DK170345B1 - Acylglutaminsyreholdige peptidforbindelser og et farmaceutisk præparat deraf - Google Patents

Description

DK 170345 B1

Denne opfindelse angår hidtil ukendte acylglutaminsyrehol-dige peptider, der er nyttige immunostimulerende og anti-infektive midler, samt farmaceutiske præparater deraf.

5 Det relativt nye område, immunofarmakologi, og især det udsnit deraf, som drejer sig om immunomodulation, fortsætter méd at udvikle sig med hurtig hastighed. En lang række naturligt forekommende forbindelser er blevet undersøgt, herunder tetrapeptidet tuftsin, der kemisk 10 betegnes som N -[1—N -L-threonyl-L-lysyl)-L-prolyl]-L-ar- ginin. Megen opmærksomhed har været rettet mod syntetiske peptidoglycanderivater, især dem, der kendes som muramyl-dipeptider. Med henblik på sammenfatninger af det brede område af forbindelser, der er undersøgt som immunomodu-15 latorer, og især som immunostimulanter, rettes opmærksom heden mod Duker et al., Annu. Rep. Med. Chem. _14, 146-167 (1979), Lederer, J. Med. Chem., 23, 819-825 (1980) og J. Kralovec, Drugs of the Future, 615-638 (1983).

20 Immunostimulerende peptider er blevet beskrevet i et antal patentskrifter: L-Alanyl-cx-glutarsyre-N-acyldipeptider i DE patent-skrift nr. 3 024 355, offentliggjort den 15. januar 1981, 25 tetra- og pentapeptider indeholdende D-alanyl-L-glu- tamyl-dele eller L-alanyl-D-glutamyl-dele, i hhv. GB patentskrift nr. 2 053 231, offentliggjort den 4. februar 1981, og DE patentskrift nr. 3 024 281, offentliggjort den 8. januar 1981, og 30 N-acyl-alanyl-jf-D-glutamyl-tripepti dderi vater, hvori den C-terminale aminosyre er lysin eller diamino-pimelinsyre, i DE patentskrift nr. 3 024 369, offentliggjort den 15. januar 1981, og lactoyl-tetrapeptider sammensat af N-lactylalanyl-, 35 glutamyl-, diaminopimelyl- og carboxymethylamino-komponen- ter, i EP patentskrift nr. 11 283, offentliggjort den 23.

2 DK 170345 B1 maj 1980.

&

Yderligere immunostimulerende polypeptider med formlen 5 R1-(HNCHC0) -HN-CH-R3 l2 n i R (tfVm CO-NH-CH-R4 (A) (ch2)3 10 R6-HN-CN-R5 1 2 hvori R betyder hydrogen eller acyl, R bla. hydrogen, 3 4 lavere alkyl, hydroxymethyl eller benzyl, R og R hver 7 8 for sig betyder hydrogen, carboxyl, -C0NR R , hvori 7 15 R betyder hydrogen eller lavere alkyl, som eventuelt 3 er substitueret med hydroxy, og R betyder mono- eller dicarboxy-lavere-alkyl, R3 betyder hydrogen eller carboxyl 4 5 med den begrænsning, at når en af R og R er hydrogen, er 7 8 6 den anden carboxyl eller -C0NR R , R betyder hydrogen, 20 m er 1, 2 eller 3, og n er 0, 1 eller 2, og derivater deraf, hvori carboxyl- og aminogrupperne er beskyttet, er angivet i US patentskrifterne nr. 4 311 640 og nr.

4 322 341 og EP offentliggørelsesskrifterne nr. 25 482, 50 856, 51 812, 53 388, 55 846 og 57 419.

25

Ingen af de i den kendte teknik angivne polypeptider har heterocyclyl-dele i den stilling, der indtages af den variable R4 i den ovenstående formel, undtagen i US patentansøgning nr. 662 668, indleveret den 19.

30 oktober 1984. US patentansøgning nr. 595 169, indleveret den 30. marts 1984 af Ives et al., beskriver polypeptider, 4 hvori den variable R er en basisk aminosyredel.

Kitaura et al., J. Med. Chem., 25_, 335-337 (1982) rappor- s 2 35 terer N - (}f-D-glutamyl)-meso-2(L) ,2(D)-diamino-pimelinsyre som den minimale struktur, der er i stand til at udløse i 3 DK 170345 B1 et biologisk respons karakteristisk for den forbindelse med formlen (A), hvori n er 1, R1 er CH^CH(OH)-CO-, R2 er CH,, hver af R3 og R5 er -COOH, R4 er -C0NHCH?C00H, 6 ^ og R er H. Den nævnte forbindelse med formlen (A) er 5 kendt som FK-156.

De hidtil ukendte immunostimulanter ifølge opfindelsen er forbindelser med formlen 10 jj

RjCNH D , C02R4 OT L O

I H (i) (CH2)2CONH^HC'R3 15 R2 hvori R^ betyder cycloalkyl med 4-7 carbonatomer, alkyl med 2-10 carbonatomer eller cycloalkylmethyl med 6-8 carbonatomer, betyder hydrogen eller alkyl med 1-3 20 carbonatomer, og betyder hydroxy eller en aminosyrerest med formlen

D

-NHCH(CH2)nC02R5 X

25 hvor X betyder hydrogen, alkyl med 1 eller 2 carbonatomer eller hydroxymethyl, og n betyder et helt tal fra 0 til 4, og R^ og R^ hver for sig betyder hydrogen, alkyl med 1-6 carbonatomer, cycloalkylmethyl med 6-8 carbonato-30 mer eller benzyl, og farmaceutisk acceptable basesalte deraf.

En foretrukken gruppe af forbindelser er de, hvori R^ er alkyl med 5-8 carbonatomer, R2 er hydrogen, R^ er 35 den angivne aminosyrerest, hvor X, n og R^ er som defi neret, og R^ er hydrogen. Særlig foretrukne er de forbin- 4 DK 170345 B1 delser inden for gruppen, hvor n er 0, og er hydrogen, alkyl med 1-6 carbonatomer eller cyclohexylmethyl. Speci- i elt foretrukne forbindelser er de, hvori R^ er (R,S)-2-e-thyl-l-butyl, R^ er hydrogen, og X er methyl, hvori 5 R^ er (R,S)-3-heptyl, R,. er hydrogen, og X er methyl, hvori R1 er (R,S)-2-methyl-l-pentyl, R^ er hydrogen, og X er methyl, hvori R^ er (R,S)-2-heptyl, R^ er hydrogen, og X er methyl, hvori R^ er (R,S)-2-ethyl-l-pentyl,

Ri- er hydrogen, og X er methyl, hvori R^ er (R,S)-l-hexyl, 10 R[- er hydrogen, og X er methyl, hvori R^ er (R,S)-2-e- thyl-l-hexyl, R,. er hydrogen, og X er methyl, hvori R^ er (S)- eller (R,S)-2-methyl-l-hexyl, R^ er hydrogen, og X er methyl, hvori R^ er (S)- eller (R,S)-2-ethyl-1-hexyl, X er methyl, og R,- er hydrogen, og hvori R^ 15 er l-hexyl,X er methyl, og R,- er hydrogen. Specielt foretrukken er også den forbindelse, hvori R^ er 1-hexyl, X er hydrogen, og n er 3. Specielt foretrukne estere er de, hvori R^ er (R,S)-2-ethyl-l-penty1, X er methyl, og R^ er n-butyl, i-butyl eller cyclohexylmethyl, hvori 20 R^ er (S)- eller (R,S)-2-methyl-l-hexyl, X er methyl, og R,- er n-butyl, i-butyl eller cyclohexylmethyl, og hvori R^ er (S)- eller (R,S)-2-ethyl-l-hexy1, X er methyl, og R,. er n-butyl, i-butyl eller cyclohexylmethyl.

25 En anden foretrukken gruppe af forbindelser er de, hvori R^ er cycloalkyl med 4-7 carbonatomer, R£ er hydrogen, og R^ er den angivne aminosyrerest, hvor n er 0, X er alkyl med 1 eller 2 carbonatomer, og R^ og R^ begge er hydrogen. Specielt foretrukken inden for denne gruppe 30 er den forbindelse, hvori R^ er cyclohexyl, og X er methyl.

En tredie foretrukken gruppe af forbindelser er de, hvori R^ er alkyl med 5-8 carbonatomer, R£ er hydrogen, 35 R^ er den angivne aminosyrerest, hvor X er hydrogen eller alkyl med 1 eller 2 carbonatomer, n er et helt tal 5 DK 170345 B1 fra 0 til 4, og R^ er hydrogen, og er alkyl med 1-6 carbonatomer, cycloalkylmethyl med 6-8 carbonatomer eller benzyl.

5 Opfindelsen angår også farmaceutiske præparater i enheds doseringsform, som er ejendommelige ved, at de indeholder en forbindelse med formlen (1) eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf og en farmaceutisk acceptabel bærer.

10

Forbindelserne og præparaterne ifølge opfindelsen kan anvendes ved en fremgangsmåde til behandling af en infektion i et menneske, hvorved mennesket indgives en anti-infektiv mængde af en forbindelse med formlen (1) eller 15 et farmaceutisk acceptabelt basesalt deraf.

Ved farmaceutisk acceptable basesalte af forbindelserne med formlen (1) menes salte med uorganiske eller organiske baser, såsom alkalimetal- og jordalkalimetalhydroxi-20 der, ammoniak, triethylamin, ethanolamin cg dicyclo- hexylamin.

Konfigurationen af de aminosyredele, som udgør forbindelserne med formlen (1) er betydningsfuld med hensyn 25 til forbindelsernes farmakologiske aktivitet. Den kraftig ste aktivitet iagttages hos de forbindelser med formlen (1), som har den i formlen angivne stereokemi. I de forbindelser med formlen (1), hvori og X er forskellige fra hydrogen, er den foretrukne stereokemi ved det nævnte 30 carbonatom angivet som hhv. L og D.

Forbindelserne med formlen (1) fremstilles ved enhver af flere fremgangsmåder, som kendes af fagfolk. Metodologien involverer dannelsen af peptidbindinger mellem aminosyrer, 35 som på grund af deres amino- og carboxylgrupper og hyppigt 6 DK 170345 B1 tilstedeværelsen af andre reaktive grupper kræver beskyttelse af de nævnte grupper og/eller aktivering af sådanne grupper, især carboxylgruppen, for at opnå en vis reaktion eller optimere en sådan reaktion.

5 I almindelighed anvendes to veje ved syntesen af forbindelser med formlen (1). Den første procedure anvender koblingen af fragmentet

10 O

II

R.CNH D

1 \ / 24 CHX L

(CH-)-CONHCHCO-H

L· Δ I * 15 R2 med aminosyrefragmentet

20 D

H2SfH<CH2>nC02R5

X

25 Den anden procedure omfatter acylering af peptidet H,N D . C0oR.

2 \ / 2 4

CH ' L O

I il 3 0 (CH2)2CONHCHC-R3 *2 med den passende syre R^C^H.

7 DK 170345 B1 I de efterfølgende eksempler er visse beskyttende og aktiverende grupper specifikt belyst. Imidlertid vil en fagmand indse, at andre beskyttende eller aktiverende grupper kunne være blevet anvendt. Valget af en bestemt 5 beskyttende gruppe afhænger i høj grad af tilgængeligheden af det nødvendige reagens, dens virkning på den "beskyttede" forbindelses opløselighed, den lethed, hvormed den fjernes, og tilstedeværelsen af andre grupper, som kunne påvirkes ved dens anvendelse, dvs. dens selektivitet 10 eller dens fjernelse.

For eksempel vil det være nødvendigt, eller i det mindste ønskeligt, ved mange reaktioner at beskytte aminogrupperne og/eller carboxylgrupperne. Den valgte syntesevej for 15 peptidsyntesen kan kræve fjernelse af den ene eller den anden eller begge de nævnte beskyttede grupper for at muliggøre yderligere reaktion af den gendannede amino-eller carboxylgruppe, dvs. de anvendte beskyttende grupper er reversible og kan i de fleste tilfælde fjernes uafhæn-20 gigt af hinanden. Desuden afhænger valget af beskyttende gruppe for en given aminogruppe af denne aminogruppes rolle i det samlede reaktionsskema. Der vil blive anvendt aminobeskyttende grupper med forskellige niveauer af labilitet, dvs. lethed af fjernelse. Det samme gælder 25 med hensyn til earboxylbeskyttende grupper. Sådanne grupper er kendt inden for faget, og opmærksomheden rettes mod oversigterne af Bodansky et al., "Peptide Synthesis", 2nd Ed.,John Wiley & Sons, N.Y. (1976),

Greene "Protective Groups in Organic Synthesis", John 30 Wiley & Sons, N.Y. (1981), McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, N.Y. (1973), og Sheppard i "Comprehensive Organic Chemistry, The Synthesis and Reactions of Organic Compounds", Pergamon Press, N.Y. (1979), edited by E. Haslam, Part 23.6, side 321-339.

Konventionelle amino- og earboxylbeskyttende grupper 35 8 DK 170345 B1 er kendt af fagfolk. Repræsentative aminobeskyttende grupper er for eksempel eventuelt substitueret aralkoxy- * carbonyl, såsom benzyloxycarbonyl, substitueret eller usubstitueret aralkyl, såsom benzyl, trityl, benzhydryl 5 og 4-nitrobenzyl, benzyliden, arylthio, såsom phenylthio, nitrophenylthio og trichlorphenylthio, phosphorylderiva-ter, såsom dimethylphosphoryl og 0,O-dibenzylphosphoryl, trialkylsilylderivater, såsom trimethylsilyl, og andre, som det er beskrevet i US patentskrift nr. 4 322 341, 10 der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved henvisning. Den foretrukne aminobeskyttende gruppe er benzyloxycarbonyl. Procedurer til indførelse af denne gruppe som substituent på en given aminogruppe er velkendte. I almindelighed omfatter de acylering af den 15 passende aminoforbindelse med benzyloxycarbonylchlorid (benzylchlorformiat) i et reaktionsinert opløsningsmiddel, f.eks. vand, methylenchlorid eller tetrahydrofuran, i nærvær af en base (syreacceptor), f.eks. natrium-eller kaliumhydroxid, når opløsningsmidlet er vand, 20 og, når der anvendes et organisk opløsningsmiddel, i nærvær af en tertiær amin, såsom ^trialkylaminer og pyridin. Når der anendes et vandigt opløsningsmiddelsystem, holdes reaktionens pH-værdi på omkring pH 8-10, og fortrinsvis ved pH 9. Alternativt kan reaktanten, 25 dvs. den forbindelse hvori en aminogruppe skal beskyttes, hvis den indeholder basiske grupper, tjene som syreacceptor.

Acylgruppen R^CO indføres i peptidet ved standardacyle-30 ringsprocedurer som for eksempel ved omsætning af peptidet med det passende syrechlorid eller -bromid i et reaktions-inert opløsningsmiddel. Foretrukne betingelser er ikke-vandige betingelser, herunder tilsætning af en egnet base, såsom en organisk base, fortrinsvis en tertiær 35 amin, såsom triethylamin, N-methylmorpholin eller pyridin.

