NO170422B

NO170422B - Analogifremgangsmaate for fremstilling av terapeutisk aktive peptider

Info

Publication number: NO170422B
Application number: NO864689A
Authority: NO
Inventors: James Patrick Rizzi
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1985-11-25
Filing date: 1986-11-24
Publication date: 1992-07-06
Also published as: FI86858B; KR900004648B1; CN86107931A; CN1017436B; DK170345B1; YU200586A; PT83796A; FI864772A0; NO170422C; NO864689D0; PH22258A; PT83796B; AU579501B2; PL150129B1; PL262563A1; DK561986D0; DK561986A; FI864772A; FI86858C; KR870005012A

Description

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av nye acylglutaminsyre-holdige peptider som kan benyttes som immuno-stimulerende og infeksjonshindrende midler, samt farma-søytiske preparater av disse beregnet for bruk ved infeksjons-behandling.

Det relativt nye feltet immuno-farmakologi, og spesielt det område innefor dette som angår immuno-modulering, fortsetter sin hurtige utvikling. En rekke naturlig forekommende forbindelser er hittil undersøkt, innbefattet tetrapeptidet tuftsin med den kjemiske betegnelsen N<2->[1-(N<2->L-treonyl-L-lysyl)-L-prolyl]-L-arginin. Stor oppmerksomhet har dessuten vært rettet mot syntetiske peptidoglykanderivater, spesielt de såkalte muramyl-dipeptidene. En oppsummering av det store utvalg av forbindelser som har vært vurdert som immuno-modulatorer, og spesielt som immuno-stimulerende milder, finnes hos Duker et al., Annu. Rep. Med. Chem., 14, 146-167 (1979), Lederer, J. Med. Chem., 23, 819-825 (1980) og til J. Kralovec, Drugs of the Future, 8, 615-638 (1983).

Immuno-stimulerende peptider er omtalt i en rekke

patenter:

L-alanyl-alfa-glutarsyre-N-acyl-dipeptider i Tysk patent

3.024.355 av 15. januar 1981;

tetra- og penta-peptider inneholdende D-alanyl-L-glutamyldeler eller L-alanyl-D-glutamyldeler henholdsvis i Britisk patent 2.053.231 av 4. februar, 1981 og Tysk patent 3.024.281 av 8. januar 1981; og

N-acyl-alanyl-gamma-D-glutamyl-tripeptid-derivater hvor den C-terminale aminosyre er lysin eller diaminopimelinsyre i Tysk patent 3.024.369 av 15. januar 1981; og

laktoyltetrapeptider bygget opp av N-laktyl-alanyl, glutamyl, diaminopimelyl og karboksymetylamino-komponenter i EP-11283 av 23. mai, 1980.

Andre immuno-stimulerende polypeptider med formel (A) hvor R<1> er hydrogen eller acyl; R<2> bl.a. er hydrogen, lavere alkyl, hydroksymetyl, benzyl; <R3> og R4 hver er hydrogen, karboksy, -CONR<7>R<8>, hvor R7 er hydrogen, lavere alkyl som even-tuelt er substituert med hydroksy; og R8 er mono-dikarboksy-lavere-alkyl; R<5> er hydrogen eller karboksy forutsatt at når én av R<4> og R<5> er hydrogen, den andre er karboksy- eller -CONR<7>R<8>; R<6> er hydrogen; m er 1-3 og n er 0-2, samt derivater derav hvor karboksy- og aminogruppene er beskyttet, er beskrevet i US-patent 4.311.640 og 4.322.341; EP-patentsøknader 25.842; 50.856; 51.812; 53.388; 55.846 og 57.419.

Ingen av de publiserte polypeptider har en heterocyklisk del i den stilling som opptas av R<4> i den ovenfor angitte formel, bortsett fra US-patentsøknad serie nr. 662.668 av 19. oktober 1984, som beskriver polypeptider hvor R<4> er en basisk aminosyre-del.

Kitaura et al., J. Med. Chem., 25, 335-337 (1982) oppgir at N<2->(gamma-D-glutamyl)-meso-2(L),2(D)-diaminopimelinsyre som den minimale struktur som kan utvirke en biologisk respons som er karakteristisk for forbindelsen (A), hvor n er 1; R<1> er CH3 (CH(OH)-C0-; R<2> er CH3; hver av R3 og R<5> er -COOH; R4 er

-CONHCH2COOH; og R6 er H. Den nevnte forbindelse med formel

(A) er kjent som FK-156.

De nye immuno-stimulerende midler fremstillet i henhold

til foreliggende oppfinnelse har formelen:

og innbefatter farmasøytisk akseptable basiske salter derav, hvor R1 er alkyl med 2-10 karbonatomer, cykloalkyl med 4-7 karbonatomer eller cykloalkylmetyl med 6-8 karbonatomer;

R2 er hydrogen eller alkyl med 1-3 karbonatomer;

R3 er hydroksy eller en aminosyre-rest med formelen:

hvor X er hydrogen, alkyl med 1-2 karbonatomer eller hydroksymetyl og n er et heltall fra 0 til 4;

R4 er hydrogen, alkyl med 1-6 karbonatomer eller benzyl, og R5 er hydrogen, alkyl med 1-6 karbonatomer, benzyl eller cykloheksylmetyl,

og farmasøytisk akseptable basiske salter derav. En foretrukket gruppe av forbindelser er de hvor Rx er alkyl med 5-8 karbonatomer, R2 er hydrogen, R3 er den nevnte aminosyre-rest hvor X, n og R5 er som angitt og RA er hydrogen. Spesielt foretrukket er forbindelser innefor den gruppe, hvor n er null og R5 er hydrogen, alkyl eller cykloheksylmetyl. Særlig foretrukne forbindelser er de hvor Rx er (R,S)-2-etyl-l-butyl, R5 er hydrogen og X er metyl, Rx er (R, S)-3-heptyl, R5 er hydrogen og X er metyl, Rx er (R,S)-2-metyl-l-pentyl, R5 er hydrogen og X er metyl, Rx er (R,S)-2-heptyl, R5 er hydrogen og X er metyl, Rx er (R,S)-2-etyl-l-pentyl, R5 er hydrogen og X er metyl, Rx er (R, S)-1-heksyl, R5 er hydrogen og X er metyl, Rx er (R, S)-2-etyl-l-heksyl, R5 er hydrogen og X er metyl, Rx er (S)- eller (R,S)-2-metyl-1-heksyl, R5 er hydrogen og X er metyl, Rx er (S)- eller (R,S)-2-etyl-l-heksyl, X er metyl og R5

er hydrogen og Rx er 1-heksyl, X er metyl og R5 er hydrogen. Spesielt foretrukket er også de forbindelser hvor Rx er 1-heksyl, X er hydrogen og n er 3. Spesielt foretrukne estere er slike hvor R], er (R, S)-2-etyl-l-pentyl, X er metyl og R5 er n-butyl, i-butyl eller cykloheksylmetyl, Rx er (S)- eller (R,S)-2-metyl-l-heksyl, X er metyl og R5 er n-butyl, i-butyl eller cykloheksylmetyl og Ri er (S)- eller (R,S)-2-etyl-l-heksyl, X er metyl og R5 er n-butyl, i-butyl eller cykloheksylmetyl.

En annen foretrukket gruppe av forbindelser utgjøres av dem hvor Rx er cykloalkyl med 4-7 karbonatomer, R2 er hydrogen og R3 er den nevnte aminosyre-rest, hvor n er 0, X er alkyl med 1-2 karbonatomer og RA og R5 hver er hydrogen. Spesielt foretrukket innen denne gruppe er forbindelsen hvor Rx er cykloheksyl og X er metyl.

En tredje foretrukket gruppe forbindelser utgjøres av dem hvor Ri er alkyl med 5-8 karbonatomer, R2 er hydrogen, R3 er den nevnte aminosyre-rest hvor X er hydrogen eller alkyl med 1-2 karbonatomer, n er et av tallene fra 0-4 og R5 er hydrogen og R4 er alkyl med 1-6 karbonatomer, cykloalkylmetyl med 6-8 karbonatomer eller benzyl.

Farmasøytiske preparater i form av enhetsdoser omfatter et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel og en antiinfeksjons-eller immuno-stimulerende virksom mengde av en forbindelse med formel 1. Preparatene kan benyttes humanmedisinsk til behandling av infeksjoner.

Med farmasøytisk akseptable basiske salter av forbindelsene med formel 1 skal forstås salter med uorganiske eller organiske baser, så som alkalimetall- og jordalkalimetallhydroksyder, ammoniumhydroksyd, trietylamin, etanolamin og dicykloheksylamin.

