SU1190992A3 - Способ получени 2,5-дикето- @ -глюконовой кислоты - Google Patents

Abstract

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 2,5-ДИКЕТО-1)-ГЛЮКОНОВОЙ КИСЛОТЫ путем культивировани  ее продуцентов на питательной среде, содержащей П-глюкозу в качестве источника углерода , источники азота, фосфора, минеральные соли и стимул тор роста, в услови х аэрации среды с последующим выделением целевого продукта, отличающийс  тем, что, с целью упрощени  и ускорени  процесса ферментации при высоком выходе целевого продукта, в качестве продуцентов используют штамм Erwinia citreus АТСС 31623 или штаммы Erwinia punctata АТСС 31624, или Erwinia punctata АТСС 31625, или Erwinia punctata АТСС 31626, или Erwinia punetata АТСС 31627, или штаммы Erwinia terreus АТСС 31628, или Erwinia terreus АТСС 31629, или Erwinia terreus АТСС 31630,или Erwinia terreus АТСС 31631. 2. Способ по п. 1, о т л и ч щ и и с   тем, что концентрацию0-глюкозы в среде устанавливают от 5 до 20 об.%.

Description

Изобретение относитс  к техничес кой микробиологии, а именно к способу получени  2,5-дикето-1)-глюконовой кислоты (2,5-ДКГ) с использованием микроорганизмов продуцентов, относ щихс  к новым штаммам микроорганизмов рода Erwinia.

Известен способ получени  2,5-дикето-В-глютеновой кислоты путем культивировани  аэробных микроорганизмов рода Pseudomonas fluorescens на питательной среде, содержащей D-глюкозу в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, минеральные соли, стимул торы рос-. . та 1 . ,

Известен также способ получени  2,5-ДКГ, согласно которому в качестве продуцента целевого продукта используют микроорганизмы рода Acetobacter, которые культивируют в услови х аэрации среды на питательной среде, содержащей D-глюкозу в качестве источника углерода, источник азота, фосфора, минеральные соли и стимул тор роста в услови х аэраци среды с последующим выделением целевого продукта 2 .

Согласно этому способу в питательную дополнительно ввод т Ь-пролин, что способствует увеличению выхода, целевого продукта. Однако эта добавка хоть и увеличивает выход продукта, но не ускор ет процесс и к тому же его усложн ет. Последний длитс  до 64 ч, что естественно приводит к большим расходам .энергии.

Целью изобретени   вл етс  упрощение и ускорение процесса ферментации при высоком выходе целевого продукта .

Цель достигаетс  тем-, что согласно способу получени  2,5-дикето-1)глюконовой кислоты путем культивировани  ее продуцентов на питательной среде, содержащей Э-глюкозу в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, минеральные соли и стимул тор роста, в услови х аэрации среды с последующим выделением из |кулътуральной среды целевого продук а , в качестве продуцентов используют штамм Erwinia citreus АТСС 31623 или штаммы Erwinia punctata АТСС 31624, или Erwinia punctata . АТСС 31625, или Erwinia punctata АТСС 31626, или Erwinia punctata АТСС 31627, или штагФ1Ь Erwinia terreus АТСС 31628, или Erwinia terreu АТСС 31629, или Erwinia terreus АТСС 31630, или Erwinia terreus АТСС 31631.

Согласно предлагаемому способу концентрацию О-глюкозы в среде следует устанавливать от 5 до 20 об.%.

Таким образом, предлагаемый способ можно осуществл ть с использованием указанных штаммов рода Erwinia способных селективно окисл ть I)-глюкозу и превращать ее в 2,5-ДКГ.

Эти штаммы перечислены в табл, 1 Они хран тс  в институте исследовани  ферментации в Японии и в Американской коллекции культур в Вашингтоне . ,

Данные таксономических исследований этих микроорганизмов представлены в табл. 2. .

А. Наблюдени .

1.Форма клеток (скошенный бульоный агар при 28°С в течение 2k, 72

и 168 ч).

Численно преобладают одиночные клетки, палочки указанных в таблице размеров с закругленными концами у всех штаммов. Иногда в некоторых наблюда отс  деформированные клетки указанных размеров .