Det foretrukne opløsningsmiddel er methylenchlorid. s 9 DK 170345 B1

Repræsentative carboxylbeskyttende grupper er forskellige esterdannende grupper, f. eks. silyl, herunder trialkylsi-lyl, trihalogensilyl og halogenalkylsilyl, visse hydrocar-bylgrupper, såsom ^alkyl, især t-butyl, benzyl og 5 substitueret benzyl, benzhydryl og trityl, phenacyl og phthalimidomethyl, visse substituerede hydrocarbylgrup-per, såsom chlormethyl-, 2,2,2-trichlorethyl og cyanme-thyl, tetrahydropyranyl, methoxymethy1 og methylthio-methyl, og andre som det er beskrevet i US patentskrift 10 nr. 4 322 341, der betragtes som inkorporeret i denne beskrivelse ved henvisning. En stærkt foretrukken carboxylbeskyttende gruppe er t-butoxycarbonylgruppen.

De beskyttede amino- og carboxylgrupper omdannes til de ubeskyttede amino- og carboxylgrupper ved procedurer, 15 der kendes af fagfolk. Benzylgruppen, den foretrukne beskyttende gruppe for carboxyl, fjernes ved katalytisk hydrogenering over palladium, især palladium på kul. Alternativt fjernes den nævnte beskyttende gruppe ved hjælp af trifluormethansulfonsyre i trifluoreddikesyre 20 og i nærvær af anisol for at undertrykke alkylering.

t-Butoxycarbonylgruppen fjernes let ved behandling med dioxan mættet med hydrogenchlorid.

Aktivering af carboxylgrupper som middel til fremskyndelse af en given reaktion er en metodologi, som er 25 kendt for fagfolk. Særlig anvendelig ved den her beskrevne reaktionssekvens er anvendelsen af anhydrider, især cycliske anhydrider og aktiverede estere, såsom dem, der afledes fra N-hydroxyphthalimid og N-hydroxysuccin-imid, som begge anvendes ved peptidsynteser.

30 10 DK 170345 B1

De aktiverede N-hydroxysuccinimidestere fremskynder efterfølgende reaktioner ved de pågældende aktiverede 4 estergrupper. Som fagmanden vil indse, kunne andre aktiverede grupper anvendes. En gruppe af særlig interesse er N-hydroxyphthalimidogruppen, der anvendes på samme 5 måde som N-hydroxysuccinimidogruppen. I begge tilfælde anvendes et dehydratiserende koblingsmiddel til dannelse af den aktiverede ester. Repræsentative for sådanne koblingsmidler er l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-car-bodiimid-metho-p-toluensulfonat, dicyclohexylcarbodiimid, 10 N,N'-carbonyldiimidazol, N-(3-dimethyl-aminopropyl)-N'- ethylcarbodiimid-hydrochlorid, ethoxyacetylen, diphenyl-keten og N-ethyl-5-phenylisoxazolen-31-sulfonat. Reaktionsbetingelserne for anvendelsen af sådanne koblings-midler er vel beskrevne i litteraturen. I almindelig-15 hed omfatter de anvendelsen af et reaktionsinert opløs ningsmiddel og temperaturer i området fra stuetemperatur til 100 °C. De ovennævnte carbodiimid-reagenser foretrækkes, da de muliggør anvendelsen af stuetemperatur og giver tilfredsstillende udbytter af de ønskede estere.

20 Efter fuldførelse af koblingsreaktionerne, som fører til slutprodukterne, kan de forskellige beskyttende grupper fjernes ved den passende teknik, som tidligere er omtalt, og forbindelserne med formlen (1) isoleres.

25 De farmaceutisk acceptable basesalte af forbindelserne med formlen (1), hvori er hydroxy, eller eller er hydrogen, opnås ved behandling af en opløsning, fortrinsvis en vandig opløsning, deraf med en base, såsom de ovenfor opregnede, almindeligvis i støkiometriske 30 forhold. Saltene isoleres ved inddampning eller ved udfældning.

Forbindelserne ifølge krav 1 og de farmaceutiske præparater deraf ifølge opfindelsen er nyttige som midler til 35 klinisk og terapeutisk behandling af pattedyr, herunder s mennesker, for sygdomme forårsaget af forskellige 11 DK 170345 B1 patogene mikroorganismer, især Gram-negative bakterier.

De er også nyttige som immunostimulanter i pattedyr, herunder mennesker, som har forøget risiko for infektion på grund af eksisterende eller klinisk induceret 5 immunosuppression.

Prøvningsproceduren, hvorved der anvendtes C^H/HeN hanmus fra Charles River Breeding Laboratory, anføres nedenfor. Musene blev akklimatiseret i 5 dage før brugen og derpå 10 behandlet enten subcutant (SC) eller oralt (PO) med forskellige fortyndinger (100, 10, 1 og 0,1 mg/kg) af prøveforbindelsen eller placebo (pyrogenfri saltopløsning) under anvendelse af et volumen på 0,2 ml. Behandlingsforskriften var afhængig af den anvendte infektiøse 15 organisme: -24 og 0 timer før udsættelsen for Klebsiella pneumoniae hos normale mus, og -3, -2 og -1 dag før udsættelsen for Escherichia coli eller Staphylococcus aureus hos immunokompromiterede mus. Udsættelsen blev indgivet intramuskulært (IM) i hoften i tilfælde af 20 K. pneumoniae eller intraperitonealt (IP) i tilfælde af E. coli og Staph, aureus. Et volumen på 0,2 ml blev anvendt til udsættelsen. Dødeligheden blev optegnet efter 7 dage i tilfældet af K. pneumoniae og efter 3 dage i tilfælde af de andre to mikroorganismeudsættelser.

25

Kulturfremstilling: K. pneumoniae, E. coli eller Staph, aureus:

Kulturen blev med henblik på renhed udstrøget fra fros-30 set-blod-lager på hjerne-hjerte-infusions-(BHI)-agar.

Tre kolonier blev opsamlet fra 18 timers pladekulturen og anbragt i 9 ml BHI-væske. Væskekulturen blev dyrket i 2 timer ved 37 °C på en roterende ryster, hvorefter 0,2 ml blev udstrøget på overfladen af flere BHI-agar-35 skråsubstrater. Efter 18 timers inkubation ved 37 °C : blev skråsubstraterne vasket med BHI-væske, kulturtæt- 12 DK 170345 B1 heden indstillet under anvendelse af et spectronic 20 og den passende fortynding foretaget til opnåelse af 5 et LD^g-udsættelsesniveau hos normale mus.

Når de anvendes som antiinfektive eller immunostimulerende midler hos mennesker, indgives forbindelserne ifølge 5 opfindelsen hensigtsmæssigt ad oral, subcutan, intra- muskulær, intravenøs eller intraperitoneal vej, almindeligvis i præparat form. Sådanne præparater inkluderer en farmaceutisk bærer udvalgt på basis af den valgte ind-givningsvej og farmaceutisk standardpraksis. For eksempel 10 kan de indgives i form af tabletter, piller, pulvere eller granulater indeholdende sådanne excipienter som stivelse, mælkesukker, visse typer ler osv. De kan indgives i kapsler, i blandinger med de samme eller ækvivalente excipienter. De kan også indgives i form af orale 15 suspensioner, opløsninger, emulsioner, siruper og elixi- rer, som kan indeholde aromatiserende og farvende midler.

Til oral indgivning af de terapeutiske midler ifølge opfindelsen er tabletter eller kapsler indeholdende fra omkring 50 til omkring 500 mg egnede til de fleste 20 anvendelser.

Lægen vil bestemme den dosering, som vil være mest egnet for en individuel patient, og den vil variere med den bestemte patients alder, vægt og respons samt indgiv-25 ningsvejen. Det foretrukne orale doseringsområde, i enkelte eller opdelte doser, er fra omkring 1,0 til 300 mg/kg/dag. Den foretrukne parenterale dosis er fra omkring 1,0 til omkring 100 mg/kg/dag. Det foretrukne område er fra omkring 1,0 til omkring 20 mg/kg/dag.

30

Denne opfindelse tilvejebringer også farmaceutiske præparater, herunder enhedsdoseringsformer, som er værdifulde til anvendelsen af de her beskrevne forbindelser til de angivne formål. Doseringsformen kan, som tidligere s 35 anført, indgives i enkelt- eller flergangsdoser til opnåelse af den daglige dosering, som er effektiv til 13 DK 170345 B1 et bestemt formål.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen. For kortheds skyld anvendes de følgende 5 forkortelser for topformer i NMR-spektrene: s = singlet, d = dublet, t = triplet, q = kvartet, m = multiplet.

EKSEMPEL 1 10 N-Heptanoyl-D-^-qlutamyl-qlycyl-D-alanin

D

iR1 = CH3(CH2)5, R2 = h, R3 = NHCH(CH3)C02H] IA. N-heptanoyl-D-glutamyl (ty-benzylester)-qlycin 15 Til en opløsning af 897 mg (13,0 mmol) glycin og 1,3 g (13,0 mmol) triethylamin i 10ml vand sættes 3,0 g (11,2 mmol) N-heptanoyl-D-Y'-glutamy 1 (a-benzylester)-hydroxy-succinimidester i 100 ml dioxan, og reaktionsblandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 80 timer. Opløsningen 20 blev hældt ud i 300 ml ethylacetat, og den separerede organiske fase blev vasket med 10 % saltsyre, vand og en saltopløsning. Den organiske fase blev skilt fra, tørret over magnesiumsulfat og koncentreret i vakuum til tørhed. Remanensen blev udrevet med diethylether 25 og filtreret under nitrogen, 3,43 g (74 % udbytte).

IB. N-heptanoyl-D-fr-qlutamyl-qlycyl-D-alanin

Til en opløsning af 2,0 g (4,78 mmol) N-heptanoyl-D- -30 glutamyKa-benzylester-p-toluensulfonsyresalt, 506 mg (5 mmol) triethylamin og 675 mg (5 mmol) 1-hydroxybenzo-triazol i 100 ml tetrahydrofuran sattes 3,03 g (7,17 mmol) l-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid-metho-p-to-luensulfonat, og reaktionsblandingen blev omrørt ved stue-35 temperatur i 18 timer. Reaktionsblandingen blev derpå τ hældt ud i 300 ml ethylacetat, og den organiske fase blev 14 DK 170345 B1 skilt fra og vasket med 10 % saltsyre, vand, en mættet natriumhydrogencarbonatopløsning og en saltopløsning. i

Den organiske fase blev skilt fra, tørret over magnesiumsulfat og koncentreret i vakuum. Remanensen blev udrevet 5 med diethylether og filtreret under nitrogen, 2,7 g.

2 g af det faste stof i 75 ml methanol med 400 mg 10 % palladiumhydroxid på kul blev rystet i en hydrogenatmosfære ved et begyndelsestryk på 345 kPa i 4 timer. Katalysatoren blev frafiltreret, og filtratet inddampet under 10 reduceret tryk, og remanensen blev opløst i vand og lyofi- liseret, hvilket gav 1,23 g (90 S udbytte) af det ønskede produkt som et hvidt fast stof.

NMR-spektret (DMS0-dg) viste absorption ved 4,35-4,2 (m, 2H), 3,83 (s, 2H), 2,35 (t, J=7Hz, 2H), 2,17 (t, 15 J = 7Hz, 2H), 2,1-1,8 (m, 2H), 1,55-1,45 (m, 2H), 1,3 (d, J = 6Hz, 3H), 1,17 (bs, 6H) og 0,75 (bs, 3H) ppm.

EKSEMPEL 2 20 N-Hept anoyl-D-fl'-glutamyl-glycin [R1 = CH3(CH2)5, R2 = H, R3 = OH]

En opløsning indeholdende 1,0 g N-heptanoyl-D-y-glutamyl-(a-benzylester)-glycin i 50 ml methanol blev behandlet 25 med 100 mg 10 % palladiumhydroxid på kul og rystet i en hydrogenatmosfære ved 345 kPa i 3 timer. Katalysatoren blev frafiltreret, og filtratet koncentreret i vakuum.

Remanensen blev opløst i varmt vand og inddampet i vakuum. Remanensen blev igen opløst i vand og lyofiliseret, 30 hvilket gav 630 mg (83 % udbytte) af det ønskede produkt som et hvidt fast stof.

NMR-spektret (DMSO-d^) viste absorption ved 4,37-4,25 (m, IH), 3,9 (s, 2H), 2,35 (t, J=7Hz, 2H), 2,18 (t, J=6Hz, 2H), 2,4-1,8 (m, 2H), 1,6-1,4 (m, 2H), 1,8 (bs, 6H) og 35 0,7 (bt, 3H) ppm.

15 DK 170345 B1 EKSEMPEL 3 N-Heptanoyl-D-y'-qlutaiTiyl-qlvcyl-qlycin [Rx = CH3(CH2)5, R2 = H, R3 = NHCH2C02H] 5 3A. N-heptanoyl-D-}T-glutamyl(Q'-benzylester)-glycin-hydroxysuccinimidBster_

Til en kold opløsning (0 °C) af 13,0 g (31 mmol) N-hepta-10 noyl-D-a'-glutamyl(o’-benzylester)-glycin og 3,91 g (34 mmol) N-hydroxysuccinimid i 400 ml tetrahydrofuran sattes 7,0 g (34 mmol) dicyclohexylcarbodiimid, og blandingen blev omrørt ved 0 °C i en time og ved stuetemperatur i 18 timer. Det faste stof blev frafiltreret, og filtra-13 tet koncentreret under formindsket tryk. Remanensen blev udrevet med diethylether og frafiltreret under nitrogen, hvilket gav 15,4 g (98 %) af det ønskede mellemprodukt .

20 3B. N-heptanoyl-D-V-glutamyl-qlycyl-qlycin

Til 2,0 g (3,97 mmol) N-heptanoyl-D-if-glutamyl(a-benzyl-ester)-glycin-hydroxysuccinimidester i 100 ml dioxan sattes 446 mg (5,95 mmol) glycin og 0,55 ml (3,9 mmol) 25 triethylamin i 10 ml vand, og reaktionsblandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 18 timer. Opløsningen blev hældt ud i 100 ml ethylacetat, og det organiske lag blev vasket med 2,5 % saltsyre, vand og en saltopløsning.

Det organiske lag blev skilt fra, tørret over magnesium-30 sulfat og koncentreret til tørhed. Remanensen blev udrevet med diethylether og frafiltreret under nitrogen, hvilket gav 1,7 g hvidt fast stof. 1,5 g af det faste stof i 75 ml methanol indeholdende 200 mg 10 % palladiumhydroxid på kul blev rystet i en hydrogenatmosfære ved 345 kPa 35 i 3 timer. Katalysatoren blev frafiltreret, og filtratet koncentreret i vakuum. Remanensen blev opløst i vand og DK 170345 Bl 16 lyofiliseret, hvilket gav 1,12 g (90 udbytte) af det ønskede produkt. * NMR-spektret (DMSO-d^) viste absorption ved 8,2-8,0 (m, 3H), 4,19 (m, IH), 4,8-4,6 (m, 4H), 2,25 (t, J=7Hz, 5 2H), 2,1 (t, J = 6Hz, 2H), 2,05-1,7 (m, 2H), 1,5 (m, 2H), 1,25 (bs, 6H) og 0,85 (t, J=6Hz, 3H) ppm.

