DK166118B - Soedemiddel med et indhold af mindst 50 vaegt% leucrose samt en fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents

Description

i

DK 166118B

Den foreliggende opfindelse angår et sødemiddel i fast eller flydende form. Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til fremstilling af dette sødemiddel.

5 Leucrose, (5-0-alpha-D-glucopyranosyl-D-fructose) har hidtil kun optrådt som et uønsket biprodukt ved syntesen af dextraner ved indvirkning af Leuconostoc mesenteroides på saccharoseop-løsninger; jvf. U. Behrens, M. Ringpfeil, Mikrobielle Polysaccharide, Akademie-Verlag Berlin, 1964, side 37-39. Ud fra 10 undersøgelser foretaget af Robyt og Eklund, Carbohydrate Research 121 (1983) , side 279-286, fremgår det, at fructose ved et molforhold mellem fructose og saccharose på 1:1 giver ca.

85% dextran og 2,2% af en blanding af leucrose og isomaltulose.

15 En isolering og rensning af leucrose fra disse blandinger er overordentlig vanskelig, således at denne forbindelses egenskaber praktisk talt endnu ikke er undersøgt og publiceret. Adskillelsen og oprensningen er især vanskelig, idet leucrose på de i teknisk målestok anvendelige polystyrensulfonatkation-20 byttere i calciumformen kromatografisk forholder sig ligesom glucose og saccharose og derfor ikke i praksis kan adskilles fra disse to komponenter.

JACS 78, side 2514 til 2518 (1956) beskriver isolering af 25 leucrose som biprodukt ved dextranfremstilling i et udbytte på 7,9% regnet på den anvendte saccharose; jvf. side 2516, spalte 2, fjerde hele afsnit. To afsnit længere nede findes i afsnittet "Properties of Leucrose" den oplysning, at leucrose ikke skulle være særligt sød. Denne oplysning er meget vag, da 30 den ikke indeholder nogen relativ sødekraft i sammenligning med f .eks. saccharose. Blandt ikke særligt søde stoffer forstår man f .eks. lactose, der har ca. 30% af saccharoses sødekraft. Allerede glucose med en sødekraft på ca. 50% af saccharose fornemmes helt igennem stadig som sød. På grund af lactoses lave 35 sødekraft anvendes dette i almindelighed ikke som sødemiddel, men derimod overvejende som fyldstof, aromaforstærker og tabletfyIdemiddel.

DK 166118 B

2 Først nyere, af ansøgeren foranledigede målinger af den relative sødekraft har vist, at leucroses sødekraft faktisk ligger ved ca. 50-60% af saccharoses og derved således endog ligger over glucoses sødekraft. Det i litteraturen forekommende udsagn 5 "ikke særligt sød" har sikkert ikke bevæget nogen inden for sødemiddelindustrien til at udvikle en fremgangsmåde til fremstilling af leucrose.

Biochem. J. 79, side 549 til 553 (1961) beskriver biprodukter 10 ved dannelse af dextran ved hjælp af Streptococcus bovis. Der blev opnået leucrose i et udbytte på 1,5% regnet i forhold til saccharose, jvf. tabel 1. Dette litteratursted giver ingen udsagn vedrørende leucroses egenskaber og mulige anvendelser.

15 I Carbohydrate Research, 62 (1978) 281-287 beskrives en kemisk totalsyntese af leucrose gående ud fra glucose. Udbyttet ved denne syntese udgør over alle trinnene ca. 3%. Udbyttet på 53% angår kun udbyttet ved det sidste trin af ialt 13 trin. Denne totalsyntese kan kun være af videnskabelig interesse og kommer 20 aldrig på tale vedrørende en kommerciel syntese af leucrose.

Die Nahrung, bind 8, side 523-531 (1964) omtaler saccharider fra dextranfremstillingsrester og deres omsætning i den dyriske tarmkanal, idet der især tages hensyn til leucrose. Disse dex-25 tranfremstillingsrester svarer nogenlunde til dem, der er beskrevet i JACS 78, side 2514 til 2518 (1956) således, at der ligeledes regnet på saccharose kan antages et udbytte på ca.

