DK149963B

DK149963B - Fremgangsmaade til fremstilling af 2,5-diketo-d-gluconsyre eller et saltderaf

Info

Publication number: DK149963B
Application number: DK361281A
Authority: DK
Inventors: Takayasu Sonoyama; Shigeo Yagi; Bunji Kageyama; Masahiro Tanimoto
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1980-08-14
Filing date: 1981-08-13
Publication date: 1986-11-03
Also published as: ES8204762A1; DK149963C; GB2083028B; DK361281A; DE3167468D1; SU1190992A3; IE811847L; US4879229A; CS224624B2; US5134077A; KR840001257B1; YU43032B; EP0046284A3; JPS6041596B2; KR830006428A; CA1168999A; IE51496B1; YU198281A; AU546761B2; AU7420481A

Description

149963

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt mikrobiologisk fremgangsmåde til fremstilling af 2,5-diketo-D-gluconsyre (herefter refereret til som 2,5-DKG) eller et salt deraf ud fra D-glucose.

2,5-DKG er et nyttigt mellemprodukt ved fremstillingen af L-as-05 corbinsyre. 2,5-DKG kan nemlig selektivt og stereospecifikt reduceres til 2-keto-L-gulonsyre, en prækursor for L-ascorbinsyre (se fx. US-patentskrifterne 3.922.194, 3.959.076, 3.963.574 og 3.998.697).

Ved kendte fremgangsmåder er fremstillingen af 2,5-DKG blevet 10 opnået ved dyrkning af aerobe mikroorganismestammer, som hører til slægterne Acetobacter, Acetomonas, Gluconobacter og Pseudomonas. Ingen tilfælde er hidtil rapporteret, hvor den er blevet fremstillet ved hjælp af dyrkning under anvendelse af fakultativt anaerobe stammer, som hører til slægten Erwinia.

15 Det har nu vist sig, at mikroorganismer tilhørende tre hidtil ukendte arter af slægten Erwinia er i stand til at danne 2,5-DKG i højt udbytte og i høj subtratkoncentration.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i overensstemmelse hermed ejendommelig ved, at D-glucosen bringes i kontakt med mindst 20 en mikroorganisme tilhørende en af arterne Erwinia citreus, Erwinia punktata og Erwinia terreus eller en cellesuspension af de nævnte mikroorganismer eller et enzym ekstraheret fra de nævnte mikroorganismer, hvorpå 2,5-diketo-D-gluconsyre eller et salt deraf om ønsket udvindes fra den resulterende blanding.

25 Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan udføres på forskellige måder, fx. ved dyrkning af mindst én stamme af de nævnte mikroorganismer i et vandigt næringsmedium indeholdende D-glucose, eller ved simpelthen at bringe disse mikroorganismer, fx. i form af hvilende celler, immobiliserede celler, knuste celler eller 30 derfra ekstraherede cellefrie enzymer, som kan være suspenderet i et flydende medium eller fikseret på overfladen af et stationært leje, i kontakt med et hvilket som helst substrat, der indeholder D-glucose.

I hele den foreliggende beskrivelse og krav anvendes udtrykket 35 "dyrke" på en sådan måde, at det omfatter alle arter af mikrobiologiske operationer, ved hvilke mikroorganismerne indpodes og inkuberes i mediet til frembringelse af en fermentativ virkning deri. Ud- 2 149963 trykket "bringe i kontakt" anvendes pi en sådan måde, at det betegner operationer, ved hvilke mikroorganismerne eller derfra opnåede produkter kombineres med substratet til frembringelse af en omdannelse af D-glucose til 2,5-DKG, uden hensyntagen til kontaktens 05 varighed, dvs. inkubation.

Af de nævnte nye arter af slægten Erwinia er stammer blevet deponeret hos Fermentation Research Institute, Japan, og hos American Type Culture Collection, Washington D.C., og har fået tildelt hhv. FERM-P og ATCC-numre som følger: 10

Tabel I

SHS- Navn tildelt de isolerede mikroorganismer FERM-P ATCC 2003 Erwinia citreus 5449 31623 2006 Erwinia punctata 5452 31626 15 2004 " " var. 5450 31624 2005 " " var. 5451 31625 2007 " " var. 5453 31627 2008 Erwinia terreus 5454 31628 2009 " 11 var. 5455 31629 20 2010 " " var. 5456 31630 2011 " " var. 5457 31631

Detaljer af taxonomiske studier af disse mikroorganismer vil blive beskrevet samlet i tabel II nedenfor.

25

Tabel II

A. Iagttagelser 1. Celleform: (Bouillon-agar skråsubstrater ved 28°C i 24, 72 og 168 timer) 30 Celler hovedsagelig enkelte, stave med de angivne dimensioner med afrundede ender fælles for alle de iagttagne stammer. Nogle gange iagttages tilstedeværelsen af deformerede celler med de viste dimensioner i nogle stammer.

35 149963 3

Fremherskende celler: Deformerede celler:

Stamme: (Dimensioner(p)) Udvidede Udstrakte celler: SHS- celler: (Dimensioner^)) 2003 0,8-1,2 x 1,0-2,9 Iagttaget Iagttaget, 1,6 x 6,0-7,0 05 2004 1,0-1,5 x 1,5-3,3 " " 0,7-0,8 x 4,0-5,0 2005 1,0-1,3 x 1,6-2,1 " " 0,7-0,8 x 2,4-3,0 2006 1,1-1,3 x 1,3-1,9 11 " 0,6-0,8 x 2,4-2,7 2007 1,0-1,2 x 1,7-2,3 Ingen Ingen _ 2008 0,8-0,9 x 1,5-1,7 " " _ 10 2009 1,0 x 1,2-2,1 " " _ 2010 1,0 x 1,0-2,0 « " _ 2011 1,1 x 1,3-2,0 " " _ 2. Motilitet og flagellation: 15 (Bouillon-agar skråsubstrater ved 20°C og 25°C i 18 til 24 timer)

Motilitet bekræftes ved hængende-dråbe metoden. Flagellation bekræftes under et optisk mikroskop efter farvning ved Toda-meto-den, eller ved hjælp af et elektronmikroskop af transmissions-type efter dyrkning ved en støttet membran-dyrkningsmetode. Stammer 20 SHS-2003, 2004, 2005, 2006 og 2007: generelt non-motile.

