DK160089B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af spergualinbeslaegtede forbindelser - Google Patents

Description

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte spergualin-beslægtede forbindelser med formlen 5 H2NCNH(CH2)mCHCH2CO-R2-NH(CH2)4NH(CH2)3NH2 (I) NH Ri hvor r! er et hydrogenatom, en hydroxylgruppe eller en alk-10 anoyloxygruppe med 1-10 carbonatomer, R2 betyder -NH-CXH--(CH2)n”c0“/ hvor X betyder et hydrogenatom, en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe med 1-6 carbonatomer, der eventuelt er substitueret med en hydroxyl-, carboxyl- eller guanidinogruppe, og n betyder 0-2, idet dog R2 ikke indbefat-15 ter en a-hydroxylglycinrest, og R2 er knyttet til nabocarbo-nylgruppen og aminogruppen ved amidbindinger, og m betyder et helt tal fra 4 til 6, eller et fysiologisk acceptabelt salt deraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at beskyttelsesgrupper fjernes fra en beskyttet, spergualin-20 -beslægtet forbindelse med formlen R3 2 1 H2NCNH(CH2)mCHCH2C0-R'2-NH(CH2)4N(CH2)3NH-R4 (II) 25 NH R1 i hvor R1 har den ovenfor anførte betydning, R'2 betyder -NH-CXH-(CH2)n-C0-, hvor X betyder et hydrogenatom, en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe med 1-6 carbonatomer, der 30 eventuelt er substitueret med en hydroxyl-, carboxyl- eller guanidinogruppe, og n betyder 0-2, idet dog R'2 ikke indbefatter en rest af α-hydroxyglycin, og R'2 eventuelt er beskyttet, såfremt den har en funktionel gruppe som substituent, og R’2 er knyttet til nabocarbonylgruppen og amino-35 gruppen ved amidbindinger, R3 og R4 er ens eller forskellige og betyder hver især en beskyttelsesgruppe for aminogruppen, og m har den ovenfor anførte betydning og om ønsket omdanner en forbindelse med den almene formel I til et fysiologisk acceptabelt salt deraf.

2

Spergualin er en forbindelse, som er isoleret fra filtratet af et dyrkningsmedium efter dyrkning af en sper-gualinproducerende stamme hørende til slægten Bacillus. Spergualin har følgende struktur: 5

H2NCNH(CH2)4 CHCH2 CONH-CHCO-NH(CH2)4-NH-(CH2)3-NH2 NH OH OH

(III) 10

Spergualin inhiberer væksten af grampositive og gramnegative bakterier og udviser betydelig virkningsfuldhed samt forlænger dyrs levetid ved behandlingen af museleukæmi L-1210, museleukæmi FL-4, Ehrlich carcinom og sarcom 180 15 (S-180). Det er således en forbindelse, der forventes at tjene som antitumormiddel (jf. fremlagt japansk patentansøgning nr. 48957/72).

Det er også kendt, at spergualin kan fremstilles ved syntese (jf. J. Antibiotics, bind 34, 1625 (1981)). Ligeledes 20 er det kendt, at 15-deoxyspergualin, spergualin deoxideret i 15-stillingen, har samme virkninger som beskrevet ovenfor.

Disse forbindelser udviser fremragende carcinostatisk virkning, men har ringe stabilitet i form af vandige opløsninger, hvilket udgør en stor gene ved den praktiske anven-25 delse deraf.

Det har nu vist sig, at der fås spergualin-beslægtede forbindelser med den almene formel I, som er stabile i form af vandige opløsninger og har god antibakteriel virkning og antitumorvirkning ved tilvejebringelse af grupper -NH-CXH-30 —(CH2)n~CO- som ovenfor defineret i stedet for gruppen

OH

-NHCHCO- ved 10- til 12-stillingerne i spergualin.

35 Opfindelsen beskrives mere detaljeret i det følgende.

I de spergualin-beslægtede forbindelser mede den almene formel (I) betyder R1 et hydrogenatom, en hydroxylgruppe eller en alkanoyloxygruppe med 1-10 carbonatomer, såsom en

DK 160089 B

o 3 formyloxy-, acetoxy-, propionyloxy-, butanoyloxy-, penta-noyloxy-, hexanoyloxy-, heptanoyloxy-, octanoyloxy-, nona-noyloxy- eller decanoyloxygruppe, fortrinsvis en lavere alkanoyloxygruppe med 1-4 carbonatomer. R2 betyder en amino-5 syrerest -NH-CXH-(CH2)n-CO- som ovenfor defineret og betegnes herefter aminosyreresten. Aminosyreresten kan, såfremt den har et optisk aktivt carbonatom, være af L-, D- og DL-ty-perne. Eksempler på aminosyrer svarende til disse grupper er α-aminosyrer, såsom glycin, alanin, -r-aminosmørsyre, to prolin, leucin, serin, homoserin, threonin, asparaginsyre, glutaminsyre, arginin, phenylalanin, histidin samt Ø-alanin.

I forbindelserne med den almene formel (I) betegner m et helt tal fra 4 til 6. Såfremt der findes en substituent i 15-stillingen i forbindelserne, kan dens konfiguration 15 være en vilkårlig af S-, R- og RS-typerne.

Disse forbindelser med den almene formel (I), hvor m betegner 4 eller 6, og aminosyreresten er en rest af glycin, serin, /?-alanin, τ-aminobutanoyl, arginin eller phenylalanin, er foretrukne på grund af deres fremragende biologiske virk-20 ninger.

De spergualin-beslægtede forbindelser med den almene formel (I) danner salte med syrer. De saltdannende syrer kan være vilkårlige uorganiske eller organiske syrer, som er ikke-toksiske. De uorganiske syrer er ikke 25 begrænsede i deres art, men foretrukne eksempler herpå er saltsyre, svovlsyre, salpetersyre og phosphorsyre.

Arterne af de organiske syrer er ligeledes ubegrænsede, men de indbefatter fortrinsvis f.eks. eddikesyre, prqpionsyre, ravsyre, fumarsyre, maleinsyre, æblesyre, vinsyre, glutar-30 syre, citronsyre, benzensulfonsyre, toluensulfonsyre, methansulfonsyre, ethansulfonsyre, propansulfonsyre, asparaginsyre og glutamsyre.

De her omhandlede spergualin-beslægtede forbindelser med den almene formel (I) fremstilles ved fjernelse 35 af beskyttelsesgrupper fra de beskyttede spergualin-beslægtede forbindelser med den almene formel (II) ved anvendelse af kendte metoder, såsom reduktion, hydrolyse

O

, DK 160089 B

4 og syrenedbrydning. Tabel I anfører typiske eksempler på beskyttelsesgrupperne i de beskyttede, spergualin-beslæg- tede forbindelser samt eksempler på metoder til fjernelse af disse beskyttelsesgrupper. Det i tabel I anførte ved- 5 rørende beskyttelsesgruppen for henholdsvis carboxyl-, hydroxyl-, mercapto-, imidazol- og guanidinogrupperne har 2 relation til R' , som har en vilkårlig af disse grupper som en beskyttet substituent samt metoder til fjernelse af beskyttelsesgruppen fra den beskyttede substituent.

10 I tabel I viser symbolet + muligheden for fjernel se af beskyttelsesgruppen ved den angivne metode. Symbolet - viser, at beskyttelsesgruppen ikke kan fjernes ved den angivne metode. Symbolet - viser'delvis fjernelse eller sønderdeling, hvilket indikerer, at den pågældende 15 metode ikke er velegnet til beskyttelsesgruppen.

De ifølge den foreliggende opfindelse anvendelige beskyttelsesgrupper er ikke begrænset til de i tabel I anførte. Der kan f.eks. anvendes alle de i følgende litteratursteder anførte: Shiro Akabori, Takeo Kaneko og Kozo 20 Narita: Tanpakushitsu Kagaku (Protein Chemistry) 1,

Amino Acids. Peptides (Kyoritsu Shuppan, 1969), Nobuo Izumiya: Peptide Gosei (Peptide Synthesis) (Maruzen, 1975) , E. Schroder og K. Liibke: The Peptide Academic Press (New York, 1965) , E. Wusch: Methoden der Organischen 25 Chemie (Houben, Weyl), Synthese von Peptiden. Georg Thieme Verlag Stuttgart (1974), M. Bodcmszky og M. A. Ondetti:

Peptide Synthesis. Interscience Publishers (New York, 1976) .

Fra reaktionsblandingen, hvorfra beskyttelsesgrup-30 perne er fjernet, isoleres derpå den spergualin-beslæg-tede forbindelse med den almene formel (I). Såfremt beskyttelsesgrupperne er blevet fjernet ved katalytisk reduktion med f.eks. palladium-sort, gennemføres isoleringen ved fjernelse af katalysatoren ved filtrering, idet 35 filtratet koncentreres under formindsket tryk, og remanensen renses·ved en kendt rensningsmetode under anvendelse af CM-Sephadex (Na+) og Sephadex LH 20 (T. Takeuchi

O

5

DK 160089 B

et al., J. Antibiotics 34, 1619 (1981)). Såfremt beskyttelsesgrupperne derimod er blevet fjernet ved anvendelse af trifluoreddikesyre, kan den ønskede forbindelse isoleres ved koncentration af reaktionsblandingen under for-5 mindsket tryk og rensning af remanensen ved samme kendte rensningsmetode.

Den ovenfor beskrevne rensningsmetode muliggør fremstilling af den spergualin-beslægtede forbindelse med den almene formel (I) i form af et hydrochlorid.

Det fremstillede hydrochlorid kan omdannes til andre salte på følgende måde: Hydrochloridet opløses i vand, og den vandige opløsning ledes gennem en stærkt basisk ionbytterharpiks. Fraktioner indeholdende det Ønskede produkt (betegnet de aktive fraktioner) opsamles, og 5 hertil sættes en syre til dannelse af det ønskede salt eller en vandig opløsning af syren eller en opløsning af syren i et hydrofilt, organisk opløsningsmiddel, såsom methanol, ethanol, acetone, tetrahydrofuran eller dioxan, til neutralisation. Den neutraliserede væske 20 tørres under formindsket tryk eller, hvis den indeholder det organiske opløsningsmiddel, fjernes dette ved destillation under formindsket tryk efterfulgt af frysetørring af remanensen.

Alternativt sættes en vandig opløsning af sølv-25 hydroxid eller sølvoxid til hydrochloridet af forbindelsen med den almene formel (I) til neutralisation af saltsyren. Det uopløselige sølvchlorid fjernes ved filtrering, og filtratet tilsættes en ønsket syre til dannelse af et salt, som derpå frysetørres.

30 Det på den ovenfor beskrevne måde fremstillede produkt kan indbefatte et hydrat, afhængigt af behandlingsbetingelserne .

De beskyttede spergualin-beslægtede forbindelser med den almene formel (II), udgangsmaterialerne ifølge 35 den foreliggende opfindelse, er hidtil ukendte forbindelser og kan fremstilles på følgende måde: 1,5,10-Dibeskyttede 1,5,10-triazadecaner med den almene formel 6

DK 160089B

O

R3 h2n(ch2)4n(ch2)3nh-r4 (VI) hvor R3 og R4 har de ovenfor anførte betydninger, kondenseres med N-beskyttede a- eller Λΐ-aminosyrer med 5 5 5 formlen R OH/ hvor R betyder en rest af en a- eller UJ-aminosyre, som resterer efter fjernelse af hydroxyl- 5 gruppen fra a-carboxylgruppen, idet dog R ikke indbefatter en rest af α-hydroxyglycin, og aminogruppen i a- eller CåJ -aminosyren er beskyttet med en beskyttel- 10 sesgruppe forskellig fra den, der er repræsenteret ved 3 4 R eller R , til dannelse af 10-(N-beskyttet amino-acyl)-1,5-di-beskyttede 1,5,10-triazadecaner med den almene formel R3 15 R5-NH(CH9).N(CH9)--NH-R4 (VII)

3 4 5 ^ 4 Δ J

hvor R , R og R har de ovenfor anførte betydninger. Beskyttelsesgruppen for aminogruppen i amino- 5 syreresten R i de fremstillede forbindelser fjernes ved sædvanlige metoder, hvorved fås 10-aminoacyl-l,5-20 -di-beskyttede 1,5,10-triazadecaner med den almene formel R3 h-r,2-nh(ch9).n(ch9)-NH-R4 (VIII) 2 3 4 Z 4 Δ ^ hvor R' , R og R har de ovenfor anførte betydninger.

25 Derpå kondenseres de dannede forbindelser med (JJ- guanidino-fedtsyrer med den almene formel H9NCNH(CH9) CHCH9C00H (IX) z i, i m i η * NH Rx 30 hvor R^" og m har de ovenfor anførte betydninger, til fremstilling af de beskyttede spergualin-beslægtede forbindelser med den almene formel (II).

Kondensationen mellem forbindelserne med den almene formel (IX) kan gennemføres ved sædvanlige me-35 toder til anvendelse i dannelsen af peptidbindinger.

