FI86858B - Foerfarande foer framstaellning av terapeutiskt anvaendbara peptider, vilka innehaoller acylglutaminsyra. - Google Patents

Description

1 86858

Menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten asyy-liglutamiinihappoa sisältävien peptidien valmistamiseksi Tämä keksintö koskee menetelmää uusien, asyyliglu-5 tamiinihappoa sisältävien peptidien valmistamiseksi, joita voidaan käyttää immunostimulantteina ja infektioita ehkäisevinä aineina ja joilla on kaava 1 0

II

10 R-CNH.. D ^C0oR, 1 2 4 ^ CH^ LO (1)

H

(ch2)2conhchc-r3

K

15 jossa Rx on 2-10 hiiliatomia sisältävä alkyyli, 4-7 hiiliatomia sisältävä sykloalkyyli tai 5-8 hiiliatomia sisältävä sykloalkyylimetyyli; R2 on vety tai 1-3 hiiliatomia sisältävä alkyyli; R3 on hydroksi tai aminohappotähde, jolla on kaava 20

D

-NHCH(CH„ ) C0oRc I z n / b

X

25 jossa X on vety, 1 tai 2 hiiliatomia sisältävä alkyyli tai hydroksimetyyli ja n on kokonaisluku 0-4; ja R4 ja R5 ovat molemmat itsenäisesti vety, 1-6 hiiliatomia sisältävä alkyyli, 6-8 hiiliatomia sisältävä sykloalkyylimetyyli tai bentsyyli, ja niiden suolojen valmistamiseksi.

30 Suhteellisen uusi immunofarmakologian ala ja eri tyisesti sen se osa-alue, joka käsittelee immunomodulaa-tiota, kehittyy jatkuvasti nopeasti. Lukuisia luonnossa esiintyviä yhdisteitä on tutkittu, mukaan lukien tetra-peptidi tuftsiini, jonka kemiallinen rakenne on N2-[l- 35 (N2-L-treonyyli-L-lysyyli)-L-prolyyli]-L-arginiini. Pal- 2 86858 jon huomiota on kohdistunut synteettisiin peptidoglykaa-nijohdannaisiin, erityisesti muramyylidipeptideihin. Yhteenvetoja immunomodulaattoreina ja erityisesti immuno-stimulantteina tutkituista lukuisista yhdisteistä löytyy 5 artikkeleista Duker et ai., Ann. Rep. Med. Chem. 14 (1979) 146-167, Lederer, J. Med. Chem. 23 (1980 819-825 ja Kralovec, J., Drugs of the Future 8 (1983) 615-638.

Immunostimulanttipeptidejä on kuvattu monissa patenttijulkaisuissa: 10 L-alanyyli-alfa-glutaarihappo-N-asyyli-dipeptidit DE-patenttijulkaisussa 3 024 355, joka on julkaistu tammikuun 15. päivänä 1981; tetra- ja pentapeptidit, jotka sisältävät D-ala-nyyli-L-glutamyyliryhmiä tai L-alanyyli-D-glutamyyliryh-15 miä, GB-patenttijulkaisussa 2 053 231, joka on julkaistu helmikuun 4. päivänä 1981 ja DE-patenttijulkaisussa 3 024 281, joka on julkaistu tammikuun 8. päivänä 1981, vastaavasti; ja N-asyylialanyyli-gamma-D-glutamyyli-tripeptidijoh-20 dannaiset, joissa C-pään aminohappo on lysiini tai diami-nopimeliinihappo, DE-patenttijulkaisussa 3 024 369, joka on julkaistu tammikuun 15. päivänä 1981; ja laktoyylitetrapeptidit, jotka muodostuvat N-lak-tyylialanyyli-, glutamyyli-, diaminopimelyyli- ja karbok-25 simetyyliaminokomponenteista EP-patenttijulkaisussa 11 283, joka on julkaistu toukokuun 23. päivänä 1980.

Immunostimulanttipolypeptidit, joilla on kaava (A) R1-(HNCHCO) -HN-CH-R3 I 2 n ' 30 R (CH0)m I 2 m .

CO-NH-CH-R (A) (<j«2>3 r6-hn-ch-r5 35 3 868 58 jossa R1 on vety tai asyyli; Rz on mm. vety, aiempi al-kyyli, hydroksimetyyli, bentsyyli; R3 ja R4 ovat kumpikin vety, karboksi tai -CONR5R0, jossa R7 on vety, hydroksi-ryhmällä valinnaisesti substituoitu alempi alkyyli ja R8 5 on mono- tai dikarboksi-alempi alkyyli; R5 on vety tai karboksi, edellyttäen, että kun joko R4 tai R5 on vety, toinen on karboksi tai -CONR7R8. R6 on vety; m on 1-3 ja n on 0-2 sekä näiden johdannaiset, joissa karboksi- ja ami-noryhmät on suojattu, on julkaistu US-patenttijulkaisuis-10 sa 4 311 640 ja 4 322 341; ja EP-patenttihakemuksissa 25 4Θ2, 50 856, 51 812, 53 388, 55 846 ja 57 419.

Yhdessäkään alalla julkaistuista polypeptideistä ei esiinny heterosyklyyliryhmää asemassa, jossa yllä olevassa kaavassa on muuttuja R4, lukuun ottamatta US-pa-15 tenttijulkaisua 4 619 915. US-patenttijulkaisussa 4 565 653 kuvataan polypeptidit, joissa muuttuja R4 on emäksinen aminohapporyhmä.

Kitaura et ai., J. Med. Chem. 25 (1982) 335-337, raportoi N2-(gamma-D-glutamyyli)-meso-2(L),2(D)-diamino-20 pimeliinihapon pienimmäksi rakenteeksi, joka pystyy nostattamaan biologisen vasteen, joka on ominainen kaavan (A) mukaiselle yhdisteelle, jossa n on 1; R1 on CH3CH(OH) -CO-; R2 on CH3; sekä R3 että R5 ovat -C00H; R4 on -C0NHCH2C00H; ja R6 on H. Mainittu kaavan (A) mukainen 25 yhdiste tunnetaan nimellä FK-156.

Edullisen ryhmän kaavan 1 mukaisia yhdisteitä muodostavat yhdisteet, joissa R: on 5-8 hiiliatomia sisältävä alkyyli, R2 on vety, R3 on mainittu aminohappotähde, jossa X, n ja R5 merkitsevät samaa kuin kaavassa 1 ja R4 30 on vety. Erityisen edullisia ovat ne ko. ryhmän yhdisteet, joissa n on 0 ja R5 on vety, mainittu alkyyli tai sykloheksyylimetyyli. Erityisen edullisia ovat kaavan 1 mukaiset yhdisteet, joissa Rx on (R,S)-2-etyyli-l-butyy-li, R5 on vety ja X on metyyli; R3 on (R, S )-3-heptyyli, R5 35 on vety ja X on metyyli; R3 on (R,S)-2-metyyli-l-pentyy- 4 86858 li, R5 on vety ja X on metyyli; Rx on (R, S)-2-heptyyli, R5 on vety ja X on metyyli; Rj on (R, S)-2-etyyli-l-pentyyli, R5 on vety ja X on metyyli; Rx on (R,S)-l-heksyyli, R5 on vety ja X on metyyli; Ri on (R,S)-2-etyyli-l-heksyyli, R5 5 on vety ja X on metyyli; Rx on (S)- tai (R,S)-2-metyyli-1-heksyyli, R5 on vety ja X on metyyli; R3 on (S)- tai (R,S)-2-etyyli-l-heksyyli, X on metyyli ja R5 on vety; ja Rt on 1-heksyyli, X on metyyli ja R5 on vety. Erityisen edullinen on myös yhdiste, jossa R: on 1-heksyyli, X on 10 vety ja n on 3. Erityisen edullisia estereitä ovat esterit, joissa Rx on (R,S)-2-etyyli-l-pentyyli, X on metyyli ja R5 on n-butyyli, i-butyyli tai sykloheksyylimetyyli;

Ri on (S)- tai (R,S)-2-metyyli-1-heksyyli, X on metyyli ja R5 on n-butyyli, i-butyyli tai sykloheksyylimetyyli; 15 ja R, on (S)- tai (R,S )-2-etyyli-1-heksyyli, X on metyyli ja R5 on n-butyyli, i-butyyli tai sykloheksyylimetyyli.

Toinen edullinen ryhmä kaavan 1 mukaisia yhdisteitä ovat yhdisteet, joissa Rj^ on 4-7 hiiliatomia sisältävä sykloalkyyli, r2 on vety ja R3 on mainittu aminohappotäh-20 de, jossa n on 0, X on 1-2 hiiliatomia sisältävä alkyyli ja R4 ja R5 ovat kumpikin vetyjä. Erityisen edullinen tässä ryhmässä on yhdiste, jossa Rt on sykloheksyyli ja X on metyyli.

Kolmas edullinen ryhmä kaavan 1 mukaisia yhdistei-25 tä ovat yhdisteet, joissa Rx on 5-8 hiiliatomia sisältävä alkyyli, R2 on vety, R3 on mainittu aminohappotähde, jossa X on vety tai 1-2 hiiliatomia sisältävä alkyyli, n on luku 0-4 ja R5 on vety, ja R4 on 1-6 hiiliatomia sisältävä alkyyli, 6-8 hiiliatomia sisältävä sykloalkyylimetyyli 30 tai bentsyyli.

Mainittujen kaavan 1 mukaisten yhdisteiden farmaseuttisesti hyväksyttävillä emässuoloilla tarkoitetaan epäorgaanisten tai orgaanisten emästen, kuten alkalime-talli- ja maa-alkalimetallihydroksidien, ammoniakin, tri-35 etyyliamiinin, etanoliamiinin ja disykloheksyyliamiinin, kanssa muodostettuja suoloja.

, 86858 b

Kaavan 1 mukaiset yhdisteet muodostavien aminohap-poryhmien konfiguraatio on merkittävä mainittujen yhdisteiden farmakologisen aktiivisuuden kannalta. Aktiivisuudeltaan tehokkaimpia ovat kaavan 1 mukaiset yhdisteet, 5 joiden stereokemia on mainitun kaavan mukainen. Niiden kaavan 1 mukaisten yhdisteiden, joissa R2 ja X ovat muita kuin vetyjä, edullinen stereokemia mainitussa hiilessä osoitetaan etuliitteillä L ja D, vastaavasti.

Kaavan 1 mukaiset yhdisteet voidaan valmistaa mil-10 lä tahansa niistä lukuisista menetelmistä, jotka alan asiantuntijat tuntevat. Menetelmät käsittävät peptidisi-dosten muodostamisen aminohappojen välille, mikä niiden amino- ja karboksiryhmien vuoksi samoin kuin usein muiden reaktiivisten ryhmien läsnäolon vuoksi tekee mainittujen 15 ryhmien suojauksen ja/tai näiden ryhmien, erityisesti karboksiryhmän, aktivoinnin välttämättömäksi, jotta saadaan aikaan tietty reaktio tai jotta tällainen reaktio voidaan optimoida.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle uusien kaavan 1 20 mukaisten yhdisteiden ja niiden suolojen valmistamiseksi on tunnusomaista, että a) kytketään dehydratoivasti yhdiste, jolla on kaava 25 i^CONH D ^^C02CH2-fenyyli L 0

I II

(CH2)2CONHCHC-OH

*2 30 jossa Rj ja R2 merkitsevät samaa kuin edellä, yhdisteen kanssa, jolla on kaava

D

H0NCH(CHn) C0oRc 2 , 2 n 2 5

35 X

6 86858 jossa reaktioon osallistumattomat funktionaaliset ryhmät voidaan estää ja jossa X, n ja Rs merkitsevät samaa kuin edellä, minkä jälkeen seuraa valinnainen vaihe, jossa selektiivisesti poistetaan estäjäryhmät, ja haluttaessa 5 valmistetaan tuotteen farmaseuttisesti hyväksyttävä emäs- suola; tai b) asyloidaan yhdiste, jolla on kaava H2N\D ^C02R5 10 L 0

I II

(ch2)2conhch-c-r3 k jossa R2, R3 ja Rs merkitsevät samaa kuin edellä, yhdis-15 teellä, jolla on kaava R1C0-Hal jossa reaktioon osallistumattomat funktionaaliset ryhmät 20 voidaan estää ja jossa R: merkitsee samaa kuin edellä ja Hai on halogeeni, minkä jälkeen seuraa valinnainen vaihe, jossa selektiivisesti poistetaan estäjäryhmät, ja haluttaessa valmistetaan tuotteen farmaseuttisesti hyväksyttävä emässuola.

25 Tässä esitetyissä esimerkeissä kuvataan erityises ti tietyt suojaryhmät ja aktivoivat ryhmät. Alan asiantuntija kuitenkin huomaa, että muita suojaryhmiä tai aktivoivia ryhmiä olisi voitu käyttää. Tietyn suojaryhmän valinta riippuu suuresti tarvittavan reagenssin saatavuu-30 desta, sen vaikutuksesta "suojatun" yhdisteen liukoisuuteen, sen poistamisen helppoudesta sekä muiden sellaisten ryhmien läsnä olosta, joihin sen käyttö saattaisi vaikuttaa; tämä tarkoittaa, sen selektiivisyydestä tai poistumisesta.

35 Esimerkiksi monissa reaktioissa on välttämätöntä tai ainakin toivottavaa suojata aminoryhmät ja/tai kar- i 7 86858 boksiryhmät. Peptidisynteesiin valittu synteettinen reitti saattaa edellyttää jommankumman mainitun suojaryhmän tai molempien mainittujen suojaryhmien poistamista, jotta uudelleen muodostetussa amino- tai karboksiryhmässä voisi 5 tapahtua lisäreaktio; tämä tarkoittaa, käytetyt suojaryh-mät ovat reversiibeleitä ja useimmissa tapauksissa poistettavia toisistaan riippumatta. Lisäksi tietyn aminoryh-män suojaryhmän valinta riippuu mainitun aminohapon osuudesta kokonaisreaktiokaaviossa. Käytetään aminoryhmän 10 suojaryhmiä, joiden labiilisuus, tämän tarkoittaa, poiston helppous, vaihtelee. Sama pitää paikkansa karboksi-ryhmän suojaryhmiin nähden. Tällaiset ryhmät ovat alalla tunnettuja ja viitataankin yleiskatsauksiin Bodansky et ai., "Peptide Synthesis", 2. painos, John Wiley & Sons, 15 N.Y. (1976); Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, N.Y. (1981); McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, N.Y. (1973); ja Sheppard, kirjassa "Comprehensive Organic Chemistry, The Synthesis and Reactions of Organic Com-20 pounds", Pergamon Press, N.Y. (1979), E. Haslam, toim., osa 23.6, s. 321-339.

Alan asiantuntijat tuntevat tavanomaiset amino- ja karboksiryhmien suojaryhmät. Edustavia aminoryhmän suoja-ryhmiä niihin mitenkään rajoittumatta ovat seuraavat: ku-25 ten bentsyylioksikarbonyyli, substituoitu tai substituoi- maton aralkyyli, kuten bentsyyli, trityyli, bentshydryyli ja 4-nitrobentsyyli; bentsylideeni; aryylitio, kuten fe-nyylitio, nitrofenyylitio ja trikloorifenyylitio; fosfo-ryylijohdannaiset, kuten dimetyylifosforyyli ja 0,0-di-30 bentsyylifosforyyli; trialkyylisilyylijohdannaiset, kuten trimetyylisilyyli; ja muut, kuten on kuvattu US-patentti-julkaisussa 4 322 341, joka on liitetty tähän viitteeksi. Edullinen aminoryhmän suojaryhmä on bentsyylioksikarbonyyli. Menetelmät tietyn aminoryhmän mainitun ryhmän 35 substituoimiseksi ovat hyvin tunnettuja. Yleensä ne käsittävät sopivan aminoyhdisteen asyloinnin bentsyylioksi- 8 86858 karbonyylikloridilla (bentsyyliklooriformaatilla) reak-tio-inertissä liuottimessa, esim. vedessä, metyleeniklo-ridissa tai tetrahydrofuraanissa, emäksen (hapon vastaanottajan), esim. käytettäessä vettä liuottimena natrium-5 tai kaliumhydroksidin läsnäollessa; ja käytettäessä orgaanista liuotinta tertiaarisen amiinin, kuten C^-trial-kyyliamiinien ja pyridiinin läsnä ollessa. Kun käytetään vesipitoista liuotinsysteemiä, reaktion pH pidetään noin pH:ssa 8-10 ja edullisesti pH:ssa 9. Vaihtoehtoisesti, 10 kun reagoiva aine (tämä tarkoittaa, yhdiste, jonka amino-ryhmä on tarkoitus suojata) sisältää emäksisiä ryhmiä, se voi toimia hapon vastaanottajana.