Stamme SHS-2008: Motil med mono-lateral flagellum.

Stammer SHS-2009, 2010 og 2011: Motile med én eller to laterale flagella.

3. Spore: Generelt ikke dannet med nogen af de anførte stam- 25 mer.

4. Gram-farvning: (Bouillon-agar skråsubstrater ved 28° C i 24, 72 og 168 timer)

Generelt negativ med hver af de anførte stammer.

5. Syrefasthed: Generelt negativ.

30 B. Vækst på forskellige medier.

1. Bouillon-agar kolonier ved 28°C i 24, 48, 72 og 168 timer. Begyndelseskolonier er generelt runde, hele, glatte, gennemskinnelige og butyrøse.

35 4 149963

Stammer Glans Farve Fremskridt af kultur SHS- (eventuel koloni-forandring) 2003 skinnende svagt rødliggul konveks 2004 11 svagt beige glat, men skifter gradvis til 05 ru 2005 " " 11 konveks, men skifter gradvis til ophøjet 2006 " 11 " konveks, men skifter gradvis til skjoldbukkelformet -]0 2007 " 11 " ophøjet, men skifter gradvis til skjoldbukkelformet 2008 mat til svagt rødliggul glat, men skifter gradvis til skinnende ru og konveks. Mat, men skif ter gradvis til skinnende 15 2009 Skinnende svagt beige glat, men skifter gradvis til ru og ophøjet 2010 " " " konveks, men skifter gradvis til skjoldbukkelformet 2011 11 svagt rødliggul konveks, men skifter gradvis 20 til flad. Viskos, men skifter gradvis til butyrøs. 1

Bouillon-agar skråsubstrat ved 28°C i 24-168 timer. Begyndelseskolonier er generelt trådformede og butyrøse.

25

Stammer Vækst Glans Farve Fremskridt af kultur SHS- (forandring) 2003 frodig skinnende svagt rødliggul _ 2004 " mat til svagt beige mat, men skifter grad- 30 skinnende vis til skinnende 2005 moderat skinnende " " _ 2006 - " mat til svagt rødliggul mat, men skifter grad skinnende til skinnende 2007 ringe mat " 11 _ 35 2008 frodig mat til " 11 mat, men skifter gradskinnende vis til skinnende 2009 11 11 11 11 " 11 2010 moderat skinnende 11 11 _ 2011 11 11 11 11 5 149963 3. Bouillon-næringsvæske ved 28°C i 24-168 timer. Generelt ingen lugt.

Stammer Vækst på overfladen af kultur Submers vækst 05 SHS- Ring langs membran flokkulent Uklarhed flokkulent rørvæggen vækst vækst bundfald 2003 På og efter - - let ringe 3. dag 2004 - på 6. dag - let til Det i be- 10 moderat gy ndel sen kompakte bundfald skifter til ringe flok- 15 kulent bundfald 2005 - på 6. dag - let ringe 2006 - '· - let til " moderat 20 2007 på 3. dag på 7. dag - let 11 2008 på 7. dag - på 3.

dag 2009 - på 3. til på 7. " " 6. dag dag 25 2010 - på 6. dag - let til " moderat 2011 - på 4. dag - let " 1 2

Bouillon-gelatine stik ved 20°C i 40 dage.

30 Generelt ingen smeltning. Vækst langs med stiklinien.

2

Lakmus-mælk ved 28°C i 40 dage.

Stamme SHS-2003: Surgørelse begynder inden for 7 dage. Svag og ensartet koagulation begynder på omkring 18. dag og er afsluttet på 38. dag. Fra 18. dag til 32. dag bliver det øvre lag lyserødt og 35 det nedre lag bliver grålig brunt, men på 38. dag bliver hele laget ensartet lyserødt.

Stammer SHS-2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010 og 2011:

Generelt iagttages ingen forandringer i løbet af inkubationen.

6 149963 6. Kartoffel-skråsubstrat ved 28°C i 24-168 timer.

Generelt trådformet, butyrøs og skinnende.

Stammer Vækst Farve 05 SHS-2003 frodig svagt rødliggul 2004 " beige 2005 moderat " 2006 " svagt beige 2007 " beige 10 2008 frodig 11 2009 " " 2010 ; moderat 11 2011 " " 15 C. Fysiologiske egenskaber (medmindre andet er anført, baseret på resultaterne af iagttagelsen ved 28°C inden for 14 dage): 1. Nitrit: Nitrit fremstilles generelt fra nitrat.

2. Nitrat-respiration: Hverken vækst eller gasproduktion iagttages i paraffin-forseglet bouillon-næringsvæske generelt indeholdende 20 1% KNOs.

3. Methyl-rødt test: generelt positiv, med undtagelse af stamme SHS-2010, som er kun meget svagt positiv.

4. Voges-Proskauer reaktion (glucose):

Stamme SHS-2003: meget svagt positiv.

25 Stammer SHS-2004, 2005, 2007, 2008, 2010 og 2011: positiv.

Stammer SHS-2006 og 2009: negativ eller meget svagt positiv.

5. · Indol: generelt negativ.

6. Hydrogensulfid: (i) Bacto-pepton-vand-blyacetatpapir: Generelt positiv.

30 (ii) TST-agar: Generelt negativ.

(iii) Kliegler-agar: Generelt negativ.

7. Ammoniak: Generelt ikke produceret.

8. Hydrolyse af stivelse: Generelt negativ.

9. Vækst på citrat-medium: 35 (i) Simmon-medium : Generelt vækst.

(ii) Christensin-medium: Generelt vækst.

*

Suppleret med en vitaminblanding.