Eksempler på disse metoder er carbodiimid-metoden under anvendelse af dicyclohexylcarbodiimid eller l-ethyl-8-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, azid-

O

7

DK 160089 B

metoden under anvendelse af hydrazider, den blandede syreanhydrid-metode under anvendelse af ethylchlorcarbo-nat eller isobutylchlorcarbonat, den aktive estermetode under anvendelse af cyanomethylester, vinylester, substi-5 tueret og usubstitueret phenylester, thiophenylester eller hydroxysuccinimidester, O-acylhydroxylaminderivat-metoden under anvendelse af acetoxim eller cyclohexanon-oxim samt N-acylforbindelsemetoden under anvendelse af carbodiimidazol eller lignende. Opløsningsmidler til an-10 vendelse ved kondensationen kan være de, der skal anvendes til dannelse af peptidbindinger. Eksempler på opløsningsmidlerne er ethere, såsom diethylether, tetrahydro-furan og dioxan, estere, såsom ethylacetat, ketoner, såsom acetone og methylethylketon, halogenerede carbon-15 hydrider, såsom methylenchlorid og chloroform, amider, såsom dimethylformamid og dimethylacetamid, og nitriler, såsom acetonitril.

De 1,5-di-beskyttede 1,5,10-triazadecaner med den almene formel (III), råmaterialerne i de ovenfor beskrev-20 ne reaktioner, kan fremstilles på følgende måde:

Monoamino-beskyttede derivater af 1,4-butandiamin med formlen r6hn(ch2)4nh2 (X) hvor repræsenterer en amino-beskyttende gruppe for- 4 25 skellig fra den, der er repræsenteret ved R , kondenseres ved sædvanlige metoder med amino-beskyttede derivater af 3-halogenpropanaminer med den almene formel X(CH~)_NHR4 (XI)

4 Δ J

hvor R repræsenterer en amino-beskyttende gruppe, der 4 30 er identisk med den, der er repræsenteret ved R defineret ovenfor, og X repræsenterer et halogenatom, til fremstilling af forbindelser med formlen r6hn(ch2)4nh(ch2)3nhr4 (XII) hvor R4 og R^ er forskellige og hver især repræsenterer 35 en amino-beskyttende gruppe.

O

8

DK 160089 B

Den resterende iminogruppe er beskyttet med en 3 ammo-beskyttende gruppe repræsenteret ved R , som kan 4 elimineres ved samme metode som for R , og som er forskellig fra den amino-beskyttende gruppe repræsenteret g 5 ved R . Derpå elimineres den amino-beskyttende gruppe

C

repræsenteret ved R selektivt til fremstilling af de 1,5-di-beskyttede 1,5,10-triazadecaner med den almene formel (VI).

De 1,5-di-beskyttede 1,5,10-triazadecaner med den 3 4 -io almene formel (VI) , hvor beskyttelsesgrupperne R og R er identiske, kan fremstilles på følgende måde: 1-(4-Aminobutyl)-hexahydropyrimidin med formlen ' H,NCH9CH->CH.,CH0-N nh Δ 2 i ί (XIII) 15 CH0 CH0 \e / 2 CH2 underkastes indvirkning af N-ethoxycarbonylphthalimid til dannelse af 1-(4-phthaliminobutyl)-hexahydropyrimi-20 din med formlen II NH (xm

Ah, ch, 25 H \2 /2 o \ch2

Den fremkomne·forbindelse hydrolyseres under sure betingelser til fremstilling af 10-phthalyl-l,5,10-triazadecan med formlen

O

30 |j ^\-CH2CH2CH2CH2-NH-CH2CH2CH2-NH2 (XV) ti o 35 Den således fremkomne forbindelse underkastes indvirkning 9

O

DK 160089 B

af et middel, der beskytter en aminogruppe ved at omdanne den til en R-holdig form, hvorved der fås 10--phthalyl-l,5,10-di-beskyttede 1,5,10-triazadecaner med formlen

O

5 II

* 4 1 !| N-CH2CH2CH2CH2-N-CH2CH2CH2-NH-R^ (XVI)

II

o 3 4 10 hvor R og R er identiske og hver især repræsenterer en beskyttelsesgruppe. Phthalylgruppen fjernes fra de fremstillede forbindelser ved sædvanlige metoder, hvorved der fås 1,5-di-beskyttede 1,5,10-triazadecaner med 3 4 den almene formel (VI), hvor R og R er identiske.

15 Aminobeskyttelsesgrupperne kan være de, der hid til har været bredt anvendt i peptidsyntese. De som R6 anvendte aminobeskyttelsesgrupper er imidlertid sådanne, som skal fjernes selektivt, til forskel fra de 3 4 aminobeskyttende grupper R og R , som skal forblive 20 intakte. iX-'-Guanidino-fedtsyrerne med den almene formel (IX) kan f.eks. fremstilles på følgende måde:

Disse forbindelser, hvor R^ er en hydroxylgruppe, og m er 4, er kendte forbindelser, som beskrevet i The Journal of Antibiotics, bind 36, side 1623 (1981), 25 og kan fremstilles ved hydrolyse af spergualin. Forbindelsen, hvori R1 er en acyloxygruppe, og m er 4, kan fremstilles ved acylering af de samme forbindelser, der har en hydroxylgruppe som R^, ved gængse metoder. Forbindelserne, hvor er et hydrogenatom, og m er 30 4-6, er beskrevet i GB patentskrift nr. 1153.424 og kan fremstilles ved omdannelse af aminogruppen i de tilsvarende U^-aminofedtsyrer til en guanidinogruppe ved sædvanlige metoder.

35 10

DK 1600 B 9 B

f* » · Tabel I

»· Beskyttelsesgrupper for funktionelle grupper af aminosyrer samt metoder til deres fjernelse.___ I o 0) c i j * w >d ό α) ό i . !

CO -ri C 0> -ri d) iH

ft T? Λ ' 2 ΌΜΟ'οωοΟΛ + + III, * * a j* £ s* >iOb;oH>e>, ; ' * * * + HOQ)r4 H>iH'OH(C-PH ! bin_fa Λ iH : cm (U Hirij +> ί ,Μ . ω H o · i —————— — — a j : Μ Λ ο ·Η Ο η .¾ 0) O Oitn ' 2 S > AS ' if) 10,¾ I · * 1 ιι *ι + ι ι ι a I Ιΰ id Η i ι Β >, ί a S > j η» i ο +) Μ j --<_ 1 }S -u 11___ ._______ I 'd ; (U 0 j CJ Ή a T4 1 ^ M -° 1 ο ω ο Η >ι X ί β a) ο io η li ...

° +! £ O § > M S S >, · *1 * I I I

a ,2 H ij! > 10 H ji-ρχ _ SbO; J id j Q fjJ-P_ cm * ΐ Ο) j iiw a ι Μ Λ j = to a ® ο J$ o a: CM ^ ΰ ; > AS J Q) ι-l g >1 III I + + ι , I ,

SU >ι·Η : (UH ! 3 -H ft +J M

g BN; a id ; J +) Λί < 4J

a ι ! ι i · .

g iJS I I a*J ι

Jj§ss! j, s Lj 1¾ .........*.....

0) j <1) ,IH

a -X Μ ! m

O ,r( ® ·Η Ο) · ' ο AS

Ο 2 b ΌΧ ^υΗ·:5>ι Ι + +ΙΙΙΙ I I I

< ^ υ >1 .ο ή & η n _ aw Η to : ο +j AS < +> j : i) I "i J "· o : O (d H o, I g* .

• H j (d H (d «Η H Pis j H 1-1 -h o P m +1++1, + , + + + , , * + + , O £ 2 ^ ! * “ ft O H £ O AS ♦·. + + +, * t “o >i° 3 s >i >ι»·Η;4Η! ¢0.11) Bl o n f.in n

-w,.- -B Ql M : 63 XI t>l*!__” ri! -D

^ " T i T ·---—------------ O ' P i <U O Ή

P o X ! AS OM

'Ci'S-l -H0) o o a: * * t I < I I ♦♦,♦♦+ +l U ? £ ^ OH m S >1

m £2.- tj >, i -UM

a BO'S! HM O fiC-P

mlS <u ~~~ a to i u η η ή S P * 7* I Ό O AS O 0) 0) M +I++I+I++ + + + ,

^m^M>t'::H(dOH>OAS

1,1 iJ ’Ί ΐί Η Φ S -H m H id S >i a «Η5 fkiddijiori'+in - -_~ „I_: ri! +J__________ _ i « i, ^ 'i J X I . o * _,IQ)ffi(d.j Η^ΐτΐΐν.β V v i f ?s .1 Sf 5 IS Snåis S1«...............9 >«S53!«Xejj SSSSI+I ·,'· € 1 g -ri Μ α ni !d Ό ti d m <+^-PAi_________________i 0)! I i 1 · i j M! K M H i f\ H! S i bl SJ i , ^ (U m ‘ C ; +j o - ,

+> ^ ! -H ! Id , o i S , cT

C ·—l t Μ 1 ιι V. Afo o o i S

o £ ® ; m<d;(u[a;,S8 S V% S g 18- ©.'difti ' °„ 8 '« Å / % Λ=ι/\δ ύ§έ M ® Η Ό ] s M = « ^ Π / ' , CJ y - «Γ* J* N I „ <-> o 'π 1 ft -ri <0 I B u„ Λ„ J" V , 5 o g V λ o 3 S « ? ? "λ r" a fo s ; os b j =o 5 5° s é H Ir S O *" ° _: . ι, !. - « -1s I ° PI O s__s__i Ββ5ΐ sy s|s « spooanisdSTduisCj i addn^b epuaggÅdtseq-ouxmv

DK 160089B

11 Λ , . Tabel I (fortsat)

Beskyttelsesgrupper fer funktionelle grupper af aminosyrer samt metoder til deres fjernelse._ ; 1 i 7ΓΊ i ^ i i Π

ihO o φ ό i I

1 c -H c tn -ri i <u j |a>>iiHa)OMjnn!<n

Æ I O ΰ H O Ό 11 (lllo Ji , . I

[g i >1 β 3 >ιΐ! 3 ;θ η >|β >, >>+ +1 + j |·-1(1)<1)·-1 r-l>ir-l'OH(0!4->h ih Ό 0"H hi Ή N ® rli< *) 2 H ~------------------ --r~» ro 0) O U · -1 B Ή P Λ O m '

o fi Tf <D O o I ω I

«Si ° C > M in : O ,* + < + 1 ; B S rO (0 i—) i t h i g S > J id ' o 4J M i i —J-*-^-j- \<*>---------—-------r-i.

• Ό 0) o ' o >H

B Ή I ·Η Ό Μ Λ O M

O P >ι K β 0) O :° 0 * i . + . . , * 2™SP >rdr-)'i!4Jl+ S 3 Ό PI «J O ! <C 4-» ti “ ; ** . i-1—!-j---------------------*" CM ' o Ό j S* m I !

B 10 hi Λ . “ to I

g n 1)0 0,¾

CM 'ΰΰ > Λ I 1) Η ε >ι 111 +* 11 I

Β ^-γΙ κ!ή 'd-riQi-ph I

2 KN jrd ^+j^c+jJ j ~Β 1 ' Γ 1 ' · j ~"" f

o 1 ® ' I 0) 5* M-t ! I

ο m as ; n ; «to j ϋ ΰ SS Ϊ' 1 0lH ® ! *0« ,. + . , ., , +1 , ..1 fc |ΜΗΌ>1 μ Η Ό >ι 0-H3-PM y |ΗΉ1)Μ, fllwllll) Ο P ø < -P !

I, I——.jinii |r -TM«rt·· I.«r mt—- . »-.,.ί, ,.—ί- ,—l—, 7 .j;j—>- : —— —" —i—^ 1 1 1 1 1 1 1 I

0) I 6 , lu I

B ·* j -K w ! o ·-* <U ! -H a) O M i o t) P I U μ O rl · E >1 -+1 I I 14 *c Ό !>i i >i ο ·μ ft +) μ

W M j H cl) : Ο -P Μ < P

- j -j—i j j i " --" r— O : Ο (β H (1) ! - 1 —1 ; (0 1-4 (0 -,¾ ! "I 4-) ! ; <-l Pm·1-1 1-1 ·Η a! Jj 01 1 .+ +. l+l i ., ,♦

O ij P _ ! >< - 30¾ u: U H % 0 X

B μ^^) »o ^ a g >i . bdiu.mdm %4) .........J l.l___________!: * ii i>r 9 i o i g, I u *h i

3 Ο P > ,¾ j 0 oi I

*· ρ λ .r+<uiOOAi ,.+ . ,., + , .+ , . * ·.

¢3 T3>1 1 +JM ! m M 0> 8 r Min O < P_____^_|________ tf) i a! a · B d3 <D I U P P Ή 2 (0Λ1-Η I ^ o M!0 1) 1) 1) ++4 + i I. + + •V. -P 01 P >,£ΙΒ<Ι|Οη>

nja-p-PHQ)g.HOo,_i(da>i 2 SH(0 ϋ,ιαίβπ I <1> Η P P

--S_j-T- .- a1—-r ci(w5; .. o 10 o>> ^j OOxaui <1> . ο I ra a <>*++*< ,,,. ,,..

w o ^ fl) id' M ,C -P H ^ λ p H m •v! S « S H. a. o a a I aT| ο ° * ^ A ; τ> c .-) -η a ^ iiB-rl S Ol P (ί'ΰρ'φ W < 4J -P^ _J---___L_________-p-l S: “ m u ': S I 2 ^ •| Η Η i Id ! 1 i , i fi M 2 H CrHiM; y CJi o §. -To ' 0 ca) 010,0), AD = 'i £} £ c *| Si 2 : -a t3 ; a : >< q i '« Ο Λ υ- S J\ ,, i AS ^ sol U ΦΌ rl fl e · P Γ |l rr r·, o o , o " s: Γ 4ί. / - - .1 /J -r-l .J Λ J ( ml E-. -=1 O u ν’ -η ^ Ο Ο o t+J " O lVU3 ( .- u >n 0 π ^ Οι ·Η , 0) I tH P -+ l, £ ~ n \j u in. -m -r, , m -o -i ^ ·» °· * * j 3s|si_s_ s t‘s|d f5t.l frifp jS<,S|

epoaouisasieuaeCj | - 3[S eqiAxoq^eo · x6 · 5(s eqp Axo jPAH

12 ' - DK 160089 B

* * Tabel I (fortsat) ·· Beskyttelsesgrupper for funktionelle .

grupper af aminosyrer samt metoder til deres fjernelse.

