DK161383B

DK161383B - Quinolincarboxylsyre-derivat, fremgangsmaade til fremstilling heraf samt antibakterielle farmaceutiske praeparater indeholdende dette

Info

Publication number: DK161383B
Application number: DK103986A
Authority: DK
Inventors: Tsutomu Irikura; Seigo Suzue; Satoshi Murayama; Keiji Hirai; Takayoshi Ishizaki
Original assignee: Kyorin Seiyaku Kk
Priority date: 1985-03-08
Filing date: 1986-03-07
Publication date: 1991-07-01
Also published as: NO165071B; FI860950A0; FI860950A; CN1012613B; DK103986A; ES552802A0; PT82153A; ES8704932A1; NO860870L; FI85698B; KR860007249A; FI85698C; EP0195316A1; DK161383C; PT82153B; NO165071C; CN86102363A; HUT40639A; DK103986D0; MX162668A

Description

DK 161383B

i

Den foreliggende opfindelse angår et hidtil ukendt quinolincarboxylsyre-derivat, en fremgangsmåde til fremstilling heraf samt antibakterielle farmaceutiske præparater indeholdende dette derivat. Nærmere bestemt angår opfin-5 delsen et quinolincarboxylsyre-derivat, der er ejendommeligt ved, at det er en forbindelse med formlen 0

HjlN I li li 10 \ W “· Å eller hydrater, farmaceutiske acceptable syreadditionssalte eller alkalimetalsalte af denne forbindelse. Des-15 uden angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af det omhandlede derivat, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 2's kendetegnende del anførte. Endelig angår opfindelsen et farmaceutisk præparat med antibakteriel virkning, og dette præparat er ejendom-20 meligt ved det i krav 3's kendetegnende del angivne.

Det omhandlede quinolincarboxylsyre-derivat med formlen (I) omfatter optiske isomere på grund af et asymmetrisk carbonatom i aminopyrrolidinringen, nemlig 7-substituen-25 ten. Alle de optiske isomere og blandingerne deraf er imidlertid af bekvemmelighedsgrunde repræsenteret ved den samme enhedsformel. Den foreliggende opfindelse er således ikke begrænset til en af de optiske isomere eller til blandingen af disse.

30

Anvendelsen af quinolincarboxylsyrer som antibakterielle midler tog sin begyndelse med nalidixinsyre (l-ethyl-7-methyl-4-naphthyridon-(l,8)-3-carboxylsyre), og er siden blevet udviklet til piromidinsyre (l-ethyl-7-pyrrolidino-35 4-naphthyridon-(l,8)-3-carboxylsyre) og yderligere igen til pipemidinsyre (l-ethyl-7-piperazino-4-naphthyridon-(1,8)-3-carboxylsyre). De udgør nyttige midler til den 2

DK 161383 B

medicinske behandling af urinvejsinfektioner forårsaget af aerobe gram-negative bakterier.

Norfloxacin, der er l-ethyl-6-fluor-l,4-dihydro-4-oxo-7-5 (l-piperazinyl)-3-quinolincarboxylsyre, og som for nylig ' er blevet udviklet af opfinderne, udviser kraftig anti-bakteriel aktivitet, ikke alene over for gram-negative bakterier, men også overfor gram-positive bakterier. Forbindelsens styrke er overordentlig meget større end hos 10 de tidligere kendte quinolincarboxylsyrer. Norfloxacin udgjorde en skelsættende udvikling inden for dette område, og forbindelsen anvendes særdeles hyppigt klinisk for øjeblikket.

15 Man har kontinuerligt udviklet de senere quinolincarboxylsyrer, såsom ofloxacin (9-fluor-2,3-dihydro-3-methyl- 10-(4-methyl-l-piperazinyl)-7-oxo-7H-pyrido[l,2,3,de]- 1,4-benzoxazin-6-carboxylsyre), ciprofloxacin (1-cyclo-propyl-6-fluor-l,4-dihydro-4-oxo-7-(l-piperazinyl)-quino-20 lin-3-carboxylsyre) og CI-934 (l-ethyl-7-(3-ethylaminome-thyl-l-pyrrolidinyl)-6,8-difluor-1,4-dihydro-4-oxo-3-qui-nolincarboxylsyre), som har substituenter svarende til norfloxacin. CI-934 har en kraftig aktivitet overfor gram-positive bakterier.

25

Ciprofloxacin er i besiddelse af en stærkere antibakteri-el aktivitet end norfloxacin. Men den antibakterielle styrke overfor gram-positive bakterier er temmelig beskeden i forhold til aktiviteten overfor gram-negative bak-30 terier. Den antibakterielle aktivitet af CI-934 overfor gram-positive bakterier er noget kraftigere; men aktiviteten overfor gram-negative bakterier er lavere.

På den anden side er man stødt på vanskeligheder på det 35 kliniske område ved den forøgede forekomst af /3-laet am-antibiotika-resistente gram-positive bakterier, såsom methicillin- og cephalosporin-resistent Staphylococcus 3

DK 161383 B

aureus, S. epidermidis og Enterococcus faecalis.

Man har yderligere kunnet påviste, at anaerobe organismer på huden eller på slimhinder virker som patogener ved 5 opportunistisk infektion takket være den stigende udbredelse af anaerobe undersøgelser som et resultat af udviklingen af teknologien indenfor klinisk afprøvning. Det er blevet rapporteret, at man har fundet anaerobe bakterier med eller uden aerobe bakterier i et omfang på 50-10 80% ved infektioner i åndedrætssystemet, ved intraperito- neale infektioner, ved kronisk otitis media, ved paranasal sinusitis og ved obstetriske og gynækologiske infektioner, og omfanget af kombinationen af anaerobe bakterier med Escherichia coli, Enterococcus faecalis og de and-15 re Streptococci er ca. 95%. Et gradvist forøget resistens-omfang for anaerobe bakterier i forhold til Ø-lac-tam-antibiotika eller clindamycin, som i sig selv er effektive overfor anaerobe bakterier, har forårsaget alvorlige problemer med hensyn til valget af kemoterapeu-20 tiske midler.

Mycoplasma er kendt som et patogen ved åndedrætssysteminfektioner, menigitis, endocarditis, arthritis etc. Mod infektioner, der skyldes Mycoplasma, har man sædvanligvis 25 anvendt tetracycliner og macrolider; men i de senere år er nogle Mycoplasmastammer i høj grad blevet resistente overfor disse lægemidler, især overfor macrolider. Dette vil derfor fremover give vanskeligheder indenfor kemoterapien .

30 I

Chlamydia, Ureaplasma og Gardneralla vaginalis er i den seneste tid blevet diskussionsemne som patogener for køn- ! ssygdomme. Man har ligeledes behov for et effektivt, nyt j

lægemiddel mod disse bakterier. I

35 i På denne baggrund er der behov for udviklingen af nye antimikrobielle midler med kraftigere aktivitet og med et 4

DK 161383 B

bredere virkningsspektrum.

Norfloxacin har været udgangspunktet for nutidens store udvalg af nye antibakterielle quinolin-forbindelser. Man 5 har fundet, at målet for quinolinerne er DNA gyrase, som regulerer topologien i DNA-dobbeltspiralen.

Man har yderligere erkendt, at den antibakterielle aktivitet af quinolincarboxylsyrerne er signifikant relateret 10 til evnen til at penetrere gennem bakteriemembraner, især til at penetrere gennem den del, der betegnes poriner. Baseret på denne viden fastlagde man konceptet for nye quinolinforbindelser, som skulle være i overensstemmelse med følgende forhold: 15 1) At indvirke på DNA gyrase.

2) At have god permeabilitet gennem de ydre membraner, især gennem poriner.

20 3) At være sikkert effektive overfor gram-positive bakterier, især Staphylococci.

4) Ikke at nedsætte aktiviteten overfor gram-negative 25 bakterier.

5) At virke kraftigt overfor Serratia sp. og Pseudomonas aeruginosa, som udviser resistens overfor andre anti-mikrobielle midler.

30 6) At udvise aktivitet overfor anaerobe bakterier.

7) At være i besiddelse af god absorption og ikke let at blive metaboliserede.

35 8) At være fremragende med hensyn til produktivitet.

5

DK 161383 B

9) At være fremragende med hensyn til selektiv toxicitet, og ikke udvise skadelige bivirkninger på levende væse ner.

5 Man syntetiserede hidtil ukendte stoffer med den ovenfor angivne formel (I) som værende forbindelser, som muligvis kunne tilfredsstille dette koncept, især punkt (9), og som et resultat af de forskellige undersøgelser i denne sammenhæng opstod den foreliggende opfindelse.

10

De særlige træk knyttet til forbindelserne, som blev undersøgt, med hensyn til den kemiske struktur er, at de besidder et fluoratom i 6-stillingen, et chloratom i 8-stillingen og en 3-aminopyrrolidinylgruppe i 7-stillingen 15 i quinolincarboxylsyre-skelettet.

