FI85698C

FI85698C - Foerfarande foer framstaellning av ett farmaceutiskt aktivt kinolonkarbonsyraderivat.

Info

Publication number: FI85698C
Application number: FI860950A
Authority: FI
Inventors: Tsutomu Irikura; Seigo Suzue; Satoshi Murayama; Keiji Hirai; Takayoshi Ishizaki
Original assignee: Kyorin Seiyaku Kk
Priority date: 1985-03-08
Filing date: 1986-03-06
Publication date: 1992-05-25
Also published as: DK103986A; MX162668A; CN1012613B; FI85698B; KR930011036B1; NO165071B; NO165071C; DK103986D0; FI860950L; CN86102363A; AU5427286A; NO860870L; FI860950A0; PT82153B; PT82153A; DK161383B; ES552802A0; HUT40639A; DK161383C; KR860007249A

Description

85698

Menetelmä farmaseuttisesti aktiivisen kinolonikarboksyyli-happojohdannaisen valmistamiseksi

Esillä oleva keksintö koskee menetelmää uuden farmaseuttisesti aktiivisen kinolonikarboksyylihappojohdannaisen valmistamiseksi, jonka kaava on I

0

Yj “A

tai sen hydraattien tai suolojen valmistamiseksi, joilla yhdisteillä on käyttöä bakteereja hävittävänä aineena.

Yhdisteellä, jota esittää kaava I, on optisia isomeerejä johtuen aminopyrrolidiinirenkaan asymmetrisestä hiiliatomista, 7-substituentista. Mutta kaikkia optisia isomeerejä ja niiden seosta esitetään mukavuussyistä yhdellä ainoalla kaavalla. Keksinnön piiri ei siis ole rajoittunut yhteen optiseen isomeeriin tai niiden seokseen.

Kinolonikarboksyylihapon kehittely bakteereja hävittäväksi aineeksi alkoi nalidiksiinihaposta ja sitä on kehitetty piromidiinihapoksi ja edelleen pipemidiinihapoksi. Niitä voidaan käyttää lääkehoitoon virtsatieinfektioissa aerobisten gram-negatiivisten bakteereiden hävittämiseksi.

Norfloksasiinillä, joka on kehitetty hiljattain, on voimakas bakteereja hävittävä vaikutus paitsi gram-negatiivisiin bakteereihin myös gram-positiivisiin bakteereihin nähden. Lisäksi sen vaikutus on äärettömän paljon voimakkaampi kuin aikaisemmilla kinolonikarboksyylihapoilla. Norfloksasiini merkitsi käänteentekevää edistystä tällä alalla ja sitä on käytetty kliinisesti hyvin paljon viime aikoina.

2 85598

Myöhemmät kinolonikarboksyylihapot kuten ofloksasiini, cipro-floksasiini ja CI-934, joissa on samankaltaisia substituent-teja kuin norfloksasiinillä, ovat jatkuvan kehittelyn tulosta. CI-934:llä on voimakkaampi vaikutus gram-positiivisiin bakteereihin nähden.

Ciprofloksasiin in bakteereja hävittävä vaikutus on voimakkaampi kuin norfloksasiinillä. Mutta sen antibakteerinen voimakkuus gram-positiivisiin bakteereihin nähden on selvästi heikompi kuin gram-negatiivisiin bakteereihin nähden. CI-934:n antibakteerinen vaikutus gram-positiivisiin bakteereihin nähden on hieman voimakkaampi, mutta gram-negatiivisiin bakteereihin nähden heikompi.

Mutta toisaalta ovat lisääntyneet β-laktaamiantibiootti-resis-tentit gram-positiiviset bakteerit kuten metisilliini- ja kefalosporiini-resistentit Staphylococcus aureus, S. epider-malis, Enterococcus faecalis, antaneet huolen aihetta kliinisellä kentällä.

Lisäksi on osoitettu, että ihon ja limakalvon vakioanaerobit vaikuttivat kuten jonkin otollisen infektion patogeeni johtuen anaerobien tarkastuksen yleistymisestä kliinisen testiteknii-kan kehittymisen myötä. Anaerobeja on ilmoitettu löydetyn aerobisten bakteerien kanssa tai ilman 50-80 % hengitystiehyei-den infektioissa, intraperitoneaalisissa infektioissa, krooni-• . sessa välikorvan tulehduksessa, paranasaalisessa sinusiitissä ja obstetrisissä ja gynegologisissa infektioissa, ja anaerobien kombinaatioaste Escherichia colin, Enterococcus faecaliksen ja muiden streptokokkien kanssa on noin 95 %. Anaerobien vähitellen tapahtuva resistenssiasteen kasvaminen β-laktaamianti-bioottien tai klindamysiinin suhteen, jotka ovat luontaisesti tehokkaita anaerobeja vastaan, on aiheuttanut vakavan pulman kemoterapeuttisten aineiden valinnan kohdalla.

Mykoplasma on tunnettu patogeeni hengitystiehyeiden infektioissa, meningiitissä, endokardiitissä, artriitissa ym. Mycoplas-man aiheuttamiin infektioihin käytetään tavallisesti tetrasyk-liinejä tai makrolidejä, mutta viime vuosina ovat jotkut myko- 3 85698 plasmat tulleet erittäin resistenteiksi näille lääkkeille, erikoisesti makrolideille. Tämän vuoksi tulee tulevaisuudessa olemaan vaikeuksia kemoterapiassa.

Chlamydia, Ureaplasma ja Gardneralla vaginalis ovat hiljattain olleet pohdinnan kohteina sukupuoli-infektioiden patogeenien ominaisuudessa. Myös näille bakteereille tarvitaan uutta tehokasta lääkettä.

Tältä taustalta on syntynyt uusien, voimakkaammin vaikuttavien ja laajemman spektrin omaavien antimikrobisten aineiden kehittämisen tarve.

Norfloksasiinin keksiminen täydensi nykypäivän runsasta anti-bakteeristen kinolonien runsautta ja sen vaikutustapaa on tutkittu. Tutkimusten tuloksena on keksitty, että kinolonien vaikutuksen kohteena oli DNA-gyraasi, joka kontrolloi kaksois-kierteisten DNA-säikeiden topologiaa.

Lisäksi havaittiin, että kinolonikarboksyylihappojen bakteereja hävittävä vaikutus oli selvästi yhteydessä bakteerimembraa-nin läpäisyyn, erikoisesti huokosiksi kutsutun osan läpäisyyn. Näihin tietoihin perustuen käsitys uusista kinoliineista vakiinnutettiin seuraaviin kohtiin: 1) Ne vaikuttavat DNA-gyraasiinf 2) niillä on hyvä läpäisykyky ulompien membraanien, erikoisesti huokosten läpi, 3) ne ovat ehdottoman varmasti tehokkaita gram-positiivisien bakteereiden suhteen, erikoisesti staphylococcibakteerien suhteen f 4) ne eivät vähennä vaikutusta gram-negatiivisten bakteereiden suhteen, 5) ne vaikuttavat voimakkaasti Serratia sp. ja Pseudomonas aeruginosaa vastaan, jotka ovat resistenttejä muihin mikrobeja ..... hävittäviin aineisiin nähden, 6) ne vaikuttavat anaerobisiin bakteereihin, 7) ne absorboituvat hyvin, eivätkä metabolisoidu helposti 4 8 5 ί 9 8 8) niillä on erinomainen tuottavuus, 9) ne ovat erittäin selektiivisesti toksisia, eikä niillä ole haitallista sivuvaikutusta elollisiin olentoihin.

Tällaisina yhdisteinä, jotka vastaisivat näitä käsityksiä, erikoisesti kohtaa 9), ainakin lähelle sitä, on valmistettu synteettisesti uusia yhdisteitä, joita esittää kaava I ja kyseessä oleva keksintö on näiden tutkimusten tulosta, jotka ovat kohdistuneet myös sen vaikutustapaan.

Tutkittujen yhdisteiden erikoispiirteenä on, että niiden kemiallisessa rakenteessa on fluoriatomi asennossa 6, kloori-atomi asennossa 8 ja 3-aminopyrrolidinyyliryhmä asennossa 7 kinolonikarboksyylihapon rungossa.

Aikaisemmin keksittiin norf loksasiini, johon oli. tuotu fluoriatomi asentoon 6 kinolonikarboksyylihapon rungossa. Koska norfloksasiinin on todettu olevan hyvin käyttökelpoista bakteeri-infektioiden hoitamisessa kliinisesti, on tämän luokan bakteereja hävittäviä aineita tutkittu innokkaasti sekä kotimaassa että ulkomailla ja tuloksena on ollut käänteentekevää edistymistä uusien kinolonien eli fluorokinolonien muodossa.

Väsymättömien tutkimusten tuloksena on sen jälkeen havaittu, että myös substituentilla asennossa 8 on erittäin tärkeä merkitys antibakteerisen spektrin laajentamisessa, vaikutuksen voimistumisessa ja lääkkeen oraalisessa absorboitumisessa.

Useita substituentteja tuotiin asentoon 8 ja näitä yhdisteitä analysoitiin käyttäen tekniikkaa kuten kvantitatiivista rakenteen ja vaikutuksen yhteyttä. Tultiin siihen johtopäätökseen, että klooriatomi on aivan yllättäen optimaalinen substituent-tina asennossa 8.

