DK154290B

DK154290B - Vitamin-d-derivater og farmaceutiske praeparater indeholdende disse

Info

Publication number: DK154290B
Application number: DK260086A
Authority: DK
Inventors: Hector F Deluca; Nobuo Ikekawa; Yoko Tanaka
Original assignee: Wisconsin Alumni Res Found
Priority date: 1984-10-04
Filing date: 1986-06-03
Publication date: 1988-10-31
Also published as: IE852443L; GB8709579D0; DK15290A; DK159389B; GB2167070A; AU4776185A; GB2167070B; AU2761488A; JPH05178887A; JPS62500301A; GB2188932A; FR2571369A1; JPH0635475B2; JPH05222089A; IT8522359A0; DK15290D0; DK15390D0; DE3590488T; FR2571369B1; JPH0689022B2

Description

DK 154290 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte vi-tamin-D-derivater og farmaceutiske præparater indeholdende disse.

5 Det er velkendt, at vitamin-D regulerer calcium og phos-phormetabolismen hos dyr og mennesker, og det er nu klart fastslået, at den biologiske virkning af vitamin-D afhænger af vitaminets metaboliske omdannelse in vivo til hydroxylerede derivater. Således hydroxyleres vita-10 min-D3 in vivo til 25-hydroxy vitamin-D3 i leveren, der for sit vedkommende omdannes til la,25-dihydroxyvitamin-D3 i nyrerne. Det er den sidstnævnte forbindelse, der er anerkendt som at være den cirkulerende hormonale form af vitamin-D.

15 På grund af forbindelsernes biologiske evne til at fremme calcium- og phosphortransporten i tarmen og mobilisere og mineralisere knogler, er disse former af vitamin-D vigtige farmaceutiske forbindelser, der er særdeles vel-20 egnede til anvendelse ved behandling af forskellige knoglesygdomme.

Vitamin-D-derivater og fremstillingen heraf og deres anvendelse er omtalt i en hel række patentskrifter og i 25 anden litteratur. F. eks. omhandler OS patentskrift nr.

3 565 924 25-dihydroxy cholecalciferol; US patentskrift nr. 3 697 559 omhandler 1,25-dihydroxycholecalciferol; US patentskrift nr. 3 471 996 omhandler la-hydroxychole-calciferol; US patentskrift nr. 3 786 062 omhandler 22-30 dehydro-25-hydroxycholecalciferol; US patentskrift nr.

3 880 894 omhandler 1,25-dihydroxyergocalciferol; US patentskrift nr. 4 201 881 omhandler 24,24-difluor-ΐα,25-dihydroxycholecalciferol ; US patentskrift nr. 4 196 133 omhandler 24,24-diflubr-la,25- dihydroxycholecalciferol.

35

DK 154290 B

2

Vitamin-D-derivaterne ifølge opfindelsen har vist sig at udøve glimrende vitamin-D-lignende virkning, og af den grund kan de let anvendes i stedet for vitamin-D3 eller derivater heraf til kendte formål som f.eks. til behand-5 ling af forskellige sygelige tilstande, der viser sig ved calcium- og phosphorubalance som f.eks. hypoparathy-roidisme, osteodystrofi, osteomalacia og osteoporose.

Herudover udviser disse derivater en i forhold til la-10 hydroxyvitamin D3 og la,25-dihydroxyvitamin D3 uventet høj antineoplastisk virkning, og denne virkning udvises uventet og overraskende uden forøget calcæmisk virkning.

Disse egenskaber gør forbindelserne særdeles velegnede som erstatninger for Ια-hydroxyvitamin D3 og la,25-dihy-15 droxyvitamin D3, der er foreslået til behandling af leu-kemoid sygdom.

Disse derivater er 24-homovitaminer og specielt la,25-dihydroxy-22E(eller Z)-dehydro-24-homovitamin-D3 og 20 la,25-dihydroxy-24-homovitamin-D3.

Derivaterne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved følgende formel I: JUr, 25 Rs~ 30

Rt0 λ hvori R]_, R2 og R3 hver især er valgt blandt hydrogen, en. acylgruppe med fra 1-4 carbonatomer og benzoyl, og R4 og R5 betegner hver især hydrogenatomer eller danner 35 3

DK 154290 B

tilsammen en carbon-carbon-dobbeltbinding.

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er ejendommelige ved det i krav 7's kendetegnende del anførte.

5

De omhandlede forbindelser kan fremstilles som angivet i følgende reaktionsskema og som beskrevet nedenfor. I den skematiske og detaljerede beskrivelse af fremgangsmåden identificerer samme numre samme forbindelser.

10 15 20 25 30 35 4

DK 154290 E

wc»* ^xlJ^J^ n£rfi| ° -j honaX^J ftonoXA^ i- £ R-1H? ^ Å^n

OH

Ύ^· V’^n^0»51 ™hi,rrS ko!t H"S *? aa ~.JX) —^ X^0—> γΧυ^

- J§, */ fcs-tfoH

S X R~H

X Λ R·* ^Y |γ=ν^;κ ^χόγ ^0Χυγ .νοΧΧγ' *^ι» ^Ν/ r« ^ tw

Hc-*-CCcK ΗΟ'-'^ζοΗ ΙΛ »♦ 5

DK 154290B

Fremgangsmåden til fremstilling af derivaterne ifølge opfindelsen beskrives nærmere nedenfor:

Bisnorcholensyreacetat (a) reduceredes med lithiumalumi-5 niumhydrid og oxideredes herefter med dichlordicyanoben-zoquinon til l,4,6-trien-3-onen (b) i et udbytte på 47%.