Man har tidligere fundet, at norfloxacin indfører et fluoratom i 6-stillingen i quinolincarboxylsyre-skelettet. Eftersom norfloxacin har vist sig at være særdeles 20 nyttig ved klinisk behandling af bakterielle infektioner, har man grundigt undersøgt de antibakterielle midler tilhørende denne klasse såvel i Japan som i andre lande, og et skel-sættende fremskridt blev gennemført, hvilket betegnes som nye quinoliner eller fluorquinoliner.

25

Som et resultat af fortsættelsen af de grundige undersøgelser bemærkede man, at substituenten i 8-stillingen ligeledes spillede en overordentlig vigtig rolle med hensyn til udvidelsen af det antibakterielle spektrum, forhøjel-30 sen af aktiviteten og den orale absorption som lægemid del. Man indførte så forskellige substituenter i 8-stillingen, og de derved opnåede forbindelser blev analyseret, idet man anvendte fremgangsmåder såsom kvantitative undersøgelser af forholdet mellem struktur og aktivitet.

35 Man er nu nået til den konklusion, at et chloratom ganske overraskende er optimalt som substituent i 8-stillingen.

DK 161383 B ; 6

Til sidst udviklede man en serie forbindelser, som havde et fluoratom i 6-stillingen og et chloratom i 8-stillin-gen som tidligere anført. Man mente især, at 8-chlor-l-cyclopropyl-6-fluor-1,4-dihydro-7-(3-methyl-1-piperazi- 5 nyl)-4-oxo-3-quinolincarboxylsyre (referenceforbindelse i \ 2) var et af de mest fremragende produkter blandt vilkårlige quinolincarboxylsyre-derivater, på grund af den brede og kraftige antibakterielle aktivitet.

10 Man fandt imidlertid uheldigvis, at denne forbindelse var i besiddelse af nogle ulemper som lægemiddel til klinisk anvendelse på mennesker. Ved gentagne perorale indgifter til hunde iagttog man således voldsom opkastning og klo-niske konvulsianer, hvilket antydede, at forbindelsen 15 havde bivirkninger på centralnervesystemet. Yderligere syntes en udpræget forhøjelse af GPT og en sænkning af TTT ved denne afprøvning at være nært forbundet med denne forbindelses hepatoxicitet. De ovenfor nævnte resultater indikerede, at det muligivs var umuligt at anvende for-20 bindeisen på mennesker.

Baseret på disse undersøgelser fortsatte man forskningen efter lægemidler med en kraftigere antibakteriel aktivitet og en højere sikkerhedsmargin, hvorved man nåede frem 25 til den foreliggende opfindelse.

Det er yderligere overraskende, at forbindelsen ifølge opfindelsen udviser en meget kraftigere antibakteriel aktivitet overfor anaerobe bakterier, Mycoplasma, Urea-30 plasma, Chlamydia og Gardnerella vaginalis, overfor hvilke de tidligere kendte quinolincarboxylsyrer har en lav aktivitet eller er inaktive. Den lavere mutationsfrekvens for bakterier er en yderligere fordel knyttet til denne forbindelse. Man har fundet, at forbindelsen i 35 forsøgsdyr udviser en god oral absorption, en fremragende vævsfordeling, en tilfredsstillende biologisk stabilitet og en god acceptabilitet.

7

DK 161383 B

I det følgende vil fremgangsmåden til fremstilling af forbindelsen ifølge opfindelsen blive beskrevet nærmere: p c /^Sy/VvCOQR. R.a'Nr-\ 5 T π |[ nk---

(id ^ (HD

« A

o 9

10 p4 f-^/V00* F7i#ArAlrC00H

eyl I jf * H2N\yyAN·^

Cl ^ (I W α Å 15 I det ovenfor viste reaktionsskema betegner R et hydro- 1 2 genatom eller en lavere alkylgruppe, R og R betegner hver for sig et hydrogenatom eller en amino-beskyttende gruppe, eller de betegner sammen en amino-beskyttende 20 gruppe, og X er et halogenatom.

Man syntetiserer således forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse, der er gengivet med formlen (I), ved at lade en forbindelse med formlen (II) omsætte sig med en 25 amin med formlen (III). Når det drejer sig om forbindel- 1 2 ser, i hvilke en af substituenterne R og R eller dem begge er amino-beskyttende grupper i formlen (III), hvor 1 2 f.eks. R er et hydrogenatom, og R er en lavere acyl- gruppe, f.eks. en acetylgruppe, en propionylgruppe etc., 30 en lavere alkoxycarbonylgruppe, f.eks. en methoxycarbo- nylgruppe, en ethoxycarbonylgruppe, en t-butoxycarbonyl- 1 2 gruppe etc., eller hvor R og R tilsammen udgør en phthaloylgruppe, fjerner man de beskyttende grupper fra forbindelserne, som i reaktionsskemaet er gengivet med 35 formlen (I1), under anvendelse af sædvanlige metoder til dannelse af forbindelsen ifølge opfindelsen. Når det drejer sig om forbindelser, hvori R er en lavere alkylgruppe

DK 161383 B

8 i formlen (II), hydrolyserer man yderligere de derved opnåede forbindelser med formlen (III) på sædvanlig måde, hvorefter esteren omdannes til carboxylsyren til opnåelse af forbindelsen ifølge opfindelsen. Reaktionen mellem 5 forbindelsen med formlen (II) og forbindelsen med formlen (III) gennemføres fortrinsvis ved opvarmning af blandingen i et opløsningsmiddel, såsom vand, alkoholer, aceto-nitril, dimethylformamid (DMF), dimethylsulfoxid (DMSO), hexamethylphosphortriamid, pyridin, picolin og lignende 10 eller uden tilstedeværelse af et opløsningsmiddel. Reaktionstemperaturen vælges passende i området mellem stue-, temperatur og 200 °C, fortrinsvis mellem stuetemperatur og 160 °C. Det foretrækkes at lade forbindelsen med formlen (II) reagere med fra 1 til 5 gange så mange mol af 15 forbindelsen med formlen (III) i mindst en time ved en temperatur fra stuetemperatur til 160 °C i 2 til 10 volumener af de ovennævnte opløsningsmidler. På dette tidspunkt er anvendelsen af syrefjernende midler, såsom tri-ethylamin, diazabicyclo-baser og kaliumcarbonat ligeledes 20 ønskværdig. Man kan derudover hydrolysere forbindelser (I'), i hvilke R betegner en lavere alkylgruppe, til forbindelser med formlen (I) under anvendelse af sædvanlige fremgangsmåder. En sådan hydrolyse kan let gennemføres med alkaliske midler, såsom kaliumhydroxid, eller med 25 syrer, såsom svovlsyre, ved en temperatur mellem stuetemperatur og det pågældende opløsningsmiddels kogepunkt.

De anvendte udgangsforbindelser med formlen (II) er ligeledes hidtil ukendte, og de opnås ved anvendelse af 30 følgende fremgangsmåder: 35 9

DK 161383 B

CNJ

^ o o yz: i =^rh- ~ \_ σ X /=\ *H LU · c: K_f “- ° ty 1

^ z; v E

o T ro 0 , z; ^ ii_ o

\ ° S

CM /-\ 4^ ^ sL “M '! X )=λ ~ lu ^ X-Λ ,\-U_ o -ro

Vi '/ φ ^ u_ O X y o rir" X ^ U_ \ o ° ^ /=\ ·. f x /=^ °~Lf ^ "Λ// jT\ o o ^ A.

o o A i-* υ>λ s φρ 8 o < Γ \ \_ ~ «s, \ o o=( X-<3 X /^=\ x )=\ 4s \_/ zi|" 2yfu- 0-5 <X{ «=*? CJ / ' o O o X U_ 10

DK 161383 B

M

LU

O

A O Ί—'

O LU

2 IXO

o (X)/ /=\ 0=0 s >=v

' K O LL—(\ λ-LL

^ U_ o \\ // o \ f~\ -A /-—\ ^ Ll_ s “·>τ °r «=? 1 ? O ^ § r s “<^=\ m § °K" _ §

7 x -J- o 0=< 2KI

o O o , X /==\ ^ . J λλ tt

23 O LL *=°. LL

^ i 1 s, cw Cii S -v -- * * CNJ _J__

O O __L_ 4-1 f-« I jT

A Z LU LU 0=0"

o O O I

o O O 0=0 ^_ O O \_ 5 s ^y/"

X ^ LL 0=0 ^ LL

° yy^ " u-<y^u- ^ ^ «a> [ i

O o O

11

DK 161383 B

Forbindelserne med formlen (I) kan yderligere omdannes, dersom dette er ønsket, til de farmaceutiske acceptable ammoniumsalte eller carboxylsyremetalsalte ved behandling med syrer eller med baser. Syren kan være en organisk 5 eller en uorganisk syre, såsom saltsyre, svovlsyre, phosphor syre, eddikesyre, methansulfonsyre, oxalsyre eller mælkesyre. Carboxylsyremetalsaltene kan f.eks. være salte af natrium, kalium, magnesium, calcium, aluminium, cerium, chrom, cobalt, kobber, jern, zink, platin eller 10 sølv.

