CS224624B2

CS224624B2 - Method for producing 2,5-diketo-d-gluconic acid or its salts

Info

Publication number: CS224624B2
Application number: CS816116A
Authority: CS
Inventors: Sonoyama Takayasu; Yagi Shigeo; Kageyama Bunji; Tanimoto Masahiro
Original assignee: Shionogi & Co
Priority date: 1980-08-14
Filing date: 1981-08-14
Publication date: 1984-01-16
Also published as: KR840001257B1; DK149963C; IE811847L; DE3167468D1; GB2083028B; MX7115E; DK361281A; YU198281A; GB2083028A; US4879229A; KR830006428A; IE51496B1; HU188073B; SU1190992A3; DK149963B; EP0046284A3; CA1168999A; YU43032B; AU546761B2; EP0046284B1

Description

Vynález se týká nového mikrobiologického způsobu výroby kyseliny 2,5-diketoglukonové (dále ^pro stručnost označoval jen ja^ko ^2,5 ^DKG) z D-glukOzy. Tý^ká se zejm^éna z^půso^bu přípravy 2,5>—I^KG· fermentaci nových mikroorganismů, které náleží novému druhu Erwinia nebo jednoduchým uvedením D· glukózy do styku s uvedenými mikroorganismy nebo produkty jimi vyráběnými, například buňkami, odpooívajícími buňkami, imobilioovarými buňkami, základními buňkami nebo z nich extrahovanými· enzymy, jež mohou být suspendovány v tekutém prostředí nebo fixovány na povrchu stacionárního lože.

2,5GDKG je výhodným mmelproduktem výroby kyseliny askorbové. 2,5-DKG lze totiž seeektivně a stereospeřeificky redukovat na kyselinu 2-keto-L-gulonovou, prekursor kyseliny L-askorbové, a to slanou novou cestou pro tento produkt (viz například americké patentové·. spisy í. 3 922 1994, 3 959 076, 3 963 574 a 3 998 ' 697).

. Podle všech známých způsobů lze doottit · produkce 2,5-DKG kultivací kmenů aerobních mikroorganismů, které patří výhradně k rodu Acetobaacer, Acetomonas, Gluconobaater a · Pseudomonas. Způsob výroby pomocí kultvvace fakultatv^rně anaerobních kmenů, které náleží rodu Ervinia, není dosud znám.

Prvým předmětem tohoto vynálezu je tudíž způsob výroby 2,5-DKG ponu^tím nově izolovaných mikroogranismů, které náleží rodu Erinia.

Ještě dalším předmětem tohoto vynálezu je způsob výroby 2,5-DKG ve vysokém výtěžku a vysoké konceenraci v živném prostředí, aby se usnad^la ^ιη^^βΐ^ace dříve zmíněné nové slibné· cesty. *

Tento vynález se tedy týká způsobu výroby 2,5-DKG, vyznačující se tím, že se uvádějí do styku mikroorganismy produkující 2,5-DKG rodu Erwinia nebo jimi produkované produkty (jakkoli produkt získaný působením na buňky uvedených mikroorganismů) s D-glukózou.

Vynález lze realizovat různými obměnami, například kultivací alespoň jednoho kmene uvedených mikroorganismů ve vodném živném prostředí obsahujícím D-glukózu nebo jednoduše uváděním zmíněných mikroorganismů nebo jimi produkovaných produktů, tj. odpovídajících buněk, imobilizovaných buněk, bezbuněčných enzymů, do styku s jakýmkoli substrátem obsahujícím D-glukózu.

V textu popisu tohoto vynálezu a v definici používaný termín .^kultivace zahrnuje jakékoli způsoby mikrobiologických operací, při nichž se do média očkují mikroorganismy a inkubují se v médiu, aby se docílilo fermentace. Používaný termín uvádění do styku” znamená operace, při nichž se mikroorganismy nebo kterékoli jimi produkované produkty uvádějí do styku se substrátem, aby se uskutečnila přeměna D-glukózy ve 2,5-DKG, bez zřetele na délku styku, tj. inkubace.

Při způsobu podle tohoto vynálezu lze používat kteréhokoli z mikroorganismů rodu Erwinia, pokud jsou tyto mikroorganismy schopný selektivně oxidovat D-glukózu a převádět ji ve 2,5-DKG. Příklady takových kmenů, které byly autory izolovány a u nichž bylo zjištěno, že náleží к novému druhu rodu Erwinia, jsou shrnuty v tabulce 1 níže.

U všech zmíněných kmenů, které byly uloženy ve Fermentation Research Institute (adresa: 1-3, Higashi, 1-chomé, Yatabe-machi, Tsukuba-gun, prefektura Ibaraki, Japonsko) a v Američan Type Gulture Collection”, Washington, D. C., USA, kterým byla přidělaná čísla FERM-P a ATCC, bylo zjištěno, že náleží třem novým druhům a že každý vzhledem к ostatním představuje varientu uvnitř druhu.