: ό »c i I | ”— i W Ό <0 Φ Ό 4 β Ό *h cbi-w om * - - ~.

®£,1£®Ο.Μ ΜΜ0) . .

fa Ό Λ I O ΌΜΟϋΦίΒΟΛί n >* C 3 >OSiO H>Sh ♦ .. ♦ «I ♦ i ·.* . .···.-♦ · . * .··♦ * 71 ® ® rj H >1Η ! O Η Λ 5 M - ··'·-· 1 fa Ό Q> »H_fa J <n ίΝ (U H ri! +> ®g i ϋ · ~ " — —

s ·*! u « o <H

o C j-α <U o o ω

'i 2 ; β > M in o X * -I

B B : <d $ Η I S >i ·- 2 S ; > tf <tf O -PM - * · *? - ------jsljj_______;_______ f • , 2! ® 0 o »m tt T| ' Ti I'd Μ Λ o to 2 ij ?o 5 ® 2 ° 2 * * · * · φ ···». ♦ * ® « P » β ^ ^ inS>i

2 ® g £ |> Ή Ti I -PM

M ® 2* «Η SB ® Μ Λ « tn 2 h - ® o S o m r C-J *0^ β >,44 ΦΗ < E >i * * *.*

tt i? Ti ^ h a-Mfa-PM

2 MNj^id J +» J4 < JJ

B * 1 J ~ :-------r———— o ‘ ® i® 2<tw O . Jj j . M .54 Sm . . ’

U 1 O -H 0) I O -H 0) ΛΟΛ4 i * t M i t . . . . . * A

m £ 2 * -hp^m 1 * 1 . * ♦ fa ij I!] * m MHt3>t i° -ri S +J ^

U *M Φ U E-tMQItO -0 4)5 ri! JJ

-I " "" i----«------—· I — — ....{ __

® Φ IH

tt ^

O -4 O) Ή ® O M

O 2 i* Ό M ! U r-t · S >t * * *·

< Ό >« !0 nJftJJH

__M w_WtO O +> SF < -P

I I) i I I · ““ “ ™ 1 ““ “ “ “ ““ ““ — ““ O O Id H qj 2* ·

* H IS ri O B IH

r-i P ** H r-i^|Q) 2 B) 1 + 11.111 I I + I t -I + o £2,* >. - ωο-a u o rH -g o m

NOJ^HflJOOooiO-P'S-PM

-Jg—__ta jj h_v< *M ri! 4J __________ ^ ‘ ° i u *w . · 52 OM tj o ί to * ** q.e o om ·*♦.*«.. »♦*♦··♦♦ H 2. £ 2 Ό M tn:S>i

a g ty 5 M to O ; << -P

<n · S 0)1 · K Ti ^ 5 O I ϋ Μ M «w 2 ” * Τ’ i Ό o λ; o o) ajl to * «Φ4.4-4.Ι 4, ♦» ^ ΝΒΒβ Ort^OJi ® -® Ti t! H®a*rf«nHrtJa>i 2 «^ ® fa Ό id c i ® η jj ij *s 'r .·: · * - ... - .. - — — er L * « —I-- “ “ --- - — — —“ G I Ή S T1 Ό Η Οι Λ -

_ 0) W (d 5 r-l >1 -H s- g . · P

°'θΜ(1)ΛΡΛ·Ρ«Ο®^00,·-,ε * * « ^ MfBWrH OOoeiidj-rtOOAi O1 ^ fl S Η H >M 3 ^ e >1H\ a n o)<d 1,1 H ή o S jj Μ "Ί 2

Ibm H ΟιίΡΛ'ΰΉ^ to rtj-ppjid _______ __ ___ _____;_______ _____ ___ 0) i 1 i «I “ ™ M ' -· ,® 0» 3 * ®; “ a +> i +J| ^ . -H Id . i -8

Vli (D H c* h ti ·· I I o

Of G <u ? to a) φ M . P G = o1 o = A

°* > « ΰ i . 5 A ? o" i 4 7 5 s

Jj <D Ό rj trt p ij « η « o N ! Γ I (Τ'S W M n ^*S »/s 8 o s a-H i U 5 5 -Γ ^ 8 .V U g S ^ p U ^

fc \ * s i o a S C Ξ- ^ ·Λ e" % i tT ^ ^ ·-. T T

I ; , „o u «euo to JJ *t « «o o o s β S

* _;_t____|_|_ , O w u W w o O o U O w»_ s g ^ v 8ροΒ3Π5θ5χ9αΐθCj *rb *5[seq / tozbp ’ ταβ *vsac . ”°ϊ5βο;ιθμ -ouTp-fUBtis

yAu®6o-tqTN

13

O

DK 1600B9B

De beskyttede spergualinforbindelser med den almene formel (II) kan også fremstilles ved kondensation af syre salte af £U-guanidinoacylaminosyrer med den almene formel H0NCNH(CH0) CHCELCO-R'2-0H (XVII) ^ li 1 mn Δ

5 NH R

1 2 hvor R , R* og m har de ovenfor anførte betydninger, med beskyttede 1,5,10-triazadecaner med den almene formel R3 h2n(ch2)4n(ch2)3nh-r4 (VI) 10 3 4 hvor R og R har de ovenfor anførte betydninger.

iiJ-Guanidinoacylaminosyrerne med den almene formel (XVII) er hidtil ukendte forbindelser og kan fremstilles ved kondensation af syresalte af ^'-guanidinofedtsyrerne 15 med den almene formel (IX) med a- eller U/-aminosyrer med den almene formel H - R'2- 0 - R7 (XVIII), hvor R'2 har 7 den ovenfor anførte betydning, og R er en beskyttelsesgruppe for a-carboxylgruppen i α- 1) eller «//-aminosyren eller et hydrogenatom, til dannelse af syresaltene af 20 u/-guanidinoacylaminosyrerne med den almene formel H.NCNH(CH0) CHCH„C0-R,2-O-R7 * || 2 m,, c ίχτχι NH R1 tXXX) 12 7 hvor m, R , R* og R har de ovenfor anførte betydninger, 25 og såfremt R er en beskyttelsesgruppe, derpå følgende fjernelse af denne ved sædvanlige metoder.

Kondensationsreaktionen mellem &J-guanidinoacylamino-syrerne med den almene formel (XVII) og de beskyttede 1,5,10-triazadecaner med den almene formel (VI) kan gennem-30 føres på samme måde som ved kondensationen mellem forbindelserne med den almene formel (VIII) og forbindelserne med den almene formel (IX).

35 14

O

DK 160089 B

Der har været foretaget forsøg med de her omhandlede forbindelser for at undersøge deres stabilitet i vandige opløsninger, deres inhiberende virkning på væksten af Bacillus subtilis, deres in vitro inhiberende virkning 5 på den hastige formering af museleukæmi-Ll210-celler og deres in vivo virkning på forlængelse af levetiden samt deres toksicitet i mus, der modtager de samme celler ved transplantation.

I tabel II er anført de ved disse forsøg anvendte 10 forbindelser ifølge opfindelsen.

15 20 25 30 35

15 DK "6 008? B

Tabel II

H-NCNH(CH0) CHCHoC0-R,?-NH(CH0),NH(CH0),NH0 2 || 2 m, 2 2 24 232

NET

Forbin- „ i n 2 delse m κ· κ · (aminosyrerest) nr.

14 H -NH-CH2-CO- (L> ' (glycyl)

CH H

2 4 H (L) (L-seryl) __-NH-CH-CO-_ 3 4 (S) OH_jj_ (L-servl) 4 4_H_„_(D) (D-seryl) CH- 5 4 Η V (L) (L-alanyl) _-NH-CH-CO-_ 6 4 H -NH-CH2CH2-CO (β-alanyl) 7 4 ^ H -NH-CH2CH2CH2-CO- (.^-aiainobutanoyl) 8 4 , H (l·) (L-prolvl) CH^CHiCH-J, 9 4 , Η I (D (L-leucyl) __-NH-CH-CO-___

CH2COOH

10 4 ' H (L) Caspartvl) _-NH-CH-CO-__

CH-CH-COOH

11 4 H /$> (L) (Ιι-gl utamyl) _.__-NH-CH-C -_ 12 4 H · CH2CH2CH2NH-^-NH2 (L) (L-arginyl) _-NH-CH-CO- _ 13 _4_H O_;_(L) (L-phenylalanyl) 14 4_H_O_(L)_(L-histidyl)

JiJJ

15 4 H Ch3h (L) (L-threonyl) _-NH-CH-CO-_ 16 4 (S)-ococh3 -nh-ch2-co- (glycyl)

CH

17 6 Η \ Δ (L) (L-seryl) _-NH-CH-CO-_' ch9ch9ok 18 4 Η I Δ * (DL) (DL-bomoseryl) ______-NH-CH-CO-_^_ t

O

1-6

DK 160089 B

1. Stabilitet af forbindelserne ifølge opfindelsen i form af vandige opløsninger.

(1) Testmetode.

Hver af forbindelserne ifølge opfindelsen opløses 5 i vand til en koncentration på 0,5% (v/v). Den vandige opløsning holdes på 40 - 1°C, og der udtages prøver med bestemte tidsintervaller. Hver prøve underkastes høj-effektiv væskechromatografisk analyse til måling af forbindelsens toppunkt ved hvert prøveudtagningstidspunkt og til 10 beregning af forholdet mellem toppunktet efter det angivne tidsrum og toppunktet ved det første prøveudtagningstids-punkt. Resultaterne af beregningerne anvendes til bestemmelse af det procentvise indhold af forbindelsen ifølge opfindelsen i den vandige opløsning efter de angivne tids-15 perioder, idet begyndelsesindholdet af forbindelsen fastsættes til 100%.

(2) Testresultater.

Tabel III viser resultaterne af den ovenfor beskrevne test.

20 Tabel III

Restindhold (%) af forbindelsen ifølge opfin- _delsen i vandig opløsning_ —^Tidsforløb

Forb. nr^_ 0 12 24 48 72 120 168 25 1 _X00 99,7 100 99,7 99,7 99,8 99,9 2 " 100 100 99.8 100 ~9t7 99, 8~ 3 ____99 T 3 99,5 100 99,6 99,7 100 4 __“ 101 100 100 1 99.7 99.6 | 100 5 ” 99,8 1 99.8 100 99.6 99,Q 99,9 6 “ 1100 1Q0 99.6 99,6 ~99t9 100 7 99T9 100 99,8 99.9 Ίθ(Γ 99.8 30 3 _i ” ~ΊθΟ j 100 99,6 1 99 y 3 99.8 ~10υ 9_“__99,7 99T3~ 99,8 1100 100 99,9 10 _ 99,9 99,4" 99.8 100 99.8 99,9~ 11 “ 99,5 99,7 101 99.5 100 99,3 12 _ 100 99.4 99.7 99,9 100 99,7 13 - 1 " 99.8 99,5 99,9 TOO 101 IlOO' 14 _ " 99,1 99.0 99,6 99.5 ' 99.9 99.6 35 15 - i " 99,2} 99,8 99,1 100,2 99,6 i 10.0,1 _16__“_ 99,9 99,5 I 99,6 I 99,2 I 99,6 99ΤΓ

17 __ 99,6 100,2 99,8 99,7 IlOO SSTT

18 ___100 99,5 99,7 99,3 99,7 j 99,5

Spergualin 94,6 90y3 84,6Γ 78,5-1 69,9 65,I~ 17

O

DK 160 O 8 9 B

2. Vækstinhiberende virkning af forbindelserne ifølge opfindelsen på Bacillus subtilis.

(1) Testmetode

Hver af forbindelserne ifølge opfindelsen opløses i 5 næringsagarsubstrater til slutkoncentrationer på 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13 og 1,56 ^ug/ml til fremstilling af agar-testplader. Bacillus subtilis PCI219 reguleres til et

C

indhold på 1 x 10 levende celler/ml i et dyrkningssubstrat, og et øjefuld af substratet påføres agarpladerne.

10 Pladerne inkuberes i 20 timer ved 37°C under stationære betingelser og iagttages for dannelse af kolonier af Bacillus subtilis. Den laveste af koncentrationerne, ved hvilken der ikke dannes kolonier, tages som den minimale inhiberende koncentration (MIC).

15 (2) Testresultater

Tabel IV viser den vækstinhiberende virkning af typiske eksempler på forbindelserne ifølge opfindelsen på Bacillus subtilis. Intensiteten af denne virkning er udtrykt ved MIC.

