KR840001257B1

KR840001257B1 - 2,5-디케토-d-글루콘산의 제조방법

Info

Publication number: KR840001257B1
Application number: KR1019810002955A
Authority: KR
Inventors: 다까야스 소노야마; 시계오 야기; 분지 가게야마; 마사히로 다니모또
Original assignee: 시오노기세이야꾸 가부시끼 가이샤; 요시도시 가즈오
Priority date: 1980-08-14
Filing date: 1981-08-14
Publication date: 1984-09-01
Also published as: DE3167468D1; EP0046284B1; CA1168999A; EP0046284A3; BG41824A3; US4879229A; CS224624B2; AU7420481A; ES504732A0; JPS6041596B2; DK149963B; KR830006428A; SU1190992A3; ES8204762A1; GB2083028A; HU188073B; IE51496B1; US5134077A; JPS5736991A; YU198281A

Abstract

내용 없음.

Description

2, 5-디케토-D-글루콘산의 제조방법

본 발명은 D-글루코오즈로부터 2, 5-디케토-D-글루콘산(여기서부터는 2, 5DKG라 부름)을 제조하는 신규의 미생물학적 방법에 관한 것이다. 특히 에르위니아(Erwinia) 속에 속하는 신규 미생물을 발효시킴으로써, 또는 D-글루코오즈를 상기의 미생물, 혹은 액체 배지에 현탁될 수 있거나 고정층(Stationary bed)의 표면상에 고정될 수 있는 휴지 세포, 부동화 세포, 지면세포(ground cells) 또는 그들로부터 추출한 효소와 같은 그들의 처리산물과 간단히 접촉시킴으로써 2, 5-DKG를 제조하는 방법에 관한 것이다.

2, 5DKG는 L-아스코르브산을 제조하는데 유용한 중간물질이다. 즉, 2, 5DKG는 후자의 생성물(예를들어 미합중국 특허 제3, 922, 194호, 3, 959, 076호, 2, 963, 574호 및 3, 998, 697호를 볼것)을 위한 유망한 새로운 방법에 있어, L-아스코르브산의 전구물질인 2-케토-L-굴론산으로 선택적이고 입체 특이적으로 환원될 수 있다.

모든 공지의 방법에 있어서, 오로지 아세토박터, 아세토모나스, 글루코노박터 및 슈도모나스 속에 속하는 호기성 미생물 균주를 배양함으로써, 2, 5DKG를 생산하고 있다.

에르위니아 속에 속하는 조건 혐기성 균주를 사용하는 배양에 의해 그것을 생산하는 것에 관해서는 지금까지 보고된 실례가 없다. 그러므로, 본 발명의 첫번째 목적은 에르위니아 속에 속하는 새로 분리된 미생물을 사용하여 2, 5DKG를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 전술한 유망한 새로운 방법의 상품화를 촉진하기 위하여 2, 5DKG를 고수율 및 높은 발효액 농도로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따라, 에르위니아 속의 미생물을 생산하는 2, 5DKG 또는 처리된 그들의 산물(상기 미생물의 세포를 처리함으로써 얻어진 생산물)을 D-글루코오즈와 접촉시킴을 특징으로 하여 2, 5DKG를 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명은 예를들어 D-글루코오즈를 함유하는 영양배지 수용액 중에서 상기 미생물중 적어도 한 균주를 배양함으로써 또는 상기 미생물 또는 휴지세포, 부동화세포, 그들로부터 추출된 무세포 효소와 같은 그들의 처리 산물들을 D-글루코오즈를 함유하는 어떤 기질과 접촉시킴으로써 다양한 형식으로 구체화될 수 있다.

본 명세서 및 특허청구의 범위를 통하여, 용어 “배양(Cultivating)”은 발효작용에 효과적인 배지속에서 미생물이 접종되고 배양되는 어떠한 양식의 미생물학적 작용이든지 포함하여 사용된다. 용어 “접촉(Contacting)”은 미생물 또는 어떤 처리된 그들의 산물이 접촉 즉, 배양의 기간에 상관없이 D-글루코오즈를 2, 5DKG로 전환하는데 효과적인 기질과 결합하는 작용을 의미하여 사용된다.

본 발명의 과정에서, 에르위니아 속의 어떤 미생물이든지 D-글루코오즈를 선택적으로 산화하고 2, 5DKG로 전환시킬 수 있는 미생물로 이용될 수 있다.

본 발명자에 의하여 분리되고 에르위니아 속의 새로운 종으로 결정된 이러한 균주의 예가 하기의 표 1에 기재되어 있다.

FERM-P 및 ATCC 숫자로 각각 지정되기 위하여 일본의 발효연구소(Fermentation Research Institute) 및 워싱턴 D.C의 미국형 배양수집(American Type Culture Collection)에 기탁되어 있는 상기 표에 실린 모든 균주들은 3가지의 신규종에 속함이 밝혀졌으며, 각각은 종에 속하는 다른 것과 관련된 변종으로 구성되어 있다.