EKSEMPEL 4 10 N-Heptanoyl-D-/-qlutamyl-qlycyl-D-serin

D

[R1 = CH3(CH2)5, R2 = H og R3 = -NHCH(CH2OH)C02H)]

Ud fra 2,0 g (3,98 mmol) N-heptanoyl-D-y-glutamyl(a-ben-zylester)-glycin-hydroxysuccinimidester, 780 mg (4,02 15 mmol) 0-benzyl-D-serin og 0,556 ml (4,02 mmol) triethyl- amin og ifølge proceduren fra eksempel 3B isoleres 902 mg (76 % udbytte) af det ønskede produkt, smp. 130-132 °C. NMR-spektret (DMSO-d^) viste absorption ved 8,36-7,94 (m, 3H), 4,46-4,28 (m, IH), 4,28-4,08 (m, IH), 3,94-3,50 20 (m, 4H), 2,25 (t, J=9Hz, 2H), 2,17 (t, J=9Hz, IH), 2,10-1,04 (m, 14H) og 0,9 (t, J=6Hz, 3H) ppm.

EKSEMPEL 5 25 N-Heptanoyl-D-y'-qlutamyl-qlycyl-D-O'-aminosiTiørsyre

D

[Rx = CH3(CH2)5-, R2 = H, R3 = -NHCH(CH2CH3)C02H]

Proceduren fra eksempel 3B blev gentaget ud fra 2,0 g (3,98 mmol) N-heptanoyl-D-)f-glutamyl(α-benzylester)-gly-30 cyl-hydroxysuccinimidester, 400 mg (4,02 mmol) D-a-amino- smørsyre og 0,556 ml (4,02 mmol) triethylamin, hvilket gav 632 mg (57 & udbytte) af det ønskede produkt, smp.

140-141 °C.

NMR-spektret (DMSO-d^) viste absorption ved 8,16-8,04 35 (m, 3H), 4,22-4,08 (m, 2H), 3,84-3,58 (m, 2H), 2,2 (t, J = 9Hz, 2H), 2,12 (t, J = 9Hz, 2H), 2,04-1,0 (m, 15H) og 17 DK 170345 B1 0,85 (t, J=6Hz, 6H) ppm.

EKSEMPEL 6 5 N-Heptanoyl-D-^-qlutamyl-qlycyl-3-aminopropionsyre [r2 = ch3(ch2)5-, r2 = h, r3 = -nh(ch2)2co2h]

Ifølge proceduren fra eksempel 3B og ud fra 1,5 g (3,0 mmol) N-heptanoyl-D-/-glutamyl(o’-benzylester)-glycin-hy-10 droxysuccinimidester, 350 mg (3,9 mmol) 3-aminopropion- syre og 0,55 ml (3,9 mmol) triethylamin blev der opnået 500 mg (43 % udbytte) af det ønskede produkt, smp. 135-138 °C. NMR-spektret (DMSO-d^) viste absorption ved 8,19-8,02 (m, 2H), 7,98-7,87 (t, J=5Hz, IH), 4,25-4,1 (m, 2H), 15 3,8-3,49 (m, 2H), 3,44-3,1 (m, 2H), 2,4 (t, J=6Hz, 2H), 2,22 (t, J=7Hz, 2H), 2,14 (t, J=7Hz, 2H), 2,1-1,67 (m, 2H), 1,6-1,17 (m, 8H) og 0,88 (t, J=6Hz, 3H) ppm.

EKSEMPEL 7 20 N-Heptanoyl-D-y-qlutamyl-qlycyl-4-aminosmørsyre [R1 = CH3(CH2)5-, R2 = H, R3 = -NH(CH2)3C02H]

Proceduren fra eksempel 6 blev gentaget, idet der blev 25 anvendt 410 mg (4,0 mmol) 4-aminosmøresyre i stedet for 3-aminopropionsyren, hvilket gav 600 mg (50 % udbytte) af det ønskede produkt, smp. 140-142 °C.

NMR-spektret (DMSO-dg) viste absortion ved 8,18-8,03 (m, 2H), 7,88 (bt, J=4Hz, IH), 4,17-4,09 (m, 2H), 3,81-30 3,48 (m, 2H), 2,32-2,08 (m, 6H), 2,08-1,08 (m, 12H) og 0,88 (t, J=6Hz, 3H) ppm.

EKSEMPEL 8 35 N-Heptanoyl-D-/-qlutamyl-qlycyl-5-amino-pentansyre [R1 = CH3(CH2)5-, r2 = H, R3 = -NH(CH2)4C02H] 18 DK 170345 B1

Idet der anvendtes 470 mg (4,0 mmol) 5-aminopentansyre i stedet for 3-aminosmørsyre, og ifølge proceduren fra s eksempel 6 blev der opnået 520 mg (42 % udbytte) af det ønskede produkt, smp. 122-124 °C.

5 NMR-spektret (DMSO-d^) viste absorption ved 8,25-7,94 (m, 2H), 7,85 ( t, J=5Hz, IH), 4,25-4,1 (m, 2H), 3,82-3,46 (m, 2H), 3,24-2,9 (m, 2H), 2,21-2,08 (m, 6H), 2,08-1,2 (m, 14H) og 0,88 (t, J=6Hz, 3H) ppm.

10 EKSEMPEL 9 N-Heptanoyl-D-y^-qlutamyl-qlycyl-6-aminohexansyre [r1= ch3(ch2)5- , r2 = h, r3 = -nh(ch2)5co2h] 15 Proceduren fra eksempel 6 blev igen gentaget, idet der anvendtes 530 mg (4,0 mmol) 6-aminohexansyre i stedet for 3-aminosmørsyren, hvilket gav 520 mg (40 % udbytte) af det ønskede produkt som et hvidt skum.

NMR-spektret (DMS0-dg) viste absorption ved 8,28-7,9 20 (m, 2H), 7,82 (bt, J=4Hz, IH), 4,27-4,1 (m, 2H), 3,81-3,47 (m, 2H), 3,15-2,90 (m, 2H), 2,3-2,08 (m, 6H), 2,08-1,18 (m, 16H) og 0,88 (t, J=6Hz, 3H) ppm.

EKSEMPEL 10 25 N-Isovaleryl-D-/-qlutamyl-qlycyl-D-alanin

D

CRχ = (CH3)2CHCH2-, R2 = H, R3 = -NHCH(CH3)C02H] 10A. Glycyl-D-alanin-benzylester-hydrochlorid 30

Til en kold (0 °C) opløsning bestående af 100 ml methylen-chlorid indeholdende 10 g (57 mmol) N-t-butyloxy-carbonyl-glycin, 20 g (57 mmol) D-alanin-benzylester-p-toluensul-fonsyresalt og 5,77 g (57 mmol) triethylamin sattes 12,3 g 35 (60 mmol) dicyclohexyl-carbodiimid, og reaktionsblandingen fik lov at opvarmes til stuetemperatur. Efter 18 timer DK 170345 Bl 19 blev blandingen filtreret, og filtratet koncentreret i vakuum. Remanensen blev opløst i 200 ml ethylacetat, og det organiske lag vasket med 2,5 % saltsyre, vand, en mættet natriumhydrogencarbonatopløsning og en salt-5 opløsning. Det organiske lag blev skilt fra, tørret over magnesiumsulfat og inddampet under formindsket tryk. Til den resulterende olie sattes 200 ml dioxan mættet med hydrogenchlorid. Efter 30 minutter tilsattes 400 ml diethylether, og produktet blev frafiltreret 10 under nitrogen, 10,9 g (70 ?ό udbytte).

10B. N-t-butoxycarbonyl-D-^-glutamyl(a-benzylester)-hydroxysuccinimidester_ 15 Til 1500 ml methylenchlorid indeholdende 50 g (143 mmol) N-t-butoxycarbonyl-D-Y-glutaminsyre-a-benzylester og 17,3 g (150 mmol) N-hydroxysuccinimid sattes 30,9 g (15 mmol) dicyclohexylcarbodiimid, og reaktionsblandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 18 timer. Det faste 20 stof blev frafiltreret, og filtratet koncentreret i vakuum. Remanensen blev udrevet med diethylether, og det faste stof frafiltreret under nitrogen, 43,7 g (68 % udbytte).

25 10C. D-y-glutamyl(o!-benzylester)-glycyl-D-alanin-benzyl- ester-hydrochlorid__

En opløsning af 4,3 g (9,45 mmol) N-t-butoxycarbonyl-D-/-glutamyl(o!-benzylester)-hydroxysuccinimidester, 2,71 g 30 (9,92 mmol) glycyl-D-alanin-benzylester-hydrochlorid og 1,0 g (9,92 mmol) triethylamin i 100 ml methylenchlorid blev omrørt ved stuetemperatur i 18 timer og blev derpå koncentreret i vakuum. Remanensen blev opløst i 200 ml ethylacetat, og opløsningen blev vasket med 35 2,5 % saltsyre, vand, 10 % kaliumcarbonatopløsning og en saltopløsning. Den organiske fase blev skilt fra, 20 DK 170345 B1 tørret over magnesiumsulfat og inddampet under formindsket tryk. Remanensen blev udrevet med 200 ml dioxan mættet med hydrogenchlorid og omrørt i to timer. Opløsningen blev koncentreret til tørhed i vakuum, og rema-5 nensen blev udrevet med diethylether. Det faste stof blev frafiltreret under nitrogen, 3,41 g (73 % udbytte).

10D. N-isovale ry l-D-Y'-qlutamyl-qlycyl-D-alanin 10 Til en opløsning af 1,0 g (2,03 mmol) D-Y'-glutamyl(a-ben- zylester)-glycyl-D-alanin-benzylester-hydrochlorid og 616 mg (6,09 mmol) triethylamin i 50 ml methylenchlorid sattes 490 mg (4,06 mmol) isovalerylchlorid, og reaktionsblandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 80 timer.

15 Methylenchloridet blev afdampet i vakuum, og remanensen opløst i ethylacetat. Den resulterende opløsning blev vasket med 2,5 % saltsyre, vand, 10 % kaliumearbonat-opløsning, vand og en saltopløsning. Den organiske fase blev skilt fra, tørret over magnesiumsulfat og koncen-20 treret under vakuum. Remanensen blev udrevet med diethyl ether, frafiltreret under nitrogen (910 mg), og 700 mg blev opløst i 50 ml methanol. Der sattes 200 mg palladium-hydroxid til opløsningen, og blandingen blev rystet i en hydrogenatmosfære ved 345 kPa i 3 timer. Katalysato-25 ren blev frafiltreret, og opløsningsmidlet fjernet i vakuum. Remanensen blev opløst i vand og lyofiliseret, hvilket gav 364 mg (65 % udbytte) af det ønskede produkt. NMR-spektret (DMS0-dg) viste absorption ved 8,25-8,05 (m, 3H), 4,33-4,12 (m, 2H), 3,72 (d, J=6Hz, 2H), 2,21 30 (t, J=8Hz, 2H), 1,88-1,68 (m, IH), 2,08-1,9 (m, 4H), 1,28 (d, J = 9Hz, 3H) og 0,9 (d, J = 7Hz, 6H) ppm.

EKSEMPEL 11 35 Ud fra det passende syrechlorid og D-Y'-glutamyl(oi-benzyl- ester)-glycyl-D-alanin-benzylester-hydrochlorid og under 21 DK 170345 B1 anvendelse af proceduren fra eksempel 1QD fremstilledes de følgende forbindelser:

5 O

II

R. CNH_ C0oH

1 \D / 2 ca' I d

(CH2)2C0NHCH2C0NHCHC02H

10 CH3

Ri 5mp. ,*C NMR, ppm CH3(CH2)8- >175 (DMSO-dg) 8.17-8.22 (m, 2H), 4.35-4.13 (m, 2H), 3.83 (d, J* 6Hz, 2Ξ) , 2.22 (t, J=6Hz, 2H), 2.15 (t, 2Q J*6Hz, 2H), 2.08- 1.65 (m, 2H), 1.45- 1.18 (m, 17H) and 0.90 (tf J=7Hz, 3H) 25 30 35

Snip. ,*C HMR, ppm 22 DK 170345 B1 (CH3)2CH- >110 (dec) (DHSO-dg) 8.2-8.08 (m, 23), 8.02 (d, J* 5 9Hz, IH), 4.3-4.1 (m, 2H), 3.72 (d, J*7Hz, 2H), 2.53-2.40 (m, IH), 2.22 (t, J=9Hz, 2H), 2.10-1.7 (m, 10 2H), 1.28 (d, J*=9Hz, 3H) and 1.08-0.9 (m, 6H)

Us)V >110 (dec) (DHSO-dg) 8.3-7.9 15 '—' (m, 3E), 4.33-4.17 (m, 2H), 3.72 (d, J=5Hz, 2H), 2.3-2.1 (m, 2H) and 2.10-1.0 (m, 16H) 20 CH3(CH2)2- >110 (dec) (DHSO-dg) 8.25-8.05 (m, 3H), 4.35-4.22 (m, 2H), 3.72 (d, J= 6Hz, 2H), 2.22 (t, 25 J=8Hz, 2H) , 2.12 (t, J=8Hz, 2H), 2.08- 1.77 (m, 2H), 1.55 (q, J=8Hz, 2H), 1.28 (d, J=8Hz, 3H) and 30 0.88 (t, J=7Hz, 3H) * 1 R1 Smp « ,*C NMR, ppm 23 DK 170345 B1 CH3(CH2)4- >190 (dec) (DMSO-dg) 8.33-8.0 (mr 3B), 4.35-4.1 5 (m, 2B), 3.7 (d, J= 6Bz, 2B), 2.17 (t, J*8Hz, 2B), 2.1 (c, J=8Hz, 2H)t 2.05- 1.63 (m, 2H), 1.48 10 (t, J»7Hz, 2H), 1.2- 1.1 (η, 7H) and 0.85 (t, J=7Hz, 3H) CH3(CH2)6- >180 (dec) (D20) 4.42-4.28 (in, 2H) , 3.91 (s, IH), 2.4 (t, J=7Hz, 2H), 2.27 (t, J=7Hz, 2H), 2.22-1.94 (m, ^ 2H), 1.65-1.55 (m, 2H), 1.39 (d, J=8Hz, 3H), 1.34-1.17 (m, 8H) and 0.73 (m, 3H) 25 30 24 DK 170345 B1 *1 .Smp-,f°c MKRr.jppm CH, I 3 CH3(CH2)3CHCH2- — (WSO-d6) 8.27-8.03 5 (s) (b, 3H), 4.32-4.1 <b, 2H), 3.72 {d, J=6Hzf 2H), 2.22 (t, J*10H2, 2H), 2.27-1.68 (m, 6H), 10. 1.42-1.0 (m, 10H) and 0.94-0.8 (m, 6H) I 3 3 CH,(CH0),CH- — (DMSO-dc) 8.22-8.0 15 3 2 3 6 (H,S) (a, 3H), 4.32-4.1 (b, 2H), 3.8-3.6 (a, 2H), 2.28-1.68 (a, 6H), 1.6-1.0 (Br 12H) and 0.94- 20 0.7 (m, 6H).