20 Tabel IV

Vækstinhiberende virkning af forbindelserne ifølge opfindelsen på Bacillus subtilis

Forbindelse MIC

(Eksempel nr.)_(pg/ml) ^ Ϊ 6,25

...........2..................12! S

_3_6.25_ _4_12.5_ _5_25.0_ 6 25,0 7 · ~25 0 8 > 100 30 __9_> 100 _ _10_> 100_ _11_;_> 100_ _12_12,5_ _13_> 100 _ _14_50 0 '_ 15 - 100 35 Ί5----- —zoo -------- _17_ 6,25_ _18__100 18

O

DK 160089 B

3. In vitro formeringsinhiberende virkning af forbindelserne ifølge opfindelsen på muse leukæmi L1210 celler.

(1) Testmetode 5 Leukæmi L1210 celler (1 x 10^/0,2 ml) transplanteres intraperitonealt til hunmus (DBA/2). Fire dage senere isoleres ascitesvæsken og centrifugeres, hvorved der fås formerede L1210 celler. De isolerede L1210 celler sættes til et RPMI1640 medium indeholdende oksefosterserum og 10 2-mercaptoethanol, hvorved der fås en suspension af 4 L1210 celler med en slutkoncentration på 5 x 10 celler /0,9 ml. Hver af forbindelserne ifølge opfindelsen opløses i dette dyrkningsmedium, hvorved der fås opløsninger med slutkoncentrationer i området fra 0,062 til 15 100 jag/ml. 0,9 ml Af L1210 cellesuspensionen og 0,1 ml af hver testopløsning blandes i petriskåle og inkuberes i 48 timer ved 37°C i en inkubator under en atmosfære af carbondioxidgas. Antallet af L1210 celler tælles før og efter inkubationen, og den koncentration af forbindelsen, 20 som inhiberer formeringen af L1210 celler med 50% af kontrollens formering, bestemmes (IC^q).

(2) Testresultater

Tabel V viser den formeringsinhiberende virkning af typiske eksempler på forbindelserne ifølge opfindelsen 25 på museleukæmi L12I0 celler. Virkningens intensitet er udtrykt ved værdien af IC^q.

30 35

O

19' '

DK 16C089 B

Tabel V

In vitro formeringsinhiberende virkning af forbindelser ifølge opfindelsen på muse-leukæmi L1210 celler_ 5 Forbindelse *^50,' (Eksempel nr.)__(pq/ml)_ LI_1__hl_ _2__4jJ>_ _3__0.95_ 4 ............. 3.6" _5__37_ 10 6 0,84 7 -U9_

_9_ 70J

10 130 Ϊ2 1,5 -----13"...... 2 Ib-------- _14__^51_ 15 15 180 17 11.3 _18__150___ “ Spergualin 4,6 4. Levetidsforlængende virkning og toksicitet af 20 forbindelserne ifølge opfindelsen i museleukæmi L1210 (1) Testmetode

Leukæmi L1210 celler (1 x 10^/0,2 ml) transplanteres intraperitonealt til CDF, SLC hanmus (6 mus pr. gruppe).

Hver af forbindelserne ifølge opfindelsen fortyndes med 25 fysiologisk saltopløsning til forskellige koncentrationer.

Hver fortynding indgives i en dosis på 0,1 ml/10 g legemsvægt én gang daglig i 9 dage, idet behandlingen påbegyndes dagen efter transplantationen. Kontrolgruppen modtager fysiologisk saltopløsning uden forbindelsen ifølge opfindelsen.

30 Musene iagttages i 60 dage, begyndende dagen efter L1210 transplantationen, for at undersøge, hvor mange dage hver mus overlever. Gennemsnitsantallet af overlevelsesdage for den gruppe, der modtager forbindelsen ifølge opfindelsen, beregnes. Det fremkomne tal divideres med gen-35 nemsnitsantallet af overlevelsesdage for kontrolgruppen,

O

20·

DK 160089 B

og kvotienten multipliceres med 100, hvorved fremkommer den forøgede levetid (T/C (%)). T/C på 125 eller derover anses for at udvise en god virkning.

Forandring i legemsvægt og måling af toksiciteten 5 af forbindelsen ifølge opfindelsen udtrykkes ved en forskel mellem forandringen i legemsvægt hos den gruppe, som modtager forbindelsen ifølge opfindelsen, og legemsvægtforandringen hos kontrolgruppen, som modtager fysiologisk saltopløsning, og som ikke underkastes trans-1 o plantation.

(2) Testresultater

Tabel VI viser den levetidsforlængende virkning af typiske eksempler på forbindelserne ifølge opfindelsen på museleukæmi L1210 samt deres toksicitet. Den levetidsfor-15 længende virkning er udtrykt ved T/C og toksiciteten ved forandringen i legemsvægt.

Tabel VI

Levetidsforlængende virkning af forbindelserne ifølge opfindelsen ved museleukæmi L1210 samt forbindelsernes toksicitet_ 20

Forbindelse Dosis ^Forandring i fFTcsemnel nr.1 (mg/kg/dag) T/C (S) legemsvægt (g)

Kontrol 0,00 100 1,8 50.00 __12.9 25.00 >279 -1,6_ 12,50__> 528 +0,2 25 ....... -j. 6,25 >769 4-0,9 3.13 >667 +0,8 l'j 56 > 388 +1,0_ 0.78 > 250__+2.7_ _,__0,39__126 +1,8 ""i 50.00 12,81 - 25.00 100 - 30 12,50__> 612__-0,2_ 2 6,25__> 705__+1,0 1 3.13 __>769 +0.6 : 1,56__> 769 +1,3_ 0,78 >346 +1*5 __0,39 124 +2,7_ 50.00 __> 342 ~ +0.2 35 25,00__> 524___+1.1_ 12 j 50__> 700__+0,8_

Spergualin _6,25__> 769 ' +0,9 3.13 __> 665__+1,2_ 1^56 >224 +2,5_ _Γ Q.,78 129 +0,8

DK 160089 B

O

21

Som det fremgår klart af de ovenfor beskrevne forsøgseksempler har forbindelserne ifølge opfindelsen god biologisk virkning, høj stabilitet og er lovende som far-maceutika, såsom antitumormidler. Af disse forbindelser, 5 der er udtrykt ved den almene formel (I), foretrækkes de, hvor m betyder 4 - 6, ^ er et hydrogenatom eller en hydroxylgruppe, og aminosyreresten, såsom R , er glycyl, seryl, β-alanyl, γ-aminobutanoyl, arginyl eller phenyl-alanyl, på grund af deres bedre virkninger.

10 Opfindelsen beskrives mere detaljeret i de efter følgende eksempler. I disse eksempler bestemmes Rf-værdien i tyndtlagschromatografi (TLC) ved at påføre en opløsning af det ønskede produkt på en 0,25 mm tyk silicagel-plade 60 F254 (Merck) i en bestemt position (såkaldt ud-15 gangspunkt), hvorefter denne plade fremkaldes med den angivne fremkalder over en distance på ca. 8 cm, distac-cen fra udgangspunktet til centrum for den fremkomne plet af det ønskede produkt med distancen fra udgangspunktet til den forreste ende af fremkaldelseszonen 2Q (såkaldt opløsningsmiddelfront). Det ønskede produkt påvises under anvendelse af UV (2537 Å) , ninhydrin og Sakaguchi's reagens.

Eksempel 1 10-[N-(7-guanidinoheptanoyl)glycyl]-1,5,10- -triazadecan-trihydrochlorid 25 -- 20,8 g (ca. 24 mmol) 10-[N-(7-guanidinoheptanoyl)-glycyl]-1,5-dibenzyloxycarbonyl-l,5,10-triazadecan-hydro-chlorid, et olieagtigt stof, opløses i en blanding af 300 ml methanol og 10 ml eddikesyre. Opløsningen tilsæt-30 tes 0,50 g palladium-sort, og blandingen reduceres katalytisk i 3 timer ved stuetemperatur og atmosfærisk tryk.

Efter omsætningen fjernes katalysatoren ved filtrering, og filtratet koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 19,5 g olieagtigt stof. Det olieagtige stof op-35 løses i 70 ml destilleret vand, og opløsningen ledes gennem 22

O

DK 16 G G 8 9 B

en 1500 ml søjle af "CM-Sephadex" C-25 (Na+). Der foretages gradient-eluering mellem 7500 ml destilleret vand og 7500 ml af en vandig opløsning af 1 M natriumchlorid.

Aktive fraktioner opsamles og koncentreres til tørhed 5 under formindsket tryk. Remanensen tilsættes methanol, og det uopløselige natriumchlorid fjernes ved filtrering.

Dette rensningstrin gennemføres endnu én gang. Til fjernelse af en ringe mængde resterende natriumchlorid opløses det fremkomne olieagtige stof i 50 ml methanol, og 10 opløsningen ledes gennem en 400 ml søjle af "Sephadex" LH-20. Søjlen elueres med methanol, og aktive fraktioner opsamles og koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 5,30 g olieagtigt stof. Det olieagtige stof opløses i 20 ml destilleret vand, og det uopløselige mate-15 riale fjernes ved filtrering. Filtratet frysetørres, hvorved der fås 5,20 g af det ønskede produkt. Udbytte: 45,1%.

Smp. 163-165°C.

NMR (DMSO - dg): =0,9 - 1,8 (b, 12H), 1,8 - 2,4 (b, 4H), 2,6 - 3,3 (b, 10H), 3,63 (d, 2H, 20 J = 5Hz), 6,9 - 9,2 (b, 12H) IR (KBr): 3410, 3310, 3150, 2930, 1640, 1520, 1470, 1410, 1160, 965.

TLC (n-propanol:pyridin:vand:eddikesyre = 6:4:3:2 r/r)

Rf = 0,4 25 MS (FD): m/z 372 (M+l).

Eksempel 2 10-[N-(7-guanidinoheptanoyl)-L-seryl]-1,5,10 -triazadecan-trihydrochlorid_ 2,50 g (3,14 mmol) 10-[N-(7-guanidinoheptanoyl)-0-30 -benzyl-L-seryl]-1,5-dibenzyloxycarbonyl-l,5,10-triaza- decan-hydrochlorid opløses i en blanding af 30 ml methanol og 1 ml eddikesyre. Opløsningen tilsættes 0,1 g palladium--sort, og blandingen reduceres katalytisk i 5 timer ved atmosfærisk tryk under opvarmning ved 50°C. Efter omsætnin-35 gen fjernes katalysatoren ved filtrering, og filtratet 23

O

DK 1600 8 9 B

koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 1,7 g olieagtigt stof.

Det olieagtige stof opløses i 6 ml destilleret vand, og opløsningen chromatograferes på en 300 ml søj-5 le af "CM-Sephadex" C-25 (Na ). Søjlen elueres ved gra-dient-eluering mellem 200 ml destilleret vand og 200 ml af en vandig opløsning af 1,5 M natriumchlorid.

Aktive fraktioner opsamles og tørres under formindsket tryk. Remanensen tilsættes methanol, og det 10 uopløselige natriumchlorid fjernes ved filtrering. Dette rensningtrin udføres igen. Til fjernelse af en ringe mængde resterende natriumchlorid opløses det fremkomne olieagtige materiale i 5 ml methanol, og opløsningen ledes gennem en 100 ml søjle af "Sephadex" LH-20.

15 Søjlen elueres med methanol, aktive fraktioner opsamles, og de opsamlede fraktioner koncentreres under formindsket tryk. Det fremkomne olieagtige stof opløses i 5 ml destilleret vand, og uopløseligt materiale fjernes ved filtrering. Remanensen frysetørres, hvorved der fås 0,43 g 20 af det ønskede produkt. Udbytte: 45,1%.

NMR (DMS0 - d6) :/=0,8-1,8 (b, 12H) , 1,8-2,4 (b, 4H) , 2,5-3,4 (b, 10H), 3,57 (d, 2H, J = 5Hz), 4,18 (m, IH), 5,5-6,5 (b, IH) , 6,7-9,5 (b, 12H) 25 IR (KBr): (cm-1) = 3350, 2940, 1640, 1535, 1465, 1375, 1160, 1060, 965.

TLC (n-propanol:pyridin:eddikesyre:vand = 6:4:3:2 r/r)

Rf = 0,3 [a]^7: -15,2° (c = 1,0, H20) 30 MS (FD) : m/z 402 (M+l)

De i den efterfølgende tabel VII anførte forbindelser med den almene formel (£l) behandles i overensstemmelse med den i eksempel 1 eller 2 beskrevne fremgangsmåde til fremstilling af de i den følgende tabel anførte for-35 bindeiser med den almene formel (I).