[표 1]

위의 미생물들에 대한 상세한 분류학적 연구결과가 하기 표 2에 기재되어 있다.

[표 2]

A. 관찰:

1. 세포의 모양:(28℃에서 24, 72 및 168시간 동안의 육즙 한천 사면)

관찰된 균주 모두가 공통적으로 끝이 둥근, 표에 기재된 치수를 갖는 우세적인(predominant) 간상체 단세포임. 때때로 표에 기재된 크기의 변형 세포의 존재가 몇몇 균주에서 관찰된다.

2. 운동성 및 편모배열(20℃ 및 25℃에서 18 내지 24시간 동안의 육즙 한천 사면)

운동성은 현적(hanging drop)법으로 확인된다. 편모배열은 토다(Toda)법으로 염색한 후 광학현미경에 의하든지 또는 지속 막 배양법(a sustained membrane culturing method)으로 배양한 후 투과형 전자 현미경에 의하여 확인된다.

SHS-2003, 2004, 2005, 2006 및 2007균주:공통으로 비운동성.

SHS-2008 균주:측면 편모를 하나가진 운동성.

SHS-2009, 2010 및 2011 균주:측면 편모를 하나 또는 둘 갖는 운동성.

3. 홀씨:공통으로 상기 표에 기재한 각 균주들에서는 형성되지 않음.

4. 그램 염색(28℃에서 24, 72 및 168시간 동안 육즙 한천 사면) 공통으로 상기표의 균주들은 각각 음성.

5. 항산성(Acid fast):공통으로 음성임.

B. 여러가지 배지의 성장.

1. 28℃에서 24, 28, 72 및 168시간 동안의 육즙 한천 콜로니.

초기의 콜로니는 공통적으로 원형이고, 전연(entire)이고, 부드러우며, 반투명이고, 버터(butyrous) 비슷함.

2. 28℃에서 24~168시간 동안의 육즙 한천 사면

초기의 콜로니는 공통적으로 실 모양이고 버터 비슷함.

3. 28℃에서 24~168시간 동안의 육즙 발효액.

공통적으로 냄새 없음.

4. 20℃에서 40일간의 육즙 한천 천자 공통으로 액화 안함. 천자선을 따라 성장.

5. 28℃에서 40일간의 리트머스 우유.

SHS-2003 균주:7일 이내에 산성화.

18일째 되는 날에 약하고 균일한 응고가 시작되어 38일째 날에 윗층은 핑크빛으로 되고, 밑층은 회갈색으로 되나, 38일째 날에는 전층이 모두 균일하게 핑크빛으로 됨.

SHS-2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010 및 2011 균주:공통적으로 배양을 통하여 아무런 변화도 관찰되지 않음.

6. 28℃에서 24, 168시간 동안의 감자사면 공통적으로, 실모양이고 버터 비슷하며, 번쩍거리는 광택임.

C. 생리학적 성질(달리 지시하지 않으면, 28℃에서 14일 이내에 관찰된 결과를 기준으로 함).

1. 아질산염:공통적으로, 아질산염이 질산염으로부터 생산됨.

2. 질산염 호흡:공통적으로, 1% KNO₃를 함유하는 파라핀으로 밀봉한 육즙 효모액 중에서는 성장도 기체도 생성되지 않음이 관찰됨.

3. 메틸-레드 시험:매우 약한 양성을 나타내는 2010균주를 제외하고는 공통적으로 양성임.

4. 포게스-프로스카우어(Voges proskaure)반응(글루코오즈):

균주 SHS-2003:매우 약한 양성

균주 SHS-2004, 2005, 2007, 2008, 2010 및 2011:양성.

균주 SHS-2006 및 2009:음성 또는 매우 약한 양성.

5. 인돌:공통적으로, 음성.

6. 황화수소:

(i) 박토 펩톤 물-납 아세테이트 종이:공통적으로 양성.

(ii) TSI한천:공통적으로 음성.

(iii) 클리글러(Kliegler)한천:공통적으로 음성.

7. 암모니아:공통적으로 생성되지 않음.

8. 전분의 가수분해:공통적으로 음성.

9. 시트르산염 배지상의 성장.

(i) 시몬 배지^*:공통적으로 성장.

(ii) 크리스텐신 배지:공통적으로 성장.

^*비타민 혼합물을 보충함.

10. 무기 질소원과의 성장:

(i) 암모늄(글루코오즈-훅커 배지)^*:공통적으로 성장.

(ii) 질산염(글루코오즈-디먹 배지^*:SHS-2006은 성장하지 않고 SHS-2007은 매우 약하게 성장하는 반면, 균주 SHS-2003, 2004, 2005, 2008, 2009, 2010 및 2011은 성장이 관찰됨.

^*비타민 혼합물을 보충함.

11. 안료 평판 스트라에이아(Straeia) 배양:

(i) 청색안료(28℃에서 7일간, 효모 추출물 1%, 글루코오즈 1%, CaCO₃2%):공통적으로 음성.