Asyyliryhmä RjCO viedään peptidiin normaaleja asy-lointimenetelmiä käyttäen, kuten antamalla mainitun pep-15 tidin reagoida sopivan happokloridin tai -bromidin kanssa reaktio-inertissä liuottimessa. Edullisia olosuhteita ovat vedettömät olosuhteet, mukaan lukien sopivan emäksen, kuten orgaanisen emäksen, edullisesti tertiaarisen amiinin, kuten trietyyliamiinin, N-metyylimorfoliinin tai 20 pyridiinin, lisäys. Edullinen liuotin on metyleeniklori-di.

Edustavia karboksiryhmän suojaryhmiä ovat lukuisat esterit, kuten silyyliesterit, mukaan lukien trialkyyli-silyyliesterit, trihalogeenisilyyliesterit ja halogeeni-25 alkyylisilyyliesterit; tietyt hydrokarbyyliesterit, kuten C1.4-alkyyli, erityisesti t-butyyliryhmät, bentsyyli ja substituoidut bentsyyliesterit, bentshydryyli ja trityy-li; fenasyyli- ja ftalimidometyyliesterit; tietyt substituoidut hydrokarbyyliesterit, kuten kloorimetyyli, 2,2,2-30 trikloorietyyli, syaanimetyyli; tetrahydropyranyyli; me- toksimetyyli; metyylitiometyyli; suojattu karbatsoyyli, kuten -CONH-NHR0, jossa R° on yllä julkituotu aminoryhmän suojaryhmä, erityisesti bentsyylioksikarbonyyli; ja muut, kuten on kuvattu US-patenttijulkaisussa 4 322 341, joka 35 on liitetty tähän viitteeksi. Hyvin edullinen karboksiryhmän suojaryhmä on t-butoksikarbonyyliryhmä.

9 86858

Suojatut amino- ja karboksiryhmät muutetaan suojaamattomiksi amino- ja karboksiryhmiksi alan asiantuntijoiden tuntemia menetelmiä käyttäen. Bentsyyliryhmä, edulliset karboksiryhmän suojaryhmät (osana suojattua 5 karbatsoyyliryhmää) poistetaan katalyyttisellä hydroge- naatiolla palladiumkatalyyttiä, erityisesti palladium-hiilikatalyyttiä käyttäen. Vaihtoehtoisesti mainitut suojaryhmät poistetaan trifluorietikkahappoon liuotetun tri-fluorimetaanisulfonihapon avulla ja anisolin läsnä olles-10 sa alkyloitumisen estämiseksi, t-butoksikarbonyyliryhmä poistetaan helposti käsittelemällä seosta vetykloridilla kyllästetyllä dioksaanilla.

Karboksyyliryhmien aktivoiminen keinona suorittaa tietty reaktio, on menetelmä, jonka alan asiantuntijat 15 tuntevat. Erityisen hyödyllistä tässä kuvatussa reaktio-järjestyksessä on käyttää anhydridejä, erityisesti syklisiä anhydridejä sekä aktivoituja estereitä, kuten N-hyd-roksiftalimidin ja N-hydroksisukkinimidin johdannaisia, joista molempia käytetään peptidisynteeseissä.

20 Aktivoidut N-hydroksisukkinimidiesterit edistävät (expedite) myöhempiä reaktioita mainituissa aktivoiduissa esteriryhmissä. Kuten alan asiantuntija havaitsee, muita aktivoivia ryhmiä voidaan käyttää. Erityisen mielenkiintoinen ryhmä on N-hydroksiftalimidoryhmä, jota on käytet-25 ty samalla tavalla kuin N-hydroksisukkinimidoryhmää. Molemmissa tapauksissa käytetään dehydratoivaa kytkentäai-netta aktivoidun esterin muodostamiseksi. Tällaisia kyt-kentäaineita ovat l-sykloheksyyli-3-(2-morfoliinoetyyli)-karbodi-imidi-meto-p-tolueenisulfonaatti, disykloheksyy-30 likarbodi-imidi, N,N'-karbonyylidi-imidatsoli, N-(3-dime-tyyliaminopropyyli)-N'-etyylikarbodi-imidihydrokloridi, etoksiasetyleeni, difenyyliketeeni ja N-etyyli-5-fenyyli-isoksatsoleeni-3'-sulfonaatti. Reaktio-olosuhteet näitä kytkentäaineita käytettäessä on hyvin kuvattu kirjalli-35 suudessa. Yleensä niissä käytetään reaktio-inerttiä liuotinta ja lämpötiloja, jotka vaihtelevat vallitsevasta ym- 10 86858 päristön lämpötilasta 100°C:seen. Yllä mainitut karbodi-imidireagenssit ovat edullisia, sillä niitä käytettäessä voidaan lämpötilana käyttää vallitsevaa ympäristön lämpötilaa ja halutuista estereistä saadaan tyydyttävät saan-5 not.

Kun lopputuotteisiin johtavat kytkentäreaktiot on suoritettu, eri suojaryhmät voidaan poistaa aikaisemmin mainittuja sopivia menetelmiä käyttäen ja kaavan 1 mukaiset yhdisteet voidaan eristää.

10 Kaavan 1 mukaisten yhdisteiden, joissa R3 on hyd- roksi tai R4 tai R5 on vety, farmaseuttisesti hyväksyttävät emässuolat saadaan käsittelemällä sen liuosta, edullisesti sen vesipitoista liuosta, yllä lueteltujen kaltaisella emäksellä yleensä stökiometrisissä suhteissa.

15 Suolat eristetään haihduttamalla tai seostamalla.

Tämän keksinnön mukaisia tuotteita voidaan käyttää imettäväisissä, mukaan lukien ihminen, aineina erilaisten patogeenisten mikro-organismien, erityisesti gram-nega-tiivisten bakteerien, aiheuttamien sairauksien kliinises-20 sä ja terapeuttisessa hoidossa. Niitä voidaan käyttää myös immunostimulantteina imettäväisissä, mukaan lukien ihminen, joilla on lisääntynyt infektioriski olemassa olevasta tulehduksesta johtuen tai lisääntyneestä infektioriskistä johtuen olemassa olevan tai kliinisesti ai-25 heutetun immunosuppression johdosta.

Koemenetelmä, jossa käytettiin C3H/HeN-uroshiiriä Charles River Breeding Laboratory -eläintallista, esitetään alla. Hiiriä totutettiin viiden päivän ajan ennen käyttöä ja sitten niitä käsiteltiin joko ihon alle annet-30 tuna (SC) tai suun kautta annettuna (PO) koeyhdisteen tai plasebon (pyrogeeniton fysiologinen suolaliuos) eri laimennuksilla (100, 10, 1 ja 0,1 mg/kg) käyttäen tilavuutta 0,2 ml. Käsittely riippui käytetystä infektoivasta organismista: -24 ja 0 tuntia ennen Klebsiella pneumoniae 35 -altistusta normaaleissa hiirissä ja -3, -2 ja -1 päivää ennen Escherichia coli- tai Staph, aureus -altistusta il 8 6 8 58 hiirissä, joiden immuunisysteemi oli vahingoittunut. Altistus annettiin lantion lihakseen (IM) K. pneumoniaen ollessa kyseessä tai vatsaonteloon (IP) E. colin ja Staph, aureuksen ollessa kyseessä. Altistuksessa käytet-5 tiin 0,2 ml:n tilavuutta. Kuolleisuus merkittiin muistiin seitsemän päivän kuluttua K. pneumoniaen ollessa kyseessä ja kolmen päivän kuluttua kun altistus suoritettiin kahdella muulla mikro-organismilla.

Viljelmien valmistus: 10 K. pneumoniae, E. coli tai Staph, aureus: viljelmä sivelyviljeltiin puhtauden tarkistamiseksi jäätyneestä verivarastosta aivo-sydän-infuusio- (BHI) agarilla. Kolme pesäkettä poimittiin 18 tunnin viljelylevyltä ja laitettiin 9 ml:aan BHI-lientä. Liemiviljelmää kasvatettiin 15 kahden tunnin ajan 37°C:ssa pyörösekoittajassa, jonka jälkeen 0,2 ml siveltiin useille BHI-agarvinopinnoille.

18 tunnin inkuboinnin 37°C:ssa jälkeen vinopinnat pestiin BHI-liemellä, viljelmätiheys säädettiin Spectronic 20 -laitetta käyttäen ja valmistettiin sopivat laimennokset, 20 jotta saataisiin LD90-altistustaso normaaleissa hiirissä.

Koetulokset

Seuraavat koetulokset (taulukot I ja II) osoittavat uusien kaavan 1 mukaisten yhdisteiden suojaavan hii-25 riä Klebsiella pneumoniae -infektiolta. Koetulokset on saatu annostelemalla hiirille tietyt määrät koeyhdistei-tä; eloonjääneet tarkoittaa sitä prosentuaalista koe-eläinmäärää, joka tietyllä annoksella kulloinkin jäi eloon, ja plasebo tarkoittaa sitä prosentuaalista koe-30 eläinmäärää, joka jäi eloon vaikkei ollut saanut suojavaa kaavan 1 mukaista ainetta. Taulukossa III on esitetty vastaavat tulokset tunnetulle standardiyhdisteelle FK-156, jota on kuvattu julkaisussa J. Med. Chem. 25 (1982) 337-9.

12 86858 <*> λ ι/> »/> «·> Ο Λ 0)

U (¾ γ—I

ο< ;rt3 —.

Kfl <*Ρ οοο οοο οοο ο ο ο •γ-, w o O <μ o O n O'Ccm

Ο -Ρ Ο Φ r-π di W C

ro _ ft

H 5 0 o o U

Vh ^ (Λ (Λ -/, m •H .p £ 5 c Π3 s en ? K ^ o o — o o — oo— o © — > o "m o ~ o o— ου tr» -* — — — <Ό X cm e 4_) .-J <J-X C.

n·* X

^ Ä Z

*H <M O W

p o © o λ; © «n c φ x. ^ e ^ O X *" < 5 e I 'xr OJ 2

ra O 'j X X X X

-H H* * § - M § Φ o e m a

M

o m •H Ή

3 M

i0 Φ X <m x X m

C-*-H CM O CMXiMX

(0 O o O O o L) n en tj r-» cm o <m o cm

qi X O X X X CXXQXX

jr u—o o u—© u—u 2 x x x x * z z z z 10 3 a (0 Ή >

•H

H

£ « * * * * < *

X

I I I I

ιΛ ι/t /t ^ /—<· y—S /> »*s

CM CM (N* CM

i-* X X X

u u o υ

W Se» W

ιλ M n

IX X X X

! sj <-> u u 13 86858 C#>

O

m Ά sA ςΑ 0) w ro

rH

(X

:r0 ^ :r3 op ' O O O O O O ©O© ©O© Π Φ n © r** es © »j o ^ n O +J — — — O 0) i-H <L' w c

fO

a <o o © © © ©

jj W (Λ CO LO

c c O' ^ o © — o o ©o— o © — ^ o— o - o — o — £ - - - « o — c ro c 5 < 4-> ro r~\ *f X z z z aä

H

O

o

rH

0 ro

H

x s s z

fS CS CS CS

© O O © © © © ©

es r> IA

f** *”* f* /—S

o£ es <n es :s X Z Z z © © © © W ^

5 x z X

x 2 Z Z

(MX Z X X

a£ ad

I I I I

»A »A *A kA

/-s A A /—S

es <s es es z z z z © © © © w s»· w w a a a n X Z X z © © © © 14 86858 <*> O o o o U m m m rt -Q Q> tn •o

rH

ooo ooo o o o ooo ^ en © *» o r- o ao «n σ> <r rt O «P "" ^ 0 Φ rH Φ ω c H £ u * •h ^ cj cj cj cj . O W5 C/5 (Λ .c ^ S e < c

<TJ

<T3

+J

W

> *

^ rt M

m CC \ o o — o o — o o — o o — •ö I tn ia —· m— kA — ia—* -P o x cj 5 O x A* ® •h J υ— x +j <r x ΰ x x w CNI O Π a; o 8 2 U-I cj es 2 C \ ^ 5

•f4 X CM

? O X X

<u / w

<CJ X

•H 2

C O X X X X

H 0 U * M g o aj * e * a 3 Ή «5

Γ3 <-H

Π3 rH

Eh (U

. Ή « X X X s

pQ CH <N iN CM

Φ O O O O

rH m (J rt <J rt <J rt <J rt *; x ©xxöxxoxxoxx ^ cj — o cj — υ cj—cj cj—o f„ x x x x

W Z 2 X Z

D

«

•H

>

•H

•H

+J

*

<t «M X X ® X

CC

esi

X I

CJ ^-S

<s IA

rt X

— X CM

Ä O CJ

w I/) >— |

wx -X X

CJ pc CJ O I

rt rt AI «M

A ^ S

fH cm cm O

XXXI o u o y\ w w rt r i

rt rt x I «A I

x * u l J

o CJ W \/ 15 86858

öP

/-> © ιΛ in O O vn ^ en o1 cm co rs1 0) ω m

H

G« »0 —

:aj dP

•r-»'—' ©OO O o O ©O© O©© © o O O O O

g o> en © oo un O'O'CO o o n o1 O' o o m O +J - - O Φ rH 0) w e aj S" u u u o υ o

VJ VJ V) VJ VJ VJ

O

4J

C

e tx> Λί ^ O O O©— ©o — o — — oo~- OO — CT2 n «— n — m — — »n— tn —

E

«s 0 e e < fd

O

ίο,.'11 1 1 = = = fd •m

H

M

0

M

M

3

r—I

3 x 1 = x x x

Π3 CM CM CM CM <M

Eh_0 o o o o o ©en ©m © rn © r·» © m © c->

QC OZX ©XX Q X X Q X X O X X O X X

©- © ©-© ©-© ©-© ©-© ©-© = 1 x x x x z Z z z z z

<N X X x X x Z

oc i

CM «N

I X x I © © X n n n © I m ΠΊ I m

— X X x X

X © X © © ^ © N © VJ 1w VJ ^ cN VJ v /-u X 1 X · X X 1χ CM © X © OC © © X©

X «M ·1 O C- IM

© ^ X ^ CM CM CM CM CJ ps|

X x X X CM X

© u © © ^- © et n w 'w n wp X X ·1> n x n

© © x X © X

^ v © © w ö 2 86858

<fP

S v\ o o o o o ^ rs m 0> ifl IT3

rH

O, o o o o o o o o o o o o o o o o o o :rd cno OO o o σν θ' αο <ϊ φν αο *·? o r·*» •rv—' — — ^ ' c O 4J Ο Φ r—< φ « c 10 a w o u ο υ <-> -M VI Vi Vi Vi c/i Vi

0 P

c < tr> — OO— o O N OO— OO— OO— oo — g — O (N ιΛ — 1-n —· v> — ,3 (Vi 10 0 c

G

< Π3 2 _» = x x = x x

** 0C

P

flj T“l

M

M

O

M

M

P

—* X X X X X X

3 Cs| fg <N csi <-*

ro O O O O O O

r. f"' Or·» O <·"> o m o r"i cj m Of-' ~ “ ox x a x x e x x ox x ox x oxx υ — u o—ο u—υ o — u u—υ ο—u x x x x x x x 2 2 X Z 2

<N X X X X X X

K 1

CM

X

U I

1 N I

Γ* I O X M

X c* X o X

υ x υ ^ o /—> U V> ' #*> <~v /-n · x X *r\ I x f*"* β; υ υ x — ^ x fs< w fNi

Oi O O ^ Vi X o n w v- Vi·—' <m ·υ v)'—·

X · X -X x os™ · X

O as u xo O X oc o

W Λ ^ u (N

X ^ ^ X 2C λ u ο υ <s

fN X X r* <N X

<—> o o . *·*. u vx o w X <*“· ^ x x <n

<J X X U O X

·—' υ υ w- o <*0 17 86858

O o O O O O

XI

0) U) <n

rH

& .'2.Ϊ ooo ooo ooo o o o ooo ooo ^ o n o co ό oo co αο Ό m n « oo o σ* co 0 +J -

0 <D

<-H (1) w c Π3 a

fO

U

O O CJ o o o o 4J Cu tSi c/i a- O. oo e < en ^ 1/% oj ιλ N k/% 04 m es u··» oi wn o< \ ΙΛ (N - -Λ 04 —* (N — ιΛ fN -« ιΛ fN « W% 04 ~ O' ... ... ... ... ... ...

g n C n :n ·ΐ> γί cn vO m rsi >£) n 04 -o en n «o n

W

O

e e < O' O' ^ x m «/» sr> x r% 2 x X X x O « cj cj oi oi cj cj ·* ' W U 1 p ς -4i

<Z

T%

M

M

O

D X X X X X X

. OI (N 04 04 oi 04

Th o O O o o o •± η CJ rn (J en cj ro cj r-ι o n cj <·% ^ x o x x axx oxx axx oxx axx

E-* O-CJ O-CJ CJ-CJ CJ- CJ O- CJ O CJ

X x X X X X

z z z z z z

04 X x X X X X

«

tl III

04 04 I 04 Oi 04

XX 04 x X X

<J cj χ cj o cj o /-N O /«“N /-S /—» »Λ ΙΛ /-N ιΛ «η «Λ XX rO X X x —· 04 04 X 04 04 04

« CJ U CJ CJ CJ CJ

(Λ w C/Jw (Λ *—r (Λ ^ (/} w (/) v

•X « X *X . X · X * X

«CJ « CJ «CJ «CJ «CJ «CJ

04 ΓΊ ΓΊ c*l 04 o ro λ\ ro r-s o 04 04 04 04 04 04 x x x x x x

Ό CJ CJ <J CJ CJ

'w' v s«r 'w' ^ *n ei m en o"* m

X X X X X X

u (J cj cj o cj 18 86858 op o Λ <ϋ O <r> o o o o co ^ m i—< a.

i 33 ~ :fd op 'C1 O O O O O O o o o o o o o o o o o o

C O 00 O' θ' Ό so ^ — CO αθ O' o O CO p- CO

o 4J — -- O Q> ^ Φ ω c 03 a 03

4J

O <-> O O o o o 4j oo o- a. a. o, o.

c < tr

\ ΙΛ N iTi ΓΝ ιΛ cm in (N en cm m CM

ζρ w"\ cm — un cm —< un cm »u in in -i un cm in n — c ... ... ... ... ... ...