Konfigurasjonen av aminosyre-delene som bygger opp forbindelser med formel 1, er av vesentlig betydning med hensyn til den farmakologiske virkning av forbindelsene. Størst aktivitet ses hos forbindelser med den stereokjemi som er angitt formel 1. I forbindelser med formel 1 hvor R2 og X er forskjellig fra hydrogen, er de foretrukne steriske forhold i det nevnte karbonatom angitt som henholdsvis L og D. Innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse ligger også forbindelser med formel 1 hvor R3 er alkoksy, cykloalkoksy, aralkoksy eller alkoksy substituert med én eller flere substituenter valgt fra amino, dialkylamino, hydroksy, alkoksy og halogen.

Forbindelsene med formel 1 kan fremstilles etter flere fremgangsmåter som er kjent på fagområdet. Fremgangsmåtene innebærer dannelse av peptid-bindinger mellom aminosyrer som på grunn av deres amino- og karboksygrupper, og ofte også forekommende andre reaktive grupper, fordrer beskyttelse og/eller aktivering av slike grupper, spesielt karboksygruppen, for å oppnå en bestemt reaksjon eller for å optimalisere en sådan.

Ifølge oppfinnelsen benyttes to syntesemetoder for fremstilling av forbindelsene 1. I henhold til den første fremgangsmåte benyttes dehydrerende kobling av fragmentet

med aminosyre-fragmentet

Den andre fremgangsmåten omfatter acylering av peptidet

med den passende syren, RiCC^H.

I de eksempler som presenteres her er visse beskyttende og aktiverende grupper spesielt belyst. Fagmannen vil imidlertid innse at andre beskyttende eller aktiverende grupper kunne ha vært anvendt. Valget av en spesiell beskyttelsesgruppe avhenger i stor grad av om det nødvendige reagens er tilgjengelig, av dets effekt på oppløseligheten av den "beskyttede" forbindelse, om det lett lar seg fjerne og av nærværet av andre grupper som kunne påvirkes ved bruk av reagenset, d.v.s. reagensets selektivitet eller fjerning.

Det vil for eksempel være nødvendig, eller i det minste ønskelig, å beskytte amino- og/eller karboksygruppene under flere av reaksjonene. Den valgte syntesevei for peptid-syntesen kan fordre at den ene eller begge av disse beskyttelsesgruppene fjernes for å muliggjøre videre omsetning i de regenererte amino-eller karboksygruppene; d.v.s.. de benyttede beskyttelsesgrupper er reversible og oftest, grupper som kan fjernes uavhengig av hevrandre. Valget av beskyttelsesgrupper for en..gitt aminogruppe avhenger dessuten av betydningen av aminogruppen i reaksjonsskjemaet sett under ett. Amino-beskyttelsesgrupper med ulike labilitetsnivåer, d.v.s. enkelthet med hensyn til fraspaltning, vil bli benyttet. Det samme gjelder karboksy-beskyttelsesgruppene. Slike grupper er kjent innen fagområdet, se f.eks. oversikt av Bodansky et al., "Peptide Synthesis", 2. utg., John Wiley & Sons, N. Y. (1976); Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, N. Y. (1981); McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, N. Y.

(1973) og Sheppard i "Comprehensive Organic Chemistry, The Synthesis and Reactions of Organic Compounds", Pergamon Press, N. Y. (1979), red. av E. Haslam, del 23.6, s. 321-339.

Representative amino-beskyttelsesgrupper er for eksempel benzyloksykarbonyl; substituert eller usubstituert aralkyl, så som benzyl, trityl, benzhydryl og 4-nitrobenzyl; benzyliden; aryltio, så som fenyltio, nitrofenyltio og triklorfenyltio; fosforylderivater, så som dimetylfosforyl og 0,O-dibenzyl-fosforyl; trialkylsilylderivater, så som trimetylsilyl; og andre beskrevet i US-patent 4.322.341. Den foretrukne amino-beskyttelsesgruppe er benzyloksykarbonyl. Fremgangsmåter for substitusjon av denne gruppe på en gitt aminogruppe er velkjent. De omfatter vanligvis acylering av den passende aminoforbindelse med benzyloksykarbonylklorid

(benzylklorformiat) i et reaksjonsinert oppløsningsmiddel, f.eks. vann, metylenklorid, tetrahydrofuran, i nærvær av en base (syre-akseptor) f.eks. natrium- eller kaliumhydroksyd når vann er oppløsningsmiddel; og ved bruk av et organisk oppløsningsmiddel, nærvær av et tertiært amin, så som Cx_ Atrialkylaminer og pyridin. Når det benyttes et vandig opp-løsningsmiddelsystem, holdes reaksjonen ved ca. pH 8-10, fortrinnsvis ved pH 9. Når reaktanten, d.v.s. den forbindelse som har en aminogruppe som skal beskyttes, inneholder basiske grupper, kan reaktanten tjene som syre-akseptor.

Acylgruppen, RiCO, innføres i peptidet etter vanlig acyl-eringsmetoder, så som omsetning av peptidet med et passende syreklorid eller bromid i et reaksjons-inert oppløsningsmiddel. Gunstige betingelser er herunder ikke-vandige betingelser, innbefattet tilsetning av en passende base, så som en organisk base, fortrinnsvis et tertiært amin, som f.eks. trietylamin, N-metylmorfolin eller pyridin. Som oppløsningsmiddel foretrekkes metylenklorid.

Representative karboksy-beskyttelsesgrupper er forskjellige estere, så som silylester, herunder trialkylsilylestere, trihalogensilylestere og

halogenalkylsilylestere; visse hydrokarbylestere, så som «alkyl, spesielt t-butylgrupper, benzyl og substituerte

benzylestere, benzhydryl og trityl; fenacyl og pftalimidometylestere; visse substituerte hydrokarbylestere, så som klormetyl, 2,2,2-trikloretyl, cyanometyl; tetrahydropyranyl; metoksymetyl; metyltiometyl; beskyttet karbazoyl, så som -CONH-NHR<0>, hvor R° er en av de ovenfor nevnte amino-beskyttelsesgrupper, spesielt benzyloksykarbonyl; og andre grupper beskrevet i US-patent 4.322.341. En spesielt foretrukket karboksy-beskyttelsesgruppe er t-butoksykarbonylgruppen.

De beskyttede amino- og karboksygrupper omdannes til de ubeskyttede amino- og karboksygrupper etter fremgangsmåter som er kjent innen fagområdet. Benzylgruppen, den foretrukne beskyttelsesgruppe for karboksygrupper (som del av den beskyttede karbazoylgruppe), fjernes ved katalytisk hydrogenering over palladium, spesielt palladium-på-kull. Som et alternativ kan disse beskyttelsesgrupper fjernes ved hjelp av trifluormetansulfonsyre i trifluoreddiksyre i nærvær av anisol for å undertrykke alkylering. t-butoksykarbonylgruppen fjernes lett ved behandling med dioksan mettet med hydrogenklorid.

Aktivering av karboksygrupper som middel til å påskynde en gitt reaksjon er en teknikk som er kjent for fagmannen. I den her beskrevne reaksjonsfølge er bruk av anhydrider, spesielt cykliske anhydrider, og aktiverte estere av N-hydroksyftalimid og N-hydroksysuccinimid som begge benyttes ved peptidsynteser, spesielt nyttige.

De aktiverte N-hydroksysuccinimidestere påskynder påfølgende reaksjoner i den aktiverte estergruppe. Andre aktiveringsgrupper vil også kunne benyttes. En spesiell interessant gruppe er N-hydroksyftalimidogruppen som benyttes på samme måte som N-hydroksysuccinimidogruppen. I begge tilfeller benyttes et dehydrerende koblingsmiddel for å danne den aktiverte esteren. Slike koblingsmidler er for eksempel 1-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)karbodiimid metode -p-toluen sulfonat, dicykloheksylkarbodiimid, N,N'-karbonyldiimidazol, N-(3-dimetylaminopropyl)-N'-etylkarbodiimid, hydroklorid, etoksyacetylen, difenylketen og N-etyl-5-fenylisoksazolen-3'-sulfonat. Reaksjonsbetingelsene ved bruk av disse koblingsmidlene er utførlig omtalt i litteraturen. De omfatter i alminnelighet bruk av reaksjons-inert oppløsningsmiddel og temperaturer fra romtemperatur til 100°C. De nevnte karbodiimidreagenser foretrekkes fordi de kan benyttes ved-romtemperatur og gir tilfredsstillende utbytte av de ønskede estere.