Forbindelserne med formlen (I) samt hydrater og salte deraf lader sig anvende som lægemidler i form af konventionelt fremstillede farmaceutiske præparater, der f.eks.

15 kan være tabletter, kapsler, pulvere, salver, supposito rier, injektionsvæsker eller Øjendråber, og som er egnet til peroral, parenteral, enteral eller lokal anvendelse.

De følgende eksempler 1-24 belyser fremstillingen af 20 udgangsmaterialer, mens eksemplerne 25, 27, 28 og 29 belyser opfindelsen.

EKSEMPEL 1 25 N-(3-chlor-4-fluorphenyl)acetamid

Man satte langsomt 200 ml eddikesyreanhydrid til 100 g 3-chlor-4-fluoranilin. Efter henstand i 30 minutter blev reaktionsblandingen hældt ud i 1 liter vand. Det derved 30 opnåede bundfald blev opsamlet ved filtrering og omkrystalliseret i vandig ethanol til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (119,4 g) smp. 118-119 °C.

35 12

DK 161383 B

EKSEMPEL 2 N-(3-chlor-4-fluor-6-nltrophenyl)acetamid 5 Man satte 154 ml (d 1,42) koncentreret salpetersyre til : en opløsning af 55 g N-(3-chlor-4-fluorphenyl)acetamid i 165 ml koncentreret svovlsyre ved 5-10 °C i løbet af 1 time og under omrøring i et bad bestående af is og salt. Reaktionsblandingen blev efter omrøring i 1 time ved den-10 ne temperatur hældt ud i isvand. Det derved opnåede bundfald blev opsamlet ved filtrering, vasket i tilstrækkeligt omfang med vand og omkrystalliseret i acetonitril_ til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (48,9 g) i form af gule nåle, smp. 114-115 °C.

15

Elementæranalyse (%) for CgHg.ClFN202

Beregnet (fundet): C 41,31 (41,48), H 2,60 (2,52), N 12,04 (12,13).

20 EKSEMPEL 3 3-chlor-4-fluor-6-nitroanilin 25 Man opvarmede under tilbagesvaling i 2,5 timer en opløsning af 30 g N-(3-chlor-4-fluor-6-nitrophenyl)acetamid i 50 ml koncentreret saltsyre og 200 ml ethanol. Til reaktionsblandingen satte man 300 ml isvand, og det derved opnåede bundfald blev opsamlet ved filtrering, vasket med 30 vand og tørret til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (24,9 g) i form af gule nåle, smp. 149,5-150 °C.

Elementæranalyse (%) for CgH4ClFN202 35

Beregnet (fundet): C 37,82 (37,85), H 2,11 (2,03), N 14,70 (14,80).

13

DK 161383 B

EKSEMPEL 4 2,3-dichlor-4-fluor-6-nitroanilin 5 Man blæste chlorgas igennem en opløsning af 14,3 g 3-chlor-4-fluor-6-nitroanilin i 150 ml eddikesyre i 70 minutter ved 18-20 °C. Reaktionsblandingen blev hældt ud i 300 ml isvand, og det derved opnåede bundfald blev opsamlet ved filtrering, vasket med vand og omkrystallise-10 ret i ethanol til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (14,33 g) i form af gule nåle, smp. 161 °C.

Elementæranalyse (%) for 15 Beregnet (fundet): C 32,03 (32,17), H 1,34 (1,26), N 12,45 (12,65).

EKSEMPEL 5 20 2,3,4-trifluor-5-fluornltrobenzen

Til en blanding af 13,58 g vandfrit cuprichlorid og 12,4 g t-butylnitrit i 100 ml vandfrit acetonitril ved 60-62 °C satte man portionsvis i løbet af 30 minutter 18,05 g 25 2,3-dichlor-4-fluor-6-nitroanilin. Efter omrøring i 30 minutter ved 60-65 °C blev reaktionsblandingen hældt ud i 300 ml afkølet 10% saltsyre og ekstraheret med benzen.

Det organiske lag blev vasket successivt med fortyndet saltsyre og med vand, tørret over vandfrit natriumsulfat 30 og opkoncentreret. Den derved opnåede inddampningsrest blev renset ved destillation til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (17,26 g), kogepunkt 137-142 °C/27 mm Hg.

35 NMR (6 i CDClg), 7,65 (d, J=7,5 Hz) EKSEMPEL 6 14

DK 161383 B

3-chlor-2,4,5-trifluornitrobenzen 5 Til en suspension af 64,9 g kaliumfluorid i 230 ml vandfrit dimethylsulfoxid ved 140 °C satte man 54,4 g 2,3,4-trichlor-5-fluornitrobenzen, hvorpå man omrørte blandingen ved samme temperatur i 10 minutter. Reaktionsblandingen blev derefter hældt ud i 700 mg isvand og ekstraheret 10 med petroleumether. Det organiske lag blev vasket successivt med vand, med en vandig kaliumcarbonatopløsning og derpå med vand, tørret over vandfrit natriumsulfat og op-koncentreret. Den derved opnåede inddampningsrest blev destilleret til dannelse af den i overskriften nævnte 15 forbindelse (9,7 g), kogepunkt 95-108 °C/30 mm Hg% NMR (6 i CDC13), 7,94 (ddd, J=6,7, 7,6, 9,0 Hz).

EKSEMPEL 7 20 3-chlor-2-cyclopropylamino-4,5-difluornitrobenzen

Man satte dråbevis ved 3-5 °C i løbet af 40 minutter under omrøring en opløsning af 2,8 g cyclopropylamin og 25 5,1 g triethylamin i 20 ml vandfrit toluen til en opløs ning af 9,7 g 3-chlor-2,4,5-trifluornitrobenzen i 30 ml vandfrit toluen. Efter omrøring i 3 timer ved samme temperatur blev reaktionsblandingen hældt ud i 150 ml isvand og ekstraheret med dichlormethan. Det organiske lag blev 30 vasket med vand, tørret over vandfrit natriumsulfat og derpå opkoncentreret. Den derved opnåede inddampningsrest blev renset ved silicagelkromatografi under anvendelse af N-hexan-dichlormethan som elueringsmiddel til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (4,4 g) i form af 35 en rød olie.

15

DK 161383 B

M

NMR (6 i CDClg), 0,5-1,0 (4H. m, <T* ), 3,0-3,2 (IH, ro, 7,19 i IH, s, NH), 7,85 (IH. dd. J-8.2. 9,9 Hz. 5-H).

5 EKSEMPEL 8 N-(2-chlor 3,4-difluor-6-nitrophenyl)-N-cyclopropylacet-amid 10 Man satte i en omgang 15 ml eddikesyreanhydrid til 4,4 g 3-chlor-2-cyclopropylamino-4,5-difluornitrobenzen, hvorpå blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 30 minutter og derpå hældt ud i 100 ml isvand. Overskud af eddikesyreanhydrid blev dekomponeret med pulverformigt kaliumcar-15 bonat, hvorpå blandingen fik lov at henstå natten over ved 5 °C. Det derved opnåede bundfald blev opsamlet ved filtrering og omkrystalliseret i ethylacetat-n-hexan til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (2,7 g), smp. 98-99,5 °C.

20

Elementæranalyse (%) for C1;LHgclF2N203

Beregnet (fundet): C 45,46 (45,56), H 3,12 (3,00), N 9,64 (9,69).

25 EKSEMPEL 9 N-(2-chlor-3,4-difluorphenyl)-N-cyclopropylacetamid 30 Man hydrogenerede i 40 minutter ved 2-3 °C under atmosfæretryk i et isbad en blanding af 2,7 g N-(2-chlor-3,4-di-fluor-6-nitrophenyl)-N-cyclopropylacetamid og 0,5 g 10% palladium-på-trækul i 50 ml ethanol. Katalysatoren blev frafiltreret, og filtratet blev opkoncentreret. Derpå 35 tørrede man den således opnåede krystallinske inddamp- ningsrest under vakuum ved stuetemperatur i 10 timer. En j opløsning af inddampningsresten i 15 ml vandfrit dime- i

DK 161383B

16 thylformamid blev dråbevis sat til en opløsning af 1,72 g t-butylnitrit i 10 ml vandfrit dimethylformamid ved 50-52 °C i løbet af 13 minutter. Reaktionsblandingen blev omrørt ved samme temperatur i 5 minutter og derpå hældt ud 5 i isvand og ekstraheret med ether. Det organiske lag blev successivt vasket med vand, med fortyndet saltsyre og med vand, tørret over vandfrit natriumsulfat og opkoncentre-ret. Den derved fremkomne inddampningsrest blev renset ved silicagelkromatografi under anvendelse af n-hexan-10 ethylacetat som elueringsmiddel og omkrystalliseret i pe-troleumether til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (0,44 g), smp. 60,5-61,5 °C.

Elementæranalyse (%) for chhioc1F2NO · 15

Beregnet (fundet): C 53,78 (53,87), H 4,10 (4,02), N 5,70 (5,78).