22-THP-etheren af (b) behandledes med alkalisk hydrogen-peroxid til opnåelse af la,2a-epoxidet (1) i et udbytte på 41%. Reduktion af (1) med lithium og ammoniumchlorid 10 i flydende ammoniak-tetrahydrofuran ved -78 °C og efterfølgende behandling med chlormethylmethylether gav dime-thoxymethyletheren (2) i et udbytte på 38%. Fjernelse af THP-gruppen efterfulgt af Swern-oxidation gav aldehydet (4) i et udbytte på 81%. Dette omsattes med vinylmagne-15 siumbromid til opnåelse af allylalkoholen (5) i et udbytte på 94%. Alkoholen opvarmedes ved tilbagesvaling i xylen med triethylorthoacetat og en katalytisk mængde propionsyre, hvorved esteren (6) opnåedes i et udbytte på 93%. Herefter omsattes esteren (6) med methylmagnesi-20 umbromid til opnåelse af alkoholen (7) i et udbytte på 93%. Fjernelse af MOM-gruppen efterfulgt af acetylering gav (22E)-la,38-diacetoxy-25-hydroxy-24-homo-cholesta- 5,22-dien (9) i et udbytte på 73%.

25 Allylbromering af (9) med N-bromsuccinimid efterfulgt af behandling med tetra-n-butylammoniumbromid og herefter med tetra-n-butylammoniumfluorid gav 5,7,22-trienen (10) som et hovedprodukt i et udbytte på 24%. 5,7,22-trienen (10) bestråledes med en mellemtrykskviksølvlampe i ben-30 zen-ethanol i 5 minutter, opvarmedes herefter 1 time ved tilbagesvaling og hydrolyseredes til opnåelse af (22E)-la,25-dihydroxy-22-dehydro-24-homovitamin-D3 (11) i et udbytte på '22%.

35

DK 154290B

6 5,22-dienen (9) hydrogeneredes selektivt til opnåelse af 5-enen (12) i et udbytte på 92%. Denne forbindelse om-dannedes til la,25—dihydroxy-24-homovitamin-D3 (14) via 5,7-dienen (13) som beskrevet ovenfor i et totalt udbyt-5 te på 12%.

I den efterfølgende detaljerede beskrivelse af fremgangsmåden bestemtes smeltepunkterne med varmtrinsmikroskop og er angivet ukorrigeret. ^HNMR-spektrene blev op-10 taget med et Hitachi R-24A (60 MHz) NMR-spektrometer i CDCI3 med Me4Si som indre standard, med mindre andet er angivet. Massespektre blev optaget med et Shimadzu QP-1000 massespektrometer ved 70 eV. DV-spektre blev opnået i ethanolisk opløsning med et Shimadzu UV-200 dobbelt-15 strålespektrofotometer. Søjlechromatografi blev udført under anvendelse af silicagel (E. Merck, kiselgel 60, 70-230 mesh). Præparativ tyndtlagschromatografi blev udført på præcoatede plader af silicagel (E. Merck, kiselgel 60 F254, 0,25 mm tykkelse). Den almindelige opar-20 bejdning sker ved fortynding med vand, ekstraktion med et organisk opløsningsmiddel angivet i parentes, vask af ekstrakten til neutral reaktion, tørring over vandfrit magnesiumsulfat, filtrering og fjernelse af opløsningsmidlet under reduceret tryk. Følgende forkortelser er 25 anvendt: THP - tetrahydropyranyl; THF - tetrahydrofuran; ether - diethylether, MeOH - methanol, MOM - methoxyme-thyl. Temperaturer er angivet i °C.

22-hydroxy-23,24-dinorchola-l,4,6-trien-3-on (b) 30

Til en opløsning af 3B-acetoxydinorcholensyre (a) (7,0 g, 18,04 mmol) i THF (20 ml) sattes lithiumaluminiumhy-drid (3,0 g, 78,95 mmol). Blandingen omrørtes ved 60 °C i 14 timer. Til reaktionsblandingen sattes forsigtigt 35

DK 154290B

7 vand og ethylacetat. Filtrering og fjernelse af opløsningsmidlet gav en remanens (5,2 g). Denne behandledes i dioxan (140 ml) med dichlordicyanobenzoquinon (11,7 g, 51,54 mmol) under tilbagesvaling i 14 timer. Efter afkø-5 ling til stuetemperatur filtreredes reaktionsblandingen, og filtratet inddampedes til en remanens, der påførtes en søjle af aluminiumoxid (200 g). Eluering med dichlor-methan gav trienonen (b) (2,8 g 47%) smp. 156-157 °C (ether) UVX EtOH/max nm (epsilon): 299 (13000), 252 10 (9200), 224 (12000), 1H-NMR (CDCI3) δ: 0,80 (3H, S, 18- H3), 1,04 (3H, d, J=6 Hz, 21-H3), 1,21 (3H, s, 19-H3), 3,10-3,80 (3H, m, 22-H2 og OH), 5,90-6,40 (4H, m, 2-H, 4-H, 6-H og 7-H), 7,05 (IH, d, J=10 Hz, 1-H), MS m/z: 326 (M~), 311, 308, 293, 267, 112.

15 la,2a-epoxy~22-tetrahydropyranyloxy-23,24-dinorchola- 4,6-dien-3-on (1)

Alkoholen (b) (2,7 g, 8,28 mmol) i dichlormethan (50 ml) 20 behandledes med dihydropyran (1,5 ml, 16,42 mmol) og p-toluensulfonsyre (50 mg) ved stuetemperatur i 1 time.

