuran (THF) , der er blevet afkølet til - 300C, sættes 6,8 g (20 mmol) chlormethyltriphenylphosphoni-umchlorid. Blandingen tillades at opvarme til 0°C og holdes ved denne temperatur i 1 time. Herefter afkøles opløsningen til -70°C, og der tilsættes dråbevis 6,5 g (13 mmol) af en 30 opløsning af N6, N6-Bisbenzoyl-21,3'-O-isopropyliden-adeno-sin-5 '-aldehyd i 100 ml THF. Herefter omrøres reaktionsblandingen ved -70°C i 2 timer, hvorefter blandingen hældes over i vand/dichlormetan. Det organiske lag skilles fra og tørres med vandfri magnesiumsulfat, hvorefter der inddampes til 35 tørhed. Remanensen chromatograferes på en silicagel-flash kolonne, idet der elueres med hexan/ethylacetat (1,5/1), DK 171645 B1 11 hvorved fås 4,1 g af titelforbindelsen som et hvidt skum.

MS : (Cl) MH+ = 546

Analyse: Beregnet for C28H24clN5°5*1/3 CH3C(0)OC2H5 : C

5 64,14, H 4,68, N 12,17

Fundet: C 61,35, H 4,62, N 12,25.

Trin d: N-£,N-^-Bisbenzovl-9-(5 1 , 5 1 . 6 1 , 6 '-tetradehvdro-5 1 . 6 1 -dideoxv-2 1 3 1 -0-isopropvliden-B-D-ribohexofuranosvl) -9-H-10 purin-6-amin,

Til en opløsning af 8 mmol lithiumdiisopro-pylamid i 120 ml THF, der er afkølet til -70°C, sættes dråbevis en opløsning af N6,N6-bisbenzoyl-2131-O-isopropyliden-9-(6'-chlor-5',6'-dideoxy-fé-D-ribohex-5'-enofuranosyl)-9-H-15 purin-6-amin i 15 ml THF. Reaktionsblandingen oprøres ved -70°C i 2 timer. Blandingen hældes herefter over i vand, og den vandige blanding extraheres med dichlormethan. De organiske extrakter samles og tørres over vandfrit MgSO^j, hvorefter det organiske opløsningsmiddel inddampes til tørhed.

20 Remanensen chromatograferes på en silicagelflash kolonne, idet der elueres med hexan/ethylacetat (2/1), hvorved får 0,8 g af titelforbindelsen som et skum.

MS: (Cl) MH+ = 510 25

Trin e: 9-(51.5'.6'.61-tetradehvdro-51,61-dideoxv-2131-0- isopropvliden-β-Ρ-ribo-hexofuranosvi)-9-H-purin-6-amin.

En blanding af 800 mg (1,6 mmol) N6,N^-bisbenzoyl-9- (5' ,5' ,6' ,6' -t et rade hydro-5 ' , 6 ' -dideoxy-2'3 ' -O-isopropyl i-30 den-S-D-ribohexofuranosyl)-9-H-purin-6-amin i 10 ml methanol og 10 ml koncentreret vandig ammoniak omrøres natten over ved omgivelsernes temperatur. Blandingen inddampes, og remansen chromatograferes på silicagel-flashkolonne idet der elueres med ethylacetat. Omkrystallisation af den oprensede titelfor-35 bindelse ud fra hexan/ethylacetat giver 170 mg af et hvidt fast stof med et smeltepunkt på 210-211°C.

DK 171645 B1 12

Analyse: Beregnet for C14H15N505 : C 55,81, H 5,02, N 23,24

Fundet: C 55,65, H 5,03, N 22,98.