(CH3CH2)2CH- — (DMSO-dg) 8.29-7.97 (b, 3H), 4.33-4.1 25 (b, 2H) , 3.81-3.59 (a, 2H), 2.32-1.65 (af 6H)t 1.65-1.17 (π, 8H) and 1.02- 0.68 (mr 6H) 30

Rj^ SmD. >*C NMR, ppm 25 DK 170345 B1 /(s)VcH2- — (DMSO-dg) 8.3-8.0 (b, 3H) , 4.32-4.1 9 (b, 2H), 3.85-3.62 (b, 2H), 2.21 J=8Hz, 2H), 2.02 (d, J=8Hz, 2H), 2.01-1.9 (m, IH), 10 1.85-1.5 (m, 8H), 1.28 (d, J=8Hz, 3H) and 1.28-0.8 (m, 5H) (CH-CH.CH-)-CBCB0 — (DMS0-dc) 8.18-8.0 15 J i i L· c (m, 3H), 4.31-4.1 (m, 2H), 3.84-3.6 (b, 2H), 2.22 (t, J*6Hz, 2H), 2.07 {d, J=8Hz, 2H), 20 2.03- 1.7 (m, 3H), 1.4- 1.15 (ro, 11H) and 0.87 (tf J=6Hz, 6E) 25 (CH3CH2)2CHCH2- — (DMS0-d6) 8.27-7.95 (m, 3H), 4.3-4.1 (m, 2H), 3.78-3.6 (m, 2H), 2.3-1.57 (m, 8H), 1.46-1.13 (m, 30 8H) and 0.84 (t, J= 8Hz, 6H) DK 170345 B1 ’ .26 R1 Smo»,°C. NMR, ppm CH, I 3 CH3(CH2)3CHCH2- — (DMSO-dg) 8.18-8.0 5 (R,S) (m, 3H), 4.24-4.06 (m, 2H), 3.74-3.56 .

(m, 2H), 2.17 (t, J= 9Hz, 2H), 2.12-2.0 <m, IH), 2.0-1.64 1° <m, 4H), 1.24 (d, J=6Hz, 7H), 1.14- 0.98 (m, 2H) and 0.81 (d, J=6Hz, 6H) 15 CH, I 3 CH3(CH2)2CHCH2- — (DMSO-dg) 8.2-8.04 (R,S) (m, 3H), 4.26-4.08 (m, 2H), 3.76-3.6 {m, 2H), 2.28-1.64 20 (m, 7H), 1.4-0.96 (m, 7H) and 0.96- 0.74 (in, 6H).

25 30 27 DK 170345 B1 R1 Stod . »°C. HHR, ppm (CH3)2CH{CH2)3- — (DMSO-dg) 8.24-7.95 (n, 3H), 4.3-4.08 5 (m, 2H), 3.81-3.59 (m, 2H), 2.21 (t, J«6Hz, 2H), 2.11 (t, J*8Hz, 2H), 2.05-1.38 (m, 7H), 10- 1.27 (d, J*8Hz, 3H) , 1.17-1.05 (m, 2H) and 0.86 (d, J=10Hz, 6H) 15 CH0 -- (DMSO-d,) 8.24-8.0 I 3 o CH3(CH2)4CH- (m, 3H), 4.33-4.11 (R,S) (m, 2H), 3.79-3.6 (m, 2H), 2.41-2.29 (m, IH), 2.22 (t, J=8Hz, 2H), 2.11-1.66 (m, 2H), 1.59-1.43 (m, IH), 1.38-1.11 (m, 11H), 1.06-0.95 (m, 3H) and 0.87 25 (t, J=6Hz, 3H) 30 5mp.r*C. NMR, .ppm 28 DK 170345 B1 CH,CH, 31 2 CH3(CH2)3CHCH2- — (DMSO-dg) 8.24-8.02 5 <R,S) . <m, 3H), 4.32-4.11 (m, 2H), 3.84-3.6 (m, 2H), 2.24 (t, J«8Hz, 2H), 2.08 (d, J-8Hz, 2H), 2.03- l°- 1.63 (m, 4H), 1.44- 1.11 (mr 12H) and 0.97-0.71 (m, 6H) 15 (CH3)2CH(CH2J4- — (DMSO-dg} 8.24-8.04 (m, 3H), 4.28-4.Γ (m, 2H), 3.76-3.6 (m, 2H), 2.18 (t, J= 6Hz, 2H), 2.1 (t, __ J=6Hz, 2H), 2.04-

M

1.86 (mr IH), 1.84- 1.66 (m, IH), 1.56- 1.38 (m, 3H), 1.23 (d, J=6Hz, 3H), 1.2- 1.06 (m, 3H) and 0.82 (d, J=6Hz, 6H) 30

Rx Smry« ,*C« NMR, ppm 29 DK 170345 B1 CH-, I 3 CT3(ch2)4chcH2- — (DMSO-dg) 8.23-7.98 5 (R/S) (b, 3H), 4.3-4.13 (b, 2H), 3.81-3.61 (b, 2H), 2.22 (t, J=8Hz, 2H), 2.18- 1.68 (mr 6H), 1.45- 10 - 1.07 (mr 12H) and -0.98-0.8 (ro, 6H) CH-I 3 15 (CH3)2CH(CH2)2CHCH2- — (DMSO-dg) 8.37-8.03 (R,S) (b, 3H), 4.31-4.1 (n, 2H), 3.78-3.6 (b, 2H), 2.26 (t, J=8Hz, 2H), 2.2-1.36 (b, 7H), 1.3 (d, J= 8Hz, 5H), 1.26-1.05 (b, 2H) and 1.05- 0.73 (m,. 9H) 25 30 R1 Snrn.i°C. NMR, ppm 30 DK 170345 B1 CH3 — (DMSO-dg) 8.23-7.98 (CH3)2CHCH2CHCH2- (m, 3H) # 4.3-4.13 5 (m, 2H), 3.81-3.61 (m, 2H), 2.21 (t, J»8Hz, 2H), 2.15- 2.0 (m, 2H)r 1.9 (t, J=8Hz, 2H), 10_ 1.85-1.52 (m, 3H), 1.4-1.22 (m, 3H), 1.22-0.94 (m, 3H) and 0.94-0.80 (m, 6H) 15 CH.CH0 31 2 CH3 (CH2) 2CHCH2- — (DMSO-dg) 8.25-7.98 (R,S) (m, 3H), 4.3-4.08 (m, 2H), 3.81-3.62 M (m, 2H), 2.22 (t, J=8Hz, 2H), 2.06 (dr J=8Hz, 2H)r 2.02-1.89 (mr IH) , 1.87-1.65 (m, 2H) , 1.41-1.06 (m, 11H) 25 and 0.98-0.7 (m, 6H) 30 RX Smp.,°C. NMR, ppm I , 31 DK 170345 B1 [ VcH2- — (DMSO-dg) 8.33-7.95 (m, 3H), 4.3-4.06 5 Cm, 2B), 3.83-3.59 (m, 2B), 2.21 (t, J—8Bz, 2H), 2.11 (s, 3B), 2.08-1.87 (m, IB), 1.87-1.35 (m, 10 8B), 1.25 (d, J=8Hz, 3H) and 1.22-0.98 (m, 3B) (CH3CB2)2CB(CH2)2- — CDMSO-dg) 8.21-8.0 (ro, 3H), 4.32-4.1 (m, 2B), 3.83-3.6 (m, 2H), 2.21 (t, J-8BZ, 2H), 2.11 (t, J*8Bz, 2H), 2.05-1.89 (m, IB), 1.87-1.67 (ro, IB), 1.57-1.38 (ro, 3B), 1.38-1.08 (m, 9H) and 0.83 (t, J=6Hz, 25 _ .

. 6H) 30

Smp»· °C. NMR, ppm 32 DK 170345 B1 CH-I 3 εΒ3(εΒ2)2σΒ(εΒ2)2- — (D«so-d5) 8.24-7.97 5 (RfS) (b, 3H), 4.33-4.1 (b, 2H>, 3.86-3.59 (b, 2H), 2.35-2.08 (a, 4H), 2.08-1.9 (Bf IB), 1.89-1.67 (b, IH), 1.63-1.46 (b, IH), 1.46-1.02 (b, 11H) and 0.98- 0.73 (m, 6H) 15 CH-CH., 31 2 CH3(CH2)4CHCH2- — (DMSO-dg) 8.2-7.94 (R,S) (a, 3H), 4.26-4.06 (b, 2H), 3.76-3.56 2© (b, 2H), 2.16 (t, J=6Hz, 2H), 2.1-1.84 (a, 3H), 1.84-1.6 (B, 2H), 1.24 (d, J= 6Hz, 9H), 1.12-0.92 (b, 3H) and 0.92-0.64 (b, 9H) 30

Rj Smp .,*C. NMR, ppm 33 DK 170345 B1 CH- I 3 CH3(CH2)5CHCH2- — (DMSO-dg) 8.23-8.0 5 <R,S) (m, 3H), 4.32-4.06 (η, 2H), 3.72 (d, J=8Hz, 2H)t 2.22 (t, J=10H2, 2H), 2.16-1.7 (η, 6H), 10 1.42-1.08 (m, 14H) and 0.92-7.0 (m, 6H) ?2H5 CH3(CH2)3CHCH2 — (DMSO-dg) 8.2-8.0 (S) <m, 3H), 4.24-4.16 (m, 2H), 3.74-3.60 (m, 2H), 2.18 (t, J=7, 2H), 2.02 (d, J=7, 2H), 2.02-1.6 20 (m, 3H), 1.26 (d, J=6, 3B)t 1.26-1.08 (m, 8H) and .92-.74 (m, 6H) 25 30 34 DK 170345 B1 EKSEMPEL 12 N-(3-(5)-Methylheptanoyl)-D-y-qlutamyl-L-analyl-D-alanin >rx = (s)ch3(ch2)3ch(ch3)ch2-, r2 = ch3, 5 r3 = -nhch(ch3)co2h< 12A. N-t-butoxycarbonyl-L-alanyl-D-alanin-benzylester

Til en opløsning af 23,0 g (0,121 mol) N-t-butoxy-carbo-nyl-L-alanin, 42,6 g (0,121 mol) D-alanin-benzylester-p-toluensulfonsyresalt og 17 ml (0,121 mol) triethylamin i 400 ml koldt (0 °C) methylenchlorid sattes dråbevis 25,0 g (0,121 mol) dicyclohexylcarbodiimid i 100 ml methylenchlorid. Efter omrøring natten over ved stuetemperatur blev det faste stof frafiltreret, og filtratet koncentreret til en olie. Remanensen blev opløst i 400 ml ethylacetat, som blev vasket med 1 % saltsyre, 10 % kaliumcarbonatopløsning, vand og en saltopløsning. Den organiske fase blev skilt fra, tørret over magnesium- 20 sulfat og koncentreret til en olie. Remanensen blev udrevet med diethylether, og det resulterende faste stof blev frafiltreret under nitrogen, 16,0 g. Yderligere 12,7 g af det ønskede produkt udkrystalliserede fra filtratet.

25 12B. L-alanyl-D-alanin-benzylester-hydrochlorid

Til en opslæmning af 28,7 g N-t-butoxycarbony1-L-alanyl-D-alanin-benzylester i 150 ml dioxan sattes 150 ml dioxan mættet med hydrogenchlorid, og blandingen blev omrørt i 4 timer ved stuetemperatur. Opløsningsmidlet blev fjernet i vakuum, og remanensen udrevet med diethylether.

Det resulterende faste stof blev frafiltreret, genopløst i methylenchlorid, og opløsningen koncentreret til omkring ^ 150 ml. Der tilsattes ether, og det faste stof blev frafiltreret under nitrogen, 22,0 g.

35 DK 170345 B1 12C. N-t-butoxycarbony1-D~y-glutamyl{o-benzylester)-L-ala-nyl-D-alanin-benzylester_

Til en opslæmning af 5,0 g (9,64 mmol) N-t-butoxycarbonyl-5 D-y-glutamin-of-benzylester-dicyclohexylamin og 2,76 g (9,64 mmol) L-alanyl-D-alanin-benzylester-hydrochlorid i 100 ml methylenchlorid afkølet til 0 °C sattes 2,0 g (9,64 mmol) dicyclohexylcarbodiimid i 20 ml af det samme opløsningsmiddel. Efter omrøring natten over ved stuetem-10 peratur blev det faste stof frafiltreret, og filtratet koncentreret i vakuum. Remanensen blev behandlet med 150 ml ethylacetat, det faste stof frafiltreret, og filtratet vasket med 1 ?0 saltsyre, 10 % kaliumcarbonat-opløsning, vand og en saltopløsning. Den organiske fase 15 blev tørret over natriumsulfat og koncentreret, hvilket gav et hvidt fast stof, som efter udrivning med ether og filtrering gav 4,1 g af det ønskede produkt.

12D. D~Y~glutamyl{o-benzylester)-L-ananyl-D-alanin-benzyl-20 ester-hydrochlorid_

Til en opslæmning af 4,1 g (7,21 mmol) N-t-butoxycarbonyΙΟ-/- glut amyl (o1-benzy lester )-L-al anyl-D-alan i n-benzyl es t er i 50 ml dioxan sattes 100 ml dioxan mættet med hydrogen-25 chlorid, og reaktionsblandingen blev omrørt i 3 timer ved stuetemperatur. Opløsningsmidlet blev fjernet under vakuum, og remanensen udrevet med diethylether, 3,5 g.

12E. N-(3-(S)-methylheptanoyl)-D-^-glutamyl(ø-benzy1-30 ester)-L-alanyl-D-alanin-benzylester_

Til 1,0 g (1,98 mmol) D~y-glutamyl(oi-benzylester)-L-ala-nyl-D-alanin-benzylester og 0,833 ml (5,93 mmol) tri-ethylamin i 50 ml methylenchlorid sattes 390 mg (2,37 35 mmol) 3-(S)-methylheptanoylchlorid, og reaktionsblandingen blev omrørt under nitrogen i 45 minutter. Reaktionsbian- 36 DK 170345 B1 dingen blev omrørt under nitrogen i 45 minutter. Reaktionsblandingen blev hældt ud i 150 ml ethylacetat, og den organiske fase blev vasket med 10 % saltsyre, 10 % kaliumcarbonatopløsning, vand og en saltopløsning. Den 5 organiske fase blev tørret over natriumsulfat og kon centreret til tørhed. Remanensen blev udrevet med ether og frafiltreret under nitrogen, 900 mg.

12F. N-(3-(S)-methylheptanoyl-D-y1glutamyl-L-alanyl-D-10 alanin_

En blanding af 200 mg palladiumhydroxid på kul og 900 mg N-(3-(S)-methylheptanoyl)-D-lf-glutamylC -benzylester)-L-alanyl-D-alanin-benzylester i 50 ml methanol blev rystet 15 i en hydrogenatmosfære ved 345 kPa i 1 time. Katalysatoren blev fra filtreret, og opløsningsmidlet fjernet i vakuum.

Vand blev sat til remanensen og fjernet under formindsket tryk, hvilket gav 492 mg af produktet som et hvidt fast stof, smp. 165-168 °C.

20 NMR-spektret (DMSO-d^) viste absorption ved 8,21-7,98 (m, 3H), 4,41-4,1 (m, 3H), 2,3-2,06 (m, 4H), 2,06-1,56 (m, 6H), 1,43-1,02 (m, 11H) og 1,02-0,73 (m, 6H) ppm.

EK5EMPEL 13 25 N-(3-(S,R)-Ethylhexanoyl) -D-V'-glutamyl (α-n-buty lester )- qlycyl-D-alanin_ [Rx = CH3(CH2)2CH(C2H5)CH2-, R2 = H, R3 = -NHCH(CH3)C02H, R4 = n-C4Hg] 30 13 A. N- t-butoxy carbonyl-D-^f-gl ut am i n( a-n-buty lest er)- di -cyclohexylaminsalt_

En opløsning af 39,5 g (0,172 mol) N-t-butoxy-carbonyl-D-35 glutaminsyreanhydrid i 75 ml tørt tetrahydrofuran sattes dråbevis i løbet af to timer til en opløsning af 47 ml 37 DK 170345 B1 (0,516 mol) n-butanol og 34,3 ml (0,172 mol) dicyclo-hexylamin i 300 ml ether ved 0 °C. Reaktionsblandingen blev omrørt ved 0 °C i 3 timer og blev opbevaret i køleskab natten over. Det faste stof blev frafiltreret, 5 opslæmmet i ethanol og frafiltreret, 43,3 g.