^ rs Ό m fs >c n cu >·© m m so n ^ n cm »c m

M

0 c c < (0 2 OS 7s

4c 33 S

4J ^ X X X X

«g OC <j υ - 4 4

M

8 OS O' os I Crt I

V = x * k J

·* Ό -O Ό 3 o cj cj r

<—( I I I IN

3 _ Hl Hl 'Ή —

ns 3 X l I I U

CN «N !N (N (N <N

t"1 O O o o o o *rt CJ crt O m cj rrt cj (rt cj m cj r"i “ °ί O X X Ο X X QXX Ωχχ ΩΧΧ cj—cj cj—cj <j — cj cj—cj cj—cj cj— cj xxx xxx z z z z z z

JN x X x XXX

OS

*N I N N I

CM X CM XX «N

x υ X a o *

<J tJ y-s O

^ *Λ »n un .—v mx m xx m

- S ™ X PM CM X

«O O u o w <-) (Λ w (O V- CO >-" CO ^ CO w

•X · x · X »x * x COX

x u oc <j oi ϋ o; υ k cj · t' m m m oi co αέ en p*» ^ /*v y··» ^ «N <N <·. r. CN rs|

X X X XXX

CJ CJ O e CJ o W Srt W Stf· ^ (3 (3 rt rt rt in

XXX XXX

CJ CJ CJ cj o o 00 19 86858

O

•2 2 ° ^ o o o

^ CN CN

(Λ <υ

rH

a :rO — :nJ 00

•r-i'-' O O O O O O O O O ©OO O O O ©OO

£ 00 O ^ co co © <r ro Or-r^. © o <j\ r*·* in O 4J ~ ^ — 0 ai rM 0) w c ffl a aj

υ o w o o O

U t/5 Cl. CO CO O- a- c <

CP

Λ!

^ ΙΛ CN u*l N ΙΛ N ιΛ (N

g1 (N ιΛ tN — m rsl — iA (N — w cn «jd cn n ·€ tA ©—«m © —* in cn ^ m n \fi o tn o 0 o c c < ti

O

ij x = x x x x

Zh Ä ti

H

H

1 Θ 0 3 TT ^n © o © ra <n γμ χ ι | |

Gh X X cn d| ¢) «

ro © © O Γ | T

X cn cn m cn rs ;n

O O O O O O O

© m ©m ©m cj m © cn © «n O x x o x x xx qxx axx xx ©—© © — © ©—© ©—© ©— © © — © x = x x x x

z 2 Z z Z Z

X = x X x X

X

Il il

fS <N | | (N CM

XX «N <N S JS

© © X X © © ns © © ns ns *n »n ns n» in w» XX <n x χ

— CN (N x X «N CM

X © © © © © © W s-' (/) s-- c/) w s—' CO ^ cO sn * X · X · X (Λ X · X ·Χ X© X© x© © cc © as © cn <n m *n cn m n ns ns ns ns ns

<N <N VN «N CN CN

X X X X X X

©©©©©© S^> W S/ S/ V s^ cn cn cn <n n n

X X X T. X X

© υ © © © © 20 86858 e* c -Q “"i m vn uo

^ C* Cs CM CM

cn

Q

r~i

Cu :.¾ —.

:Ό=·° ooo o o o ooo ooo ooo r->—- r>.wnr^ o cm o oo «i aj m n <y* m m 3 o c

Ή C W C

ϋ

Q

c ° O u u :j <Λ Vi Vi Vi Vi c <

X

\ ζτ ε CO— CO— oo— oo— o c — x o— o— o— o— o — 0 ~ ~ ” c c < <T3 o

X

V

<3 r* X X X X X

•r-ι «

M

M

O

M

M

3 f*-i 3

S = X X X X

“ cm es es cm

O o O O O

^ C ro o ro o o cj ro e ro a: ö x x Ο x x oxx g x x g x x

e — o <J-u o-CJ u — C-? CJ-CJ

x x x x x

2 2 2 2 Z

5s* X X X X X

K

ac

I I

oo I cm <r X /-s »—*

<N U <M <N

X <N I χ * o ^ /V u u ^ CO f /-S > w '-e <·*> X 1 VI I <*S ro x o l — J x x o w u o 21 86858 O o Λ OJ ω Π3 r—i Ο.

:π3 ^ Ο Ο Ο Ο Ο Ο i' αο j> η ο Ο Ό C — —

O 4J

O Q) Μ 0) ω c (ΰ α 03 -Ρ ο *ο υ 4J «Λ Vi e < cp χ \ σ> 5 οο- cc: _ C — C — ω “ ~ ο

C

C

< Π3 Ο X <τ X = jj ai . Φ .* V*

3 X

•Η Ο 3 * *Τ es £ cc c-» m (j <n ς; m

Oi a = s a x x

sj-<J O — O

z E

rs x x x

CM

G

v ΙΛ

—· ~iN

QC O

X

I V) <J

»o <->

«—S f-V

rs <N|

X X

u υ >✓ >W» c"*

X X

O o 22 86858 ,)Ρ

H

Sh C

H X3

•H φ O

-C mm — ifl r—1 c (¾ nj Φ 4-> m <3 > (0 p — 0 <*>

•H

-μ 4-1 Φ Φ li- I f* C :rö o o o -H :ra yo <o <o I -m 0) c Π3 0

-r4 V£> O

C 141 ^4 o ι-t ω

e I

M 3 X

M φ t, M c a o 3

X rH

3 -H

.—i 0) <T3 -3 -h a 3 tn ns

E-I -H 4-1 U

X! o tn φ 4-1

Ή C

« <C

m 3 3 m

•rH

> Ή

•H

-M

-y < tr Λί tr e (Λ ΓΟ rH r-4 o 3 o 3 < 86858 23 Käytettäessä tämän keksinnön mukaisia yhdisteitä infektioita ehkäisevinä aineina tai immunostimulantteina, ne annetaan suun kautta, ihon alle, lihakseen, suoneen tai vatsaonteloon yleensä koostumuksena. Tällaiset koos-5 tumukset ovat farmaseuttisen käytännön mukaisia. Esimerkiksi ne voidaan antaa tabletteina, pillereinä, jauheina tai rakeina, jotka sisältävät sellaisia apuaineita kuin tärkkelys, maitosokeri, tietyntyyppisiä savia jne. Ne voidaan antaa kapseleissa sekoituksina samojen tai ekvi-10 valenttien apuaineiden kanssa. Ne voidaan antaa myös suun kautta annettavina suspensioina, liuoksina, emulsioina, siirappeina ja eliksiireinä, jotka voivat sisältää makuja väriaineita. Tämän keksinnön mukaisten terapeuttisten aineiden suun kautta tapahtuvassa annossa tabletit tai 15 kapselit, jotka sisältävät noin 50-500 mg, ovat useimmissa sovellutuksissa sopivia.

Lääkäri päättää annoksesta, joka on sopivin yksittäiselle potilaalle ja annos vaihtelee tietyn potilaan iän, painon ja vasteen sekä antotavan mukaan. Edullinen 20 suun kautta annettava annosalue, yksittäisenä tai jaettuna annoksena, on noin 1,0 - 300 mg/kg/päivä. Edullinen ruoansulatuskanavan ulkopuolelle annettava annos on noin 1.0 - 100 mg/kg/päivä; edullinen alue vaihtelee noin 1.0 - 20 mg/kg/päivä.

25 Seuraavat esimerkit annetaan pelkästään keksinnön valaisemiseksi edelleen. Lyhyyden takia käytetään seuraa-via lyhennyksiä NMR-spektrin piikkien muodoista: s, sing-letti, d, dupletti, t, tripletti, q, kvartetti, m, multi-pletti. Termit mooli ja millimooli on lyhennetty m:ksi ja 30 mm:ksi, vastaavasti.

86858 24

Esimerkki 1 N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli-glysyyli-D- alaniini

D

5 Rx = CH3(CH2)5; R2 = H; ja R3 = NHCH(CH3)C02H) IA. N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli(alfa-bentsyy- liesteri)glysiini_

Liuokseen, joka sisälsi 879 mg (13,0 mm) glysiiniä ja 1,3 g (13,0 mm) trietyyliamiinia 10 mltssa vettä, li-10 sättiin 5,0 g (11,2 mm) N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli-(alfa-bentsyyliesteri)hydroksisukkinimidiesteriä 100 ml:ssa dioksaania ja saadun reaktioseoksen annettiin sekoittua huoneen lämpötilassa 80 tunnin ajan. Liuos kaadettiin 300 ml:aan etyyliasetaattia ja erotettu orgaani-15 nen faasi pestiin 10-%:isella kloorivetyhapolla, vedellä ja suolaliuoksella. Orgaaninen faasi erotettiin, kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä ja konsentroitiin kuiviin vakuumissa. Jäännös jauhettiin pölyksi dietyylieetterin kanssa ja suodatettiin typen alla, 3,43 g (74 %:n saan-20 to).

IB. N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli-glysyyli-D- alaniini_

Liuokseen, joka sisälsi 2,0 g (4,78 mm) N-heptano-yyli-D-gamma-glutamyyli(alfa-bentsyyliesteri)glysiiniä, 25 1,75 g (5 mm) D-alaniinibentsyyliesteri-p-tolueenisulfo- nihapposuolaa, 206 mg (5 mm) trietyyliamiinia ja 675 mg (5 mm) 1-hydroksibentsotriätsolia 100 ml:ssa tetrahydro-furaania, lisättiin 3,03 g (7,17 mm) l-sykloheksyyli-3-(2 morfoliinoetyyli)karbodi-imidi-meto-p-tolueenisulfo-30 naattia ja reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilas sa 18 tunnin ajan. Reaktioseos kaadettiin 300 ml:aan etyyliasetaattia ja orgaaninen faasi erotettiin ja pestiin 10-%:isella kloorivetyhapolla, vedellä, kyllästetyllä natriumbikarbonaattiliuoksella ja suolavedellä. Or-35 gaaninen faasi erotettiin, kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä ja konsentroitiin vakuumissa. Jäännös jauhettiin 25 86858 pölyksi dietyylieetterin kanssa ja suodatettiin typen alla, 2,7 g. 2 g kiinteää ainetta 75 ml:ssa metanolia, joka sisälsi 400 mg 10-%:ista palladiumhydroksidi-hiili-kata-lyyttiä, ravistettiin neljän tunnin ajan vetyatmosfääris-5 sä alkupaineen ollessa 345 kPa. Katalyytti suodatettiin, suodos haihdutettiin alennetussa paineessa ja jäännös liuotettiin veteen sekä kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 1,23 g (90 %:n saanto) haluttua tuotetta valkeana, kiinteänä aineena.

10 NMR-spektri (DMS0-d6) osoitti absorptiota jaksolu vuilla 4,35 - 4,2 (m, 2H), 3,83 (s, 2H), 2,35 (t, J = 7 Hz, 2H), 2,17 (t, J = 7 Hz, 2H), 2,1 - 1,8 (m, 2H), 1,55 - 1,45 (m, 2H), 1,3 (d, J = 6 Hz, 3H), 1,17 (bs, 6H) ja 0,75 (b, 3H) ppm.

15 Esimerkki 2 N-heptanoyyli-D-gammaglutamyyli-glysiini (Rj = CH3(CH2)5; R2 = H; ja R3 = OH)

Liuos, joka sisälsi 1,0 g N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli(alfa-bentsyyliesteri)glysiiniä 50 ml:ssa meta-20 nolia, käsiteltiin 100 mg:11a 10-%:ista palladiumhydrok-sidihiili-katalyyttiä ja seosta ravisteltiin vetyatmos-fäärissä 345 kPa:n paineessa kolme tunnin ajan. Katalyytti suodatettiin ja suodos konsentroitiin vakuumissa. Jäännös liuotettiin kuumaan veteen ja haihdutettiin va-25 kuumissa. Jäännös liuotettiin uudelleen veteen ja kylmä-kuivattiin, jolloin saatiin 630 mg (83 %:n saanto) haluttua tuotetta valkeana kiinteänä aineena.

NMR-spektri (DMS0-d6) osoitti absorptiota jaksoluvuilla 4,37 - 4,25 (m, 1H), 3,9 (s, 2H), 2,35 (t, J = 7 30 Hz, 2H), 2,18 (t, J = 6 Hz, 2H), 2,4 - 1,8 (m, 2H), 1,6 -1,4 (m, 2H), 1,8 (bs, 6H) ja 0,7 (bt, 3H) ppm.

26 86858

Esimerkki 3 N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli-glysyyli-glysiini (Rt = CH3(CH2)5; R2 = H; ja R3 = NHCH2C02H) 3A. N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli(alfa-bentsyy-5 liesteri)glysiinlhydrokslsukkinamidiesteri

Kylmään liuokseen (0°C), joka sisälsi 13,0 g (31 mm) N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli(alfa-bentsyyli-esteri)glysiiniä ja 3,91 g (34 mm) N-hydroksisukkinimidiä 400 ml:ssa tetrahydrofuraania, lisättiin 7,0 g (34 mm) 10 disykloheksyylikarbodi-imidiä ja seoksen annettiin sekoittua 0°C:ssa tunnin ajan ja huoneen lämpötilassa 18 tunnin ajan. Kiinteät aineet suodatettiin ja suodos konsentroitiin alennetussa paineessa. Jäännös jauhettiin pölyksi dietyylieetterin kanssa ja suodatettiin typen alla, 15 jolloin saatiin 15,4 g (98 %) haluttua välituotetta.

3B. N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli-glysyyli- glysiini_ 2,0 g:aan (3,97 mm) N-heptanoyyli-D-gammaglutamyy-li-(alfa-bentsyyliesteri)glysiinihydroksisukkinimidieste-20 riä 100 ml:ssa dioksaania lisättiin 446 mg (5,95 mm) gly-siiniä ja 0,55 ml (3,9 mm) trietyyliamiinia 10 ml:ssa vettä ja saadun reaktioseoksen annettiin sekoittua huoneen lämpötilassa 18 tunnin ajan. Liuos kaadettiin 100 ml:aan etyyliasetaattia ja orgaaninen kerros pestiin 25 2,5-%:isella kloorivetyhapolla, vedellä ja suolavedellä.