MS : (Cl) MH+ = 302 5

Trin f: 9-(5^5^6^61 - tetradehvdro-5 1 . 6 ' -dideoxv-E-D-ribohe-xof uranosvl).- 9 - H-purin- 6 -amin

En opløsning af 270 mg 9-(5 ',5',6',6’-tetradehydro-5 ' , 6 1 -dideoxy-2 ' , 3 ' -0-isopropyliden-15-D-ribo-hexofuranosyl) -10 9-H-purin-6-amin i vand/myresyre (30 ml hver) opvarmes i et 50°C varmt oliebad under en nitrogenatmosfære i 2 timer. Blandingen inddampes, og remanensen omkrystalliseres ud fra methanol, hvorved fås 122 mg af titelforbindelsen som et hvidt fast stof med et smeltepunkt på 213-214°C.

15

Analyse: Beregnet for C11H11N503 · 3/4 H20: C 48,08, H

4,58, N 25,49

Fundet: C 48,43, H 4,52, N 25,12.

MS : (Cl) MH+ = 262 20

Adenosinderivater med formlen I, hvori R]_ betyder cyano, kan fremstilles efter konventionelle fremgangsmåder og teknikker, der er kendte af fagfolk. En syntesefremgangsmåde er vist i reaktionsskema B.

25 30 35 DK 171645 Bl 13

Reaktionsskema B

nh-B nh b I 2 2 5 0 HC I φΟΗ2θ- n HC i

U 0 " II

H 'S*1 H I* ^

I· trin a II

OB 0B OB 0B

10 (IV) (IX)

NH B

15 L

# ^TT ^ N

HC I

-^ Ah r/ -► trin b η N ......V h trin c 20 1 ‘

O8 0B

(X)

25 NH

2 NH2

’VS' ^ J

“ -Ώ _. .*Qi ' oB oB trin d

^ u OH OH

(XI) (XII) 35 DK 171645 B1 14 I trin a omdannes det aldehydderivat med formlen (IV), i hvilket amino- og hydroxygrupperne er blevet blokerede på en måde, der er analog med den, der er vist i reaktionsskema A, til det tilsvarende oximderivat (IX) . Det 5 foretrukne reagens til denne omsætning er O-benzylhydroxyl-amin, hvilket resulterer i, at O-benzyloxim dannes. Aldehydderivatet (IV) kan alternativt omdannes til den frie oxim ved omsætning med hydroxylamin-hydrochlorid.

Oximderivatet (IX) omdannes herefter til cyanoderiva-10 tet (X) i trin b ved omsætning med en egnet base, såsom lithiumdiisopropylamid. Når der anvendes den frie oxim, er det foretrukne reagens tosylchlorid i en egnet base.

I trinene c og d kan amino- og hydroxyblokerings-grupperne fjernes på en måde, der er analog med den, der er 15 beskrevet i reaktionsskema A (trinene e og f).

Alternativt kan adenosinderivaterne med formlen (I), hvori betyder cyano, fremstilles ved at omdanne den egnede 5'-syre eller tilsvarende ester (hvori de reaktive hydroxy-og aminogrupper er blokerede som beskrevet i reaktionsskema 20 A (trin a)) til 5'-carboxamidet ved hjælp af fremgangsmåder, der er kendte af fagfolk. Dette 5'-carboxamid kan herefter dehydratiseres til det ønskede nitril under anvendelse af flere forskellige reagenser, såsom phosphorpentoxid, phos-phorylchlorid/pyridin eller trichlormethylchlorformiat.

25 Blokeringsgrupperne kan herefter fjernes som beskrevet i reaktionsskema A (trinene e og f).

De følgende eksempler frembyder en typisk syntese, som den er beskrevet i reaktionsskema B.

30 Eksempel 2 9-(β-D-ribofuranvlnitril)-9-H-purin-6-amin

Trin a: N&, N—-Bisbenzovl-5 1 -deoxv-2 1 , 3 1 -O-isopropyliden-adenosin-51-carboxaldehvd-O-benzvloxim 35 -Bisbenzoyl-2 ' , 3 1 -O-isopropyliden-adenosin-5 1 - aldehyd fremstilles som det er beskrevet i eksempel 1. 2,6 DK 171645 B1 15 g (3,7 mmol) af adenosinaldehydderivatet bringes sammen med 0,85 g (4 mmol) O-benzylhydroxylamin i 50 ml ethanol, og der opvarmes ved 60°C i et oliebad, indtil reaktionen er fuldstændig. Herefter inddampes reaktionsblandingen, hvoref-5 ter remanensen chromatograferes på en flash-silikagelkolonne, idet den elueres med ethylacetat/hexan, hvorved fås titelforbindelsen som et skum.