7 149963 10. Vækst med uorganiske nitrogen kilder: (i) Ammonium (Glucose-Hucker-medium) : Generelt vækst.

(ii) Nitrat (Glucose-Dimmick-medium) : Vækst iagttages for stammer SHS-2003, 2004, 2005, 2008, 2009, 2010 og 2011: 05 mens SHS-2006 ikke vokser og SHS-2007 kun vokser meget svagt.

Suppleret med en vitaminblanding.

11. Pigment (Pladestregkultur): (i) Blåt pigment (gærekstrakt 1%, glucose 1%, CaCO^ 2%, 10 ved 28°C i 7 dage): generelt negativ.

(ii) Lyserødt diffunderbart pigment (samme medium som ovenfor): Generelt negativ.

(iii) Gult pigment (bouillon-agar ved 28°C i 7 dage): generelt negativ.

15 12. Urease: Generelt negativ.

13. Catalase: Generelt positiv.

14. Oxidase (bouillon-agar skråsubstrat, i 18-24 timer, indeholdende tetramethylphenylendiamin): Generelt negativ.

15. Temperaturforhold (Bacto-gærekstrakt 0,5%, Bacto-pepton 20 0,5% og glucose 0,5%, pH 7):

Stammer Væksttemperatur Optimal væksttemperatur SHS- (°C) (°C) 2003 8,5 - 38,5 18 - 31 25 2004 6,5 - 40,0 20 - 34 2005 6,5 - 38,5 22-28 2006 6,5 - 38,5 21 - 28 2007 4,0 - 47,5 21 - 27 2008 18,0 - 40,0 19,5 - 32,5 30 2009 8,3 - 38,5 24 - 30 2010 6,5 - 40,0 20 - 34 2011 4,0 - 40,0 19,5 - 24 16. pH-forhold (glycerol 1%, Bacto-gærekstrakt 0,05%, Bacto-pepton 35 1%, NaCI 0,5%, i 0,1 M 3,3-dimethyl-glutarsyrepuffer, 28°C i 2-4 dage) δ 149963

Stammer vækst-pH Optimal vækst-pH

SHS- 2003 5,5 - 8,0 6,0 - 7,5 2004 5,5 - 8,5 6,0 - 7,5 05 2005 5,5 - 8,5 6,0 - 7,5 2006 5,5 - 8,5 6,0 - 7,5 2007 5,5 - 8,5 6,0 - 7,5 2008 5,5 - 7,5 6,0 - 7,5 2009 5,5 - 8,0 6,0 - 7,5 10 2010 6,0 - 8,0 6,0 - 7,5 2011 5,5 - 7,5 6,0 - 7,5 17. Oxygenbehov: Generelt fakultativt anaerob: i (i) Flydende paraffin-forseglet stikkultur: 15 (Glucose-BCP-medium, indeholdende Bacto-kødekstrakt 1%, Bac- to-pepton 1%, Bacto-gærekstrakt 0,2%, NaCI 0,5%, bromcresol purpur 0,004% og agarpulver 1,5%, pH indstillet til 7,0-7,2, fordeltes pi .testrør med 18 mm diameter i en dybde på ca. 8 cm. Det fordelte medium steriliseredes ved 121°C i 15 minutter. Stikpodning gennem-20 førtes før komplet størkning af mediet. Testrørene forsegledes dernæst med steril, flydende paraffin (5-7 ml) i en dybde pi 4 cm.) Rørene dyrkedes ved 28°C og Jagttoges over et tidsrum på 7 dage.

Der iagttages en tydelig vækst langs stiklinien fra toppen til 25 bunden af mediet inden for 2-3 dage, og kulturen begynder at blive let ensartet gullig og udviser en tydelig farveforskel fra det forseglede, dyrkede, ikke-podede kontrolrør med hver af de anførte stammer. Graden af gul farve forøges yderligere i tidens løb.

(ii) Gas-Pak anaerobt system (BBL): 30 (Bacto-næringsagarplade, indeholdende Bacto-kødekstrakt 1%,

Bacto-pepton 1%, NaCI 0,5% og agarpulver 1,5%, eller GYP agarplade, indeholdende glycerol 0,5%, Bacto-gærekstrakt 0,5%, Bacto-pepton 0,3%, KHgPO^ 0,1%, MgSO^HgO 0,02% og agarpulver 1,5%, pH indstillet til 7,0-7,2). En let stribe-podning af en suspension af test-35 organismen dyrkedes ved 28°C i 48 timer efter fjernelse af oxygen ved en 2 timers reaktion ved 45°C i en inkubator.

9 149963

Der iagttages generelt kun svag vækst. Væksten er svagere end væksten af den til kontrol anvendte Escherichia coli.

18. O-F-test (Hugh-Leifson-metode): Generelt fermenterende. Medi-05 um, indeholdende Bacto-trypton 1%, Bacto-gærekstrakt 0,1%, brom- cresol purpur 0,004%, glucose (eller lactose) 1% og agarpulver 0,2%, pH indstillet til 7,0-7,2, fordeltes pi testrør (18 mm i diameter) i en dybde pi ca. 8 cm. Fordelt medium steriliseredes ved 121°C i 15 minutter. Efter at temperaturen af mediet var steget til ca. 30-40°C 10 gennemførtes dobbelte podninger for hver organisme af de anførte stammer, og et rør af hvert par forsegledes si med steril, flydende paraffin (5-7 ml) i en dybde pi ca. 4 cm. Rør dyrkedes ved 28°C og iagttoges over et tidsrum pi 7 dage.

15 Syre produceres både under aerobe og anaerobe betingelser fra D-glucose (også fra lactose, i tilfældet af SHS-2003), men ingen gas. En synlig vækst langs stiklinien fra toppen til bunden iagttages både hos den forseglede og den ikke-forseglede kultur.

Anaerob syredannelse er ikke si hurtig som ved den til kontrol 20 anvendte Escherichia coli.