Orgaaninen kerros erotettiin, kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä ja konsentroitiin kuiviin. Jäännös jauhettiin pölyksi dietyylieetterin kanssa ja suodatettiin typen alla, jolloin saatiin 1,7 g valkoista, kiinteää ainetta.

30 Puoltatoista grammaa kiinteää ainetta 75 ml:ssa metano-lia, joka sisälsi 200 mg 10-%:ista palladiumhydroksidi-hiili-katalyyttiä, ravisteltiin vetyatmosfäärissä 345 kP:n paineessa kolmen tunnin ajan. Katalyytti erotettiin ja suodos konsentroitiin vakuumissa. Jäännös liuotettiin 35 veteen ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 1,12 g (90 %:n saanto) haluttua tuotetta.

86858 27 NMR-spektri (DMSO-d6) osoitti absorptiota jaksoluvuilla 8,2 - 8,0 (m, 3H), 4,19 (m, 1H), 4,8 - 4,6 (m, 4H), 2,25 (t, J = 7 Hz, 2H), 2,1 (t, J = 6 Hz, 2H), 2,05 - 1,7 (m, 2H), 1,5 (m, 2H), 1,25 (bs, 6H) ja 0,85 5 (t, J = 6 Hz, 3H) ppm.

Esimerkki 4 N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli-glysyyli-D- seriini

D

10 (Ri = CH3(CH2)5; R2 * H; ja R3 = -NHCH(CH20H)C02H) Käyttäen lähtöaineina 2,0 g (3,98 mm) N-heptanoyy-li-D-gammaglutamyyli(alfa-bentsyyliesteri)glysiinihydrok-sisukkinimidiesteriä, 780 mg (4,02 mm) O-bentsyyli-D-se-riiniä ja 0,556 ml (4,02 mm) trietyyliamiinia ja seuraten 15 esimerkin 3B menetelmää eristettiin 902 mg (76 %:n saanto) haluttua tuotetta, sp. 130-132°C.

NMR-spektri (DMS0-d6) osoitti absorptiota jaksoluvuilla 8,36 - 7,94 (m, 3H), 4,46 - 4,28 (m, 1H), 4,28 - 4,08 m, 1H), 3,94 - 3,50 (m, 4H), 2,25 (t, J = 9 Hz, 2H), 20 2,17 t, J = 0 Hz, 1H), 2,10 - 1,04 (m, 14H) ja 0,9 (t, J = 6 Hz, H) ppm.

Esimerkki 5 N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli-glysyyli-D-alfa- aminovoihappo

25 D

(Rx = CH3( CH2 )5-; R2 = H; ja R3 = -NHCH( CH2CH3 )C02H)

Esimerkin 3B menetelmä toistettiin käyttäen lähtöaineina 2,0 g (3,98 mm) N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli-alfa-bentsyyliesteri)glysyylihydroksisukkinimidiesteriä, 30 400 mg (4,02 mm) D-alfa-aminovoihappoa ja 0,556 ml (4,02 mm) trietyyliamiinia, jolloin saatiin 632 mg (57 %:n saanto) haluttua tuotetta, sp. 140-141°C.

NMR-spektri (DMS0-d6) osoitti absorptiota jaksoluvuilla 8,16 - 8,04 (m, 3H), 4,22 - 4,08 (m, 2H), 3,84 -35 3,58 (m, 2H), 2,2 (t, J = 9 Hz, 2H), 2,12 (t, J = 9 Hz, 2H), 2,04 - 1,0 (m, 15H) ja 0,85 (t, J = 6 Hz, 6H) ppm.

28 86858

Esimerkki 6 N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli-glysyyli-3-amino- propionihappo (Rx = CH3(CH2)5-; R2 = H; ja R3 on -NH(CH2)2C02H) 5 Seuraten esimerkin 3B menetelmää ja käyttäen läh töaineina 1,5 g (3,0 mm) N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyy-li(alfa-bentsyyliesteri)glysiinihydroksisukkinimidieste-riä, 350 mg (3,9 mm) 3-aminopropionihappoa ja 0,55 ml (3,9 mm) trietyyliamiinia saatiin 500 mg (43 %:n saanto) 10 haluttua tuotetta, sp. 135-138°C.

NMR-spektri (DMS0-d6) osoitti absorptiota jaksoluvuilla 8,19 - 8,02 (m, 2H), 7,98 - 7,87 (t, J = 5 Hz, 1H), 4,25 - 4,1 (m, 2H), 3,8 - 3,49 (m, 2H), 3,44 - 3,1 (m, 2H), 2,4 (t, J = 6 Hz, 2H), 2,22 (t, J = 7 Hz, 2H), 15 2,14 (t, J = 7 Hz, 2H), 2,1 - 1,67 (m, 2H), 1,6 - 1,17 (m, 8H) ja 0,88 (t, J = 6 Hz, 3H) ppm.

Esimerkki 7 N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli-glysyyli-4-amino- voihappo 20 (Ri = CH3( CH2 )5-; R2 = H; ja R3 = -NH(CH2)3C02H)

Esimerkin 6 menetelmä toistettiin korvaamalla 3-aminopropionihappo 410 mg:11a (4,0 mm) 4-aminovoihappoa, jolloin saatiin 600 mg (50 %:n saanto) haluttua tuotetta, sp. 140-142°C.

25 NMR-spektri (DMS0-d6) osoitti absorptiota jaksolu vuilla 8,18 - 8,03 (m, 2H), 7,88 (bt, J = 4 Hz, 1H), 4,17 - 4,09 (m, 2H), 3,81 - 3,48 (m, 2H), 2,32 - 2,08 (m, 6H), 2,08 - 1,08 (m, 12H) ja 0,88 (t, J = 6 Hz, 3H) ppm. Esimerkki 8 30 N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli-glysyyli-5-amino- pentaanihappo (Rx = CH3(CH2)5-; R2 - H; ja R3 = -NH( CH2 )4C02H) Korvaamalla 3-aminovoihappo 470 mg:11a (4,0 mm) 5-aminopentaanihappoa ja seuraamalla esimerkin 6 menetel-35 mää saatiin 520 mg (42 %:n saanto) haluttua tuotetta, sp. 122-124°C.

8 6 8 58 29 NMR-spektri (DMSO-d6) osoitti absorptiota jaksoluvuilla 8,25 - 7,94 (m, 2H), 7,85 (t, J = 5 Hz, 1H), 4,25 - 4,1 (m, 2H), 3,82 - 3,46 (tn, 2H), 3,24 - 2,9 (m, 2H), 2,21 - 2,08 (tn, 6H), 2,08 - 1,2 (m, 14H) ja 0,88 (t, 5 J = 6 Hz, 3H) ppm.

Esimerkki 9 N-heptanoyyli-D-gamma-glutamyyli-glysyyli-6-amino- heksaanihappo (Rj = CH3( CH2 )5 -; R2 = H; ja R3 = -NH( CH2)5C02H) 10 Esimerkin 6 menetelmä toistettiin taas korvaten 3-aminovoihappo 530 mg:11a (4,0 mm) 6-aminoheksaanihap-poa, jolloin saatiin 520 mg (40 %:n saanto) haluttua tuotetta valkoisena vaahtona.

NMR-spektri osoitti absorptiota (DMS0-d6) jaksolu-15 vuilla 8,28 - 7,9 (m, 2H), 7,82 (bt, J = 4 Hz, 1H), 4,27 - 4,1 (m, 2H), 3,81 - 3,47 (m, 2H), 3,15 - 2,90 (m, 2H), 2,3 - 2,08 (m, 6H), 2,08 - 1,18 (m, 16H) ja 0,88 (t, J = 6 Hz, 3H) ppm.

Esimerkki 10 20 N-isovaleryyli-D-gamma-glutamyyli-glysyyli-D-ala- niini

D

(Rj = (CH3 )2CHCH2-; R2 = H; ja R3 = -NHCH( CH3 )C02H) 10A. Glysyyli-D-alaniinibentsyyliesterihydroklori- 25 di_ 100 ml:aan kylmää metyleenikloridiliuosta, joka sisälsi 10 g (57 mm) N-t-butyylioksikarbonyyliglysiiniä, 20 g (57 mm) D-alaniinibentsyyliesteri-p-tolueenisulfoni-happosuolaa ja 5,77 g (57 mm) trietyyliamiinia, lisättiin 30 12,3 g (60 mm) disykloheksyylikarbodi-imidiä ja saadun reaktioseoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan. 18 tunnin kuluttua seos suodatettiin ja suodos konsentroitiin vakuumissa. Jäännös liuotettiin 200 ml:aan etyyliasetaattia ja orgaaninen kerros pestiin 2,5-%:isella 35 kloorivetyhapolla, vedellä, kyllästetyllä natriumbikarbo-naattiliuoksella ja suolaliuoksella. Orgaaninen kerros 30 86858 erotettiin, kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutettiin alennetussa paineessa. Saatuun öljyyn lisättiin 200 ml dioksaania, joka oli kyllästetty vetykloridilla.

30 minuutin kuluttua seokseen lisättiin 400 ml dietyyli-5 eetteriä ja tuote suodatettiin typen alla, 10,9 g (70 %:n saanto).

IOB. N-t-butoksikarbonyyli-D-gamma-glutamyyli(al- fa-bentsyyliesteri)hydroksisukkinimidiesteri_ 1 500 ml:aan metyleenikloridia, joka sisälsi 50 g 10 (143 mm) N-t-butoksikarbonyyli-D-gamma-glutamiinihappo- alfa-bentsyyliesteriä ja 17,3 g (150 mm) N-hydroksisuk-kinimidiä, lisättiin 30,9 g (15 mm) disykloheksyylikarbo-di-imidiä ja saadun reaktioseoksen annettiin sekoittua huoneen lämpötilassa 18 tunnin ajan. Kiinteät aineet suo-15 datettiin ja suodos konsentroitiin vakuumissa. Jäännös jauhettiin pölyksi dietyylieetterin kanssa ja kiinteät aineet suodatettiin typen alla, 43,7 g (68 %:n saanto).

IOC. D-gamma-glutamyyli(alfa-bentsyyliesteri)gly-syyll-D-alaniinibentsyyliesterihydrokloridi 20 Liuokseen, joka sisälsi 4,3 g (9,45 mm) N-t-butok- sikarbonyyli-D-gamma-glutamyyli(alfa-bentsyyliesteri)hyd-roksisukkinimidiesteriä, 2,71 g (9,92 mm) glysyyli-D-ala-niinibentsyyliesterihydrokloridia ja 1,0 g (9,92 mm) tri-etyyliamiinia 100 ml:ssa metyleenikloridia, annettiin se-25 koittua huoneen lämpötilassa 18 tunnin ajan, jonka jälkeen se konsentroitiin vakuumissa. Jäännös liuotettiin 200 ml:aan etyyliasetaattia ja liuos pestiin 2,5-%:isella kloorivetyhapolla, vedellä, 10-%:isella kaliumkarbonaatilla ja suolaliuoksella. Orgaaninen faasi erotettiin, 30 kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä ja haihdutettiin alennetussa paineessa. Jäännös käsiteltiin 200 ml:11a dioksaania, joka oli kyllästetty vetykloridilla ja seoksen annettiin sekoittua kahden tunnin ajan. Liuos konsentroitiin kuiviin vakuumissa ja jäännös jauhettiin pölyksi di-35 etyylieetterin kanssa. Kiinteät aineet suodatettiin typen alla, 3,41 g (73 %:n saanto).

i 86858 31 10D. N-isovaleryyli-D-gamma-glutamyyli-glysyyli-D-alanlini__

Liuokseen, joka sisälsi 1,0 g (2,03 mm) D-gamma-glutamyyli(alfa-bentsyyliesteri)glysyyli-D-alaniinibent-5 syyliesterihydrokloridia ja 616 mg (6,09 mm) trietyyli-amiinia 50 mlrssa metyleenikloridia, lisättiin 490 mg (4,06 mm) isovaleryylikloridia ja reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 80 tunnin ajan. Metyleeniklori-di haihdutettiin vakuumissa ja jäännös liuotettiin etyy-10 liasetaattiin. Saatu liuos pestiin 2,5-%:isella kloorive-tyhapolla, vedellä, 10-%:isella kaliumkarbonaatilla, vedellä ja suolaliuoksella. Orgaaninen faasi erotettiin, kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä ja konsentroitiin vakuumissa. Jäännös jauhettiin pölyksi dietyylieetterin 15 kanssa, suodatettiin typen alla (910 mg) ja 700 mg liuotettiin 50 ml:aan metanolia. 200 mg palladiumhydroksidia lisättiin liuokseen ja seosta ravisteltiin vetyatmosfäärissä 345 kPa:n paineessa kolmen tunnin ajan. Katalyytti suodatettiin ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännös 20 liuotettiin veteen ja kylmäkuivattiin, jolloin saatiin 364 mg (65 %:n saanto) haluttua tuotetta.

NMR-spektri (DMS0-d6) osoitti absorptiota jaksoluvuilla 8,25 - 8,05 (m, 3H), 4,33 - 4,12 (m, 2H), 3,72 (d, J = 6 Hz, 2H), 2,21 (t, J = 8 Hz, 2H), 1,88 - 1,68 (m, . 25 1H), 2,08 - 1,9 (m, 4H), 1,28 (d, J = 9 Hz, 3H) ja 0,9 (d, J = 7 Hz, 6H) ppm.

Esimerkki 11 Käyttäen lähtöaineina sopivaa happokloridia ja D-gamma-glutamyyli(alfa-bentsyyliesteri)glysyyli-D-alanii-30 nibentsyyliesterihydrokloridia ja käyttäen esimerkin 10D mukaista menetelmää, valmistettiin seuraavat yhdisteet: 32 86858 o

II

R,CNH v CO~H

1 \d / 2

Cft'

5 I D

(CH2)2C0NHCH2C0NHCHC02H

CH3

Rj SP-,°C. NMR, ppm 10 CH3(CH2)8- >175 (DMSO-dg) 8,17-8,22 (m, 2H), 4,35-4,13 (n, 2H), 3 T 83 (d, J= 6Hz, 2H), 2,22 (t, 15 J=6Hz, 2H), 2,15 (t, J=6Hz, 2H) , 2,08- 1,65 (m, 2H), 1,45-1,18 (m, 17H) ja 0,90 (t, J=7Hz, 3H) 20 (CH3)2CH- >110 (haj.) (DMSO-dg) 8,2-8,08 (m, 2H) , 8,02 (d, J= 9Hz, 1H) , 4,3-4,1 (m, 2H), 3,72 (d, J=7Hz, 25 2H), 2,53-2,40 (m, 1H), 2,22 (t, J=9Hz, 2H), 2,10-1,7 (m, 2H), 1,28 (d, J=9Hz, 3H) ja 1,08-0,9 30 (m, 6H)

Us)V >110 (haj.) (DMSO-dg) 8,3-7,9 '—' (m, 3H) , 4,33-4,17 (m, 2H) , 3,72 (d, 35 J=5Hz, 2H), 2,3-2,1 (τη, 2H) ja 2,10-1,0 (m, 16H) 33 86 8 5 8 f tl SP· »cC» HMR, ppm CH3(CH2)2- >110 (haj.) (DMSO-dg) 8,25-8,05 5 (m, 3H), 4,35-4,22 (m, 2H) , 3,72 (d, J= 6Hz, 2H), 2,22 (t, J=8Hz, 2H) , 2,12 (t, J=8Hz, 2H), 2,08- 10 1,77 (m, 2H), 1,55 tq, J=8Hz, 2H), 1,28 (d, J=8Hz, 3H) ja 0,88 (t, J=7Hz, 3H) 15 CH3(CH2)4" >190 <ha3·) (DMSO-dg) 8,33-8,0 <m, 3H), 4,35-4,1 (m, 2B), 3,7 (d, J= 6Bz, 2H), 2,17 (t, J=8Hz, 2H), 2,1 <t, 20 J=8Hz, 2H) , 2,05- 1,63 (m, 2H), 1,48 (tf J=7Hz, 2H), 1,2- 1,1 (m, 7H) ja 0,85 (t, J=7Hz, 3H) 25 CH3(CH2)6- >180 (haj.) (D20) 4,42-4,28 (m, 2H), 3,91 (s, 1H) , 2,4 (t, J=7Hz, 2H), 2,27 <t, J=7Hz, 30 2H), 2,22-1,94 (m, 2H), 1,65-1,55 (m, 2H), 1,39 (d, J=8Hz, 3H), 1,34-1,17 (m, 8H) ja 0,73 (m, 3H) 35 34 86858 sp. , *C. NME, ppm CE-, I 3 5 CH3(CH2)3CHCH2- — (DKSO-dg) 8r27-8r03 (6) (·, 3H), 4,32-4,1 (, 2H) , 3,72 (d, J=6Hz, 2H)t 2,22 (t, J-lOHz, 2H), 10 2,27-1,68 (m, 6H) , 1,42-1,0 (m, 10H) ja 0,94-0,8 (n, 6H) CH-CH- | 2 3 15 CH3(CH2)3CH- — (DMSO-dg) 8,22-8,0 (R,S) (e, 3H), 4,32-4,1 (K, 2H), 3,8-3,6 (, 2H), 2,28-1,68 (e, 6H), 1,6-1,0 20 (m, 12H) ja 0,94- 0,7 (m, 6H).