Trin b: N·^·,N—-Bisbenzovl-9 - (2 1 . 3 1 -O-isopropvliden-fé-D-ribo-10 furanvlnitril)-9-H-Purin-6-amin 618 mg (1 mmol) N6,N6-Bisbenzoyl-5'-deoxy-2',3'-0-isopropyliden-adenosin-51-carboxaldehyd-O-benzyloxim sættes til en opløsning af 2 mmol lithiumdiisopropylamid i 25 ml THF, der er afkølet til -70°C. Reaktionsblandingen omrøres 15 ved -70°C indtil reaktionen er fuldstændig, hvilket ses ved hjælp af tyndtlagschromotografi. Blandingen hældes herefter over i vand/dichlormethan, hvorefter lagene tillades at skille. Det organiske lag tørres over vandfrit magnesiumsulfat, hvorefter det inddampes til tørhed. Remanensen chro-20 motografes på en flash-silikagelkolonne, idet der elueres med ethylacetat/hexan, hvorved fås titelforbindelsen som et skum.

Trin c og d: 9-(fS-D-Ribofuranvlnitril)-9-H-purin-6-amin 25 Herefter afblokeres N^,N®-Bisbenzoyl-9-(21,31-O-iso- propyliden-E-D-ribofuranylnitril) -9-H-purin-6-aminen som det er beskrevet i trinene e og f i eksempel 1, hvorved fås titelforbindelsen. Produktet omkrystalliseres ud fra methanol og har smeltepunkt 209,5-211°C.

30

En alternativ fremgangsmåde til fremstilling af adeno-sinderivater med formlen (I) er anført i reaktionsskema D.

Ved denne metode anvendes separat fremstilling af adenosyl-basen og ribosyldelene, hvorefter en kondensation af delene 35 finder sted.

DK 171645 B1 16

Reaktionsskema D

HC — C OCH3 HC= C

OB 0B OH OH

(XV) (XVI) 10 HC — C 0 ^ B/)y5roAc

trin b OAc 0B

15 (XVII)

B

NH2 hc || J

20 HC-C Ov I N

(XVII)+ I N --h N—f

H trin c OAc 0B

(XVIII) 25 (VI)

Acetylen-ribosylderivater (XV) fremstilles efter standardteknikker og -fremgangsmåder, der er kendte af fagfolk. F.eks. kan disse forbindelser fremstilles ud fra egnede ribosylderivater ved hjælp af metoder, der er analoge med 30 de, der er beskrevet i reaktionsskema A. Egnede udgangsmaterialer er let tilgængelige.

Disse derivater (XV) hydrolyseres i trin a under anvendelse af en syre, såsom eddikesyre. Det hydrolyserede derivat (XVI) omdannes herefter til den tilsvarende eddike-35 syreester (XVII) i trin b ved omsætning med eddikesyrean-hydrid i pyridin.

DK 171645 B1 17

Fremgangsmåder til fremstilling af adeninderivater (XVIII) involverer også standardteknikker og -fremgangsmåder, hvilke er kendte af fagfolk.

Eddikesyreesteren (XVII) kan herefter kondenseres 5 med et egnet adeninderivat (XVIII) ved en fusionsreaktion eller ved en kondensationsreaktion i nærværelse af bis-trime-thylsilylacetamid og en Lewis-syre, såsom trimethylsilsyltri-fluormethansulfonat.

Det kondenserede produkt (VI) kan herefter afblokeres 10 ved hydrolyse som beskrevet i reaktionsskema A (trinene e og f) .