19. Fremstilling af syrer og gasser fra carbohydrater: (Modificeret Barsikow-metode ved 28°C i 7 dage, stationær) 149963 ίο ® O I ® ® ® .

Stammer ® φ g £3 o os « 3 ·η o ο 01 +> Λ οι oi φ+j-h ® oi-hÆm

CtIC +) O O -P O 0 ΟΙ-ΗΟΟΙΟ,ΟΟΦ

&na O O (d ® U 3 0 3 Ή Ο +> ·Η Η O

3 3r-t;S33,OB— h H 01 I r-ι αί P Cd Λ £ ‘S - ,¾ Λ fa ο Ο 03.¾) Z CdSCfli*ii-3<<<oc3 2003 + + + + + + + + + + + + + 200¾ + + + + + + - + + - + - + 2005 + + + + + + - + + - + + + 2006 + + + + + + - + + - + + - 2ΟΟ7 + + + + + + - + + - + + - 2008 + + + + + + -.+ + - + + + 2ΟΟ9 + + + + + -- + + - + + + 2010 + + + + + + - + + - + + - 2011 + + + + + -- + + - + + - Φ ®

co ® 01 ® I

ο ® H 01 Η Η O H

M ® S S M 0 0 0 0 -p 0 jVrt 0

-τις (0 01 -Η -Η O +» 3 +> +> -Η ζ S S H

SHS- . Λ o U rt 3 ·Η ·Η ·Η ·Η Ν ·£ +* ° Ο+>+>ϋε^<Ηίϊϋ®-0 2 Ο Η X 3 Cd 3+4 ΟΗΗ « SS 3 Ο Π3 ej « 11 ΐ Ο Λ * Ό 3 « ·Τ* ,-

w s ο ag aitacQa-^^SiOH

2003 - -- -- -- -- -- -- 200¾ + _- -- -- -- -- -- 2005 + __---- + -- -- -- 2006 - -- -- -- -- -- -- 2007 + -- -- - + -- -- -“ 2008 - -- -- -- -- -- -- 2ΟΟ9 + -- -- -- -- -- -- 2010 - -- -- -- -- -- -- 2011 - -- -- -- -- -- --

Note (1) syre produceret, men ingen gas (+) (ii) lidt syre produceret, men ingen gas (+) (iii) hverken syre eller gas produceret (-) 11 149963 20. Methylen-blåt (bouillon-næringsvæske/ 18-24 timer):

Generelt reduceret.

21. D-gluconsyre: Generelt udnyttet.

22. 2-keto-D-gluconsyre: Generelt udnyttet.

05 23. Produktion af reduceret forbindelse fra saccharose (Bergey's

Manual of Determinative Bacteriolgy, 8. udgave (1974), side 335, tabel 8.19, fodnote f): Generelt positiv med undtagelse af SHS-2003.

24. Decarboxylering af forskellige aminosyrer: 10 (Shaw, C & Clarke, P.H., J. Gen. Microbiol., 13, 155-161 (1955)).

(i) L-glutaminsyre: negativ med SHS-2003, 2008, 2009, 2010 og 2011.

positiv med SHS-2004, 2005, 2006 og 2007.

15 (ii) L-lysin: generelt negativ.

(iii) L-arginin: generelt negativ.

(iv) L-ornithin: generelt negativ.

25. Lipase (modificeret Starr-metode, Starr, M.P., Science, 93 333-334 (1941)): generelt negativ.

20 26. D-gluconat-oxidation (Shaw, C & Clarke, P.H., J. Gen.

Microbiol., 13, 155-161 (1955)): Generelt positiv.

27. Pectat-nedbrydning (A.M. Paton, Nature, 183, 1812-1813 (1959)): Generelt negativ.

28. Casein-hydrolyse (D.W. Dye, N.Z. J. Sci., 11, 590-607 (1968)): 25 Generelt negativ.

29. Symplasmata (Graham, D.C. & Hodgkiss, W., J. Appl. Bacteriol., 30(1), 175-189 (1967): negativ med SHS-2003, 2004, 2005, 2007, 2008 og 2009. Positiv med SHS-2G06, 2010 og 2011.

30. DNase (Bacto-DNase testagar): generelt negativ.

30 31. Phenylalanindeaminase (phenylalanin/malonsyre-medium, kan fås fra Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.):

Stammer SHS-2003, 2008, 2009, 2010 og 2011: negativ eller meget svagt positiv.

Stammer SHS-2004, 2005, 2006 og 2007: negativ.

35 32. KCN-inhibering: generelt positiv.

33. Vækst i 5% NaCl-bouillon: generelt positiv.

34. Auxotrofi (Gray & Tatum's medium): kræver generelt nikotinsyre eller nicotinamid.

12 149963 35. Udnyttelse af nogle organiske forbindelser (D.W. Dye, N.Z. J.

Sci., 11, 590-607 (1968), OY-medium, 28°C, 20 & 44 timer, rystning): 05

Stammer +; * d d ^ ° ^ cd- -P +> «j d C d d 3 d -P O h +> arre. d(fl,H^0-P-HO-u C <d -P « d SHS- +>d£dOdONd O Η α -p -p ® -P ti S 3 H O fiH4JH d O ti o o-H03Hd3<Dddd*kd d COfcfeCiSWCQOCSOCUH -1 10 2003 + + + + + + + -- -- -- + 2004 + + + + + + + -- -- -- + 2005 + + + + + + + -- -- -- + 2006 + + + + + + + -- -- -- + 2007 + + + + + + + -- -- -- + 15 2008 + + + + + + + -- -- -- + 2009 +_+ + +.+ + + ------ + 2010 + + + + + + + -- -- -- + 2011 + + + + + + + -- -- -- + 20 Note: (i) Udnyttes som en enkelt carbonkilde (+) (ii) Udnyttes svagt eller udnyttes ikke som en enkelt carbonkilde (±) (iii) Udnyttes ikke (-) 25 36. Ubiquinon (Y. Yamada, K. Aida & T. Uemura, J. Gen. Appl.