2.Подвижность и жгутикование (скошенный бульонный агар при 20 и 25С в течение 18-24 ч).

Подвижность определ ют методом вис щей капли.

Жгутикование подтверждаетс  под оптическим микроскопом после окрашивани  по методике Toda или при помощи просвечивающего электронного микроскопа после культивировани  по методике культивировани  в поддерживаемой мембране.

Штаммы SHS-2003, 2004, 2005, 2006 и 2007 подвижные.

Штамм SHS-2008 подвижный с монолатеральным жгутиком.

Штаммы SHS-2009, 2010 и 2011 подвижные с одним или двум  латеральными жгутиками. .

3.Споры не образуют ни один из приведенных штаммов.

4.Окрашивание по Граму (скошенный бульонный агар при в течение 24, 72, 168 ч). Отрицательна  у всех из приведенных в таблице

: штаммов. 5, Кислотостойкость. У всех штаммов отрицательна . Ь. Рост на различных средах (табл. 3). 1.Колонии на бульонном агаре пр в течение 24, 48, 72 и 168 ч. Начальные колонии-все круглые, цельные, гладкие, прозрачные и масл нистые. 2.Скошенный бульонный агар при 28с в течение 24-168 ч (табл. 4). Начальные колонии все нитевидные и масл нистые. 3.Бульон при 28 С в течение 24-68 ч. У всех штаммов нет запаха (табл. 5). 4.Столбик бульонной желатины при 20 С в течение 40 дней. Все штаммы не разжижают. Рост вдоль оси столбика. 5.Лакмусовое молоко при 28 С в течение 40 дней. Штамм SHS-2003. Подкисление нач наетс  в течение 7 сут. Слаба  рав мерна  коагул ци  начинаетс  прибл зительно на 18-й день и заканчиваетс  на 38-й день. С 18-го по 32-й день верхний слой становитс  розовы а нижний слой - серовато-коричневым но на 32-й день весь слой равномерн розовый. У штаммов SHS-2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2010 и 2011 в течение периода инкубации не замечено ника ких изменений, 6.Скошенный картофель при в течение 24-168 ч. Колонии у всех штаммов нитевидные, масл нистые и блест щие (табл. 6). В. Физиологические свойства (на основании результатов наблюдений при 28С в течение 14 дней, если отсутствуют другие указани ). 1.Нитрит. Все штаммы продуцируют нитрит из нитрата. 2.Нитратное дыхание. У всех не наблюдаетс  ни рост, ни продуцирование газа в запечатанном парафином .бульоне, содержащем 1% KNO. 3.Испытание с метилротом. У всех положительный, за исключением штамма SHS-2010 (слабо положительный). 4. Реакци  Voges-Proskanera (глюкоза). У штамма SHS-2003 - слабо положительна . У штаммов SHS-2004 2005, 2007, 2008, 2010 и 2011 - положительна . У штаммов SHS-2006 и 924 2009 -т отрицательна  или слабо положительна  . 5.Индол. У всех штаммов - отруцательна . 6.Сероводород. Бактопептонна  вода-свинцово- ацетатна  реактивна  бумага - у всех положительна . TSI-arap. У всех штаммов - отрицательна . Агар Klieglera. У всех штаммов отрицательна . 7.Аммиак. Все штаммы не продуцируют . 8.Гидролиз крахмала. Отрицательна  у всех штаммов. 9.Рост на цитратных средах. Среда Simmona, дополненна  витаминной смесью. Рост - у всех штаммов . Среда chrrstensina. Рост у всех штаммов. Рост на неорганических источниках азота. Аммиак (среда - глюкоза Huckera, дополненна  витаминной смесью). Рост У всех. Нитрат (среда - глюкоза Dimmika, дополненна  витаминной смесью). Рост наблюдаетс  у штаммов SHS-2003, 2004, 2005, 2008, 2009, 2010 и 2011, штамм SHS-2006 не растет, а штамм SHS-2007 растет очень слабо, 11. Пигмент (культура штрихом на чашках Петри). Синий пигмент (дрожжевой экстракт 1%, глюкоза 1%, СаСО, 2% при 28с в течение 7 дней). У всех негативна . отрицательна . Розовый, способный к диффузии пигмент (среда аналогично приведенной), У всех штаммов - отрицательна . Желтыр пигмент (бульонный агар при 28с в течение 7 дн.). У всех штаммов - отрицательна . 12.Уреаза. У всех штаммов - отрицательна  . 13.Каталаза. У всех штаммов отрицательна . (4. Оксидаза (скошенный бульонный агар, содержащий тетраметилфенилендиамин , в течение 18-24 ч). Отрицательна  у всех штаммов. 15. Температурна  зависимость (бактодрожжевой экстракт 0,5%, бактопептон 0,5% и глюкоза 0,5%, рН 7) представлена в табл. 7.