Forbindelser med formlen (I) , hvori R-^ betyder cyano, kan også fremstilles efter metoder, der er analoge med de, der er beskrevet i reaktionsskema D.

15 De hertil nødvendige udgangsmaterialer kan fremstilles ved hjælp af metoder, der er analoge med de, der er beskrevet ovenfor samt andre konventionelle metoder, der er kendte af fagfolk.

Man kan inhibere af AdoMet-afhængig transmethyler-20 ingsaktivitet hos en patient med behov herfor ved indgivelse af en forbindelse med formlen (I) i en effektiv inhiberende mængde. Betegnelsen "effektiv inhiberende mægnde" betyder en mængde, der er tilstrækkelig til at inhibere AdoMet-afhæn-gig transmethyleringsaktivitet efter en enkelt eller flere 25 indgivelser af en dosis.

Som anvendt her betyder betegnelsen patient et varmblodet dyr, såsom et pattedyr, der lider af en særlig sygdomstilstand. Det skal forstås, at hunde, katte, rotter, mus, heste, kvæg, får og mennesker er eksempler på dyr inden-30 for rammen af betegnelsens betydning.

Forbindelserne med formlen (I) menes at udøve deres inhiberende virkning på AdoMet-afhængig transmethylering ved at inhibere AdoHcy-hydrolase, hvorved der tilvejebringes en forøgelse af niveauerne for AdoHcy i vævet, hvilket igen 35 tilvejebringer feedback-inhibering af AdoMet-afhængig transmethylering. Det skal imidlertid forstås, at den foreliggende DK 171645 B1 18 opfindelse ikke er begrænset af nogen speciel teori eller foreslået mekanisme, der skal forklare dens effektivitet ved en slutanvendelse.

Som kendt af fagfolk er forskellige sygdomstilstande, 5 såsom visse neoplastiske sygdomstilstande og virusinfektioner, karakteriserede ved en usædvanlig stor AdoMet-afhængig transmethyleringsaktivitet. Som anvendt her betyder betegnelsen "udsædvanlig stor" et niveau, der tillader en fremad-skriden af sygdomstilstanden.

10 Mere specifikt tilvejebringer den foreliggende opfind else mulighed for at behandle en patient, der lider af en neoplastisk sygdomstilstand, der er karakteriseret ved en udsædvanlig stor AdoMet-afhængig transmethyleringsaktivitet, idet patienten får indgivet en effektiv antineoplastisk 15 mængde af en forbindelse med formlen (I). Betegnelsen "neoplastisk sygdomstilstand", som den anvendes her, betyder en anormal tilstand, der er karakteriseret ved en hurtig formerende cellevækst eller neoplasma. Neoplastiske sygdomstilstande, der er karakteriserede ved en usædvanlig stor AdoMet-20 afhængig transmethyleringsaktivitet, og hvor behandling med en forbindelse med formlen (I) vil være særlig anvendelig, omfatter: Leukæmier, såsom, men ikke begrænset til akut lymphoblastisk, kronisk lymphocytisk, akut myloblastisk og kronisk mylocytisk; carcinomaer, såsom men ikke begrænset 25 til de i cervix, oesophagus, maven, tyndtarmen, colon og lunger; sarcomaer, såsom men ikke begrænset til oesteoma, osteosarcoma, lipoma, liposarcoma, hemangioma og hemangiosar-coma; melanomaer, herunder amelanotisk og melanotisk, og blandede typer af neoplasier, såsom, men ikke begrænset til 30 carcinosarcoma, lymphoid vævstype, folicullar reticulum, cellesarcoma og Hodgkin's sygdom.

En effektiv antineoplastisk mængde af en forbindelse med formlen (I) betyder en mængde, der effektivt styrer væksten af en neoplasma eller forlænger overlevelsestiden for 3 5 patienten udover hvad man skulle forvente, når en sådan behandling udelades, ved indgivelse af en enkelt eller flere DK 171645 B1 19 doser. Som anvendt her betyder "styring af væksten" af en neoplasma, at væksten og metastaser sænkes, afbrydes, bremses eller stoppes, og betyder ikke nødvendigvis en fuldstændig elimination af neoplasmaen.