(CH3CH2)2CH- — (DMSO-dg) 8,29-7,97 25 <m, 3H), 4,33-4,1 <b, 2H), 3,81-3,59 (, 2H), 2,32-1,65 (b, 6H), 1,65-1,17 (a, 8H) ja 1,02- 30 0,68 (tn, 6H) 35 80858 R1 sp‘ ,°C. NMR, ppm

Us)VcH2“ — (DMSO-dg) 8,3-8,0 <B, 3H), 4 ,32-4 , 1 5 (b, 2H) , 3 , 85-3 ,62 (l, 2H), 2,21 (t, J=8Bz, 2H), 2,02 (d, J=8Hz, 2H), 2,01-1,9 (m, 1H), 10 1,85-1,5 (m, 8H) , lr28 (d, J=8Hz, 3H) ja 1,28-0,8 (m, 5H) (CH3CH2CH2)2CHCH2 — (DMSO-dg) 8,18-8,0 <*, 3B), 4,31-4,1 (c, 2H), 3,84-3,6 (m, 2H) , 2,22 (t, J=6Bz, 2H), 2,07 2Q (df J=8Bz, 2H), 2.03- 1,7 (m, 3H) , 1.4- 1,15 (m, 11H) ja 0^87 (t, J=6Hz, 6H) 25 (CH3CH2)2CHCH2- — (DMSO-dg) 8,27-7,95 (n, 3B), 4,3-4,1 (m, 2H), 3,78-3,6 (m, 2B), 2,3-1,57 (m, 30 8B), 1,46-1,13 (m, 8H) ja 0,84 (t, J= 8Ez, 6B) 36 86858 R1 SP· ,°C. NMR, ppm CH-I 3 CH3tCH2*3CHCH2" — (DHSO-dg) 8,18-8,0 5 (RrS) (m, 3H), 4,24-4,06 (m, 2H), 3,74-3,56 (m, 2H), 2,17 (t, J= 9Hz, 2H), 2,12-2,0 (m, 1H), 2,0-1,64 10 7 (m, 4H), 1,24 (d, J=6Hz, 7H), 1,14- 0,98 (m, 2H) ja 0,81 (d, J=6Hz, 6H) 15 CH, I 3 CH3(CH2)2CHCH2- — (DMSO-dg) 8,2-8,04 (R,S) (m, 3H), 4,26-4,08 (m, 2H), 3,76-3,6 20 (m, 2H), 2,28-1,64 (m, 7H), 1,4-0,96 (m, 7H) ja 0,96-0,74 (m, 6H).

(CH3)2CH(CH2)3- — (DMSO-dg) 8,24-7,95 25 (m, 3H), 4,3-4,08 (m, 2H), 3,81-3,59 (m, 2H), 2,21 (t, J=6Hz, 2H), 2,11 (t, J=8Hzf 2H), 30 2,05-1,38 (m, 7H) , 1,27 (d, J=8Hz, 3H), 1,17-1,05 (m, 2H) ja 0,86 (d, J=10Hz, 6H) 37 86858

Rl SP· i*C. NKR, ppm CH3 ' — (DMSO-dg) 8,24-8,0 5 CH3(CH2)4CH- (m, 3H), 4,33-4,11 (R,S) (m, 2H), 3,79-3,6 (m, 2H), 2,41-2,29 (m, 1H), 2,22 (t, J=8Hz, 2H), 2,11-1,66 10 (m, 2H), 1,59-1,43 (m, 1H), 1,38-1,11 (m, 11H), 1,06-0,95 (m, 3H) ja 0,87 CH PH, J=6Hz' 3H> 15 3I 2 CH3(CH2)3CHCH2- — (DMSO-dg) 8,24-8,02 (R#S) (m, 3H), 4,32-4,11 (m, 2H), 3,84-3,6 (m, 2H), 2,24 (t, 20 J=8Hz, 2H), 2,08 (d, J=8Hz, 2H), 2,03- 1,63 (m, 4H), 1,44- 1,11 (m, 12H)ja 0,97-0,71 (in, 6H) 25 (CH3)2CH<CH2)4- — (DMSO-dg) 8,24-8,04 (m, 3H), 4,28-4,1 (m, 2H), 3,76-3,6 (tn, 2H) , 2,18 (t, J= 30 6Hz, 2H), 2,1 (t, J=6Hz, 2H), 2,04- 1,86 (m, 1H), 1,84- 1,66 (m, 1H) , 1,56- 1,38 (m, 3H), 1,23 35 (d, J=6Hz, 3H), 1,2- 1,06 (τη, 3H) ja 0,82 (d, J=6Hz, 6H) 38 86858

Rj sp. , *C. NMR, ppm CH, I 3 CH3(CH2)4CHCH2- — (DMSO-d6) 8,23-7,98 5 (R,S) <*, 3H) , 4 r 3-4,13 (, 2H), 3,81-3,61 (e, 2H) , 2,22 (t, J=8Hz, 2H), 2,18- 1,68 (m, 6H), 1,45- 10 1,07 (m, 12H) ja 0,98-0,8 (m, 6H) ch3 (CH3)2CH(CH2)2CHCH2- — (DMSO-dg) 8,37-8,03 15 (R,S) (r, 3H) , 4,31-4,1 (e, 2H) , 3,78-3,6 (*, 2H) , 2,26 (t, J=8Hz, 2H), 2,2-1,36 (m, 7H), 1,3 (d, J= 20 8Hz, 5H), 1,26-1,05 (*, 2H) ja 1,05-0,73 (m, 9H) CH, — (DMSO-d,) 8,23-7,98 I 3 D ' 25 (CH3)2CHCH2CHCH2- (m, 3H), 4,3-4,13 (m, 2H), 3,81-3,61 (m, 2H) , 2,21 (t, J=8Hz, 2H), 2,15- 2,0 (m, 2H), 1,9 30 (t, J=8Hz, 2H), 1,85-1,52 (m, 3H), 1,4-1,22 (m, 3H), 1,22-0,94 (m, 3H) ja 0,94-0,80 (m, 6H) 35 l! 39 86 8 58 R1 sd. ,°C. NMR, ppm CH-CH-31 2 CH3(CH2)2CHCH2- — (DMSO-dg) 8,25-7,98 5 (R, S) (m, 3H), 4,3-4,08 (in, 2H) , 3,81-3,62 (m, 2H), 2,22 (t, J=8Hz, 2H), 2,06 (d, J=8Hz, 2H), 10 2,02-1,89 (m, 1H), 1.87- 1,65 (m, 2H), 1,41-1,06 (m, 11H) ja 0,98-0,7 (m, 6H) 15 Γ V^H2- — (DMSO-dg) 8,33-7,95 (m, 3H) f 4,3-4,06 (m, 2H), 3,83-3,59 (m, 2H), 2,21 (t, J=8Hz, 2H), 2,11 (s, 20 3H), 2,08-1,87 (m, 1H), 1,87-1,35 (m, 8H), 1,25 (d, J=8Hz, 3H) ja 1,22-0,98 (m, 3H) 25 (CH3CH2)2CB(CH2)2- — (DMSO-d6) 8,21-8,0 (m, 3H), 4,32-4,1 (ra, 2H)f 3,83-3,6 (m, 2H), 2,21 (t, 30 J=8Hz, 2H), 2,11 (t, J=8Hz, 2H), 2,05-1,89 (m, 1H), 1.87- 1,67 (m, 1H), 1,57-1,38 (m, 3H), 35 1,38-1,08 (m, 9H) ja 0,83 (t, J=6Hz, 6B) 4o 86 8 58 R^ so. ,°C. NMR, ppm CH, I 3 CH3(CH2)2CH(CH2>2- — (DMSO-dg) 8,24-7,97 (R,S) <B, 3H), 4,33-4,1 (b, 2H), 3,86-3,59 (n, 2H), 2,35-2,08 (a, 4H), 2,08-1,9 10 <*. 1H), 1,89-1,67 (Bf 1H), 1,63-1,46 (b, 1H), 1,46-1,02 (b, 11H) ja 0,98-0,73 (m, 6H) 15 CH-CH-31 3 CH3(CH2)4CHCH2- — (DMSO-dg) 8,2-7,94 (R,S) (m, 3H), 4,26-4,06 (b, 2H), 3,76-3,56 20 (b, 2H), 2,16 (t, J=6Hz, 2H), 2,1-1,84 (b, 3H), 1,84-1,6 (m, 2H), 1,24 (d, J= 6Hz, 9H), 1,12-0,92 25 (b, 3H) ja 0,92- 0,64 (in, 9B) CH-.

I 3 CH3(CH2)5CHCH2- — (DMSO-dg) 8,23-8,0 (R,S) (m, 3H), 4,32-4,06 30 (m, 2H), 3,72 (d, J=8Hz, 2H), 2,22 (t, J=10Hz, 2H), 2,16-1,7 <m, 6H), 1,42-1,08 (m, 14H) 35 ja 0,92-7,0 (m, 6H) 4i 86858 \ gP-r NMR, ppm ?2H5 CH3(CH2)3CHCH2 -- (DMSO-dg) 8,2-8,0 5 <s> (m, 3H) , 4 , 24-4,16 (m, 2H), 3,74-3,60 (m, 2H), 2,18 (t, J-l, 2H), 2,02 (d, J*7, 2H), 2,02-1,6 (m, 3H), 1,26 (d, J=6, 3H), 1,26-1,08 (m, 8H) ja ,92-,74 (π, 6H) 15

Esimerkki 12 N- (3- (S)-metyyliheptanoyyli)-D-gamma-glutamyyli-L-alanyyli-D-alaniini (R^ = (S) CH3(CH2)3CH(CH3)CH2-;

D

20 R2 = CH3' R3 = -NHCH(CH3)C02H) 12A. N-t-butoksikarbonyyli-L-alanyyli-D-alaniini- bentsyyl jester i _______

Liuokseen, joka sisälsi 23,0 g (0,121 m) N-t-butok-sikarbonyyli-L-alaniinia, 42,6 g (0,121 m) D-alaniinibent-25 syyliesteri-p-tolueenisulfonihapposuolaa ja 17 ml (0,121 m) trietyyliamiinia 400 ml:ssa kylmää (0°C) metyleeniklori-dia, lisättiin tipoittain 25,0 g (0,121 m) disykloheksyyli-karbodi-imidiä 100 ml:ssa metyleenikloridia. Yli yön huoneen lämpötilassa sekoituksen jälkeen kiinteät aineet suo-30 datettiin ja suodos konsentroitiin öljyksi. Jäännös liuotettiin 400 ml:aan etyyliasetaattia, joka pestiin 1-%:isel-la kloorivetyhappoliuoksella, 10-%:isella kaliumkarbonaatti-liuoksella, vedellä ja suolaliuoksella. Orgaaninen faasi erotettiin, kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä ja kon-35 sentroitiin öljyksi. Jäännös jauhettiin pölyksi dietyyli-eetterin kanssa ja saadut kiinteät aineet suodatettiin 42 86858 typen alla, 16,0 g. 12,7 g lisää haluttua tuotetta kiteytyi suodoksesta.

12B. L-alanyyli-D-alaniinibentsyyljesterihydrokloridi Lietteeseen, joka sisälsi 28,7 g N-t-butoksikarbo-5 nyyli-L-alanyyli-D-alaniinibentsyyliesteriä 150 ml:ssa di-oksaania, lisättiin 150 ml vetykloridilla kyllästettyä di-oksaania ja seosta sekoitettiin neljän tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Liuotin poistettiin vakuumissa ja jäännös jauhettiin pölyksi dietyylieetterin kanssa. Saadut kiinteät 10 aineet suodatettiin, liuotettiin uudelleen metyleeniklori-diin ja liuos konsentroitiin noin tilavuuteen 150 ml. Eetteriä lisättiin ja kiinteät aineet suodatettiin typen alla, 22,0 g.

12C. N-t-butoksikarbonyyli-D-gamma-glutamyyli(alfa-1 5 bentsyyliesteri)-L-alanyyli-D-alaniinibentsyy- liesteri_

Lietteeseen, joka sisälsi 5,0 g (9,64 mm) N-t-butok-sikarbonyyli-D-gamma-glutamiini(alfa-bentsyyliesteri)di-sykloheksyyliamiinia ja 2,76 g (9,64 mm) L-alanyyli-D-ala-20 niinibentsyyliesterihydrokloridia 100 ml:ssa 0°C:seen jäähdytettyä metyleenikloridia, lisättiin 2,0 g (9,64 mm) di-sykloheksyylikarbodi-imidiä 20 ml:ssa samaa liuotinta. Yli yön huoneen lämpötilassa sekoituksen jälkeen kiinteät aineet suodatettiin ja suodos konsentroitiin vakuumissa. Jään-25 nös käsiteltiin 150 ml:11a etyyliasetaattia, kiinteät aineet suodatettiin ja suodos pestiin 1-%:isella kloorivety-hapolla, 10-%:isella kaliumkarbonaattiliuoksella, vedellä ja suolaliuoksella. Orgaaninen faasi kuivattiin natrium-sulfaatin päällä ja konsentroitiin, jolloin saatiin valkeaa, 30 kiinteää ainetta, josta kun se oli jauhettu pölyksi eetterin kanssa ja suodatettu, saatiin 4,1 g haluttua tuotetta.

12D. D-gamma-glutarnyyli(alfa-bentsyyliesteri)-L-ala-nyy1i-D-alaniinibentsyyliesterihydrokloridi Lietteeseen, joka sisälsi 4,1 g (7,21 mm) N-t-butok-35 sikarbonyyli-D-gamma-glutamyyli(alfa-bentsyyliesteri)-L-alanyyli-D-alaniinibentsyyliesteriä 50 mlrssa dioksaania, 86858 43 lisättiin 100 ml dioksaania, joka oli kyllästetty vetyklo-ridilla ja reaktioseosta sekoitettiin kolmen tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Liuotin poistettiin vakuumissa ja jäännös jauhettiin pölyksi dietyylieetterin kanssa, 3,5 g.

5 12E. N-(3-(S)-metyyliheptanoyyli)-D-gamma-glutamyy- li(alfa-bentsyyliesteri)-L-alanyyli-D-alaniini- bentsyyliesteri ____

Seokseen, joka sisälsi 1,0 g (1,98 mm) D-gamma-glu-tamyyli)alfa-bentsyyliesteri)-L-alanyyli-D-alaniinibentsyy-10 liesteriä ja 0,833 ml (5,93 mm) trietyyliamiinia 50 ml:ssa metyleenikloridia, lisättiin 390 mg (2,37 mm) 3-(S)-metyy-liheptanoyylikloridia ja reaktioseosta sekoitettiin typen alla 45 minuutin ajan. Reaktioseos kaadettiin 150 ml:aan etyyliasetaattia ja orgaaninen faasi pestiin 10-%:isella 15 kloorivetyhapolla, 10-%:isella kaliumkarbonaattiliuoksella, vedellä ja suolaliuoksella. Orgaaninen faasi kuivattiin natriumsulfaatin päällä ja konsentroitiin kuiviin. Jäännös jauhettiin pölyksi eetterin kanssa ja suodatettiin typen alla, 900 mg.

20 12F. N-(3-(S)-metyyliheptanoyyli-D-gamma-glutamyyli- L-alanyyli-D-alaniini_

Seosta, joka sisälsi 200 mg palladiumhydroksidi-hii-li-katalyyttiä ja 900 mg N-(3-(S)-metyyliheptanoyyli)-D-gammaglutamyyli(alfa-bentsyyliesteri)-L-alanyyli-D-alanii-25 nibentsyyliesteriä 50 mlrssa metanolia, ravisteltiin vety-atmosfäärissä 345 kPa:n paineessa tunnin ajan. Katalyytti suodatettiin ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännökseen lisättiin vettä, joka poistettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin 492 mg tuotetta valkeana kiinteänä aineena, 30 sp. 165-168°C.