Tabel VII_ 24_DK 16 Q O 8 9 B

♦ Eksempel Forbindelse med formlen .(II) [Forbindelse med formlerl (1) 10-[N-((S)-7-guanidino-3- 10-[N-({S)-7-guanidino-3- hydroxyheptanoyl)-O-benzyl- hydroxyhaptanoyl)-L-seryl] -L-seryl]-l,5-dibenzyloxy- 1,5,10-triazadecan- , *· carbonyl-l,5,10-triazadecan- trihydrochlorid hydrochloride τ» v NMR (DMSO-dg) ' SIMR (DMSO-dg) 8=0,9 - 2,0 (b, 12H) S-1,0 - 1,8 (b, 10H) 2.1 - 2,4 (d, 2H, J-6Hz) 1,8 - 2,4 (b, 4H) 2.6 - 3,5 (b, 10H) 2,6 - 3,5 (b, 10H) 3,60 (d, 2H, J=5Hz) 3,60 (d, 2H, J=5Hz) 3 3,8 - 4,7 (b, 2H) :3,7 - 4#3 (b, 2H) . 4,48 (s, 2H) 4,3 -5,5 (b, 2H) 4,5 - 5;5 (b, IH) 6,9 - 9,1 (b, 12H) 5.01 (s, 2H) IR (KBr). « 5J05 (s, 2H) (cm-1) * 3365, 2945, 1650 6.7 - 8,3 (b, 8H) 1540, 1460, 1170 7,27 (s, J5H) 1060,* 965 7,30 Jsf 10H) TLC (n-butanol: vand: TLC <n-butanol:pyridin· .

eddikesyre — 4:1:1 v/v) vand:eddikesyre

Rf = 0,6 = 6:4:3:2 r/r)

Rf = 0,3 [cK)J3 -14,7° (c « 1,0 H20) I _;_IMS (FD) m/z 418 (M + 1) * % • \

25 DK 160089 B

Tabel VII (fortsat) ---!------------------ || )'Eksempel Forbindelse med formlen (II) Forbindelse med formlen (IJm 10-iN-(7-guanidinoheptanoyl}- 10-[N-(7-guanidinohepta- O-benzyl-D-seryl]-1,5- noyl)-D-seryl]-1,5,10- dibenzyloxycarbonyl-1,5,10- triazadecane triazadecan - hydrochlorid trihydrochloride NMR (DMSO-dg) NMR (DMSO-dg) S =0.9 - 2,0 (b, 1411) ' £=0,8 - 1,9 (b, 1211) 2.0 - 2,4 (d, 2H) 1;8 - 2,4 (b, 4H) 2.7 - 3,5 (b, 10H) 2,6 - 3,4 (b, 10H) . 3,58 (d, 2H, J=5Hz) 3,58 (d, 2H, J=5Hz) 4 4,2 - 4,8 (b, IH) 4,18 (m, IH) 4,47 (s, 2H) 5,0 - 5,8 (b, li!) 4,5 - 5,5 (b, IH) 6,7 - 9,4 (b, 12H) 5.01 (s, 2H) IR (KBr) 5,04 (s, 2H) (cm-·3) = 3350, 2940, 1640 6.7 - 8,3 (b, 811) 1535, 1460, 1360 7,27 (s, 511) 1160, 1060, 7,30 (.s, 10H) TLC (chioroIojLiu:methanol: TLC (n-butanol:pyridinb eddikesyre = 9:1:0.5 r/r) vand:eddikesyre Rf = 0,2 = 6:4:3:2 r/r)

Rf = 0,4 [o(]2d6 +15,3° (c = 1,0 H20) '___|MS (FD) m/z 402 (M + D _ • * . .v

. 26 DK 160089 B

Tabel VII (fortsat)__________ /Eksempel Forbindelse med formlen (II) Forbindelse med formlen (I) 10-[N-(7-guanidinoheptanoyl) 10-[N-(7-guanidinoheptanoyl -L-alanyl3-1,5-dibenzyloxy- -L-alanyl]~1,5,10-carbonyl-1r5f10-triazadecan- triazadecane hydrochlorid trihydrochlorid NMR (DMSO—dc) NMR (DMSO-d,) 6 o £=0,9 - 2 , 0 (b, 17H) £=0,9 " 1;8 15H) 2.0 - 2T3 (d, 2H} 1;8 - 2,4 (b, 4H) 2.3 - 3;5 (b, 10H) 2,6 - 3;4 (b, 10H) * 4.0 - 4,5 (b,lH) 3,9 - 4,5 (b, IH) 5 4,99 (s, 2H) ;-.5,9 - 8;2 (b, 12H) . 5,03 (s, 2H) 6.3 8,7 (b, 8H) 7,,3 (s’ 10H) IR- (KBr) (cm”1) = 3380, 2940, 1640 1540, 1370, 1160 ".S, * 965 TLC (n-propanol:pyridin; ‘PLC (n-propanol:pyiidin: vand:eddikesyre vand:eddikesyre = 6:4:3:2 r/r) = 6:4:3:2 r/r)

Rf - 0,8 Rf =0,4 bOp7 -21,6° (c = 1,2 K20) ______IMS (FD) m/z 386 (M- 4· 1)- • r »v * \ *1 * fa / - —

Tabel VII (fortsat)

Eksempel Forbindelse med formlen (II) Forbindelse med formlen~(i) 10-[N-(7-guanidinoheptanoyl) 10-[N~(7-guanidinohcptanoyl -(9-alanyl3-1,5-dibanzyloxy- -^-alanyl3-1,5,10-carbony1-1,5,10-triazadecan- triazadecanr hydrochlorid' trihydrochlorid NMR (DMSO-dg) NMR (DMSO-dg) £=1,0 - 2,1 (b, 14H) £=1,0 - 1,8 (b, 12H) 2,0 - 2,5 (d, 4H) 1,9 - 2,5 (b, 6H) 2.6 - 3,1 (b, 12H) 2,6 - 3,5 (b, 12H) 4,99 (s, 2H) 7,0 - 9,3 (b, 12H) 6 5,03 (s, 2H) 6.7 - 8,3 (b, -8II) 7,3 (s, 10H) IR (KBr) (cm-1) = 3350, 2935, 1635 1545, 1460, 1365 1165, 965 TLC (chloroform:methanol: TLC (chloroform methanol: 29% ammoniakvand 29% ammoniakvand = 2:2:1 r/r) = 2:2:1 r/r)

Rf = 0,8 Rf = 0,6 _____MS (FD) m/z 386 (M 4- 1) _

28 DK 160089 B

Tabel VII (fortsat)

Eksempel Forbindelse med formlen (II) Forbindelse med formlen (I) 10-[K-(7-guanidinoheptanoyl) 10-IN-(7-guanidinoheptanoyl -’f-aminobutanoyl-l, 5- -y-aminobutanoyl3-1,5,10- dibenzyloxycarbonyl-1,5,10- triazadecan-triazadecan - hydrochloride trihydrochlorid NMR (DMSO-d,,) KMR (DMSO-d^) C 6 c- 6 o -0,9 - 2T0 (b, 16H) b =0T9 - 1,8 (b, 14H) 2.0 - 2,5 (d, 4H) 1,8 - 2,4 (b, 60) 2,7 - 3,7 (b, 12H) 2,6 - 3,4 (b, 12H) 7 4,99 (s, 2H) 6,7 - 9,2 (b, 12H) 5,03 (s, 2H) 6,5 - 8,5 (b, 8H) 7,30 is, 10H) IR (XBr) (cm"1) = 3350, 2940, 1640 1550, 1460, 1360 TLC (n-butanol: vand TLC (n-propanoljpyri'din; eddikesyre = 4:1:1 r/r) vand:eddikesyre

Rf = 0,6 = 6:4:3:2 r/r)

Rf = 0,4 _____MS (FD) m/z 400 (M + 1) . Λ* /

29 DK 160089 B

Tabel VII' tfortsat)_________

Eksempel Forbindelse med formlen (II) Forbindelse med formlen (I) 10- [N- (7-guan.idinohepta- 10- [W- (7-guan.idinohepta-noyl-L-propy13-1,5-dibenzy1~ noyl)-L-propyl3-1,5,10-oxycarbonyl-1,5,10-triaza- triazadecan- decan - hydrochlorid trihydrochlorid NMR (DMSO-dg) NMR (DMSO-dg) 8=079 - 2,4 (b, 20H) δ =1,0 - 2,4 (b, 20H) 2,7 - 3,7 (d, 12H) 2,5 - 3,9 (b, 1211) 4.0 - 4.4 Cb, IH) 4,0 - 4,5 (b, IH) 5.00 (s, 211) 6,7 - 9,3 (b, 11H) 8 5,04 (s, 211) .6,5 - 7,9 (b, 7H) 7,33 (s, 10H) IR (KBr) (cm"1) = 3400, 2940, 1640 1450, 1160, 965 TLC (n-butanol:eddikesyre: TLC (n-propanolspyridins vand = 4:1:1 r/.r ) = 6:4:3:2 r/rvand:eddikesyre

Rf = 0;3 : =6:4:3:2 r/r)

Rf = 0,3 -42,3° (c = 1,3, H20) ______MS (FD) m/z 412 (M + 1) . ·>* i

30 DK 160089 B

Tabel Vil (fortsat)__ .Eksempel Forbindelse med formlen (II) Forbindelse med formlen (I) 10-[N-(7-guanidinohepta- 10-[N-(7-guanidinoheptanoyl noyl-L-leucyl]-lf5-dibenzyl- -L-leucyl]~l,5,10-oxycarbonyl-l,5,10-triaza- triazadecan-decan -hydrochlorid trihydrochloride NMR (DMSO-dg) NMR (DMS0-dg) £=0,6 - 1,0 (bf 6H) S =0 ,5 - 1;0 (br 6H) 1.1 - 1,9 (dr 16H) 1,0 - 1;9 (b, 15H) 1,9 - 2,4 (br 3H) 1,9 - 2,3 (b, 4H) 2.7 - 3,5 (bf 10H) 2,6 -.3,5 <b, 10H) 3.8 - 4,6 (m, IH) 3,9 - 4T5 (bf 1K) S 5,06 (s, 2H) . '6,8 - 9,1 (b, 12H) • 5,10 {s, 2H) 6.8 - 8,3 (b, 8H) 7,33 (s/ 10H) IR (KBr) (cm-1) = 3400, 2945, 1645 1535, 1465, 1370 14 1165, 970 TLC (n-butanol: eddikesyre: TLC (n-propanol :pyridin*.

vand = 4:1:1 r/r) vånd: eddikesyre

Rf = 0,5 = 6:4:3:2 v/v) , Rf = 0,4 I<^D7 "20,5° (c « 1,4, H20) __;_ MS (FD) ra/z 428 (M + 1) . .\· \ 31

Tabel VII (fortsat)____________

Eksempel Forbindelse med formlen (II) Forbindelse med formlen (I) 10-[N-(-7-guanidinohepta- 10-[N-(7-guanidinohepta- noyl)- -benzyl-L-aspartyl]- noyl)-L-aspartyl]~l,5,10~ 1,5-dibenzyloxycarbonyl- triazadecan - 1,5,10-tr iazadecan« trihydrochlor id hydrochlorid NMR (DMSO-dg) NMR (DMSO-dg) £=1,0 - 2;5 (b, 14H) £ -0,9 - 1,8'(b, 12H) 1,9 - 2,4 (d, 2H) 1,8 - 2,5 (b, 6II) 2.4 - 3;7 (b, 12H) 2,7 - 3,5 (b, 10H) 4,3 - 4;9 (b, IH) .. 4,1 - 4,7 (b, IH) 5,00 (s, 2H) 6,9 - 8,7 (b, 13H) 5.05 (s, 4H) 10 5,2 - 6*4 (b, 3H) 6,7 - 8,0 (b, 5H) 7,33 (s, 15H) IR (KBr) '.i (cm”1) = 3320, 2935, 1640 1550, 1470, 1350 1310, 1170, 965 TLC (n-butanol: vand: TLC (n-but.anolipyridin: eddikesyre = 4:4:1 r/r) vand:eddikesyre

Rf = 0,4 = 6:4:3:2 r/r)

Rf = 0,4

Id)^1 -10,3° (c = 1,5 .H 0) _ MS (FD) m/z 430 (Μ + 1) 32 \ Eksempel_Forbindelse med formlen (II) Forbindelse med formlen (I) 10-[N-(-7~guanidinohepta- 10-[N-(7-guanidinobepta- noyl)-L-glutaminyl]-1,5- noyl)-L-glutaminyl]-1,5 ,10 dibensyloxycarbonyl-1,5,10- triazadecane triazadecan - hydrochlorid trihydrochlorid NMR (DMSO—d,) NMR (DMSO-d..) 6 6 £=0,9 - 2,4 (b, 20H) 0=0,8 - 1,8 (bf 14H) 2r6 - 3,8 Cd, 1011) 1,8 - 2,4 (b, 6H) 3,3 - 4,3 (b, IH) 2,6 - 3;S (b, 12H) 4,99 (s, 2H) 4,0 - 4,3 (m, IH) 11 5,04 (s, 2H) .,6,5 - 9,2 (b, 12H) 6,5 - 8,3 (b, 10H) 7,34 (s, 10H) IR (KBr) (cm-1) = 3400, 2940, 1655 1540, 1455, 1160 965 TEC (chloroform:methanol: TLC (n-propanolzpyridin: eddikesyre - 8;2:0.5 r/r) vand:eddikesyre

Rf = 0,1 = 6:4:3:2 r/r)

Rf = 0,4 [M]^3 -11,2° (c = 1,1 H20) ___MS (FD) m/z 443 (M + 1) Γ.ν *

33 DK 160089 B

Tabel VII (fortsat)_____

Eksempel Forbindelse med formlen (II) Forbindelse med formlen (I) 10-[N -(-7-guanidinohepta- 10-[N-(7--guanidinohepta- r1 noyl)-N -nitro-L-arginyl3 - noyl)-L-arginy1]-1,5,ΙΟΙ ,5-dibenzyloxycarbonyl- triazadecan- 1,5,10- triazadecan - hydro- trihydrochlorid chlorid NMR (DMSO-dg) NMR (DMSO-dg) 5= 1,0-1,9 (b, 18H), 1,9- l,0-l,9(b, 16H), 1,9- 2,5(b, 2H), 2,7-3,8(b, 2,3(b, 4H), 2,7-3,8(b, 12H), 4,1-4,5(b, IH), 12H), 4,0-4,5(b, IH), 5,01 (a, 2H), 5,04{a, .. 6,5-9,2(b, 1711).