Lopuksi kehitettiin sarja yhdisteitä, joissa oli fluoriatomi asennossa 6 ja klooriatomi asennossa 8, kuten edellä on esitetty. Yhdisteen 8-kloori-1-syklopropyyli-6-fluori-1,4-dihydro- 5 85698 7-(3-metyyli-l-piperatsinyyli)-4-okso-3-kinoliinikarboksyy-lihapon (vertailuyhdiste 2, kuvattu EP-A-0 167 763:ssa) katsottiin erikoisesti olevan yksi parhaita yhdisteitä kinolonikarboksyylihappojohdannaisten joukosta johtuen sen laajasta ja voimakkaasta bakteereja hävittävästä vaikutuksesta.

Ikävä kyllä huomattiin, että tällä yhdisteellä oli tiettyjä haittoja ihmislääkkeenä kliinisesti käytettäessä. Esimerkiksi havaittiin voimakasta oksentamista ja nykivää kouristusta, kun sitä annettiin oraalisesti useamman kerran koiralle, mikä viittasi sivuvaikutukseen keskushermostosysteemiin.

Selvä GPT:n nousu ja TTT:n aleneminen tässä testissä näyttivät lisäksi liittyvän läheisesti tämän yhdisteen hepatoksi-suuteen. Edellä mainitut tulokset viittasivat siihen, että saattaisi olla mahdotonta käyttää sitä ihmisille.

Tähän tutkimukseen perustuen jatkettiin sellaisten lääkkeiden etsimistä, joilla olisi voimakkaampi bakteereja hävittävä vaikutus ja jotka olisivat turvallisempia, ja tällöin toteutettiin tämä keksintö.

Oli yllättävää, että keksinnön mukaisella yhdisteellä oli paljon voimakkaampi bakteereja hävittävä vaikutus anaerobisia bakteereja Mycoplasma, Ureaplasma, Chlamydia ja Gardne-rella vaginalis vastaan, joiden suhteen kaikki vanhemmat kinolonikarboksyylihapot olivat heikommin vaikuttavia tai eivät vaikuttaneet lainkaan. Lisäksi tämän yhdisteen etuna oli alhaisempi bakteerien mutaatiofrekvenssi. Havaittiin, että eläimillä yhdiste absorboitui hyvin oraalisesti, jakautui erinomaisesti kudoksessa, sen biologinen stabiilisuus ja sen sieto olivat tyydyttävät.

Kaavan I mukainen yhdiste voidaan keksinnön mukaisesti valmistaa siten, että kondensoidaan yhdiste, jonka kaava on II

6 8 5 £ 9 8 0 COOR 11 ,w

"A

jossa R on vetyatomi tai alempi alkyyliryhmä ja X on halo-geeniatomi, yhdisteen kanssa, jonka kaava on III

R1

'"'N

R2^"" ^^

NH III

1 _/ jossa ja R2 merkitsevät kumpikin itsenäisesti vetyatomia tai aminoryhmän suojaryhmää, tai muodostavat yhdessä amino-ryhmän suojaryhmän; ja, kun molemmat tai jompikumpi ryhmistä R* ja R2 ovat aminoryhmän suojaryhmä, kondensoidusta tuotteesta poistetaan suojaryhmä aminojohdannaisen muodostamiseksi ja, kun R on alempi alkyyliryhmä, kondensoitu tuote saippuoidaan karboksyylihappojohdannaisen muodostamiseksi.

Seuraavassa on selostus keksinnön mukaisen yhdisteen valmistusmenetelmästä .

7 85698 j?

T if if N

JL Jl U nh -i.

X^A (II) L/

Cl (III) Ί S . 0

Rr^VV00R cooh ·· «?„ - Viv - joissa kaavoissa R on vetyatomi tai alempi alkyyliryhmä, 1 2 R ja R merkitsevät kumpikin itsenäisesti vetyatomia tai amino-ryhmän suojaryhmää, tai ne muodostavat yhdessä aminoryhmän suoja- ryhmän, ja X on halogeeniatomi.

Kun annetaan kaavan (II) avulla esitettyjen yhdisteiden reagoida amiinien kanssa, joita esitetään kaavalla (lii), voidaan syntetisoida keksinnön mukainen yhdiste, jota esitetään kaavan I avulla.

Mutta siinä tapauksessa, että yhdisteissä molemmat tai jompikumpi ... 1 2 R tai R ovat aminoryhmän suojaryhmiä kaavassa (III) , esimerkiksi . : 1 2 ... R on vetyatomi ja R on alempi asyyliryhmä, esimerkiksi ase- tyyliryhmä, propionyyliryhmä ym., alempi alkoksikarbonyyliryhmä, esimerkiksi metoksikarbonyyliryhmä, etoksikarbonyyliryhmä, t- 12 butoksikarbonyyliryhmä ym., tai R ja R muodostavat ftaloyyli- V. ryhmän yhdessä, tuloksena olevista kaavan (I1) mukaisista yhdisteistä poistetaan suojaryhmä tavanmukaisen menetelmän avulla, jolloin saadaan keksinnön mukaisia yhdisteitä. Siinä tapauksessa, että yhdisteissä merkitsee R kaavassa (II) alkyyliryhmää, reaktion tuloksena olevat yhdisteet, joita esittää kaava (III), hydrolysoidaan tunnetun menetelmän avulla ja esteri muutetaan karboksyylihapoksi, jolloin saadaan keksinnön mukainen yhdiste. Kaavan (II) mukaisten yhdisteiden reaktio kaavan (III) mukaisten yhdisteiden kanssan suoritetaan etupäässä kuumentamalla seosta jossakin liuottimessa kuten vedessä, alkoholeissa, ase-tonitriilissä, dimetyyliformamidissa (DMF), dimetyylisulfoksi- s 85698 dissa (DMSO), heksametyylifosfori-triamidissa, pyridiinissä, pikoliinissa ym., tai ilman liuotinta. Reaktiolämpötila valitaan sopivasti huoneenlämpötilan ja 200°C väliltä, etupäässä se on välillä huoneenlämmöstä 160°C:een. Kaavan (II) mukaisten yhdisteiden annetaan reagoida 1-5 kertaisen mooli-määrän kanssa kaavan (III) mukaisia yhdisteitä yhdestä tunnista useaan tuntiin huoneenlämmöstä 160°C:een välillä 2-10 kertaisen volyymimäärän kanssa edellä mainittuja liuottimia. Tällöin on edullista käyttää happoa sitovia aineita kuten tri-etyyliamiinia, diatsabisyklo-emäksiä ja kaliumkarbonaattia. Kaavan (I') mukaisia yhdisteitä, silloin kun kaavassa (I) R merkitsee alempaa alkyyli, voidaan hydrolysoida tavanmukaisen menetelmän mukaisesti. Tällainen hydrolyysi voidaan suorittaa helposti alkalien kuten kaliumhydroksidin, tai happojen kuten rikkihapon avulla huoneenlämmöstä liuottimien kiehumapistee-seen saakka vedessä, veden ja alkoholien seoksessa, veden ja etikkahapon seoksessa ym.

Kaavan (II) mukaiset lähtöaineet ovat myös uusia ja niitä saadaan seuraavien menetelmien avulla.

9 S5c'58

/K

^ (N. p •w o <u

° yz -S

i \ a o Z-/v A-u. w z y4T t o \_ / \ a V i ^ X v * O Y i ~ 1 c o ΓΛ Ä X Li.

V- ° s

oi I

I )=V *« u- 1 % z ' (ti *=V 1_1_

^ ^ V

1 - o < / \ z *=* u_ 1 4>*. °r_ 4\ ' o o ^ * O o f Z ^ Y )=\ o IK" 1_ Z ^ LL. /===\ ^ __, 4; \_( ° o=< z-< f Hs «* *=v / \ OOO U- U.

10 85528 +->

UJ

O

A O +-> _ o uj o=o "M" S °>v . ° u_-(, Λ-u.

>< U- O

f /-\ «* LL.

s "m" ° r «v LL.

2 °

°v ί S

_ I >, - -f o ° - O o /Vo ^fr y — O LL «v 11 2 ** i "f St

o O O X

^ υ — +-· ·μ i x z: t 2 uj uj 0=0"

O O o I

u O O 0=0 e -fr Y *fr 2 ^ U_ 0=0 «y u> ; “f -fr “r ^ ^ ^ Li.

o o o 11 85698

Kaavan (I) mukaisia yhdisteitä voidaan myös muuttaa, mikäli niin halutaan, farmaseuttisesti sopiviksi ammoniumsuoloiksi tai karboksyylihapon metallisuoloiksi käsittelemällä hapon tai alkalin avulla. Happo voi olla orgaaninen tai epäorgaaninen happo kuten esimerkiksi kloorivety-, rikki-, fosfori-, etikka-, metaanisulfoni-, oksaali- tai maitohappo. Karboksyylihapon metallisuolat voivat olla esimerkiksi natrium-, kalium-, magnesium-, kalsium-, alumiini-, cerium-, kromi-koboltti-, kupari-, rauta-, sinkki-, platina- ja hopeasuoloja.