13B. D-y-glutamyl(a-n-butylester)-glycyl-D-alanin-ben-zylester-hydrochlorid_ 10 Produktet fra eksempel 13A (10 g, 0,021 mol) og 6,7 g (0,024 mol) glycyl-D-alanin-benzylester-hydrochlorid blev opslæmmet i 200 ml methylenchlorid under nitrogen og afkølet til 0 °C. Der tilsattes dicyclohexylcarbodiimid (4,25 g, 0,021 mol), og blandingen fik lov at opvarmes til stue-15 temperatur natten over. Urinstof-biproduktet blev frafil treret, og opløsningsmidlet fjernet i vakuum. Remanensen blev behandlet med ethylacetat, og blandingen blev filtreret. Filtratet blev vasket successivt med vand, 2,5 % saltsyre, vand, 10 % kaliumcarbonatopløsning og saltopløs-20 ning. Den organiske fase blev tørret over magnesiumsulfat, opløsningsmidlet fjernet under vakuum, og remanensen opløst i 300 ml dioxan mættet med hydrogenchlorid. Efter omrøring i 4 timer ved stuetemperatur blev opløsningsmidlet fjernet, og remanensen udrevet i ethylacetat/hexan (1:1) 25 og frafiltreret (7,4 g).

13C. N-(3 -(S, R)-ethy lhexanoyl-D-glutamyl (οί-n-buty l ester )-qlycyl-D-alanin_ 30 Til produktet fra eksempel 13B (1,0 g, 2,35 mmol) og 0,99 ml (7,05 mmol) triethylamin i 50 ml. methy lenchlorid sattes 460 mg (2,83 mmol) 3-(S,R)-ethylhexanoylchlorid, og reaktionsblandingen blev omrørt natten over under nitrogen. Opløsningsmidlet blev fjernet i vakuum, og remanensen op-35 løst i ethylacetat. Den organiske fase blev successivt va sket med 10 % saltsyre, vand, 10 % kaliumcarbonatopløsning 38 DK 170345 B1 og saltopløsning. Den organiske fase bleu skilt fra og tørret over magnesiumsulfat, og opløsningsmidlet blev fjernet under vakuum. Remanensen blev opløst i 10 ml methanol og rystet med 170 mg 10 % palladiumhydroxid i en 5 hydrogenatmosfære ved et begyndelsestryk på 345 kPa i 1,5 time.

Den brugte katalysator blev frafiltreret, og opløsningsmidet fjernet i vakuum, 100 mg.

10 NMR-spektret (DMSO-dg): 8,18 (d, 0=6, IH), 8,10 (d, 0=6, IH), 8,02 (t, 0=5, IH), 4,28-4,10 (m, 2H), 4,00 (t, J=6, 2H), 3,78-3,56 (m, 2H), 2,18 (t, 0=6, 2H), 2,02 (d, 0=6, ’ 2H), 2,00-1,60 (m, 3H), 1,58-1,42 (m, 2H), 1,28-1,08 (m, 8H), 1,24 (d, 0=6, 3H), 0,92-0,76 (m, 9H).

15 EKSEMPEL 14

Under anvendelse af den almene procedure fra eksempel 13 og ud fra de krævede reagenser fremstilledes de følgende 20 forbindelser:

O

li R.CNH D . C0oR, 1 \ / 24 ch' d

25 (CH2) 2CONHCH2CONHCH (ch3 ) C02H

R1 R4 . NMR

3-methylheptanoyl methyl NMR (DMSO-dg) s 8.23 (d, 3Q J=6, IB) f. 8.15 (d, J=6, IH), 8.09 (t, J=6, IH), 4.28-4.14 (m, 2H); 3.72 (d, J*6, 2H), 3.61 (s, 3H), 2.23 (t, J=7, 2H), 35 2.16-1.70 (m, 6H), 1.34- 1.04 (m, 8H), 1.25 (d, J=7, 3H), 0.92-0.76 (m, 6H).

R1 . R4 NMR

39 DK 170345 B1 3-ethylheptanoyl methyl NMR (DMSO-dg): 8.19 (d, 5 J*6, IH), 8.11 (d, J*6, IH), 8.03 (t, J-6, IH), . 4.24-4.10 (m, 2H), 3.74- 3.62 (m, 2H), 3.57 (s, 3H), 2.18 (t, J**9, 2H), 10 2.01 (d, J=6, 2H), 1.ΟΤ Ι.60 (m, 3H), 1.32-1.10 (m, 8H), 1.23 (d, J*7, 3H), 0.90-0.72 (m, 6H) 15 . 3-methylheptanoyl ethyl NMR (DMSO-dg) : 8,24-8.02 (m, 3H), 4.26-3.96 (m, 2H), 4.04 (q, J=9, 2H) , 3.76-3.56 (m, 2H) , 2.17 (t, J*7, 2H), 2.12-1.63 20 (m, 6H); 1.74-0.94 (m, 6H), 1.23 (d, J=5, 3H), 1.13 (t, J=9, 3H), 0.88- 0.72 (m, 6H) 25 30 ! i

R1 R4 HMR

40 DK 170345 B1 3-ethylheptanoyl ethyl NMR (DMSO-dg): 8.16 (d, J«6, IB), 8.09 (d, J*6, IH), 8.02 (t, J*6, IH), 4.22-4.08 (m, 2H), 4.02 (q, J-7, 2H), 3.74-3.54-(m, 2H), 2.16 (t, J=7, 10 2H) , 2.00 (d, J=6, 2H), 1.96-1.58 (m, 3H), 1.30- 1.08 (m, 8H), 1.21 (d, J=7, 3H), 1.13 (t, J=7, 3H) , 0.88-0.70 (m, 6H) 15 3-methylheptanoyl iso- NMR (DMSO-dg) : 8.14 (d, butyl J=6, IH), 8.08-7.98 (m, 2H), 4.20-4.04 (m, 2H), 3.75 (d, J=6, 2H), 3.68- 20 3.54 (m, 2H), 2.14 (t, J=6, 2H), 2.08-1.64 (m, 6H), 1.28-0.96 (m, 6H) , 1.19 (d, J=7, 3H) , 0.88=* 0.70 (m, 12H) 25 30

*1 R4 NMR

41 DK 170345 B1 3-ethylheptanoyl iso- NMR (DMSO-dg): 8.21 (d, butyl Je6, IH), 8.14-8.04 (m, 2H), 4.24-4.08 (m, 2H), 3.79 (d, J=*6, 2H) , 3.72- 3.58 (a, 2H), 2.19 (t, J-7, 2H), 2.03 (d, J*6, 2H), 1.99-1.60 (m, 4H), 1.32-1.10 (m, 8H), 1.23 (d, J=6, 3H), 0.92-0.72 (m, 12H) 15 3-ethylhexanoyl iso- NMR (DMSO-dg) : 8.18 (d, butyl J“6, IH), 8.10—8.00 (m, 2H) , 4.26-4.08 {ro, 2H) , 3.79 (d, J—6, 2H) , 3.72- 3.58 (m, 2H), 2.18 (t, 20 J=6, 2H), 2.02 (d, J=6, 2H), 1.98-1.62 (m, 4H), 1.34-1.08 (ro, 6H) , 1.23 {d, J=7, 3H), 0.96-0.72 (ro, 12H) 25 30

*1 R4 NMR

42 DK 170345 B1 3-ethylhexanoyl methyl NMR (DMSO-d^.): 8.21 (d, J«7, IH), 8.10 (d, J=7, IH), 8.05 (t, J=6, IH), 4.26- 4.10 (m, 2H), 3.76- 3.60 (m, 2H), 3.59 (s, 3H), 2.18 (t, J=6, 2H), 2.02 (d, J*6, 2H), 2.00- 1.60 (m, 31), 1.32-1.08 (m, 7H), 0.90-0.72 (m, 6H) .

15 3-ethylhexanoyl ethyl NMR (DMSO-dg): 8.22 (d, J=*7, IH), 8.18-8.06 (m, 2H), 4.26-4.10 {m, 2H), 4.06 (q, J=5, 2H), 3.78- 3.58 (m, 21), 2.20 (t, 20 J=6, 2H), 2.04 (d, J=6, 2H), 2.02-1.60 (m, 3H), 1.26- 1.20 (m, 7H), 1.18 (t, J=5, 31), 0.90-0.78 (m, 6H) 25 30 (

R1 R4 KMR

43 DK 170345 B1 3-methylheptanoyl butyl NMR {DMSO-dg): 8.20 (df J=7, IH), 8.16-8.04 (*, 2H), 4.24-4.06 (m, 2H), 4.00 (t, J*6, 2H), 3.74r 3.56 (m, 2H), 2.17 (t, J*6, 2H), 2.12-1.60 (b, 5H), 1.58-1.40 (m, 2H), 1.36-1.00 (m, 8H), 1.21 (d, J»6, 3H) , 0.90-0.74 (m, 9H) 15 3-ethylheptanoyl butyl NMR (DMSO-dg) s 8.16 (d# J=7, IH), 8.11 (d, J=7, IH), 8.03 (t, J=5, IH), 4.26-4.09 (m, 2H), 3.99 (t, J=7, 2H), 3.79-3.58 20 (m, 2H), 2.17 (t, J=6, 2H), 2.01 (d, J-6, 2H), 2.00-1.60 (m, 3H), 1.58- 1.42 (m, 2H), 1.36-1.08 (m, 10H), 1.24 (d, J=5, 25 3H), 0.92-0.72 (m, 9H) 30 44 DK 170345 B1 EKSEMPEL 15 N— ( 3 — (R j S )-Ethylhexanoyl)-D- Jr'-glutamyl-glycyl-D-alanin- ethylester_ 5 [R1 = CH3(CH2)2CH(C2H5)CH2-, R2 = H, r3 = -hnch(ch3)co2c2h5, r5 = H] 15A. D-Y^glutamyl (o-benzylester)-glycyl-D-alanin-ethyl-ester-hydrochlorid_ 10

Til en opslæmning af 14,8 g (0,0285 mol) N-t-butoxy-carbo-nyl-D- 'yLgiutaminsyre-o'-benzylester-dicyclohexylaminsalt og 6 g (0,0285 mol) glycyl-D-alanin-ethylester-hydro-chlorid i 200 ml methylenchlorid sattes 5,6 g (0,0270 mol) 15 dicyclohexylcarbodiimid, og blandingen blev omrørt under en nitrogenatmosfære natten over. Urinstoffet blev frafiltreret, og opløsningsmidlet fjernet i vakuum. Remanensen blev behandlet med 300 ml ethylacetat, blandingen blev filtreret, og filtratet blev vasket successivt 20 med 2,5 Si saltsyre, vand, 10 % kaliumcarbonatopløsning og saltopløsning. Den organiske fase blev skilt fra, tørret over magnesiumsulfat og koncentreret under vakuum.

Den resterende olie blev opløst i 450 ml dioxan mættet med hydrogenchlorid. Opløsningen blev omrørt i to timer, 25 og opløsningsmidlet fjernet i vakuum. Remanensen blev udrevet med ether og frafiltreret, 11,2 g.

15B. N(3 — (R,S)-ethylhexanoyl)-D-y^glutamyl-glycyl-D- alanin-ethylester_ 30

Til produktet fra eksempel 15A (1,0 g, 2,33 mmol) og 0,98 ml (6,98 mmol) triethylamin i 30 ml methylenchlorid under en nitrogenatmosfære sattes 378 mg (2,33 mmol) 3-(R,S)-ethylhexanoylchlorid. Efter omrøring ved stuetem-35 peratur i 1,5 time blev blandingen hældt ud i 100 ml ethylacetat, og den organiske fase blev vasket successivt 45 DK 170345 B1 med 10 % kaliumcarbonatopløsning og saltopløsning. Den organiske fase blev skilt fra, tørret over magnesiumsulfat og koncentreret i vakuum. Den hvide faste remanens blev opløst i 30 ml methanol og hydrogeneret over 0,1 5 g palladiumhydroxid i en hydrogenatmosfære ved et begynd elsestryk på 345 kPa. Efter to timer blev katalysatoren frafiltreret, filtratet koncentreret til tørhed, og remanensen udrevet med ether og frafiltreret, 275 mg.

NMR (DMSO-dg) 8,26 (d, J=9, IH), 8,14-8,02 (m, 2H), 10 4,31-4,00 (m, 2H), 4,06 (q, 3=10, 2H), 3,78-3,60 (m, 2H), 2,17 (t, J=8, 2H), 2,08-1,65 (m, IH), 2,03 (d, J=8, 2H), 1,82-1,53 (m, 3H), 1,40-0,96 (m, 5H), 1,23 (d, 3=6, 3H), ' 1,14 (t, 3=10, 3H), 0,90-0,64 (m, 6H).