16.Зависимость от рН (глицерин 1%, бактодрожже.вой экстракт 0,5%,

бактопептон 1%, хлорид на5три  0,5%, в буфере 0,1 М 3,3-диметилглутарово кислоте, 28 С в течение 2-4 дней) представлена в табл. 8.

17.Потребность в кислороде. У всех штаммов - факультативна .

Палочкова  культура, запечатанна  жидким парафином. В этом случае среду глюкоза-ВСР, содержащую, %: бактом сной экстракт 1, бактопептон 1, бактодрожжевой экстракт 0,2, хлорид натри  0,5, бромкрезол пурпурный 0,004 и порошок агара 1,5 (рН 7,0-7,2), разлили в пробирки диаметром 18 мм и высотой около 8 с и стерилизовали при 121 С в течение 15 мин. Столбики инокулировали до полного затвердевани  среды. Затем пробирки запечатали стерильным жидКИМ парафином (5-7 мл) на глубину 4 см, культивировали при 28 С и наблюдали спуст  7 дней.

При значительном росте вдоль оси палочек сверху до дна среды в течение 2-3 дней культура начала равномерно окрашиватьс  в бледно-желтый цвет, показыва  отчетливую разНиду в окраске каждого из приведенных в таблице, штаммов по сравнению с контрольной запечатанной неинокулирован ной пробиркой. С течением времени интенсивность желтой окраски возрастала .

Анаэробна .система газ-Рак (ВВ L).

Использовали чашку Петри с бакто питательным агаром, содержащим, %: бактом сной экстракт 1, бактопептон 1, хлорид натри  0,5 и порошок агара 1,5, или чашку Петри с агаром I УР, содержащим, %: глицерин 0,5; бактодрожжевой экстракт 0,5; бактопептон 0,3; KHjPO 0,1;- M. 0,02; порошок агара 1,5; рН 7,0-7,2 Слабый посев штрихом суспензии Испытуемого организма культивировали : при 2Р. С в течение 48 ч после удалени  кислорода путем двухчасовой, реакции при 45С в инкубаторе.

У всех штаммов наблюдалс  слабый рост, слабее чем у Escherichia coli, вз той дл  контрол .

18(Тест открытого пол . У всех штаммов - ферментативна . Среду, содержащую, %: бактотриптон 1 : , бактодрожжевой экстракт 0,1; бромкрезол

пурпурный 0,004; глюкозу (или лактозу ) 1% и порошок агара 0,2; pi 7,0-7,2, разлили в пробирки (ди метр 18 мм) на глубину приблизительно 8 см и стерилизовали при 121 С в течение 15 мин. После достижени  температуры среды приблизительно 30-40 С продублирована инокул ци  дл  каждого организма из приведенных в таблице штаммов. Затем одну пробирку из каждой пары запечатали стерильным жидким парафином (5-7 мл) на глубину приблизительно 4 см, культивировали , при 28 С и вели за ними наблюдение в течение 7 дней.

Продуцируют кислоту как в аэробных , так и анаэробных услови х из D-ГЛЮКОЗЬГ (а также из лактозы в случае SHS-2003) , газ не продуцирует. Наблюдаетс  отчетливый рост вдоль оси палочек сверху до дна как в запечатанной, так и в, незапечатанной культуре.

Продуцируют кислоту в анаэробных услови х не так быстро, как Escherichia cioli, вз тую дл  контрол .

19.Продуцирование кислот и газов из углеводородов показано в табл. 9 и 10.

20.Метиленова  синь (бульон, 18-24 ч). Все штаммы восстанавливают

21.D-глюконова  кислота. Все штаммы и спользуют.