Tabulka!

SHS-	Jméno přidělené izolovanému mikroorganismu	FERM-P	ATCC
2003	Erwinia citreus	5449	31623
2006	Erwinia punctata	5452	31626
2004	Erwinia punctata var.	5450	31624
2005	Erwinia punctata var.	5451	31625
2007	Erwinia punctata var.	5453	31627
2008	Erwinia terreus	5454	31628
2009	Ewrinia terreus var.	5455	31629
2010	Erwinia terreus var.	5456	31630
2011	Erwinia terreus var.	5457	31631

Podrobnosti taxonomlckých studií o těchto mikroorganismech jsou popsány souhrnně v tabulce 2 níže.

3·

Tabulka 2

Α» Pozorování

1. Tvar buněk:

(Bujónové šikmé agary při teplotě 28 °С, po dobu 24, 72 a 168 hodin). Buňky převážně jednotlivé, tyčinky uvedených rozměrů se zakulacenými konci u každého ze sledovaných kmenů. Občas lze pozorovat u některých kmenů přítomnost deformovaných buněk uvedených rozměrů.

Kmen: Převažující buňky: Deformované buňky:

SHS- [rozměry (^i)J Rozšířené buňky: Prodloužené buňky:

[rozměry (p)]

2003	0,8 - 1,2 x 1	l,0 - 2,9	pozorováno	pozorováno	1,6 x 6,0 - 7,0
2004	1,0 - 1,5 x 1	l,5 - 3,3	pozorováno	pozorováno	0,7 - 0,8 x 4,0 - 5,0
2005	1,0 - 1,3 x 1	!,6 - 2,1	pozorováno	pozorováno	0,7 - 0,8 x 2,4 - 3,0
2006	1,1 - 1,3 x 1	1,3 - 1,9	pozorováno	pozorováno	0,6 - 0,8 x 2,4 - 2,7
2007	1 ,0 - 1,2 x 1	l,7 - 2,3	žádné	žádné	— -
2008	0,8 - 0,9 x 1	l,5 - 1,7	žádné	žádné	—
2009	1,0x1	l,2 - 2,1	žádné	žádné	—
2010	1,0 x 1	1,0 - 2,0	žádné	žádné
2011	1,1x1	1,3 - 2,0	Žádné	Žádné	—

2. Pohyblivost a tvorba biěíků (Bujónový šikmý agar při teplotě 20 a 25 °C po dobu 18 až 24 hodin).

Pohyblivost se zjištuje metodou visuté kapky. Tvorba bičíků se zjišluje pomocí optického mikroskopu po vybarvení metodou dle Toda nebo pomocí elektronového mikroskopu přenosového typu po kultivaci technikou trvalé membrány.

Kmeny SHS-2003, 2004, 2005, 2006 a 2007: obvykle nepohyblivém

Kmen JH3-2008: pohyblivý jedním bočním bičíkem.

Kmeny 3H3-2009, 2010 a 2011: pohyblivé jedním nebo dvěma bočními bičíky.

3. Spory: u Žádného z uvedených kmenů se obvykle nevytvářejí.

4. Vybarvování podle Grama:

(Bujónový šikmý agar při teplotě 28 °C po dobu 24, 72 a 168 hodin). Negativní u všech uvedených kmenů.

5. Tvorba kyseliny: obvykle negativní.

B. Růst na různých prostředcích

1. Kolonie na bujónovém agaru při teplotě 28 °C po dobu 24, 48, 72 a 168 hodin.

Počáteční kolonie jsou obvykle kruhovité, celistvé, hladké, průsvitné a mazlavé.

Tabulka 2 - pokračování

Kmeny SHS-	Lesk	Barva	Vývoj kultury (změny v koloniích, pokud k nim dodházX)
2003	třpytivý	světle červeno žlutá	konvexní
2004	třpytivý	světle	hladká, avšak postupně
		béžová	přechází v hrubou
2005	třpytivý	světle	konvexní, avšak postupně
		béžoÝá	se mění na zvýšenou
2006	třpytivý	světle	konvexní, .avšak postupně
		béžová	se mění na vypouklou
2007	třpytivý	světle	zvýšená, avšak postupně
		béžová	se mění na vypouklou
2008	kalný až	světle čer-	hladká, postupně se však
	třpytivý	venožlutá	mění na hrubou a konvexní. Kaná, postupně se však mění ve třpytivou
2009	třpytivý	světle	hladká, postupně se však
	-	béžová	mění na hrbou a zvýšenou
2010	třpytivý	světle	konvexní, postupně se však
		béžová	mění ns vypouklou
2011	třpytivý	světle čer-	konvexnn, avšak postupně
		venoŽlutá	se na plochou. Vis- kózní, avšak postupně přechází na mazlavou