Almindelig oparbejdning (ethylacetat til ekstraktionen) gav en urenset forbindelse. Til en opløsning af denne forbindelse i MeOH (70 ml) sattes 30% H202 (4,8 ml) og 25 10% NaOH/MeOH (0,74 ml), og blandingen omrørtes 14 timer ved stuetemperatur. Sædvanlig oparbejdning (ethylacetat til ekstraktionen) gav en urenset forbindelse, der påførtes en søjle af silicagel (50 g). Eluering med ben-zen-ethylacetat (100:1) gav epoxidet (1) (1,45 g, 41%): 30 smp. 113-115 °C (hexan) UVX Et^H/max nm (epsilon): 290 (22000), XH-NMR (CDC13) 6: 0,80 (3H, s, 18-H3), 1,04 (3H, d, J=6 Hz, 2I-H3), 1,21 (3H, s, 19-H3), 3,38 (IH, dd, J=4 og 1,5 Hz, 1-H), 3,55 (IH, d, J=4 Hz, 2-H), 3,30-4,10 (4H, m, 22-H2 og THP), 4,50 (IH, m, THP), 5,58 35

DK 154290 B

8 (IH, d, J=l,5 Hz, 4-H), 6,02 (2H, s, 6-H og 7-H), MS m/z: 342 (M+-DHP), 324 (M+- THPOH), 309, 283, 85.

la,38-dimethoxy-23,24-dinorchol-5-en-22-tetrahydropyra-5 nylether (2)

Lithium (5,00 g ) sattes i små portioner til flydende ammoniak (200 ml) ved -78 °C i en argonatmosfære i løbet af 30 minutter. Efter omrøring i 1 time ved -78 °C til-10 dryppedes la,2a-epoxy-22-tetrapyranyloxy-23,24-dinorcho-la-4,6-dien-3-on (1) (2,00 g, 4,69 mmol) i tør THF (50 ml) ved -78 °C i løbet af 30 minutter, og blandingen om-rørtes 1 time ved -78 °C. Til reaktionsblandingen sattes vandfrit NH4CI (60 g) i små portioner i løbet af 1 time 15 ved -78 °C. Efter 1,5 timers forløb fjernedes afkølingsbadet, og det meste af ammoniakken fjernedes ved gennem-bobling med argon. Sædvanlig oparbejdning (ether anvendtes som opløsningsmiddel) gav en urenset forbindelse.

Denne behandledes med chlor-methylmethylether (2,0 ml, 20 26,34 mmol) og N,N-diethylcyclohexylamin (4,6 ml, 24,93 mmol) i dioxan (20 ml) ved 45 °C i 24 timer. Sædvanlig oparbejdning (ethylacetat) gav en urenset forbindelse, der påførtes en søjle af silicagel (40 g). Eluering med hexan-ethylacetat (5:1) gav dimethoxymethyletheren (2) 25 (922 mg, 38%) som en olie. 1H-NMR δ: 0,70 (3H, s, 18- H3), .1,02 (3H, s, I9-H3), 1,04 (3H, d, J=6 Hz, 21-H3), 3,34 (3H, s, -0-CH3), 3,37 (3H, s, -0-CH3), 4,63 (2H, ABq, J=7 Hz, δ AB=11 Hz, 1 CX-O-CH2-O-), 4,64 (2H, S, 3β-0-CH2-0-> og 5,50 (IH, m, 6-H).

30 35 9

DK 154290 B

la,38-dimethoxy-23,24-dinorchol-5-en-22-ol (3) THP-etheren (2) (922 mg, 177 mmol) i THF (8 ml) og MeOH (8 ml) behandledes med 2 M HC1 (1 ml) i 2 timer ved 5 stuetemperatur. Sædvanlig oparbejdning (ethylacetat) gav en urenset forbindelse, der påførtes en søjle af silica-gel (40 g). Eluering med hexan-ethylacetat (2:1) gav alkoholen (3) (678 mg, 88%) som et amorpht fast stof. ^H-NMR 6: 0,70 (3H, s, I8-H3), 1,02 (3H, s, 19-H3), 1,04 10 (3H, d, J=6 Hz, 2I-H3), 3,34 (3H, s, -O-CH3), 3,38 (3H, s, -O-CH3), 4,65 (2H, ABq, J=7 Hz, δ AB= 11 Hz, la-O-CH2-0-), 4,66 (2H, s, 38-0-CH2-0-), 5,53 (IH, m, 6-H).

la,3g-dimethoxy-23,24-dinorchol-5-en-22-al (4) 15

Til en opløsning af oxalylchlorid (0,27 ml, 3,09 mmol) i dichlormethan (8 ml) sattes ved -78 °C under argon dime-thylsulfoxid (0,44 ml, 6,21 mmol). Blandingen omrørtes 10 minutter ved -78 °C. Til opløsningen sattes alkoholen 20 (3) (660 mg, 1,51 mmol) i dichlormethan (5 ml) ved -78 °C. Efter omrøring i 15 minutter tilsattes triethylamin (1,89 ml, 13,6 mmol). Blandingen omrørtes ved -78 °C under argon i 5 minutter og opvarmedes til stuetemperatur.

Sædvanlig oparbejdning (ether) gav en urenset forbindel-25 se, der påførtes en søjle af silicagel (30 g). Eluering med hexan-ethylacetat (4:1) gav aldehydet (4) (607 mg, 92%) som en krystallinsk masse med smeltepunkt 71-72 °C (hexan), 1H-NMR 6: 0,74 (3H, s, I8-H3), 1,04 (3H, s, 19-H3), 1,12 (3H, d, J=6 Hz, 21-H3),3,35 (3H, s, -O-CH3), 30 3,39 (3H, s, -O-CH3), 3,7 (IH, m, 1β-Η), 4,65 (2H, ABq, J=7 Hz, δ AB=11 Hz, la-0-CH2-0-), 4,66 (2H, s, 3&-0-CH- 0-), 5,52 (IH, m, 6-H) og 9,61 (IH, d, J=3 Hz, -CHO), analyse beregnet for-G2gH4205: C, 71,-85; H 9;74. -Fundet: C, 71,71; H, 9,68.