5 Desuden muliggør den foreliggende opfindelse behand ling af patienter, der lider af en virusinfektion, som er karakteriseret ved en usædvanlig stor AdoMet-afhængig trans -methyleringsaktivitet, idet der indgives en effektiv antiviral mængde af en forbindelse med formlen (I). Betegnelsen 10 "virusinfektion", som den anvendes her, betyder en anormal tilstand, der er karakteriseret ved viral omdannelse af celler, replikation af virus og formering. Virusinfektioner, der er karakteriserede ved en usædvanlig stor AdoMet-afhængig transmethyleringsaktivitet, og hvor behandling med en forbin-15 delse med formlen (I) eller (la) vil være særlig anvendelig, omfatter: Retrovira, såsom men ikke begrænset til HTLV-I, HTLV-II, vira, der forårsager human immundefekt, HTLV-III (AIDS-virus), og lignende; RNA-vira, såsom, men ikke begrænset til influenza A, B og C, fåresyge, mæslinger, rhinovirus, 20 dengue-feber, rubella, rabies, hepatitis virus A, encephalitis virus; DNA-vira, såsom, men ikke begrænset til herpes, vaccinia, pappiloma virus (vorte), hepatitis virus B.

En effektiv antiviral mængde af forbindelse med formlen (I) betyder en mængde, der effektivt styrer virus. Denne 25 styring af virus betyder at sænke, afbryde, bremse eller stoppe den virale omdannelse af celler eller replikationen og formeringen af viruset og betyder ikke nødvendigvis en total eliminering af virus.

En effektiv dosis kan let bestemmes af den læge, der 30 behandler patienten, samt af fagfolk ved anvendelse af konventionelle teknikker og ved at observere resultater, der er opnået under analoge omstændigheder. Ved bestemmelse af den effektive dosis tages et antal faktorer med i betragtning af den udøvende læge, herunder men ikke begrænset til: typen 35 af pattedyr, dets størrelse, alder og almene sundhedstilstand, den specifikke sygdom, der er involveret, graden af DK 171645 B1 20 eller involveringen af eller alvoren af sygdommen, den enkelte patients reaktion, den særlige forbindelse, der indgives, indgivelsesvejen, biotilgængelighedskarakteristiska for det præparat, der indgives, den valgte dosisbehandling, 5 anvendelsen af ledsagende medicin og andre relevante omstændigheder.

Effektive antineoplastiske og antivirale mængder af en forbindelse med formlen (I) forventes at variere fra ca.

0,1 mg pr. kg. kropsvægt pr. dag (mg/kg/dag) til ca. 100 10 mg/kg/dag. Foretrukne mængder forventes at variere fra ca.

0,5 til ca. 10 mg/kg/dag.

Den foreliggende opfindelse muliggør behandling af en patient, der lider af en neoplastisk sygdomstilstand eller en virusinfektion, idet man indgiver en effektiv antineoplas-15 tisk eller antiviral mængde af en forbindelse med formlen (I), ved behandling sammen med et effektiv inhiberende mængde af en adenosin-deaminase (ADA)- inhibitor. Betegnelsen "behandling sammen med" betyder indgivelse af (I) sammen med en ADA-inhibitor på i det væsentlige samme tid eller behand-20 ling af en patient med en ADA-inhibitor før eller efter behandlingen med en forbindelse med formlen (I). En effektiv inhiberende mængde af en ADA-inhibitor er en mængde, der effektivt signifikant inhiberer ADA i patienten.

ADA deaminerer forbindelser med formlen (I) og nedbry-25 der derved de aktive forbindelser til relativt inaktive metaboliter. Når en forbindelse med formlen (I) og en ADA-inhibitor indgives sammen ved behandling, vil dosen være mindre i mængde eller i indgivelsesfrekvens end den, der er nødvendig, når en forbindelse med formlen (I) indgives alene.