(ii) 핑크색 확산성 안료(위와 동일한 배지):공통적으로 음성.

황색안료(28℃에서 7일간 육즙한천):공통적으로 음성.

12. 요소분해효소:공통적으로 음성.

13. 카탈라아제:공통적으로 양성.

14. 산화제(18 내지 24시간 동안, 테트라메틸페닐렌디아민 함유 육즙한천 사면):공통적으로 음성.

15. 온도관계(박토 효모 추출물 0.5%, 박토펩톤 0.5% 및 글루코오즈 0.5%, pH 7)

16. pH 관계(28℃에서 2~4일간, 0.1M 3, 3-디메틸글루타르산 완충액중 글리셔롤 1%, 박토 효모 추출물 0.05%, 박토펩톤 1%, NaCl 0.5%).

17. 산소필요조건:공통적으로 조건혐기성.

(i) 액체 파라핀으로 밀봉한 천자 배양:(박토 쇠고기 추출물 1%, 박토펩톤 1%, 박토효모 추출물 0.2%, NaCl 0.5%, 브로모크레졸 퍼플 0.0045 및 한천분말 1.5%를 함유하는 글루코오즈-BCP 배지의 pH를 7.0~7.2로 조절하여, 깊이 8cm 직경 18mm의 시험관에 담는다. 조제한 배지를 121℃에서 15분간 멸균한다. 배지가 완전히 고화하기전에 천자 배양을 수행한다.

그런 다음, 멸균한 액체 파라핀으로 4cm(5~7ml)의 깊이로 시험관을 밀봉한다) 시험관을 28℃에서 배양하고 7일동안 관찰한다. 2~3일 이내에 배지의 정부로부터 저부까지 천자선을 따라 뚜렷한 성장을 한 것이 관찰되며, 배양은 균일하게 약간 황색으로 되기 시작하여, 비접종한 대조군의 밀봉 배양관과 표의 각 균주는 색깔이 현저히 차이가 남을 알 수 있다. 황색의 정도는 시간이 경과함에 따라 더 증가한다.

(ii) 기체-팩(gas-pak) 혐기성계(BBL):(박토 쇠고기 추출물 1%, 박토펩톤 1%, NaCl 0.5% 및 한천 분말 1.5%를 함유하는 박토영양한천 평판, 또는 글리세롤 0.5%, 박토효모추출물 0.5%, 박토펩톤 0.3% KH₂PO₄0.1%, MgSO₄·7H₂O 0.02% 및 한천분말 1.5%를 함유하는 GYP 한천 평판을 pH7.0~7.2로 조절함), 45℃ 인큐베이터중 2시간 반응함으로써 산소를 제거한 후 시험유기물의 현탁액을 소량 획선 접종한 것을 28℃에서 48시간 동안 배양한다. 공통적으로 매약한 성장만이 관찰된다. 대조로서 사용된 에스케리키아 콜리의 성장보다 더 미약하다.

18. 0-F시험[휴-라이프슨(Hugh-Leifson)법]:공통적으로 발효성임.

박토트립톤 1%, 박토 효모추출물 0.1%, 브로모크레졸퍼플 0.004%, 글루코오즈(또는 락토오즈) 1% 및 한천분말 0.2%를 함유하는 배지의 pH를 7.0~7.2로 조절하에 깊이 약 8cm(직경 18mm)인 시험관에 담는다. 조제한 배지를 121℃에서 15분간 멸균한다. 배지의 온도가 약 30~40℃로 된 후, 표의 각 균주의 유기물에 대하여 똑같은 접종을 수행한 것을 두개 만든다. 그런 다음 각 쌍중 한 시험관을 깊이 약 4cm가 되도록 멸균한 액체 파라핀(5~7ml)으로 밀봉한다. 시험관을 28℃에서 배양하고 7일간 관찰한다.

호기성 뿐아니라, 혐기성 조건하에서도 D-글루코오즈(SHS-2003의 경우 락토오즈로부터) 산이 생성되나 기체의 발생은 없다. 정부에서 저부로 천자선을 따른 뚜렷한 성장이 밀봉하지 않은 배양에서와 마찬가지로 밀봉한 배양에서도 관찰된다. 무산소성 산형성은 대조로서 사용된 에스케리키아콜리 보다는 덜 빠르다.

19. 탄수화물로부터의 산 및 기체의 생성:(28℃에서 7일간 수정 바르시코프법, 정상)

주의:(i) 기체발생없이 산생성(+)

(ii) 기체없이 약간의 산생성(±)

(iii) 기체, 산 둘다 생성 안됨(-)

20. 메틸렌 블루(육즙, 발효액, 18~24시간):공통적으로 황원됨.

21. D-글루콘산:공통적으로 이용됨.

22. 2-케토-D-글루콘산:공통적으로 이용됨.

23. 슈크로오즈로부터 환원 화합물의 생성(Bergey's manual of determinative bacteriology 8판(1974) 페이지 335, 표 8. 19, 각주 f):SHS-2003을 제외하고 공통적으로 양성.