8%. I dette skrifts indledning findes ganske vist en henvisning til, at den ved dextranfremstilling fremkomne moderlud kan an-30 vendes til diætisk formål. Der tænkes dog her uden tvivl på hovedbestanddelen fructose, der skal gøres nyttig til den menneskelige ernæring. Det var formålet med denne undersøgelse at fastslå, om de yderligere bestanddele i disse dextranfremstillingsrester var fysiologisk acceptable således, at også disse 35 kunne udnyttes til den menneskelige ernæring uden forudgående fraskillelse.

DK 166118B

3

Det er først nu lykkedes at udvikle en teknisk anvendelig fremgangsmåde til fremstilling af større mængder ren leucrose. Endvidere har det ved undersøgelse af leucroses egenskaber vist sig, at den kan anvendes som et ikke-kariogent, for diabetikere 5 velegnet og udmærket acceptabelt sødemiddel.

Det har nemlig vist sig, at der ved standardprøven for karies med Streptococcus mutants ikke iagttages nogen syredannelse. Desuden er leucrose ikke acceptor for glucose, således at der 10 ikke opstår nogen af de dextraner, der fører til den frygtede plakdannelse. Forsøg med tarmbakterier har vist, at leucrose spaltes med en hastighed, der svarer til 1/5 til 1/3 af hastigheden for spaltning af maltose. Dette er således en lavere spaltningshastighed i sammenligning med maltose og saccharose, 15 og det fører således ikke til den typiske bratte forøgelse af blodglucosen, som ses med saccharose eller maltose. Det må derfor forventes, at leucrose i modsætning til saccharose og maltose slet ikke eller kun i væsentligt ringere omfang stimulerer insulinsekretion. Leucrosen ses således at være særligt egnet 20 for diabetikere. Det er først med de nu foreliggende nøjagtigere måleresultater blevet fastslået, at leucrose kun spaltes med ca. 38% af hastigheden for saccharose og derfor er velegnet som et sukkererstatningsstof for diabetikere.

25 Efter at det nu er lykkedes at fremstille og rense leucose i store mængder på kommerciel måde, er der først nu mulighed for at anvende denne forbindelse som sødemiddel i fast eller flydende form. Sødemidlets indhold af leucrose skal i så fald udgøre mindst 50 vægt%. Ifølge opfindelsen er det imidlertid uden 30 videre muligt at fremstille leucrose med en renhed på mindst 98%. Ved anvendelsen af leucrose som et ikke-kariogent, for diabetikere velegnet og udmærket acceptabelt sødemiddel, er det i-midlertid tilstrækkeligt at anvende en renhedsgrad på mindst 95 vægt%.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af leucrose fremkommer den i en blanding med dextraner og isomalto- 35

DK 166118 B

4 oligosaccharider samt en smule fructose. Dextranerne og iso-maltooligosacchariderne er i det mindste delvis let at skille fra, således at der fremkommer leucrose med et indhold på mindst 50 vægt%. Da såvel fructose som lavere isomaltooligo-5 saccharider kan accepteres som sødemiddel, kan man til en række anvendelsesformål direkte anvende den umiddelbart opståede blanding af leucrose, fructose og lavere isomaltooligosaccha-rider. Det er imidlertid muligt at fraskille både fructosen og dextranerne og isomaltooligosacchariderne kromatografisk i så 10 vidt omfang, at der fremkommer leucrose med renhedsgrader på mindst 95 vægt%, fortrinsvis 98 vægt%.

Om ønsket kan man imidlertid også blande leucrose med andre kendte sødemidler, idet der her navnlig tænkes på sådanne søde-15 stoffer som saccharin, cyclamat, acesulfam K, aspartam og ta-lin. Til visse andre anvendelsesformål kan der også komme blandinger med sukkererstatningsstoffer på tale, såsom sorbitol, mannitol, maltitol, xylitol, "Palatinit"® og "Lycasin"®.