Kaavan (I) mukaista yhdistettä, sen hydraatteja ja suoloja voidaan käyttää lääkkeinä farmaseuttisten valmisteiden tavanmukaisessa muodossa, jotka voivat olla esimerkiksi tabletteja, kapseleita, jauhetta, voiteita, peräpuikkoja, ruiskeita tai silmätippoja, jotka soveltuvat annettaviksi per-oraalisesti, parenteraalisesti, enteraalisesti tai paikallisesti.

Seuraavat esimerkit valaisevat tätä keksintöä lisää ilman sen rajoittamista niihin.

Esimerkki 1 N-(3-kloori-4-fluorifenyyli)-asetamidi 3-kloori-4-fluorianiliiniin (100 g) lisättiin hitaasti etikka-happoanhydridiä (200 ml). Annettiin seisoa 30 min ja kaadettiin sitten reaktioseos veteen (1 litra). Saatu sakka koottiin suodattamalla ja kiteytettiin uudelleen vesipitoisesta etanolista, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (119,4 g), s.p. 118-119°C.

Esimerkki 2 N-(3-kloori-4-fluori-6-nitrofenyyli)-asetamidi

Liuokseen, jossa oli N-(3-kloori-4-fluorifenyyli)-asetamidia (55 g) kons.rikkihapossa (165 ml) lisättiin pisaroittain konsentroitua typpihappoa (d 1,42, 154 ml) lämpötilassa 5-10°C yhden tunnin aikana sekoittaen jää-suola-hauteessa. Sekoitettiin tunti samassa lämpötilassa ja kaadettiin reaktioseos jääveteen. Syntynyt sakka otettiin talteen suodattamalla, pestiin riittävästi vedellä ja kiteytettiin uudelleen asetonitriilistä, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (48,9 g) keltaisina neulasina, s.p. 114-115°C.

1? 85598

Analyysi (%) CgHgClFN203:lle, laskettu (saatu): C 41,31 (41,48); H 2,60 (2,52); N 12,04 (12,13) .

Esimerkki 3 3-kloori-4-fluori-6-nitroaniliini

Liuosta, jossa oli N-(3-kloori-4-fluori-6-nitrofenyyli)-aset-amidia (30 g) konsentroidussa kloorivetyhapossa (50 ml) ja etanolissa (200 ml) kuumennettiin refluksoiden 2,5 h ajan. Reaktioseokseen lisättiin jäävettä (300 ml) ja saatu sakka otettiin talteen suodattamalla, pestiin vedellä ja kuivattiin, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (24,9 g) keltaisina neulasina, s.p. 149,5-150°C.

Analyysi (%) C6H4ClFN2C>2: lie, laskettu (saatu): C 37,82 (37,85); H 2,11 (2,03); N 14,70 (14,80).

Esimerkki 4 2,3-dikloori-4-fluori-6-nitroaniliini

Liuokseen, jossa oli 3-kloori-4-fluori-6-nitroaniliinia (14,3 g) etikkahapossa (150 ml) annettiin kuplia kloorikaasun lämpötilassa 18-20°C 70 min ajan. Reaktioseos kaadettiin jääveteen (300 ml) ja syntynyt sakka otettiin talteen suodattamalla, pestiin vedellä ja kiteytettiin uudelleen etanolista, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (14,33 g) keltaisina neulasina, s.p. 161°C.

Analyysi (%) :lie laskettu (saatu): C 32,03 (32,17); H 1 ,34 (1 ,26); N 1 2,45 (1 2,65) .

Esimerkki 5 2,3,4-trikloori-5-fluorinitrobentseeni

Seokseen, jossa oli vedetöntä kuparikloridia (13,58 g) ja t-butyylinitriittiä (12,4 g) vedettömässä asetonitriilissä (100 ml) lisättiin pienin annoksin 2,3-dikloori-4-fluori-6-nitroanilii-nia (18,05 g) lämpötilassa 60-62°C 30 min kuluessa. Sekoitettiin 30 min lämpötilassa 60-65°C ja kaadettiin reaktioseos jäähdytettyyn, 10-prosenttiseksi laimennettuun kloorivetyhappoon (300 ml) ja uutettiin bentseenin kanssa. Orgaaninen kerros pestiin peräkkäin laimennetulla kloorivetyhapolla ja vedellä, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä ja konsentroitiin.

13 8 5 £ S 8

Saatu jäännös puhdistettiin tislaamalla, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (17,26 g), k.p. 137-142°C/27 mm Hg.

NMR (6 CDC13:ssa) 7,65 (d, J=7,5 Hz).

Esimerkki 6 3-kloori-2,4,5-trifluorinitrobentseeni

Kaliumfluoridin (64,9 g) suspensioon vedettömässä dimetyyli-sulfoksidissa (230 ml) lisättiin 2,3,4-trikloori-5-fluori-nitrobentsconiä (54,4 g) 140°C:ssa ja sekoitettiin samassa lämpötilassa 10 min. Reaktioseos kaadettiin jääveteen (700 ml) ja uutettiin petrolieetterillä. Orgaaninen kerros pestiin peräkkäin vedellä, kaliumkarbonaatin vesiliuoksella ja sitten vedellä, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä ja konsentroitiin. Saatu jäännös tislattiin ja saatiin otsakkeen yhdistettä (9,7 g), k.p. 95-108°C/30 mm Hg.

NMR (6 CDCl3:ssa) 7,94 (ddd, J=6,7, 7,6, 9,0 Hz)

Esimerkki 7 3-kloori-2-syklopropyyliamino-4,5-difluori- nitrobentseeni

Liuos, jossa oli syklopropyyliamiinia (2,8 g) ja trietyyli-amiinia (5,1 g) vedettömässä tolueenissa (20 ml) lisättiin pisaroittain 3-kloori-2,4,5-trifluorinitrobentseenin (9,7 g) liuokseen vedettömässä tolueenissa (30 ml) 3-5°C:ssa 40 min aikana sekoittaen. Sekoitettiin vielä 3 h samassa lämpötilassa ja kaadettiin reaktioseos sitten jääveteen (150 ml) ja uutettiin dikloorimetaanilla. Orgaaninen kerros pestiin vedellä, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä ja konsentroitiin. Saatu jäännös puhdistettiin silikageeli-kromatografiän avulla käyttäen n-heksaani-dikloorimetaania eluenttina, ja saatiin otsakkeen yhdistettä (4,4 g) punaisena öljynä.

f 11 NMR ((S CDCl 3: ssa) , 0,5-1,0 (4H, m,-'-^[_l| ), 3,0-3,2 (1H, m, ), 7,19 (1H, 2, NH) , 7,85 (1H, dd, J=8,2, 9,9 Hz, 5-H) .

14 8 5 £98

Esimerkki 8 N-(2-kloori-3,4-difluori-6-nitrofenyyli)- N-syklopropyyliasetamidi 3-kloori-2-syklopropyyliamino-4,5-difluorinitrobentseeniin (4,4 g) lisättiin asetanhydridiä (15 ml) yhdellä kertaa ja seosta sekoitettiin 30 min huoneenlämmössä ja kaadettiin sitten jääveteen (100 ml). Ylimäärä asetanhydridiä hajotettiin kaliumkarbonaattijauheen avulla ja seoksen annettiin sitten seisoa yli yön 5°C:ssa. Saatu sakka otettiin talteen suodattamalla ja uudelleenkiteytettiin etyyliasetaatti-n-hek-saanista, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (2,7 g), s.p. 98-99,5°C.

Analyysi (%) ^ :lle, laskettu (saatu): C 45,46 (45,56); H 3,12 (3,00); N 9,64 (9,69).

Esimerkki 9 N-(2-kloori-3,4-difluorifenyyli)-N-syklo- propyyliasetamidi

Seosta, jossa oli N-(2-kloori-3,4-difluori-6-nitrofenyyli)-N-syklopropyyliasetamidia (2,7 g) ja 10 % palladium-hiiltä (0,5 g) etanolissa (50 ml) hydrattiin 40 min ajan 2-3°C:ssa atmosfäärin paineessa jäähauteessa. Katalysaattori suodatettiin erilleen ja suodos konsentroitiin. Saatu kiteinen jäännös kuivattiin sitten vakuumissa huoneenlämmössä 10 h. Tämän jäännöksen liuosta vedettömässä dimetyyliformamidissa (15 ml) lisättiin tipoittain t-butyylinitriitin liuokseen (1,72 g) vedettömässä dimetyyliformamidissa (10 ml) 50-52°C:ssa 13 min ajan. Reaktioseosta sekoitettiin samassa lämpötilassa 5 min, kaadettiin sitten jääveteen ja uutettiin eetterillä. Orgaaninen kerros pestiin peräkkäin vedellä, laimennetulla kloori-vetyhapolla ja vedellä, kuivattiin vedettömän natriumsulfaa-tin päällä ja konsentroitiin. Saatu jäännös puhdistettiin si-likageelikromatografiän avulla käyttäen n-heksaani-etyyli-asetaattia eluenttina ja kiteytettiin uudelleen petrolieette-ristä ja saatiin otsakkeen yhdistettä (0,44 g), s.p. 60,5-61,5°C.