NMR-spektri (DMSO-dg) osoitti absorptiota jakso-luvuilla 8,21 - 7,98 (m, 3H), 4,41 - 4,1 (m, 3H), 2,3 - 2,06 (m, 4H), 2,06 - 1,56 (m, 6H), 1,43 - 1,02 (m, 11H) ja 1,02 - 0,73 (m, 6H) ppm.

44 86 8 58

Esimerkki 13 N-(3-(S,R)-etyyliheksanoyyli)-D-gamma-glutamyyli-(alfa-n-butyyliesteri)glysyyli-D-alaniini (R1 = CH3(CH2)2CH{C2H5)CH2-, R2 = H; R3 =

5 D

-NHCH(CH3)C02H? R4 = n-C4H9) 13A. N-t-butoksikarbonyyli-D-gamma-glutamiini(alfa-n-butyyliesteri)disykloheksyyliamiinisuola Liuos, joka sisälsi 39,5 g (0,172 m) N-t-butoksi-10 karbonyyli-D-glutaamihappoanhydridiä 75 ml:ssa kuivaa tet-rahydrofuraania, lisättiin tipoittain kahden tunnin aikana liuokseen, joka sisälsi 47 ml (0,516 m) n-butanolia ja 34,3 ml (0,172 m) disykloheksyyliamiinia 300 ml:ssa eetteriä 0°C:ssa. Reaktioseoksen annettiin sekoittua 0°C:ssa 15 kolmen tunnin ajan ja seosta pidettiin jääkaapissa yli yön. Kiinteät aineet suodatettiin, lietettiin etanoliin ja suodatettiin, 43,3 g.

13B. D-gamma-glutamyyli(alfa-n-butyyliesteri)gly-syyli-D-alaniinibentsyyliesterihydrokloridi 20 Esimerkin 13A tuote (10 g, 0,021 m) ja 6,7 g (0,024 m) glysyyli-D-alaniinibentsyyliesterihydrokloridia lietettiin 200 ml:aan metyleenikloridia typen alla ja seos jäähdytettiin 0°C:seen. Disykloheksyylikarbodi-imidiä (4,25 g, 0,021 m) lisättiin ja seoksen annettiin lämmetä 25 huoneen lämpötilaan yli yön. Ureasivutuote suodatettiin ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännös käsiteltiin etyyliasetaatilla ja suodatettiin. Suodos pestiin peräkkäin vedellä, 2,5-%:isella kloorivetyhapolla, vedellä, 10-%:isella kaliumkarbonaatilla ja suolaliuoksella. Orgaaninen faasi 30 kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä, liuotin poistettiin vakuumissa ja jäännös liuotettiin 300 ml:aan dioksaania, joka oli kyllästetty vetykloridillä. Neljän tunnin huoneen lämpötilassa sekoituksen jälkeen liuotin poistettiin ja jäännös jauhettiin pölyksi etyyliasetaatti-heksaaniseokses-35 sa (1:1) ja suodatettiin, 7,4 g.

45 86 8 58 13C. N-(3-(S,R)-etyyliheksanoyyli-D-glutamyyli-(alfa-n-butyyljesteri)glysyyli-D-alaniini

Seokseen, joka sisälsi esimerkin 13B tuotetta (1,0 g, 2,35 mm) ja 0,99 ml (7,05 mm) trietyyliamiinia 50 mlrssa 5 etyleenikloridia, lisättiin 460 mg (2,83 mm) 3-(S,R)-etyy-liheksanoyylikloridia ja reaktioseosta sekoitettiin yli yön typen alla. Liuotin poistettiin vakuumissa ja jäännös liuotettiin etyyliasetaattiin. Orgaaninen faasi pestiin peräkkäin 10-%:isella kloorivetyhapolla, vedellä, 10-%:isella 10 kaliumkarbonaatilla ja suolaliuoksella. Orgaaninen faasi erotettiin, kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännös liuotettiin 10 ml:aan metanolia ja seosta ravisteltiin 170 mg:n 10-%:ista palla-diumhydroksidia kanssa 1,5 tunnin ajan vetyatmosfäärissä 15 alkupaineen ollessa 345 kP.

Käytetty katalyytti suodatettiin ja liuotin poistettiin vakuumissa, 100 mg.

NMR (DMSO-dg): 8,18 (d, J=6, 1H) , 8,10 (d, J=6, 2Q 1H), 8,02 (t, J=5, 1H), 4,28-4,10 (m, 2H), 4,00 (t, J=6, 2H), 3,78-3,56 (m, 2H), 2,18 <t, J=6, 2H), 2,02 (d, J=6f 2H), 2,00-1,60 (m, 3H) , 1,58-1,42 (m, 2H) , 1,28-1,08 (m, 8H), 1,24 (a, J=61 3H), 0,92-0,76 (m, 9H).

25 Esimerkki 14 Käyttäen esimerkin 13 mukaista yleistä menetelmää ja käyttäen lähtöaineina tarvittavia reagensseja valmistettiin seuraavat yhdisteet: 46 86858

O

II

R.CNH D .C0oR.

1 \ / 2 4

CH D

5 I

(CH2)2CONHCH2CONHCH(CH3)C02H

Ri R.

1_ 4 NKR

3-metyyliheptanoyyli metyyli NMR (DMSO-dg): 8,23 (d, 10 J=6, 1H), 8,15 (d, 3=6, 1H), 8,09 (t, 3=6, 1H) , 4,28-4,14 (m, 2H); 3,72 (d, J=6, 2H), 3,61 (s, 3H), 2,23 (t, 3=1, 2H), 15 2,16-1,70 (m, 6H), 1,34- 1,04 (m, 8H), 1,25 (d, 3=1, 3H), 0,92-0,76 (m, 6H) .

20 3-etyyliheptanoyyli metyyli NMR (DMSO-dg): 8,19 (d, 3=6, 1H) , 8,11 (d, J=6, 1H), 8,03 (t, J=6, 1H) , 4,24-4,10 (m, 2H), 3,74-3,62 (m, 2H) , 3,57 (s, 25 3H) , 2,18 (t, J=9, 2H), 2,01 (d, J=6, 2H), 1,97- 1,60 (m, 3H) , 1,32-1,10 (m, 8H), 1,23 (d, 3=1, 3H) , 0,90-0,72 (m, 6H) 30 3-netyyliheptanoyvli etyyli NMR (DMSO-dg): 8,24-8,02 (m, 3H), 4,26-3,96 (m, 2H), 4,04 (q, J=9, 2H), 3,76-3,56 (m, 2H) , 2,17 35 (t, 3=1, 2H) , 2,12-1,63 (m, 6H); 1,74-0,94 (m, 6H) , 1,23 (d, J=5, 3H) , 1,13 (t, J=9, 3R), 0,88-0,72 (m, 6H) 47 868 58

R1 R4 gHR

3-etyy1iheptanoyy1i etyyli NMR (DMSO-dg): 8,16 (d, 5 J=6, 1H) , 8,09 (d, J=6, 1H), 8,02 (t, J=6, 1H) , 4,22-4,08 (in, 2H), 4,02 (q, J=7, 2H), 3,74-3,54 (m, 2H), 2,16 (t, J=7, 10 2H) , 2,00 (d, J=6, 2H) , 1,96-1,58 (m, 3H), 1,30- 1,08 (m, 8H) , 1,21 (d, J-7, 3H), 1,13 (t, J=7, 3H) , 0,88-0,70 (m, 6H) 15 3-metyy 1 iheptanoyy 1 i iso·- NMR (DMSO-dg): 8,14 (d, butyyli J=6, 1H), 8,08-7,98 (m, 2H), 4,20-4,04 (m, 2H) , 3,75 (d, J=6, 2H), 3,68- 20 3,54 (ro, 2H), 2,14 (tf J=61 2H) , 2,08-1,64 (xnr 6H), 1,28-0,96 (m, 6H)f 1,19 (d, J=7, 3H), 0,88- 0,70 (ra, 12H) 25 3-etyyliheptanoyyli iso- NMR (DMSO-dg) : 8,21 (d, butyyli j»6, 1H) , 8,14-8,04 (m, 2H), 4,24-4,08 (m, 2H) r 3,79 (d, J=6, 2H) , 3,72- 30 3,58 (η, 2H) , 2,19 (t, J=7, 2H), 2,03 <d, J=6, 2H) , 1,99-1,60 (η, 4H), 1,32-1,10 (m, 8H), 1,23 (d, J=6, 3H) , 0,92-0,72 35 (m, 12H) 48 86858

*1 R4 NMR

3-etyyliheksanoyyli iso- NMR (DMSO-d^) : 8,18 (d, 5 butvyli J=6, 1H) , 8,10-8,00 (m, 2H) , 4,26-4,08 (m, 2H), 3,79 (d, J=*6, 2H) , 3,72- 3,58 (m, 2H) , 2,18 (t, J=6, 2H) , 2,02 (d, J=6, 2H), 1,98-1,62 <m, 4H) , 1,34-1,08 (m, 6H), 1,23 (d, J=7, 3H) , 0,96-0,72 (m, 12H) 3-etyyliheksanoyyli metyyli NMR (DMSO-dfc): 8,21 (d, J*7, 1H) , 8,10 (d, J=7, 1H), 8,05 (t, Js6, 1H), 4 ,26-4,10 (m, 2H), 3,76- 3.60 (m, 2H), 3,59 (s, 20 3H), 2,18 (t, J=6, 2H), 2,02 (d, J=6, 2H), 2,00- 1.60 (o, 3H) , 1,32-1,08 (m, 7H) , 0,90-0,72 (in, 6H) .

25 3-etyyliheksanoyyli etyyli NMR (DMSO-dg) : 8,22 (d, J=7, 1H) , 8,18-8,06 (m, 2H) , 4,26-4,10 (in, 2H) , 4,06 (q, J=5, 2H), 3,78- 30 3,58 (m, 2H), 2,20 (t, J=6, 2H), 2,04 (d, J=6, 2H), 2,02-1,60 (m, 3H), 1,26-1,20 (m, 7H) , 1,18 (t, J=5, 3H), 0,90-0,78 35 (m, 6H) 86858 49 R, R.

1 < _KMR

3-rnetvyliheptanoyyli butyyli NMR (DMSO-dg) : 8,20 (d, J=7, 1H) , 8,16-8,04 (, 5 2H), 4,24-4,06 (m, 2H), 4,00 (t, J=6, 2H), 3,74- 3,56 (m, 2H), 2,17 (t, J=6, 2H) , 2,12-1,60 <E, 5H) , 1,58-1,40 (m, 2H), 10 1,36-1,00 (m, 8H), 1,21 (d, J=6, 3H) , 0,90-0,74 (m, 9H) 3-etvyiiheOtanoyyli butvvli NMR (DMSO-d,) : 8,16 (d. 15 ' 6 7 J=7, 1H) , 8,11 (d, J=7, 1H) , 8,03 (t, J=5 , 1H) , 4,26-4,09 (m, 2H)f 3,99 (t, J=7, 2H) , 3,79-3,58 2Q Un, 2H) , 2,17 (t, J=6, 2H) , 2,01 (d, J=6, 2H) , 2,00-1,60 (mv 3H), 1,58- 1,42 (m, 2H) , 1,36-1,08 (m, 10H) , 1,24 (d, J=5, 25 3H) , 0,92-0,72 (m, 9H) „ 86858 50

Esimerkki 15 N-(3-(R,S)-etyyliheksanoyyli)-D-gamma-glutamyyli- glysyyli-D-alaniinietyyliesteri (R1 = CH3(CH2)2CH(C2H5)CH2-; R2 = H; R^ =

5 D

-HNCH(CH3)C02C2H5; R5 = H) 15A. D-gamma-glutamyyli(alfa-bentsyyliesteri)glysyy- li-D-alaniinietyyliesterihydrokloridi_

Lietteeseen, joka sisälsi 14,8 g (0,0285 m) N-t-bu-10 toksikarbonyyli-D-gamma-glutamiinihappo(alfa-bentsyylies- teri)disykloheksyyliamiinisuolahappoa ja 6 g (0,0285 m) gly-syyli-D-alaniinietyyliesterihydrokloridia 200 ml:ssa mety-leenikloridia, lisättiin 5,6 g (0,0270 m) disykloheksyyli-karbodi-imidiä ja seosta sekoitettiin typpiatmosfäärissä 15 yli yön. Urea suodatettiin ja liuotin poistettiin vakuumis-sa. Jäännös käsiteltiin 300 ml :11a etyyliasetaattia, suodatettiin ja suodos pestiin peräkkäin 2,5-&:isella kloorive-tyhapolla, vedellä, 10-%:isella kaliumkarbonaattiliuoksel-la ja suolaliuoksella. Orgaaninen faasi erotettiin, kuivat-20 tiin magnesiumsulfaatin päällä ja konsentroitiin vakuumissa. Jäljelle jäänyt öljy liuotettiin 450 ml:aan dioksaania, joka oli kyllästetty vetykloridilla. Liuosta sekoitettiin kahden tunnin ajan ja liuotin poistettiin vakuumissa. Jäännös jauhettiin pölyksi eetterin kanssa ja suodatettiin, 25 11,2 g.

15B. N-(3-(R,S)-etyyliheksanoyyli)-D-gamma-glutamyy- liglysyyli-D-alaniinietyyliesteri_

Seokseen, joka sisälsi esimerkin 15A tuotetta (1,0 g, 2,33 mm) ja 0,98 ml (6,98 mm) trietyyliamiinia 30 30 ml:ssa metyleenikloridia typpiatmosfäärissä, lisättiin 378 mg (2,33 mm) 3-(R,S)-etyyliheksanoyylikloridia. Kun seosta oli sekoitettu huoneen lämpötilassa 1,5 tunnin ajan, se kaadettiin 100 ml:aan etyyliasetaattia ja orgaaninen faasi pestiin peräkkäin 10-%:isella kaliumkarbonaattiliuok-35 sella ja suolaliuoksella. Orgaaninen faasi erotettiin, kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä ja konsentroitiin 51 86858 vakuumissa. Valkea kiinteä jäännös liuotettiin 30 ml:aan metanolia ja hydrattiin 0,1 g:11a palladiumhydroksidia vetyatmosfäärissä alkupaineen ollessa 345 kPa. Kahden tunnin kuluttua katalyytti suodatettiin, suodos konsentroitiin 5 kuiviin ja jäännös jauhettiin pölyksi eetterin kanssa ja suodatettiin, 275 mg.

NMR (DMSO-dg) 8,26 (d, J=9, 1H) , 8,14-8,02 (m, 2H) , 4,31-4,00 (m, 2H) , 4,06 <q, J=10, 2H) f 3,78-3,60 (m, 2H) , 2,17 <t, J=8, 2H) , 2,08-1,65 (m, 1H) , 2,03 (df J=8, 10 2H), 1,82-1,53 (m, 3H), 1,40-0,96 (ro, 5H) f 1,23 td, J»6, 3H) , 1,14 (t, J=10, 3H), 0,90-0,64 (m, 6H) .