35 10

DK 154290 B

la,3g-dimethoxychola-5,23 dien-22-ol (5)

Til magnesium (70 mg, 2,92 mmol) i THF (3 ml) sattes en 50%^ opløsning af vinylbromid i THF (0,42 ml, 2,98 mmol).

5 Blandingen omrørtes under argon ved stuetemperatur i 30 minutter. Til det fremstillede Grignard-reagens sattes aldehydet (4) (5,95 mg, 1,37 mmol) i THF (6 ml) ved stuetemperatur. Blandingen omrørtes 1 time ved stuetemperatur. Sædvanlig oparbejdning (ether) gav en urenset 10 forbindelse, der påførtes en søjle af silicagel (30 g).

Eluering med hexan-ethylacetat (3:1) gav allylalkoholen (5) (595 mg, 94%) som et amorpht fast stof. ^H-NMR 6: 0,70 (3H, s, I8-H3), 1,02 (3H, s,m 19-H3), 3,35 (3H, s, -O-CH3), 3,38 (3H, s, -O-CH3), 3,69 (IH, m, lgH), 4,20 15 (IH, m, 22-H), 4,64 (2H, ABq, J=7 Hz, δ AB= 11 Hz, la-O-CH2-0-), 4,65 (2H, s, 38-0-CH2-0-), 5,52 (IH, m, 6-H), 4,90-6,0 (3H, m, 23-H og 24-H2).

(22E)-la,3g-dimethoxymethoxy-27-norcholesta-5,22-dien-20 26-onsyreethylester (6)

En opløsning af allylalkoholen (5) (590 mg, 1,28 mmol), triethylorthoacetat (1,0 ml, 5,64 mmol), propionsyre (4 dråber) og xylen (8 ml) opvarmedes under argon i 2 timer 25 med tilbagesvaling. Fjernelse af opløsningsmidlet under reduceret tryk gav en remanens, der påførtes en søjle af silicagel (30 g). Eluering med hexan/ethylacetat (4:1) gav esteren (6) (630 mg, 93%) som en olie. ^H-NMR δ: 0,68 (3H, s, I8-H3), 0,97 (3H, d, J=6 Hz, 2I-H3), 1,03 30 (3H, s, I9-H3), 1,24 (3H, t, J=7 Hz, -C02CH2CH3), 3,35 (3H, s, -O-CH3), 3,39 (3H, s, -O-CH3), 3,70 (IH, m, ΙβΗ), 4,11 (2H, q, J=7 Hz, -C02CH2CH3), 4,64 (2H, ABq, J=7 Hz, δ AB= 11 Hz, la-0-CH2-0-), 4,65 (2H,"s, 3β-0~ CH2-0-), 5,29 (2H, m, 22-H og 23-H), 5,52 (IH, m, 6-H).

35

DK 154290B

11

Eventuelt kan den 22E stereoisomere forbindelse (6) let omdannes til 22Z stereoisomeren ved behandling med iod.

Behandling af forbindelsen (6) i ether med en katalytisk mængde iod (2%) i forhold til forbindelsen (6) bevirker 5 således under diffust daglys i 1 time en trans til cis isomerisering, der efter HPLC-rensning (Zorbax-Sil søjle, 4,6 x 25 cm, 6% 2-propanol/hexan) giver 22Z-stereo-isomeren.

10 ( 22E)-lot, 3g-dimethoxymethoxy-24-homo-cholesta-5,22-dien- 25-01 (7)

Til en opløsning af esteren (6) (605 mg, 1,14 mmol) i THF (6 ml) sattes en 1 M opløsning af methylmagnesium-15 bromid i THF (4,5 ml, 4,5 mmol) ved stuetemperatur.

Blandingen omrørtes 1 time ved stuetemperatur. Sædvanlig oparbejdning (ether) gav en urenset forbindelse, der på-førtes en søjle af silicagel (30 g). Eluering med he-xan/ethylacetat (3:1) gav alkoholen (7) (548 mg, 93%) 20 som en olie. 1H-NMR 6: 0,68 (3H, s, I8-H3), 0,97 (3H, d, J=6 Hz, 21-H3), 1,01 (3H, s, 19-H3), 1,21 (6H, s, 26-H3 og 27-H3) 3,33 (3H, s, -0-CH3), 3,38 (3H, s, -O-CH3), 3,70 (IH, m, lg-H), 4,64 (2H, ABq, J=7 Hz, δ AB= 11 Hz, la-0-CH2-0-), 4,65 (2H, s, 3B-0-CH2-0-), 5,29 (2H, m, 25 22-H og 23-H) og 5,50 (IH, m, 6-H).

(22E)-24-homocholesta-5,22-dien-la,3g,25-triol (8)

En opløsning af dimethoxymethyletheren (7) (540 mg, 1,04 30 mmol) i THF (15 ml) behandledes med 6 M HC1 (3 ml) ved 50 °C i 2,5 timer. Sædvanlig oparbejdning (ethylacetat) gav en urenset forbindelse, der påførtes en søjle af si- .....licagel (20-g). Eluering med hexan/ethylacetat (1:1) gav triolen (8) (428 mg, 95%) som et krystallinsk produkt.