20 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af leucrose med en renhedsgrad på mindst 50 vægt% er ejendommelig ved, at saccharose omsættes med alpha-(1-6)-glucosyltransferase i nærværelse af mindst 100 mmol fructose per 1000 IU enzym, og dextranerne og isomaltooligosacchariderne i det mindste delvis 25 fraskilles. Fortrinsvis anvendes der mere end 300 mmol fructose per 1000 IU enzym. Reaktionen gennemføres fortrinsvis i et temperaturområde fra 265 til 310°K og ved en pH-værdi på 4,5 til 8,0. Koncentrationen af saccharose vælges af økonomiske grunde så høj som muligt. Principielt er endog koncentrationer på 70% 30 saccharose mulig, men ved så høje saccharosekoncentrationer synker omsætningshastigheden. Koncentrationer under 20% fører til lavere udbytter og kræver ved den senere oparbejdning unødigt forbrug af energi. Fortrinsvis arbejdes der derfor med koncentrationer fra 35 til 50% saccharose.

Den som acceptor anvendte fructose gendannes i løbet af fremgangsmåden ud fra saccharosen, således at fructosekoncentra- 35

DK 166118 B

5 tionen i løbet af fremstillingsprocessen praktisk taget forbliver konstant. Glucose er en væsentligt bedre acceptor, og derfor reagerer den fremkomne glucose meget hurtigt videre til isomal-tooligosaccharider og dextraner. Efter reaktionens 5 afslutning foreligger der således praktisk talt ikke mere saccharose og glucose, således at disse ikke skal skilles fra. Dextraner og isomaltooligosaccharider kan i det mindste delvis på i og for sig kendt måde, f.eks. ved kromatografi, adskilles fra blan-dingen. Ved hjælp af polystyrensulfonatkationbyttere 10 i calciumformen er det endog muligt at fraskille disse biprodukter og fructosen praktisk talt fuldstændigt.

Fremgangsmåden gennemføres fortrinsvis på den måde, at tilsætningen af den vandige saccharoseopløsning til blandingen af 15 fructose og enzym sker således, at den tilsatte saccharose omsættes så hurtigt som muligt, således at der hele tiden kun foreligger en lav koncentration i reaktionsblandingen.

En yderligere foretrukket udførelsesform består i at fiksere 20 glucosyltransferase på en bærer eller indeslutte glucosyltrans-ferase i en porøs bærer. Enzymets binding på en bærer kan principielt ske ved hjælp af alle konventionelle fremgangsmåder til binding af enzymer på en bærer, under den forudsætning, at enzymets aktivitet ikke formindskes for kraftigt ved bindingen.

25 Enzymet kan også indesluttes i en porøs bærer. F.eks. kan det indføres perleformet i alginat og i denne form omsættes med fructose og saccharose. Også her må der drages omsorg for, at der foreligger mindst 100, fortrinsvis 300 mmol fructose per 1000 IU enzym. Udbytterne af leucrose regnet i forhold til sac-30 charose ligger ifølge opfindelsen ved 40% og derover. De som biprodukter fremkomne dextraner og isomaltooligosaccharider kan anvendes på konventionel måde og forøger derved fremgangsmådens økonomi.

35 Som separationsmetoder kommer navnlig kromatografi med "Size Exclusion Geler" eller polystyrensulfonatkationbytterharpikser i calciumformen på tale. Navnlig dextranerne og højere molkylæ-

DK 166118B

6 re isomaltooligosaccharider kan med fordel fraskilles allerede før kromatografering, f.eks. ved membranadskillelsesmetoder, såsom ultrafiltrering. Navnlig kromatografi på polystyrenkat-ionbytterharpikser i calciumformen gør det også muligt at fra-5 skille fructosen. Fructosen kan om ønsket genindføres i fremgangsmåden, idet den hele tiden gendannes i samme mængde og dermed tydeligvis overtager en katalysatorfunktion.

I de efterfølgende eksempler belyses nærmere fremgangsmåden 10 ifølge opfindelsen til fremstilling og rensning af leucrose såvel som anvendelsen deraf.

EKSEMPEL 1 15 I 6 1 af en vandig opløsning af enzymet a-(l-6)-glucosyltrans-ferase (dextransucrase), der havde en aktivitet på 7500 IU/1, opløstes 4000 g krystallinsk fructose ved 298°K. Opløsningens pH-værdi udgjorde 5,4. Til denne opløsning sattes 30 1 af en 40%'s saccharoseopløsning med en pH-værdi på 5,4. Efter 48 ti-20 mer udgjorde indholdet af saccharose mindre en 1% i tørstoffet, og indholdet af leucrose var 30,1%, hvilket svarer til et udbytte på 40,1% regnet ud fra den tilsatte saccharose.