EKSEMPEL 10 20 N-cyclopropyl-2-chlor-3,4-difluoranilin

Man opvarmede i 6 timer under omrøring ved 80-100 °C en opløsning af 0,44 g N-(2-chlor-3,4-difluorphenyl)-N-cyc-25 lopropylacetamid i 7 ml 20% fortyndet saltsyre, hvorpå man afkølede. Reaktionsblandingen blev hældt ud i isvand, gjort alkalisk med vandig natriumhydroxid og ekstraheret med ether. Etherlaget blev vasket med vand, tørret over vandfrit natriumsulfat og derpå opkoncentreret. Den der-30 ved opnåede inddampningsrest blev renset ved silicagelkromatografi under anvendelse af petroleumether som elueringsmiddel til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (100 mg) i form af en orangefarvet olie.

35 EKSEMPEL 11

17 DK 161383 B

ethyl-8-chlor-l-cyclopropyl-6,7-difluor-l/4-dihydro-4-oxo-3-quinolincarboxylat 5

Man omrørte i 10,5 timer ved 100-135 °C en blanding af 100 mg N-cyclopropyl-2-chlor-3,4-difluoranilin og 100 mg diethyl-ethoxymethylenmalonat, idet man fjernede den dannede alkohol med en strøm af gasformig nitrogen, hvorpå 10 man afkølede. Til blandingen sattes 1 g polyphosphorsyre, og blandingen blev omrørt i 3 timer ved 125-135 °C. Efter afkøling blev reaktionsblandingen hældt ud i isvand og ekstraheret med chloroform. Det organiske lag blev vasket successivt med vandig kaliumcarbonat og med vand, tørret 15 over vandfrit natriumsulfat og derpå opkoncentreret. Den derved opnåede inddampningsrest blev renset ved silicagel tyndtlagskromatografi under anvendelse af ether som elu-eringsmiddel til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (11 mg) i form af farveløse nåle, smp. 160-20 162,5 °C.

NMR (6 i CDC13), 1,0-1, 5 (4H, m, 1,40 (3H, t, J=.

Hz, -CH3), 4,1-4,4 (IH, m, -¾^] ), 4,38 (2H, g, J=7,0 Hz, -CH^-25 CH ), 3,22 (IH, dd, J=8,8, 9,7 Hz, 5-H), 8,66 (IH, s, 2-H) EKSEMPEL 12 30 2,3,4-trichlor-5-fluoranilin

Man satte langsomt under kraftig omrøring ved 50-60 °C

6,7 ml koncentreret saltsyre til en suspension af 54,6 g jernpulver i 60 ml vand. Efter tilblanding af 150 ml 35 ethanol satte man ved 60-70 °C i løbet af 1 time i portioner 75,1 g 2,3,4-trichlor-5-fluornitrobenzen til suspensionen. Efter omrøring 1 time ved 80 °C blev den varme i 18

DK 161383 B

reaktionsblanding filtreret, og det uopløselige materiale blev vasket successivt med 100 ml varm ethanol og med 300 ml benzen. Filtratet og vaskevæskerne blev forenet og blandet med isvand. Det således opnåede organiske lag 5 blev opsamlet, og vandlaget blev ekstraheret med 200 ml benzen. De organiske lag blev vasket med vand, tørret over vandfrit natriumsulfat og derpå opkoncentreret. Den derved opnåede inddampningsrest blev omkrystalliseret i n-hexan til dannelse af den i overskriften nævnte forbin-10 delse (58,6 g) i form af lysebrune nåle, smp. 118-120 °C.

EKSEMPEL 13 2,3,4-trichlor-5-fluorbenzonitril 15

Man satte under kraftig omrøring ved mellem -2 og 0 "C i løbet af 20 minutter 21,1 g natriumnitrit i 50 ml vand til en suspension af- 4-3,8 g 2,3,4-trichlor-5-fluoranilin i 300 ml koncentreret saltsyre. Efter omrøring i 30 20 minutter blev blandingen hældt ud i 300 ml isvand indeholdende 67,2 g natriumtetrafluorborat og omrørt kraftigt, hvorpå den fik lov at henstå i 30 minutter i et is-bad. Det derved opnåede bundfald blev opsamlet ved filtrering og vasket successivt med afkølet vand og ether.

25 Dette svagt gule bundfald blev i portioner i løbet af 30 minutter under kraftig omrøring ved stuetemperatur sat til en opløsning af 36,5 g cuprocyanid, 53,0 g kaliumcyanid og 11,1 g natriumcarbonat i 300 ml vand. Efter at blandingen var blevet omrørt i 30 minutter satte man 300 30 ml benzen til suspensionen, hvorpå blandingen blev omrørt i 15 minutter. Det uopløselige materiale blev opsamlet ved filtrering og vasket med 150 ml benzen. Filtratet og vaskevæskerne blev forenet og vasket successivt med 20% kaliumcyanidopløsning og med vand, tørret over vandfrit 35 natriumsulfat og derpå opkoncentreret. Den derved opnåede inddampningsrest blev omkrystalliseret i n-hexan til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (27 g) i 19

DK 161383 B

form af lysebrune nåle, smp. 97,99 °C.

EKSEMPEL 14 5 3-chlor-2,4,5-trifluorbenzonitril

Under omrøring ved 130 °C sattes 15 g 2,3,4-trichlor-5-fluorbenzonitril til en opløsning af 31,7 g kaliumfluorid i 100 ml dimethylsulfoxid, hvorpå blandingen blev omrørt 10 i 1,5 timer ved 140 °C. Reaktionsblandingen blev efter afkøling hældt ud i 300 ml isvand og ekstraheret med di-chlormethan. Det organiske lag blev vasket med vand, tørret over vandfrit natriumsulfat og opkoncentreret til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (11,9 15 g) som en lysebrun olie.

EKSEMPEL 15 3-chlor-2,4,5-trifluorbenzamid 20

Man opvarmede under tilbagesvaling i 80 minutter en opløsning af 11,9 g 3-chlor-2,4,5-trifluorbenzonitril i 150 ml 30% hydrogenbromid-eddikesyre, hvorpå man hældte opløsningen ud i 350 ml isvand og ekstraherede med ether.

25 Etherlaget blev vasket successivt med 1 N kaliumhydroxidopløsning og vand, tørret over vandfrit natriumsulfat og opkoncentreret. Inddampningsresten blev renset ved sili-cagelkromatografi, idet man eluerede med n-hexan-ethyl-acetat til dannelse af den i overskriften nævnte forbin-30 delse (3,97 g), smp. 110-113,5 °C.

EKSEMPEL 16 3-chlor-2,4,5-trifluorbenzoesyre 35

Man omrørte ved 125-135 °C igennem 9 timer en blanding af

3,97 g 3-chlor-2,4,5-trifluorbenzamid og 20 ml 18 N

20

DK 161383 B

svovlsyre, hvorpå blandingen blev hældt ud i 100 ml isvand. Efter henstand natten over blev det således opnåede bundfald inddampet ved filtrering. Moderluden blev ekstraheret med ether, og etherlaget blev tørret over vand-5 frit natriumsulfat og derpå opkoncentreret og blandet sammen med bundfaldet. En opløsning af ovennævnte bundfald og inddampningsresten i 150 ml dichlormethan blev filtreret gennem en pude af "Celite", og filtratet blev opkoncentreret til dannelse af den i overskriften nævnte 10 forbindelse (2,38 g), smp. 115-116,5 °C.

Elementæranalyse (%) for CyH^ClF^O^.

Beregnet (fundet): C 39,93 (40,18), H 0,96 (0,80).

15 EKSEMPEL 17 3-chlor-2,4,5-trifluorbenzoylchlorid 20 Man opvarmede under tilbagesvaling i'2,5 timer en opløsning af 2,38 g 3-chlor-2,4,5-trifluorbenzoesyre i 10 ml thionylchlorid, hvorpå man opkoncentrerede. Den således opnåede inddampningsrest blev renset ved destillation i en nitrogenatmosfære til dannelse af den i overskriften 25 nævnte forbindelse (1,99 g), kogepunkt 88 °C/10 mm Hg.

EKSEMPEL 18 diethyl-3-chlor-2,4,5-trifluorbenzoylmalonat 30

Til 1,5 ml absolut ethanol sattes 0,22 g magensiumdreje-spåner og 0,1 ml carbontetrachlorid. Til suspensionen satte man under omrøring dråbevis en opløsning af 1,4 g diethylmalonat og 2 ml absolut ethanol i 6 ml toluen i 35 løbet af 28 minutter ved 47-60 °C. Blandingen blev omrørt i 80 minutter og derpå afkølet i et bad af acetone og tøris. Til den således opnåede opløsning satte man ved en

DK 161383 B

21 temperatur på mellem -12 og -8 °C i løbet af 13 minutter dråbevis en opløsning af 1,99 g 3-chlor-2,4,5-trifluor-benzoylchlorid i 2 ml vandfrit toluen. Blandingen blev omrørt i 2 timer ved en temperatur på mellem -10 og -5 °C 5 og fik lov at henstå natten over ved stuetemperatur, hvorpå den blev blandet med 6 ml isvand indeholdende 0,4 ml koncentreret svovlsyre. Det derved opnåede organiske lag blev opsamlet, og vandlaget blev ekstraheret med toluen. De samlede organiske lag blev vasket med vand, 10 tørret over vandfrit natriumsulfat og derpå opkoncentre-ret til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (3,05 g) i form af en lysegul olie.