35

DK 154290 B

12

Smp. 164-166 °C (hexan/ethylacetat) ^H-NMR δ: 0,68 (3H, s, I8-H3), 0,95 (3H, s, J=6 Hz, 2I-H3), 1,00 (3H, s, 19-H3), 1,20 (6H, s, 26-H3 og 27-H3), 3,80 (IH, m, 18H), 3,92 (IH, m, 3a-H), 5,30 (2H, 22-H og 23-H) og 5,53 (IH, 5 mr 6-H)- (22E)-la,38-diacetoxy-25-hydroxy-24-homocholesta-5,22-dien (9) 10 En opløsning af triolen (8) (395 rag, 0,919 mmol) i pyri-din (2 ml) behandledes med eddikesyreanhydrid (1 ml) ved stuetemperatur i 16 timer. Sædvanlig oparbejdning (ethylacetat) gav en urenset forbindelse, der påførtes en søjle af silicagel (20 g). Eluering med hexan/ethyl-15 acetat (2:1) gav diacetatet (9) (361 mg, 77%) som en olie. 1H-NMR δ: 0,67 (3H, s, I8-H3), 0,97 (3H, d, J=6 Hz, 21-H3), 1,07 (3H, S, 19-H3), 1,21 (6H, s, 26-H3 og 27-H3), 2,01 (3H, s, acetyl), 2,04 (3H, s, acetyl), 4,98 (IH, m, 3a-H), 5,05 (IH, m, 18-H), 5,31 (2H, m, 22-H og 20 23-H) og 5,52 (IH, m, 6-H).

(22E)-la,3 B-diacetoxy-25-hydroxy-24-homocholesta-5,7,22-trien (10) 25 En opløsning af 5-enen (9) (51 mg, 0,0992 mmol) og N- bromsuccinimid (21 mg, 0,118 mmol) opvarmedes med tilbagesvaling under argon i 20 minutter i carbontetrachlorid (3 ml). Efter at blandingen var afkølet til 0 °C frafil-treredes det udfældede bundfald. Filtratet koncentrere-30 des under 40 °C til opnåelse af en remanens. Denne behandledes i THF (5 ml) med en katalytisk mængde tetra-n-butylammoniumbromid i 50 minutter ved stuetemperatur.

Herefter behandledes blandingen med en opløsning af te-tra-n-butylammoniumfluorid i THF (3,5 ml, 3,5 mmol) i 30 35

DK 154290B

13 minutter ved stuetemperatur. Sædvanlig oparbejdning (ethylacetat) gav en urenset forbindelse, der underkastedes præparativ tyndtlagschromatografi (hexan/ethylace-tat, 4:1, fremkaldt 5 gange). Båndet med Rf-værdien 0,48 5 fjernedes og elueredes med ethylacetat. Fjernelse af opløsningsmidlet gav 5,7,22-trienen (10) (12,5 mg, 24%), UVX Et0H/max nm: 293, 282 og 271.

lot,25-dihydroxy-22E-dehydro-24-homovitamin-D7 (11) 10

En opløsning af 5,7,22-trienen (10) (7,3 mg, 0,0143 mmol) i benzen (90 ml) og ethanol (40 ml) bestråledes med en mellemtrykskviksølvlampe gennem et Vycor-filter ved 0 °C i 5 minutter under argon. Reaktionsblandingen 15 opvarmedes under argon i 1 time med tilbagesvaling.

Fjernelse af opløsningsmidlet under reduceret tryk gav en urenset forbindelse, der underkastedes præparativ tyndtlagschromatografi (hexan/ethylacetat, 4:1, der blev fremkaldt 5 gange). Båndet med Rf-værdien 0,38 fjernedes 20 og elueredes med ethylacetat. Fjernelse af opløsningsmidlet gav vitamin-D3~diacetatet (1,8 mg, 25%). Båndet med Rf-værdien 0,43 fjernedes, og der elueredes med ethylacetat. Fjernelse af opløsningsmidlet genudvandt 5,7,22-trienen (10) (2,1 mg, 29%).

25

Vitamin-D3-diacetat (1,8 mg, 2,15 mmol) i THF (4 ml) behandledes med 5% KOH/MeOH (1 ml) ved stuetemperatur i 20 minutter. Sædvanlig oparbejdning (ethylacetat) gav en urenset forbindelse, der underkastedes præparativ tyndt-30 lagschromatografi (hexan/ethylacetat, 1:2, fremkaldt 3 gange). Båndet med Rf-værdien 0,43 fjernedes og elueredes med ethylacetat. Fjernelse af opløsningsmidlet gav vitamin-D3-analogen (11) (1,4 mg, 90%). Renheden af forbindelsen (11) bestemtes til 100% ved højtryksvæskechro-35 14

DK 154290 B

matografi (Shimadzu LC-3A? søjle Zorbax ZIL normalfase, 4,6 mm indre diameter x 15 cm; opløsningsmiddel MeOH-CH2CI2, 1:49, strømningshastighed 3 ml/minut; tilbageholdelsestid 11,5 minutter). Den vitamin-D3 analoge (11) 5 havde følgende spektraldata: DVX Et0H/max: 265 nm, UVX Et0H/min: 228 nm, MS m/z: 428 (M+), 410, 392 (basetop), 374, 287, 269, 251, 152, 134, 123, 59 1H-NMR (360 MHz) δ: 0,55 (3H, s, I8-H3), 1/02 (3H, d/ J=6,6 Hz, 21-H3), 1,22 (6H, s, 26-H3 og 27-H3), 2,32 (IH, dd, J=13,2 og 10 6,7 Hz), 2,60 (IH, dd, J=13,0 og 3,0 Hz), 2,83 (IH, dd, J=12,0 og 3,0 Hz), 4,23 (IH, m, Wjy2 = 18 »4 Hz, 3a-H), 4,43 (IH, m, W1/2 = 16,9 Hz, 1β-Η), 5,00 (IH, bs, W1/2 = 3,2 Hz, 19-H), 5,30 (IH, dd, J=15,0 og 7,1 Hz, 22-H eller 23-H), 5,33 (IH, bs, Wi/2 = 3,2 Hz, 19-H), 5,37 (IH, 15 dd, J=15,0 og 5,8 Hz, 22-H eller 23-H), 6,01 (IH, d, J=11,0 Hz, 7-H), 6,32 (IH, d, J=11,0 Hz, 6-H).