24. 각종 아미노산의 탈 카르복실화:(Shaw, C ＆ Clarke, P.H., J. Gen. Microbiol., 13, 155-161(1955))

(i) L-글루탐산:SHS-2003, 2008, 2009, 2010 및 2011은 음성.

SHS-2004, 2005, 2006 및 2007은 양성.

(ii) L-리신:공통으로 음성.

(iii) L-아르기닌:공통으로 음성.

(iv) L-오르니틴:공통으로 음성.

25. 리파아제(수성 스타르법, Starr, M.P., Science, 93, 333~334(1941)):공통으로 음성.

26. D-글루코네이트 산호(Shaw, C ＆ Clarke, P.H., J. Gen. Microbiol., 13, 155-161(1955)):공통으로 양성.

27. 펙테이트 분해(A. M. Paton, Nature, 183, 1812~1813(1959)):공통으로 음성.

28. 카제인 가수분해(D. W. Dye, N. Z.J. Sci., 11, 590-607(1968)):공통으로 음성.

29. 심플라스마타(Graham, D. C. ＆ Hodgkiss, W., J. Appl. Bacteriol., 30(1), 175-189(1967)):SHS-2003, 2004, 2005, 2007, 2008 및 2009는 음성. SHS-2006, 2010 및 2011은 양성.

30. DN 아제(박토 DN 아제 시험 한천):공통으로 음성.

31. 페닐알라닌 아미노기 이탈효소(니쓰이 제약 주식회사로부터 이용 가능한 페닐알라닌 말론산 배지:균주 SHS-2003, 2008, 2009, 2010 그리고 2011:음성 또는 매우 약한 양성. 균주 SHS-2004, 2005, 2006 및 2007:음성.

32. KCN 억제:공통으로 양성.

33. 5% NaCl 육즙중의 성장:공통적으로 양성.

34. 영양 요구성(그레이 및 테이텀 배지):공통으로 니코틴산 또는 니코틴아미드를 필요로함.

35. 몇가지 유기 화합물의 이용(D. W. Dye, N. Z. J. Sci., 11, 590-607(1968), OY medium, 28℃에서 20 44시간 진동):

주의:(i) 단순한 탄소원으로서 이용함(+)

(ii) 단순한 탄소원으로서 약간 이용하거나 또는 이용하지 않음(±)

(iii) 이용하지 않음(-)

36. 유비퀴논(Y. Yamada, K. Aida ＆ T. Uemura, J. Gen. Appl. Microbiol., 15, 181-196(1969)):균주 SHS-2003, 2008:유비퀴논-8(및 유비퀴논-7)

균주 SHS-2004, 2005, 2006, 2007, 2009, 2010 및 2011:Ubiquinone-8.

D. 원천

균주 SHS-2003, 2004, 2006, 2007, 2010 및 2011:만다린 오렌지.

균주 SHS-2005 및 2009:감.

균주 SHS-2008:토양.

표 1의 균주들은 표 2의 각 균주의 상술한 분류학적 성질과 1974년도 Determinative Bacteriology의 Bergey 매뉴얼 8판(여기서부터는 단순히 “매뉴얼”이라 칭함)의 기술과 비교하여 측정함으로써 하기에 서술한 바와 같은 결론에 도달한다.

1)과 (Family)에 의한 배정:

목록에 올라있는 모든 균주가 그램-음성의 짧은 간상체이고, 포자를 형성하지 않는 조건 혐기성이며, 산하세 활성을 제외한 카탈라아제 활성을 나타낸다는 사실 등의 관찰된 상기의 결과를 토대로 할때, 그들은 엔테로박테리아세과에 속한다고 결정된다.

2) 속(Genus)에 의한 배정

분류학적 성질, 특히 아도니톨, 둘시톨 또는 멜레지토오즈로부터가 아니라 β-메틸글루코시드 및 슈크로오즈(슈크로오즈로부터 산을 생성하지는 않으나 유일한 탄소원으로서 동일한 물질을 이용하는 균주 SHS-2003을 제외함)로부터 산을 생성함; 벤조에이트, 옥살레이트 및 프로피오네이트를 이용하지 않음; 전분을 가수분해할 수 없음; 글루탐산, 아르기닌, 리신 및 오르니틴을 탈가르복실화할 수 없음(글루탐산을 탈카르복실화하는 균주 SHS-2004, 2005, 2006 및 2007을 제외함); 그리고 요소분해 효소 또는 리파아제 활성을 나타내는 성질등을 토대로 할 때 목록의 모든 균주들은 에르위니아 속에 속한다고 결정할 수 있다.

3) 종에 의한 배정

균주 SHS-2003:

이 균주는 편모 배열이 없음을 기초로한 매뉴얼에 정의된 그룹 헤르비콜라의 에르위니아 스테와르티이와 밀접하게 관련된다고 생각되기는 하나, 다음과 같은 점에서 에르위니아 스테와르티이의 분류학적 성질과는 크게 다른 분류학적 성질을 갖는다.

