DK170810B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af cellulose fra l igninholdige råmaterialer - Google Patents

Description

i DK 170810 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fjernelse og/eller omdannelse af lignin fra 1ignocelluloseholdigt materiale.

Til fremstilling af cellulose eller celluloselignende materiale må det 1ignocelluloseholdige materiale såsom træ eller etårige planter be-5 fries for lignin, da dette i betydelig grad forbedrer de mekaniske og fysisk-kemiske egenskaber af det papir, der fremstilles ud fra cellulosen. Konventionelle fremgangsmåder arbejder med høje tryk og temperaturer under anvendelse af miljøbelastende kemikalier.

Hidtil kendte biologiske fremgangsmåder til cellulosefremstilling 10 arbejder med mikroorganismer, især svampe. Fra DE-patentskrift 3110117 kendes således en fremgangsmåde til udvinding af cellulose fra træ eller andre plantefibermaterialer, ved hvilken lignocellulosen nedbrydes ved hjælp af hvidrådsvampe. Mikroorganisme-fremgangsmåderne har imidlertid betydelige ulemper. Således har det hidtil ikke været muligt at opnå 15 nedbrydning og løsgørelse af ligninen fra de ledsagende polymerer (cellulose) uden en samtidig vækst af de pågældende mikroorganismer. Den samtidige vækst af svampen giver meget lange nedbrydningstider, som kan vare indtil flere uger.

På grund af de ved anvendelse af mikroorganismer beskrevne vanske-20 ligheder er mulighederne for at anvende isolerede enzymsystemer blevet undersøgt i forstærket grad i de senere år. Især er enzymerne af hvidrådsvampen Phanerochaete chrysosporium blevet undersøgt og beskrevet meget detaljeret. Fra "Biotechnology in the Pulp and Paper Industry, 3. International Conference, Stockholm 1986" er det således kendt, at reak-25 tionens ligevægt ved nedbrydning af lignin uden egnede enzymsystemer ligger på polymerisationssiden.

Endvidere har P.J. Harvey et al. undersøgt radikalkationernes rolle ved nedbrydning af lignin. Herved har de iagttaget, at veratrylal kohol som mediator ved in vitro fremgangsmåden kan medvirke til ligninnedbryd-30 ning ved hjælp af Phanerochaete chrysosporium (Abstract Bulletin of the Institute of Paper Chemistry, vol. 57, nr. 7, januar 1987, Appleton, Wisconsin, USA) P.J. Harvey et al.: "Lignin-degrading enzymes and the role of radical cations in lignin biodegration, side 958,

Zusammenfassung 8575, & STFI/SPCI Int. Conf. Biotehnol. Pulp & Paper 35 Ind. (Stockholm) 3rd: 11-12 (16-19 juni, 1986). Det er ligeledes kendt, at fedtsyrer har indflydelse på Phanerochaete chrysosporium. Således kunne ligninaseproduktionen ved hjælp af Phanerochaete chrysosporium ved tilsætning af Tween 80® iagttages (Abstract Bulletin of the Institute of 2 DK 170810 B1

Paper Chemistry, vol. 57, nr. 7, januar 1987 (Appleton, Wisconsin, USA) M. Asther et al.: "Production of ligninolytic enzymes of Phanerochaete chrysosporium INA-12 in submerged agitated cultures", side 956-957, Zusammenfassung 8558, & STFI/SPCI Int. Conf. Biotechnol. Pulp & Paper 5 Ind. (Stockholm), 3rd: 152-153 (16-19 juni, 1986).

Derudover har man beskæftiget sig med mangans rolle ved ligninned-brydning (Abstract Bulletin of the Institute of Paper Chemistry, vol.

57, nr. 7, januar 1987 (Appleton, Wisconsin, USA) V.-B Huynh et al: "Oxidation of lignin model compounds by a manganese-dependent enzyme 10 from Phanerochaete chrysosporium as compared to chemically generated Mn(III)", side 959, Zusammenfassung 8578, & STFI/SPCI Int. Conf.

Biotechnol. Pulp & Paper Ind. (Stockholm), 3rd: 42-45 (16-19 juni, 1986). Herved blev det slået fast, at Phanerochaete chrysosporium producerer en peroxidase, der fremkalder oxidation af mangan(II) til mangan-15 (III). Mangan(III) på sin side fremkalder oxidation af ligninmolekyler-ne. Det vil sige, at Mn-peroxidaseproduktionen spiller en afgørende rolle ved 1igninnedbrydningen. På den anden side fremgår det af "A.