la,38-diacetoxy-24-homocholesta-5-en-25-ol (12) 20 En blanding af 5,22-dienen (9) (40 mg, 0,0778 mmol) og 10% Pd-C (4 mg) i ethylacetat (2 ml) omrørtes under hydrogen i 3 timer ved stuetemperatur. Pd-katalysatoren frafiltreredes, og filtratet koncentreredes til opnåelse af en remanens, der påførtes en søjle af silicagel (5 25 g). Eluering med hexan/ethylacetat (4:1) gav 5-enen (12) (37 mg, 92%) som en olie. ^H-NMR 6: 0,66 (3H, s, I8-H3), 1,08 (3H, s, 19-H3), 1,20 (6H, s, 26-H3 og 27-H3), 2,02 (3H, s, acetyl), 2,05 (3H, s, acetyl), 4,97 (IH, m, 3a- H), 5,07 (IH, m, 18-H), 5,53 (IH, m, 6-H).

30 la,38-diacetoxy-24-homocholesta-5,7-dien-25-ol (13) 5^enen (12) (19 mg, 0,037 mmol) omdannedes som beskrevet for forbindelsen (9) til 5,7-dienen (13) (5,8 mg, 31%).

35

•DK 154290 B

15 UVX Et0H/max: 293, 282, 271 nm.

la,25-dihydroxy-24-homovltaniin-D^ (14) 5 5,7-dienen (13) (5,8 mg, 0,0113 mmol) omdannedes søm beskrevet for forbindelsen (10) til den vitamin-D3 analoge (14) (890 /ug, 19%). Tilbageholdelsestiden for (Γ4) under de ovenfor beskrevne HPLC-betingelser var 11,D minutter DVX EtOH/max. 265 am, UVX E^H/min: 228 nm,. ;MS 10 m/z: 430 (M+), 412, 394 ((.basetop), 376, 287, 269, TESI, 152, 134, 59.

De omhandlede forbindelsea: kan eventuelt let fås ii rfcry-stallinsk form ved omkrystallisation med passende qpløs-15 ningsmidler som hexan, ether, alkohol, eller blandinger heraf, hvilket vil være klart for fagmanden.

Biologisk aktivitet 20 Knoglecalciummobiliseringsvirkninq af la,25-(OH)?-2;4-ho-mo-D^-forbindelser

Den knoglecalciummobilisexende virkning undersøgtes ved at måle forøgelsen i serumealciumniveauer som respons på 25 den administrerede forbindelse. Han-fravænnede rotter (Holtzman Co., Madison, Wl') blev fodret med en lav-cal-cium-vitamin-D-fattig diæt (Suda et al., J. Nutr. 100, 1049-1059, 1970) og vand ad libitum i 3 uger. Herefter blev rotterne opdelt i 3 grupper på 5-6 rotter i hver 30 gruppe og intrajugulart indgivet enten l,2'5(OH)2D3 eller forsøgsforbindelsen opløst i 0,05 ml 95% ethanol. Rotterne i kontrolgruppen fi:k 0,05 ml ethanolvehikel på . samme måde. 18 timer efter indgivelsen aflivedes rotterne, og deres blod opsamledes og centrifugeredes til op-35 16

DK 154290 B

nåelse af serum. Serumcalcium-koncentrationerne bestemtes med et atomabsorptionsspektrometer Model 403 (Per-kin-Elmer Co., Norwalk, Conn.) i nærværelse af 0,1% lan-thanumchlor id.

5

Resultaterne er angivet i følgende tabel: 10 15 20 25 30 35

OK 154290B

17 "Tabel 1

Forøgelse af serumcalciuankoncentration som respons på en administreret forbindelse 5

Administreret Administreret Serumcalcium forbindelse mængde koncentration (pmol/rotte) (mg/100 ud) 10 Eks. I Ethanol — 3,6±0,3a/)* la, 25- ‘650 4,9±0,2bl) (OH)2-D3 la, 25- (650 4,4±0,2b'> (OH)2-24- 15 homo-D3

Eks. II Ethanol — 4,2+0,lc;) la,25- (OH)2D3 325 5,0+0,5d) 20 la,25- 650 5,0±0,5d) (OH)2-22E- dehydro-24- homo-D3 25 * Standardafvigelse fra gennemsnit signifikant forskel lig b) fra a) og p < 0,001 d) fra c).

30 35

DK 154290 B

18

Af ovennævnte resultater kan det konkluderes, at i de vitamin-D afhængige systemer hos vitamin-D-manglende dyr udviser de omhandlede forbindelser samme virkning som la,25-dihydroxyvitamin-D3, den cirkulerende hormonale 5 form af vitaminet, skønt når det drejer sig om 22-dehy-dro-derivatet, var dosis betydelig højere.

Dersom de omhandlede forbindelser administreres til humane promyelocytiske leukæmiceller (HL-60 celler) dyrket 10 i vævskultur, inducerer disse differentiering af disse celler til makrofager (monocyter). I adskillige standardmetoder til måling af differentieringsaktiviteten viste disse forbindelser sig at være mere effektive end la,25-(OH)2D3, det mest aktive hidtil kendte vitamin D-15 derivat. Disse forsøg udførtes på følgende måde:

Undersøgelse af homovitamin D-forbindelsers differentieringsvirkning 20 Den humane promyelocytiske leukæmicellelinie (HL-60) holdtes i suspensionskultur i RPM1 1640 substrat (Gibco,

Grand Island, NY) tilsat 10 rumfang/rumfang-% varmeinak-tiveret føtalt kalveserum, 100 ug/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin og 0,25 pg/ml fungizone. Cellerne 25 dyrkedes i en befugtet atmosfære med 5% CO2. Cellelevedygtighed undersøgtes ved standardmetoder f.eks. ved tryphanblåt exclusion. Den morphologiske bedømmelse blev foretaget på Wright farvede dækglaspræparater.