15 EKSEMPEL 16

Ud fra de passende reagenser og under anvendelse af proceduren fra eksempel 15A-15B fremstilledes de følgende f orbindelser: 20

O

R1CNHV D CO-H

\ X

Cn D

25 I

(CH2) 2C0NHCH2C0NHCH (CH3) C02R5 30 35

• R1 R5 NMR

46 DK 170345 B1 3-methylheptanoyl iso-butyl NMR (DMSO-dg): 8.24 (d, J=6, IH), 8.10-8.00 (m, 2B), 4.30-4.18 (m, IH), 4.18-4.08 (m, IH), 3.86-3.72 (m, 2H), 3.72- 3.58 (ro, 2H), 2.16 (t, J=6, 2H), 2.12-1.64 (m, 6H) , 1.52-1.00 (m, 6H), 1.27 (d, J*7, 3H), 0.90-0.76 (m, 12H) 15 3-ethylhexanoyl iso-butyl NMR (DMSO-dg): 8.23 (d, J=6, IH), 8.08-7.99 (ro, 2H), 4.29-4.17 (ro, IH), 4.17-4.07 (ro, IH), 20 3.83-3.71 (ro, 2H) , 3.71-3.58 (ro, 2H) , 2.15 (t, J=7, 2H), 2.04-1.60 (B, 4H), 2.00 (d, J=6, 2H), 1.31-1.09 (m, 6H), 25 1.25 (d, J=6, 3H), 0.90-0.72 (m, 12H) 30

R1 R5 NMR

47 DK 170345 B1 3-ethylheptanoyl iso-butyl NMR (DMSO-dg): 8.23 (d, 5 J«6, IH), 8.08-7.98 (m, 2H), 4.29-4.18 (ra, IH), 4.18-4.07 (m, IH), 3.86-3.72 (m, 2H), 3.70-3.57 (m, 2H), 2.15 10 (t, J*7, 2H), 2.04-1.59 (id, 4H), 2.00 (d, 2H), 1.30-1.11 (m, 8H), 1.25 (d, J=6, 3H), 0.89-0.70 (ra, 12H) 15 3-raethylheptanoyl methyl- NMR (DMSO-dg): 8.25 (d, cyclohexyl J=6, IH), 8.13-8.00 (m, 2H), 4.32-4.20 (m, IH), 4.20-4.08 (m, IH), 20 3.91-3.76 (m, 2H), 3.76-3.59 (m, 2H), 2.18 (t, J=6, 2H), 2.13-1.48 (m, 8H), 1.36-1.01 (m, 12H), 1.27 (d, J=6, 25 3H), 1.02-0.76 (m, 8H) 30

R1 R5 NMR

48 DK 170345 B1 3-ethylhexanoyl nethyl· NMR (DMSO-dg): 8.25 (d, 5 cyclohexyl J»6, IH), 8.13r8.00 (n, 2H), 4.32-4.20 (m, IH), 4.20-4.08 <m, IH), 3.92- 3.74 (m, 2H), 3.74-3.59 (m, 2H), 2.18 10 (t, J*6, 2H), 2.09-1.86 (m, IH), 2.03 (d, J=6, 2H), 1.82-1.43 (m, 8H), 1.36-1.01 (η, 9H), 1.27 (d, J»6, 3H) , 1.01-0.70 15 (m, 8H) 3-ethylheptanoyl methyl- NMR (DMSO-dg) s 8.26 (d, cyclohexyl J=6, IH), 8.12-8.02 (m, 2H), 4.31-4.19 (m, IH), 20 4.19-4.08 (m, IH), 3.93- 3.72 (m, 2H), 3.72-3.58 (m, 2H), 2.18 (t, J=6, 2H), 2.08-1.86 (m, IH), 2.03 25 <d, J=6, 2H), 1.82-1.48 (m, 8H) , 1.34-1.02 (m, 11H), 1.27 (d, J=6, 3H), 1.00-0.74 (m, 8H) 30

R1 R5 MMR

49 DK 170345 B1 3-methylheptanoy1 ethyl HKR (DMSO-dg): 8.25 (d, 5 J*6, IH), 8.12-8.00 (m, 2B), 4.28-3.96 (m, 2H), 4.03 (q, J*7, 2R), 3.74-3.56 (m, 2H), 2.16 (t, J=9, 2H), 2.11-1.62 IQ (η, 6H), 1.32-0.98 (m, 6H), 1.24 (d, J**7 , 3B) , 1.14 (t, J=7, 3H), 0.88-0.76 {m, 6H) 3-ethylheptanoy1 ethyl NMR (DMSO-dg): 8.28 (d, 15 J=6, IH), 8.16-8.04 (m, 2H), 4.32-4.04 (m, 2H), 4.10 (q, J-6, 2H), 3.78-3.64 (m, 2H), 2.22 (t, J=6, 2H), 2.11-1.92 20 (m, IH), 2.07 (d, J*6, 2H), 1.86-1.64 (m, 2H), 1.40-1.14 (m, 8H), 1.30 (d, J=6, 3H), 1.21 (t, (J=6, 3H), 0.94-0.76 25 {a, 6H).

30 50 DK 170345 B1

*1 R5 · HMR

3-ethy lhept anoy 1 butyl HMR (DMSO-dg) s 8.27 (d, 5 J»8, IH), 8.14-8.02 (m, 2H), 4.32-4.10 (ra, 2H), 4.10-3.94 (a, 2H), 3.78-3.60 (m, 2H), 2.18 (t, J*6, 2H), 2.04 (d, 10 J»6, 2H), 2.04-1.62 (m, 3H), 1.60-1.46 (o, 2H), 1.38-1.10 (m, 123), 1.27 <d, J=6, 3H)/ 0.90-0.75 (m, 9H) 15 3-S-methylheptanoyl butyl NMR (DMSO-dg) : 8.30 (d, J*8, IH), 8.15-8.04 (m, 2H), 4.45-4.12 (m, 2H), 4.12-3.98 (m, 2H), 20 3.78-3.65 (m, 2H), 2.22

Ct, J»7, 2H), 2.18-1.69 (m, 7H), 1.61-1.48 (m, 2H), 1.40-1.11 (m, 11H), 0.97-0.80 (m, 9H) 25 30

R1 R5 NMR

51 DK 170345 B1 3-S-ethylheptanoyl butyl NMR (DMSO-dg) i 8.22 (d, J*7, IH), 8.12-8.0 (m, 2H) , 4.4-4.16 (in, 2B) , 4.08-3.95 Cm, 2H), 3.75- 3.62 (m, 2H), 2.18 (t, J=6, 2H), 2.02 (d, 10 J*6, 2H), 2.04-1.62 (m, 3H), 1.60-1.46 (m, 2H), 1.38-1.1 (m, 15H), and .9-.75 (η, 9H) 15 3-ethylhexanoyl butyl NMR (DMSO-dg) s 8.28 (d, J=8, IH), 8.14-8.04 (m, 2H), 4.34-4.10 (m, 2H), 4.10-3.95 (m, 2H), 3.75- 3.62 (m, 2H), 2.19 20 (t, J*6, 2H), 2.04 (d, J=6, 2H), 2.04-1.60 (m, 3H), 1.60-1.45 (m, 2H), 1.40-1.10 (m, 13H), 0.90-0.76 (m, 9H) 25 30 EKSEMPEL 17 52 DK 170345 B1

Proceduren fra eksempel 15 gentages igen ud fra de passende reagenser med undtagelse af, at hydrogeneringen ikke 5 udføres, hvilket gav de følgende forbindelser:

O

II · R.CNH D CO-R.

10 1 \ / 24

CH D

(CH2) 2CONHCH2CONHCH (CH3)C02R5

15 R1 R4 *5 NMR

3-ethyl- butyl butyl NMR (DMSO-dg): 8.27 (d, J=7, hexanoyl IH), 8.20 (d, J=7, ΪΗ), 8.07 (t, J*7, IH), 4.37-4.13 (m, 2Q 2H), 4.02 (t, J=6, 4H), 3.80- 3.62 (m, 2H), 2.20 (t, J=*6, 2H), 2.05 (d, J=6, 2H), 2.02-1.64 (m, 3H), 1.60- 1.47 (m, 4H) , 1.40-1.13 (m, 25 13H), 0.95-0.77 (mr 12H) 3-ethyl- butyl butyl NMR (DMSO-dg): 8.27 (d, J»7, heptanoyl IH), 8.20 (d, J*7, IH), 8.06 (t, J=6, IH), 4.36-4.13 (n, 3Q 2H), 4.02 (t, J*6, 4H), 3.80- 3.60 (m, 2H), 2.20 (t, J=6, 2H), 2.04 (d, J=6, 2H) , -2.00-1.60 <m, 3H), 1.60- 1.49 (m, 4H), 1.40-1.10 (m, 15H), 0.95-0.72 (m, 12H) 53 DK 170345 B1

»! R4 Rs «MR

3-methyl- butyl butyl NMR (DMSO-dg): 8.26 (d, J=7, heptanoyl IH), 8.19 (d, J-7, IH), 8.07 5 (t, Js6, IH), 4.32-4.11 (m, 2H), 4.02 (t, J=5, 4H)> 3.79-3.59 (m, 2H), 2.20 (t, J=6, 2H), 2.14-1.68 (m, 5H), 1.61-1.46 (m, 4H), 1.40- 10- 1.06 (m, 13H), 0.95-0.81 (m, 12H) 3-S- benzyl benzyl NMR (DMSO-dg) s 8.33 (d, J=7, j methyl- IH), 8.24 (d, J=7, IH), 8.08 heptanoyl (t, J=5, IH), 7.33 (s, 10H), 5.08 (s, 4H), 4.40-4.22 (m, 2H), 3.80-3.60 (m, 2H), 2.21 (t, J=5, 2H), 2.14-1.64 (m, ^ 5H), 1.26 (d, J=7, 3H), 20 1.22-0.98 (m, 6H), 0.88-0.73 (m, 6H) 25 30 EKSEMPEL 18 5 DK 170345 Bl 54

Krystallinsk N-(3-(S)-methylheptanoyl)-D-^glutamyl-gly- cyl-D-alanin_ N-(3-(S)-Mehtylheptanoyl)-D-X-glutamyl(a-benzylester)-gly-cyl-D-alanin-benzylester (30,8 g) blev opslæmmet i 300 ml absolut ethanol i en 2 liters autoklav. Der tilsattes 5 % Pd/C (1,54 g, 50 % vandbefugtet), og blandingen 10 blev hydrogeneret ved 4 x atmofærisk tryk i en time, ved hvilket tidspunkt hydrogenoptagelsen var fuldstændig. Katalysatoren blev genvundet ved filtrering, først over papir, derpå over 0,45 micro nylon milipore, under anvendelse af 100-150 ml ethanol til overførsel og vaskning.

15 Kombinationen af filtrat og vaskevæsker blev inddampet til et fugtigt hvidt stof, som blev opløst i 150 ml varm blanding af absolut ethanol og acetonitril i volumenforholdet 1:10, klaret ved varm filtrering, kogt ned til 35 ml, langsomt afkølet til stuetemperatur, 20 granuleret og filtreret, hvilket gav krystallinsk, tæt, ikke-elektrostatisk, i overskriften angivet produkt, 20,1 g (94 %) karakteriseret ved dets ir (nujol-opslæm-ning), som inkluderer større, veladskilte, skarpe toppe ved 3340, 3300, 2900, 2836, 1725, 1650, 1628, 1580, 25 1532, 1455, 1410, 1370, 1280, 1240, 1216 og 1175 cm-1.

Dette krystallinske produkt (9,4 g) blev yderligere renset ved opløsning i 1000 ml acetone under opvarmning med tilbagesvaling i 1 time. Opløsningen blev afkølet 30 til stuetemperatur og podet med et spor af de ovennævnte krystaller. Efter omrøring i 6 timer blev det i overskriften angivne produkt udvundet ved filtrering med minimal acetonevaskning og tørret i vakuum ved 35 °C, 7,25 g, med identisk ir-karakteristik.

35 EKSEMPEL 19 55 DK 170345 B1 N-(3-(R)-Methyl-4-heptenoylglutamyl(α-benzylester)- qlycyl-D-alanin-benzylester_ 5

Ifølge proceduren fra eksempel 10D gav 2,77 g (5 mmol) D-f-glutamyl(α-benzylester)-glycyl-D-alanin-benzylester-hydrochlorid og syrechloridet fremstillet ud fra 747 mg (5 mmol) 3-(R)-methyl-4-heptensyre den i overskriften 10 angivne forbindelse.

EKSEMPEL 20 N-(3-(S)-Methyl-4-heptanoyl)-D-ji--qlutamyl-qlycyl-D-alanin 15

En blanding af 500 mg af produktet fra eksempel 19 og 26 mg af 5 % palladium på kul (50 % vandbefugtet) i 125 ml ethanol blev rystet i en hydrogenatmosfære med et begyndelsestryk på 4 x atmosfærisk tryk i 2,5 timer.

20 Katalysatoren blev frafiltreret, og opløsningsmidlet fjernet i vakuum. Produktet blev renset ved proceduren fra eksempel 18 og var identisk i alle henseender med produktet fra det eksempel.

25 30 35 56 DK 170345 B1

PRÆPARATION A

Cyclohexylacety1chiorid 5 Al. Ethyl-cyclohexylacetat

Til 4,9 g 60 % natriumhydrid i olie blev der sat en tilstrækkelig mængde hexan til opløsning af olien. Til det oliefri natriumhydrid under nitrogen blev sat 100 10 ml tør tetrahydrofuran efterfulgt af en opløsning af 22,2 ml triethylphosphonoacetat i 80 ml tør tetrahydrofuran. Efter omrøring ved stuetemperatur i 1 time blev der tilsat 10,5 ml cyclohexanon i 40 ml tetrahydrofuran, og reaktionsblandingen blev omrørt ved stuetemperatur 15 natten over. Reaktionsblandingen blev udhældt i vand og ekstraheret med diethylether. Den organiske fase blev vasket med 1 N natriumhydroxidopløsning, vand og saltvand. Den organiske fase blev fraskilt, tørret over magnesiumsulfat og koncentreret under reduceret tryk.

20

Resten blev opløst i 250 ml methanol, behandlet med 1,5 g 10 % palladiumhydroxid på kul, og blandingen blev omrystet i en hydrogenatmosfære ved 345 kPa i 4 timer. Katalysatoren blev frafiltreret og filtratet koncentreret 25 i vakuum. Resten blev destilleret ved 45-50 °C/0,4 mmHg til opnåelse af 15,4 g (90 % udbytte) af det ønskede mellemprodukt.

A2. Cyclohexylacetylchlorid 30

Til 100 ml methanol indeholdende 15,4 g ethyl-cyclohexyl-acetat blev sat 15,2 g kaliumhydroxid, og opløsningen blev opvarmet under tilbagesvaling i 3 timer. Methanolen blev fjernet i vakuum, og resten blev behandlet med 35 vand. Opløsningen blev ekstraheret med diethylether og derpå syrnet med 10 % saltsyre. Den syrnede opløsning 57 DK 170345 B1 blev ekstraheret med frisk ether, og den organiske fase blev skilt fra og vasket med vand og en saltvandsopløsning. Fjernelse af opløsningsmidlet efter tørring gav en væskeformig remanens.

5

Remanensen blev opløst i 60 ml methylenchlorid og behandlet med 18 ml oxlylchlorid. Efter omrøring ved stuetemperatur i 4 timer blev reaktionsblandingen koncentreret under vakuum og remanensen destilleret, 45-50 °C/0,4 mmHg, 10 12,5 g (86 % udbytte).

PRÆPARATION B

Idet man følger den generelle procedure i Præparatin 15 A og går ud fra triethylphosphonoacetal og det passende aldehyd eller den passende keton, fremstilledes følgende syrechlorider: 20 RjCOCl

Rj Kogepunkt °C/mmHg (CH3CH2CH2)2CHCB2- 50-55/0.4 · 25 (CH3CH2) 2CHCH2- 22-25/0.5 CH, I 3 CH-(CH,),CHCH,- 23-30/0.5 3 2 3(R,sr 30 CH, I 3 CH,(CH,),CHCH,- 22-25/0.5 3 2 2(R,S? 35 (CH3)2CH(CH2)3- 24-31/0.7 H Kogepunkt °C/mmHg 58 DK 170345 B1 CH,CH, I 3 2 _ CH,(CH,),CHCH, 34-37/0.5

5 0 Z *{K,ST

CH, I 3 CH,(CH,).CHCH, 45-47/0.6 10 Λ * e(Rrsr O CH2- 25-30/0.5 15 (CH3CH2)2CH(CH2)2- 32-36/0.4 CH, I 3 CH,(CH,),CH(CH,),- 30-38/.06 * * Z(R,S)^ i 20 CH,CH,

g J Z

CH,(CH,).CHCH, 63-65/.95 3 2 Vs? 25 CH3 CH,(CH,)-CHCH,- 89-92/5 J Å Vsr CH, I 3 30 (CH3)2CH(CH2)2CHCH2 46-50/0.5 \R»S) 59 DK 170345 B1

Rj Kogepunkt 0C/mmHg CH, I 3 5 (CH,) -CHCH-CHCH-- 30-34/0.5 3 2 Z(R»Sr CH-CH, 3| 2 CH-(CHJ,CHCH_- 31-35/0.7 10 3 2 2(RrSf PRÆPARATION C 15 6-Methylheptanoylchlorid

Cl. 3-Hydroxy-4-methyl-l-penten 20 Til 90 ml 1,0 M vinylmagnesiumbromid i tetrahydrofuran afkølet til 5 °C blev dråbevis sat 6,3 ml isobutyraldehyd i 30 ml tetrahydrofuran, og blandingen fik lov at op-varme til stuetemperatur. Efter to timer blev reaktions-blandingen såt til en mættet ammoniumchloridopløsning 25 og ekstraheret med ether. Etherekstrakterne blev kombine ret, vasket med en mættet ammoniumchloridopløsning, en mættet natriumbicarbonatopløsning og en saltvandsopløsning og tørret over magnesiumsulfat. Opløsningsmidlet blev fjernet i vakuum til opnåelse af 6,0 g af det ønske-30 de produkt.