30 Forskellige farmaceutisk acceptable ikke-toxiske ADA-inhibitorer kan anvendes, herunder men ikke begrænset til deoxycoformycin. En effektiv inhiberende mængde af ADA-inhibitoren varierer fra ca. 0,05 mg/kg/dag til 0,5 mg/kg/dag og er fortrinsvis fra ca. 0,1 mg/kg/dag til ca. 0,3 mg/kg/-35 dag. Deoxycoformycin er den foretrukne ADA-inhibitor til anvendelse ved behandling sammen med forbindelser med form- DK 171645 B1 21 len (I).

Ved udførelsen af en behandling af en patient, der lider af en sygdomstilstand som ovenfor beskrevet, kan en forbindelse med formlen (I) indgives på en hvilken som helst 5 form eller måde, der gør forbindelsen biotilgængelig i effektive mængder, herunder ad orale og parenterale veje. F.eks. kan forbindelserne med formlen (I) indgives oralt, subkutant, intramuskulært, intravenøst, transdermalt, intranasalt eller rectalt. I almindelighed foretrækkes oral indgivelse. Fagfolk 10 indenfor fremstilling af præparater kan let vælge den egnede form og indgivelsesmåde afhængig af de særlige karakteristika for den valgte forbindelse, den sygdomstilstand, der skal behandles, sygdomsniveauet og andre relevante omstændigheder.

15 Forbindelserne kan indgives alene eller i form af et farmaceutisk præparat sammen med farmaceutisk acceptable bærestoffer eller excipienser, hvor mængden og naturen af disse er bestemt af den valgte forbindelses opløselighed og kemiske egenskaber, den valgte indgivelsesvej og farmaceu-20 tisk standardpraksis. Desuden kan forbindelserne mod formlen (I) yderligere indgives som ovenfor i kombination med en ADA-inhibitor. Forbindelserne ifølge opfindelsen kan, skønt de i sig selv er effektive, formuleres og indgives i form af deres farmaceutisk acceptable syreadditionsalte på grund 25 af stabiliteten, mere bekvem krystallisation, forøget opløselighed og lignende.

Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der et farmaceutisk præparat, der indeholder en effektiv mængde af en forbindelse med formlen (I). Præparatet ifølge opfin-30 delsen kan yderligere indeholde en effektiv ADA-inhiberende mængde af en ADA-inhibitor i blanding eller på anden måde sammen med et eller flere farmaceutisk acceptable bærestoffer eller excipienser. Betegnelsen "effektive mængder", som den anvendes på forbindelserne med formlen (I), betyder effek-35 tive inhiberende, antineoplastiske eller antivirale mængder.

De farmaceutiske præparater fremstilles på en af DK 171645 B1 22 fagfolk indenfor den farmaceutiske industri kendt måde. Bærestoffet eller excipiensen kan være et fast stof, et halvfast stof, eller et væskeformigt materiale, der kan tjene som et bærestof eller medium for den aktive komponent.

5 Egnede bærestoffer eller excipienser er kendte af fagfolk.

Det farmaceutiske præparat kan tilpasses oral eller parenteral anvendelse, og det kan indgives til en patient i form af tabletter, kapsler, suppositorier, opløsninger, suspensioner eller lignende.

10 Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse kan indgives oralt, f .eks. sammen med et indifferent fortyndingsmiddel eller sammen med et spiseligt bærerstof. De kan være indesluttede i gelatinekapsler eller sammenpressede i tabletter. Til oral terapeutisk indgivelse kan forbindelser-15 ne inkorporeres med excipienser og anvendes i form af tabletter, pastiller, kapsler, eliksirer, suspensioner, sirupper, vafler, tyggegummi og lignende. Disse præparater bør indeholde mindst 4% af forbindelsen ifølge opfindelsen, den aktive komponent, men kan variere afhængig af den særlige 20 form, og mængden kan passende være mellem 4% til ca. 70% af enhedens vægt. Mængden af forbindelse, der er til stede i præparaterne, er sådan, at der opnås en egnet dosering. Foretrukne præparater ifølge den foreliggende opfindelse er fremstillet således, at en oral doseringsenhedsform indehol-25 der mellem 5,0 og 300 mg af en forbindelse ifølge opfindelsen .