EKSEMPEL 19 15 ethyl-3-chlor-2,4,5-trifluorbenzoylacetat

Man satte 4 mg p-toluensulfonsyre til en emulsion af 3,05 g diethyl-3-chlor-2,4,5-trifluorbenzoylmalonat i 4 ml 20 vand, hvorpå man opvarmede under tilbagesvaling i 4 timer med kraftig omrøring. Reaktionsblandingen blev efter afkøling ekstraheret med dichlormethan. Det organiske lag blev vasket med vand, tørret over vandfrit natriumsulfat og opkoncentreret. Inddampningsresten omkrystalliseredes 25 i ether-n-hexan til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (1,22 g), smp. 80-83 °C.

Elementæranalyse (%) for cnH8C1F3°3 30 Beregnet (fundet): C 47,08 (46,96), H 2,87 (2,77).

EKSEMPEL 20 ethyl-2-(3-chlor-2,4,5-trifluorbenzoyl)-3-ethoxyacry1at

Man omrørte i 3 timer ved 118-143 °C en blanding af 1,22 g ethyl-3-chlor-2,4,5-trifluorbenzoylacetat, 0,97 g 35 22

DK 161383 B

ethylorthoformiat og 1,12 g eddikesyreanhydrid, hvorpå man opkoncentrerede til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (1,4 g) i form af en gul olie.

5 EKSEMPEL 21 ethyl-2-(3-chlor-2,4,5-trifluorbenzoyl)-3-cyclopropylami-noacrylat 10 Man satte ved 5-10 °C i løbet af 15 minutter en opløsning af 0,26 g cyclopropylamin i 2 ml absolut ethanol til en opløsning af 1,4 g ethyl-2-(3-chlor-2,4,5-trifluorbenzoyl ) -3 -ethoxyacrylat i 2 ml absolut ethanol. Blandingen fik lov at henstå ved 5 °C i 1,5 timer, hvorpå den blev 15 omrørt ved stuetemperatur i 1 time. Det derved opnåede bundfald blev opsamlet ved filtrering. Filtratet blev op-koncentreret, blandet med bundfaldet og derpå omkrystalliseret i petroleumether til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (1,09 g), smp. 84-85,5 °C.

20

Elementæranalyse (%) for C^H^ClFgNOg

Beregnet (fundet): C 51,81 (51,76), H 3,77 (3,74), N 4,03 (4,03).

25 EKSEMPEL 22 ethyl-8-chlor-l-cyclopropyl-6,7-difluor-l,4-dihydro-4-oxo-3-quinolincarboxylat 30

Man satte 0,21 g natriumfluorid til en opløsning af 1,09 g ethyl-2-(3-chlor-2,4,5-trifluorbenzoyl)-3-cyclopropyl-aminoacrylat i 5 ml vandfrit dimethylformamid. Blandingen blev omrørt i 3,5 timer ved 130-156 °C og derpå hældt ud 35 i 50 ml isvand, og det derved opnåede bundfald blev opsamlet ved filtrering, vasket med vand og omkrystalliseret i ethylacetat til dannelse af den i overskriften 23

DK 161383 B

nævnte forbindelse (0,96 g), smp. 159-159 °C.

Elementæranalyse (%) for 5 Beregnet (fundet): C 54,98 (54,96), H 3,69 (3,57), N 4,27 (4,25).

EKSEMPEL 23 X0 8-chlor-l-cyclopropyl-6,7-difluor-1,4-dihydro-4-oxo-3- quinolincarboxylsyre

Man opvarmede under tilbagesvaling i 1 time en blanding af 0,24 g ethyl-8-chlor-l-cyclopropyl-6,7-difluor-1,4-15 dihydro-4-oxo-3-quinolincarboxylat, 2 ml eddikesyre, 1,5 ml vand og 0,25 ml koncentreret svovlsyre, hvorpå man hældte blandingen ud i isvand. Det derved opnåede bundfald blev opsamlet ved filtrering og vasket successivt med vand og med ether til dannelse af den i overskriften 20 nævnte forbindelse (0,17 g), smp. 194-195 °C.

Elementæranalyse (%) for C^gHgClF2N0g

Beregnet (fundet): C 52,11 (52,00), H 2,69 (2,53), 25 N 4,67 (4,64).

EKSEMPEL 24 7-[3-(t-butoxycarbonylamino)-l-pyrrolidinyl]-8-chlor-l-30 cyclopropyl-6-fluor-1,4-dihydro-4-oxo-3-quinolincarboxyl- syre

Man opvarmede under tilbagesvaling i 1 time en blanding af 500 mg (1,67 mmol) 8-chlor-l-cyclopropyl-6,7-difluor-35 l,4-dihydro-4-oxo-3-quinolincarboxylsyre, 5 ml vandfrit acetonitril, 250 mg (1,67 mmol) 1,8-diazabicyclo[5,4,0]-7-undecen (DBU) og 430 mg (3-(t-butoxycarbonylamino)pyr-

DK 161383 B

24 rolidin. Reaktionsblandingen blev opkoncentreret under reduceret tryk, og man satte ethanol-ether til den derved opnåede inddampningsrest og lod blandingen henstå i 2 dage i et køleskab. Det således opnåede bundfald blev 5 frafiltreret og vasket med ethanol-ether (1:1), og derpå med ether til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (430 mg, 55,3%) i form af et lysegult pulver.

0C(CH ) OH

KBr -1 /33/ 10 IRVmaxcm 1 3300 (-NH-C0), 1710 (C=0, C=0), 1620 (C=0) NMR (6 i CDC13) : 0^0-1^30 (4H, m), Ij45 (9H, s), 1760- 2 f 50 (3H, m), 3^10-3^6 (4H, m), 4,00-4.,60 (IH, m). 7,94 (IH, d, J=13r18 Hz), 8-f86 (IH, s).

15 EKSEMPEL 25 7-(3-amino-l-pyrrolidiny1)-8-chlor-1-cyclopropy1-6-fluor- 1,4-dihydro-4-oxo-3-quinolincarboxylsyre 20

Man opløste 430 mg 7-[3-(t-butoxycarbonylamino)-l-pyrro-lidinyl]-8-chlor-l-cyclopropyl-6-fluor-l,4-dihydro-4-oxo- 3-quinolincarboxylsyre i en blanding af 5 ml methanol og 5 ml koncentreret saltsyre og omrørte ved stuetemperatur 25 i 30 minutter. Til reaktionsblandingen satte man en koncentreret vandig ammoniakopløsning til regulering af pH til 7, og det derved opnåede bundfald blev frafiltreret, vasket successivt med vand og med methanol og omkrystalliseret i en blanding af chloroform-methanol-koncentreret 30 vandig ammoniakopløsning til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (110 mg) i form af et mælkehvidt pulver, smp. 253-258 °C (dekomp.).

Elementæranalyse (%) for C17H17C1F3N03

Beregnet (fundet): C 55,82 (56,09), H 4,68 (4,82), N 11,49 (11,46).

35 25

DK 161383 B

EKSEMPEL 26 7-(3-acetamido-1-pyrrolidlny1)-8-chlor-1-cyclopropy1-6-fluor-1,4-dihydro-4-oxo-3-quinolincarboxylsyre 5

Man opvarmede under tilbagesvaling i 1 time en blanding af 1 g 8-chlor-l-cyclopropyl-6,7-difluor-1,4-dihydro-4-oxo-3-quinolincarboxylsyre, 10 ml vandfrit acetonitril, 0,64 g 3-acetamidopyrrolidin og 0,51 g DBU. Reaktions-10 blandingen blev opkoncentreret under reduceret tryk, og den således opnåede inddampningsrest blev opløst i 20 ml chloroform og vasket med 10 ml 10% vandig citronsyreopløsning. Chloroformlaget blev yderligere vasket med en vandig mættet natriumchloridopløsning, tørret under vand-15 frit natriumsulfat og opkoncentreret under reduceret tryk. Den derved fremkomne inddampningsrest blev omkrystalliseret i methanol til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (1,2 g) i form af lysegule prismer, smp. 210-121 °C.

20

Elementæranalyse (%) for C^gH^gClFN^O^, 1/4 H^O

Beregnet (fundet): C 55,35 (55,39), H 4,77 (4,68), N 10,19 (10,12).