22.2-Кето-0-глюконова  кислота. Используют все штаммы.

23i Продуцирование восстановленных соединений из сахарозы.Положительна  у всех штаммов за исключение штамма SHS-2003.

24.Декарбоксилирование различных аминокислот.

D-глютаминова  кислота. Отрицательна  у штаммов SHS-2003, 2008, 2009, 2010 и 2011; положительна  у штаммов SHS-2004, 2005, 2006 и 2007.

L-лизин. Отрицательна  у всех штаммов.

L-аргинин. Отрицательна  у всех штаммов.

L-орнитин. Отрицательна  у всех гптаммов.

25.Липаза. Отрицательна  у всех штаммов.

26.Окисление глюконата. Положительна  у всех штаммов.

27.Разложение пектата. Отрицательна  у всех штаммов. 28.Гидролиз казеина. Отридатель на  у.всех штаммов. 29.Симплазмата. Отрицательна  у штамт-юв SHS-2003, 2004, 2005, 2007, 2008 и 2009. Положительна  у штаммов SHS-2006, 2010 и 2011. 30.D-Наза (бакто-П-наза испытуемый агар). Отрицательна  у всех штаммов. 31.Фенилаланин-дезаминаза (сред фенилаланин/малонова  кислота). У штаммов SHS-2003, 2008, 2009, 2010 и 2011 отрицательна  или слабоположительна ; у штаммов SHS-2004, 2005 2006 и 2007 отрицательна . 32.Подавление KCN. Положительн у нсех штаммов. 33.Рост в 5%-ном бульоне хлорид натри . Положительный у всех штаммов . 34.Ауксртрофи  (среда Grayand Tatunia). Требуетс  никотинова  кис лота или никотинамид всем штаммам. 35.Использование некоторых соединений (среда ОУ, 28°С, 20 и 44 ч, встр хивание) представлено в табл. 1 36..Убихинон. Штаммы SHS-2003 и 2008 - убихинон-8 (и убихинон-7). Штаммы SHS-2004, 2005, 2006, 2007, 2009, 2010 и 2011 - убихинонГ . Происхождение. Штаммы SHS-2003, 2004, 2006, 2007, 2010 и 2011 - мандарин благородньй . Штаммы SHS-2005. и 2009 - хурма, виргинска . Штамм SHS-2008 - почва. 111таммы в табл. 1 определены путем сравнени  упом нутых таксономических свойств соответствующих штаммов в табл. 2 с известньми. 1.Распределение в,пределах семей ства . На основании описанньпс результатов наблюдени  можно сделать вывод, что все приведенные в таблицах штам мы  вл ютс  короткими палочками грамотрицательных и факультативных анаэробов, которые не образуют споры и про вл ют каталазную активность,. но/не обладают оксидазной активностью , они отнесены к семейству Enterobacterialceae. 2.Распределение з пределах рода Все приведенные в таблицах штаммы отнесены к роду Erurieia на основан таксономических свойств, в частност они продуцируют кислоты из чР-метилглюкозида и сахарозы (за исключением штамма SHS-2003, который не продуцирует кислоту из сахарозы, но использует последнюю в качестве единственного источника углерода), но не из адонита, дульцита или мелецитозы, не используют бензоат, оксалат и пропионат, не способны гидролизовать крахмал, не способны декарбоксилиро-вать глутаминовую кислоту, аргинин, лизин и ортинин (за исключением штаммов SHS-2004,- 2005 и 2007, которые декарбоксилируют глутаминовую кислоту) и не про вл ют уреазной или липазной активности. 3. Распределение в пределах вида. Хот  штамм SHS-2003 считаетс  близким к Erwinia stewartu группы herbicola на основании отсутстви  жгутиковани , однако у него -имеютс  другие таксономические свойства, сильно отличающиес  от свойств Erwinia stewartu в потребности в никотиновой кислоте или никотинамиде дл  роста, в продуцировании сероводорода из цистеина, в восстановлении нитратов в нитриты, в непродуцировании кислоты из сахарозы (хот  он не может продуцировать кислоту из сахарозы, однако использует сахарозу в качестве единственного источника углерода), арабинозы, рафинозы или сорбита, в продуцировании кислоты из сал1щина, целлсбиозы и глицерина, в неиспользовании тертраты в качестве единственного источника углерода. Кроме того, так как этот штамм не показал совпадени  с любыми другими известными видами рода, его следует отнести к новым видам, предлагаемого изобретени  Erwinia Citreus. Хот  штаммы SHS-2004, 2005, 2006 и 2007 считаютс  близкими к Erwinia stewartu с точки зрени  отсутстви  жгутиковани , однако они обладают таксономическими свойствами, сильно отличающимис  от свойств Erwinia stewartu в потребности в никотиновой или никотинамиде дл  роста, в