FI86363C - Soetningsmedel, dess framstaellning och anvaendning. - Google Patents

Description

Makeutusaine, sen valmistus ja käyttö 1 86363

Keksinnön kohteena on makeutusaine kiinteänä tai nestemäisenä ravinto-, nautintoaineita ja rehuja varten.

5 Lisäksi keksintö koskee näiden makeutusaineiden valmistusta ja käyttöä, erityisesti puhdistetussa muodossa, joka ei aiheuta hammasmätää, sopii sokeritautisille, on energeet-tisesti arvokasta ja hyvin siedetty makeutusaine.

Leukroosi(5-0-alfa-D-glukopyranosyyli-D-fruktoosi) 10 on tähän asti ollut vain ei-toivottu sivutuote dekstraa-nin synteesissä bakteerin Leuconostoc Mesenteroides vaikuttaessa sakkaroosiliuoksiin, vrt. U. Behrens, M. Ring-pfeil, Mikrobielle Polysaccharide, Akademie-Verlag Berlin, 1964, sivut 37-39. Robytin ja Enklundin tutkimuksista, 15 Carbohydrate Research 121 (1983), sivut 279-286, ilmenee, että fruktoosi tuottaa moolisuhteessa fruktoosi/sakkaroosi 1:1 noin 85 % dekstraania ja 2,2 % leukroosin ja isomal-toosin seosta.

Leukroosin eristäminen ja puhdistaminen tällaisesta 20 seoksesta on erittäin vaikeaa, joten tämän disakkaridin ominaisuuksia ei ole käytännössä tutkittu eikä julkaistu. Eristäminen ja puhdistaminen ovat erityisen vaikeita siksi, että leukroosi käyttäytyy teollisessa mittakaavassa kokeilluissa polystyroolisulfonikationivaihtimissa, jotka 25 ovat kalsiummuodossa, kuten glukoosi ja sakkaroosi, joten ‘ sitä ei voida erottaa näistä kahdesta komponentista.

JACS 78, sivut 2514-2518 (1956) esittää leukroosin /*· eristämisen dekstraanin valmistuksen sivutuotteena saan nolla 7,9 % käytetystä sakkaroosista, vrt. s. 2516, palsta ; 30 2, neljäs täydellinen kappale. Kaksi kappaletta myöhemmin esitetään kappaleessa "Leukroosin ominaisuudet", ettei leukroosi olisi kovin makea. Tämä maininta on hyvin epä-määräinen, koska siinä makeutta ei ole verrattu esim. sak-·“*; karoosiin makeutusvaikutukseen. Ei kovin makeilla soke- 2 86363 reillä ymmärretään esimerkiksi laktoosia, jolla on noin 30 % sakkaroosin makeudesta. Jo glukoosia, jonka makeus on noin 50 % sakkaroosin makeudesta, pidetään vielä täysin makeana. Laktoosin matalan makeuden takia ei sitä käytetä 5 makeutusaineena vaan yleensä täyteaineena, aromin lisääjänä ja tablettien täyteaineena.

Vasta uudemmat hakijan suorittamat suhteellisen makeuden mittaukset ovat osoittaneet, että leukroosin makeus on tosiasiassa noin 50-60 % sakkaroosin makeudesta 10 ja on siten jonkin verran suurempi kuin glukoosilla. Kirjallisuudessa oleva tieto "ei kovin makea” ei varmaankaan ole innostanut ketään ruoka-aineteollisuudessa kehittämään valmistusmenetelmää leukroosille.

Biochem. J. 79, sivut 549-553 (1961) esittää deks-15 traanin muodostumisen sivutuotteita Streptococcus Bivis'n kautta. Leukroosia saatiin saannolla 1,5 % sakkaroosin perusteella laskettuna; vrt. taulukko 1. Tämä kirjallisuus ei anna mitään tietoja leukroosin ominaisuuksista ja mahdollisista käytöistä.

20 Carbohydrate Research, 62 (1978) 281-187 esittää leukroosin kokonaissynteesin lähtien glukoosista. Tämän synteesin saanto on kaiken kaikkiaan noin 3 %. Saanto 53 % on vain viimeisen vaiheen saanto kaikkiaan 13 vaiheesta. Kokonaissynteesillä voi olla vain tieteellistä 25 mielenkiintoa ja se ei tule milloinkaan kysymykseen leukroosin taloudellisena synteesinä.