C2. 6-Methyl-4-heptansyre-ethylester

En blanding af 18,2 g 3-hydroxy-4-methyl-l-penten, 200 ml 35 triethyl-orthoformiat og 500 ml p-toluensulfonsyre blev behandlet med 400 ml toluen og opvarmet til tilbagesvaling 60 DK 170345 B1 over 4A molekylsigter i 24 timer. Opløsningsmidlet blev fjernet i vakuum og resten destilleret. Den fraktion, der destillerer ved 45-64 °C/0,5 mmHg, gav 7,5 g af det ønskede produkt.

5 C3. 6-Methylheptansyre-ethylester

Til 7,5 g 6-methyl-4-heptansyre-ethylester i 75 ml methanol blev der sat 700 mg 10 % palladiumhydroxid på kul, 10 og blandingen blev omrystet i en hydrogenatmosfære ved 345 kPa i 1,5 timer. Katalysatoren blev frafiltreet og opløsningsmidlet fjernet under vakuum til opnåelse af 5,7 g af det ønskede produkt.

15 C4. 6-Methylheptanoylchlorid

Ifølge proceduren fra præparation A2 gav 5,7 g 6-methyl-heptansyre-ethylester 2,0 g af det ønskede produkt, kp. 30-34 °C/0,5 mmHg.

20

PRÆPARATION D

2-Methylheptanoylchlorid 25 Dl. 2-methylheptansyre

Til en kold (0 °C) opløsning af 100 ml tør tetrahydro-furan indeholdende 11,8 mg tør diisopropylamin og 55 ml 1,6 M n-butyllithium blev der sat 5,4 ml n-heptansyre, 30 og blandingen blev omrørt i 1 time ved stuetemperatur.

Den resulterende opløsning blev afkølet til 0 °C, og der blev tilsat 7,2 ml methyliodid. Reaktionsblandingen blev omrørt ved stuetemperatur under nitrogen i 1,5 time og blev derpå udhældt i 10 % saltsyre og ekstraheret 35 med diethylether (3 x 100 ml). Ekstrakterne blev kombineret, vasket med 10 % saltsyre, vand, 20 fa natriumbisul- ; 61 DK 170345 B1 fit og en saltvandsopløsning og tørret over magnesium-sulfat. Opløsningsmidlet blev fjernet i vakuum og remanensen på 5,61 g opløst i methanol indeholdende 5,1 g kaliumhydroxid. Efter omrøring natten over blev methanolen 5 fjernet og remanensen opløst i 150 ml vand. Det vandige lag blev vasket med ether (2 x 100 ml) og syrnet med 10 % saltsyre. Produktet blev ekstraheret med ether, vasket med en 20 % natriumbisulfitopløsning og saltopløsning og tørret over magnesiumsulfat. Fjernelse af etheren 10 gav 5,0 g af produktet som en gul væske.

D2. 2-Methylheptanoylchlorid

Ved anvendelse af 5 g 2-methylheptansyre og 7,6 ml oxalyl-15 chlorid og anvendelse af proceduren ifølge præparation A2 opnåedes 3,5 g af det ønskede produkt, kp. 32-34 °C/0,6 mmHg.

PRÆPARATION E

20 3-(5)-Methylheptanoylchlorid

El. 3-(R)-methylqlutarsyre-monomethylester 25 Til en 5 1 firehalset kolbe udstyret med omrører og pH-elektrode blev der sat 2,5 1 0,01 M sur phosphatpuffer på kaliumform, pH-værdi 7,0, efterfulgt af 150 mg svine-leveresterase og 150 g dimethy1-3-methylglutarat. Blandingens pH-værdi blev holdt ved ca. 6,85 ved periodisk 30 tilsætning af en 10 % kaliumcarbonatopløsning. Efter

2,5 timer blev reaktionsblandingen syrnet med 10 % saltsyre til pH 2,0, og produktet blev ekstraheret med di-ethylether. Ekstrakterne blev kombineret, tørret over magnesiumsulfat og koncentreret i vakuum til opnåelse 35 af 114 g af det ønskede produkt, [«]q = -1,48 (CH^OH

c=0,086 g/ml) 62 DK 170345 B1 E2. Methyl-3-(R)-methyl-5-hydroxypentanoat

Til 114 g 3-(R)-methylglutarsyre-monomethylester i 715 ml tør tetrahydrofuran afkølet til O °C blev der langsomt 5 sat 391 ml 2 M opløsning af borandimethylsulfid i tetra- hydrofuran. Efter fuldendt tilsætning blev reaktions-blandingen omrørt natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen blev afkølet, og der blev langsomt tilsat 50 ml vand. Reaktionsblandingen blev ekstraheret (3 10 x 100 ml) med ether og ekstrakteret kombineret, vasket med vand, en mættet natriumbicarbonatopløsning og en saltvandsopløsning og tørret over magnesiumsulfat. Fjernelse af opløsningsmidlet gav 37 g af det ønskede produkt.

15 E3. Methyl-3-(R)-methy1-5-(t-butyldimethylsilyloxy)-pentanoat_

Til en opløsning af 37 g (0,253 mol) methyl-3-(R)-methyl-20 5-hydroxypentanoat og 37 g (0,543 mol) imidazol i 500 ml dimethylformamid sattes 37 g (0,249 mol) t-butyldimethyl-silylchlorid, og reaktionsblandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 2 timer. Reaktionsblandingen blev udhældt i vand og ekstraheret (4 x 100 ml) med ether. De kombi-25 nerede ekstrakter blev vasket med 10 % saltsyre, en mættet natriumbicarbonatopløsning, vand og en saltvandsopløsning og tørret over magnesiumsulfat. Fjernelse af opløsningsmidlet gav 121,88 g af et råt produkt, som efter destillation gav 107,12 g rent produkt, kp.

30 80-81 0C/0,4 mmHg.

E4. 3-(S)-methyl-5-(t-butyldimethylsilyloxy)-l-pentanol

Til 8,5 g (0,224 mol) lithiumaluminiumhydrid i 250 ml 35 diethylether under nitrogen sattes 53,5 g (0,206 mol) methyl-3-(R)-methyl-5-(t-butyldimethylsilyloxy)pentanoat 63 DK 170345 B1 i 125 ml ether. Reaktionsblandingen blev omrørt i en time ved 0 °C og derpå behandlet dråbevis med 8,4 g vand, 8,4 ml af en 15 % natriumhydroxidopløsning og 25,2 ml vand. De faste stoffer blev frafiltreret og 5 den organiske fraskilt og vasket med vand, 2,5 % saltsyre og en saltvandsopløsning. Den organiske fase blev tørret over magnesiumsulfat og koncentreret i vakuum til opnåelse af 46 g produkt.

10 E5. 3-(R)-methyl-5-(t-butyldimethylsilyloxy)-l-pentanal

Til 56,3 g oxalylchlorid i 300 ml tør methylenchlorid afkølet til -50 °C og under en nitrogenatmosfære blev der dråbevis sat 74,81 g dimethylsulfoxid i 100 ml tør 15 methylenchlorid. Efter 15 minutters forløb blev der tilsat 92,0 g 3-(S)-methyl-5-(t-butyldimethylsilyloxy)-1-pentanol i 250 ml af samme opløsningsmiddel. Efter 30 minutters forløb blev der tilsat 206,1 g triethylamin ved -60 °C efterfulgt af fjernelse af kølebadet. Reak-20 tionsblandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 1,5 time og blev derpå udhældt i vand og ekstraheret med methylenchlorid. Ekstrakterne blev vasket med 2,5 % saltsyre, en mættet natriumbicarbonatopløsning, vand og en saltvandsopløsning og derpå tørret over magnesium-25 sulfat. Opløsningsmidlet blev fjernet og resten opløst i ether og genvasket og tørret som før. Fjernelse af etheren gav 90,9 g af det ønskede produkt.

E6. 5-(5)-methyl-7-(t-butyldimethylsilyloxy)-2-hepten 30

Til en opslæmning af 80 g (0,2155 mol) triphenylethyl-phosphoniumbromid i 800 ml tør tetrahydrofuran afkølet til 0 °C blev der sat 165,7 ml 1,3 M opløsning af n-bu-tyllithium (0,2155 mol) i samme opløsningsmiddel. Efter 35 2 timers forløb blev der til reaktionsblandingen dråbevis sat 45 g (0,196 mol) 3-(R)-methy1-5-(t-butyldimethyl- 64 DK 170345 B1 silyloxy)-l-pentanal i 200 ml tør tetrahydrofuran. Reaktionsblandingen blev omrørt i 2 timer ved stuetemperatur og derpå udhældt i vand og ekstraheret med ether. De kombinerede ekstrakter blev vasket med vand og en salt-5 vandsopløsning og tørret over magnesiumsulfat. Fjernelse af opløsningsmidlet i vakuum gav en gul olie, som efter destillation gav 37,4 g produkt, kp. 74-70 °C/0,2-0,1 mmHg.

10 E7. 3-(5)-methyl-l-heptanol

Til en opløsning af 74,8 g 5-(S)-methyl-7-(t-butyldi-methylsilyloxy)-2-hepten i 500 ml methanol sattes 7,5 g 10 % palladiumhydroxid på kul, og blandingen blev 15 rystet i en hydrogenatmosfære i 1,5 time ved 345 kPa.

Katalysatoren blev filtreret og opløsningsmidlet fjernet under vakuum, hvilket gav 30 g.

E8. 3-(5)-methylheptansyre 20

Til 10 g 3-(S)-methy1-1-hepanol i 175 ml acetone sattes i løbet af 45 minutter dråbevis sat 90 ml Jones reagens ved 15-20 °C. Efter 15 minutters forløb blev der tilsat 15 ml isopropanol, og omrøringen blev fortsat i 30 minut-25 ter. Reaktionsblandingen blev udhældt i vand og produktet ekstraheret med ether. Ekstrakterne blev kombineret, vasket med vand, en natriumbisulfitopløsning og en saltvandsopløsning og tørret over magnesiumsulfat. Fjernelse af opløsningsmidlet gav 10 g af produktet i form af 30 en væske, kp. 84-88 °C/0,4 mmHg, [a]^ = -4,46 (CH^OH, C = 0,105 g/ml) E9. 3-(S)-methylheptanoylchlorid 35 Ved at følge proceduren fra præparation A2, gav 5,0 g 3-(S)-methylheptansyre og 7,5 ml oxalylchlorid 2,9 g af det ønskede syrechlorid, kp. 29-32 °C/0,25 mmHg.

65 DK 170345 B1

BIOLOGISK AFPRØVNING

De følgende tabeller I og II indeholder data, som viser aktiviteten af forbindelserne ifølge opfindelsen til 5 beskyttelse af Balb C mus mod Klebsiella pneumoniae infek tion ved den prøvningsprocedure, som er skitseret i slutningen af beskrivelsens almene del.

Forbindelserne blev indgivet i den anførte dosis 24 timer 10 før infektionen og igen i den anførte dosis ved tidspunktet for infektionen. Overlevelsen er den procent af dyrene som overlevede ved der. anførte dosis, og placebo er den procent af dyrene, som overlevede, når der ikke blev indgivet nogen beskyttende forbindelse.

15

Aktiviteten af den tidligere nævnte standardforbindelse FK-156 er rapporteret i tabel III.

DK 170345 Bl 66 ...

O

to un ιλ m O

S >-4 r-4 C4 CO

§

(U

S - : '

Ld

CO

_l

LjJ ooo ooo ooo o o o 2a O O CN O Ort oun >ί ΟΛΝ I , i H ^4 ^ tn Ld .

=3 2= s: o

Cd n CO Ld _J :>

ej- . O O O O

~T rn en en en en ω g w z

1—I

UJ

c I—i 2 ^ o σ>

ΞΖ dC

n rt \ pt CP O O ^ O O ι-l oo>-< o O —'

Ld O p o O <-i O ·”· O —* Z O ‘ , ,-· -* i-· ·”*

Q_ * M

d o-X rn <r x tn <c x s: , c* o tn M i o u o —J ej ex o -J Ld \ ^ ^ c x x CQ LO yU-ej < CO -s' w

I- Ld S

_j O xr X = X *

va O X

*· r-»

X

cc o

Lu oz

Ld 2a o X _ , X ex χ X en

I— ex O ex X ex X

Ld O O O O O O

. en ej en ex u ex u _ex Γ~ x a x x x o x x ax x ι-f o—o u o—o o-o

2= X X X X

z z z z I— iC <

ex X X XX

X

oc

I 1 I I

m m >a m n es n ^ ex ex ex ex

X X X X

ej υ u o sa >—- v_a ua en en en en X X X x o u o u DK 170345 Bl 67 Λ Μ § m m <n m Μ

S

P* δ?

bJ

ω ϋί o o o o o o o o o o o o

=5 øk 0\ en ONN O σ"ί 0 0>N

u -* -1

_J

er u o n u > u u o o o 2 tn en tn tn 2 n /---1 en -4—1 me O O —' O O — OO·-* O O — ~ = o H o— o-ι o —i en ^ 5 —· —· 4j ω r 1—1 o 01

O O

II- Q

rH

_J

u

CQ ,3· χ X X X

C X

I—

X X X X

CM CM CM CM

O O O O

O O o CJ

cm en n· m m —v /-N z-' **>,

x CM CM CM CM

X X X X

u υ o u v S V— Μ»

X X X X

z z z z

CM X X X X

ei

Bi

I I I I

m un m un /"*>* Λ »*>

CM CM CM CM

X X X X

o o o y s./ ^ V/ en en en en

X X X X

u o o u 68 DK 170345 B1

/S

H

S o o o o W CO «Ό Λ «Π s 04 o? LU . ' - σι · .

_j

Lul O O O O O O O O O O O O

> Ok o < O ΝΌ O CO N W < CO

Lul ** ·-*

H? OC

i S

o

CU

03 2 -I Os < CQ C-3 © © O © “ q os » to cn w z (—1

LJ

c (-1 z ^ O Q1

S _Y

30 \ y op ε o o — ©o** ©o— o © —1

I ___ IA H m*4 ΛΗ uo —I

°=S ro tn

35 CN

<C * ^ g-05 tn

—i o* z S

i CM o Q

ri o v

l—1 Lu O CH

HH v

I LO ' CM

J „ α x x

LU CD o—O

03 Lul ^

< -I S

I— o <T X X * X

O X

0C oT

O

Li_

DC

LU

Os

O

!“! XXX 3= ,

Lul eM CM CM CM

I— © O O © _ co © cn O en u cn u cn

X QXXQXXOXXQXX

o= u — u ©—© © — © ©—© m x x g 5 < · .