(i) 성장을 위한 니코틴산 또는 니코틴아미드의 필요성.

(ii) 시스테인으로부터 황화수소의 생성.

(iii) 질산염의 아질산염으로의 환원

(iv) 슈크로오즈^*, 아라비노오즈, 라피노오즈 또는 소르비톨로부터 산이 생성되지 않음.

(v) 살라신, 셀로비노오즈 및 글리세롤로부터의 산의 생성 및

(vi) 유일한 탄소원으로서 타르타레이트를 이용치 않음.

(^*그것이 슈크로로즈로부터 산을 생성할 수 없다 할지라도 그것은 유일한 탄소원으로서 동일한 물질을 이용할 수 있다)

더우기, 이 균주는 매뉴얼에 정의된 속에 속하는 어떤 다른 공지의 종들과 병발교차를 나타내지 않기 때문에 본 발명자에 의해 에르위니아 시트레우스로 명명된 새로운 종에 속하여야 한다고 결론 지어진다.

균주 균주 SHS-2004, 2005, 2006 및 2007:

이들 균주들이 편모 배열이 없는 점에서 에르위니아 스테와르티이와 밀접하게 관련된다고 생각될지라도 다음과 같은 점에서 에르위니아 스테와르티이와는 크게 다른 공통의 분류학적 성질을 갖는다.

(i) 성장을 위한 니코틴산 또는 니코틴아미드의 필요성

(ii) 시스테인으로부터 황화수소의 생성

(iii) 질산염의 아질산염으로의 환원

(iv) 글루탐산의 탈카르복실화

(v) 아라비노오즈, 만니톨, 락토오즈 또는 소르비톨로부터 산이 생성되지 않음.

(vi) 살리신 및 셀로비오즈로부터의 산의 생성, 그리고

(vii) 유일한 탄소원으로서 타르타레이트를 이용치 않음.

더우기 이들 균주들은 다음과 같은 점에서 전술한 균주 균주 SHS-2003과 다르다고 관찰됨.

글루탐산의 탈카르복실화; 유일한 탄소원으로서 락토오즈, 아세테이트 및 락테이트를 거의 이용할 수 없음; 만니톨 및 락토오즈로부터 산을 생성할 수 없음; 그리고 리트머스 우유에 대한 활성이 없는 점등.

또한, 이들 균주들은 매뉴얼에 정의된 속에 속하는 어떤 다른 공지의 종들과의 병발교차를 나타내지 않기 때문에, 본 발명자에 의하여 에르위니아 풍크타타라고 명명된 신규의 종에 속한다고 결론지을 수 있다.

이들 균주 중에서, 균주 SHS-2004 및 2006은 다음과 같은 분류학적 성질을 공통으로 갖는다.

(i) 라피노오즈로부터 산이 생성되지 않는 검; 및

(ii) 만니톨, 아세테이트 또는 락테이트를 이용하지 않는 점.

그러나, 균주 SHS-2004는 다음과 같은 점에서 균주 SHS-2006과 다르다.

i 글루코오즈로부터 아세토인의 생성,

ii 질소원으로서 질산염이 이용,

iii 글리세롤로부터 산의 생성 및

iv 유일한 탄소원으로서 포르메이트의 이용.

한편, 균주 균주 SHS-2005는 그들의 유일한 탄소원으로서 만니톨, 아세테이트 및 락테이트를 거의 이용할 수 없다는 점에서 균주 SHS-2006가 동일한 분류학적 성질을 가지나, 전자는 다음과 같은 점에서 후자와 다르다.

(i) 글리세롤로부터 산의 생성

(ii) 글루코오즈로부터 아세토인의 생성,

(iii) 킹 B배지중 형광 안료의 형성,

(iv) 라피노오즈로부터 거의 산을 생성치 않음, 그리고

(v) 유일한 탄소원으로서 포르디이티의 이용.

더우기, 균주 SHS-2007은 그들의 유일한 탄소원으로서 만니톨, 아세테이트 및 락테이트를 거의 이용할 수 없는 점에서 균주 SHS-2006과 동일한 성질들을 가지나, 전자는 다음과 같은 점에서 후자와 다르다.

(i) 라피노오즈로부터 산의 생성,

(ii) 글루코오즈로부터 아세토인의 생성,

(iii) 유일한 탄소원으로서 포르메이트의 이용, 및

(iv) 4.0~47.5℃와 같은 성장을 위한 광범위한 온도범위.

상기 지적된 관찰의 결과를 토대로 할때, 마찬가지로 균주 SHS-2004, 2005, 2006 및 2007은 모두 상기의 에트위니아 풍크타타에 속하며, 각각은 다른것들과 관련된 변종을 형성함을 알았다.

이들 균주들이 측면 편모를 하나가진 운동성이 있다는 관점에서 볼때 에르위니아 트라케이필라 또는 에르위니아 쿠에르시나와 밀접하게 관련된다고 생각될지라도, 그들의 분류학적 성질은 다음과 같은 점에서 매뉴얼에 정의된 에르위니아 트라케이필라와 크게 다르다.