Analyysi (%) QClF2NO:lle, laskettu (saatu): C 53,78 (53,87); H 4,10 (4,02) ; N 5,70 (5,78) .

is 8 5 698

Esimerkki 10 N-syklopropyyli-2-kloori-3,4-difluorianiliini

Liuosta, jossa oli N-(2-kloori-3,4-difluorifenyyli)-N-syklo-propyyliasetamidia (0,44 g) 20-prosenttisessa laimennetussa kloorivetyhapossa (7 ml) kuumennettiin 80-100°C:ssa 6 h ajan sekoittaen ja jäähdytettiin sitten. Reaktioseos kaadettiin jääveteen, tehtiin alkaliseksi natriumhydroksidin vesiliuoksella ja uutettiin eetterillä. Eetterikerros pestiin vedellä, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä ja konsentroitiin. Saatu jäännös puhdistettiin silikageelikromatografiän avulla käyttäen petrolieetteriä eluenttina, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (100 mg) oranssin värisenä öljynä.

Esimerkki 11 Etyyli-8-kloori-1-syklopropyyli-6,7-difluori- 1,4-dihydro-4-okso-3-kinoliinikarboksylaatti

Seosta, jossa oli N-syklopropyyli-2-kloori-3,4-difluorianilii-nia (100 mg) ja dietyyli-etoksimetyleenimalonaattia (100 mg), sekoitettiin 10,5 h ajan 100-135°C:ssa poistaen muodostunut etanoli virtaavan typpikaasun avulla ja sen jälkeen jäähdytettiin. Joukkoon sekoitettiin polyfosforihappoa (1 g) ja seosta sekoitettiin 3 h 125-135°C:ssa. Jäähdytettiin ja kaadettiin reaktioseos jääveteen, uutettiin kloroformin avulla. Orgaaninen kerros pestiin peräkkäin kaliumkarbonaatin vesiliuoksella ja vedellä, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä ja konsentroitiin sitten. Saatu jäännös puhdistettiin silikageeli-ohutlevykromatografiän avulla käyttäen eetteriä eluenttina, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (11 mg) värittöminä neulasina, s.p. 160-162,5°C.

<H

NMR (δ CDC13), 1,0-1,5 (4H, m, ), 1,40 (3H, t, J=7,0

H

Hz, -CH3), 4,1-4,4 (1H, m, -fc^j ) 4,38 (2H, q, J=7,0 Hz, -CH2~ CH3), 8,22 (1H, dd, J=8,8, 9,7 Hz, 5-H), 8,66 (1H, s, 2-H)

Esimerkki 12 2,3,4-trikloori-5-fluorianiliini

Rautajauheen (54,6 g) suspensioon vedessä (60 ml) lisättiin hitaasti, sekoittaen voimakkaasti 50-60°C:ssa konsentroitua 16 8 5 65 8 kloorivetyhappoa (6,7 ml). Lisättiin etanolia (150 ml), sekoitettiin ja lisättiin 2,3,4-trikloori-5-fluorinitrobentseeniä (75,1 g) pienin annoksin suspensioon 60-70°C:ssa yhden tunnin aikana. Sekoitettiin 1 h 80°C:ssa suodatettiin kuuma reaktio-seos ja liukenematon aine pestiin peräkkäin kuumalla etanolilla (100 ml) ja bentseenillä (300 ml). Suodos ja pesunesteet yhdistettiin ja sekoitettiin jääveteen. Saatu orgaaninen kerros otettiin talteen ja vesikerros uutettiin bentseenillä (200 ml). Orgaaniset kerrokset pestiin vedellä, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä ja konsentroitiin sitten. Saatu jäännös kiteytettiin uudelleen n-heksaanista, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (58,6 g) vaalean ruskeina neulasina, s.p. 118-120°C.

Esimerkki 13 2,3,4-trikloori-5-fluoribentsonitriili

Suspensioon, jossa oli 2,3,4-trikloori-5-fluorianiliinia (43,8 g) konsentroidussa kloorivetyhapossa (300 ml), lisättiin voimakkaasti sekoittaen natriumnitriittiä (21,1 g) vedessä (50 ml) lämpötilassa -2 n, o° 20 min aikana. Sekoitettiin 30 min, kaadettiin seos jääveteen (300 ml), joka sisälsi natriumtetra-fluoriboraattia (67,2 g), sekoitettiin voimakkaasti ja annettiin sitten seisoa 30 min jäähauteessa. Saatu sakka otettiin talteen suodattamalla ja pestiin peräkkäin kylmällä vedellä ja eetterillä. Heikosti keltainen sakka lisättiin annoksittain ‘ 30 min aikana liuokseen, jossa oli kuprosyanidia (36,5 g), ka- liumsyanidia (53,0 g) ja natriumkarbonaattia (11,1 g) vedessä (300 ml) voimakkaasti sekoittaen huoneenlämmössä. Seosta sekoitettiin 30 min, lisättiin bentseeniä (300 ml) suspensioon ja sekoitettiin seosta 15 min. Liukenematon aine otettiin talteen suodattamalla ja pestiin bentseenillä (150 ml). Suodos ja pesunesteet yhdistettiin ja pestiin peräkkäin 20 % kalium-syanidin vesiliuoksella ja vedellä, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä ja konsentroitiin sitten. Saatu jäännös kiteytettiin uudelleen n-heksaanista, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (27 g) vaalean ruskeina neulasina, s.p. 97-99°C.

17 85698

Esimerkki 14 3-kloori-2,4,5-trifluoribentsonitriili

Liuokseen, jossa oli kaliumfluoridia (31,7 g) dimetyylisulfok-sidissa (100 ml) lisättiin sekoittaen 130°C:ssa 2,3,4-tri-kloori-5-fluoribentsonitriiliä (15 g) ja sen jälkeen seosta sekoitettiin 1,5 h 140°C:ssa. Jäähdytettiin ja reaktioseos kaadettiin jääveteen (300 ml) ja uutettiin dikloorimetaanilla. Orgaaninen kerros pestiin vedellä, kuivattiin vedettömän nat-riumsulfaatin päällä ja konsentroitiin, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (11,9 g) kalpean ruskeana öljynä.

Esimerkki 15 3-kloori-2,4,5-trifluoribentsamidi

Liuosta, jossa oli 3-kloori-2,4,5-trifluoribentsonitriiliä (11,9 g) 30 % bromivety-etikkahapossa (150 ml) kuumennettiin refluksoiden 80 min, kaadettiin jääveteen (350 ml) ja uutettiin eetterillä. Eetterikerros pestiin peräkkäin 1 N kalium-hydroksidiliuoksella ja vedellä, kuivattiin vedettömän natrium-sulfaatin päällä ja konsentroitiin. Jäännös puhdistettiin silikageelikromatografiän avulla eluoiden n-heksaanietyyliase-taatin kanssa, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (3,97 g), s.p. 110-113,5°C.

Esimerkki 16 3-kloori-2,4,5-trifluoribentsoehappo

Seosta, jossa oli 3-kloori-2,4,5-trifluoribentsamidia (3,97 g) ja 18 N rikkihappoa (20 ml) sekoitettiin 125-135°C:ssa 9 h ajan ja kaadettiin sitten jääveteen (100 ml). Annettiin seisoa yli yön ja otettiin muodostunut sakka talteen suodattamalla. Emä-liuos uutettiin eetterillä ja eetterikerros kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä, ja konsentroitiin sitten ja sekoitettiin sakkaan. Edellä mainitun sakan liuos ja jäännös dikloorimetaanissa (150 ml) suodatettiin seliittikerroksen läpi ja suodos konsentroitiin, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (2,38 g), s.p. 115-116°C.

Analyysi (%) C^t^ClF-^O^: lie, laskettu (saatu): C 39,93 (40,18); H 0,96 (0,80).

18 8 5 598

Esimerkki 17 3-kloori-2,4,5-trifluoribentsoyylikloridi

Liuosta, jossa oli 3-kloori-2,4,5-trifluoribentsoehappoa (2,38 g) tionyylikloridissa (10 ml) kuumennettiin refluksoiden 2,5 h ja konsentroitiin sitten. Saatu jäännös puhdistettiin tislaamalla typpiatmosfäärissä, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (1,99 g), k.p. 88°C/19 mm Hg.

Esimerkki 18 Dietyyli-3-kloori-2,4,5-trifluoribentsoyyli- malonaatti

Magnesiumlastuja (0,22 g) ja hiilitetrakloridia (0,1 ml) lisättiin absoluuttiseen etanoliin (1,5 ml). Suspensiota sekoitettiin ja lisättiin siihen pisaroittaan liuosta, jossa oli dietyylimalonaattia (1,4 g) ja absoluuttista etanolia (2 ml) tolueenissa (b ml) 28 min aikana 47-60°C:ssa. Seosta sekoitettiin 80 min ja jäähdytettiin se sen jälkeen asetoni-kuivajää -hauteessa. Liuosta, jossa oli 3-kloori-2,4,5-trifluoribentso-yylikloridia (1,99 g) vedettömässä tolueenissa (2 ml) lisättiin pisaroittain saatuun liuokseen -12 "< 8°C:ssa 13 min aikana. Seosta sekoitettiin 2 h -10 111 -5°C:ssa ja annettiin seisoa yli yön huoneenlämmössä ja sekoitettiin sitten jääveteen (6 ml), joka sisälsi konsentroitua rikkihappoa (0,4 ml). Saatu orgaaninen kerros otettiin talteen ja vesikerros uutettiin tolueenil-la. Yhdistetty orgaaninen kerros pestiin vedellä, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä ja konsentroitiin, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (3,05 g) kalpean keltaisena öljynä.