12 2H), 6,0-8,4(b, 11H), IR(KBr) 7,30 (a, 10H) (^-1)=3330, 2930, 1640, TLC(n-propanol:pyridin : .1530, 1460, 1365, 1250, vand:eddikesyre = 1160, 1100.

6:4:3:2 r/r) TLC(n-propanol:pyridin: vand:eddikesyre = 6:4:3:2 r/r)

Rf =0,8: Rf = 0,2

IcUp3-7,2°(c=l,2, -H20) MS(FD) m/z 471(M+l).

' i . 1v φ. , ___ ... 34 DK 160089 Β

Tabel VII (fortsat)________

Eksempel Forbindelse med formlen (II) Forbindelse med formlen (I) 10- [N-(-7-guanidinohepta- 10-[N-(7-guanidinohepta- noyl)-L-phenylalanyl]- noyl)-L-phenyialanyl]- 1,5-dibenzyloxyearbonyl- 1,5,10-triazadecan- l,5,10-triazadecan - hydro- trihydrochlorid chlorid NMR (DMSO-dg) NMR (DMS0-dg> $= 0;9-2;4 (b, 16H), 2,1- £= 0,9-1,8(^ 12H), 1,9- 3;7(b,10H), 3,5(s, 2,3(b, 4H)r 2,7-3,8(b, 2H), 4/3-4;7(b./ IH), 12H), 4,2-4,7(b, IH), 4;98(a, 2H), 5 r 02(s r 6,9-9,3(b, 12H), 7;22 13 2H), 679-8;3(br 8H), : (s, 5H).

7;17(s, 5H), 7730(s, IR(KBr) 10H). (cm-1)=3320 , 29 30, 1645 TLC(n-butanol: vand:eddike- 1530, 1455, 1370, 965, acid = 4:1:1 r/r) 700.

TLC(n-propanol:pyridin: vand:eddikesyre = 6:4:3:2 r/r)

Rf = 0j5 Rf — 0,4 [o(3q7-6,70(c=1^2, H20) MS(FD) m/z 462(M+l).

>=·-- - -------------—---- ,* .v '

35 DK 160089 B

Tabel VII (fortsat)_____________________

Eksempel| Forbindelse med formlen (II) Forbindelse med formlen (I) 10-[N-(~7-guanidinohepta- 10-[N~(7-guanidinohepta- 3.

noyl)-N 1 -benzyloxyccrbonyl- noyl)-L~histidyl]~l,5,lO-L-histidyl3~l,5-dibenzyloxy~ triazadecan-carbcnyl-1,5,10--triazadecane trihydrochlorid hydrochlorid NMR (DKSO-dg) RMR (DMSO-d6) .£=0,9 - 2,0 (b, 14H) £ = 0,9 - 1,8 (b, 12H) 2.0 - 3,5 (d, 14H) 1,8 - 2,3 (bf 4H) 4.0 - 4,5 (b, IH) 2,7 - 3,5 (b, 123) 4,99 (s, 2H) :: 4,3 - 4,9 (b, IH) 5,03 (s, 2H) 6,3 - 9,0 (bf 17H) 14 5,10 (s, 2H) 6,7 - 8,0 (b, 20) 7,31 (s, 15H) IR (KBr) (cm-1) = 3370, 2940, 1650 1 1540, 1460, 1370 1165, 1080 TLC (n-butanol: vand: tlc (n-propanol :pyri.din : eddikesyre - 4:1:1 r/r) vand:eddikesyre

Rf=0j4 =6:4:3:2 r/r) '·' , Kf - 0,3

IcU2d7 “2,8° (c = 1,2 H20) _____:__MS (FD) m/z 452 (M + 1) 36 ' ---- -

Tabel VII (fortsat)_______

Eksempel Forbindelse med formlen (II) Forbindelse med formlen (I) 10- [N-(-7-guanidinohepta- 10-[K-(7-guanidinohepta- noyl)-O-benzyl-L-threonyl]- noyl)-L-threonyl]-l,5,10- 1,5-dibenzyloxycarbonyl- fcriazadecan- 1,5,10-triazadecane trihydrochloride hydrochlorid NMR (DMSO—d, ) NMR (DMSO-dc) o r o £=0,6 - 2,4 (b, 19H) <3=1,05 (d, 3H, J=6Hz) 2,6 - 3,5 (b, 10E) 0,8 - 1,9 (b, 12H) 3.5 - 4,3 (b, 2H) 1,9 - 2,4 {b, 4H) 4,3 - 4,6 (b, 2H) 2,6 - 4,3 (b, 15H) 4.6 - 5,2 (b, 3H) :;6,5 - 9}5 (b, 10H) 15 ' 4,98 (s, 2H) 5.02 (s, 2H) 6,5 - 8,0 (b, 5H) 7,2.(s, 5H) 7.3 (s, 10H) IR (KBr) * (cm-1) = 3330, 2940, 1650 1530, 1465, 1380 1160, 1110, 930 TLC (n-butanol: vand: TLC (n-butanoi:pyridin : eddikesyre = 4:4:1 (r/r) vand:eddikesyre Rf = 0;7 = 6:4:3:2 r/r )

Rf = 0,2 [οϋ0 -13,1° (c = 1,1H.20) • _!____MS (FD) m/z 416 (M + 1) i

37 Ui\ ibUUB^D

Tabel VII (fortsat)

Eksempel Forbindelse med formlen (II) Forbindelse med formlen (I) 10- [ti- ( (S) ~7~guanidino~3- 10- [N- ( (S )-7~cjuanidino-3-acetoxyheptanoyl)-glycyl]- acatoxyheptanoyl)-glycyl- 1,5-dibenzyloxycarbonyl- 1,5,10-triazad.ecan- 1,5,10-triazadecan- trihydrochlor id hydrochlorid NMR (DM30-dg) nm (DMSO-dg) 5=0,9 - 1,9 (b, 12H) £=1,0 - J-;8 <b, 10H) 2,0 (s, 3H) 1,8 - 2,2 (b, 2K) 2.2 - 2,7 (b, 2H) 2,0 (s, 3H) 2.7 - 3,8 (b, 12H) 2,2 - 2,7 (b, 2H) 4,9 - 5,3 (b, IH) 2,7 - 3,5 (b, 10H) 16 4,98 3,65 (b, 2H, J=5Hz) 5.02 (s,s 4H) 4.9 - 5,3 (b, 1K) 5.7 - 9,0 (b, 8H) 5,7 - 9,6 (b, 12H) 7.3 (s, 10H) IR (KBr) (cm"1) = 3390, 2950, 1720 1650, 1545, 1455 1380, 1250, 1170 1030 TLC (n-butanol: vand: TLC (n-propanolipyridin : eddikesyre = 4:1:1 r/r) vand:eddikesyre

Rf = 0,8 =6:4:3:2 r/r)

Rf = 0,27 [cU2D°/6-l,4° (c = 1,14, B20) _____[MS (FD) m/z 417 (H + 1)

Tabel VII (fortsat)__;_^___ ' Eksempel Forbindelse med formlen (II) Forbindelse med formlen (I) 10-[N-(9-guanidinohepta- 10-[N- (9-guanidinohepta- noyl)-O-ben zy1-L-seryl]- noy1)-L-seryl]-1,5,ΙΟΙ, 5-benzyloxycarbonyl- triazadecan - 1,5,10-triazadecan - trihydrochlorid hydrochlorid NMR (DMSO-d-.) NMR (DMSO-d,) b b S =1, 0 -2,0 (b, 18H) δ =1,0 - 1,8 (b, 16H) 2;0 - 2,4 (b, 2H) 1.8 - 2,4 (b, 4H) 2,7 - 3.5 (br 10H) 2.6 - 3,5 (b, llH) 3,58 (d, 2H, J=6Kz) 3;55 (dr 2Hr J=5Kz) 4;2 - 4,8 (b, IH) ^4,0 - 4;3 (b, lH) 17 ' 4,47 Csf 2H) 7,0 - 9,6 (b, 12H) 5,01 (s, 2H) 5.05 (s, 2H) 6,9.- 8,3 (b, 8H) 7,29 (s, 5H) 7.33 (s, 10H) * IR (KBr) - (cm-1) = 3350, 2940, 1655 1540, 1470, 1160 1060 TLC (chloroform:methanol: TLC (n-propanolipyridin : eddikesyre = 9:1:0,3 r/r) vand:eddikesyre Rf = 0,2 = 6:4:3:2 r/r)

Rf = 0,6 \ tå)” -5,0° (c = 0,5 H20) ___MS (FD) m/z 430 (tø + £)_

O

39

DK 160089 B

Eksempel 18 1,04 g (ca. 1,5 mmol) 10-[N-(7-guanidinoheptanoyl)--DL-homoseryl]-1,5-di-tert.-butoxycarbony1-1,5,10-triaza-decanacetat opløses under afkøling i 3 ml trifluoreddike-5 syre. Derpå omrøres opløsningen i 5 timer ved stuetemperatur til eliminering af tert.-butoxycarbonylgruppen.

Efter omsætningen afdestilleres trifluoreddikesy-ren ved koncentration under formindsket tryk. Remanensen tilsættes 10 ml 1 N saltsyre, og blandingen koncentreres 10 under formindsket tryk, hvorved der fås 0,97 g olieagtigt stof. Det olieagtige stof opløses i 10 ml destilleret vand, og opløsningen chromatograferes på en 230 ml søjle af "CM-Sephadex" C-25 (Na+). Søjlen elueres under anvendelse af en gradienteluering mellem 1200 ml destilleret 15 vand og 1200 ml af en vandig opløsning af 0,9 M natrium-chlorid.

Aktive fraktioner opsamles og tørres under formindsket tryk. Det tørrede materiale tilsættes methanol, og det uopløselige natriumchlorid fjernes ved filtrering.

2o Dette rensningstrin gennemføres igen. Til fjernelse af en ringe mængde resterende natriumchlorid opløses det dannede olieagtige stof i 5 ml methanol og ledes gennem en 100 ml søjle af "Sephadex" LH-20. Søjlen elueres med methanol, og aktive fraktioner opsamles og koncentreres 25 under formindsket tryk, hvorved der fås 0,38 g olieagtigt stof. Dette olieagtige stof opløses i 4 ml destilleret vand, og det uopløselige materiale fjernes ved filtrering. Filtratet frysetørres, hvorved der fås 0,37 g af det ønskede produkt i et udbytte på 45%.

30 NMR (DMS0 - dg):^ 0,6-2,0 (b, 14H) , 2,0-2,3 (b, 4H) , 2,6-4,0 (b, 15H), 4,0-4,7 (b, IH), 6,0-9,5 (b, 10H).

IR (KBr): V (cm_1)= 3380, 2940, 1650, 1530, 1470, 1380, 1165, 1055, 965.

35 TLC (n-propanol:pyridin:vand:eddikesyre = 6:4:3:2 r/r)

O

40

DK 160089 B

Rf = 0,4

Ms (FD): m/z 416 (M + 1).

Referenceeksempel 1 (1) 10-(Ν,Ν-phthalylglycyl)-1,5-dibenzyloxycarbonyl--1,5,10-triazadecan 5 —i- 1,24 g (30,0 mmol) l,5-dibenzyloxycarbonyl-l,5,10--triazadecan opløses i 100 ml tetrahydrofuran, og 4,90 ml (35,0 mmol) triethylamin sættes til opløsningen under afkøling med is. Blandingen tilsættes yderligere 10,6 g 10 (35,0 mmol) af en ester af phthalylglycin med N-hydroxy- succinimid, og systemet bringes til omsætning natten over ved stuetemperatur.

Reaktionsblandingen tørres under formindsket tryk, og remanensen opløses i 1200 ml ethylacetat. Ethylacetat-15 opløsningen vaskes med en 5%'s natriumhydrogencarbonatopløsning, 0,5 N saltsyre og en mættet vandig opløsning af natrium-chlorid i den nævnte orden. Ethylacetatlaget tørres over vandfrit natriumsulfat, hvorefter tørremidlet fjernes ved filtrering. Filtratet koncentreres under formindsket 20 tryk, og ethylacetat og ethylether sættes til remanensen til krystallisation af denne. De dannede krystaller opsamles ved filtrering og tørres, hvorved der fås 14,6 g af det ønskede produkt i et udbytte på 81,0%.

Smp.: 102-104°C

25 NMR (DMS0 - d^ · J' = 1,0-2,2 (b, 6H), 2,7-3,6 (b, 8H), 4,20 (s, 2H), 5,01 (s, 2H), 5,03 (s, 2H), 6,8-8,4 (b, 2H), 7,30 (2, 10H), 7,84 (s, 4H).