Microbiol, 15, 181-196 (1969)):

Stammer SHS-2003, 2008: Ubiquinon-8 (og ubiquinon-7)

Stammer (SHS-2004, 2005 , 2006, 2007, 2009, 2010 og 2011:

Ubiquinon-8.

30 D. Oprindelse

Stammer SHS-2003, 2004, 2006, 2007, 2010 og 2011: Mandarin.

Stammer SHS-2005 og 2009: Dadelblomme.

Stamme SHS-2008: Jord.

De i tabel I anførte stammer blev bestemt ved sammenligning af de ovenfor nævnte taxonomiske egenskaber af de enkelte stammer i 35 13 149963 tabel II med beskrivelserne i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave, 1974 (herefter simpelthen betegnet "håndbog"), hvilket førte til den nedenfor beskrevne konklusion.

1) Tilhørsforhold mht. familie: 05 På grundlag af de ovenfor beskrevne resultater af iagttagelsen af, at alle anførte stammer har korte stave, er gram-negative og fakultativt anaerobe og ikke danner sporer og udviser en catala-se-aktivitet, men ingen oxidase-aktivitet, bestemmes de til at høre til familien Enterobacteriaceae.

10 2) Tilhørsforhold mht. slægt:

Alle anførte stammer bestemmes til at høre til slægten Erwinia på basis af de taxonomiske egenskaber, især p.g.a. at de producerer syrer fra β-methylglucosid og saccharose (med undtagelse af SHS-2003, som ikke producerer syre fra saccharose, men udnytter den som den 15 eneste carbonkilde), men ikke fra adonitol, dulcitol eller melezitose; ikke udnytter benzoat, oxalat og propionat; ikke er i stand til at hydrolysere stivelse; ikke er i stand til at decarboxylere glutaminsyre, arginin, lysin og ortinin (med undtagelse af SHS-2004, 2005, 2006 og 2007, som decarboxylerer glutaminsyre) og ikke udviser urease-20 eller lipaseaktivitet.

3) Tilhørsforhold mht. art:

Stamme SHS-2003:

Selvom denne stamme p.g.a. fravær af flagellation anses for at være nært beslægtet med Erwinia stewartii af gruppen herbicola, der 25 er defineret i håndbogen, har den imidlertid andre taxonomiske egenskaber, som på følgende punkter er meget forskellige fra egenskaberne af Erwinia stewartii: (i) Behov for nikotinsyre eller nicotinamid for vækst, (ii) Produktion af hydrogensulfid fra cystein, 30 (Πί) Reduktion af nitrat til nitrit, (iv) Ingen syreproduktion fra saccharose , arabinose, raffinose eller sorbitol, (v) Produktion af syrer fra salicin, cellobiose og glycerol, og (vi) Ingen udnyttelse af tartarat som den eneste carbonkilde.

* 35 ( Selvom den ikke kan producere syre fra saccharose, kan den udnytte denne som den eneste carbonkilde).

14 149963

Da denne stamme Ikke udviste overensstemmelse med nogen andre kendte arter i den i håndbogen definerede slægt, blev det ydermere konkluderet, at den skulle tilordnes en ny art, af opfinderne kaldet

Erwinia citreus.

05

Stammer SHS-2004, 2005 , 2006 og 2007:

Selvom disse stammer ligeledes anses for at være nært beslægtede med Erwinia stewartii p.g.a. manglende flagellation, deler de stadig andre almindelige taxonomiske egenskaber, som pi de følgende 10 punkter er meget forskellige fra egenskaberne af Erwinia stewartii: (i) Behov for nikotinsyre eller nicotinamid for vækst, (ii) Produktion af hydrogensulfid fra cystein, (iii) Reduktion af nitrat til nitrit, (iv) Decarboxylering af glutaminsyre, 15 (v) Ingen syreproduktion fra arabinose, mannitol, lactose eller sorbitol, (vi) Produktion af syrer fra salicin og cellobiose, og (vii) Ingen udnyttelse af tartarat som den eneste carbon kilde.

Desuden iagttages der, at disse stammer er forskellige fra den 20 tidligere beskrevne stamme SHS-2003 på punkterne: decarboxylering af glutaminsyre: er næppe i stand til at udnytte lactose, acetat og lactat som den eneste carbonkilde; er ikke i stand til at producere syrer fra mannitol og lactose; og har ingen aktivitet på lakmus-mælk.

Da disse stammer ikke viste overensstemmelse med nogen andre 25 kendte arter i den i håndbogen definerede slægt, blev det ydermere konkluderet, at de skulle tilordnes en ny art, af opfinderne kaldet Erwinia punctata.

Blandt disse stammer har stammerne SHS-2004 og 2006 fælles taxonomiske egenskaber på følgende punkter: 30 (i) Ingen syreproduktion fra raffinose, og (ii) Ingen udnyttelse af mannitol, acetat eller lactat.

SHS-2004 adskiller sig imidlertid fra SHS-2006 på følgende punkter: (i) Produktion af acetoin fra glucose, 35 (ii) Udnyttelse af nitrat som nitrogen kilde, (iii) Produktion af syre fra glycerol, og (iv) Udnyttelse af formiat som den eneste carbonkilde.

143963 15

Pi den anden side har stammen SHS-2005 de samme taxonomiske egenskaber som SHS-2006 på det punkt, at de næppe er i stand til at udnytte mannitol, acetat og lactat som den eneste carbonkilde, men førstnævnte stamme adskiller sig fra sidstnævnte på følgende 05 punkter: (i) Produktion af syre fra glycerol, (ii) Produktion af acetoin fra glucose, (iii) Dannelse af fluorescerende pigmenter i King B medium, (iv) Ringe produktion af syre fra raffinose, og 10 (v) Udnyttelse af formiat som den eneste carbonkilde.