Paszczgnski et al.: Composition of Ligninase-1 and Peroxidase-Mg from the White-Rot Fungus Phanerochaeta Chrysosporium. Arch. Biochem.

20 Biophys. Vol. 244. Nr. 2", at den Mn-afhængige peroxidase fra

Phanerochaeta Chrysosporium hæmmes ved tilsætning af reduktionsmidler. Dithionit derimod virker som aktivator.

Dokumenter, der blev offentliggjort i forbindelse med den 3. Internationale Bioteknologiske Konference i Stockholm, 1986 (cf. under-25 søgel sesreferater og nærværende beskrivelse, side 1, linie 20-27), især bidragene fra M. Leisola et al. "Production and characterization of ligninolytic enzymes of Phanerochaete Chrysosporium" og M. Asther et al. "Production of ligninolytic enzymes of Phanerochaete Chrysosporium INA-12 in submerged agitated cultures", viser endvidere anvendelsen af 30 veratrylal kohol.

Her tjener veratrylakohol imidlertid kun til fremme af dannelsen af 1 igninnedbrydende enzymer.

Den foreliggende opfindelse har til formål at tilvejebringe en fremgangsmåde til fjernelse og/eller omdannelse af lignin fra ligno-35 celluloseholdigt materiale, hvorved de ovenfor beskrevne ulemper ved anvendelse af mikroorganismer, enzymer og kemikalier undgås. Dette opnås ved en fremgangsmåde, der er ejendommelig ved det i krav l#s kendetegnende del angivne. Et eller flere oxidations- og/eller reduktionsmid- 3 DK 170810 B1 ler og/eller salte og/eller phenol forbi ndel ser sættes til en sur, vandig opløsning af de ligninholdige råmaterialer, redoxpotentialet indstilles i området 200-500 mV, derefter igangsættes en 1 igni nnedbrydende reaktion med samtidig blegning ved tilsætning af enzymer, mikroorganismer eller 5 dyre- eller planteceller og reaktionen opretholdes ved en omkring en konstant redoxpotential værdi svingende værdi, konstant temperatur, konstant pH-værdi og under konstant omrøring i flere timer.

Redoxpotentialet ligger fortrinsvis ved 250-350 mV. Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan redoxpotentialet måles ved hjælp af en re-10 doxelektrode og holdes konstant under hele reaktionstiden ved hjælp af en regulator og en indstillingsindretning gennem tilsætning af oxidations- og/eller reduktionsmidler og/eller salte og/eller phenol forbi ndel ser og/eller organiske syrer. Som oxidationsmiddel anvendes fortrinsvis hydrogenperoxid, oxygen og ozon. Som reduktionsmiddel kan der an-15 vendes ascorbinsyre, dithionit og natriumbisulfit. Som salt egner sig fortrinsvis MnSO^ og/eller FeCl2. Som phenol forbi ndel se kan der anvendes veratrylal kohol. Som organisk syre kan der fx. anvendes mælkesyre.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes som enzym fortrinsvis 1 i gnolyti ske enzymer. Disse omfatter fortrinsvis phenol oxidaser, 20 laccaser og peroxidaser. Effektiviteten af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan forøges ved tilsætning af pectinaser og/eller hæmicel lul aser. Ifølge opfindelsen kan der især anvendes sådanne enzymer, der udvindes fra hvidrådsvampen Phanerochaete chrysosporium. Eventuelt kan også Pha-nerochaete chrysosporium selv tilsættes ved nedbrydnignsprocessen.

25 Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ligger pH-værdien mellem 2 og 5. Specielt foretrukket er en pH-værdi på 3. Temperaturen er 20-60°C. Fortrinsvis udføres reaktionen ved 40°C.

Hvis de anførte betingelser for fremgangsmåden ifølge opfindelsen overholdes, vil indstillingen et redoxpotentialet på 250-350 mV lykkes.

30 Herved kan ligninindholdet af fx. hvedehalm (ca. 18% 1igninindhold) nedbrydes til næsten 0%. Grantræslib (1igninindhold ca. 28-30%) kan nedbrydes til lignende slutværdier. Disse resultater kan overraskende opnås inden for 2-6 timer, ofte endog inden for 2 timer. Den fysiske og/eller kemiske forbehandling, der er påkrævet især ved anvendelse af træ eller 35 etårige planter, er ikke medregnet heri.