30 Cellerne udsåedes i koncentrationer på 1,5-2 x 10^ cel-ler/ml i 10 ml substrat i vævskulturskåle. Efter 20 timers forløb behandledes skålene parvis med la,25-(OH)2D3 - og en af forbindelserne Ί"eller II i forskellige·koncentrationer som angivet nedenfor. (Forbindelserne I og II 35

DK 154290 B

19 er defineret nedenfor). IForsøgsforbindelserne tilsattes som opløsninger i 100% ethanol, således at den totale ethanolkoncentration i hver dyrkningsskål ikke oversteg 0,2%. Kontrolkulturer belhandledes med samme koncentrati-5 on af ethanol. Efter 4 dages (96 timers) inkubation med forsøgsforbindelserne indhøstedes cellerne fra disse kulturskåle og celletal og levedygtighed bestemtes. Differentieringsgraden induceret af de undersøgte vitamin D-derivater udtryktes som den procentdel af cellenre, 10 der udviste funchonale og enzymatiske markører, der er karakteristiske for monoeyter. De to undersøgte markører var a) evnen ved cellerne til at phagocytisere død<gær, og b) evnen hos cellerne til at frembringe superoxid (reduceret nitrotetrazollaimblåt), når der stimuleredes 15 med phorbolestere.

a) Phagocytoseundersøgelse for differentieringsakitivi-tet; 20 De indhøstede celler opslæmmedes i RPMI substrat indeholdende 20% AB serum og 20% føtalt kalveserum til opnåelse af et præparat, der indeholdt 2 x 10® celler//mL.

Til 0,5 ml (10® celler) af ovennævnte suspension .-sattes herefter 0,5 ml af en suspension (i phosphatpufret salt-25 vand) af varmedræbte Sacctoaromyces cerevisiae celler (1 x 10® celler), der var blevet farvet med tryphanb'låt.

Efter inkubering af denne blanding i 1 time ved 37 °C blev antallet af phagocyliske celler talt (bestemt ved hjælp af tryphanblåtfarvet gær, der forekom intracellu-30 lært) og udtrykt som en procentdel af det totalt tilstedeværende antal levende celler. Denne "% phagocytiéke celler" giver differienteringsprocenten induceret af forsøgsfOrbindelserne·.-Resultaterne er opsummeret i tabel 2 nedenfor.

35 20

DK 154290 B

TABEL 2

Procent phagocytiske (differentierede) celler produceret i HL-60 cellekulturer behandlet med vitamin D-forbindelser i forskellige koncen-5 trationer

Admini- Koncentration (mol/liter) streret 10 forbindelse 0(a'b) 3x1O-10 5xl0~10 lxlO_9(bJ lxl0“8(b) lxl0_7(b) lxlO-7 la,25- (OH)2D3 1Q±1,5 17 23 28±4 47±1 67±6 69 15

Forbindelse I* 10±1,5 29 38 47±6 69±3 77+1 78

Forbin- 20 delse II* 10±1,5 31 48 51±4 59+0,5 77±1 78 a kontrolniveau; cellekulturer blev behandlet kun med opløsningsmidlet ethanol 25 h ° resultaterne angivet i disse søjler repræsenterer gennemsnit ± standardafvigelse af tre forsøg, der hver blev foretaget 2 gange.

2Q *Forbindelse I - la,25-dihydroxy-24-homovitamin D3

Forbindelse II - la,25-dihydroxy-22E-dehydro-24-homo- vitamin D3 35

DK 154290 B

21

Resultaterne i tabel 2 viser, at 24-homoforbindel·serne havde meget ens differentieringsaktivitet og er betydeligt mere aktive end 25—(OH)2D3. I alle koncentrationer bevirker homoforbindelserne en større grad af diffe-5 rentiering af leukæmicellerne end la,25-(OH)2D3, den hidtil mest aktive kendte forbindelse. F.eks. bevirker homoforbindelserne i en koncentration på 10“8 mol/1 en differentiering på 70%, medens la,25-(OH)2D3 i samme koncentration kun giver ca. 47% differentierede celler.

10 For at opnå en omtrentlig 50% differentiering kræves en koncentration på 1 x 10-9 M af homoforbindelserne, men ca. 1 x 10-8 M af la,25-(OH)2D3 dvs. homoforbindelserne har en differentieringsaktivitet, der er ca. 10 ganpe højere.

15 b) NBT-reduktionsforsøg for differentiering:

Denne analysemetode udnytter evnen hos monocytlignende leukæmiceller til at reducere nitroblåt tetrazolium 20 (NBT) reagenset til et blåsort bundfald (formazan), nar de stimuleres med phorbolestere. Undersøgelsen udførtes som beskrevet af Yen et al- (J. Cellular Physiol. 11U, 277 (1984). Cellerne indhøstbedes som beskrevet ovenfor og opslæmmedes i RPMI substrat; til 0,2 ml af denne sus-25 pension (indeholdende 1,4 x 108 celler/ml) sattes 0,2 ml nitroblåt tetrazolium (NBT) reagens. (NBT reagenset var fremstillet ved at blande en opløsning indeholdende 50 mg nitroblåt tetrazolium i 50 ml phosphatpufret saltvand med 10 μΐ af en acetone/vand (1:1) opløsning indeholden-30 de 0,5 mg/ml 48-phorbol-1.2~myristat-13-acetat). Efter henstand i 30 minutter i vandbad taltes de differentierede celler (dvs. celler, der viste formazanblåtaflejringer som en-indikation-på NBT reduktion) med· et hæmo-cytometer og udtryktes som en procentdel af det totale 35

DK 154290 B

22 antal tilstedeværende levende celler. Resultaterne af denne undersøgelse er angivet i tabel 3.