TLC (chloroform:methanol:eddikesyre = 95:5:3 r/r) 30 Rf = 0,4

Udgangsmaterialet, 1,5-dibenzyloxycarbonyl-l,5,10--triazadecan, fremstilles på følgende måde: 55,0 g (350 mmol) 1-(4-aminobutyDhexahydro-pyrimi-din og 92,0 g (420 mmol) ethoxycarbonylphthalimid opløses 35 i 580 ml dimethylsulfoxid. Til opløsningen sættes 42,0 g

DK 160089B

O

41 (700 mmol) iseddike·, og blandingen omsættes natten over ved stuetemperatur og under omrøring. Reaktionsblandingen koncentreres under formindsket tryk ved hjælp af en vakuumpumpe.

5 Remanensen opløses i 200 ml destilleret vand, og opløsningen indstilles på pH-værdi 1,0 ved tilsætning af koncentreret saltsyre, hvorefter opløsningen koncentreres under formindsket tryk. Remanensen omkrystalliseres fra ethanol, hvorved der fås 46,9 g 10-phthalyl-10 _1'5 ,10-triazadecan-dihydrochlorid som et bleggult stof i et udbytte på 38,5%.

Smp.: 244-246°C

NMR (D20) :£/"*= 1,5-2,0 (b, 4H) , 2,0-2,5 (m, 2H) 2,9-3,5 (b, 6H), 3,5-3,9 (b, 2H) 15 7,76 (s, 4H).

27,9 g (80,0 mmol) af det dannede 10-phthalyl--1,5,10-triazadecan-dihydrochlorid opløses i 300 ml chloroform. Til opløsningen sættes 43,9 g (160 mmol) benzyl-S-4,6-dimethylpyrimidin-2-yl-thiolcarbonat og 2o 17,8 g (17,6 mmol) triethylamin, og blandingen omsættes i 6 timer ved stuetemperatur og under omrøring. Reaktionsblandingen vaskes med 1 N saltsyre og en vandig opløsning af natriumchlorid i den nævnte orden og tørres over vandfrit magnesiumsulfat. Det tørrede materiale koncentreres 25 under formindsket tryk, hvorved der fås 43,1 g (kvantitativt) 10-phthalyl-l,5-dibenzyloxycarbonyl-l,5,10-triaza-decan som et bleggult olieagtigt stof.

NMR (CDC13): or = 1,3-2,1 (b, 6H), 1,9-3,9 (m, 8H) 5,10 (s, 4H), 7,30-7,33 (s, s, 10H) 30 7,73 (m, 4H) .

31,3 g (57,6 mmol) af den dannede lO-phthalyl-1,5--dibenzyloxycarbonyl-l,5,10-triazadecan opløses i 600 ml ethanol. 18,2 g (291 mmol) 80%1 s hydrazinhydrat sættes til opløsningen, og blandingen opvarmes natten over under 35 tilbagesvaling. Udfældede krystaller fjernes ved filtre-

DK 160089 B

42 o ring, og filtratet koncentreres under formindsket tryk.

Remanensen opløses i 300 ml ethylacetat, og opløsningen ekstraheres med fortyndet saltsyre for at overføre det ønskede produkt til det vandige lag. Det vandige lag 5 vaskes med ethylacetat, og der tilsættes natriumcarbonat for at indstille den vandige væske på pH-værdi 10. Et olieagtigt materiale, som udskilles, ekstraheres med 500 ml ethylacetat, og ethylacetatlaget vaskes med en mættet vandig opløsning af natriumchlorid. Det vaskede 10 lag tørres over vandfrit natriumsulfat og koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 20,1 g 1,5-di-benzyloxycarbonyl-l,5,10-triazadecan i et udbytte på 84,8%.

NMR (CDC13)iOr= 1/0-2,3 (b, 8H), 2,3-2,9 (b, 2H), 15 2,9-3,5 (m, 6H), 5,05 (s, 2H), 5,07 (s, 2H), 5,1-6,1 (b, IH), 7,30 (s, 10H).

(2) 10-Glycyl-l,5-dibenzyloxycarbonyl-l,5,10-triazadecan 370 ml Ethanol og 6,00 g (120 mmol) hydrazinhydrat 20 sættes til 14,4 g (24,0 mmol) 10-(Ν,Ν-phthalylglycyl)--1,5-dibenzyloxycarbonyl-l,5,10-triazadecan, og blandingen tilbagesvales i 2 timer. Efter omsætningen fjernes uopløseligt materiale ved filtrering, og filtratet koncentreres under formindsket tryk. Det fremkomne olieagti-25 ge materiale opløses i 300 ml ethylacetat, og opløsningen vaskes med en 5%'s vandig opløsning af natriumhydrogen-carbonat og destilleret vand i den nævnte orden. Ethylacetatlaget tørres over vandfrit natriumsulfat, og tørremidlet fjernes ved filtrering. Filtratet koncentreres 30 under formindsket tryk, hvorved der fås 12,5 g af det ønskede produkt som et olieagtigt stof i kvantitativt udbytte.

NMR (CDC13): (f =0,8-2,1 (b, 6H), 2,8-3,5 (b, 10H) 5,0-6,1 (b, 2H), 5,06 (s, 2H) 35 5,10 (s, 2H), 7,33 (s, 10H) 43

DK 160089 B

O

TLC (chloroform:methanol:eddikesyre = 95:5:3 r/r)

Rf = 0,1 (3) 10-[N-(7-guanidinoheptanoyl)glycyl]-1,5-dibenzyl-oxycarbonyl-1,5,10-triazadecan-hydrochlorid_ 5 12,5 g (ca. 24 mmol) 10-glycyl-l,5-dibenzyloxy- carbonyl-1,5,10-triazadecan opløses i 20 ml tetrahydro-furan. 4,00 ml (29,0 mmol) triethylamin sættes til opløsningen under afkøling med is. Til blandingen sættes yderligere en opløsning af 1,3 g (ca. 30 mmol) af en 10 ester af 7-guanidinoheptansyre-hydrochlorid med N-hy-droxysuccinimid opløst i 50 ml dimethylformamid, og systemet omsættes natten over ved stuetemperatur.

Reaktionsblandingen koncentreres under formindsket tryk, og den olieagtige remanens opløses i 700 ml ethyl-15 acetat. Opløsningen vaskes med 0,5 N saltsyre mættet med natriumchlorid og vaskes derpå med en mættet vandig opløsning af natriumchlorid. Et olieagtigt materiale, som fælder ud under dette vaskningstrin, opløses ved tilsætning af en lille mængde ethanol. Derpå tørres ethylace-20 tatlaget over vandfrit natriumsulfat, og tørremidlet fjernes ved filtrering. Filtratet koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 20,8 g (udbytte: kvantitativt) af det ønskede produkt som et olieagtigt stof.

NMR (CDC13X: ^/0,8-1,.9 (b, 14H) , 1,9-2,4 (b, 2H) , 25 2,7-3,5 (b, 10H), 3,5-4,0 (b, 2H), 5,04 (s, 4H), 6,2-8,0 (b, 8H), 7,27 (s, lOH) TLC (n-butanol:eddikesyre:vand = 4:1:1 r/r)

Rf = 0,3.

30 Den ovenfor anvendte ester af 7-guanidinoheptan- syre-hydrochlorid med N-hydroxysuccinimid fremstilles på følgende måde: 50,0 g (0,344 mol) 7-aminoheptansyre og 63,5 g (0,514 mol) methylisourinstof opløses i 250 ml 50%'s 35 vandig methanol (r/r). Til opløsningen sættes dråbevis

O

-44

DK 160089 B

en opløsning af 34,3 g (0,858 mol) natriumhydroxid i 400 ml vand.

Efter den dråbevise tilsætning opvarmes blandingen natten over under tilbagesvaling. Reaktionsblandin-5 gen koncentreres under formindsket tryk til ca. halvdelen af den oprindelige mængde, hvorefter koncentratet afkøles til udfældning af hvide krystaller. Krystallerne opsamles ved filtrering og tørres, hvorved der fås 42,6 g (udbytte: 66,1%) 7-guanidinoheptansyre.

10 NMR (D20 + DCl): ¢/ = 1,0-2,0 (b, 8H), 2,2-2,6 (m, 2H), 3,0-3,3 (m, 2H).

TLC (chloroform:methanol:17%1 s ammoniakvand = 2:2:1)

Rf = 0,5 9-guanidinononansyre fremstilles på tilsvarende 15 måde ud fra 9-aminononansyre.

NMR (DMS0 + dg + DCl): q[ = 0,9-1,9 (b, 12H), 2,0-2,4 (m, 2H), 2,9-3,4 (m, 2H) TLC (n-propanol:vand:29%'s ammoniakvand = 10:3:0,15 r/r) 20 Rf = 0,6 18,7 g (10 mmol) 7-guanidinoheptansyre fremstillet i det foregående trin opløses i 1 N saltsyre, og opløsningen koncentreres under formindsket tryk til afdestil-lation af vand og tilvejebringelse af tilstrækkelig tør-25 hed. Der fås herved 2,24 g (10 mmol) 7-guanidinoheptan-syre-hydrochlorid. Dette produkt opløses i 10 ml tørt dimethylformamid, og 2,06 g (10 mmol) dicyclohexyl-carbodiimid og 1,00 g (12 mmol) N-hydroxysuccinimid sættes i den nævnte orden til opløsningen under omrøring 30 og afkøling med is. Reaktionssystemet omrøres i 30 minutter ved 0°C, får lov at antage stuetemperatur og omsættes natten over under omrøring. Udfældet dicyclohexylurinstof fjernes ved filtrering, og filtratet koncentreres under formindsket tryk.

35 10 ml ethylacetat sættes til remanensen, og udfældet

O

45

DK 160089 B

dicyclohexylurinstof fjernes ved filtrering, hvorefter filtratet koncentreres under formindsket tryk. Det fremkomne olieagtige materiale tilsættes petroleumsether, og blandingen omrøres efterfulgt af dekantering af den oven-5 stående væske. Dette vaskningstrin gentages flere gange, og det vaskede olieagtige materiale koncentreres under formindsket tryk. Det resterende opløsningsmiddel fjernes ved hjælp af en vakuumpumpe, hvorved der fås 3,65 g (kvantitativt) af en rå ester af 7-guanidinoheptansyre-10 -hydrochlorid med N-hydroxysuccinimid.

NMR (DMSO-dg): £/'= 1,1-2,0 (b, 8H), 2,67 (t, 2H, J= 6,0 Hz), 2,84 (s, 4H), 3,1 (m, 2H), 7,3, 8,0 (b, b, 5H).

Referenceeksempel 2 15 (1) 10-(N-tert.-butoxycarbonyl-O-benzyl-L-seryl)-1,5-di- benzyloxycarbonyl-1,5,10-triazadecan_ 4,76 g (11,5 mmol) l,5-dibenzyloxycarbonyl-l,5,lO--triazadecan opløses i 50 ml ethylacetat, og opløsningen tilsættes 1,04 g (10,3 mmol) triethylamin under afkøling 20 med is. Blandingen tilsættes yderligere 5,87 g (ca. 15 mmol) af en ester af N-tert.-butoxycarbonyl-O-benzyl-L--serin med N-hydroxysuccinimid, og reaktionssystemet omsættes natten over ved stuetemperatur. 50 ml Ethylacetat sættes til reaktionsblandingen, og den fremkomne 25 ethylacetatopløsning vaskes med en 5%'s vandig opløsning af natriumhydrogencarbonat, 0,1 N saltsyre og en mættet vandig opløsning af natriumchlorid i den nævnte orden. Ethylacetatlaget tørres over vandfrit natriumsulfat, og tørremidlet fjernes ved filtrering. Filtratet 30 koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 8,34 g (udbytte: kvantitativt) af det ønskede produkt.

NMR (CDC13): = 0,8-2,2 (b, 6H), 1,46 (s, 9H), 2,7-3,5 (b, 8H), 3,66 (m, 2H), 3,9-4,4 (b, IH), 4,50 (s, 2H), 35 5,11 (s, 4H), 5,1-5,4 (b, 2H), 46

DK 160089 B

O

6,1-6,8 (b, IH), 7,33 (s, 15H) TLC (chloroformrmethanol = 9:1 r/r)

Rf = 0,8 (2) 10-(O-benzyl-L-seryl)-l,5-dibenzyloxycarbonyl-l,5,10--triazadecan 5 ——----- 8,00 g (11,5 mmol) 10-(N-tert.-butoxycarbonyl-O--benzyl-L-seryl)-1,5-dibenzyloxycarbonyl-l,5,10-triaza-decan opløses ved tilsætning af 8,0 ml trifluoreddike-syre, og systemet omsættes i 3 timer ved stuetemperatur.

10 Reaktionsblandingen koncentreres under formindsket tryk, og remanensolien opløses i 200 ml ethylacetat. Opløsningen vaskes med en 5%'s natriumhydrogencarbonatopløsning og destilleret vand i den nævnte orden, og ethylacetat-laget tørres over vandfrit natriumsulfat. Efter fjernelse 15 af tørremidlet ved filtrering koncentreres filtratet under formindsket tryk, hvorved der fås 6,82 g (udbytte: kvantitativt) af det ønskede produkt som et olieagt-igt stof.