Tabletter, piller, kapsler, pastiller og lignende kan også indeholde et eller flere af de følgende adjuvanser: bindemidler, såsom mikrokrystallinsk cellulose, tragantgummi 30 eller gelatine; excipienser, såsom stivelse eller lactose, desintegreringsmidler, såsom alginsyre, primogel, majsstivelse og lignende; smøremidler, såsom magnesiumstearat eller Sterotex; glidemidler, såsom kolloidt siliciumdioxid; og sødemidler, såsom sucrose eller saccharin, kan tilsættes, 35 eller et aromastof, såsom pebermynte, methylsalicylat eller orangesmag. Når doseringsenhedsformen er en kapsel, kan den DK 171645 B1 23 foruden materialer af den ovenfor nævnte type indeholde et flydende bærerstof, såsom polyethylenglycol eller en fed olie. Andre doseringsenhedsformer kan indeholde andre forskellige materialer, der ændrer doseringsenhedens fysiske 5 form, f.eks. som overtræk. Tabletterne eller pillerne kan overtrækkes med sukker, shellak eller andre enteriske overtræksmidler. En sirup kan foruden de foreliggende forbindelser indeholde sucrose som et sødemiddel og visse konserveringsstoffer, farvestoffer og aromastoffer. De materialer, 10 der anvendes til fremstilling af disse forskellige præparater, bør være farmaceutisk rene og ikke-toxiske i de anvendte mængder.

Til parenteral terapeutisk indgivelse, såsom intra-musculær, intravenøs og subcutan, kan forbindelserne ifølge 15 den foreliggende opfindelse inkorporeres i en opløsning eller suspension. Disse præparater bør indeholde mindst 0,1% af en forbindelse ifølge opfindelsen, men mængden kan variere mellem 0,1 og ca. 50 vægt-% deraf. Mængden af forbindelse ifølge opfindelsen, der er til stede i sådanne præpara-20 ter, er således, at der opnås en egnet dosering. Foretrukne præparater ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles således, at en parenteral doseringsenhed indeholder mellem 5,0 og 100 mg af forbindelsen ifølge opfindelsen.

Opløsninger eller suspensioner kan også indeholde 25 et eller flere af de følgende adjuvanser: sterile fortyndingsmidler, såsom vand til injektion, en saltvandsopløsning, fikserede olier, polyethylenglykoler, glycerol, propylengly-col eller andre syntetiske opløsningsmidler; antibaktielle midler, såsom benzylalkohol eller methylparaben; antioxidan-30 ter, såsom ascorbinsyre eller natriumbisulfit; chelaterings-midler, såsom ethylendiamintetraeddikesyre; puffere, såsom acetater, citrater eller phosphater, og midler til regulering af toniciteten såsom natriumchlorid eller dextrose. Det parenterale præparat kan være indesluttet i ampuller, én-35 gangssprøjter eller multidosishætteglas, der er fremstillet af glas eller plast.

Claims

24 DK 171645 B1

1. Adenosinderivat, kendetegnet ved, at det har formlen 5 nh2

10 HC Rl ^ O N SyS \H H / H N_|/h 15 OH OH i hvilken R1 betyder ethynyl eller cyano, eller er et farmaceutisk acceptabelt salt deraf.

2. Forbindelse ifølge krav l, kendetegnet ved, at den er 9-(5^5^6^61 -tetradehydro-5 ', 6 ' -dideoxy-fi-D-ribohexofura-nosyl)-9-H-purin-6-amin eller 9-(β-D-ribofuranylnitril)-9-H-purin-6-amin eller et farma-25 ceutisk acceptabelt salt deraf.

3. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder en effektiv mængde af en forbindelse ifølge krav 1 eller 2. 30 35