Etter at koblingsreaksjonene som fører til sluttproduktene er fullført, kan de forskjellige beskyttelsesgruppene fjernes ved hensiktsmessig anvendelse av den ovenfor omtalte teknikk, hvorved forbindelser med formel 1 kan isoleres.

De farmasøytisk akseptable basiske saltene av forbindelsene 1, hvor R3 er hydroksy eller R4 eller R5 er hydrogen, oppnås ved å behandle en oppløsning, fortrinnsvis vandig oppløsning, med en av de nevnte baser som i alminnelighet benyttes i støkiometriske forhold. Saltene isoleres ved inndampning eller utfelling.

Produktene oppnådd i henhold til oppfinnelsen utgjør egnede midler for klinisk og terapeutisk behandling av sykdommer forårsaket av forskjellige patogene mikroorganismer, spesielt gram-negative bakterier. De kan også anvendes som immuno-stimulerende midler hos pattedyr, innbefattet mennesket, som har en høyere risiko for infeksjoner på grunn av klinisk indusert immuno-suppresjon.

Under utprøvningen av midlene ble det benyttet C3H/HeN hannmus fra Charles River Breeding Laboratory. Musene ble akklimatisert i 5 dager før bruk og deretter behandlet subkutant (s.c.) eller peroralt (p.o.) med forskjellige oppløsninger (100, 10, 1 og 0,1 mg/kg) av testforbindelse eller placebo (pyrogenfri saltoppløsning) i et volum på

0,2 ml. Behandlingsopplegget var avhengig av hvilke infektiøse organismer som ble benyttet, d.v.s. klokkeslettet minus 24 og 0 før påvirkning med Klebsiella pneumoniae av normale mus og 3, 2 og 1 dager før påvirkning med Escherichia coli eller Staph. aureus i immuno-kompromiserte mus. Smitten ble tilført intramuskulært (i.m.) i hoften for K. pneumoniae eller

intraperitonealt (i.p.) for E. coli og Staph. aureus. Et volum på 0,2 ml ble benyttet for denne påvirkning. Mortaliteten ble registrert etter 7 dager for K. pneumoniae og etter 3 dager for påvirkningen av de øvrige to mikroorganismene.

For fremstilling av kulturmediet for K. pneumoniae, E. coli eller Staph. aeureus ble kulturen utstrøket for renhetskontroll fra frosset blod på hjerne-hjerte-infusjon (BHI)-agar. Tre kolonier ble tatt fra 18 timers skålkulturen og anbrakt i 9 ml BHI-buljong. Buljongkulturen ble dyrket i 2 timer ved 37°C på en roterende ristemaskin, hvoretter 0,2 ml ble utstrøket på overflaten av flere skråkulturer av BHI-agar. Etter 18 timers inkubasjon ved 37°C ble skråkulturene vasket med BHI-buljong, kultur-tettheten regulert ved bruk av et spektronic 20 og den passende fortynning foretatt for å oppnå et LD90 smittenivå i normale mus.

Ved bruk som antiinfeksjonsmiddel eller immuno-stimulerende midler hos mennesker, gis de nye forbindelsene peroralt, subkutant, intramuskulært, intravenøst eller intraperitonealt i form av et preparat. I henhold til farmasøytisk praksis kan de for eksempel gis som tabletter, piller, pulvere eller granulater som inneholder hjelpestoffer som stivelse, melkesukker, visse typer leire, etc. De kan gis i kaspler, i blanding med de samme eller tilsvarende hjelpestoffer. De kan også gis i form av orale suspensjoner, oppløsninger, emulsjoner, siruper og miksturer som kan inneholde smaksforbedrende stoffer og farvestoffer. For peroral administrasjon er tabletter eller kapsler som inneholder fra ca. 50 til ca. 500 mg av de nye forbindelser egnet for de fleste formål.

Behandlende lege vil avgjøre hvilken dose som.vil være mest hensiktsmessig for pasienten, og den vil variere med pasientens alder, vekt, respons og administrasjonsmåte. Det mest fordelaktige område ved peroral dosering av enkeltdoser eller avdelte doser er fra ca. 1,0 til ca. 300 mg/kg/dag. Parenteralt foretrekkes doser på ca. 1,0-100 mg/kg/dag, fortrinnsvis 1,0-20 mg/kg/dag.

De etterfølgende eksempler har utelukkende som hensikt å belyse oppfinnelsen ytterligere. Følgende forkortelser benyttes for formen av toppene i NMR-spektrene: s, singlett; d, dublett; t, triplett; q, kvartett; m, multiplett.

Eksempel 1

N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl-glycyl-D-alanin

D

fRj = CH,( CH,) ?; R? = H og R, = NHCH fCH,) CO?H)

IA. N- heptanoyl- D- qamma- qlutamyl ( alfa- benzylester)- qlvcin

Til en oppløsning av 897 mg (13~, 0 mmol) glycin og 1,3 g (13,0 mmol) trietylamin i 10 ml vann ble det tilsatt 5,0 g (11,2 mmol) N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-hydroksysuccinimidester i 100 ml dioksan og den resulterende reaksjonsblanding ble omrørt ved romtemperatur i 80 timer. Oppløsningen ble helt over i 3 00 ml etylacetat, og de adskilte organiske fasene ble vasket med 10% saltsyre, vann og en saltoppløsning. Den organiske fase ble fraskilt, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum til tørrhet. Residuet ble utgnidd med dietyleter og filtrert under nitrogen, 3,43 g.

(74% utbytte).

IB. N- heptanoyl- D- gamma- qlutamvl- glvcyl- D- alanin

Til en oppløsning av 2,0 g (4,78 mmol) N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-glycin, 1,75 g (5 mmol) D-alanin benzylester p-toluensulfonsyresalt, 506 mg (5 mmol) trietylamin og 675 mg (5 mmol) 1-hydroksybenzotriazol i 100 ml tetrahydrofuran. ble det tilsatt 3,03 g (7,17 mmol) 1-cykloheksyl-3-(2-morfolinoetyl)karbod-ii-m-id- meto-p-toluensulfonat og reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer. Reaksjonsblandingen ble helt over i 300 ml etylacetat, og den organiske fase ble fraskilt og vasket med 10% saltsyre, vann, en mettet natriumbikarbonatoppløsning og en saltoppløsning. Den organiske fase ble fraskilt, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum. Residuet ble utgnidd med dietyleter og filtrert under nitrogen, 2,7 g. To gram av faststoffet i 75 ml metanol med 400 mg 10% palladiumhydroksyd på kull ble ristet i en hydrogenatmosfære ved et start-trykk på 3,5 kg/cm<2> i 4 timer. Katalysatoren ble frafiltrert og filtratet inndampet under redusert trykk. Residuet ble oppløst i vann og lyofilisert for å gi 1,23 g (90% utbytte) av det ønskede produkt som et hvitt faststoff.

NMR-spekteret (DMS0-d6) viste absorbsjon ved 4,35-4,2 (m, 2H); 3,83 (s, 2H); 2,35 (t, J=7Hz, 2H); 2,17 (t, J=7Hz, 2H); 2,1-1,8 (m, 2H); 1,55-1,45 (m, 2H); 1,3 (d, J=6Hz, 3H); 1,17 (bs, 6H); og 0,75 (bs, 3H) ppm.

Eksempel 2

N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl-glycin

fRT = CH,( CH?K; R, = H. oa R, = OH)

En oppløsning inneholdende 1,0 g N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-glycin i 50 ml metanol ble behandlet med 100 mg 10% palladiumhydroksyd på kull og ristet i hydrogenatmosfære ved 3,5 kg/cm<2> i 3 timer. Katalysatoren ble frafiltrert og filtratet konsentrert i vakuum. Residuet ble løst opp i varmt vann og inndampet i vakuum. Residuet ble igjen oppløst i vann og lyofilisert for å gi 630 mg (83% utbytte) av det ønskede produkt som et hvitt faststoff.

NMR-spekteret (DMS0-d6) viste absorbsjon ved 4,37-4,25 (m, 1H); 3,9 (s, 2H); 2,35 (t, J=7Hz, 2H); 2,18 (t, J=6Hz, 2H); 2,4-1,8 (m, 2H); 1,6-1,4 (m, 2H); 1,8 (bs, 6H) og 0,7 (bt, 3H) ppm.

Eksempel 3

N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl-glycyl-glycin

(Rt = CH, ( CHo K; R-, = H; oa R, = NHCH?C02<H>)

3A. N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-glycin-hydroksysuccinamidester

Til en kald oppløsning (0°C) av 13,0 g (31 mmol) N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-glycin og 3,91 g (34 mmol) N-hydroksysuccinamid i 400 ml tetrahydrofuran ble det tilsatt 7,0 g (34 mmol) dicykloheksylkarbodiimid og blandingen ble omrørt ved 0°C i 1 time og ved romtemperatur i 18 timer. Faststoffene ble frafiltrert og filtratet konsentrert under redusert trykk. Residuet ble utgnidd med dietyleter og filtrert under nitrogen for å gi 15,4 g (98%) av det ønskede mellomprodukt.