Desuden har stammen SHS-2007 fælles egenskaber med SHS-2006 på de punkter, at de næppe er i stand til at udnytte mannitol, acetat og lactat som den eneste carbonkilde, men førstnævnte stamme adskiller sig fra sidstnævnte på følgende punkter: 15 (i) Produktion af syre fra raffinose, (ii) Produktion af acetoin fra glucose, (iii) Udnyttelse af formiat som den eneste carbonkilde, og (iv) Bredt temperaturområde for vækst såsom 4,0 - 47,5°C.

P.g.a. de ovenfor anførte resultater af iagttagelser udgør stam- 20 merne SHS-2004, 2005, 2006 og 2007 hver især en variant i forhold til de andre.

Stammer SHS-2008 og 2010:

Selvom disse stammer anses for at være nært beslægtede med 25 Erwinia tracheiphila eller Erwinia quercina p.g.a. deres motilitet med mono-lateral flagellum, er deres taxonomiske egenskaber på følgende punkter stadig meget forskellige fra egenskaberne af Erwinia tracheiphila, som er defineret i håndbogen: (i) Vækst ved en temperatur, der er højere end 36°C, 30 (ii) Frodig vækst på bouillon-agar medier, (iii) Udviser mucoid vækst, (iv) Reduktion af nitrat til nitrit, (v) Produktion af syrer fra salicin, xylose, melibiose og mannose, og 35 (vi) Udnyttelse af lactat som den eneste carbonkilde.

På den anden side er de på følgende punkter forskellige i taxonomiske egenskaber fra den i håndbogen definerede Erwinia quercina: 16 149963 (i) Oxidation af gluconsyre, (Π) Reduktion af nitrat til nitrit, (iii) Produktion af syrer fra melibiose og cellobiose, (iv) Ingen syreproduktion fra mannitol, α-methylglucosid, 05 esuclin og sorbitol, og (v) Ingen gasproduktion pi glucose-pepton medier.

Da disse stammer ikke udviser overensstemmelse med nogle andre kendte arter i den i håndbogen definerede slægt, blev det ydermere fundet passende at tilordne dem en ny art, af opfinderne kaldet Er-10 winia terreus.

Desuden udviser stammen SHS-2010 betydelig overensstemmelse med SHS-2008, bortset fra visse forskelle, som er iagttaget på følgende punkter: (i) Ingen syreproduktion fra glycerol, 15 (ii) Produktion af syre fra ribose ved SHS-2008 i modsætning til meget ringe produktion ved SHS-2010, (iii) Svagt positiv i methyl-rødt-test, og (iv) Dannelse af fluorescerende pigmenter pi King B medium.

20 Stamme SHS-2009

Denne stamme anses for at være nært beslægtet med Erwinia tracheiphila, E. quercina og E. herbicola, var. herbicola p.g.a. mo-tilitet med mono-lateral flagellum.

Der består imidlertid på følgende punkter bemærkelsesværdige 25 forskelfe i de taxonomiske egenskaber af denne stamme sammenlignet med Erwinia tracheiphila, som er beskrevet i håndbogen: (i) Frodig vækst i bouillon-agar medier, (ii) Vækst ved en temperatur, der er højere end 36°C, (iii) Udviser mucoid vækst, 30 (iv) Reduktion af nitrat til nitrit, og (v) Produktion af syrer fra salicin, xylose, melibiose, cellobiose, glycerol og mannose.

Derudover er der på følgende punkter også fundet bemærkelsesværdige forskelle fra Erwinia quercina: 35 (i) Oxidation af gluconat, (ii) Reduktion af nitrat til nitrit, (iii) Svag dannelse af acetoin fra glucose, 17 149963 (iv) Produktion af syrer fra xylose, melibiose og cellobiose, (v) Ingen syreproduktion fra mannitol, ot-methylglucosid, esuclin, ribose eller sorbitol, (vi) Ingen udnyttelse af tartarat som den eneste carbonkilde, 05 og (vii) Ingen gasproduktion fra glucose-pepton medium.

Desuden er der på følgende punkter yderligere fundet bemærkelsesværdige forskelle i egenskaberne af SHS-2009 og Erwinia herbicoia, var. herbicoia: 10 (i) Behov for nikotinsyre eller nicotinamid for væksten, (ii) Svag dannelse af acetoin fra glucose, (iii) Ingen smeltning af gelatine, (iv) Produktion af syrer fra melibiose, cellobiose og glycerol, og 15 (v) Ingen syreproduktion fra arabinose, mannitol, maltose, dextrin, rhamnose, ribose eller sorbitol.

Selvom der stadig forbliver nogle forskelle ved sammenligning af denne stamme med den tidligere definerede stamme SHS-2008, nemlig på punkterne: 20 (i) Svag acetoin-dannelse fra glucose, og (ii) Ingen syreproduktion fra ribose, stemmer førstnævnte stamme i andre fremherskende egenskaber overens med sidstnævnte og er således identificeret til at være en variant af den tidligere definerede Erwinia terreus.

25

Stamme SHS-2011

Denne stammer anses for at være nært beslægtet med Erwinia tracheiphila eller Erwinia amylovora p.g.a. af dens motilitet med en mono-lateral flagellum.

30 Når egenskaberne af denne stamme først sammenlignes med egenskaberne af Erwinia tracheiphila, der er defineret i håndbogen, opdages der bemærkelsesværdige forskelle på følgende punkter: (i) Moderat vækst i bouillon-agar medier, (ii) Vækst ved en temperatur, der er højere end 36°C, 35 (iii) udviser mucoid vækst, (iv) Reduktion af nitrat til nitrit, 18 149963 (v) Produktion af syrer fra salicin, xylose, melibiose, cellobiose og mannose, og (vi) Udnyttelse af lactat som den eneste carbonkilde.

Når egenskaberne sammenlignes med egenskaberne af Erwinia 05 amylovola, opdages der bemærkelsesværdige forskelle på følgende punkter: (i) Dannelse af hydrogensulfid fra cystein, (ii) Vækst ved en temperatur på 36°C eller højere, (ti?) Reduktion af nitrat til nitrit, ^0 (iv) Ingen smeltning af gelatine, (v) Produktion af syrer fra salicin, xylose, melibiose, cellobiose og mannose, og (vi) Ingen syreproduktion fra ribose.