Esimerkki 19 Etyyli-3-kloori-2,4,5-trifluoribentsoyyli- asetaatti

Emulsioon, jossa oli dietyyli-3-kloori-2,4,5-trifluoribentso-yylimalonaattia (3,05 g) vedessä (4 ml) lisättiin p-tolueeni-sulfonihappoa (4 mg) ja kuumennettiin refluksoiden 4 h voimakkaasti sekoittaen. Jäähdytettiin ja uutettiin reaktioseos dikloori-metaanilla. Orgaaninen kerros pestiin vedellä, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä ja konsentroitiin. Jäännös kiteytettiin uudelleen eetteri-n-heksaanista, ja saatiin otsakkeen yhdistettä (1,22 g), s.p. 80-83°C.

is 85 558

Analyysi (%) C^HgClF^O^ :lle, laskettu (saatu): C 47,08 (46,96); H 2,87 (2,77) .

Esimerkki 20 Etyyli-2-(3-kloori-2,4,5-trifluoribentsoyyli)-3 etoksiakrylaatti

Seosta, jossa oli etyyli-3-kloori-2,4,5-trifluoribentsoyyliase-taattia (1,22 g), etyyli-ortoformiaattia (0,97 g) ja asetan-hydridiä (1,12 g) sekoitettiin 118-143°C:ssa 3 h ajan ja konsentroitiin sen jälkeen, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (1,4 g) keltaisena öljynä.

Esimerkki 21 Etyyli-2-(3-kloori-2,4,5-trifluoribentsoyyli)- 3-syklopropyyliaminoakrylaatti

Liuokseen, jossa oli etyyli-2-(3-kloori-2,4,5-trifluoribentsoyyli) -3-etoksiakrylaattia (1,4 g) absoluuttisessa etanolissa (3 ml) lisättiin syklopropyyliamiinin (0,26 g) liuosta absoluuttisessa etanolissa (2 ml) 5-10°C:ssa 15 min aikana. Seoksen annettiin seisoa 5°C:ssa 1,5 h ja sen jälkeen sitä sekoitettiin huoneenlämmössä 1 h ajan. Saatu sakka koottiin suodattamalla. Suodos konsentroitiin, yhdistettiin sakan kanssa ja kiteytettiin uudelleen petrolieetteristä ja saatiin otsakkeen yhdistettä (1,09 g), s.p. 84-85,5°C.

Analyysi (¾) ^ClF^NO^:lie laskettu (saatu): C 51,81 (51,76); H 3,77 (3,74); N 4,03 (4,03).

Esimerkki 22 Etyyli-8-kloori-1-syklopropyyli-6,7-difluori- 1,4-dihydro-4-okso-3-kinoliinikarboksylaatti

Liuokseen, jossa oli etyyli-2-(3-kloori-2,4,5-trifluoribentsoyyli) -3-syklopropyyliaminoakrylaattia (1,09 g) vedettömässä dimetyyliformamidissa (5 ml) lisättiin natriumfluoridia (0,21 g). Seosta sekoitettiin 130-156°C:ssa 3,5 h ajan ja sitten se kaadettiin jääveteen (50 ml) ja saatu sakka otettiin talteen suodattamalla, pestiin vedellä ja kiteytettiin uudelleen etyyliasetaatista, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (0,96 g), s.p. 158-159°C.

20 8 5 698

Analyysi (%) ^ClF^NO^: He, laskettu (saatu): C 54,98 (54,96); H 3,69 (3,57); N 4,27 (4,25).

Esimerkki 23 8-kloori-1-syklopropyyli-6,7-difluori-1,4-dihydro-4-okso-3-kinoliinikarboksyylihappo

Seosta, jossa oli etyyli-8-kloori-1-syklopropyyli-6,7-difluori- 1,4-dihydro-4-okso-3-kinoliinikarboksylaattia (0,24 g), etikka-happoa (2 ml), vettä (1,5 ml) ja kons. rikkihappoa (0,25 ml), kuumennettiin refluksoiden 1 h ajan ja kaadettiin sitten jää-veteen. Saatu sakka otettiin talteen suodattamalla ja pestiin peräkkäin vedellä ja eetterillä, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (0,17 g), s.p. 194-195°C.

Analyysi (%) : He laskettu (saatu): C 52,1 1 (52,00); H 2,69 (2,53); N 4,67 (4 ,64) .

Esimerkki 24 7-/3-(t-butoksikarbonyyliamino)-1-pyrrolidi- nyyli7~8-kloori-1-syklopropyyli-6-fluori-1,4-dihydro-4-okso- 3-kinolonikarboksyylihappo

Seosta, jossa oli 8-kloori-1-syklopropyyli-6,7-difluori-1,4-di-hydro-4-okso-3-kinoliinikarboksyylihappo, (500 mg, 1,67 mmoolia), vedetöntä asetonitriiliä (5 ml), 1,8-diatsabisyklo/5,4,0/-7-undekeeniä (DBU; 250 mg, 1,67 mmoolia) ja 3-(t-butoksikarbonyyliamino) -pyrrolidiiniä (430 mg) kuumennettiin refluksoiden 1 h ajan. Reaktioseos konsentroitiin vähennetyssä paineessa ja saatuun jäännökseen lisättiin etanoli-eetteriä ja se seisoi 2 vrk jääkaapissa. Saatu sakka suodatettiin ja pestiin etanoli-eetterillä (1:1) ja eetterillä peräkkäin ja saatiin otsakkeen yhdistettä (430 mg, 55,3 %) kalpean keltaisena jauheena.

OC (CH-) , OH

Tf Rv- _ 1 IR v cm : 3300 (-NH-CO), 1710 (C=0, C=0), 1620 (C=0) max NMR ( (S CDCl 2: ssa) : 0,80-1,30 (4H, m), 1,45 (9H, s), 1,60- 2,50 (3H, m), 3,10-3,96 (4H, m), 4,00-4,60 (1H, m), 7,94 (1H, d, J=13,18 Hz), 8,86 (1H, s).

21 8 5 6 '3 8

Esimerkki 25 7-(3-amino-1-pyrrolidinyyli)-8-kloori-1- syklopropyyli-6-fluori-1,4-dihydro-4-okso-3-kinoliinikarbok-syylihappo 7-/3-(t-butoksikarbonyyliamino)-1-pyrrolidinyyli7-8-kloori-1-syklopropyyli-6-fluori-1,4-dihydro-4-okso-3-kinoliinikarbok-syylihappoa (430 mg) liuotettiin seokseen, jossa oli metanolia (5 ml) ja kons.kloorivetyhappoa (5 ml) ja sekoitettiin huoneenlämmössä 30 min. Reaktioseokseen lisättiin kons.ammoniakin vesiliuosta pH:n säätämiseksi arvoon 7, ja saatu sakka suodatettiin, pestiin vedellä ja metanolilla peräkkäin ja kiteytettiin uudelleen seoksesta kloroformi-metanoli-konsentroitu ammoniakin vesiliuos, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (110 mg) maidonvalkeana jauheena, s.p. 253-258°C (hajosi).

Analyysi (%) C^H^CIFN^O^: Ile, laskettu (saatu): C 55,82 (56,09); H 4,68 (4,82); N 11,49 (11,46).

Esimerkki 26 7-(3-asetamido-1-pyrrolidinyyli)-8-kloori-1- syklopropyyli-6-fluori-1,4-dihydro-4-okso-3-kinoliinikarbok- syy1ihappo

Seosta, jossa oli 8-kloori-1-syklopropyyli-6,7-difluori-1,4-dihydro-4-okso-3-kinoliinikarboksyylihappoa (1 g), vedetöntä asetonitriiliä (10 ml), 3-asetamidopyrrolidiiniä (0,64 g) ja DBU:a (0,51 g) kuumennettiin refluksoiden 1 h ajan. Reaktioseos konsentroitiin vähennetyssä paineessa, saatu jäännös liuotettiin kloroformiin (20 ml) ja pestiin 10 % sitruunahapon vesi-liuoksella (10 ml). Kloroformikerros pestiin vielä kyllästetyllä natriumkloridin vesiliuoksella, kuivattiin vedettömän natriumsulfaatin päällä ja konsentroitiin vähennetyssä paineessa. Saatu jäännös kiteytettiin uudelleen metanolista, ja saatiin otsakkeen yhdistettä (1,2 g) kalpean keltaisina prismoina, s.p. 210-212°C.

Analyysi (%) gClFN^O^.1/4 I^Orlle, laskettu (saatu): C 55,35 (55,39); H 4,77 (4,68); N 10,19 (10,12).