Esimerkki 16 Käyttäen lähtöaineina sopivia reagensseja ja esimer-15 kin 15A-15B mukaista menetelmää, valmistettiin seuraavat yhdisteet:

O

RjCNH D C°2h

20 Q.H'' D

(CH2) 2CONHCH2CONHCH (CH3) C02R5 R5 NMR_ 25 3-metyyliheptanoyyli iso- NMR (DMSO-dg) : 8,24 butyyli (d, J=6, 1H), 8,10-8,00 (m, 2H) , 4,30-4,18 (m, IB), 4,18-4,08 (m, 1H), 3,86-3,72 (m, 2H), 30 3,72- 3,58 (m, 2H), 2,16 (t, J*6, 2H) , 2,12-1,64 (m, 6H) , 1,52-1,00 (m, 6H), 1,27 <d, J=7, 3H) , 35 0,90-0,76 (m, 12H) 52 86858

--- HUB

^ 3-etyyliheksanoyyli iso- NMR (DMSO-dg) : 8,23 (d, butyyli J=6, 1H) , 8,08-7,99 (m, 2H) , 4,29-4,17 (m, 1H) , 4,17-4,07 (m, 18), 3,83-3,71 (m, 2H)r 10 3,71-3,58 (m, 2H), 2,15 (t, J=7, 2H), 2,04-1,60 (m, 4H), 2,00 (d, J=6, 2H) , 1,31-1,09 (m, 6H), 1,25 (d, J=6, 3H), 1 5 0,90-0,72 (m, 12H) 3-etyyliheptanoyyli isobutyyli NMR (DMSO-dg): 8,23 (d, J=6, 1H)t 8,08-7,98 (m, 2H), 4,29-4,18 (m, 1H), 20 4,18-4,07 (m, 1H), 3,86-3,72 (n, 2H), 3,70-3,57 (in, 2H) , 2,15 (t, J=7, 2H), 2,04-1,59 (m, 4H), 2, 00 (d, J=6, 25 2H), 1,30-1,11 (m, 8H), 1,25 (d, J=6, 3H), 0,89-0,70 (m, 12H) 3-netyyliheptanoyyli metyyli- NMR (DMSO-dg) : 8,25 (d, 30 syklo- J=6, 1H), 8,13-8,00 (m, heksyyli 2H), 4,32-4,20 (m, 1H), 4,20-4,08 (m, 1H), 3,91-3,76 (m, 2H), 3,76-3,59 (m, 2H), 2,18 35 (t, J=6, 2H), 2,13-1,48 (m, 8H), 1,36-1,01 (m, 12H), 1,27 (d, J=6, 38), 1,02-0,76 (m, 8H) 53 868 58

R1 r5 HMR

3-etyyliheksanoyyli metyyli- NMR (DMSO-dg) : 8,25 (d, syklo- J=6, 1H), 8,13-8,00 (m, heksyyli 2H), 4,32-4,20 (m, 1H), 4,20-4,08 (©, 1H), 3,92-3,74 (m, 2H), 3,74-3,59 (m, 2H), 2,18 10 (t, J=6, 2H) , 2,09-1,86 (m, 1H) , 2,03 (d, J=6, 2H), 1,82-1,43 (m, 8H), 1,36-1,01 (m, 9H), 1,27 (d, J=6, 3H), 1,01-0,70 15 (ro» ®R) 3_etyyliheptanoyyli metyyli- NMR (DMSO-dg) : 8,26 (d, syklo- J=6, 1H) , 8,12-8,02 (m, heksyyli 2H) , 4,31-4,19 (m, IB), 4,19-4,08 (m, 1H), 20 3,93-3,72 (m, 2H) , 3,72-3,58 (m, 2H), 2,18 (t, J=6, 2H), 2,08-1,86 (m, 1H), 2,03 (d, J=6, 2H), 1,82-1,48 25 (m, 8H) , 1,34-1,02 (m, 11H), 1,27 (d, J=6, 3H), 1,00-0,74 (m, 8H) 3-netyyliheptanoyyli etyyli HMR (DMSO-dg) : 8,25 (d, 30 J-6, 1H), 8,12-8,00 <m, 2H), 4,28-3,96 (n, 2H), 4,03 (q, J-7, 2H), 3,74-3,56 (m, 2H), 2,16 <t, J-9, 2H), 2,11-1,62 35 (m, 6B), 1,32-0,98 (m, 6H), 1,24 (d, J-7, 3H), 1,14 (t, J-7, 3H), 0,88-0,76 (m, 6H) 54 86858

R1 R5 NMR

3-etyyliheptanoyyli etyyli NMR (DMSO-dg): 8,28 (d, J-6, 1H), 8,16-8,04 (in, 5 2B), 4,32-4,04 (m, 2H), 4,10 (q, J=6, 2H), 3,78-3,64 (m, 2H), 2,22 (t, J=6, 2H), 2,11-1,92 (m, 1H), 2,07 (d, J=6, 10 2H), 1,86-1,64 (m, 2H), 1,40-1,14 (m, 8H), 1,30 (d, J=6, 3H), 1,21 (t, <J=6, 3H), 0,94-0,76 (m, 6B) .

15 3-etyyliheptanoyyli butyyli NMR (DMSO-dg): 8,27 (d, J=8, IB), 8,14-8,02 (m, 2H), 4,32-4,10 (m, 2H), 4,10-3,94 (m, 2H), 20 3,78-3,60 (m, 2H), 2,18 (t, J=6, 2H), 2,04 (d, J=6, 2B), 2,04-1,62 (m, 3H), 1,60-1,46 (m, 2B), 1,38-1,10 (m, 12H), 25 1,27 (d, J=6, 3H), 0,90-0,75 (id, 9H) 3-S-metyylihepta- butyyli NMR (DMSO-dg): 8,30 (d, noyyli J=8 , IB), 8,15-8,04 (m, 30 2H), 4,45-4,12 (m, 2H), 4,12-3,98 (ra, 2H), 3,78-3,65 (m, 2H), 2,22 (tf J=7, 2H), 2,18-1,69 (m, 7H), 1,61-1,48 <m, 35 2H), 1,40-1,11 (m( 11H), 0,97-0,80 (m, 9H) 86858 55

Ri Rc

— 1 5 NMR

3-S-etyyliheptano- butyyli NMR (DMSO-dg): 8,22 (d, 5 yyli J=7, IE) , 8,12-8,0 (m, 2H), 4,4-4,16 (m, 2H), 4,08-3,95 (m, 2H), 3.75- 3,62 (m, 2H), 2,18 (t, J=6, 2H), 2,02 (d, 10 J-6, 2H), 2,04-1,62 (o, 3H) , 1,60-1,46 (m, 2H), 1,38-1,1 (m, 15H), ja ,9-,75 (m, 9H) 15 3-etyyliheksanoyyli butyyli NMR (DMSO-dg): 8,28 (d, J=8, 1H) , 8,14-8,04 (m, 2H) , 4,34-4,10 (m, 2H), 4,10-3,95 (m, 2H) , 3.75- 3,62 (m, 2H), 2,19 20 (t, J=6, 2H) , 2,04 (d, J=6, 2H), 2,04-1,60 (m, 3H), 1,60-1,45 <m, 2H), 1,40-1,10 (m, 13H), 0,90-0,76 (m, 9H) 25

Esimerkki 17

Esimerkin 15 menetelmä toistettiin taas käyttäen lähtöaineina sopivia reagensseja, paitsi että hydrogenoin- tia ei suoritettu, jolloin saatiin seuraavat yhdisteet:

3C

0

II

RCNH D CO,Ra

1 \ / 24 n CH D

35 (CH2) 2CONHCH2CONHCH (CH3)C02R5 56 868 58

R, R. Rc NMR

1 4 D _ 3-etyy- butyyli butyyli NMR (DMSO—dg): 8,27 (d, J=7, 5 lihek- 1H) , 8,20 (d, J=7 , 1H), 8,07 sanoyyli (t, J=7, 1H) , 4,37-4,13 Jm, 2H) , 4,02 (t, J=6, 4R) , 3.80- 3,62 (m, 2H), 2,20 (t, J=6, 2H) , 2,05 (d, J=6, 10 2H) , 2,02-1,64 (m, 3H), 1,60- 1,47 (m, 4H), 1,40-1,13 (m, 13H), 0,95-0,77 (m, 12H) 3-etyy- butyyli butyyli NMR (DMSO-dg): 8,27 (d, J=7, 15 lihep- 1H), 8,20 (d, J=7, 1H), 8,06 tanoyyli (t, J=6, 1H) , 4,36-4,13 (m, 2H) , 4,02 (t, J=6, 4H), 3.80- 3,60 (m, 2H), 2,20 (t, J=6, 2H) , 2,04 (d, J=6, 20 2H) , 2,00-1,60 (m, 3H), 1,60- 1,49 (tn, 4H) , 1,40-1,10 (m, 15H), 0,95-0,72 (m, 12H) 3-metyy- butyyli butyyli nmr (DMSO-dg): 8,26 (d, J=7, 25 lihepta- 1H) , 8,19 (d, J=7, 1H), 8,07 noyyli (t, J=6, 1H), 4,32-4,11 (m, 2H), 4,02 (t, J=5, 4H), 3,79-3,59 (m, 2H), 2,20 (t, J=6, 2H), 2,14-1,68 (m, 30 5H), 1,61-1,46 (m, 4H), 1,40- 1,06 (in, 13H), 0,95-0,81 (in, 12H) 57 86858 r2 r4 r5 nmr 5 3--S-me- bentsyy-- bentsyy-KMR {DMSO-dg): 8,33 (d, J=7, tyyli- li li 1H) , 8,24 (d, J=7, lH), 8r08 he?ta~ <t, J=5, 1H), 7,33 (s, 10H), noyyli 5,08 (s, 4H), 4,40-4,22 (m, 2H), 3,80-3,60 (m, 2H), 2,21 10 <t, J=5, 2H), 2,14-1,64 (m, 5H) , 1,26 <d, J=7, 3H) , 1,22-0,98 (m, 6H), 0,88-0,73 (m, 6H) 15 Esimerkki 1 8

Kiteinen N-(3-(S)-metyyliheptanoyyli)-D-gamma-glu-tamyyli-glysyyli-D-alaniini N-(3-(S)-metyyliheptanoyyli)-D-gamma-glutamyyli-(alfa-bentsyyliesteri)glysyyli-D-alaniinibentsyyliesteri 20 (30,8 g) lietettiin 300 ml:aan absoluuttista etanolia 2 litran autoklaavissa. 5 % Pd/C, 1,54 g, 50 %:n vesipitoisuus, lisättiin ja seosta hydrogenoitiin neljä kertaa ilmanpaineen suuruisessa paineessa tunnin ajan, jona aikana vedyn kulutus oli loppunut. Katalyytti otettiin talteen suo-25 dattamalla käyttäen ensin paperia ja sitten 0,45 mikrometrin nylonista Millipore-suodatinta ja käyttämällä 100--150 ml etanolia siirtoon ja pesuun. Yhdistetty suodos ja pesunesteet poistettiin, jolloin saatiin kosteaa, valkoista kiinteää ainetta, joka liuotettiin 150 ml:aan kuumaa absoluut-30 tista etanolin ja asetonitriilin seosta, 1:10, kirkastettiin suodattamalla kuumana, keitettiin 35 ml:n tilavuuteen, jäähdytettiin hitaasti huoneen lämpötilaan, rakeistettiin ja suodatettiin, jolloin saatiin kiteinen, tiivis ei-säh-köstaattinen otsikkotuote, 20,1 g (94 %), jolle oli omi-35 naista sen IR (nujol mull), joka sisältää hyvin erottuneet, terävät pääpiikit värähdysluvuilla 3340, 3300, 2900, 2836, 86858 58 1725, 1650, 1628, 1580, 1532, 1455, 1410, 1370, 1280, 1240, 1216 ja 1175 cm"1.

Tämä kiteinen tuote (9,4 g) puhdistettiin edelleen liuottamalla se 1 000 ml:aan asetonia refluksoiden yhden 5 tunnin ajan. Liuos jäähdytettiin huoneen lämpötilaan ja ympättiin käyttämällä pientä määrää yllä mainittuja kiteitä. Kuuden tunnin sekoituksen jälkeen otsikkotuote otettiin talteen suodattamalla ja pesemällä mahdollisimman pienellä määrällä asetonia ja kuivatettiin vakuumissa 35°C:ssa, 10 7,25 g, jolla oli identtiset IR-ominaisuudet.

Esimerkki 19 N-(3-(R)-metyyli-4-heptenoyyli)-D-gamma-glutamyyli-(alfa-bentsyyliesteri)glysyyli-D-alaniinibentsyyli-esteri 15 Seuraten esimerkin 10D mukaista menetelmää, 2,77 g (5 mm) D-gamma-glutamyyli(alfa-bentsyyliesteri)glysyyli-D-alaniinibentsyyliesterihydrokloridi ja 747 mg:sta (5 mm) 3-(R)-metyyli-4-hepteenihappoa valmistettu happokloridi tuottivat otsikkoyhdisteen.

20 Esimerkki 20 N-(3-(S)-metyyli-4-heptanoyyli)-D-gamma-glutamyyli-glysyyli-D-alaniini

Seosta, joka sisälsi 500 mg esimerkin 19 tuotetta ja 26 mg 5-%:ista palladiun-hiili-katalyyttiä (50 %:n ve-25 sipitoisuus) 125 mlrssa etanolia, ravisteltiin 2,5 tuntia vetyatmosfäärissä alkupaineen ollessa 4 x ilmanpaine. Katalyytti suodatettiin ja liuotin poistettiin vakuumissa. Tuote puhdistettiin käyttäen esimerkin 18 menetelmää ja oli kaikissa suhteissa identtinen tuon esimerkin tuotteen 30 kanssa.

Valmistus A

Sykloheksyyliasetyylikloridi A1. Etyylisykloheksyyliasetaatti 4,9 g:aan 60-%:ista natriumhydridiä öljyssä lisät-35 tiin riittävästi heksaania liuottamaan öljy. öljyttömään natriumhydridiin lisättiin typen alla 100 ml kuivaa 59 86858 tetrahydrofuraania ja sen jälkeen liuos, joka sisälsi 22,2 ml trietyylifosfonoasetaattia 80 mlrssa kuivaa tetrahydrofuraania. Kun seosta oli sekoitettu huoneen lämpötilassa tunnin ajan, siihen lisättiin 10,5 ml sykloheksanonia 5 40 mlrssa tetrahydrofuraania ja reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa yli yön. Reaktioseos kaadettiin veteen ja uutettiin dietyylieetterillä. Orgaaninen faasi pestiin 1N natriumhydroksidiliuoksella, vedellä ja suolaliuoksella. Orgaaninen faasi erotettiin, kuivattiin magnesiumsulfaatin 10 päällä ja konsentroitiin alennetussa paineessa.

Jäännös liuotettiin 250 ml:aan metanolia, käsiteltiin 1,5 g:11a 10-%:ista palladiumhydroksidi-hiili-kata-lyyttiä ja seosta sekoitettiin vetyatmosfäärissä 345 kPrn paineessa neljän tunnin ajan. Katalyytti suodatettiin ja 15 suodos konsentroitiin vakuumissa. Jäännös tislattiin 45-50°C:n lämpötilassa 0,4 torrin paineessa, jolloin saatiin 15,4 g (90 %:n saanto) haluttua välituotetta.

A2. Sykloheksyyliasetyylikloridi 100 mlraan metanolia, joka sisälsi 15,4 g etyyli-20 sykloheksyyliasetaattia, lisättiin 15,2 g kaliumhydroksi-dia ja liuosta refluksoitiin kolmen tunnin ajan. Metanoli poistettiin vakuumissa ja jäännöstä käsiteltiin vedellä. Liuos uutettiin dietyylieetterillä, jonka jälkeen se tehtiin happamaksi 10-%:isella kloorivetyhapolla. Hapan liuos 25 uutettiin tuoreella eetterillä ja orgaaninen faasi erotettiin ja pestiin vedellä ja suolaliuoksella. Liuottimen poisto kuivauksen jälkeen tuotti nestemäisen jäännöksen.

Jäännös liuotettiin 60 mlraan metyleenikloridia ja sitä käsiteltiin 18 ml:11a oksalyylikloridia. Kun reaktio-30 seosta oli sekoitettu huoneen lämpötilassa neljän tunnin ajan, se konsentroitiin vakuumissa ja jäännös tislattiin, 45/50°C/0,4 torr, 12,5 g (86 %:n saanto).

Valmistus B

Seuraten valmistuksen A : n mukaista yleistä menetelmää 35 ja käyttäen lähtöaineina trietyylifosfonoasetaalia ja sopivaa aldehydiä tai ketonia, valmistettiin seuraavat happo-kloridit : 86858 I^COCl R1 K^-.°C./torr 5 (CH3CH2CH2)2CHCH2- 50-55/0, 4 (CH3CH2)2CHCH2- 22-25/0,5 CH., I 3 10 CH.(CH?)-CHCH9- 23-30/0,5 3 J(R,sr CH-.