Når denne stamme sammenlignes med SHS-2008, erkendes det 15 p| den anden side, at dens egenskaber er i overensstemmelse med sidstnævtes med den undtagelse, at der ikke produceres syre fra ribose eller glycerol, og den identificeres som en variant af den tidligere definerede Erwinia terreus.

Ud over disse isolerede mikroorganismer (vilde stammer) kan alle derfra opnåede spontane mutanter og alle stammer, der opnås ved kunstig eller induktiv mutation eller modifikation af disse isolerede mikroorganismer, og som har væsentlig samme egenskaber som disse, således at de kan henregnes til nævnte arter, anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

25 De tidligere definerede mikroorganismer vokser frodigt i et van digt næringsmedium indeholdende D-glucose som hoved-carbonkilde, majsstøbevæske som nitrogenkilde og en lille mængde uorganiske salte. Hvis de dyrkes aerobt, vokser de på medier med meget høj D-glucose-koncentration med tilstrækkelig stabilitet til at producere 30 2,5-diketo-D-gluconsyre (2,5-DKG) med godt udbytte i sammenligning med de kendte mikroorganismer, som er blevet anvendt til fremstilling af samme produkt.

Koncentrationen af D-glucose i næringsvæsken kan være så høj som 40 vægt/vol-%, hvis dette specielt er ønsket, selvom det sæd-35 vanligvis er hensigtsmæssigt for en økonomisk produktion af 2,5-di- 19 149963 keto-D-gluconsyre at holde denne koncentration i området mellem 15-25 vægt/vol-% og mere foretrukket, på ca. 20 vægt/vol-%.

Temperaturen af den til fermentering benyttede næringsvæske kan ligge i området 15-35°C, fortrinsvis i området 20-30°C og mere 05 foretrukket ved ca. 28°C. Mediets begyndelses-pH-værdi kan være i området 3,5-7,5 og fortrinsvis i området 6,0-7,0.

Næringsvæskens pH-værdi kan holdes i et ønsket område fra 4,0 - 5,5 under fermenteringen ved at inkorporere passende uorganiske salte med puffer-virkning i begyndelses-næringsvæsken, eller 10 ved fortløbende at sætte passende baser til næringsvæsken, mens fermenteringen skrider frem. Saltet kan eksempelvis være calciumcar-bonat, og basen kan eksempelvis være natriumhydroxid.

Den podede fermenterings-næringsvæske omrøres konstant med en omrører (ca. 1.740 o.p.m.) under luftning i et forhold på ca.

15 600 N ml/min.

Fermenteringen er komplet, når omdannelsen af D-glucose til 2,5-DKG når en værdi, som svarer til ca. 90% udbytte af sidstnævnte, hvilket sker ca. 17-31 timer efter starten.

Den akkumulerede 2,5-DKG eller dens salte kan isoleres som 20 krystaller fra fermenterings-næringsvæsken efter en hvilken som helst behandling såsom pH-indstilling, eller alternativt kan næringsvæsken som den er, med fordel benyttes som næringsmediet i næste trin. Fx. kan den 2,5-DKG-holdige næringsvæske direkte anvendes til produktionen af 2-keto-L-gulonsyre, således at sidstnævnte kan 25 opnås i højt udbytte ved en enkel procedure i sammenligning med de konventionelle metoder.

Udover den tidligere beskrevne fermentering kan opfindelsen udøves ved simpelthen at bringe opnåede produkter af mikroorganismerne i kontakt med substrater, der indeholder D-glucose. I disse 30 tilfælde kan betingelser, der svarer til de ovenfor i forbindelse med dyrkningen af levedygtige celler beskrevne, også anvendes til inkubation af de opnåede produkter i substratet, og omdannelsen begynder umiddelbart efter kontaktens påbegyndelse.

I det følgende beskrives opfindelsen nærmere ved hjælp af ek-35 sempler.

20 149963

Eksempel 1 (1) Podemedium:

En vandig opløsning indeholdende: D-glucose (hydratiseret, indhold 91%) 1,0 vægt/vol-% Q5 Majsstøbevæske (CSL) 5,0 "

Kaliumdihydrogenphosphat (KHgPO^ 0,1 "

Magnesiumsulfat (MgS04.7H20) 0,02 11 , og

Calciumcarbonat (CaCOg) 0,5 11 10 indstilles tii pH 6,8-7,0 med 10% vandig opløsning af NaOH, deles i 50 ml portioner og anbringes i steriliserede 500 ml koniske kolber til opnåelse af podemediet.

(2) Podekultur: 15 Hvert af medierne i kolberne podes med en løkkefuld af de i tabel III nedenfor anførte stammer hver og rystes (slag: 71 mm, 270 s.p.m) ved 28°C i ca. 8 timer. Dyrkningen afsluttes, når den optiske tæthed (O.D.) af medierne bliver ca. 8 (slutpunkt).

20 (3) Fermenterings-næringsvæske:

En vandig opløsning indeholdende: D-glucose 20,0 vægt/vol-% CSL 3,0 " KH2P04 0,1 " og 25 CaC03 6,3 " instilles til pH 6,8-7,0, deles i 455 ml portioner og anbringes i 1 L fermentatorer til opnåelse af fermenterings-næringsvæsken, hvortil der sættes 45 ml af podemediet.

30 (4) Fermentering:

Fermenteringen gennemføres under følgende betingelser:

Temperatur: 28°C

Omrøring: 1740 opm.

35 Luftning 600 N ml/min.

Tid: 17-31 timer.

21 149963 (5) Bestemmelse:

Produktet kromatograferes pi en filterpapirbærer ved, at der gis frem under de nedenfor specificerede betingelser, og pletterne bestemmes kvantitativt ved densitometri.