22 8 5 698

Esimerkki 27 7-(3-amino-1-pyrrolidinyyli)-8-kloori-1-syklo- propyyli-6-fluori-1,4-dihydro-4-okso-3-kinoliinikarboksyylihappo

Seosta, jossa oli 7-(asetamido-1-pyrrolidinyyli)-8-kloori-1 -syklopropyyli-6-fluori-1,4-dihydro-4-okso-3-kinoliinikarboksyy-lihappoa (0,8 g) ja vettä (20 ml), joka sisälsi natriumhydrok-sidia (0,8 g), kuumennettiin refluksoiden 5 h. Reaktioseos neutraloitiin etikkahapon kanssa, saatu sakka otettiin talteen suodattamalla. Tämä sakka pestiin vedellä, kuivattiin ja kiteytettiin uudelleen seoksesta metanolikloroformi-kons.ammonikin vesiliuos, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (0,41 g) valkeana levynä, s.p. 238-240°C (hajosi).

Analyysi (%) yH^ClFN^O^ · 1/2 IVOille laskettu (saatu): C 54,48 (54,44); H 4,84 (4,78); N 11,21 (11,20).

Esimerkki 28 7-(3-amino-1-pyrrolidinyyli)-8-kloori-1-syklo- propyyli-6-fluoro-1,4-dihydro-4-okso-3-kinoliinikarboksyylihappo

Seosta, jossa oli 8-kloori-1-syklopropyyli-6,7-difluori-1,4-dihydro-4-okso-3-kinoliinikarboksyylihappoa (0,6 g), vedetöntä asetonitriiliä (6 ml), 3-aminopyrrolidiiniä (0,35 g) ja DBUrta (0,31 g) kuumennettiin refluksoiden 1 h ajan. Sitten lisättiin vielä 3-aminopyrrolidiiniä (0,2 g) ja refluksoitiin edelleen 2 h. Jäähdytettiin ja otettiin saatu sakka talteen suodattamalla, liuotettiin veteen (9 ml), joka sisälsi natriumhydroksidia (0,12 g) ja neutraloitiin etikkahapon kanssa. Saatu sakka otettiin talteen suodattamalla ja pestiin vedellä ja asetonitrii-tillä peräkkäin, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (0,52 g) - värittömänä jauheena, s.p. 237-238°C (hajosi).

Analyysi (%) C1^7C1FN303.H20:lie laskettu (saatu): C 53,20 (52,97); H 4,99 (4,62); N 10,95 (10,83).

Esimerkki 29 7-(3-amino-1-pyrrolidinyyli)-8-kloori-1-syklo propyyli-6 -f luori-1 ,4-dihydro-4-okso-3-kinoliinikarboksyyliha-pon hydrokloridi

Suspensioon, jossa oli 7-(3-amino-1-pyrrolidinyyli)-8-kloori-1-syklopropyyli-6-fluori-1,4-dihydro-4-okso-3-kinoliinikarbok- 23 85 £98 syylihappoa (100 mg) etanolissa (2 ml), lisättiin 0,2 ml kloo-rivetyhapon liuosta etanolissa (7,0 mmoolia HCl/ml) ja sen jälkeen konsentroitiin seos. Saatu jäännös kiteytettiin uudelleen metanolista, jolloin saatiin otsakkeen yhdistettä (79 g) vaalean keltaisina prismoina, s.p. 263-265°C (hajosi).

Analyysi (%) C^H^CIFN^O^ .HC1: lie laskettu (saatu): C 50,76 (50,50); H 4,51 (4,44); N 10,45 (10,38).

Koe 1 Antibakteerinen spektri Määrättiin minimi-inhibointikonsentraatioita (MIC) menetelmän mukaan, jota on suositellut Japan Society of Chemotherapy. Tulokset ovat taulukoissa 1 ja 2. Kyseessä olevalla yhdisteellä on hyvin paljon voimakkaampi antibakteerinen vaikutus anaerobisia bakteereja ja aerobisia gram-positiivisia bakteereja vastaan, jotka olivat standardikantoja tai kliinisesti eristettyjä kantoja kuin vertailuyhdisteillä. Kyseessä olevalla yhdisteellä oli erikoisesti huomattavasti voimakkaampi vaikutus Pseudomonas aeruginosan suhteen kuin vertailuyhdisteillä.

24 >·· S - S 8

Taulukko 1-1 In vitro antibakteerinen vaikutus (standardikannat)

Minimi-inhibcinti konsentraatio

Organismi (10^ solua/ml) Gram :-.. (/ug/n^.l— . -

r Esim. Vertai- Vertai- nT

___25 luvhd. Iluvhd. 2| ^ CI~934

Bacillus subtills PCI 219__+ 0,025 0,025| 0,025 0,05 0,05

Staphylococcus aureus 209 P__+__0,05 0,20 0, 10 0,39__0,10 S. aureus IIP 670 (Terallna)__+__Qp 05 0,20 0, 10 0,39__0,10 S. epldermldls IIP 866__+__0,05__0,20__0,10 0p 39__0,10

Streptococcus pyogenes (S-8)__+__0,05__0,39__0,39__0,39__0,20 S. pyogenes IIP 692__+__0,10__0,78__0,78__0,78__0,39 S. pneumoniae IIP 552__+__0,10__0,78__0,39__1,56__0,39 E. faecalls IIP 682__+ 0,10 0,78 0,39 0,78 0,39

Escherichia coll NIHJ JC-2__^0,006 i.0,006 ^0,006 lp,006 0,10 E. coll ATCC 10536__ 0,0125 0,0125 0,0125 0,0125 0f10~

Proteus vulgaris IFO 3167__-__0p0125 —0,006 0,0125 ϋ.0ρ006 0,05 P. nirabllis IIP 994__0r0125 ~0,006 0,0125 0,0125 0,20 P. morganil IIP 602__0p05 0,025 0,05 0,05 0,39

Klebsiella pneumoniae KY(GN)64&5 - 0,0125 0,0125 0,025 0,0125 0,20 K. pneumoniae 1-220S__-__0p05 0,05 0,05 0,05__0,39

Enterobacter cloacae IIP 977__-__0p05__0,025 0,05__0,05__0,78

Cltrobacter freundil IIP 976__-__0.0125 0,0125 0,05 —0,006 0,20

Serratia marcescens IIP 618__-__0,05 0.10 0,05 0,39 0,39

Shigella sonnel IIP 969__0,0125 -0,006 0,0125 -0,006 0,10

Salmonella enteritidis IIP 604__-__0p0125 0,0125 0,05__0,025 0,39

Pseudomonas aeruginosa V-l__-__0,20 0,20 j 0,20 0,20__-_ P. aeruginosa IFO 12689_ 0,20 0,39 lf56 0,39 6,25

Yersinia enterocolltlca IIP 981__-__0,025 0,025 0,05__0,05__0,39

Acinetobacter anltratus IIP 876__-__0,05 0^0125 0,05__0,025 0?39

Alcallgenes faecalls 0104002__-__0,05__0f025 0,20__0, 39__6,2 5 25 8 5 6 9 8

Taulukko 1-2 In vitro antibakteerinen vaikutus (standardikannat) —------

Miniiui-inhibointi konsentraatio

Organismi (10^ solua/ml) Irair, ---(,ug/mlj__

Esim. Vertai- VertaiH mv Ci-934 ---25 luyhd. Iluvhd. 2___

Bacteroldes fraeilis GM 7000__-__0,10 1,56 0,39 3,13 ¢,25 B. fraeilis 0558__ 0,10 0,78 I 0,39 3,13 3,13 B. fragllis 25285__-__0,10 0,78 0,39 6,25 3,13 B. fraeilis 8503__0,39__0,78 6,25 6,25 B. thetalotaoirlcron (0661)__-__0,20 3,13 0,78 25__25

Fusobacterlum necroohorua S-45__-__0,20_-_0,39__1,56__-_ F. varlum KYA 8501_ 0,78 3,13 3,13 12,5 6,25

Eubacteriun lentun GAI 5242_I +__0,10 1 -__0,20 I 0,78__-_

Propicnibacteriun acens 11S28__+ | 1,56__I 3,13 12,5 I _

Peptococcus aaenus KY 017_| + I 0,05__-__0,20 1 0,39 I _

Clostridiuc difficile I-E_I + I__- I - I -__3,13 C. perfrlneens KYA 13123__+ 1 0,10 0,3 9 0,39 0,39 - C. ranosun__+__0, 73__-__3,13 I 6,25__-_

Peptostrepcccoccus anaerobius + ο "Ό - 0 78 1 _KYA 27337 ______

Pst. nlcror.s UPI 5464-1_I » 0,05__0,20 0,20

Veillonella Parola KYA 10790_- 0,05 - 0,20 0,20 -.-. Vertailu- yhdiste 1: 1-syklopropyyli-6,8-difluori-1,4-dihydro-4-okso-7-(1-piperatsinyyli)- : : 3-kinoliinikarbcksyylihappo , kuvattu EP-A-0 126 355:ssa

Vertailu- yhdiste 2: 8-kloori-1-sykloprcpyyli-6-fluori-1,4-dihvdro-7-(3-metyyli-1-piperat- sinyyli)-4-cksc-3-kinoliinikarboksyylihappo, kuvattu EP-A-0 167 763:ssa CFLX: siprofloksasiini CI-934: 1-etyyli-7- (3 -e tyy 1 i amincme tyy 1 i -1 -pyrrolidinyyli) -6,8-difluori-1,4- .., . dihydro-4-okso-3-kinoliinikarboksyylihappo 26 85698