EKSEMPEL 2 25 I en 4% natriumalginatopløsning indrørtes 40 ml dextransucrase-opløsning, som havde en aktivitet på 320 IU. Enzym/alginat-opløsningen dryppedes fra en pipette ind i en 1% calciumchlo-ridopløsning, hvorefter der under gelering af alginatet dan-30 nedes perleformede partikler. Disse udvaskedes med destilleret vand. De dextransucraseholdige alginatperler fyldtes på en kolonne og gav et gelleje på 196 ml. Enzymaktiviteten udgjorde 1,3 IU/ml alginatgel.

35 Gennem dette gelleje pumpedes 8 ml/time af en vandig saccharose/fructose-opløsning, der indeholdt 10 g fructose og 45 g saccharose per 100 g opløsning. I den ud fra gellejet udløbende

DK 166118B

7 opløsning var der et indhold på 32,8% leucrose, hvilket svarer til et udbytte på 40,0% regnet ud fra saccharose.

EKSEMPEL 3 5 18 kg af en vandig opløsning med et tørstofindhold på 35% af den ifølge eksempel 1 fremstillede leucrose påførtes en 6 m høj skillekolonne, der indeholdt 190 1 polystyrensulfonatkationbyt-ter, ladet med calciumioner. Ved tilføring af 35 1/time destil-10 leret vand blev i skillekolonnen værende saccharider elueret. Efter et forløb på 51 1 elueredes inden for de næste 38 1 noget dextran og isomaltooligosaccharider.

Den efterfølgende fraktion på 3 1 indeholdt 112 g leucrose ved 15 siden af 39 g andre saccharider, den efterfølgende fraktion på 12 1 indeholdt 1041 g leucrose med en renhed på 96,1%. Inden for de næste 3 1 elueredes yderligere 158 g leucrose ved siden af 50 g fructose og 2 g glucose. 1

De således vundne leucroseopløsninger kunne om ønsket anvendes direkte som sødemiddel. De kunne imidlertid også inddampes videre til en sirup. Fast leucrose vindes f.eks. ved frysetørring af opløsningerne.

25 EKSEMPEL 4

Den ifølge eksempel 3 vundne leucrosefraktion, som efter et andet kromatografisk rengøringstrin var bragt til en renhed på 98,1%, afprøvededes under anvendelse af Streptococcus mutants 30 NCTC 10449 for syredannelse. Her bestemtes protonproduktionen både ved registrering af pH-faldet ved syringsforsøg og ved ludforbruget (pH konstant) ved hjælp af automatisk tilbagetitrering. Det viste sig, at leucrose ikke danner nogen syrer. Da leucrose er et dårligt substrat for glucose, danner der sig 35 heller ingen dextraner. Undersøgelser med tarmbakterier har vist, at spaltninghastigheden for leucrose i sammenligning med spaltningen af maltose udgør 1/5 til 1/3. Leucrose har således

Claims (6)

1. Sødemiddel i fast eller flydende form, kendetegnet ved et indhold af mindst 50 vægt% leucrose samt et eller flere andre sødemidler fra gruppen af sødestoffer og sukkererstatningsstoffer . 30

2. Sødemiddel ifølge krav l, kendetegnet ved et indhold af leucrose på mindst 95 vægt%.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af leucrose med et renheds-35 indhold på mindst 50 vægt%, kendetegnet ved, at man omsætter saccharose med alpha- (1-6) -glucosyltransferase i nærværelse af mindst 100 mmol fructose per 1000 IU enzym og i det DK 166118B mindste delvis fraskiller de dannede dextraner og isomaltooli-gosaccharider.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, 5 at man til forøgelse af leucrosens renhedsgrad til mindst 95 vægt% fraskiller fructosen og isomaltooligosacchariderne kromatografisk.

5. Anvendelse af leucrose med en renhedsgrad på mindst 50 10 vægt% i fast eller flydende form som sødemiddel i blanding med et eller flere sødemidler fra gruppen af sødestoffer og sukkererstatningsstoffer .

6. Anvendelse ifølge krav 5, kendetegnet ved, at 15 leucrosen har en renhedsgrad på mindst 95 vægt%.