25 EKSEMPEL 27 7-(3-amino-l-pyrrolidinyl)-8-chlor-l-cyclopropyl-6-fluor~ 1,4-dihydro-4-oxo-3-quinolincarboxylsyre 30

Man opvarmede under tilbagesvaling i 5 timer en blanding af 0,8 g 7-(acetamido-l-pyrrolidinyl)-8-chlor-l-cyclopro-pyl-6-fluor-1,4-dihydro-4-oxo-3-quinolincarboxylsyre og 20 ml vand indeholdende 0,8 g natriumhydroxid. Reaktions-35 blandingen blev neutraliseret med eddikesyre, og det derved opnåede bundfald blev opsamlet ved filtrering. Dette bundfald blev vasket med vand, tørret og omkrystalliseret i 26

DK 1.61383 B

i en blanding af methanol-chloroform-koncentreret vandig ammoniakopløsning til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (0,41 g) i form af hvide plader, smp.

238-240 °C (dekomp.) 5

Elementæranalyse (%) for C^H^ClFNgOg, 1/2

Beregnet (fundet): C 54,48 (54,44), H 4,84 (4,78), N 11,21 (11,20).

10 EKSEMPEL 28 7-(3-amino-l-pyrrolidinyl)-8-chlor-l-cyclopropyl-6-fluor- 1,4-dihydro-4-oxo-3-quinolincarboxylsyre 15

Man opvarmede under tilbagesvaling i 1 time en blanding af 0m6 g 8-chlor-l-cyclopropyl-6,7-difluor-l,4-dihydro-4-oxo-3-quinolincarboxylsyre, 6 ml vandfrit acetonitril, 0,35 g 3-aminopyrrolidin og 0,31 g DBU. Derpå tilsatte 20 man yderligere 0,2 g 3-aminopyrrolidin, og man opvarmede under tilbagesvaling i yderligere 2 timer. Efter afkøling blev det således opnåede bundfald opsamlet ved filtrering, opløst i 9 ml vand indeholdende 0,12 g natriumhydroxid og neutraliseret med eddikesyre. Det således 25 opnåede bundfald blev opsamlet ved filtrering og vasket successivt med vand og med acetonitril til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (0,52 g) i form af et farveløst pulver, smp. 237-238 °C (dekomp.).

30 Elementæranalyse (%) for C^H^ClFN^Og, H20

Beregnet (fundet): C 53,20 (52,97), H 4,99 (4,62), N 10,95 (10,83).

35

DK 161383 B

27 EKSEMPEL 29 7-(3-amino-l-pyrrolidinyl)-8-chlor-l-cyclopropyl-6-fluor- 1,4-dihydro-4-oxo-3-quinolincarboxylsyre, hydrochlorid 5

Til en suspension af 100 mg 7-(3-amino-l-pyrrolidinyl)-8-chlor~l-cyclopropyl-6-fluor-l,4-dihydro-4-oxo-3-quinolin-carboxylsyre i 2 ml ethanol satte man 0,2 ml af en etha-nolisk opløsning af hydrogenchlorid (7,0 mmol HCl/ml), 10 hvorpå blandingen blev opkoncentreret. Den derved opnåede inddampningsrest blev omkrystalliseret i methanol til dannelse af den i overskriften nævnte forbindelse (79 mg) i form af lysegule prismer, 263-265 °C (dekomp.).

15 Elementæranalyse (%) for C^H^ClFN^Og, HC1

Beregnet (fundet): C 50,76 (50,50), H 4,51 (4,44), N 10,45 (10,38).

20 Eksperiment 1 Antibakterielt spektrum

Man bestemte værdierne for de minimale inhiberende koncentrationer (MIC) i overensstemmelse med den metode, som er anbefalet af Japan Society of Chemotherapy. De derved 25 opnåede resultater er vist i de følgende tabeller 1 og 2. Forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse viste betydelig kraftig antibakteriel aktivitet overfor anaerobe bakterier og aerobe gram-positive bakterier, som var standardstammer eller klinisk isolerede stammer, i for-30 hold til referenceforbindelserne. I særdeleshed viste forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse fremragende aktivitet overfor Pseudomonas aeruginosa i forhold til referenceforbindelserne.

35

Xn yj-tro antibakteriel aktivitet (standard stammer) i 28

DK 161383 B

Tabel 1-1 5 ----_____- j

Organisme (10^ celler/ml) MIC (^ug/ml)

Gram---r—---i—.........

Eks.25 Ref.l Ref.2 CFLX CI-934

Bacillus subtilis PCI 219__+ 0,025 0,025 0,025 0,05 0r05

Staphylococcus aureus 209 P__+__0,05 0,20 0,10 0,39 0,10 S. aureus IIP 670 (Terajlma)__+__0,05 0,20__0,10__0,39__0,10 S. epldermldls IIP 866__+ 0,05 0,20 0,10 0,39 0,10

Streptococcus pyogenes (S-8)__+__0,05 0,39__0,39__0,39__0,20 S. pyogenes IIP 692_.__+ 0,10 0,78 0,78 0,78 0,39 S. pneumoniae IIP 552__+__0,10 0,78 ' 0,39 1,56 0,39 15 E. faecalis IIP 682__+ 0,10 0,78 0,39 0,78 0,39 ·

Escherichia coll HIHJ JC-2_ <0,006 i.0,006 £o,Q06 i.0,006 0,10 E. co 11 ATCC 10536__ 0,0125 0,0125 0,0125 0,0125 0,10~i

Proteus vulgaris IFO 3167__- 0,0125 ^.0,006 0,0125 =0?006 0,05 i P. airabllis HD 994__0,0125 £o,OQ6 0,0125 0,0125 0^20 !

20 P. morganil IIP 602__ 0,05 . 0,025 0,05 0,05 0,39 I

Klebsiella pneumoniae KY(GN)6445 - 0,0125 0,0125 0,025 0,0125 0,20 K. pneumoniae 1-220S__-__0,05 0^05__0,05__0,05__0^39

Enterobacter cloacae IIP 977__-__0,05 0,025 0,05__0,05 0,78

Citrobacter freundii IIP 975__- 0,0125 0,0125 0,05 =-0,006 0,20

Serratia aarcescens IIP 618__-__0,05 0,10__0,05__0,39__0,39 25 Shigella sonnel IIP 969__0,0125 io,QQ6 0,0125 Ιρ,ΟΟθ 0?10

Salmonella enterltidls IIP 604__- 0,0125 0,0125 0,05__0,025 0,39

Pseudomonas aeruginosa V-l__~__0,20__0,20__0,20__0,20 — P. aeruginosa IFO 12689__y__0,20 0,39__1,56__0,39__6,25

Yersinia enterocolitlca IIP 931__-__0,025 0,025 0,05__0,05__0,39 2q Acinetobacter anitratus IIP 876__-__0,05 0,0125 0,05__0^025 0,39

Alcaligenes faecalis 0104002 1 ~ I 0,05 0,025 0,20 0,39 6,25 35

Tabel 1-2

In vitro antibakteriel aktivitet (standard stammer) 29

DK 161383 B

5 ^ MIC (^ug/ml)

Organisme (10 celler/ml) Gram------

Eks.25 : Ref.I Ref.2 CFLX CI-934

Bacteroldes fragilis GH 7000__0,10__1,56__0^39__3,13__6,25 B. fragllls 0553__ 0,10 0,78 0,39 3,13 3,13 B. fragllls 25285__ 0,10 0,78 0,39 6,25 3,13 B. fragilis 8503_ 0,39__0,78 6;25 6,25 B. thetalotaomicron (0661)__-__0,20__3,13__0,78 25__25__

Fusobacterlum necrophorum $-45__-__0,20__-__0,39__1^56__~ 15 F. varlum KYA 8501__ 0,78 3,13 3r13 12f5 6,25

Eubacterlum lentum GAI 5242__+__0,10__^__0,20 0f78__-

Proplonibacterlum aceris 11828__+__1,56__-__3f13 12,5__~

Peptococcus nagnus KY 017__+__0,05__-__0F20 0?39__-

Clostridium difficile I-E__+__-__-__-__-__3,13 C. perfringens KYA 13123 + 0,10 0,39 0,39 0,39 20 --------’--------- C. ramosum__+__0,78__—__3,13__6^25__—__

Peptostreptococcus anaerobius + 0 "’O - O 78 1 56 - _KYA 27337 _________t

Pst, microns UPI 5464-1__+__0,05__-__0,20 0^20__~

Velllonella parvula KYA 10790_ - 0,05 - 0,20 0,20 - · 25

Ref. 1 : l-cyclopropyl-6,8-difluor-l,4-dihydro-4-oxo-7-(1-piperazlnyl)-3-quinolincarboxylsyre

Ref. 2 : 8-chlor-l-cyclopropyl-6-fluor-l,4-dihydro-7-(3-methyl-l-piperazinyl)-4-oxo-3~quinolincarboxyl-syre CFLX : Ciprofloxacin (l-cyclopropyl-6-fluor-l,4-dihy-dro-4-oxo-7-(1-piperazinyl)-quinolin-3-carboxyl-syre) 35 CI-934 : l-ethyl-7-(3-ethylaminomethyl~l-pyrrolidinyl)- 6,8-difluor-l,4-dihydro-4-oxo-3-quinolincarbo-xylsyre

In vitro antibakteriel aktivitet (kliniske isolater)