Taulukko 2 In vitro antibakteerinen vaikutus (kliinisesti eristetyt bakteerit)

Minimi-inhibointi konsentraatio Kliinisesti Kanto- ( /ml) eristetyt jen n:o — -—L—.—-——-

bakteerit Esim. Vertai- CFLX 0FLX NFLX

_ _L25_luyhd.___ S. aureus_: 21 I 0,05 0,10 0,39 0,39 1,56 MR-S. aureus_:46 0,10 0,39 3,13 1,56 25 S. oplriermirilG_: 10 0,05 0,10 0,20 0,39 0.78 S. ayoeenes_: 6 0,10 | 0,39 0,39 I 1,56 1,56 S. pneumoniae_: 6 0,10 0,78__1,56__3,13 12,5 E. faecalls_: 5 | 0,20 0,78 0,78 3,13 6,25 N. gonorrhoeae_: 16 0,013 0,006 0,025 0,05 0,10 N. meningitidis_: 3 0,006 0,006 0,006 0,025 0,05 B. catarrhalis_:21 0,05 0,05 0,10 0,20 1,56 H. Influenzae_:26 0,013 0,025 0,05 0,10 0,20 E. coll_: 2 5 0,013 0,025 0,025| 0,10 0,10 P. oneumonlae_:25 0,05 0,20 0,20 0,78 0,78 E. cloacae_:21 0,013 0,05 0,05 0,10 0,10 S. narcescena_:20 0,05 0,05 0,05 0,20 0,10 P. nlrabills_t 10 0,05 0,05 0,05 0,20 0,10 P. vulgaris_: 6 0,05 0,05 0,05 0,10 0,05 M. norpanii_: 8 0,025 0,10 0,05 0,10 0,05 C. freundii_; 9 0,10 0,20 0,10 0,39 0,39 P. aeruginosa_;27 0,20 1,56 0,39 3,13 1,56 P. maltophilla_; 9 0,78 1,56 12,5 6,25 25

Acinetobacter sp._: 13 0,10 0,78__1,56__3,13 12 r 5

Alcaligenes sp._: 9 0,78 6,25__6,25__6^25 100

Campylobacter leluni ;20__0,05__0,20 I 0,20__0,39__0f 78

Bacteroides sp._: 17__0,10__0,39__6,25__3,13 50_ 0FLX : Ofloksasiini NFLX : norfloksasiini 27 85598

Koe 2 Spontaanisti resistenttien mutanttien frekvenssi

Kutakin testikantaa viljeltiin yli yön Mueller-Hinton-liha-liemessä (Difco) 37°C:ssa ja sitten 0,1 ml kutakin lihalie-miviljelyä ympättiin 10 mlraan Mueller-Hinton-lihalientä. Inkuboitiin 6 h 37°C:ssa ravistellen ja sen jälkeen bakteeri-solut otettiin talteen sentrifugoimalla nopeudella 3000 kierr./ min 15 min ajan. Pelletit suspendoitiin 5 mitään tuoretta Mueller-Hinton-lihalientä. Yksi annos (0,1 ml) näistä baktee-risuspensioista ympättiin Mueller-Hinton-agarin päälle, jotka sisälsivät kutakin yhdistettä 2-, 4- tai 8-kertaisen MIC määrän ja sen jälkeen levyjä inkuboitiin 37°C:ssa 48 h ajan. Taulukko 3 osoittaa kyseessä olevan yhdisteen tai vertailuyhdisteiden suhteen resistenttien mutanttien frekvenssin. Mutaatiotrek-venssi laskettiin seuraavasti: kolonioiden lukumäärä, jotka ilmestyivät lääkettä sisältävän agarlevyn pinnalle/ympin si-sällämien elinvoimaisten solujen kokonaislukumäärä. Kyseessä olevan yhdisteen spontaanisen mutaation frekvenssi oli selvästi alhaisempi kuin vertailuyhdisteiden vastaava.

28 8 5 69 8

Taulukko 3 Spontaanisti resistenttien mutanttien frekvenssi Lääkkei- TT , ., , , Vertailu-

„ . den kon- „ . . . . , Ί ~ CFLX

Kannat , Esimerkki 25 vhd. 2 sentraa- 1 ______ S. aureus 2MIC 2,9 x 10~8 - 3,6 χ 10-7 209 P 4MIC <2,9 x 10-9 5,1 x 10~8 1,3 x 10~7 S. aureus 2MIC <2^g χ 1Q-9 3^6 χ 10"7 4>1 x 10'8

Smith E. cloacae 2MIC 6,7 x 10~10 3,1 x 10-7 1,0 x 10~8 IID 977 4MIC <6,7 x 10_1° <6,7 x 10~10<6,7 x 10-10 S. marcescens 2MIC 1,5 x 10 8 1,0 x 10 7 4,1 x 10 9 IID 618 4MIC <1,0 x 10-9 <1,0 x ΙΟ-9 <1,0 x 10~9 c 2MIC 2,3 x 10"7 - 1,2 x 10_/ S. marcescens 7 7 GN ?577 4MIC <5,3 x 10_1° 9,9 x 10_? <5,3 x 10_1° 8MIC <5,3 x 10_1° 2,1 x 10"9 <5,3 x 10-1° P. aeruginosa 2MIC 4,5 x 10~8 5,5 χ 10-7 1,5 x 10~7 IFO 12689 4MIC <6,3 x 10-10 <6,3 x 10_1° 1,9 x 10~9 P. aeruginosa 2MIC <6,7 x 10-i° 7,7 x 10-8 IFO 1210 4MIC <6,7 x 10_1° <6,7 x 10_1° 7,0 x 10-8 29 85698

Koe 3 In vivo antibakteerinen vaikutus systeemisiin infektioihin hiirellä

Infektiot saatiin aikaan injektoimalla intraperitoneaalisesti bakteerisolujen suspensiota. Yhdisteitä annettiin oraalisesti yhden tunnin kuluttua injektiosta. Kunkin annoksen kokeiluun käytettiin viisi ICR koirashiirtä. 50-prosenttisesti vaikuttava annos (ED5Q), joka suojelee 50 % eläimistä infektion aiheuttamalta kuolemalta, määrättiin annostuksen ja eloonjäämis-prosentin suhteesta. Kyseessä olevan yhdisteen tehokkuus on esitetty taulukossa 4 verrattuna vertailuyhdisteiden vastaavaan. Kyseessä oleva yhdiste oli tehokkaampi kuin vertailuyh-disteet kaikkien testattujen bakteeri-infektioiden suhteen.

Se osoitti erikoista erinomaista tehokkuutta S. pneumoniae-infektion suhteen, johon vertailuyhdisteet olivat tehottomia.

Taulukko 4 In vivo antibakteerinen vaikutus systeemisiin infektioihin hiirillä

Yhdiste E. coli P. aeruginosa S. aureus S. pneumoniae _ML 4 707 IIP 1210_Smith_S-4288_

Esimerkki 25 0,9 2,9 2,0 13,0 CFLX 1,5 4,5 31 >100 OFLX 2,1 12,1 17 >100 NFLX 8,9 18,9 - >100

Koe 4 Terapeuttinen vaikutus kokeellisessa, anaerobisten bak-teereiden aiheuttamassa paikallisessa infektiossa granulooma-pusseissa rotilla

Eetterinukutuksessa injektoitiin subkutaanisesti Wistar-koiras-rotille (7 viikon ikäisiä) selkään 20 ml taudinaiheuttajista vapaata ilmaa (steriloitu membraanisuodattamalla, huokosten koko 0,45 ^um) ruiskun avulla. Tulehdusreaktio saatiin aikaan jatkuvasti injektoimalla yksi ml steriiliä kroton-öljyliuosta (1 % oliiviöljyssä) muodostuneeseen ilmapussiin. Kahden päivän kuluttua ilma poistettiin. Kahdeksantena päivänä injektoitiin 30 8 5 598 0,5 ml Bacteroides fragilis 2 viljelyä (106 CFU/ml) lävistettyihin granuloomapusseihin. Kutakin yhdistettä annettiin oraalisesti tai subkutaanisesti 2 h kuluttua infektiosta. Käytettiin kolme eläintä kutakin lääkeryhmää kohti kokeessa ja 0,6 ja 24 h kuluttua yhdisteiden antamisesta otettiin näytteitä pusseihin erittyneestä nesteestä elinkykyisten bakteerien lukumäärän määräämistä varten. Kokeen aikana oli ruoan ja juoman nauttiminen vapaata. Tulokset on esitetty taulukossa 5.

Oli tiedossa, että jo olemassa olevien kinolonikarboksyyli-happoyhdisteiden vaikutus anaerobisiin vakiobakteereihin oli hyvin heikko. Mutta kyseessä olevalla yhdisteellä oli paljon voimakkaampi antibakteerinen vaikutus anaerobisiin bakteereihin nähden, ei ainoastaan in vitro, vaan myös in vivo kuin muilla kinolonikarboksyylihapoilla. Tämä kyky on myös eräs tämän yhdisteen erinomaisista ominaisuuksista. Kuten taulukosta 5 käy ilmi, tämä koe osoittaa, että kyseessä oleva yhdiste on tehokkaampi kuin kefoksitiini (CFX), klindamysiini (CLDM) ja metro-nidatsoli (MND), joita tavallisesti käytetään anaerobisten infektioiden kliiniseen hoitoon.