(i) 36℃보다 더 높은 온도에서의 성장,

(ii) 육즙 한천 배지상에서의 충분한 성장,

(iii) 뮤코이드 성장을 보임,

(iv) 질산염의 아질산염으로의 환원,

(v) 살리산, 크실로오즈, 멜리비오즈 및 만노오즈로부터 산의 생성 및,

(vi) 유일한 탄소원으로서 락테이트의 이용.

한편, 다음과 같은 점에서, 매뉴얼에 정의된 에르위니아 쿠에르시나와 그들의 분류학적 성질에서 차이점이 있다.

(i) 글루콘산의 산화,

(ii) 질산염의 아질산염으로의 환원,

(iii) 멜리비오즈 및 셀로비오즈로부터 산의 생성,

(iv) 만니톨, SHS-메틸글루코시드, 예수클린 및 소트비톨로부터 산을 생성치 않음, 및

(v) 글루코오즈-펩톤 배지상에서 기체를 생성치 않음.

더우기, 이들 균주들은 매뉴얼에 정의된 속에 속하는 어떤 다른 공지의 종들과의 병발교차를 나타내지 않으므로, 본 발명자에 의하여 에르위니아 테레우스라고 명명된 신규의 종에 적절히 속함을 알 수 있다.

또한, SHS-2010은 다음과 같은 점에서 관찰된 확실한 차이점을 제외하고, SHS-2008과 실질적인 병발교차를 나타낸다.

(i) 글리세롤로부터 산을 생성치 않음,

(ii) SHS-2010에 의해서는 거의 생성되지 않는 것과는 대조적으로 SHS-2008에 의한 리보오즈로부터의 산의 생성,

(iii) 메틸 레드 시험에 의하여 약간 산성, 및

(iv) 킹 B배지상의 형광 안료의 형성.

균주 SHS-2009:

이 균주는 하나의 측면 편모를 가진 운동성이 있다는 점에서 에르위니아 트라케이필라, E. 쿠에르시나 및 E. 헤르비콜라, var. 헤르비콜라와 밀접하게 관련이 있다고 생각된다.

그러나, 매뉴얼에 정의된 에르위니아 트라케이필라와 비교해볼때 이 균주의 분류학적 성질은 다음과 같은 점에서 현저한 차이점이 있다.

(i) 육즙 한천 배지중 충분한 성장,

(ii) 36℃보다 더 높은 온도에서의 성장,

(iii) 뮤코이드 성장을 나타냄,

(iv) 질산염의 아질산염으로의 환원, 및

(v) 살리신, 크실로오즈, 멜리비오즈, 셀로비오즈, 글리세롤 및 만노오즈로부터 산의 생성.

여기에 덧붙여, 다음과 같은 점에서 에르위니아 쿠에르시나의 성질과 현저한 차이점이 발견된다.

(i) 글루코네이트의 산화,

(ii) 질산염의 아질산염으로의 환원,

(iii) 글루코오즈로부터 아세토인의 저조한 형성,

(iv) 크실로오즈, 멜리비오즈 및 셀로비오즈로부터 산의 생성,

(v) 만니톨, SHS-메틸글루코시드, 에수클린, 리보오즈 또는 소르비톨로부터 산을 생성치 않음,

(vi) 유일한 탄소원으로서 타르타레이트를 이용안함.

(vii) 글루크오즈-펩톤 배지로부터 기체를 발생 안함.

또한, 다음과 같은 점에서, 에르위니아 헤르비콜라 var. 헤르비콜라와 SHS-2010의 성질간에는 현저한 차이점이 발견된다.

(i) 성장을 위한 니코틴산 또는 니코틴아미드의 필요성,

(ii) 글루코오즈로부터 아세토인의 저조한 형성,

(iii) 젤라틴의 액화가 안됨,

(iv) 멜리비오즈, 셀로비오즈 및 글리세롤로 부터 산의 생성, 및

(v) 아리비노오즈, 만니톨, 말토오즈, 덱스트린, 람노오즈, 리보오즈 또는 소르비톨로부터 산을 생성치 않음.

이 균주를 상술한 SHS-2008과 다음의 점에서 비교할 때 몇가지 차이점이 남아 있기는 하나,

(i) 글루코오즈로부터 아세토인의 저조한 형성, 및

(ii) 리보오즈로부터 산을 생성치 않음,

전자는 다른 지배적인 성질에서 후자와 일치하므로 상술한 에르위니아 테레우스의 변종으로 확인된다.

균주 SHS-2011

이 균주는 측면의 편모를 하나 갖고 운동성이 있다는 점에서 에르위니아 트라케이필라 또는 에르위니아 아밀로보라와 밀접하게 관련된다고 생각된다.

우선, 이 균주의 성질을 매뉴얼에 정의된 에르위니아 트라케이팔라의 그것과 비교할 때, 다음과 같은 점에서 현저한 차이점이 발견된다.