Tabel 2 30

DK 161383 B

5 „ . · MIC ( ,ug/ml)

Antal __ / ____

Kliniske isolater - Ref.2 CFLX OFLX NFLX

S. aureus_:21 0,05 0,10 0,39 0^39 1,56 MR-S. aureus :46 0,10 0,39 3,13 1,56 25 1Q ------ S. epidermidls_ ;10 0,05 0,10 0,20 0,39 0,78 S. pyogenes_: 6__0,10__0^39__0,39__1,56__1,56 $. pneunonlae_r 6__0,10__0,78__1,56__3^13 12^ 5 E. faecalls_: 5 0,20 0?73 0^78 3jl3__6,25 N. gonorrhoeae_:16 0f013 0,006 0,025 0?05 0,10 W. meningitidis_; 3__0,006 0^006 0^006 0,025 0,05 B. catarrhalls_:21 0,05 0,05 0,10 0,20 1,56 H, Influenzae_:26 0,013 0^025 0j05 0,10 0,20 E. co 11_:25 0,013 0T025 0,025 0,10 0,10 20 P. pneunonlae_:25 0,05 0,20 0,20 0,78 0,73 E. cloacae_:21__0,013 0,05__0,05__0,10 0,10 S. marcescens_:20 0,05 0,05 0,05 0,20 0,10 P. nirabllls_:10 0,05 0,05 0,05 0,20 0r10 P. vulgaris_; 6 0,05 0,05 0_,05 0,10 0,05 25 M. morganil_: 8 0,025 0,10 0,05 0,10 0,05 G. freuixdii_: 9 0,10 0,20 0,10 0,39 0,39 P. aeruginosa_:27 0,20__1,56__0,39__3, 13__1,56 P, maltophilla_: 9__0,78__1,56 12,5__6,25 25__

Acinatobacter sp._:13 0,10 0,78 1,56 3,13 12,5 30 Alcallgenes sp._: 9 0,78 6,25 6,25 6,25 100

Campylobacter jejuni :20 0,05 0,20 0,20 0,39 0,78

Bacteroldes sp,_:17 0,10 0,39 6,25 3,13 50_ OFLX : Ofloxacin (9-fluor-2,3-dihydro-3-me1:hyl-l0-(4-me-35 thyl-l-piperazinyl)-7-oxo-7H-pyrido[1,2,3,de]-1,4- benzoxazin-6-carboxylsyre) NFLX : Norfloxacin (l-ethyl-6-fluor-l,4-dihydro-4-oxo-7-(1-piperazinyl)-3-quinolincarboxylsyre)

DK 161383 B

31

Eksperiment 2 Hyppigheden a£ spontant resistente mutanter

Hver af de stammer, der skulle afprøves, blev dyrket nat-5 ten over i såkaldt Mueller-Hinton broth (Difco) ved 37 °C, hvorefter 0,1 ml af hver dyrkningsvæske blev podet med 10 ml Mueller-Hinton broth. Efter inkubering ved 37 °C i 6 timer under rystning blev bakteriecellerne indhøstet ved centrifugering ved 3000 omdrejninger pr. minut i 10 15 minutter. Klumperne blev bragt i suspension i 5 ml frisk Mueller-Hinton broth. En portion (0,1 ml) af disse bakterie-suspensioner blev podet på Mueller-Hinton agar indeholdende hver af forbindelserne ved 2, 4 eller 8 gange MIC, og pladerne blev inkuberet ved 37 °C i 48 timer.

15 I den efterfølgende tabel 3 er vist hyppigheden af resistente mutanter over for forbindelsen ifølge opfindelsen eller overfor referenceforbindelserne. Mutations-hyppigheden blev beregnet på følgende måde: Det samlede antal af kolonier, som fremkom på den lægemiddelindeholdende 20 agarplade divideret med det samlede antal levedygtige celler i podningen. Den spontane mutationshyppighed for forbindelsen ifølge opfindelsen var signifikant lavere end værdierne for referenceforbindelserne.

25 30 35

Tabel 3

DK 161383B

32

Hyppigheden af spontant resistente mutanter 5

Stammer Kone. af E'ksempel 25 Ref-2 CFLX

lægemid- __del ' S. aureus 2MIC 2,9 x 10_8 - 3,6 x 10~7 10 -9 -8 -7 209 P 4MIC <2,9 x 10 5T1 x 10 1,3 x 10 S. aureus 2MIC <2^g χ 1Q-9 3?6 χ 1()-7 4?1 x 10~8

Smith E. cloacae 2MIC 6,7 x 10_1° 3,1 x 10~' 1,0 x 10~8 15 i i i IID 977 4 MI C <6,7 * 10~10 <6,7 x 10_1° < 6,,7 * 10_1° S. marcescens 2MIC 1,5 x 10-8 10 x 10~7 4,1 x 10~9 IID 618 4MIC <1T0 x 10_9 <1,0 x 10~9 <1,0 x 10~9 20 c 2MIC 2,3 x 10~7 - 1,2 x 10~7 u S. marcescens * i GN 7577 4MIC <5,3 x 10_1° 9,9 x 10~7 <5,3 x 10_1° 8MIC <5,3 x 10~10 2,1 χ 10~9 <5,3 x 10_1° P- aeruginosa 2MIC 4,5 x 10 8 5,5 x 10 7 1,5 x 10~7 25 IFO 12689 4MIC <6,3 x 10~10 <6,3 x 10_1° 19 x 10~9 --- J “o P. aeruginosa 2MIC <6,7 x 10 7,7 x 10 IFO 1210 4MIC <6,7 x 10~10 <6,7 x 10_1° 7,0 x 10_3 30 35 33

DK 161383 B

Eksperiment 3 In vivo antibakteriel aktivitet overfor systemiske infektioner hos mus

Infektionerne blev fremkaldt ved intraperitoneal injek-5 tion af en suspension af bakteriecellerne. De pågældende forbindelser blev indgivet per os 1 time efter injektionen. Ved hver dosering anvendte man 5 hanmus af samme ICR. Man bestemte den 50% effektive dosis (ED^q), som beskytter 50% af dyrene fra død som følge af infektionen, 10 ud fra forholdet mellem doseringen og overlevelsesprocenten. Effektiviteten af forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse er vist i tabel 4 i sammenligning med effektiviteten for referenceforbindelserne. Forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse var mere effektiv end 15 referenceforbindelserne overfor alle de afprøvede bak terieinfektioner. Den udviste især fremragende effektivitet overfor S. pneumoniae infektion, overfor hvilken referenceforbindelserne var ineffektive.

20 Tabel 4

In vivo antibakteriel aktivitet overfor systemiske infektioner hos mus 25 r—-------- __ED50 __

Fffcbindelse E. coli P. aeruginosa S. aureus S. pneumonia __ME 4707__IIP 1210__Smith__S-4288 30 Eksempel 25.__0^9__2_^9__2,0 13,0 CFLX__Ll5__ij_5__31__> 100 0FLX__2j_l__12 r 1__17__> 100 NFLX__8y 9__18,9_ - > 100 35

DK 161383B

34

Eksperiment 4 Terapeutisk virkning ved en eksperimental lokal infektion med anaerobe bakterier i granuloma poser hos rotter 5 Man sprøjtede subcutant etherbedøvede Wistar hanrotter (7 uger gamle) i ryggen med 20 ml kimfri luft (der var steriliseret ved membranfiltrering, 0,45 um porestørrelse), idet man anvendte en injektionssprøjte. Man indførte kontinuerligt en inflammatorisk reaktion ved indsprøjt-10 ning af 1 ml steril crotonolieopløsning (1% i olivenolie) i den således dannede luftpose. Efter 2 dages forløb blev luften fjernet. På den ottende dag indsprøjtede man 0,5 ml Bacteroides fragilis 2 kultur (10^ CFU/ml) i hullet i granuloma poserne. Hver forbindelse blev indgivet per os 15 eller suncutant 2 timer efter infektionen. For hver lægemiddelgruppe anvendte man 3 dyr pr. eksperiment, og 0, 6 og 24 timer efter indgift af forbindelserne udtog man prøver af exudatet fra poserne for at bestemme antallet af levedygtige bakterier. Under eksperimentet blev føde 20 og vand frit tildelt. De opnåede resultater er vist i tabel 5. Det var kendt, at aktiviteten af de eksisterende quinolincarboxylsyreforbindelser over for obligat anaerobe bakterier var meget svagt. Forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse udviste imidlertid en meget 25 stærkere antibakteriel aktivitet overfor anaerobe bakterier, ikke alene in vitro men også in vivo, end det var tilfældet for de andre quinolincarboxylsyrer. Denne egenskab er ligeledes en af de fremragende karakteristika for forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse. Som det 30 fremgår af tabel 5, viser dette eksperiment, at forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse er mere effektiv end cefoxitin (CFX), clidamycin (CLDM) og metronida-zol (MND), som sædvanligvis anvendes klinisk ved behandlingen af anaerobe infektioner.