3B. N- heptanoyl- D- qamma- qlutamyl- qlycyl- qlycin

Til 2,0 g (3,97 mmol) N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl (alfa-bensylester)-glycin-hydroksysuccinamidester i 100 ml dioksan ble det tilsatt 446 mg (5,95 mmol) glycin og 0,55 ml (3,9 mmol) trietylamin i 10 ml vann og den resulterende reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer. Oppløsningen ble helt over i 100 ml etylacetat og det organiske lag vasket med 2,5% saltsyre, vann og en saltoppløsning. Det organiske lag ble fraskilt, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert til tørrhet. Residuet ble utgnidd med dietyleter og filtrert under nitrogen for å gi 1,7 g hvitt faststoff. 1,5 g av faststoffet i 75 ml metanol inneholdende 2 00 mg 10% palladiumhydroksyd på kull ble ristet

i en hydrogenatmosfære ved 3,5 kg/cm<2> i 3 timer. Katalysatoren ble frafiltrert og filtratet konsentrert i vakuum. Residuet ble oppløst i vann og lyofilisert for å gi 1,12 g (90% utbytte) av det ønskede produkt.

NMR-spekteret (DMSO-d6) viste absorbsjon ved 8,2-8,0 (m, 3H); 4,19 (m, 1H); 4,8-4,6 (m, 4H); 2,25 (t, J=7Hz, 2H); 2,1 (t, J=6Hz, 2H); 2,05-1,7 (m, 2H); 1,5 (m, 2H); 1,25 (bs, 6H);

og 0,85 (t, J=6Hz, 3H) ppm.

Eksempel 4

N-heptanoyl-D-gamma.-glutamyl-glycyl-D-serin

D

(Rn = CH,( CH, U; R, = H; og R, = - NHCH( CHoOH) CO^ H)

Ved å gå ut 2,0 g (3,98 mmol) N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-glycin-hydroksysuccinamidester, 78 0 mg (4,02 mmol) O-benzyl-D-serin og 0,556 ml (4,02 mmol) trietylamin og følge fremgangsmåten i Eksempel 3B, ble 902 mg (76% utbytte) av det ønskede produkt isolert, smp. 130-132°C.

NMR-spekteret (DMS0-d6) viste absorbsjon ved 8,3 6-7,94 (m, 3H); 4,46-4,28 (m, 1H); 4,28-4,08 (m, 1H); 3,94-3,50 (m, 4H);

2,25 (t, J=9Hz, 2H); 2,17 (t, J=9Hz, 1H); 2,10-1,04 (m, 14H);

og 0,9 (t, 6Hz, 3H) ppm.

Eksempel 5

N- heptanoyl- D- qamma- qlutamyl- qlycyl- D- alfa- aminosmørsyre

D

( R, = CH,( CH,) <; R? = H; og R, = - NHCH( CH, CH,) CO,H)

Fremgangsmåten i Eksempel 3B ble gjentatt ved å gå ut fra 2,0 g (3,98 mmol) N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester) -glycyl-hydroksysuccinamidester, 400 mg (4,02 mmol) D-alfa-aminosmørsyre og 0,556 ml (4,02 mmol) trietylamin for å gi 632 mg (57% utbytte) av det ønskede produkt, smp. 140-141°C.

NMR-spekteret (DMSO-d6) viste absorbsjon ved 8,16-8,04 (m, 3H); 4,22-4,08 (m, 2H); 3,84-3,58 (m, 2H); 2,2 (t, J=9Hz, 2H); 2,12 (t, J=9Hz, 2H); 2,04-1,0 (m, 15H); og 0,85 (t, J=6Hz, 6H) ppm.

Eksempel 6

N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl-glycyl-3-aminopropionsyre

f R, = CH,fCH,) «- ; R, = H; og R, = - NH ( CH,KCO,H)

Ved å følge fremgangsmåten i Eksempel 3B og gå ut fra

1,5 g (3,0 mmol) N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester) -glycin-hydroksysuccinamidester , 350 mg (3,9 mmol) 3-aminopropionsyre og 0,55 ml (3,9 mmol) trietylamin, ble 500 mg (43%) utbytte) av det ønskede produkt oppnådd, smp. 135-138°C.

NMR-spekteret (DMSO-d6) viste absorbsjon ved 8,19-8,02 (m, 2H) ; 7,98-7,87 (t, J=5Hz, 1H); 4,25-4,1 (m, 2H) ; 3,8-3,49 (m, 2H) ; 3,44-3,1 (m.,- 2H.) ;.. 2.,-4- (t, J=6Hz, 2H) ; 2,22 (t, J=7Hz, 2H) ; 2,14 (t, J=7Hz, 2H) ; 2,1-1,67 (m, 2H) ; 1,6-1,17 (m,. 8H) ;. og 0,88 (t, J=6Hz, 3H) ppm.

Eksempel 7

N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl-glycyl-4-aminosmørsyre

(R, = CH,(CH,K- ; R, = H; og R, = - NHfCH, KCO,^ Fremgangsmåten i Eksempel 6 ble gjentatt ved å erstatte 3-aminopropionsyren med 410 mg (4,0 mmol) 4-aminosmørsyre for å gi 600 mg (50% utbytte) av det ønskede produkt, smp. 140-142°C.

NMR-spekteret (DMSO-d6) viste absorbsjon ved 8,18-8,03 (m, 2H); 7,88 (bt, J=4Hz, 1H); 4,17-4,09 (m, 2H); 3,81-3,48 (m, 2H); 2,32-2,08 (rn, 6H); 2,08-1,08 (m, 12H) og 0,88 (t, J=6Hz, 3H) ppm.

Eksempel 8

N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl-glycyl-5-aminopentansyre

(R, = CH, fCH? K- ; R, = H; oa R, = - NH( CH,) ,,C0-,H)

Ved å benytte 470 mg (4,0 mmol) 5-aminopentansyre i stedet for 3-aminopropionsyre og følge fremgangsmåten i Eksempel 6 ble 520 mg (42% utbytte) av det ønskede produkt oppnådd, smp. 122-124°C.

NMR-spekteret (DMS0-d6) viste absorbsjon ved 8,25-7,94 (m, 2H); 7,85 (t, J=5Hz, 1H); 4,25-4,1 (m, 2H); 3,82-3,46 (m, 2H); 3,24-2,9 (m, 2H); 2,21-2,08 (m, 6H); 2,08-1,2 (m, 14H) og 0,88 (t, J=6Hz, 3H) ppm.

Eksempel 9

N-heptanoyl-D-gamma-glutamyl-glycyl-6-aminoheksansyre

(R, = CH,(CH, K- ; R, = H; oa R? = — NH ( CH -,) gCO-?H) Fremgangsmåten i Eksempel 6 ble gjentatt ved å benytte 530 mg (4,0 mmol) 6-aminoheksansyre i stedet for 3-aminopropionsyre for å gi 52 0 mg (4 0% utbytte) av det ønskede produkt som et hvitt skum.

NMR-spekteret (DMSO-d6) viste absorbsjon ved 8,28-7,9 (m, 2H); 7,82 (bt, J=4Hz, 1H); 4,27-4,1 (m, 2H); 3,81-3,47 (m, 2H)~; 3,15-2,90 (m, 2H) ; 2,3-2,08 (m, 6H) ; 2,08-1,18 (m, 16H) , og 0,88 (t, J=6Hz, 3H) ppm.

Eksempel 10

N-isovaleryl-D-gamma-glutamyl-glycyl-D-alanin

D

( R-, = ( CH,) , CHCH,- ; R, = H: oa R, = - NHCH ( CH,) COoH)

10A. glycyl- D- alanin benzvlester- hvdroklorid

Til en kald (0°C) oppløsning av 100 ml metylenklorid inneholdende 10 g (57 mmol) N-t-butyloksykarbonylglycin, 20 g (57 mmol) D-alanin benzylester p-toluensulfonsyresalt og 5,77 g (57 mmol) trietylamin ble det tilsatt 12,3 g (60 mmol) dicykloheksylkarbodiimid og den resulterende reaksjonsblandingen fikk deretter anta romtemperatur. Etter 18 timer ble blandingen filtrert og filtratet konsentrert i vakuum. Residuet ble løst opp i 2 00 ml etylacetat og det organiske lag vasket med 2,5% saltsyre, vann, en mettet natriumbikarbonatoppløsning og en saltoppløsning. Det organiske lag ble fraskilt, tørket over magnesiumsulfat og inndampet under redusert trykk. Til den resulterende olje ble 200 ml dioksan mettet med hydrogenklorid tilsatt. Etter 3 0 minutter ble 400 ml dietyleter tilsatt og produktet ble filtrert under nitrogen, 10,9 g (70% utbytte).