Redoxpotentialet indstilles gennem forholdet mellem de forskellige tilsatte materialer i reaktionsbeholderen. Ved passende måling og regulering af tilsætningen af oxidations- og reduktionsmidlerne, saltene og 4 DK 170810 B1 phenol forbindelserne kan et bestemt redoxpotentiale opretholdes under hele reaktionsforløbet. Formålet med opretholdelsen af det således indstillede redoxsystem er at hindre ligninen i at repolymerisere.

Med dette biologiske nedbrydningssystem er det for første gang lyk-5 kedes at udvikle en til fjernelse af lignin anvendelig fremgangsmåde, der inden for et meget kort tidsrum (2-6 timer) ved fysiologiske temperaturer (40°C), uden tryk og med minimal kemikalietilsætning fungerer økonomisk og frem for alt skånsomt for miljøet. En yderligere fordel er det høje udbytte af cellulose eller celluloselignende materiale. Ved 10 etårige planter udgør udbyttet ca. 80% og ved træ ca. 70% af tørstoffet efter forbehandlingen.

Den omhandlede fremgangsmåde har under nedbrydnings- og/eller omdannelsesreaktion også en betydelig blegningsvirkning, der gør det muligt at arbejde med blegemidler, som belaster miljøet i væsentligt mind-15 re grad. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er derfor også egnet som blegnings- eller efterblegningsmetode ved forskellige processer. Derfor kan fremgangsmåden også anvendes til biologisk blegning og biologisk spildevandsbehandling af spildevand fra celluloseindustrien og andet spildevand. Især kan fremgangsmåden anvendes overalt, hvor en affarvning 20 og afgiftning af spildevand er målsætningen.

En yderligere fordel ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er muligheden for en kontinuerlig udøvelse af fremgangsmåden. Fremgangsmåden kan udøves på særlig økonomisk måde, når de brugte enzymer genvindes og føres tilbage til reaktionsprocessen. Dette mål kan nås ved hjælp af af-25 finitetskromatografi. Herved ledes enzymet efter reaktionens afslutning over en kromatograferingssøjle, hvor det renses og så tilbageføres til reaktionsprocessen. Enzymrensningen udføres i kromatograferingssøjlen ved affinitetskromatografi. Til dette formål er der blevet udviklet særlige ligandtyper, der kan benyttes i forbindelse med det dertil svarende 30 enzymteknologiske know-how. Sådanne ligander er beskrevet i patentansøgning PCT/EP87/00214. I det foreliggende kan der fx. anvendes phenol forbi ndel ser. Desuden kan der anvendes proteinspecifikke ligander. Som eksempel kan nævnes tannin.

I det følgende belyses apparatet til udøvelse af fremgangsmåden 35 ifølge opfindelsen nærmere under henvisning til tegningen. Via tilledningen 7 tilføres mikroorganismer eller enzymer til reaktoren. Mikroorganismerne eller enzymerne kan eventuelt også være immobil i seret i reaktoren. Til immobilisering kan anvendes sædvanlige fyld- og bærer- 5 DK 170810 B1 materialer. Oxidationsmiddel, reduktionsmiddel, salte eller phenol -forbindelser kan doseres via tilledningen 4. Doseringen kan styres i afhængighed af det til enhver tid gældende redoxpotential. Til dette formål er der anbragt en redoxelektrode i reaktoren (ikke vist på 5 tegningen), ved hjælp af hvilken der kan udføres en fortløbende måling af redoxpotentialet. Via forbindelse med en tilsvarende reguleringsindretning kan redoxpotentialet så holdes konstant under hele reaktionsforløbet. Via tilledningen 7 tilsættes desuden råmaterialerne. Der kan være tale om 1igninholdige materialer af enhver art. Især kommer kemisk 10 og/eller fysisk forbehandlet halm og træ i betragtning. Ligninholdigt lud fra udløb og spildevand kan dog ligeledes behandles i apparatet. I reaktoren nedbrydes ligninet ved hjælp af lignolytiske enzymer eller mikroorganismer. Som enzymer kommer især sådanne i betragtning, der er udvundet fra svampen Phanerochaeta chrysosporium. Som mikroorganismer 15 egner sig især cellulase- og hæmicellulasefrie mutanter. Især kan mutanter af Phanerochaeta Chrysosporium anvendes. Når 1 igni nnedbrydningen er tilendebragt, ledes det omdannede råmateriale via udledningen 8 sammen med de brugte kemikalier, mikroorganismer eller enzymer bort fra reaktoren. Materialeblandingen ledes fx. gennem et filter 3, hvor 20 opløste og uopløste materialer adskilles. Den enzymholdige opløsning ledes gennem en kromatograferingssøjle 2. Denne søjle fungerer efter affinitetskromatografi princippet. Her genvindes enzymerne og føres derefter tilbage til reaktionsprocessen via tilledningen 5. De fra enzymerne adskilte materialer bortledes via ledningen 6. Til affinitetskromato-25 grafi anvendes særlige enzymspecifikke ligander, især phenolforbindel- ser. Ligeledes kan der anvendes proteinspecifikke ligander, især tannin.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af følgende eksempel.