35

DK 161383 B

p ----j—— Q) μ * * * * μ * ·χ * ·*< O o tn -h co O r~ >n t, ^ r* r» ^ ^ ^ OJ E O o o o o o o

O -H H

s ε -*-j •C ^ +1 +1 +1 +| +» +1 +1 1-1 Cl !?, io tn n m- C'- <n tn S CTCS1 -s*. - CD ° crv-g-vovoiDcn·^·

O

a —--—- (0 5? * * ·* G - * * o * 0 '^\ o —t in tn o —i ή

C j^gOOOOOOO

1 7! +1 +1 +1 +1 -η -H +1 tT 4-> dj^fMvocrsvoojf'i-· w.

n ^ *^ *- - * *“ ^ ^ 0) ^ VO Μ- Π -<r tn tO 1-0 -Ph-1 0 a> ____ ' ° •H 0 - ^q- JJ o

V CD P

in ω 01 00 c -u vo i-i 0) .il cn f-ι o (d

_i >, ω O« <U

(0 o ε o o u P CD -Η Ό Ό n > -u +1 +1 (D C! H 0 >*

_i o —1 vd E

μ V, ·>- H

m in m 0(¾

μ P

c -—i——,---- -P M

§ St g ....· Ok* •η ουυοο “ μ .... - Ό

Φ a w « c. a (OH

G ,h O

co - ‘N -S

tn Cn Cn Cn tn P

(J) JjC ^j£ Oi Φ .

C cn tn cn tn cn jj ® ^ Ε ε ε ε ε Φ m' Ό 11 m o m o m m ^ Φ ? cm m cn m ^ cm p o" •Hi—I [_t 0

Dl Ε O -η ‘H *3

C <D c-, m C G

-H O' -t-> cm o P ® G ffi C Cm g X I O —H ", 2 g P icrøxr CM G -5,3 ‘ij 9-xqq - μ ^ > f Ct. PI 21 «-4 . μ .5

* £ υ <-> Σ « Q C G

w K · 01 •H UJ CQ H a P __:__ ., Ww W 3 +1

<D

HG ·* * ® <0 * * Λ P ® G 0 fi "

En Eh O *

DK 161383 B

36

Eksperiment 5 Akut toxicitet hos mus

Den akutte toxicitet af forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse blev undersøgt hos hanmus, og hvert 5 lægemiddel blev afprøvet intravenøst. Værdien af LD^q for forbindelsen ifølge opfindelsen er omtrent den samme som værdien for forbindelsen ciprofloxacin.

Tabel 6 10

Akut toxicitet hos mus

Forbindelse LD^q (m9/kg) 15 Eksempel 25__242 (221-279) CFLX__231 (212-255)

Eksperiment 6 Subakut toxicitet hos hund 20

Man gennemførte undersøgelsen af den subakutte toxicitet for forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse i hunde af racen beagle (10 uger gamle, n=3). Man indgav til dyrene per os i 8 dage 20 mg/kg/dag af forbindelsen 25 ifølge den foreliggende opfindelse og derefter 50 mg/kg/dag i 7 dage.

Man iagttog ingen bemærkelsesværdige ændringer i legemsvægt og i almentilstanden, og man iagttog heller ikke no-30 gen abnormalitet med hensyn til den hematologiske undersøgelse og serum-biokemisk analyse.

35 37

DK 161383 B

Eksperiment 7 Absorption, ekskretion og metabolisme hos dyr 1) Rotter 5

Man indgav per os til rotter forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse og ciprofloxacin, hver med en dosis på 10 mg/kg, hvorpå der blev udtaget prøver af blodet på den indikerede tid efter indgift. Koncentratio-10 nerne af lægemidlet i serum blev målt ved biologisk måling. Ekskretionen gennem urinen og fra galden blev ligeledes bestemt ved biologisk måling. De opnåede resultater er vist på fig. 1 og i eksempel 7. Serumniveauerne for forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse var tre 15 gange højere end for ciprofloxacin. På tilsvarende måde var de genfundne værdier i urinen og galdevæsken af forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse ligeledes henholdsvis 2, 4 og 7 gange højere end værdierne for ciprofloxacin.

20

Tabel 7

Ekskretion gennem urin og galde (rotter, 10 mg/kg, p.o,) 25 [7 ; r ; " — ~ forbindelse Ekskretionshastighed % af dosis __Urin_Galde_

Eksempel 25 21,7 13,4 CELX 8,9 1,9 30 0-24 timer 2) Hunde

Man indgav til hunde af racen beagle per os og intrave-35 nøst en dosis på 2 mg af forbindelsen af den foreliggende opfindelse, og man målte niveauerne i serum ved hjælp af HPLC (High-performance liquid chromatography). Det opnåe- DK 161383 B , 38 de resultat er vist på fig. 2. Serumniveauerne for forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse ved den perorale vej var omtrent lige så store som dem, der opnås ved intravenøst indgift, hvilket antyder den fremragende 5 orale absorption af forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse. En undersøgelse af metabolitterne i urin indikerer, at den foreliggende forbindelse næppe metabo-liseres.

10 Eksperiment 8 Afprøvning af mutagenicitet

Ved antibakterielle midler er en afprøvning af mutageni-citeten under anvendelse af bakterier i nogen grad vanskelig på grund af midlernes aktivitet på de bakterier, 15 der bruges til afprøvningen. For at bedømme de mutage-niske aktiviteter ved højere koncentration udvalgte man derfor en stamme, der viste sig resistent overfor de afprøvede midler, og som ligeledes opretholdt egenskaberne knyttet til stamforbindelsen blandt afprøvnings-20 stammerne. Under anvendelse af denne resistente afprøvningsstamme var det muligt at undersøge en 10 gange højere koncentration i sammenligning med, hvad der var muligt med udgangsstammen.

25 Når man gennemførte omvendt mutationsundersøgelse under anvendelse af den nalidixinsyre-resistente Salmonella typhimurium TA98 stamme (nal ) med forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse og med ciprofloxacin indenfor de målelige koncentrationer, med eller uden lægemidlets 30 metaboliske aktivering, indførte man ciprofloxacin 2 gange His+ revertante kolonier i sammenligning med opløsningsmiddelkontrollen; men forbindelsen ifølge den foreliggende opfindelse udviste ingen forhøjelse af His+ revertante kolonier i sammenligning med kontrollen (tabel 35 8). Disse resultater antyder, at forbindelsen ciprofloxa cin kunne have en svag mutagenicitet.

39

DK 161383 B

Tabel 8

Mutagenisk aktivitet i S. typhimurium 5 _____ _TA9 8 (na1Γ )__

/ ! j rn „;w Eksempel 25 CFLX

yug/plade bv-mix —---1-— __His revertanter pr. plade_

Kontrol - 27 27 10 0,001 0,005 - 28 0,01 - 29 0,05 - 26 28 0,1 - 16* 44 15 0,5 - 0* 47 1.0 - 55 5.0 - 0* 0,2 (4NQQ1)) - 190 190 20___

Kontrol + 49 49 0,001 + 0,005 + 60 0,01 + 48 25 1 0,05 + 39* 47 0,1 + 6* 76 0,5 + 0* 103 1,0 + 30* __ 5,0 + 0* 0;5 (2AA1*) + 277 277 * : Baggrundsvæksten var inhiberet 35 1) : 4-nitroquinolin-l-oxid : 2-aminoanthracen

Claims

1. Quinolincarboxylsyre-derivat, kendetegnet 5 ved, at det er en forbindelse med formlen 0 F/NArcooH ΗαΝγ^ L 1 U »>

10 U α A eller hydrater, farmaceutisk acceptable syreadditionssalte eller alkalimetalsalte af denne forbindelse. 15

2. Fremgangsmåde til fremstilling af et quinolincarboxyl-syrederivat med formlen 0 20 u T 3 (I) 25 eller hydrater, farmaceutisk acceptable syreadditionssalte eller alkalimetalsalte af forbindelsen med formlen I ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man kondenserer en forbindelse med formlen: 30 0 r y^AsrCOOR. (II) f η ϋ

35. A hvori R betegner et hydrogenatom eller en lavere alkyl- DK 161383 B gruppe og X er et halogenatom, med en forbindelse med formlen: 5 £ \ (III) NH 1 2 hvori R og R hver for sig betegner et hydrogenatom 10 eller en amino-beskyttende gruppe eller tilsammen udgør en amino-beskyttende gruppe, hvorefter det kondenserede 1 2 reaktionsprodukt, når mindst en af grupperne R og R er en amino-beskyttende gruppe, underkastes en fjernelse af den amino-beskyttende gruppe, eller det kondenserede pro-15 dukt, dersom R er en lavere alkylgruppe, behandles ved hydrolyse til dannelse af den tilsvarende carboxylsyre-forbindelse, hvorpå man om ønsket omdanner en opnået forbindelse til hydrater eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte eller alkalimetalsalte deraf. 20

3. Farmaceutisk præparat men antibakteriel virkning, kendetegnet ved, at det indeholder et quinolin-carboxylsyre-derivat ifølge krav 1 og et inert, farmaceutisk acceptabelt bærestof. 25 30 35