10B. N-t-butoksykarbonyl-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-hydroksysuccinamidester

Til 1500 ml metylenklorid inneholdende 50 g (143 mmol) N-t-butoksykarbonyl-D-gamma-glutaminsyre alfa-benzylester og 17,3 g (150 mmol) N-hydroksysuccinamid ble det tilsatt 30,9 g (15 mmol) dicykloheksylkarbodiimid, og den resulterende reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer. Faststoffet ble frafiltrert og filtratet konsentrert i vakuum. Residuet ble utgnidd med dietyleter og faststoffet frafiltrert under nitrogen, 43,7 g (68% utbytte).

10C. D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-glycyl-D-alanin benzyl-

ester- hydroklorid

En oppløsning inneholdende 4,3 g (9,45 mmol) N-t-butoksykarbonyl-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-hydroksysuccinamidester, 2,71 g (9,92 mmol) glycyl-D-alanin benzylester-hydroklorid og 1,0 g (9,92 mmol) trietylamin i 100 ml metylenklorid ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer og ble deretter konsentrert i vakuum. Residuet ble løst opp i 200 ml etylacetat og oppløsningen vasket med 2,5% saltsyre, vann, 10% kaliumkarbonat og en saltoppløsning. Den organiske fase ble fraskilt, tørket over magnesiumsulfat og inndampet under redusert trykk. Residuet ble behandlet med 2 00 ml dioksan mettet med hydrogenklorid og ble deretter omrørt i 2 timer. Oppløsningen ble konsentrert til tørrhet i vakuum og residuet utgnidd med dietyleter. Faststoffet ble frafiltrert under nitrogen, 3,41 g (73% utbytte).

10D. N- isovaleryl- D- qamma- qlutamvl- glvcyl- D- alanin

Til en oppløsning av 1,0 g (2,03 mmol) D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-glycyl-D-alanin benzylester-hydroklorid og 616 mg (6,09 mmol) trietylamin i 50 ml metylenklorid ble det tilsatt 490 mg (4,06 mmol) isovalerylklorid og reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 80 timer. Metylenkloridet ble fordampet i vakuum og residuet oppløst i etylacetat. Den resulterende oppløsning ble vasket med 2,5% saltsyre, vann, 10% kaliumkarbonat, vann, og en saltoppløsning. Den organiske fase ble fraskilt, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert under vakuum. Residuet ble utgnidd med dietyleter, filtrert under nitrogen (910 mg) og 700 mg oppløst i 50 ml metanol. Palladiumhydroksyd 200 mg ble tilsatt til oppløsningen- og blandingen ble ristet i en hydrogenatmosfære ved 3,5 kg/cm<2> i 3 timer. Katalysatoren ble frafiltrert og oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i vann og lyofilisert for å gi 364 mg (65% utbytte) av det ønskede produkt.

NMR-spekteret (DMSO-d6) viste absorbsjon ved 8,25-8,05 (m, 3H); 4,33-4,12 (m, 2H); 3,72 (d, J=6Hz, 2H); 2,21 (t, J=8Hz, 2H); 1,88-1,68 (m, 1H); 2,08-1,9 (m, 4H); 1,28 (d, J=9Hz, 3H) og 0,9 (d, J=7Hz, 6H) ppm.

Eksempel 11

Ved å gå ut fra det passende syreklorid og D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-glycyl-D-alanin benzylester-hydroklorid og benytte fremgangsmåten i Eksempel 10D, ble følgende forbindelser fremstillet:

Eksemp el 12

N-(3-(S)-metylheptanoyl)-D-gamma-glutamyl-L-alanyl-D-alanin

D

(Ri = ( S) CH3 J.CH2 1.3 CH ( CH3 ) CH2 - ; R2 _^_ CKs ; R3 = - NHCH( CH3 ) C02 H) 12A. N- t- butoksykarbonyl- L- alanyl- D- alanin benzylester

Til en oppløsning av 23,0 g (0,121 mol) N-t-butoksykarbonyl-L-alanin, 42,6 g (0,121 mol) D-alanin benzylester p-toluensulfonsyresalt og 17 ml (0,121 mol) trietylamin i 400 ml kald (0°C) metylenklorid ble det dråpevis tilsatt 25,0 g (0,121 mol) dicykloheksylkarbodiimid i 100 ml metylenklorid. Etter omrøring natten over ved romtemperatur ble faststoffet frafiltrert og filtratet konsentrert til en olje. Residuet ble løst opp i 400 ml etylacetat som var vasket med 1% saltsyre, 10% kaliumkarbonatopp-løsning, vann og en saltoppløsning. Den organiske fase ble fraskilt, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert til en olje. Residuet ble utgnidd med dietyleter og det resulterende faststoff frafiltrert under nitrogen, 16,0 g. Ytterligere 12,7 g av det ønskede produkt krystalliserte fra filtratet.

12B. L- alanyl- D- alanin benzylester- hydroklorid

En oppslemming av 28,7 g N-t-butoksykarbonyl-L-alanyl-D-alanin benzylester i 150 ml dioksan mettet med hydrogenklorid, ble omrørt i 4 timer ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum og residuet utgnidd med. dietyleter. Det resulterende faststoff" ble frafiltrert, oppløst igjen i metylenklorid og oppløsningen konsentrert til ca. 150 ml— Eter ble tilsatt og faststoffet frafiltrert under nitrogen, 22,0 g.

12C. N-t-butoksykarbonyl-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-L- alanyl- D- alanin benzylester

Til en oppslemming av 5,0 g (9,64 mmol) N-t-butoksykarbonyl-D-gamma-glutamin alfa-benzylester-dicykloheksylamin og 2,76 g (9,64 mmol) L-alanyl-D-alanin benzylester-hydroklorid i ,100 ml metylenklorid avkjølt til 0°C, ble det tilsatt 2,0 g (9,64 mmol) dicykloheksylkarbodiimid i 20 ml av det samme oppløsningsmiddel. Etter omrøring natten over ved romtemperatur ble faststoffet frafiltrert og filtratet konsentrert i vakuum. Residuet ble behandlet med 150 ml etylacetat, faststoffet deretter frafiltrert og filtratet vasket med 1% saltsyre, 10% kaliumkarbonatopp-løsning, vann og en saltoppløsning. Den organiske fase ble tørket over natriumsulfat og konsentrert for å gi et hvitt faststoff, som etter utgnidning med eter og filtrering ga 4,1 g av det ønskede produkt.

12D. D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-L-alanyl-D-

a lanin benzylester- hydroklorid

Til en oppslemming av 4,1 g (7,21 mmol) N-t-butoksykarbonyl-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-L-alanyl-D-alanin benzylester i 50 ml dioksan ble det tilsatt 100 ml dioksan mettet med hydrogenklorid og reaksjonsblandingen ble omrørt i 3 timer ved romtemperatur. Oppløsningsmidlet ble fjernet under vakuum og residuet utgnidd med dietyleter, 3,5 g.

12E. N-(3-(S)-metylheptanoyl)-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)- L- alanyl- D- alanin benzylester

Til 1,0 g (1,98 mmol) D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-L-alanyl-D-alanin benzylester og 0,833 ml (5,93 mmol) trietylamin i 50 ml metylenklorid ble det tilsatt 390 mg (2,37 mmol) 3-(S)-metylheptanoylklorid og reaksjonsblandingen ble omrørt under nitrogen i 45 minutter. Reakjonsblandingen ble helt over i 150 ml etylacetat og den organiske fase ble vasket med 10% saltsyre, 10% kaliumkarbonatoppløsning, vann og en saltoppløsning. Den organiske fase ble tørket over natriumsulfat og konsentrert til tørrhet. Residuet ble utgnidd med eter og filtrert under nitrogen, 900 mg. 12F. N-( 3-( S)- metylheptanoyl)- D- qamma- glutamyl- L- alanyl- D- alanin

En blanding av 200 mg palladiumhydroksyd på kull og 900 mg N-(3-(S)-metylheptanoyl)-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-L-alanyl-D-alanin benzylester i 50 ml metanol ble ristet i en hydrogenatmosfære ved 3,5 kg/cm<2> i 1 time. Katalysatoren ble frafiltrert og oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Vann ble tilsatt til residuet og fjernet under redusert trykk for å gi 492 mg av produktet som et hvitt faststoff, smp. 165-168°C.