NMR (CDC13) : £/"= 1,2-2,0 (b, 6H) , 1,74 (s, 2H) , 2,8-3,5 (b, 8H), 3,64 (m, 3H), 20 4,51 (s, 2H), 5,12 (s, 4H), 4,6-6,0 (b, 2H), 7,33 (s, 15H) TLC (chloroform:methanol = 9:1 r/r)

Rf = 0,5 (3) 10-[N-(7-guanidinoheptanoyl)-O-benzyl-L-seryl]-1,5--dibenzyloxycarbonyl-1,5,10-triazadecan-hydrochlorid

aO

3,56 g (6,03 mmol) 10-(0-benzyl-L-seryl-l,5-dibenz-yloxycarbonyl-1,5,10-triazadecan opløses i 30 ml tetra-hydrofuran. Opløsningen afkøles med is, hvorpå der tilsættes 0,61 g (6,03 mmol) triethylamin. Blandingen til-30 sættes yderligere en opløsning af 6,14 g (ca. 7 mmol) tri-fluoracetat af en ester af 7-guanidinoheptansyre med p-nitrophenol opløst i 10 ml tetrahydrofuran. Dette reagerer natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen koncentreres under formindsket tryk, og remanensolien op-35 løses i 150 ml ethylacetat. Opløsningen vaskes med en 10%'s 47

O

DK 16CC89B

vandig natriumcarbonatopløsning, 0,5 N saltsyre og en mættet vandig opløsning af natriumchlorid i den nævnte orden. I løbet af vaskningstrinnet udfældes der et olieagtigt stof, som opløses ved tilsætning af en lille 5 mængde ethanol. Derpå tørres ethylacetatlaget over vandfrit natriumsulfat, og tørremidlet fjernes ved filtrering. Filtratet koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 4,77 g (udbytte: kvantitativt) af det ønskede produkt som et olieagtigt stof.

10 NMR (DMSO - dg): rf = 1,0-2,0 (b, 14H), 2,0-2,4 (b, 2H), 2.7- 3,5 (b, 10H), 3,58 (d, 2H, J=5 Hz), 4,2-4,8 (b, IH) , 4,47 (s, 2H), 5,01 (s, 2H), 5,04 (s, 2H), 6.8- 8,3 (b, 8H), 7,27 (s, 5H), 15 7,30 (s, 10H) TLC (chloroform:methanol:eddikesyre = 9:1:0,3 r/r)

Rf = 0,2

Den i referenceeksempel 1 eller 2 beskrevne fremgangsmåde gennemføres ved som N-beskyttede aminosyrer 20 med den almene formel (IV) at anvende N-tert.-butoxycarb-onyl-O-benzyl-D-serin, N-tert.-butoxycarbony1-L-alanin, N-tert.-butoxycarbonyl-ft-alanin, N-tert.-butoxycarbonyl--γ-aminosmørsyre, N.tert.-butoxycarbonyl-L-prolin, N-tert.-butoxycarbonyl-L-leucin, N-tert.-butoxycarbonyl- 25 -L-asparaginsyre-ft-benzylester, N-tert.-butoxycarbonyl-

G

-L-glutamid, N-tert.-butoxycarbonyl-N -nitro-L-arginin, N-tert.-butoxycarbonyl-L-phenylalanin, N-butoxycarbonyl- -Nim-benzyloxycarbonyl-L-histidin og N-tert.-butoxycarb- onyl-O-benzyl-L-threonin. Der fremstilles de tilsvarende 2 30 10-[N-(7-guanidinoheptanoyl-R1 ]-1,5-dibenzyloxycarbonyl- -1,5,10-triazadecan-hydrochlorider med den almene formel (II) .

35

DK 160089B

48

O

Referenceeksempel 3 (S)-7-guanidino-3-acetyloxyheptansyre 3,55 g (14,8 mmol) (S)-7-guanidino-3-acetyloxy-heptansyre opløses i 100 ml iseddike, og hydrogen-5 chloridgas indføres i opløsningen til mætning ved en temperatur under stuetemperatur. Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer ved stuetemperatur og koncentreres under formindsket tryk. Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde gennemføres endnu to gange, og remanensen tørres tilstrække-10 ligt til opnåelse af det ønskede produkt i en kvantitativ mængde.

NMR (DMSO - d,): (j = 1,0-1,9 (b, 6H) , 2,00 (s, 3H) ,

O

2,4-2,8 (b, 2H), 2,9-3,4 (b, 2H), 4,9-5,3 (b, IH), 6,6-9,3 (b, 6H) 15 TLC (aluminiumoxidplade:n-butanol:pyridin:vand:eddikesyre = 6:4:3:1 r/r)

Rf * 0,5

Referenceeksempel 4 (1) 10-(N-benzyloxycarbonyl-DL-homoseryl)-1,5-di-tert.-2Q -butoxycarbonyl-1,5,10-triazadecan_ 3,76 g (16,0 mmol) N-benzyloxycarbonyl-DL-homoserin-lacton opløses i 20 ml tetrahydrofuran. Til den dannede opløsning sættes en opløsning af 2,07 g (6,00 mmol) 1,5--di-tert.-butoxycarbonyl-1,5,10-triazadecan i 5 ml tetra-25 hydrofuran. Systemet henstilles til reaktion i 3 dage ved stuetemperatur.

Reaktionsblandingen koncentreres under formindsket tryk til afdampning af opløsningsmidlet. Remanensolien søjlechromatograferes på 400 g silicagel "Wako-Gel" C-200 3Q under anvendelse af en blanding af chloroform og methanol [chloroform:methanol = 20:1 r/r] som fremkalder. Aktive fraktioner koncentreres under formindsket tryk, og der fås 1,38 g (udbytte: 37,8%) af det ønskede produkt.

NMR (CDC13): <f = 1,0-2,3 (b, 8H), 1,47 (s, 18H), 35 2,8-3,5 (b, 8H), 3,5-4,0 (b, 3H),

O

49

DK 160089 B

4,1-4,6 (m, IH), 4,7-5,4 (b, IH), 5,09 (s, 2H), 5,8-6,3 (b, IH), 6,6-7,1 (b, IH), 7,31 (s, 5H) TLC (chloroform:methanol = 20:1 (r/r)) 5 Rf = 0,2 (2) 10(DL-homoseryl)-1,5-di-tert.-butoxycarbonyl-1,5,10- -triazadecan______ 1,35 g (2,22 mmol) 10-(N-benzyloxycarbonyl-DL-homo-seryl)-1,5-di-tert.-butoxycarbonyl-1,5,10-triazadecan 10 opløses i 20 ml methanol. 0,1 g Palladium-sort sættes til opløsningen, og systemet reduceres katalytisk i 8 timer ved stuetemperatur og atmosfærisk tryk. Efter omsætningen fjernes katalysatoren ved filtrering, og filtratet koncentreres under formindsket tryk til afdestillation af op-15 løsningsmidlet. Der fås 0,91 g (udbytte: 86,4%) af det ønskede produkt i form af en remanensolie.

NMR (CDC13): (f = 1,1-2,2 (b, 10H), 1,47 (s, 18H), 2,8-3,5 (b, 9H), 3,5-4,0 (m, 3H), 4,6-5,6 (b, IH), 7,4-7,9 (b, IH) 20 TLC (chloroform:methanol = 9:1 r/r)

Rf = 0,1 (3) 10-[N-(7-guanidinoheptanoyl)-DL-homoseryl]-1,5-di--tert.-butoxycarbonyl-1,5,10-triazadecan-acetat 0,88 g (1,85 mmol) 10-(DL-homoseryl)-1,5-di-tert.-25 -butoxycarbonyl-1,5,10-triazadecan opløses i 5 ml tetra-hydrofuran, og opløsningen tilsættes 0,30 g (2,96 mmol) triethylamin under afkøling med is. Blandingen tilsættes yderligere en opløsning af 1,19 g (ca. 3 mmol) af en ester af 7-guanidino-heptansyre-hydrochlorid med N-hydroxysuccin-30 imid opløst i 8 ml dimethylformamid, og systemet omsættes natten over ved stuetemperatur.

Efter omsætningen koncentreres reaktionsblandingen under formindsket tryk. Remanensolien opløses i 50 ml af en 2%'s vandig phosphorsyreopløsning, og opløsningen 35 vaskes med ethylacetat. Natriumcarbonat sættes til det 50

DK 160089 B

O

vandige lag til indstilling af dette på en pH-værdi på ca. 10,5. Derpå ekstraheres det vandige lag to gange med 50 ml ethylacetat, og ethylacetatlaget tilsættes eddikesyre, indtil det bliver i hovedsagen neutralt.

5 Blandingen koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 1,08 g (udbytte: 86,4%) af det ønskede produkt som et olieagtigt stof.

NMR (DMSO - dg): <f= 0,9-2,0 (b, 16H), 1,43 (s, 18H), 1,84 (s, 3H), 2,0-2,4 (b, 2H), 10 2,7-3,7 (b, 11H), 3,37 (t, 2H), 4,1-4,6 (b, IH), 6,3-8,4 (b, 8H) TLC (chloroform:methanol:eddikesyre = 8:2:0,5 r/r)

Rf = 0,3

Referenceeksempel 5 15 10-[N-(S)-7-guanidino-3-acetoxyheptanoyl)glycyl]- -1,5-dibenzyloxycarbonyl-l,5,10-triazadecan-hydro-chlorid_

En opløsning af 1,28 g (3,1 mmol) 1,5-dibenzyloxycarbonyl-l, 5, 10-triazadecan opløst i 20 ml tetrahydro-20 furan og 0,5 g triethylamin sættes til en opløsning af en ester (3,1 mmol) af N-(7-guanidino-3-acetoxyheptanoyl)--glycin-hydrochlorid med N-hydroxysuccinimid opløst i 50 ml dimethylformamid. Systemet omsættes natten over ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen koncentreres under 25 formindsket tryk. Remanensolien opløses i 100 ml ethylace-tat. Opløsningen vaskes med 0,5 N saltsyre og en mættet vandig opløsning af natriumchlorid i den nævnte orden, og med ethanol tilsat lidt efter lidt for at undgå udfældning af olieagtigt materiale. Ethylacetatlaget tørres 30 over vandfrit magnesiumsulfat, og tørremidlet fjernes ved filtrering. Filtratet koncentreres under formindsket tryk, hvorved der fås 1,91 g (udbytte: 83,9%) af det ønskede produkt som et olieagtigt stof.

35 51

O

DK 160G89 B

Referenceeksempel 6 10-[N-(9-guanidinononanoyl)-O-benzyl-L-seryl)--1,5-benzyloxycarbonyl-l,5,10-triazadecan-hydrochlorid_ 5 4,71 g (7,98 mmol) 10-(O-benzyl-L-seryl)-1,5-benz yloxycarbonyl-l, 5, 10-triazadecan-hydrochlorid opløses i 30 ml dimethylformamid, og opløsningen tilsættes 1,30 g (12,8 mmol) triethylamin under afkøling med is. Der tilsættes yderligere en dimethylformamidopløsning, der som 10 ester indeholder (ca. 12 mmol) 9-guanidinononansyre-hy-drochlorid med N-hydroxysuccinimid. Det fremkomne system omsættes natten over. Reaktionsblandingen koncentreres under formindsket tryk, og den olieagtige remanens opløses i 500 ml ethylacetat. Opløsningen vaskes med en 5%'s 15 natriumhydrogencarbonatopløsning, en mættet vandig natri-umchloridopløsning, 0,2 N saltsyre og en mættet vandig natriumchloridopløsning i den nævnte orden, og der tilsættes ethanol lidt efter lidt for at undgå udfældning af olieagtigt materiale. Ethylacetatlaget koncentreres 20 under formindsket tryk, hvorved der fås 6,02 g (udbytte: 95,7%) af det ønskede produkt som et olieagtigt stof.

25 30 35

Claims (2)

1. 5 H2NCNH(CH2)mCHCH2CO-R2-NH(CH2)4NH(CH2)3NH2 (I) HH R1 hvor R1 er et hydrogenatom, en hydroxylgruppe eller en alka-10 noyloxygruppe med 1-10 carbonatomer, R2 betyder -NH-CXH--(ch2)n-CO-· hvori X betyder et hydrogenatom, en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe med 1-6 carbonatomer, der eventuelt er substitueret med en hydroxyl-, carboxyl- eller guanidinogruppe, og n betyder 0-2, idet dog R2 ikke indbefat-15 ter en α-hydroxylglycinrest, og R2 er knyttet til nabocarbo-nylgruppen og aminogruppen ved amidbindinger, og m er et helt tal fra 4 til 6, eller et fysiologisk acceptabelt salt deraf, kendetegnet ved, at beskyttelsesgrupper fjernes fra en beskyttet spergualin-beslægtet forbindelse 2 0 med formlen R3 , I H2NCNH(CH2)mCHCH2 CO-R'2-NH(CH2)4N(CH2)3NH-R4 (II)
2. 25. Ri hvor R1 har den ovenfor anførte betydning, R'2 betyder -NH-cXH-(CH2)n“C0"/ hvori X betyder et hydrogenatom, en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe med 1-6 carbonatomer, 30 der eventuelt er substitueret med en hydroxyl-, carboxyl-eller guanidinogruppe, og n betyder 0-2, idet dog R'2 ikke indbefatter en α-hydroxyglycinrest, og R'2 eventuelt er beskyttet, hvis den som substituent har en funktionel gruppe, og R'2 er knyttet til nabocarbonylgruppen og aminogruppen 35 ved amidbindinger, og R3 og R4 er ens eller forskellige og hver især betyder en beskyttelsesgruppe for aminogruppen, og m har den ovenfor anførte betydning og om ønsket omdanner en forbindelse med den almene formel I til et fysiologisk acceptabelt salt deraf. 40