продуцировании сероводорода из цистеина , в восстановлении нитратов в нитриты, декарбоксилировании глутаминовой кислоты. Кроме того, они не продуцируют кислоты из арабинозы, маниита, лактозы или сорбита, но продуцируют кислоты из салицина и целлобиозы и не используют тартраты 9 в качестве единственного источника углерода.. Кроме того,, эти штаммы -отличают от описанного штамма ЗН8-20ЬЗ тем, что декарбоксилируют глутаминовую кислоту, почти не используют лакто ацетат и лактат в качестве единстве ного источника углерода, не продуци руют кислоты из маннита и лактозы, не обладают активностью к лакмусовом молоку. Поскольку эти штаммы не показали совпадени  с любыми другими известн ми видами рода, их следует отнести jHOBOMy виду, названному Erwinia pun tata.: . Из этих штаммов штаммы SHS-2004 и 2006 не продуцируют кислоту из . рафинозы и не используют маннит, ацетат или лактат, - Но штамм SHS-2004 отличаетс  от штамма SHS-2006 тем, что продуцируе ацетоин из глюкозы, использует нитрат в качестве источника азота, продуцирует кислоту из глицерина и использует формиат в качестве единственного источника углерода. Штамм SHS-2005 как и штамм SHS-2006 почти .не способен использо вать маннит, ацетат и лактат в качестве единственного источника углерода-, однако первый отличаетс  от последнего тем, что продуцирует кислоту из глицерина, ацетоин из глюкозы, образует флуоресцирующие пигменты в среде King В, почти не продуцирует кислоту из рафинозы и использует формиат в качестве единственного источника углерода. Кроме того, штамм SHS-2007 и штамм SKS-2006 почти не способен использовать маннит, ацетат и лакта в качестве единственного источника углерода, однако первый отличаетс  от последнего тем, что продуцирует кислоту из рафинозы, ацетоин из глюкозы, использует формиат как единственный источник углерода и имеет широкий диапазон температуры роста 4,0-47,5С. На основании указанных результатов наблюдений все штаммы SHS-2004, 2005, 2006 и 2007 отнесены к Erwini punctata и. каждый из них представл ет вариант по отношению к остальным . Хот  штаммы SHS-2008 и 2010 близ ки к En rinia tracheiphila или 9210 . Erwinia guereina с точки зрени  их подвижности с монолатёральным жгутиком , но их таксономические свойства сипьно отличаютс  от свойств Erwihia tracheiphila в следующем: рост при температуре выше 36 С, обильный рост на бульонном агаре, показывают мукоидный рост, восстанавливают нитраты в нитриты, продуцируют кислоты из салицина, ксилозы, мелибиозы и маннозы и используют лактат в качестве единственного источника углерода. Кроме того, имеютс  различи  меж.ду их таксономическими свойствами и свойствами Erwinia guerina в том , что они окисл ют глюконовую кислоту, восстанавливают нитраты в нитриты, . продуцируют кислоты из мелибиозы и целлобиозы, не продуцируют кислоты из маннита, uJ-метилглюкозида, эзуклина и сорбита, не продуцируют газ на глюкозопептонной среде. Кроме того, поскольку эти штаммы не совпадают ни с какими другими известными видами рода, целесообразно отнести их к виду Erwinia. Штамм SHS-2010 показывает значительное совпадение со. штаммом SHS-2008 за исключением некоторых различий, которые заключаютс  в том, что он не продуцирует кислоту из глицерина , SHS-2008 продуцирует хислоту из рибозы, а SHS-2010 почти не продуцирует ее. Кроме того, у него слабо положительна  реакци  в тесте с метилротом и он образует флоуресцирующие пигменты на среде. . Штамм SHS-2009 близок к Erwinia tracheipVdla, Е. guerce/.na и Е. herbicola с точки зрени  по.