NMR-spekteret (DMSO-de) viste absorbsjon ved 8,21-7,98 (m, 3H); 4,41-4,1 (m, 3H); 2,3-2,06 (m, 4H); 2,06-1,56 (m, 6H); 1,43-1,02 (m, 11H); og 1,02-0,73 (m, 6H) ppm.

Eksempel 13

N-(3-(S,R)-etylheksanoyl)-D-gamma-glutamyi (alfa-n-butylester)-glycyl-D-aianin

D

(Ri = CH3 (CH2 ) 2 CH (C2 Hs ) CH2 - ; R2 = H ; R3 = -NHCH (CH3 ) C02 H ;

R 4 _=...n-C_-i Ho )

13A. N-t-butoksykarbonyl-D-gamma-glutamin (alla-n-butylester)-dicykloheksylaminsalt

En oppløsning av 39,5 g (0,172 mol) N-t-butoksykarbony1-D-giutaminsyre-anhydrid i 75 ml tørr tetrahydrofuran ble i løpet av 2 timer dråpevis tilsatt til en oppløsning av 47 ml (0,516 mol) og 34,3 ml (0,172 mol) dicykloheksylamin i 300 ml eter ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0° C i 3 timer og ble satt i kjøleskap over natten. Faststoffet ble frafiltrert, oppslemmet i etanol og filtrert, 43,3 g.

13B. D-gamma-glutamyl (alfa-n-butylester)-glycyl-D-alanin benzylester- hydroklorid

Produktet fra Eksempel 13A (10 g, 0,021 mol) og 6,7 g

(0,024 mol) glycyl-D-alanin benzylester-hydroklorid ble oppslemmet i 200 ml metylenklorid under nitrogen og avkjølt til 0°C. Dicykloheksylkarbodiimid (4,25 g, 0,021 mol) ble tilsatt, hvorpå blandingen fikk anta romtemperatur over natten. Urea-biproduktet ble frafiltrert og oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble behandlet med etylacetat og filtrert. Filtratet ble vasket suksessivt med vann, 2,5% saltsyre, vann, 10% kaliumkarbonat og saltoppløsning.. Den organiske fase ble tørket over magnesiumsulfat, oppløsningsmidlet fjernet i vakuum og residuet løst opp i 300 ml dioksan mettet med hydrogenklorid. Etter omrøring i 4 timer ved romtemperatur ble oppløsningsmidlet fjernet og residuet utgnidd i etylacetat-heksan (1:1) og filtrert, 7,4 g.

13C. N-(3-(S,R)-etylheksanoyl-D-glutamyl (alfa-n-butylester)-glycyl- D- alanin

Til produktet fra Eksempel 13B (1,0 g, 2,35 mmol) og 0,99 ml (7,05 mmol) trietylamin i 50 ml metylenklorid ble det tilsatt 460 mg (2,83 mmol) 3-(S,R)-etylheksanoylklorid, hvoretter reaksjonsblandingen ble omrørt over natten under nitrogen. Opp-løsningsmidlet ble fjernet i vakuum og residuet oppløst i etylacetat. Den organiske fase ble suksessivt vasket med 10% saltsyre, vann, 10% kaiiumkarbonat og saltoppløsning. Den organiske fase ble fraskilt, tørket over magnesiumsulfat og oppløsnings-midlet fjernet i vakuum. Residuet ble oppløst i 10 ml metanol og ristet med 170 mg 10% palladiumhydroksyd i en hydrogenatmosfære ved et start-trykk på 3,5 kg/cm<2> i 1,5 timer.

Den brukte katalysatoren ble frafiltrert og oppløsnings-midlet fjernet i vakuum, 100 mg.

NMR (DMSO-ds): 8,18 (d, J=6Hz, 1H); 8,10 (d, J=6Hz, 1H); 8,02 (t, J=5Hz, 1H); 4,28-4,10 (m, 2H); 4,00 (t, J=6Hz, 2H); 3,78-3,56 (m, 2H); 2,18 (t, J=6Hz, 2H); 2,02 (d, J=6Hz, 2H); 2,00-1,60 (m, 3H); 1,58-1,42 (m, 2H); 1,28-1,08 (m, 8H); 1,24 (d, J=6Hz, 3H); 0,92-0,76 (m, 9H).

Eksempel 14

Ved å benytte den generelle fremgangsmåte i Eksempel 13 og gå ut fra de nødvendige reagenser, ble følgende forbindelser fremstillet:

Eksempel 15

N-(3-(R,S)-etylheksanoyl)-D-gamma-glutamyl-glycyl-D-

alanin etylester

Ri = CH3 (CH2 )2CH(C2H5 )CH2-; R2 = H;

D

Rs = -H NCH( CH3 ) C02 C2 Ha i__Rs = H)

15A. D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-glyc/l-D-

ala nin etylester- hydroklorid

Til en oppslemming av 14,8 g (0,0285 mol) N-t-butoksykarbonyl-D-gamma-glutaminsyre alfa-benzylester-dicykloheksylamin-salt og 6 g (0,0285 mol) glycyl-D-alanin etylester-hydroklorid i 200 ml metylenklorid ble det tilsatt 5,6 g (0,0270 mol) dicykloheksylkarbodiimid og blandingen ble omrørt under nitrogenatmosfære over natten. Urea ble frafiltrert og oppløsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble behandlet med 300 ml etylacetat, filtrert og filtratet vasket suksessivt med 2,5% saltsyre, vann, 10% kaliumkarbonatoppløsning og saltoppløsning. Den organiske fase ble fraskilt, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum. Den gjenværende olje ble løst opp i 450 ml dioksan mettet med hydrogenklorid. Oppløsningen ble omrørt i 2 timer og opp-løsningsmidlet fjernet i vakuum. Residuet ble utgnidd med eter og filtrert, 11,2 g.

15B. N(3-(R,S)-etylheksanoyl)-D-gamma-glutamyl-

qlycyl- D- alanin etylester

Til produktet fra Eksempel 15A (1,0 g, 2,33 mmol) og 0,98 ml (6,98 mmol) trietylamin i 30 ml metylenklorid ble det under, nitrogenatmosfære tilsatt 378 mg (2,33 mmol) 3-(R,S)-etyl-heksanoylklorid. Etter omrøring ved romtemperatur i 1,5 timer ble blandingen helt over i 100 ml etylacetat og den organiske fase vasket suksessivt med 10% kaliumkarbonatoppløsning og salt-oppløsning. Den organiske fase ble fraskilt, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum. Det hvite faste residuum ble oppløst i 30 ml metanol og tilsatt palladiumhydroksyd i en hydrogenatmosfære ved et begynnelsestrykk på 3,5 kg/cm<2>. Etter 2 timer ble katalysatoren frafiltrert, filtratet konsentrert til tørrhet og residuet utgnidd med eter og filtrert, 275 mg.

NMR (DMSO-de): 8,26 (d, J=9Hz, 1H); 8,14-8,02 (m, 2H); 4,31-4,00 (m, 2H); 4,06 (q, J=10Hz, 2H); 3,78-3,60 (m, 2H); 2,17 (t, J=8Hz, 2H); 2,08-1,65 (m, 1H); 2,03 (d, J=8Hz, 2H); 1,82-1,53 (m, 3H); 1,40-0,96 (m, 5H); 1,23 (d, J=6Hz, 3H); 1,14 (t, J=10Hz, 3H); 0,90-0,64 (m, 6H).

E ksempel 16

Ved å gå ut fra passende reagenser og benytte fremgangsmåten i Eksempel 15A-15B, ble følgende forbindelser fremstillet:

E ksempel 17

Fremgangsmåten i Eksempel 15 ble på nytt gjentatt, ved å gå ut fra passende reagenser men utelate hydrogeneringen, hvorved følgende forbindelser bie oppnådd:

Ek sempel 18

Krystallinsk N-(3-< S)-metylheptanoyl)-D-gamma-glutamyl-giycyl- D- alanin

N-(3-(S)-metylheptanoyl)-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-glycyl-D-alanin benzylester (30,8 g) bie oppslemmet i 300 ml absolutt etanol i en 2 liter autoklav. 5% Pd/C, 1,54 g, 50% vanninnhold) ble tilsatt og blandingen hydrogenert ved 4 x atmosfæretrykk i i time, d.v.s. inntil hydrogenopptaket var fullført. Katalysatoren ble frafiltrert, først over papir og deretter på 0,45 mikron nylon milipore ved å bruke 100-150 ml etanol for overføring og vask. Kombinasjonen av filtrat og vaske-væsker bie inndampet til et fuktig, hvitt faststoff som ble oppløst i 150 ml av en varm 1:10 blanding absolutt etanol og acetonitril, klarnet ved varmfiltrering, kokt inn til 35 ml, langsomt avkjølt tii romtemperatur,.granulert og filtrert for å gi et krystallinsk, tett, ikke-elektrostatisk tittelprodukt,

20,1 g (94%) karakterisert ved dets I.R. (Nujol) som inkluderer vei oppløste, skarpe hovedtopper ved 3340, 3300, 2900, 2836, 1725, 1650, 1628, 1580, 1532, 1455, 1410, 1370, 1280, 1240, 1216 og 117 5 cm- i .