Die Nahrung, Band 8, s. 523-531 (1964) esittää sak-karidia dekstraanivalmistuksessa ja sen reaktiota eläimen suolialueella erityisesti huomioon ottaen leukroosi. Nämä 30 dekstraanin valmistukset vastaavat niitä, jotka on esitetty JACS 78, sivuilla 2514-2518 (1956), siten että samalla tavalla voidaan saada saanto noin 8 % verrattuna sakkaroosiin. Tämän viittauksen johdannossa on kuitenkin vain yksi viittaus siihen, että dekstraanin valmistuksessa saatavia 35 emäliuoksia voitaisiin käyttää ravinnollisiin tarkoituk- 3 86363 siin. Tällöin on epäilemättä ajateltu pääainesta fruktoosia, joka oli tarkoitus tehdä ihmisen ravinnoksi sopivaksi. Tutkimuksen päämääränä oli todeta, olivatko tämän dekstraanilähtöaineen muut aineosat fysiologisesti siedet-5 tyjä ja olisivat siten ilman edeltävää erotusta tehtävissä ihmisravinnoksi käyttökelpoiseksi.

Nyt on onnistuttu ensimmäisen kerran kehittämään teknisesti käyttökelpoinen menetelmä suurten puhtaiden leukroosimäärien valmistamista varten. Lisäksi tutkimuk-10 sissa saatiin leukroosin ominaisuuksina selville, ettei se aiheuta hammasmätää, se sopii sokeritautisille, on energeettisesti arvokasta ja sitä voidaan käyttää hyvin siedettynä makeutusaineena.

On nimittäin osoittautunut, että hammasmädän stan-15 dardikokeessa Streptococcus mutans'n kanssa ei havaita haponmuodostusta. Lisäksi leukroosi ei ole glukoosin ak-septori, joten ei synny dekstraania, joka johtaa pelättyyn plakin muodostumiseen. Suolibakteerikokeet ovat osoittaneet, että leukroosi hajoaa nopeudella, joka vastaa 1/5-20 1/3 maltoosin nopeudesta. Leukroosi on siten täysin ener gisesti arvokas hiilihydraatti, jolla on kuitenkin hitaampi hajoamisnopeus kuin sakkaroosilla ja maltoosilla. Se ei siten johda veren glukoosin nopeaan nousuun kuten on tyypillistä sakkaroosille ja maltoosille. Siten on odotet-25 tavissa, ettei leukroosi toisin kuin sakkaroosi ja maltoosi, johda ollenkaan tai johtaa vain vähäisessä määrin in-suliinierityksen lisääntymiseen. Leukroosi vaikuttaa siten myös sokeritautisille erityisen sopivalta. Suolibakteerien vaikutuksesta syntyy hajoamisessa yleensä vain 50 % veren 30 glukoositasoon suoraan vaikuttavaa glukoosia ja 50 % fruktoosia. Fruktoosi ei tunnetusti ainakaan tietyissä rajoissa kuormita veren glukoositasoa. Fruktoosi osallistuu suu-' ressa määrin maksan aineenvaihduntaan, ja osallistuu glu koosin rakentumiseen.

35 Leukroosin hajoaminen suolibakteerien vaikutuksesta 4 86363 tapahtuu kuitenkin niin nopeasti, että suuria määriä ei pääse ohutsuoleen ja ei hyvin myöhäisen aineenvaihdunnan kautta mene läpi. Tällä on erityistä merkitystä lapsille mutta myös sokeritautisille. Vasta nyt saatavissa olevat 5 tarkat mittaustulokset ovat osoittaneet, että leukroosi hajoaa nopeudella, joka on vain noin 38 % sakkaroosin nopeudesta ja leukoosi on siten sokeritautisille erinomainen sokerinvaihtoehto.

Koska vasta nyt on onnistunut valmistaa ja puhdis-10 taa leukroosia suurina määrinä ja taloudellisesti, on ensimmäisen kerran mahdollista käyttää tätä disakkaridia makeuttimena ravintoaineissa, nautintoaineissa ja rehuissa kiinteinä tai nestemäisinä. Tällöin tulisi leukroosin määrä makeutusaineessa olla vähintään 50 p-%. Keksinnön mu-15 kaisesti on kuitenkin tietenkin mahdollista valmistaa leukroosia vähintään 98 % puhtaana. Käytettäessä leukroosia hammasmätää aiheuttamattomana, sokeritautisille sopivana, energeettisesti täysiarvoisena, hyvin siedettynä makeutusaineena, riittää kuitenkin jo vähintään 95 p-%:nen 20 puhtaus.