(i) 육즙 한천 배지중의 보통성장,

(ii) 36℃보다 더 높은 온도에서의 성장,

(iii) 뮤코이드 성장을 보임,

(iv) 질산염의 아질산염으로의 환원,

(v) 살리신, 크실로오즈, 멜리비오즈, 셀로비오즈 및 만노오즈로부터 산의 생성, 및

(vi) 유일한 탄소원으로서 락테이트의 이용.

그들을 에르위니아 아밀로보라(Erwinia Amylovora)의 성질과 비교할 때 다음과 같은 현저한 차이점이 발견된다.

(i) 시스테인으로 부터 황화수소의 형성,

(ii) 36℃ 또는 더 높은 온도에서의 성장,

(iii) 질산염의 아질산염으로의 환원,

(iv) 젤라틴이 액화 안함,

(vi) 리보오즈로부터 산을 생성치 않음.

한편, 이 균주를 SHS-2008과 비교할 때, 리보오즈 또는 글리세롤로부터 산이 생성하지 않는 점만 제외하고는 성질이 후자와 일치한다고 생각되므로, 상술한 에르위니아 테레우스의 변종이라고 확인된다.

분리된 미생물(야생 균주)에 덧붙여, 그것으로부터 얻어진 자발적인 돌연변이체는 어느 것이나 그들이 2, 5-디케토-D-글루콘산을 생성할 수 있는한 본 발명에 유리하게 이용될 수 있으며, 그들은 바람직한 성질을 나타내므로 이들 분리된 미생물들을 인공적으로 또는 유도적으로 돌연변이 시키거나 또는 개량함으로써 얻어진 균주는 어느 것이나, 균주를 적절히 재배함으로써 본 발명을 원활하게 실시하는데 이용할 수 있음은 두말할 필요가 없다.

상술한 미생물들은 주 탄소원으로서의 D-글루코오즈, 질산원으로서의 옥수수 담근액 및 소량의 무기염류를 함유하는 영양배지 수용액 중에서 충분히 성장한다. 그들이 호기적으로 배양되면, 동일한 산물을 생성하는데 이용되는 공지의 미생물과 비교할 때 양호한 수율로 2, 5-디케토-D-글루코산(2, 5DKG)을 충분히 안정하게 생산하도록 D-글루코오즈의 농도가 매우 높은 배지 상에서 성장한다.

발효액중의 D-글루코오즈의 농도는, 15~25w/v%의 범위 및 더 바람직하게는 대략20w/v%로 농도를 유지하는 것이 2, 5-디케토-D-글루콘산을 경제적으로 생산하는데 일반적으로 유리하다 할지라도 특별히 원한다면 40w/v% 정도의 고농도일 수도 있다.

발효 육즙의 온도는 15~35℃, 바람직하게는 20~30℃ 더 바람직하게는 약 28℃의 범위라도 무방하다. 배지의 초기 pH치는 5.5~7.5의 범위, 바람직하게는 6.0~7.0의 범위가 무방하다.

발효액의 pH치는 출발 발효액중 완충작용을 갖는 적절한 무기염류를 배합함으로써, 또는 발효과정에 적절한 염기를 발효액에 계속해서 공급함으로써 발효하는 동안의 pH를 소기의 4.0~4.5수준으로 유지할 수 있다.

염으로는 탄산칼슘을 들 수 있고, 염기로는 수산화 나트륨을 들 수 있다.

접종된 발효 육즙을 통기 조건하 600N ml/분의 비로 교반기(Ca. 1,740r.p.m)로 일정하게 교반한다.

2, 5DKG의 비율이 90%가 되도록 D-글루코오즈의 전환이 이루어졌을 때 발효는 완결되는데, 시간은 시작후 약 17~31시간 이내이다.

축적된 2, 5DKG 또는 그의 염들은 pH조절과 같은 어떤 방법으로 처리한 후 발효육즙으로 부터 결정으로 분리되거나, 또는 발효액은 다음 단계의 영양 배지와 같은 것으로서 유리하게 이용될 수 있다.

예를들면, 2, 5DKG를 함유하는 발효액은 2-케토-L-글론산의 제조에 직접 이용되므로, 후자는 종래의 방법과 비교해볼 때 단순한 방법에 의해서도 고수율로 수득될 수 있다.

전술한 발효에 덧붙여, 본 발명은 미생물의 어떤 처리 산물을 D-글루코오즈 함유의 어떤 기질과 단순히 접촉시킴으로써 실시할 수 있다. 이들 경우에 있어, 살아있는 세포의 배양에 관련되어 상술한 것과 유사한 조건이 기질 중에서 처리 산물을 배양하는데도 적용될 수 있으며, 전환은 접촉하자마자 즉시 시작된다.

다음의 기술에서, 본 발명은 실시예에 의하여 더 상세히 설명될 것이다.

[실시예 1]

(1) 종자배지:

를 함유하는 수용액을 10% NaOH수용액을 사용하여 pH 6.8~7.0으로 조절하여 50ml씩으로 나누어 종자배지를 만들기 위하여 멸균된 500ml원뿔형 플라스크에 넣는다.