движности с монолатеральным жгутиком. Однако имеетс  заметна  разница между таксономическими свойствами этого штамма и свойствами Erwinia tracheiphila в том, что наблюдаетс  обильный рост на бульонном агаре, рост при температуре выше 36 С. Кро-. ме того, он показывает мукоидный рост, восстанавливает нитраты в нитриты , продуцирует кислоты из салицина , ксилозы, мелибиозы, целлобиозы, глицерина и маннозы. Найдено также заметное отличие от свойства Erwinia guereina в окислении глюконата, восстановлении нитратов в нитриты, слабом образовании ацетоина и глюкозы, продуцировании кислот из ксилозы, мелибиозы и целлобиозы. Кроме TorojOH не продуцирует кислот из маннита, oi-метилглюкоэида, эзуклина , рибозы или сорбита, не исполь зует тертрат в качестве единственного источника углерода и не продуцирует газ на глюкозопептонной среде. Отличи  свойств штамма SHS-2010 от свойств Erwinia herbicola var herbicola состо т в его потребности в никотиновой кислоте или никотинамиде дл  роста, в слабом образовани ацетоина из глюкозы, он не. разжижае желатину, продуцирует кислоты из мелибиозы, целлобиозы и глицерина, продуцирует кислоты из арабинозы, маннита, мальтозы, декстрина, рамнозы , рибозы или сорбита. Хот  остаютс  еще некоторые различи  при сравнении этого штамма . с ранее определенным штаммом SHS-2008 в слабом образовании ацето ина из глюкозы, в непродуцировании кислоты из рибозы, однако первый штамм совпадает с последним по другим ;преобладающим свойствам и, следовательно , идентифицирован как вариант определенного ранее штамма. Штамм SHS-2011 близок к Erwinia tracheiphila или Erwinia. amylavara 1с точки зрени  подвижности с моношатеральным жгутиком. При сравнении свойств этого штам ма со свойствами Erwinia tracheiphila различи  состо т в его умеренном росте в бульонном агаре, росте при температуре вьш1е . Кроме того, он показывает мукоидный рост, восстанавливает нитраты в нитриты, продуцирует кислоты из салицина, ксил зы, мелибиозы, деллобиозыиманнозы и использует лактат в количестве един ственного источника углерода. При сравнении свойств этого штам ма со свойствами Erwinia amylovola различи  состо т в образовании серо водорода из цистеина, росте при температуре и выше, восстановлении нитратов в нитриты. Кроме тог он не разжижает желатину, продуцирует кислоты из салицина, ксилозы, мелибиозы, целлобиозы и маннозы, не продуцирует кислоту из рибозы. При сравнении со штакмом SHS-2008 этот штамм совпадает с последним по свойствам, однако не продуцирует кислоту из рибозы или глицерина и идентифициров.ан как вариант определенного ранее штамма. Определенные микроорганизмы обильно растут в водной питательной среде, содержащей D-глюкозу в качестве о новного источника углерода, настой кукурузы в качестве источника азота и небольшое количество неорганических солей. Если их культивируют в аэробных услови х, они растут на среде с очень большой концентрацией D-глюкозы с достаточной стабильностью дл  продуцировани  2,5-дикето-В-глюконовой кислоты (2,5-ДКГ) с хорошим выходом по сравнению с известными микроорганизмами, примен ющимис  дл  получени  этого продукта. Концентраци  D-глюкозы в бульоне может достигать при необходимости АО об.%, хот  с экономической точки зрени  целесообразно дл  получени  2,5-дикето-В-глюконовой кислоты поддерживать концентрацию D-глюкозы в интервале 15-25 об.%, более предпочтительно . 20 об.%. Температура сбраживаемой среды 15-35с предпочтительно 20-30 Си может состаВоП ть , Начальные значени  рН среды должны быть в ин- . тервале 5,5-7,5, предпочтительно 6,0-7,0. Значени  рН среды можно- поддерживать во врем  ферментации в требуемом интервале А,0-5,5 путем введени  неорганических солей, например карбоната кальци , обладающих буферным действием, в исходную среду или введением оснований, например гидроксида натри , в среду по мере прртекани  процесса ферментации. Инокулированную сбраживаемую среду следует непрерывно перемешивать мешалкой (приблизительно 17АОоб/мий) при аэрации в количестве приблизительно 600 Н. мл/мин. Брожение заканчиваетс  спуст  17-31 ч с начала процесса, когда превращение D-глюкозы в 2,5-ДКГ достигает значени , которое соответствует выходу приблизительно 90%. Накапливающа с  2,5-ДКГ или ее соли могут быть выделены из культуральНой жидкости в виде кристаллов после обработки любым способом, например регулированием рН, или среда может быть успешно использована как такова  в качестве питательной среды на следук цей стадии. Например, среда, содержаща  2,5-ДКГ, может быть непосредственно применена дл  получени  2-кето-1.-гулоново кислоты. Таким образом, последн   может быть получена с большим выходом по упрощенной технологии.