31 85698 ί &

S

tn o $ x m qJ * * * * o 11 i -te -k <K 4C > C o ld r- co o r-~ in o •H iH <— n co vo *— m

g »> *- V V K *·, V

(rt O O o O O oo en s , (¾ tn + i +i +i +i +i +i +i ·—

<D —* X

tn ni to tn m r-' mm :«J

•h o Ί" ^ k *· *· * ·· tn >H r-i cn σι vo vo m σι ^ tn rp '—' Ή

(0 -P

χ +> -k tn

ar—I -K -k 00 * -P

O Or-lDlDO r- T- I

tn v-cocmot- mm -P

rtj *»··.«·*·»· i tn -P ooooo oo -h tn o p

(D tn +i +i +i +i +i +i+i S

tn -h O, •H >ι XJ CN VO OI VO (N (N I— ί—ιλ; ^ * *. o

i—i >. vo vo P1 m ^i· tn to tn -P

φ χ tn

Φ C -H

X -H 'O

o i—i **+ x: λ: <u o >i

O H

tn <ϋ +j iH

0 rP 0 O O .P

+· i—I -p o

0 -H Φ Λ +1 +1 H

Po tn o t- vo C

(0 M 3 * O

> _ tn m x

nJ

ss .... . 1 - h φ o d d o d .* 0 +j tn .... . tn

.pm o. tn tn o. O. SS

niQi *»·». * « e <rt O. (rt t? O' O' 01 Crt — ·Ρ (Ö E g « ΐ ,3 3 SS g1 g g- g g -s | ? m o tn o tn · * -p <n m r+ tn -p (N Q -P *-r-t rP · +» o rp rp CO W ' tn O tn O :(o o a " ii +l s v ji « S ä Bit § $ o.

-¾ ϊ x ϊ g | a * 5- 1 I Jöui J? 5 ! <0 :(0 tn o -p o E+ (P M > (0 X * 32 B b £ 5 8

Koe 5 Akuutti toksisuus hiirellä

Kyseessä olevan yhdisteen akuuttia toksisuutta tutkittiin koirashiirillä ja kutakin lääkettä annettiin intravenöösisesti. Kyseessä olevan yhdisteen LD^-arvo on lähes sama kuin cipro-floksasiinin.

Taulukko 6 Akuutti toksisuus hiirellä

Yhdiste LD50 (rn9/k<3)

Esimerkki 25 24 2 (221-279) CFLX 231 (212-255) (i · v.)

Koe 6 Subakuutti toksisuus koiralla

Kyseessä olevan yhdisteen subakuuttia toksisuutta koskeva tutkimus suoritettiin beagle-koirilla (10 viikon vanhoilla, n=3). Eläimille annettiin oraalisesti 20 mg/kg/päivä kyseessä olevaa yhdistettä 8 päivän ajan ja sen jälkeen 50 mg/kg/päivä 7 päivän ajan.

Ei havaittu mitään huomattavia muutoksia ruumiinpainossa ja yleisvoinnissa, eikä minkäänlaista abnormaalisuutta hematolo-gisessa tutkimuksessa ja seerumin biokemiallisessa analyysissä.

Koe 7 Absorptio, eritys ja metabolismi eläimillä 1 Rotat

Kyseessä olevaa yhdistettä ja ciprofloksasiiniä annettiin oraalisesti rotille vastaavasti annoksella 10 mg/kg, ja sitten otettiin näytteet verestä määrättyinä aikoina lääkkeen antamisen jälkeen. Lääkkeen konsentraatiot seerumissa mitattiin bio-kokeella. Virtsan ja sapen eritykset 24 h sisällä lääkkeen antamisesta määrättiin myös biokokeella. Tulokset on esitetty kuviossa 1 ja taulukossa 7. Kyseessä olevan yhdisteen pitoisuudet seerumissa olivat kolme kertaa korkeammat kuin cipro- 33 85698 floksasiinin. Samaten oli kyseessä olevan yhdisteen eritys virtsan ja sapen kautta 2,4 ja vastaavasti 7 kertaa korkeammat kuin ciprofloksasiinin.

Taulukko 7 Virtsan ja sapen eritys (Rotat, 10 mg/kg, p.o.)

Yhdiste Erittymisaste (% annoksesta) ____V i risa_Sappi_

Esimerkki 25 21,7 13,4 CFLX 8,9 1,9 0-24 h 2 Koirat

Beagle-koirille annettiin 2 mg annos kyseessä olevaa yhdistettä oraalisesti tai intravenöösisesti ja pitoisuudet seerumissa mitattiin HPLCrn avulla (korkeateho-nestekromatografia). Tulokset on esitetty kuviossa 2. Kyseessä olevan yhdisteen pitoisuudet seerumissa olivat oraalisesti annettaessa lähes samat kuin intravenöösisesti annettaessa, mikä viittaa kyseessä olevan yhdisteen erinomaiseen oraaliseen absorptioon. Virtsan metaboliittion tutkimus osoittaa, että kyseessä oleva yhdiste saattaa olla vaikeasti metabolisoituva.

Koe 8 Mutageenisyyden koe

Bakteereja hävittävien aineiden mutageenisyyden määrääminen bakteereja käyttäen on jonkin verran vaikeata johtuen niiden vaikutuksesta testibakteereihin. Mutageenisten vaikutusten määräämistä varten korkeammilla konsentraatioilla valittiin kanta, joka oli resistentti testiaineisiin nähden ja joka myös säilytti testattavan lähtökannan ominaisuudet. Käyttämällä tätä resistenttiä testikantaa oli mahdollista suorittaa koe 10 kertaa korkeammalla konsentraatiolla kuin sukulaiskan-nan kanssa.

Kun suoritettiin käänteinen mutaatiokoe käyttäen nalidiksiini-hapolle resistenttiä Salmonella typhimurium TA98-kantaa (nalr) kyseessä olevan yhdisteen ja ciprofloksasiinin kanssa, mitattavissa konsentraatioissa, lääkkeen metabolisen aktivoinnin kanssa tai ilman sitä, ciprofloksasiini indusoi 2 kertaisesti His+-käänteiskolonioita verrattuna liuotinkontrolliin, mutta kyseessä olevalla yhdisteellä ei ole His+-käänteiskolonioiden lisäys vaikutusta verrattuna kontrolliin (taulukko 8). Tulokset viittaavat siihen, että ciprofloksasiinillä saattaisi olla heikko mutagecnisyys.

35 6 5 598

Taulukko 8 Mutageeninen vaikutus S. typhimurium'iin TA98 (nalr)

yUg/levy S9-mix Esimerkki 25 CLFX

__ His+-käänteiskolonioita levyä konti

Kontrolli - 27 27 0,001 0,005 - 28 0,01 - 29 0,05 - 26 28 0,1 - 16* 44 0,5 - 0* 47 1.0 - 55 5.0 - 0* 0,2 (4NQQ15) - 190 190

Kontrolli ♦ 49 49 ' 0,001 + 0,005 + 60 0,01 + 48 0,05 + 39* 47 0,1 + 6* 76 0,5 + 0* 103 1.0 + 30* 5.0 + 0* 0,5 (2AA2)) + 277 277 * : Taustakasvu estettiin 1): 4-nitrokinoliini-1-oksidi 2 ): 2-aminoantraseeni

Claims

36 8 5 6 98 Patenttivaatimus Menetelmä farmaseuttisesti aktiivisen yhdisteen valmistamiseksi, jonka kaava on I 0 V-yV COOH I V ^ tunnettu siitä, että kondensoidaan yhdiste, jonka kaava on II O II “A jossa R on vetyatomi tai alempi alkyyliryhmä ja X on halo-geeniatomi, yhdisteen kanssa, jonka kaava on III Rl ^ N R2^·"" ^^ NH III I_/ jossa Rl ja R2 merkitsevät kumpikin itsenäisesti vetyatomia tai aminoryhmän suojaryhmää, tai muodostavat yhdessä amino-: ryhmän suojaryhmän; ja, kun molemmat tai jompikumpi ryhmistä R^ ja R2 ovat aminoryhmän suojaryhmä, kondensoidusta tuotteesta poistetaan suojaryhmä aminojohdannaisen muodostamiseksi ja, kun R on alempi alkyyliryhmä, kondensoitu tuote saippuoidaan karboksyylihappojohdannaisen muodostamiseksi. „ 85598 Förfarande för framställning av en farmaceutiskt aktiv förening med formeln I 0 H2N ,L X jj V “A kännetecknat av att man kondenserar en förening med formeln II O COOR 11 MJ “A väri R är en väteatom eller en lägre alkylgrupp och X är en halogenatom, med en förening med formeln III r! : NH III 1_/ väri R* och R^ betecknar envar oberoende av varandra en väteatom eller en skyddsgrupp för aminogruppen, eller bildar tillsammans en skyddsgrupp för aminogruppen; och dä bäda eller den ena av grupperna R^ och R^ är en skyddsgrupp för aminogruppen, avlägsnas skyddsgruppen frän den kondenserade produkten för bildande av aminoderivatet, och dä R är en lägre alkylgrupp, förtvälas den kondenserade produkten för bildande av karboxylsyraderivatet.