(2) 종자배양:

플라스크안의 상기 각 배지를 하기 표 3에 주어진 균주 1루우프(loop)씩으로 각각 접종한 다음, 28℃에서 8시간 동안 진탕(행정:71mm 270s.p.m)시킨다. 배지의 광학 밀도(O.D)가 약 8(말점)이 되었을 때 배양이 종식된다.

(3) 발효 육즙:

를 함유하는 수용액의 pH를 6.8~7.0으로 조절하여, 455ml씩으로 나눈다음, 발효 육즙을 만들기 위하여 1ℓ 발효기에 넣고 여기에 상기의 종자 배지를 각각 45ml씩 첨가한다.

발효를 하기 조건하에 수행한다.

(5) 측정:

생성물을 하기의 조건하 상행(ascending)에 의하여 여과지 담체 상에서 크로마토그라피하고, 그 반점을 덴시토메트리에 의하여 측정한다.

(i) 담체:도요로시 No., 50

(ii) 전계용매:

페놀:포름산:물=75:4:25

(iii) 색올림:AHF용액[아닐린(0.93g) 및 프탈산(1.66g)을 함유하는 수포화 n-부탄올(100ml)의 용액]으로 분무한 다음 105℃에서 2분간 색-전개 처리를 한다.

(iv) 색 및 Rf 값

여기에 덧붙여, 박층 크로마토그라피를 “TLC알루미쉬이트 셀루로오즈(alumisheet cellulose)”(E Merck A.G의 상표) 및 상술한 바와 동일한 전개 용매 계 및 색울림 조작에 의하여 수행한다. 이 경우, 믿을만한 견본에서 얻어진 크로마토그램과 비교하여 결정한다.

(6) 종결:

2-케토-D-글루콘산의 핑크색 반점이 상기의 종이 또는 박층 크로마토그램으로부터 사라졌을 때에 발효는 종결된다.

(7) 결과:

[표 3]

[실시예 2 및 3(세포 현탁액 및 조(crude)효소 추출물과의 생산물)]

(1) 미생물 세포를 얻기 위해 사용된 배지:

효모 추출물(다이고 에이요 야꾸힝 K.K로부터 이용가능함)

를 포함하는 수용액의 pH를 7.0으로 조절하고, 80ml씩으로 나눈 다음, 원뿔형 플라스크(500ml)에 넣는다.

(2) 미생물 세포를 수집하고 조 효소 추출물을 분리하기 위한 배양:

상기의 각각의 배지를 실시예 1의 종자 배양에서와 동일한 방법으로 표 4의 균주로 접종시켜, 28℃에서 16시간 동안 진탕(행정, 71mm, 270s.p.m) 시킨다.

진탕후, 배양 배지를 원심 분리하여 미생물 세포를 수집하고, 생리 식염수로 두번 세척한 다음, 두부분으로 나눈다.

한 부분은 생리식염수에 다시 현탁하여 세포 현탁액을 만든다. 다른 한 부분은, 그 속의 세포가 초음파 처리에 의해 분해되고 상청액으로 부터 불용성의 잔류물을 제거하기 위한 원심 분리를 한 1/50M의 트리-HCl 완충용액(pH 7.5)에 현탁한다.

(3) 세포 현탁액과의 접종:

660m에서의 O.D가 약 10이 되도록 세포농도가 조절된, 약 5w/v%의 D-글루코오즈를 함유하는 1/10M 3, 3-디메틸글루타르산 완충액(pH 5.0)의 혼합물을 제조한다. 혼합물을 10ml씩으로 분리하여, 23mm(직경)×196mm(길이) 크기의 시험관에 넣은 다음, 28℃에서 3시간 동안 배양시킨다.

종이 크로마토그라피에 의해 분석되는 상청액을 얻기 위하여 혼합물을 원심분리한다. 결과를 하기의 표 4에 요약하였는데, 여기에 배양전 혼합물중의 D-글루코오즈의 농도도 표시하였다.

[표 4]

(4) 조한 효소 추출물과의 뱌양:

상술한 (3)의 방법과 동일하게 제조한 혼합물에, 그것의 농도가 0.25mg/ml가 되도록 조한 효소 추출물을 첨가하고, 단백질 양(폴린 법)으로서 측정한다. 전술한 바와 같이 진동시킨 후, 단백질 부분을 제거하기 위하여 혼합물을 10w/v%의 트리클로로아세트산 용액 2방울로 처리하여, 여과지로 크로마토그라피한다. 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.

Claims

에르위니아속의 미생물을 생산하는 하나이상의 2, 5-디케토-D-글루콘산의 균주, 또는 상술의 산을 생산하고 축적하기에 충분한 조건하의 상기 미생물의 어떤 처리 산물 또는 그의 염들 존재하, 접촉 혼합물중, D-글루코오즈를 2, 5-디케토-D-글루콘산으로 전환함을 특징으로 하는 2, 5-디케토-D-글루콘산 또는 그의 염의 제조방법.