Dette krystallinske produktet (9,4 g) ble videre renset ved oppløsning i 1000 ml kokende aceton under tilbakeløpskjøling i 1 time-. Oppløsningen ble avkjølt til romtemperatur og podet med spor av de ovenfor oppnådde krystaller. Etter omrøring i 6 timer ble tittelproduktet frafiltrert, vasket med minst mulig-aceton og tørket i vakuum ved 35°C, hvorved 7,25 g med samme I.R.-karakteristika ble oppnådd.

Eksempel 19

N-(3-(R)-metyl-4-heptenoyl)-D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester) - glycyl- D- ala nin benzylester

Ved å følge fremgangsmåten i Eksempel 10D, ga 2,77 g

(5 mmol) D-gamma-glutamyl (alfa-benzylester)-glycyl-D-alanin benzylester-hydroklorid og syrekloridet fremstillet fra 747 mg (5 mmol) 3-(R)-metyl-4-heptensyre tittelforbindelsen.

Eksempel 20

N-( 3-( S)- metyl- 4- heptanoy1)- D- qamma- glutamyl- glyc yl- D- alanin

En blanding av 500 mg av produktet fra Eksempel 19 og 26 mg 5% palladium-på-kull (50% vanninnhold) i 125 ml etanol ble ristet i en hydrogenatmosfære ved et begynnelsestrykk på 4 x atmosfæretrykk i 2,5 timer. Katalysatoren ble frafiltrert og oppløsnings-midlet fjernet i vakuum. Produktet ble renset etter fremgangsmåten i Eksempel 18 og var i alle henseende identisk med produktet fra det eksemplet.

Fre mstil ling A

Cykioheksyiacetylklorid

Al. Etyl cykloheksylacetat

Til 4,9 g 60% natriumhydrid i olje ble det tilsatt nok heksan til å løse opp oljen. Til det oljefrie natriumhydrid ble det under nitrogen tilsatt 100 ml tørr tetrahydrofuran etterfulgt av en oppløsning av 22,2 ml trietylfosfonoacetat i 80 ml tørr tetrahydrofuran. Etter omrøring ved romtemperatur i 1 time ble 10,5 ml cykloheksanon tilsatt i 40 ml tetrahydrofuran og reaksjonsblandingen omrørt ved romtemperatur over natten. Reaksjonblandingen ble helt over i vann og ekstrahert med dietyleter. Den organisek fase ble vasket med IN natriumhydroksydopp-løsning, vann og saltoppløsning. Den organiske fase ble fraskilt, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert under redusert trykk.

Residuet ble løst opp i 250 ml metanol, behandlet med 1,5 g 10% palladiumhydroksyd på kull og blandingen ristet i en hydrogenatmosfære ved 3,5 kg/cm<2> i 4 timer. Katalysatoren ble frafiltrert og filtratet konsentrert i vakuum. Residuet ble destillert ved 45-50°C/0,4 torr for å gi 15,4 g (90% utbytte) av det ønskede mellomprodukt.

A2. Cykioheksyiacetylklorid

Til 100 ml metanol inneholdende 15,4 g etylcykloheksylacetat ble det tilsatt 15,2 g kaliumhydroksyd, og oppløsningen ble tilbakeløpsbehandlet i 3 timer. Metanolen ble fjernet i vakuum og residuet behandlet med vann. Oppløsningen ble ekstrahert med dietyleter og deretter surgjort med 10% saltsyre. Den sure oppløsning ble ekstrahert med ny eter og den organiske fase ble fraskilt og vasket med vann og en saltoppløsning. Fjerning av oppløsningsmidlet etter tørking ga et flytende residuum.

Residuet ble oppløst i 60 ml metylenklorid som var behandlet med 18 ml oksalylklorid. Etter omrøring ved romtemperatur i 4 timer ble reaksjonsblandingen konsentrert under vakuum og residuet destillert, 45-50°C/0,4 torr, 12,5 g (86% utbytte).

Fremstilling B

Ved å følge den generelle fremgangsmåte under Fremstilling A og gå ut fra trietylfosfonoacetal og det passende aldehyd eller keton ble følgende syreklorider fremstillet:

Fremstilling C

6- metylheptanoylklorid

Cl. 3- hydroksy- 4- metyl- l- penten

Til 90 ml 1,OM vinylmagnesiumbromid i tetrahydrofuran avkjølt til 5°C ble det dråpevis tilsatt 6,3 ml isobutyraldehyd i 30 ml tetrahydrofuran, hvorpå blandingen fikk anta romtemperatur. Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen tilsatt til en mettet ammoniumkloridoppløsning og ekstrahert med eter. Eterekstraktene ble kombinert, vasket med en mettet ammoniumkloridoppløsning, mettet natriumbikarbonatoppløsning og en saltoppløsnin<g>- og deretter tørket over magnesiumsulfat. Oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum for å gi 6,0 g av det ønskede produkt.

C2. 6- metyl- 4- heptansyre etylester

En blanding av 18,2 g 3-hydroksy-4-metyl-l-penten, 200 ml trietylortoformiat og 500 ml p-toluensulfonsyre ble behandlet med 400 ml toluen og oppvarmet under tilbakeløpskjøling over en 4A molekylsikt i 24 timer. Oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum og residuet destillert. Fraksjonen som destillerte ved 45-64°C/0,5 torr ga 7,5 g av det ønskede produkt.

C3. 6- metylhepta nsyre etylester

Tii 7,5 g 6-metyl-4-heptansyre etylester i 75 ml metanol ble det tilsatt 700 mg 10% palladiumhydroksyd på kull og blandingen ble ristet i en hydrogenatmosfære ved 3,5 kg/cm<2> i 1,5 timer. Katalysatoren ble frafiltrert og oppløsningsmidlet fjernet i vakuum for å gi 5,7 g av det ønskede produkt.

C4. 6- metylheptanoylklorid

Ved å følge fremgangsmåten i Fremstilling A2, ga 5,7 g 6-metylheptansyre etylester 2,0 g av det ønskede produkt, kp. 30-34°C/0,5 torr.

F remstilling D

2- metylheptanoylklorid

Dl. 2- metylheptansyre

Til en kald (0°C) oppløsning av 100 ml tørr tetrahydrofuran inneholdende 11,8 ml tørr diisopropylamin og 55 ml 1,6M n-butyllitium ble det tilsatt 5,4 ml n-heptansyre hvorpå blandingen ble omrørt' ved romtemperatur i 1 time. Den resulterende opp-løsning ble avkjølt til 0°C og 7,2 ml metyljodid ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur under nitrogen i 1,5 timer og ble deretter helt over i 10% saltsyre og ekstrahert med dietyleter (3 x 100 ml). Ekstraktene ble kombinert, vasket med 10% saltsyre, vann, 20% natriumbisulfitt og en saltoppløsning og tørket over magnesiumsulfat. Oppløsningsmidlet ble fjernet i vakuum og residuet, 5,61 g, oppløst i metanol inneholdende 5,1 g kaliumhydroksyd. Etter omrøring over natten ble metanolen fjernet og residuet oppløst i 150 mi vann. Det vandige lag ble vasket med eter (2 x 100 ml) og surgjort med 10% saltsyre. Produktet ble ekstrahert med eter, vasket med 20% natriumbisulfittoppløsning og saltoppløsning og tørket over magnesiumsulfat. Fjerning av eteren ga 5,0 g av produktet som en gul væske.

D2. 2- metylheptanoylkIorid

Ved å bruke 5 g 2-metylheptansyre og 7,6 ml oksalylklorid og benytte fremgangsmåten i Fremstilling A2, ble 3,3 g av det ønskede produkt oppnådd, kp. 32-34°C/0,6 torr.