Keksinnön mukaisessa leukroosin valmistusmenetelmässä syntyy leukroosi seoksessa, jossa on dekstraaneja ja isomalto-oligosakkarideja kuten myös fruktoosia. Dekstraa-ni ja isomalto-oligosakkaridi ovat ainakin osittain hel- 25 posti erotettavissa, siten että leukroosia syntyy vähin tään pitoisuutena 50 p-%. Koska sekä fruktoosi että myös alemmat isomalto-oligosakkaridit ovat käyttökelpoisia ma-keutusaineina, voidaan joukossa käyttökohteita käyttää suoraan välittömästi syntyvää seosta, jossa on leukroosia, 30 fruktoosia ja alempia isomalto-oligosakkarideja. On kui tenkin mahdollista erottaa fruktoosi kuten myös dekst-raani ja isomalto-oligosakkaridit kromatografisesti niin pitkälti, että syntyy leukroosia puhtausasteella vähintään 95, edullisesti 98 p-%.

35 Haluttaessa voidaan leukroosi kuitenkin myös se- 5 86363 koittaa muihin makeutusaineisiin, erityisesti tähän sopivat makeutusaineet kuten sakkariini, syklamaatti, Acesul-fam K, Aspartam ja Talin. Tiettyjä muita käyttökohteita varten tulevat kysymykseen myös muut seokset sokerivaih-5 toehtojen kanssa kuten sorbitolin, mannitolin, maltitolin, ksylitolin, Palatiniitin(R) ja Lycasin(R) kanssa.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle, jolla valmistetaan leukroosia, jonka puhtausaste on vähintään 50 p-%, on tunnusomaista, että sakkaroosin annetaan reagoida 10 alfa(l-6) glykosyylitransferaasin kanssa siten, että läsnä on vähintään 100 mmol fruktoosia 1000 IU entsyymiä kohti ja että dekstraani ja isomalto-oligosakkaridit erotetaan ainakin osittain. Edullisesti käytetään enemmän kuin 300 mmol fruktoosia 1000 IU entsyymiä kohti. Reaktio suorite-15 taan edullisesti lämpötila-alueella 265-310K ja pH-arvossa 4,5-8,0. Tämä sakkaroosin konsentraatio valitaan taloudellisista syistä mahdollisimman korkeaksi. Periaatteessa ovat myös 70 %:n sakkaroosikonsentraatiot mahdollisia, kuitenkin laskee reaktionopeus näin suurilla sakkaroosi-20 konsentraatioilla. Konsentraatiot, jotka ovat alle 20 %, johtavat liian alhaisiin saantoihin ja vaativat seuraavis-sa vaiheissa tarpeetonta energian käyttöä. Edullisesti työskennellään siten sakkaroosin konsentraatioalueella 35-50 %.

. 25 Akseptoriksi pantu fruktoosi muodostuu menetelmän aikana sakkaroosista, siten että fruktoosikonsentraatio pysyy menetelmän aikana vakiona. Glukoosi on oleellisesti parempi akseptori siten, että syntyvä glukoosi reagoi erittäin nopeasti edelleen isomalto-oligosakkarideiksi ja • 30 dekstraaniksi. Reaktion lopettamisen jälkeen ei käytännöl lisesti katsoen ole jäljellä yhtään sakkaroosia eikä glukoosia, siten niitä ei tarvitse myöskään erottaa. Dekstraani ja isomalto-oligosakkaridi voidaan ainakin osittain erottaa tunnetulla tavalla seoksesta kuten esimerkiksi ‘ · 35 kromatografiällä. Kalsiummuodossa olevan polystyrolisul- 6 86363 fonikationinvaihtajan avulla on myös mahdollista erottaa nämä sivutuotteet ja fruktoosi käytännöllisesti katsoen kokonaan.

Menetelmä suoritetaan edullisesti siten, että 5 sakkaroosivesiliuoksen lisääminen fruktoosin ja entsyymin seokseen tapahtuu siten, että lisätty sakkaroosi reagoi mahdollisimman nopeasti ja että sitä siten on reaktioseok-sessa vain pieninä konsentraatioina.