TABEL 3 5

Procent celler i HL-60 cellekulturer, der udviser nitroblåttetrazolium (NBT) reducerende evne efter behandling med vitamin D-forbindelser i forskellige koncentrationer 10 —-

Admini- Koncentration (mol/liter) streret ' ' forbindelse o(a'b> 3xl0—10 5xl0“10 lxl0_9(b) lxl0“8(b> lxl0-7<b) lxl0-7 15 -I- 10,25- (OH)2D3 10±1,5 15 27 31+4 45±4 69±7 65

Forbin- 20 delse I1 10±1,5 33 39 46±4 72±1 79±5 77

Forbindelse II1 10±1,5 33 45 52+5 71±1 78±5 79 25 a kontrolniveau; celler kun behandlet med opløsningsmidlet ethanol k resultaterne angivet i disse søjler repræsenterer 2q gennemsnit ± standardafvigelse på tre adskilte forsøg# der hver blev foretaget 2 gange.

Forbindelse I - lo,25-dihydroxy-24-homovitamin D3 Forbindelse II - la#25-dihydroxy-22E-dehydro-24-homo-25 vitamin D3

•BK 154290 B

23

Resultaterne angivet i tabel 3 viser atter, at de undersøgte 24-homoforbindelser er mere aktive end la,25-(OH)2D3 til at inducere «differentiering af humane rnyelo-ide leukæmiceller til normale celler, in vitro, ag iat 5 alle homoforbindelser som i det forrige forsøg (tabel 2) er lige aktive. For at opnå 60% differentiering af leu-kæmiceller målt ved denne NBT reduktionsmetode kræves en koncentration på 2 x 10“® M af homoforbindelserne;; for at opnå samme differentieringsgrad med la,25-(OH’)3>I>3 10 kræves en koncentration på 3,5 x 10“® M, en 17 fold forskel med hensyn til aktiviteten.

Begge undersøgelser bekræfter således den høje aktivitet af de omhandlede 24-homovitamin D-forbindelser til at 15 inducere differentiering af leukæmiceller. Herudover viser ovennævnte resultater* at med hensyn til denne differentieringsaktivitet er de omhandlede homovitamiin d-forbindelser 10-20 gange mere aktive end la,25-(®H;)jiD3.

20 De omhandlede forbindelser kan let administreres som sterile parenterale opløsninger ved injektion eller Intravenøst eller per os i form af perorale doser eller som suppositorier eller transcutant. Doser på fra ca..

0,1 yg til ca. 2,5 ug pr. dag er i stand til at give fy-25 siologisk calciumbalancerespons, der er karakteristisk for vitamin-D-lignende virkning, idet en vedligeholdelsesdosis på fra ca. 0,1 pg til ca. 0,5 ug er passende.

Doseringsformer af de omhandlede forbindelser kan frem-30 stilles ved at kombinere disse med et ikke-toxisk farmaceutisk acceptabelt bærestof, der er velkendt inden for området. Sådanne bærestoffer kan være enten faste eller flydende som f.eks, majsstivelse, lactose, saccharose, jordnøddeolie, olivenolie, sesamolie og vand.

35

DK 154290B

24

Dersom et fast bærestof anvendes, kan doseringsformerne af de omhandlede forbindelser være tabletter, kapsler, pulvere, drageer eller sugetabletter. Dersom et flydende bærestof anvendes, kan bløde gelatinekapsler eller si-5 rupper eller flydende suspensioner, emulsioner eller opløsninger udgøre doseringsformen. Dosisformerne kan også indeholde adjuvanser som f.eks. konserveringsmidler, stabilisatorer, befugtningsmidler eller emulgatorer, opløsningsf remmere osv. De kan yderligere indeholde andre 10 terapeutiske aktive forbindelser.

Den administrerede dosis til en patient afhænger af det specifikke sygdomstilfælde, af det resultat man ønsker i det pågældende tilfælde, af patientens fysiske størrelse 15 såvel som af andre faktorer, der er velkendte for fagmanden.

20 25 30 35

Claims

1. D-vitaminderivater, kendetegnet ved,, at de 5 har den almene formel I o - 10 rJ^· 15 hvori Rx, R2 og R3 hver især er valgt blandt hydrogen, en acylgruppe med fra 1 til 4 carbonatomer og benzoyl, og R4 og R5 hver især betegner hydrogenatomer eller ttil-20 sammen danner en carbon-carbon dobbeltbinding.

2. Derivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Ri, R2 og R3 betegner hydrogen, og R4 og R5 betegner hydrogenatomer.

3. Derivat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at Ri, R2 og R3 betegner hydrogen, og R4 og R5 tilsammen danner en carbon-carbon-dobbeltbinding.

4. Derivat ifølge krav 2 eller 3, k e nd e t e g me t ved, at det er i krystallinsk form.

5. Derivat ifølge krav 3, kendetegnet ved, at Δ-22-bindingen er i E-komfigurationen. 35 DK 154290 B

6. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det indeholder et derivat ifølge et vilkårligt af de foregående krav og et farmaceutisk acceptabelt hjælpestof. 5 10 15 20 25 30 35