Предлагаемый способ может быть также практически осуществлен путе простого контактировани  любого из продуктов, полученных обработко клеток указанных микроорганизмов, любым из субстратов, срдержащих D-глюкозу.

Пример 1. Дл  посева испозуют среду (водный раствор), содержащую , об.%:

D-глюкоза (гидра . тированна , содержание 91%)1,0 .Настой кукурузы (CSL) 5,0 Дигидрофосфат кали  () 0,1 Сульфат магни  (MgS04-7H20) 0,02 Карбонат кальдн  (СаСО)0,5

Среду довод т до рН 6,8-7,0 при помощи 10%-ного водного раствора едкого натра, дел т на порции по 50 мл и помещают в стерилизованные конические колбы емкостью 500 мл.

Каждую порцию среды в колбе инокулируют полной петлей одного из штаммов, приведенных в табл. 3, и встр хивают (ход 71 мм, 270 ударов в минуту) при температуре в течение приблизительно 8 ч. Культивирование заканчиваетс , когда оптическа  плотность (OD) среды достигает приблизительно 8 (конечна  точка)..

Таким образом получают культуру дл  посева. i.

Сбраживаемую среду (водньш раствор ) готов т следующего состава,

об.%: ...

20,0 3,0

0,1

6,3 50

Довод т рН сбраживаемой среды до 6,8-7,0, дел т на порции по 455 мл и помещают в ферментеры емкостью 1 л. В каждый из ферментеров добавл ют по 45 мл указанной среды дл  посева Затем осуществл ют сбраживание при .следующих услови х:

Температура, С 28 Перемешивание, об/мин 1740

Аэраци , Н. мл/мин 600 Продолжительность, ч 17-31 Полученный продукт хроматографируют на носителе фильтровальной бумаги путем капилл рного подн ти  и коколичественно определ ют п тна методом денситометрии. При этом используют носитель Тоуе Roshi № 50 и про вл ющий растворитель - фенол : муравьина  кислота : вода, вз тые в соотношении 75 : 4 : 25.

Дл  проведени  окрашивани  набрызгивают раствор насьш1енного водой н-бутанола (100 мл), содержащего анилин (0,93 г) и фталевую кислоту (1,66 г), и провод т последующую обра отку при 105 С в течение 2 мин дл про влени  окраски. Результаты представлены в табл. 12.

Кроме того, проведена также тонкослойна , хроматографи  с TLC allumisheet cellolose и с описанными системой про вл ющего растворител  . и методикой окраски. В этом случае определение осуществл ют путем сравнени  хроматограмм с хроматограммами полученными дл  аутентичных экземпл ров .

Брожение заканчиваетс , розовое п тно 2-кето-В-глкконовой кислоты исчезает с указанной бумаги или с тонкослойной хроматограммы. Результаты, полученные после инкубации штаммов, представлены в табл. 13

Пример 2. Продуцирование с применением суспензии клеток и сырого экстракта фермента. Дл  получени  клеток микроорганизмов использую.т среду (водный раствор) следующего составаJ об.%:

КН,,,1

Na2S04-7H20О.,02

СаСО50,6

Среду довод т до рН 7,0, дел т на порции по 80 мл и помещают в конические колбы емкостью 500 мл.