Toinen edullinen suoritusmuoto muodostuu siitä, 10 että glukosyylitransferääsi kiinnitetään kantajaan kuten huokoiseen kantaja-aineeseen. Entsyymin sitoutuminen kantajan pintaan voi tapahtua kaikilla tavallisilla menetelmillä, joissa sitoutuu entsyymiä kantajan pinnalle, sillä edellytyksellä, että sitoutuminen ei pienennä entsyymin 15 aktiviteettia liian paljon. Entsyymi voidaan myös sulkea huokoiseen kantajaan. Se voi olla esimerkiksi helmenmuo-toisena alginaatissa ja voi tässä muodossa reagoida fruktoosin ja sakkaroosin kanssa. Myös tällöin on huolehdittava siitä, että vähintään 100, edullisesti 300 mmol fruk-20 toosia on 1000 IU entsyymiä kohti. Leukroosin saannot sakkaroosiin perustuen ovat keksinnön mukaisesti 40 % tai suurempia. Sivutuotteina saatavat dekstraani ja isomalto-oligosakkaridi voidaan käyttää tavalliseen tapaan ja ne lisäävät menetelmän taloudellisuutta.

25 Erotusmenetelminä tulevat kysymykseen erityisesti ..... kromatografia "Size Exclusion Gelen" tai polystyrolisul- fonaattikationinvaihtohartsit kalsiummuodossa. Erityisesti dekstraani ja suurimolekylaariset isomalto-oligosakkaridit voidaan erottaa edullisesti jo ennen kromatografiaa esi-30 merkiksi membraanierotusmenetelmillä kuten ultrasuodatuk-sella. Erityisesti kromatografia polystyrolisulfonaatti-kationinvaihtohartseilla, jotka ovat kalsiummuodossa, saa aikaiseksi myös fruktoosin erottamisen. Fruktoosi voidaan haluttaessa tuoda jälleen takaisin menetelmään, koska sitä 35 muodostuu aina samassa määrin ja siten se ilmeisesti toimii katalyyttitehtävässä.

7 86363

Seuraavissa esimerkeissä valaistaan tarkemmin keksinnön mukaista menetelmää leukroosin valmistamiseksi ja puhdistamiseksi kuten myös sen käyttöä.

Esimerkki 1 5 6 litraan alfa-(1-6)glukosyylitransferaasi (deks- traanisukraasi) entsyymin vesiliuosta, jonka aktiivisuus oli 7500 IU/1, liuotettiin 4000 g kiteistä fruktoosia 298K:ssa. Liuoksen pH oli 5,4. Tähän liuokseen lisättiin 30 1 40 %:sta sakkaroosiliuosta, jonka pH oli 5,4. 48 tun-10 nin kuluttua oli sakkaroosipitoisuus kuiva-aineesta vähemmän kuin 1 % ja leukroosipitoisuus 30,1 %, joka vastaa saantoa 40,1 % sakkaroosin perusteella laskettuna.

Esimerkki 2 4 %:seen natriumalginaattiliuokseen lisättiin 40 ml 15 dekstraanisukraasiliuosta, jonka aktiivisuus oli 320 IU. Entsyymi/alginaattiliuos tiputettiin pipetistä 1 %:een kalsiumkloridiliuokseen, jonka pinnalle muodostui alginaa-tin hyytymisen vaikutuksesta helmenmuotoisia pieniä palasia. Nämä pestiin tislatulla vedellä. Dekstraanisukraasia 20 sisältävät alginaattihelmet pantiin pylvääseen ja saatiin 196 ml: n geelipohja. Entsyymiaktiivisuus oli 1,3 IU/ml alginaattigeeliä.

Tämän geelipohjan läpi pumpattiin 8 ml/h sakkaroo-si/fruktoosiliuosta, jossa oli 10 g fruktoosia ja 45 g .25 sakkaroosia 100 g liuosta kohti. Geelipohjasta ulostule-vassa liuoksessa oli 32,8 % leukroosia, joka vastaa saantoa 40,0 % sakkaroosin perusteella laskettuna.

Esimerkki 3 18 kg kuiva-ainepitoisuuden 35 % omaavaa, esimer-30 kin 1 mukaisesti saatua leukroosia sisältävää vesiliuosta syötettiin 6 m korkeaan erotuskolonniin, jossa oli 190 1 . . polystyrolisulfonaattikationinvaihtajaakalsiumionimuodos- sa. Lisäämällä 35 1/h tislattua vettä eluoitiin erotuspyl-vääseen syötettyä sakkaridia. Kun oli ensin juoksutettu ’"•‘•35 51 1, eluoitui seuraavassa 38 l:ssa jonkin verran dekst- raania ja isomalto-oligosakkaridia.