30 Eksempel 20 g skåret atro (= tørret ved 110°C) halm med en længde på 10-20 mm behandles i 24-48 timer med 400 ml 1-2% NaOH. Derefter frafiltreres den skårne halm og vaskes med 1200 ml varmt vand. Den frafiltrerede halm overføres til en Jokru-mølle. Dernæst tilsættes 250 ml vand. Der males 35 ved 150 opm i 5-10 minutter. Herefter optages en mængde halm svarende til en tørvægt på 1 g i 90 ml vand. Under konstant omrøring indstilles pH-værdien til 3 med 0,2 M HC1. Efter indstilling af pH-værdien tilsættes vand til 100 ml. Derefter tilsættes H2O2 (60 /il af en opløsning, 6 DK 170810 B1 der indeholder 49 ml HgO + 4 ml HgOg)- Som reduktionsmiddel tilsættes en ækvimolær mængde ascorbinsyre. Ved tilsætning af enzymer, der er udvundet fra Phanerochaete chrysosporium (7000 U, 1 U = omsætning af 1 μΜοΙ veratrylal kohol til veratryl aldehyd pr. liter pr. minut). Reaktionen 5 udførtes ved 40°C. Efter 2 timer var 33% af ligninen nedbrudt.

Claims (11)

1. Fremgangsmåde til fjernelse og/eller omdannelse af lignin eller dets nedbrydningsprodukter fra lignocelluloseholdigt materiale ved hjælp 5 af udvundne lignolytiske enzymer, KENDETEGNET ved, at man a) ved tilsætning af oxidationsmidler, reduktionsmidler, salte og phenol forbi ndel ser til en vandig opløsning af de ligninholdige råmaterialer indstiller et redoxpotentiale i området fra 200 til 500 mV, b) derefter ved tilsætning af de lignolytiske enzymer igangsætter 10 en 1igninnedbrydende reaktion med samtidig blegning, c) opretholder reaktionen ved en værdi mellem 200 og 500 mV, konstant temperatur mellem 20°C og 60°C, konstant pH-værdi mellem 2 og 5 og under konstant omrøring i 2 til 6 timer, d) fortløbende måler redoxpotentialet ved hjælp af en redoxelek-15 trode og holder det mellem 200 og 500 mV ved hjælp af en regulator og indstillingsindretning under hele reaktionen ved tilsætning af oxidationsmidler, reduktionsmidler, salte, phenol forbi ndel ser og organiske syrer, og e) efter afslutning af reaktionen leder enzymet gennem en kromato-20 graferingssøjle, hvor det renses og så føres tilbage til reaktionsprocessen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at redoxpotentialet indstilles i området fra 250 til 350 mV. 25

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, KENDETEGNET ved, at H^, 02 eller ozon anvendes som oxidationsmiddel.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1-3, KENDETEGNET ved, at ascorbinsyre, 30 dithionit eller natriumbisulfit anvendes som reduktionsmiddel.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1-4, KENDETEGNET ved, at veratrylalkohol anvendes som phenol forbi ndel se.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1-5, KENDETEGNET ved, at pH-værdien indstilles til 3. 8 DK 170810 B1

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1-6, KENDETEGNET ved, at temperaturen indstilles til 40°C.

7 DK 170810 B1

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1-7, KENDETEGNET ved, at enzymrensning 5 udføres ved affinitetskromatografi i kromatograferingssøjlen.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, KENDETEGNET ved, at affinitetskromatografien udføres med enzymspecifikke ligander, især phenol forbindelser. 10

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, KENDETEGNET ved, at affinitetskromatografien udføres med proteinspecifikke ligander, især tannin.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 1-10, KENDETEGNET ved, at der tillige 15 bleges med gængse blegemidler, såsom natriumhypochlorit, chlor, ozon, Og eller chlordioxid.