CM X X XX

X

CM

X I

© Λ r-. tn

Λ X

_< X CM

X © O

v W t-' I

CO X »X X

© x u u i m tn cm cm

η η n S

CM CM CM O

XXXI © O ©

v '— IA II

en co X W

X X © L J

© © ^ \/ 69 DK 170345 B1 Λ Η w ! s a a s ° s tf /-s

On

Ld tn

_J

ΰ O O O O o o o o o ooo O o o §22 2 οί§ n oooin O'er»» oon σ> o\ 2®*° _J " ^ cc

Ld >

O

n

Ld g S S S s s s z *—' σ> g 1 ss- SS- SS- s--. ss- ss- 4J LO r n

„ ω o o L- Q

i—t l-H

Ld ^ χ X X X X *

CQ X

< t— x χ x x x °§__sn °i—B °i—i' °|-5 °!~5

x x X X x S

z Z Z z z z

<N X X X x X X

X

I ‘es CS -T* i 31 o <M i O ^ X e-\. -V , ri g 'es X° X^ '» g 04 Hs S »3 m3 ^ w„i£ δ *S -S g S ~ ~ g n.

es es N es X

x x x s ?5 o u U o ~ to to s' ^ to x x _p g x 3 ® g υ ~ ° DK 170345 Bl 70

/N

K

w

S m O O O O O

H es cn 52 s >>a

On V-/ UJ t tn

_J

y OOO OOO OOO OOO O O O ooo i", o o ooo ounn ao in »3· o\aoxr ooin >—4 ·-€ >—4 1-* '

CC

Ld ;=· o n

Ld 5> [ή o O U o. o o

g OT « OT CO OT W

z

I—I

cn ^ di -p \ CD c1 O O —· O OM O O — O O —I OO—I 0 0—1 m c m —i om m -< m—i m —< m —i

UJ v_-· CNJ

-d> CO f- ^

£ I

I—I I—I

_J

^'a-ooEscssK m x c

ΙΕ X E X X S

cm cm cm es cs es

O O O O O O

cn u en o cn u cn u cn o en o cn

E O E E OEE C X X O E E QEE Q X X

0 — O O-O O-O O-O O-O O-O

E X E E E X

z z z z z z «SEE E EX *

X

es · -

X

O I ,

I Λ es I

cs i cn e es .

E es E U X

U E O λ U

^ U w en /*»

m /-s - S E

1 E en K o O X

— cn es E cm Me es x — u o η nx to , i 5N U5 V» tn CN » ϋ CO ^

X »X * E X E cs - X

U EU EU O X X O

w i^V y CN

X ^ ^ ff X 'I

U CM CM u o CS

cs X E es es X »

/1 U C? ei es O

cn 4-e cn en w E cn cn E x en

O E E U O X

u u >«✓ w o 71 DK 170345 B1

H

w § o o o o m o

H

S

t

LU

tn

_J

y o o o ©oo o o o ooo o oo 222 rr in\Dtn on« oo as «3· η«n o- oo oo 00»oo ΰ cr

LU

> o n

LU

:>

rn O O O O O W

g o« c/3 w en cn w z t-i m es mes m oi moi , m oi ,-iC2 v- inN« in n h in n h m n -< m oi —' moi-^ m £ oi vo ps oi vo ps oivoci oivotn N«n ojocn ,1 = 'I —I —< —· M W .

4« tn

u M

i i 1—I l™i i O O' ~ s: ps m m x u<-srx x s sr s: “ 84 'f u o" o'" ^ ° ^οι =ρ| Soi “o, “o, "p*

O O O O O O

o u ps Ups u pi ups U ps O *n

ctf » χ χ Q X χ O X X Q X X Ο X X O X_X

“o c “ U u O O U—O O O o — o s x x x * * Z Z X z Z z oj X X X » = *

X

'oi 'oi I 'cm 'oi OI

S S *" 5 δ δ /-* #-N O -—V >"* »Λ »Λ /-s »Λ »Λ *· χχ ps χ χ * — ΟΙ ΟΙ X οι ΟΙ ρ*

κυ u ο u ο „JJ

c/s vi ^ cn'— w ^ wv 07 ^

• X ·Χ » X * X *3= " X

χ ο χ υ xu χυ χ ο κοι

ΟΙ PS PS PS PS

ρ> Λ Ο Λ Ο ^ PI CM ΟΙ ΡνΙ ΟΙ ρ* X X X X = g υ u u ο υ ϋ w w ν w '-ί 'Γη η is is η Γ1 X X X X X g u ο υ u υ u 72 DK 170345 B1

L

M

§o O O O o '

Id M

§

(W

----

LjJ

tn _j y OOO O O O O o o o o o o o o oo© o oo o m oio vo«^ eotorn © O co r^co u-l _| — — cc

UJ

©> o n

LJ

> ΰ o o o o o o

U (/3 cu CU ft« &4 X

f—i tr y—- v m cs ιπμ mes m es m es m es j, s. miSH m n h BiNH m cs — m cs —< mes — ^ pi i » · ··· »·· · * * ··« ··» ro ^ es Ό en cs o en es ve en es >© en cs >ø en «s >© en ¢/5 C '—i im* *4 m* ** ·“ tn ι- ίο tn u_ o

s— O

I—I

I—I

_1 O. _ρ» !±ί ^ “se x x x x

CD Bfi O O

< I I

i- ς ς ο» σ> c» w 1

x x x k J

•ί ·ϊ >ϊ N/ 0 o o T, 1 I I es •Kl -Kl -Kl = x x V V I o cs es (S cs es es

OOO O O O

en tjen O en o en Oen oen O _en

CC OXX OXX QXX OXX OXX OXX

o—o o—o o — o o—o o—o o— υ

XXX X X X

Z Z X Z Z Z

es z x x xx x X 1

I I

I es i es cs I

es x es X x js X O X O O x

O Λ O λ ys O

y-v m y-N mm en x en X X en

— X es x es cs X

cc o O O O O V

co·— so— tn — tn — sow ^ • x »x »x »x » x to x tf O tf U tf O tf ϋ tf ιλ n <n cm co tf ^

Λ Λ η A Λ eA

es es es es es «s XXX X X x OOO U o o sy sy sy sy ty sy en en en en en <n

XXX X X X

OOO o o o 73 DK 170345 B1 Λ Μ v § © o « © © o W es 3

X

*·—s

iB

UJ

in uj o o o ©o© o o o oo© 22? ? ? 2 > »©S 5>tce © *» cn o η* n. oo«a· evf^ in UJ "* -* “*

-J

te u is

O

n u i=

C3 O O O © O O

Q M Cb OT W ft* ^

Z

£ < m IQ 2 «»2 «S2 ® g1 eviiécn Nién ο«-·ιη o — m cjier» ni©cn 0 O· _< ^ *-* · — · —< -<

4-i ς/} ' O O

μ i—I

o CO

©. S

N_s Q

(-H

t-l

_J

UJ _ _.

CD *3· X x S 2 * *

< SS

t— φ Φ „ f f f x" xN é« ^1 $1

tP °CM UCS Hs Jm N N

Sen S cn ° 8 cn S r> S en S jn °i-g °i-5 s-e °s-§ cs-s g-s 2 z i 2 2 z cm χ S * * s *

X

N 'cm I I Jr· ^ s S χ~ =" δ δ ” O O ru ^ m m /-% *** _ g Ξ~ j* * WS «S ~ . x . s * * W x * x * g ko x © x ©^ w “* υ_, * cn

m tn cn «η fM

*-S ^

CM CM CM JM CM CM

5 δ δ g δ g V-/ w "w* ^ v „ cn m m cn cn cn s S S δ δ δ 74 DK 170345 B1

/•N

M

v./ o Λ ΙΠ «Λ Λ Λ Λ

1*3 CS Ρ»ί CM

3 P*

&S

v^»

Ld cn

—J

ooo c> o o o o o o o o o o o i,· r·» d d © in cm c> CO "·τ co d d 9>nn

, i-C i—I

QC

LJ

>

O

n bj > c* U O o o o

q OT OT OT W OT

z 1—1 - 1 ·*> \ S p' © o — © © — oo— oo— oo — co = .o— o— o— o— o — ^ in ^ — — — — ϋ! o tn <*- o

•W O

i—' i—i

—I

UJ

cd «» s x X s s c «* l·— X S X s s

CM eM CM CM CM

o o o o o d u o Ud ud Ud Ud

X oxx cxx e x x OXX Q X X

u—u u—u u—u u—u u— u

X X X X X

Z X Z X X

CM X X XX X

X

X

I I

CO I CM Ί «-Μ X ^ d.

CM u CM CM -

X CM 1 X X

U d /\ U <J

--- d f d. 1 ^ d X OT d d x U I M> J x x

U ~ u O

75 DK 170345 B1

N

O _

A ιΛ O

W

3

Cu 65

LJ

tn

_J

y o o o o o o r3 oo o» ri o o ό LU i-* ** _l cc

LU

>

O

i~]

LU

CD o O

0 w w 2 h-i Q1 01

^ E

— o o o o — tD in O —* o -i tn π-, ·*-> tn n °

° O

h-i

f-H

LU J* = =

CD

< ’cm

X

o

X I

CM CM

C O

cn u cn O n tf αχ x q x x o—υ o—c?

X X

z z

CM X X

X

CM

X

o *>"s m x

—« CM

tf O

w

X

I w o v£ m /S /-v

CM CM

X X

c? u w w λ <n

X X

o υ 76 DK 170345 B1 w n o ^ w m => 3 s: b* u

CD

_i

C

CD

LU

< ►—i

Z

o · s: s? CD '—-* LU lu z m - a. _j

U

_ <c >

_ -J LU

i—i _J —I O O O

rj o; SO O O

SO

_J 1—' U-s LU

UJ (Λ - >

CD CD O

C LU U.

1— —i ic

QC

O

U-

DC

Ui

Ds

CD

I—

UJ

I— o

HH UJ

> > 1—1 ·

I- CJ

* “ o < Z η t—l σ'

DC

\ σ' E.

LO * M l^r-, LO " O °

O

Claims (9)

1. Peptidforbindelser med den almene formel 5 O II R.CNHv D C0oR« 1 \ / 2< CB LO I II I 10 (CH2)2cosbchc-r3 R2 ' hvori R^ betyder cycloalkyl med 4-7 carbonatomer, alkyl med 2-10 carbonatomer eller cycloalkylmethy1 med 6-8 15 carbonatomer, R2 betyder hydrogen eller alkyl med 1-3 carbonatomer, R^ betyder hydroxy eller en aminosyrerest med formlen D -NHCH (CHj) jjCOjRj

20 X hvori X betyder hydrogen, alkyl med 1 eller 2 carbonatomer eller hydroxymethyl, og n er et helt tal fra 0 til 4, og R^ og R,. hver for sig betyder hydrogen, alkyl med 1-6 carbonatomer, cycloalkylmethy1 med 6-8 carbon-25 atomer eller benzyl, og farmaceutisk acceptable basesalte deraf.

2. Forbindelser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Rj er alkyl med 5-8 carbonatomer, R2 er hydrogen,

30 R^ er en aminosyrerest med formlen D -NBCB(CBJ CO_Rc I i n i 5 X hvori X betyder hydrogen eller alkyl med 1 eller 2 carbon-35 atomer, n er et helt tal fra 0 til 4, og R^ er hydrogen, alkyl med 1-6 carbonatomer, cycloalkylmethy1 med 6-8 carbonatomer eller benzyl, og R^ er hydrogen. DK 170345 B1

3. Forbindelser ifølge krav 2, kendetegnet ved, at n er O, og er hydrogen, alkyl med 1-6 carbon- * atomer eller cyclohexylmethy1.

4. Forbindelser ifølge krav 3, kendetegnet 5 ved, at er (S,R)-2-ethyl-l-butyl, X er methyl, og R^ er hydrogen, eller R^ er (S,R)-3-hepty1, X er methyl, og R,- er hydrogen, eller 10 er (5,R)-2-hepty1, X er methyl, og R^ er hydrogen, eller ' R^ er (S,R)-2-ethy1-1-penty1, X er methyl, og R,- er hydrogen, eller R^ er (S,R )-2-ethy1-1-penty1, X er methyl, og 15 R,. er n-butyl, eller R^ er (S,R)-2-ethy1-1-penty1, X er methyl, og R,. er isobutyl, eller R^ er (S,R)-2-ethy1-1-penty1, X er methyl, og R^ er cyclohexylmethyl, eller 20 R^ er (S)-2-methy1-1-hexy1, X er methyl, og R,- er hydrogen, eller R^ er (S )-2-methy1-1-hexyl, X er methyl, og R^ er n-butyl, eller R ^ er (S,R)-2-ethyl-l-hexyl, X er methyl, og 25 R^ er hydrogen, eller R^ er (S,R)-2-ethyl-l-hexyl, X er methyl, og R^ er n-butyl, eller R^ er (S,R)-2-ethyl-l-hexyl, X er methyl, og R^ er isobutyl, eller

30 R^ er (S,R)-2-ethy1-1-hexyl, X er methyl, og R^ er cyclohexylmethyl, eller R^ er (5)-2-ethyl-l-hexyl, X er methyl, og R^ er hydrogen, eller R^ er (S)-2-ethyl-l-hexyl, X er methyl, og 35 R,. er n-butyl, eller * DK 170345 B1 er (S)-2-ethyl-l-hexyl, X er methyl, og er cyclohexylmethyl, eller R^ er (S,R)-2-methyl-l-hexyl, X er methyl, og R5 er hydrogen, eller

5. Forbindelser ifølge krav/ 2, kendetegnet ved, at R^ er 1-hexyl, X er hydrogen, n er 5, og R,. er hydrogen.

5 R^ er (S,R)-2-methyl-l-hexy1, Xer methyl, og R^ er n-butyl, eller R^ er (S,R)-2-methyl-l-hexyl, X er methyl, og R^ er isobutyl, eller R^ er (S,R)-2-methyl-l-hexyl, X er methyl, og 10 R^ er cyclohexylmethyl, eller R^ er (S,R)-2-methyl-l-pentyl, X er methyl, og R,- er hydrogen, eller ' R^ er (S,R)-1-hexy1, X er methyl, og R,. er hydrogen. 15

6. Forbindelser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R^ er cycloalkyl med 4-7 carbonatomer, R2 er hydrogen, R^ er en aminosyrerest med formlen D -NHCH(CH2> nC02K5

25 X hvori n er 0, og X er alkyl med 1 eller 2 carbonatomer, og R^ og R,. begge er hydrogen.

7. Forbindelser ifølge krav 6, kendetegnet 30 ved, at R^ er cyclohexyl, og X er methyl.

8. Forbindelser ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R^ er alkyl med 5-8 carbonatomer, R2 er hydrogen, R^ er en aminosyrerest med formlen 35 DK 170345 B1 D -NHCH(CH,) CO^Re | i n 2 5 X hvori X er hydrogen eller alkyl med 1 eller 2 carbon-5 atomer, n er et helt tal fra 0 til 4, er hydrogen, og er alkyl med 1-6 carbonatomer, cycloalkylmethy1 med 6-8 carbonatomer eller benzyl.

9. Farmaceutisk præparat i enhedsdoseringsform, k e n -10 detegnet ved, at det indeholder en farmaceutisk acceptabel bærer og en antiinfektiøst eller immunosti-* mulerende effektiv mængde af en forbindelse med formlen I eller et farmaceutisk acceptabelt basesalt deraf ifølge ethvert af de forudgående krav. 15 20 25 30 r 35