β 86363 Tämän jälkeen seuraavassa 3 l:n fraktiossa oli 112 g leukroosia yhdessä 39 g:n kanssa muita sakkarideja, seuraavassa 12 l:n fraktiossa oli 1041 g leukroosia, jonka puhtaus oli 96,1 %. Seuraavassa 3 l:ssa eluoitui edelleen 5 158 g leukroosia ja 50 g fruktoosia ja 2 g glukoosia.

Näin saadut leukroosiliuokset voidaan haluttaessa käyttää välittömästi makeutusaineena. Ne voidaan myös vä-kevöidä edelleen siirapiksi. Kiinteää leukroosia saadaan esimerkiksi liuoksen pakastuskuivauksella.

10 Esimerkki 4

Esimerkin 3 mukaisesti saatua leukroosifraktiota, joka oli toisen kromatografisen puhdistusvaiheen kautta puhdistettu puhtausasteeseen 98,1 %, testattiin haponmuo-dostuksen suhteen käyttämällä Streptococcus mutans NCTC 15 10449. Tällöin määritettiin protonintuotto sekä rekiste röimällä pH:n aleneminen happamoitumiskokeissa kuten myös emäksen kulutus (pH vakiona) automaattisella takaisintit-rauksella. Osoittautui, ettei leukroosi tuottanut happoa. Koska leukroosi on huono substraatti glukoosille, ei syn-20 tynyt myöskään yhtään dekstraania. Tutkimukset suolisto-bakteereilla ovat osoittaneet, että leukroosin pilkkoutu-misnopeus on 1/5 - 1/3 maltoosin pilkkoutumisnopeudesta. Fruktoosin ja glukoosin pilkkoutumistuotteet ovat jo ohutsuolessa käytettävissä ja ne voidaan käyttää täysin ener-25 geettisesti hyväksi. Paksussa suolessa ei ole käytännöllisesti katsoen yhtään pilkkoutumatonta leukroosia.

Esimerkki 5 1,6 l:aan entsyymin alfa-l-6-glukosyyli-transferaa-sin (dekstraanisukraasi) vesiliuokseen, jonka aktiivisuus 30 oli 7 500 IU/1, liuotettiin 2000 g kiteistä fruktoosia 298 K:ssa. Liuoksen pH oli 5,4. Tähän liuokseen pumpattiin • . 13 l:n sakkaroosivesiliuos, jossa oli 5200 g sakkaroosia, 70 tunnin aikana. Kaksi tuntia sakkaroosiliuoksen lisäämisen päättymisen jälkeen oli sakkaroosipitoisuus reaktio-35 seoksen kuiva-aineessa vähemmän kuin 1 % ja leukroosipi- 9 86363 toisuus 38,1 %, joka vastaa saantoa 52,7 % sakkaroosin perusteella laskettuna.

75-80 %:n kuiva-ainepitoisuuteen väkevöityyn leuk-roosiliuokseen lisätään siemenkide ja jäähdytetään hitaas-5 ti (1-3° tunnissa). Näin saadaan leukroosi monohydraattina romboedrisen kiteen muodossa, sulamispiste 159-160°C, o£° = -6,8° .

Claims (6)

1. Kiinteä tai nestemäinen makeutusaine ravintoaineita, nautintoaineita ja rehuja varten, tunnettu 5 siitä, että se sisältää vähintään 50 paino-% leukroosia ja lisäksi yhtä tai useampaa muuta makeutusainetta tai sokerin korviketta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen makeutusaine, tunnettu siitä, että se sisältää vähintään 95 pai- 10 no-% leukroosia.

3. Tapa valmistaa leukroosia, jonka puhtausaste on vähintään 50 paino-%, tunnettu siitä, että sakkaroosi saatetaan reagoimaan alfa-(l-6) glukosyylitransfe-raasin kanssa kun läsnä on vähintään 100 mmol fruktoosia 15 entsyymin 1000 IU:ta kohti ja että dekstraani ja iso-mal-to-oligosakkaridit erotetaan ainakin osittain.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen tapa, tunnettu siitä, että puhtausasteen kohottamiseksi vähintään 95 paino-%:iin leukroosi erotetaan fruktoosista ja 20 iso-malto-oligosakkarideista kromatografisesti.

5. Vähintään 50 paino-%:n puhtausasteen omaavan leukroosin käyttö kiinteässä tai nestemuodossa makeutusai-neena ravintoaineissa nautintoaineissa ja rehuissa, jolloin leukroosi mahdollisesti käytetään seoksena yhden tai *:* 25 useamman muun makeutusaineen tai sokerin korvikkeen kans sa.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että leukroosin puhtausaste on vähintään 95 paino-%. li 86363