CH-(CH-)-CHCH-- 22-25/0,5 15 3 Z ^{R,Sr (CH3)2CH(CH2)3- 24-31/0 , 7 CB,CH0 I 3 2 20 CH3(CH2)3CHCH? 34-37/0,5 (R» S] CH0 I 3 25 CH,(CH0)-CHCH- 45-47/0,6 3 1 4(R,sf [^\cB2- 25-30/0,5 30 (CH3CH2)2CH{CH2)2- 32-36/0,4 CH, I 3 CH7(CH ) CH(CH } - 30-38/,06 3 MR,sr 35 ,, 8 6 8 S 8 o 1 !i Rp .°C./torr CH-CH- 5 I 3 2 CH3(CH2)4CHCH? 63-65/;95 (R» Sf f3 10 CH,(CH_)^CHCH0- 89-92/5 <R,Sf CH, I 3 (CH3)2CH(CH2),CHCH2 46-50/0j5 15 tR/S) Γ3 (CH~)_CHCH^CHCH_- 30-34/0,5 (R,Sf 20 CH,CH~ 31 2 CH,(CH?)5CHCH5- 31-35/0;7 mr,sr

Valmistus C

25 6-metyyliheptanoyylikloridi C1 . 3-hydroksi-4-metyyli-1 -penteeni 90 mlraan 5°C:seen jäähdytettyä 1,0 mol/1 vinyyli-magnesiumbromidia tetrahydrofuraanissa, lisättiin tipoit-tain 6,3 ml isobutyraldehydiä 30 ml:ssa tetrahydrofuraania, 30 jonka jälkeen seoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan. Kahden tunnin kuluttua reaktioseos lisättiin kyllästettyyn ammoniumkloridiliuokseen ja uutettiin eetterillä. Eetteri-uutokset yhdistettiin, pestiin kyllästetyllä aramoniumklo-ridiliuoksella, kyllästetyllä natriumbikarbonaattiliuoksel-35 la ja suolaliuoksella sekä kuivattiin magnesiumsulfaatin 62 86 8 58 päällä. Liuotin poistettiin vakuumissa, jolloin saatiin 6,0 g haluttua tuotetta.

C2. 6-metyyli-4-hepteenihappoetyyliesteri Seosta, joka sisälsi 18,2 g 3-hydroksi-4-metyvli-1-5 penteeniä, 200 ral trietyyliortoasetaattia ja 500 ml p-to-lueenisulfonihappoa, käsiteltiin 400 ml:11a tolueenia ja kuumennettiin refluksoiden 4A-molekyyliseulan päällä 24 tunnin ajan. Liuotin poistettiin vakuumissa ja jäännös tislattiin. Fraktio, joka tislautui lämpötilassa 45-64°C 10 ja 0,5 torrin paineessa, tuotti 7,5 g haluttua tuotetta. C3. 6-metyylihepteenihappoetyyliesteri Seokseen, joka sisälsi 7,5 g 6-metyyli-4-heptaani-happoetyyliesteriä 75 mlrssa metanolia, lisättiin 700 mg 10-%:ista palladiumhydroksidi-hiili-katalyyttiä ja seosta 15 ravisteltiin vetyatmosfäärissä 345 kP:n paineessa 1,5 tunnin ajan. Katalyytti suodatettiin ja liuotin poistettiin vakuumissa, jolloin saatiin 5,7 g haluttua tuotetta.

C4. 6-metyyliheptanoyylikloridi

Seuraten valmistuksen A2 menetelmää saatiin 5,7 g:sta 20 6-metvyliheptaanihappoetyyliesteriä 2,0 g haluttua tuotetta, kp. 30-34°C/0,5 torr.

Valmistus D

2-metyyliheptanoyylikloridi D1. 2-metyyliheptaanihappo 25 Kylmään (0°C) liuokseen, joka sisälsi 100 ml:ssa kuivaa tetrahydrofuraania 11,8 ml kuivaa di-isopropyyli-amiinia ja 55 ml 1,6 mol/1 n-butyylilitiumia, lisättiin 5.4 ml n-heptaanihappoa ja seoksen annettiin sekoittua huoneen lämpötilassa tunnin ajan. Saatu liuos jäähdytet- 30 tiin 0°C:seen ja siihen lisättiin 7,2 ml metyylijodidia. Reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa typen alla 1.5 tunnin ajan, jonka jälkeen se kaadettiin 10-%:iseen kloorivetyhappoon ja uutettiin dietyylieetterillä (3 x 100 ml). Uutokset yhdistettiin, pestiin 10-%:isella kloo- 35 rivetyhapolla, vedellä, 20-%:isella natriumbisulfiitilla ja suolaliuoksella sekä kuivattiin magnesiumsulfaatin 63 86858 päällä. Liuotin poistettiin vakuumissa ja jäännös, 5,61 g, liuotettiin metanoliin, joka sisälsi 5,1 g kaliumhvdroksi-dia. Kun seosta oli sekoitettu yli yön, metanoli poistettiin ja jäännös liuotettiin 150 ml:aan vettä. Vesipitoinen 5 kerros pestiin eetterillä (2 x 100 ml) ja tehtiin happamaksi 10-%:isesti kloorivetyhapolla. Tuote uutettiin eetterillä, pestiin 20-%:isella natriumbisulfiittiliuoksella ja suolaliuoksella sekä kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä. Eetterin poisto tuotti 5,0 g tuotetta keltaisena nes-10 teenä.

D2. 2-metyyliheptanoyylikloridi Käyttäen 5 g 2-metyyliheptaanihappoa ja 7,6 ml ok-salyylikloridia sekä valmistuksen A2 mukaista menetelmää saatiin 3,3 g haluttua tuotetta, kp. 32-34°C/0,6 torr.

15 Valmistus E

3-(S)-metyyliheptanoyylikloridi E1. 3-(R)-metyyliglutaarihappomonometyyliesteri 5 litran nelikaulaiseen pulloon, johon oli asetettu sekoittaja ja pH-elektrodi, laitettiin 2,5 1 0,01 mol/1 20 kaliumhappofosfaattipuskuria, pH 7,0 ja sen jälkeen 150 mg sian maksan esteraasia ja 150 g dimetyyli-3-metyyligluta-raattia. Seoksen pH pidettiin noin pH 6,85:ssä lisäämällä ajoittain 10-%:ista kaliumkarbonaattiliuosta. 2,5 tunnin kuluttua reaktioseos tehtiin happamaksi 10-%:isella kloo-25 rivetyhapolla pHrhon 2,0 ja tuote uutettiin dietyylieette-rillä. Uutokset yhdistettiin, kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä ja konsentroitiin vakuumissa, jolloin saatiin 114 g haluttua tuotetta /alfa_7D= -1,48 (CH^OH C = 0,086 g/ml) .

E2. Metyyli-3-(R)-metyyli-5-hydroksipentanoaatti 30 Seokseen, joka sisälsi 114 g 3-(R)-metyyliglutaari- happomonometyyliesteriä 715 ml:ssa 0°C:seen jäähdytettyä kuivaa tetrahydrofuraania, lisättiin hitaasti 391 ml 2 mol/1 boraanidimetyylisulfidiliuosta tetrahydrofuraanissa. Kun lisäys oli tehty, reaktioseosta sekoitettiin yli yön huo-35 neen lämpötilassa. Reaktioseos jäähdytettiin ja 50 ml vettä lisättiin hitaasti. Reaktioseosta uutettiin (3 x 100 ml) 64 86858 eetterillä ja uutokset yhdistettiin, pestiin vedellä, kyllästetyllä natriumbikarbonaattiliuoksella ja suolaliuoksella sekä kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä. Liuottimen poisto tuotti 37 g haluttua tuotetta.

5 E3. Metyyli-3-(R)-metyyli-5-(t-butyylidimetyylisi- lyvljoksi)pentanoaatti_

Liuokseen, joka sisälsi 37 g (0,253 m) metyyli-3-(R)-metyyli-5-hydroksipentanoaattia ja 37 g (0,543 m) imid-atsolia 500 mlrssa dimetyyliformamidia, lisättiin 37 g 10 (0,249 m) t-butyy]idimctyylisilyylikloridia ja reaktio- seosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa kahden tunnin ajan. Reaktioseos kaadettiin veteen ja uutettiin (4 x 100 ml) eetterillä. Yhdistetyt uutokset pestiin 10-%:isel-la kloorivetyhapolla, kyllästetyllä natriumbikarbonaatti-15 liuoksella, vedellä ja suolaliuoksella ja kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä. Liuottimen poisto tuotti 121,88 g raakatuotetta, josta tislattaessa saatiin 107,12 g puhdasta tuotetta, kp. 80-81°C/0,4 torr.

E4. 3-(S)-metyyli-5-(t-butyylidimetyylisilyvlioksi)- 2 0 1 -pent ano li ___________

Seokseen, joka sisälsi 8,5 g (0,224 m) litiumalu-miinihydridiä 250 ml:ssa dietyylieetteriä typen alla, lisättiin 53,5 g (0,206 m) metyyli-3-(R)-metyyli-5-(t-butyylidimetyylisilyylioksi)pentanoaattia 125 ml:ssa eet-25 teriä. Reaktioseosta sekoitettiin tunnin ajan 0°C:ssa, jonka jälkeen sitä käsiteltiin tipoittain 8,4 g:lla vettä, 8,4 ml:lla 15-%:ista natriumhydroksidiliuosta ja 25,2 ml:11a vettä. Kiinteät aineet suodatettiin ja orgaaninen faasi erotettiin ja pestiin vedellä, 2,5-%:isella kloorivetyha-30 polla ja suolaliuoksella. Orgaaninen faasi kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä ja konsentroitiin vakuumissa, jolloin saatiin 46 g tuotetta.

E5. 3-(R)-metyyli-5-(t-butyylidimetyylisilyylioksi)- 1-pentanaali_ 35 Seokseen, joka sisälsi 56,3 % oksalyylikloridia 300 mlrssa -60°C:scen jäähdytettyä kuivaa metyleenikloridia 65 868 58 typpiatmosfäärissä, lisättiin tipoittain 74,81 g dimetyyli-sulfoksidia 100 ml:ssa kuivaa metyleenikloridia. 15 minuutin kuluttua lisättiin tipoittain 92,0 g 3-(S)-metyyli-5-(t-butyylidimetyylisilyylioksi)-1-pentanolia 250 mlrssa 5 samaa liuotinta. 30 minuutin kuluttua 206,1 g trietyyli-amiinia lisättiin -60°C:seen reaktioseokseen, jonka jälkeen jäähdytyshaude poistettiin. Reaktioseosta sekoitettiin huoneen lämpötilassa 1,5 tunnin ajan, jonka jälkeen se kaadettiin veteen ja uutettiin metyleenikloridilla.

10 Uutokset pestiin 2,5-%:isella kloorivetyhapolla, kyllästetyllä natriumbikarbonaattiliuoksella, vedellä ja suolaliuoksella, jonka jälkeen ne kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä. Liuotin poistettiin ja jäännös liuotettiin eetteriin sekä pestiin uudelleen ja kuivattiin kuten aikaisem-15 min. Eetterin poisto tuotti 90,9 g haluttua tuotetta.

E6. 5-(S)-metyyli-7-(t-butoksidimetyylisilyylioksi)- 2-hepteeni_

Lietteeseen, joka sisälsi 80 g (0,2155 m) trifenyy-lietyylifosfoniumbromidia 800 ml:ssa 0°C:seen jäähdytettyä 20 kuivaa tetrahydrofuraania, lisättiin 165,7 ml 1,3 mol/1 n-butyylilitiumliuosta (0,2155 m) samassa liuottimessa. Kahden tunnin kuluttua reaktioseokseen lisättiin tipoittain 45 g (0,196 m) 3-(R)-metyyli-5-(t-butyylidimetyyli-silyylioksi)-1-pentanaalia 200 ml:ssa kuivaa tetrahydro-25 furaania. Reaktion annettiin sekoittua kahden tunnin ajan huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen se kaadettiin veteen ja uutettiin eetterillä. Yhdistetyt uutokset pestiin vedellä ja suolaliuoksella ja kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä. Liuottimen poisto vakuumissa tuotti keltaista Öl-30 jyä, josta tislattaessa saatiin 37,4 g tuotetta, kp. 74-79°C/0,2 - 0,1 torr.

E7. 3-(S)-metyyli-1-heptanoli

Liuokseen, joka sisälsi 74,8 g 5-(S)-metyyli-7-(t-butyylidimetyylisilyylioksi)-2-hepteeniä 500 mlrssa metano-35 lia, lisättiin 7,5 g 10-%:ista palladiumhydroksidi-hiili-katalyyttiä ja seosta ravisteltiin vetyatmosfäärissä 86858 66 1,5 tunnin ajan 345 kP:n paineessa. Katalyytti suodatettiin ja liuotin poistettiin vakuumissa, 30 g.

E8. 3-(S)-metyyliheptaanihappo 10 g:aan 3-(S)-metyyli-1-heptanolia 175 ml:ssa ase-5 töniä lisättiin tipoittaan 45 minuutin kuluessa ja lämpötilassa 15-20°C 90 ml Jones'in reagenssia. 15 minuutin kuluttua seokseen lisättiin 15 ml isopropanolia ja sekoitusta jatkettiin 30 minuuttia. Reaktioseos kaadettiin veteen ja tuote uutettiin eetterillä. Uutteet yhdistettiin, pes-10 tiin vedellä, natriumbisulfiittiliuoksella ja suolaliuoksella sekä kuivattiin magnesiumsulfaatin päällä. Liuotin poistettiin, jolloin saatiin 10 g tuotetta nestemuodossa, kp. 84-88°C/0,4 torria, faliaJO = -4,46 (CH3OH C = 0,105 g/ml).

15 E9. 3-(S)-metyyliheptanoyylikloridi

Seuraten valmistuksen A 2 menetelmää saatiin 5,0 g: s ta 3-(S)-metyyliheptaanihappoa ja 7,5 ml:sta oksalyyliklori-dia 2,9 g haluttua happokloridia, kp. 29-32°C/0,25 torria.

Claims (4)

67 868 58

1. Menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten, asyyliglutamiinihappoa sisältävien peptidien 5 valmistamiseksi, joilla on kaava 1 O li F^CNH-^ D ^CO~R, 1 2 4 LO (1) II io (ch2)2conhchc-r3 ^2 jossa Rj on 2-10 hiiliatomia sisältävä alkyyli, 4-7 hiiliatomia sisältävä sykloalkyyli tai 6-8 hiiliatomia si-15 sältävä sykloalkyylimetyyli; R2 on vety tai 1-3 hiiliatomia sisältävä alkyyli; R3 on hydroksi tai aminohappotähde, jolla on kaava D

20 -NHCH(CH«) CO^R^ | Z Π Z O x jossa X on vety, 1 tai 2 hiiliatomia sisältävä alkyyli tai hydroksimetyyli ja n on kokonaisluku 0-4; ja R4 ja R5 25 ovat molemmat itsenäisesti vety, 1-6 hiiliatomia sisältä vä alkyyli, 6-8 hiiliatomia sisältävä sykloalkyylimetyyli tai bentsyyli, ja niiden suolojen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) kytketään dehydratoivasti yhdiste, jolla on 3. kaava RjCONH^ D C02CH2-fenyyli ^ CH L O < Il (CH2)2CONHCHC-OH 35 k2 86858 68 jossa R3 ja R2 merkitsevät samaa kuin edellä, yhdisteen kanssa, jolla on kaava D

5 H0NCH(CH„) C0oRc 2 | 2 n 2 5 X jossa reaktioon osallistumattomat funktionaaliset ryhmät voidaan estää ja jossa X, n ja R5 merkitsevät samaa kuin 10 edellä, minkä jälkeen seuraa valinnainen vaihe, jossa selektiivisesti poistetaan estäjäryhmät, ja haluttaessa valmistetaan tuotteen farmaseuttisesti hyväksyttävä emäs-suola; tai b) asyloidaan yhdiste, jolla on kaava 15 H2N \ D ^ C02R5 ^ CH ^ LO I II (ch2)2conhch-c-r3 *2 20 jossa R2, R3 ja R5 merkitsevät samaa kuin edellä, yhdisteellä, jolla on kaava R-jCO-Hal 25 jossa reaktioon osallistumattomat funktionaaliset ryhmät voidaan estää ja jossa R3 merkitsee samaa kuin edellä ja Hai on halogeeni, minkä jälkeen seuraa valinnainen vaihe, jossa selektiivisesti poistetaan estäjäryhmät, ja halut-30 taessa valmistetaan tuotteen farmaseuttisesti hyväksyttä vä emässuola.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että kytkentä suoritetaan käyttäen N-hydroksisukkinimidiä tai 1-hydroksibentsotriatso-35 lia ja karbodi-imidiä. 69 86858

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että asylointi suoritetaan happo-kloridilla tertiäärisen amiinin läsnäollessa.

4. Patenttivaatimuksen 2 tai 3 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että O-bentsyyliryhmät poistetaan katalyyttisellä hydrogenolyysillä. 70 86858