Каждую из указанных сред инокулируют соответствующим штаммо.м (табл.4 по способу, описанному в примере 1, и встр хивают (ход 71 мм, 270 ударов в минуту) при в течение 16 ч.

После встр хивани  клетки микроорганизмов отдел ют центрифугированием культуральной среды, дважды

15

промывают солевым раствором и дел т на две части.

Одну из указанных частей суспендируют снова солевым раствором и получают суспензию клеток. Вторую часть суспендируют в буфере 1/50 М трис-НС1 (рН 7,5), измельчают ультр звуком, центрифугированием удал ют нерастворимый остаток и получают сырой ферментный экстракт в виде .всплывшего сло .

Затем осуществл ют инкубации с клеточной суспензией и с сырым ферментным экстрактом соответственно.

При инкубации с клеточной суспензией готов т смесь из буфера 0,1 М 3,3-диметилглутаровой кислоты (рН 5,0), содержащего приблизительно 5 об.% D-глюкозы, в которой концентрацию клеток регулируют так, чтобы OD при 660 М Ш быпа приблизительно 10. Смесь дел т на порции по 10 мл, помещают в пробирки 23 мм (диаметр) х 196 мм (высота) и инкубируют при 28 С в течение 3ч.

Затем смесь центрифугируют, образуетс  всплывший слой, который

9099216

анализируют методом бумажной хроматографии .

Результаты, полученные после инкубации с клеточной суспензией, а также концентраци  D-глюкозы в смеси до инкубации представлены в табл. 14.

При инкубации с сырым ферментным экстрактом к смеси, приготовленной аналогично описанному, добавл ют сырой ферментный экстракт так, чтобы его концентраци ,выраженна  количеством протеина, составл ла 0,25 мг/л. После встр хивани  аналогично описанному смесь обрабатывают двум  капл ми 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты дл  удалени  протеиновой части и хроматографируют на фильтровальной бумаге. Результаты, полученные после инкубации с сырым ферментным экстрактом, представлены в табл. 15.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает высокий выход 25 2-кето-В-глюконовой кислоты за 17-31 ч ферментации, что ускор ет и упрощает процесс ее получени .

Таблица 1

Таблица 2

2009

Бледно-бежева 

Блест ща 

2010 То же

То же

2011

Бледно-красно-желта 

Гладка , но постепенно мен етс  до шероховатой и рельефной

Выпукла , но постепенно мен етс  до взгорбленной

Выпукла , но постепенно мен етс  до плоской. Липка , но постепенно мен етс  до масл нистой, .

f а б п   ц а 4

Таблица

Обильный

Вледно-красно-желта 

Бежева 

Умеренный

Бледно-бежева  Бежева 

Обильньй

Умеренный

Таблица 7

Таблица 9

+

+. + Примечание. Примечание. Продуцирует кислоту без газа (); не продуцирует ни кислоту, ни газ (-); слабо продуцирует кислоту без газа (±), Использует в качестве единственного источника углерода (+); слабо использует или не использует в качестве единственного источника углерода (-); не использует (-). Т.аблица И

Таблица 15

Claims (2)

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

2,5-ДИКЕТО-0-ГЛЮКОНОВОЙ КИСЛОТЫ путем культивирования ее продуцентов на питательной среде, содержащей Ώ-глюкозу в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, ми неральные соли и стимулятор роста, в условиях аэрации среды с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения процесса ферментации при высоком выходе целевого продукта, в качестве продуцентов используют штамм Erwinia citreus АТСС 31623 или штаммы Erwinia punctata АТСС 31624, или Erwinia punctata АТСС 31625, или Erwinia punctata АТСС 31626, или Erwinia punctata АТСС 31627, или штаммы Erwinia terreus АТСС 31628, или Erwinia terreus АТСС 31629, или Erwinia terreus АТСС 31630,или Erwinia terreus АТСС 31631.

2. Способ поп. 1, о т л и чающ и й с я тем, что концентрацию D-глюкозы в среде устанавливают от 5 до 20 об.%.

1 1190992