Fremstilling E

3-(S)- metylheptanoylk lorid

Ei• 3-( R)- metylqlutarsyre mono- metylester

Tii en 5 liter firehalset kolbe utstyrt med en rører og pH-elektrode ble det tilsatt 2,5 liter 0,01M kaliumhydrogenfosfat-buffer pH 7,0, etterfulgt av 150 mg svinelever-esterase og 150 g dimetyl 3-metylglutarat. Blandingens pH ble holdt ved ca. 6,85 ved periodisk tilsetning av 10% kaliumkarbonatoppløsning. Etter 2,5 timer ble reaksjonsblandingen surgjort med 10% saltsyre til pH 2,0 og produktet ekstrahert med dietyleter. Ekstraktene ble kombinert, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum for å gi 114 g av det ønskede produkt, [alfa]o = -1,48 (CH3OH

C = 0,086 g/ml).

E2. Metyl 3-( R)-me tyl- 5- hydroksypentanoat

Til 114 g 3-(R)-metylglutarsyre mono-metylester i 715 ml tørr tetrahydrofuran avkjølt til 0°C, ble det langsomt tilsatt 391 ml 2M oppløsning av boran dimetylsulfid i tetrahydrofuran. Etter endt tilsetning ble reaksjonsblandingen omrørt over natten ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble avkjølt og 50 ml vann ble langsomt tilsatt. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert (3 x 100 ml) med eter og ekstraktene kombinert, vasket med vann, en mettet natriumbikarbonatoppløsning og en saltoppløsning og tørket over magnesiumsulfat. Fjerning av oppløsningsmidlet ga 37 g av det ønskede produkt.

E3. Metyl 3-( R)- metyl- 5-( t- butyldimetylsilyloksy) pentanoat

Til en oppløsning av 37 g (0,253 mol) metyl 3-(R)-metyl-5-hydroksypentanoat og 37 g (0,543 mol) imidazol i 500 ml dimetyl-formamid ble det tilsatt 37 g (0,249 mol) t-butyldimetylsilyl-klorid og reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble helt over i vann og ekstrahert (4 x 100 ml) med eter. De kombinerte ekstraktene ble vasket med 10% saltsyre, en mettet natriumbikarbonatoppløsning, vann og en saltoppløsning og tørket over magnesiumsulfat. Fjerning av oppløsningsmidlet ga 121,88 g råprodukt som etter destillasjon ga 107,12 g rent produkt, kp. 80-81°C/0,4 torr.

E4. 3-( S)- metyl- 5-( t- butyldimetyls ilyioksy)- 1- pentanol

Til 8,5 g (0,224 mol) litiumaiuminiumhydrid i 250 ml dietyleter under nitrogen.ble det tilsatt 53,5 g .(0,206 mol)

metyl 3-(R)-metyl-5-(t-butyldimetylsilyloksy)pentanoat i 125 ml eter. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time ved 0°C og ble deretter dråpevis behandlet med 8,4 g vann, 8,4 ml 15% natrium-hydroksydoppløsning og 25,2 ml vann. Faststoffene ble frafiltrert og den organiske fase fraskilt og vasket med vann, 2,5% saltsyre og en saltoppløsning. Den organiske fase ble tørket over magnesiumsulfat og konsentrert i vakuum for å gi 46 g av produktet.

E 5. 3-( R)- metyl- 5-( t- butyldimetylsilyloksy)- 1- pentanal

Til 56,3 g oksalylklorid i 300 ml tørr metylenklorid avkjølt til -60°C og under nitrogenatmosfære, ble det dråpevis tilsatt 74,81 g dimetylsulfoksyd i 100 ml tørr metylenklorid. Etter 15 minutter ble 92,0 g 3-(S)-metyl-5-(t-butyldimetylsilyloksy)-1-pentanol i 250 ml av det samme oppløsningsmiddel dråpevis tilsatt. Etter 30 minutter ble 206,1 g trietylamin tilsatt ved -60°C hvorpå kjølebadetble fjernet. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1,5 timer og ble så helt over i vann og ekstrahert med metylenklorid. Ekstraktene ble vasket med 2,5% saltsyre, en mettet natriumbikarbonatoppløsning, vann og en saltoppløsning, og deretter tørket over magnesiumsulfat. Opp-løsningsmidlet ble fjernet og residuet oppløst i eter og vasket på nytt og tørket som tidligere. Fjerning av eteren ga 90,9 g av det ønskede produkt.

E6. 5-( S)- mety1- 7-( t- butyldimetylsilyloksy)- 2- hepten

Til en oppslemming av 80 g (0,2155 mol) trifenyletyl fosfoniumbromid i 800 ml tørr tetrahydrofuran avkjølt til 0°C ble det tilsatt 165,7 ml 1,3M oppløsning av n-butyllitium (0,2155 mol) i det samme oppløsningsmiddel. Etter 2 timer ble 45 g (0,196 mol) 3-(R)-metyl-5-(t-butyldimetylsilyloksy)-1-pentanal i 200 ml tørr tetrahydrofuran dråpevis tilsatt til reaksjonsblandingen. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer og ble deretter helt over i vann og ekstrahert med eter. De kombinerte ekstraktene ble vasket med vann og en saltoppløsning og tørket over magnesiumsulfat. Fjerning av oppløsningsmidlet i vakuum ga en gul olje som etter destillasjon ga 37,4 g produkt, kp. 74-79°C/0,2-0,1 torr.

E7. 3-( S)- metyl- l- heptanol

Til en oppløsning av 74,8 g 5-(S)-metyI-7-(t-butyldimetyl-siiyioksy)-2-hepten i 500 mi metanol ble det tilsatt 7,5 g 10% palladiumhydroksyd på kull og blandingen ble ristet i en hydrogenatmosfære i 1,5 timer ved 3,5 kg/cm<2>. Katalysatoren ble frafiltert og oppløsningsmidlet fjernet i vakuum, 30 g.

E8. 3-( S)- metylheptansyre

Til 10,0 g 3-(S)-metyl-l-heptanol i 175 mi aceton ble det i løpet av 45 minutter dråpevis tilsatt 90 ml Jones reagens ved 15-20°C. Etter 15 minutter ble 15 ml isopropanol tilsatt og omrøring fortsatt i 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble helt over i vann og produktet ekstrahert med eter. Ekstraktene ble kombinert, vasket med vann, en natriumbisulfittoppløsning og en saltopp-løsning, og tørket over magnesiumsulfat. Fjerning av oppløsnings-midlet ga 10 g av produktet som en væske, kp. 84-88°C/0,4 torr, [alfajo = -4,46 (CH3OH C = 0,105 g/ml).

E9. 3-(S)- metylheptanoylklorid

Ved å folge fremgangsmåten i Fremstilling A2, ga 5,0 g 3-(S)-metylheptansyre og 7,5 ml oksalylklorid 2,9 g av det ønskede syreklorid, kp. 29-32°C/0,25 torr.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv forbindelse med formelen hvor Ri er alkyl med 2-10 karbonatomer, cykloalkyl med 4-7 karbonatomer eller cykloalkylmetyl med 6-8 karbonatomer; R2 er hydrogen eller alkyl med 1-3 karbonatomer; R3 er hydroksy eller en aminosyre-rest med formelen: hvor X er hydrogen, alkyl med 1-2 karbonatomer eller hydroksymetyl og n er et heltall fra 0 til 4; R4 er hydrogen, alkyl med 1-6 karbonatomer eller benzyl, og R5 er hydrogen, alkyl med 1-6 karbonatomer, benzyl eller cykloheksylmetyl, og farmasøytisk akseptable basiske salter derav, karakterisert veda) dehydrerende kobling av en forbindelse med formelen: hvor Rx og R2 er som angitt ovenfor, med en forbindelse med formelen: hvor de funksjonelle grupper som ikke inngår i reaksjonen kan være blokkert og hvor X, n og R5 er som ovenfor angitt, eller b) acylering av en forbindelse med formelen: hvor R2/ R3 og R4 er som angitt ovenfor, med en forbindelse hvor de funksjonelle gruppene som ikke inngår i reaksjonen kan være blokkert og hvor Rx er som ovenfor angitt og Hal står for halogen, etterfulgt av følgende eventuelle trinn 1) selektiv fjerning av de blokkerende gruppene og, 2) om ønsket, fremstilling av et farmasøytisk akseptabelt basisk salt av produktet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for fremstilling av en forbindelse hvor Rx er (S) 2-etyl-l-heksyl, R2 og R^. er hver hydrogen og R3 er karakterisert ved at man anvender tilsvarende utgangsmaterialer.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, for fremstilling av en forbindelse hvor RI er (S) 2-metyl-l-heksyl, R2 og R4 er hver hydrogen og R3 er karakterisert ved at man anvender tilsvarende utgangsmaterialer.