05 (i) Bærer: Toyo Roshi Nr. 50 (ii) Fremkaldelsesopløsning: Phenol: Myresyre: Vand = 75:4:25 (iii) Farvning:

Sprøjtning af AHF-opløsning (en opløsning af vandmættet n-butanol (100 ml) indeholdende anilin (0,93 g) og phthal-10 syre (1,66 g) efterfulgt af en farvefremkaldelses behand ling ved 105°C i 2 minutter.

(iv) Farve og Rf-værdi:

Stof: Farve: Rf: 2,5-diketo-D-gluconsyre brun 0,16-0,18 15 2-keto-D-gluconsyre lyserød 0,27-0,29 D-glucose brun 0,48-0,50

Derudover gennemføres også en tyndtlagskromatografi med "TLC alumisheet cellolose" (handelsbetegnelse, E. Merck A.G) og 20 samme fremkaldelsesopløsningsmiddelsystem og samme farveoperation som ovenfor beskrevet. I dette tilfælde gennemføres bestemmelsen ved sammenligning af kromatogrammet med det med autentiske prøver opnåede.

25 (6) Afslutning:

Fermenteringen afsluttes på et tidspunkt, når den lyserøde plet af 2-keto-D-gluconsyre forsvinder fra papiret eller tyndtlagskro-matog rammet.

30 (7) Resultater: 35 22 149963

Tabel III

Stammer Podekultur_Fermenteringskultur SHS- Ved afslutning Ved afslutning 2,5-diketo-D- ___________gluconsyre 05 pH OD Tid pH OD Tid Kone. Udbytte (h) (h) vægt/ for D- vol-% glucose _%_ 2003 7,0 10,0 8 5,4 12,3 18 19 88 10 2004 6,0 8,5 8 4,9 12,0 17 19 89 2005 6,9 9,5 9 5,1 12,6 20 19 86 2006 5,9 7,5 8 4,7 12,0 21 19 89 2007 6,0 7,0 8 4,9 12,6 17 19 89 2008 5,6 3,1 10 5,3 12,4 29 17 70 15 2009 5,8 3,4 10 5,7 12,4 21 18 79 2010 5,4 2,5 10 5,4 12,8 31 18 75 2011 5,3 2,4 10 5,1 12,2 31 17 75

Eksempler 2 og 3 (Produktioner med cellesuspension og med rå enzymekstrakt) 20 O) Medium anvendt til opnåelse af mikroorganismeceller:

En vandig opløsning indeholdende: Gærekstrakt (kan fås fra Daigo Eiyo Yakuhin K.K.) 0,1 vægt/vol-% KH2PO4 0,1 vægt/vol-% 25 NaSC^^HgO 0,02 vægt/vol-% og

CaCOg 0,6 vægt/vol-% indstilles til pH 7,0, deles i 80 ml portioner og anbringes i koniske kolber (500 ml).

30 (2) Kulturer til opsamling af mikroorganismeceller og til separering af rå enzymekstrakt:

Hvert af medierne podes med de i tabel IV nedenfor anførte stammer pi samme måde som beskrevet for podekulturen i eksempel 35 1 og rystes (slag, 71 mm, 270 s.p.m.) ved 28°C i 16 timer.

Efter rystning opsamles mikroorganismecellerne ved centrifugering af de dyrkede medier, vaskes to gange med saltvand og deles i to portioner.

1499 S3 23

En af portionerne suspenderes igen i saltvand til opnåelse af cellesuspensionen. Den anden suspenderes i et 1/50 IVI tris-HCI puffer (pH 7,5), hvori cellerne sprænges ved ultrasonisk behandling og centrifugeres til fjernelse af uopløselige rester deraf til opnåelse 05 af rå, cellefri enzymekstrakt som supernatant.

(3) Inkubation med cellesuspension:

En blanding fremstilles med 1/10 IVI 3,3-dimethylgultarsyrepuffer (pH 5,0) indeholdende ca. 5 vægt/vol-% D-glucose, hvori cellekon-10 centrationen indstilles således, at O.D. ved 660 mp er ca. 10. Blandingen deles i 10 ml portioner, anbringes i testrør på 23 mm (diameter) x 196 mm (længde) og inkuberes ved 28°C i 3 timer.

Blandingen centrifugeres til opnåelse af en supernatant, som analyseres ved papirkromatografi. Resultaterne er sammenstillet i 15 tabel IV nedenfor, hvori koncentrationen af D-glucose i blandingen før inkubation også er anført.

Tabel IV

(Koncentrationer efter 3 timers rystning)

Stammer D-glucose (¾) 2-keto-D-glucon- 2,5-diketo-D-glucon-20 før in- syre (%) syre (%) kubation 2003 4,9 2,7 0,8 1,9 2004 5,0 1,9 0,7 1,5 2005 5,0 2,6 0,6 0,7 25 2006 5,0 1,9 0,9 1,1 2007 5,0 1,4 0,3 1,4 2008 5,0 1,3 0,8 1,2 2009 5,2 1,9 0,7 1,3 2010 5,0 2,9 0,5 0,9 30 2011 5,0 2,8 0,7 0,9 1

Inkubation med rå enzymekstrakt:

Til en blanding fremstillet på samme måde som beskrevet i (3) ovenfor sættes den rå enzymekstrakt, således at dens koncentration 35 er 0,25 mg/ml, bestemt som en proteinmængde (Folin-metode). Efter rystning som tidligere beskrevet behandles blandingen med to dråber af 10 vægt/vol-% trichloreddikesyre-opløsning til fjernelse af proteindelen, og kromatograferes på et filterpapir. Resultaterne er vist i tabel V nedenfor.

24 149963

Tabel V

(Koncentrationer efter 3 timers rystning)

Stamme 2-keto-D-gluconsyre (%) 2,5-diketo-D-gluconsyre (%) SHS- 05 2003 1,0 1,0 2004 0,6 0,8 2005 0,4 0,4 2006 0,5 0,5 2007 0,3 0,4 10 2008 0,8 0,5 2009 0,4 0,6 2010 0,3 0,3 2011 0,3 0,3