2. Bujónový Šikmý agar při teplotě 28 °C po dobu 24 až 168 hodin. Počáteční kolonie jsou obvykle nitkovité a mazlavé.

Kmeny BHS-	Růst	• Lesk	Barva	Vývoj kultury (změna)
2003	bohatý	třpytivý	světle červenožlutá	—
20.04	bohatý	kalný až třpytivý	světle béžová	kalný, avšak postupně přecnází v třpytivý '
2005	mírný	třpytivý	světle béžová	—
2006	mírný	kalný až třpytivý	světle červeno Žlutá	kalný, avšak postupně přechází v třpytivý
2007	skrovný	kalný	světle červenožlutá	—
2008	bohatý	kalný až třpytivý	světle červenožlutá	kalný, avšak postupně přechází ve třpytivý
2009	bohatý	kalný až třpytivý	světle červenožlutá	kalný avšak postupně přecháží ve třpytivý
2010	mírný	třpytivý	světle červenožlutá	—
2011	mírný	třpytivý	světle červeno-	--- .

žlutá

Tabu.lka 2 - pokračování

3. Bijonová Živné ^prostředí při ²8 °C ^po dobu ²⁴ až ¹⁶⁸ hodin. Obvykle bez vůně.

Kmeny -HS-	Růst na povrchu kultury	dnbmeezní růst
Kruh kolem stěny zkumavky	Membránový růst	Vločkoovtý růst	Turbidita	. Vločkoovtý sediment
2003	třetího dne a pozděěi	—	—	ne^patrná	skrovný
2004		šestého dne		ne^petrná až mírná	počáteční kompaattní sediment se mění v mírně vločkovitý sediment
2005	---	šestého dne	—	nepatrná	skrovný
2006	--- .	šestého dne	—	nepatrná mírná	až skrovný
2007	třetího dne	sedmého dne	—	nepatrná	skrovný
2008	sedmého dne	—	třetího dne	nepatrná	skrovný
2009	—	třetího až šestého dne	sedmého dne	nepatrná	skrovný '
2010	—	šestého dne	—	nepatrná až mírná	skrovný
2011	—	čtvrtého dne	—	nepatrná	skrovný

4. Bujón-želatinový vpic^{h p}ři te^plotě ²⁰ °C ^po ^do^bu ^{40 d}ní. Obvykle Žá^dné ztekucování. Růst podél linie vpichu.

5. ^Lakmusové ^m.^éko ^při te^plot^{ě 28} °C po tohu 40 ^dní.

Kmen 3H3-2003: Otyselení začíná po sedmi, dnech, olabá a rovnoměrná koagulace začíná asi osmréctý den a je skončena'třicátý osmý den. Od osmnáctého do dvaatřicátého dne horní yrstva zrůžoví a dolní je Šedohnědá, avšak třcáátáho osmého dne celá vrstva je rovnoměrně růžová.

Kmeeny -HS-2⁰⁰⁴, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010 a 2011: Během inkubace nebyly obvykle pozorovány žádné změrny· ⁶. Růst na nimrám ^prostředí bamborov^o ^škro^bu ^při teplotě ²⁸ °C ^po ^do^bu 24 až b68 hodin.

KT-tura obvykle nitkovitá, maalavá a třpytivá.

Kmeny dH--	Růst	Barva
2003	bohatý	světle , červenožlutá
2004	bohatý	béžová
2005	mírný	béžová
2006	mírný	světle béžová
2007	mírný	béžová
2008	bohatý	béžová
2009	bohatý	béžová
2010	mírný	béžová
2011	mírný	béžová

Tabulka 2- pokračování

C. Fyziologické vlastnosti (není-li uvedeno jinak, založené na výsledcích pozorování při te^plotě ²⁸ °^{C p}o ^dobu 14 dní):

1. Dusttan: DsStan vzniká z dusičnanu.

2. Dusičnanové dýchání: V bujónovém prostředí uzavřeném parafn^i^m, obsshhjícím 1% roztok dusičnanu draselného, nebyl pozorován·ani růst ani vznik plynu.

3. Zkouška oethhlčerveni: Pozitivní ve všech případech, s výjimkou kmene 2010, který poskytuje jenom slabě p^oi1ti^v^:í reakci. . .

4. Vogeз-Przskaueгzva reakce (glukóza): Kmen SHS-2003: Velice slabě p^oilLiv^:í.

Kmeny SHS-2004, 2005, 2007, 2008, 2010 a 2011: Poziiivní.

Kmeny SHS-2006 a 2009: Negaaivní nebo velice slabě pozitivní.

5. Indol: Obvykle negaaivní.

6. Sirovodík:

(i) Papprek Bacto pepton, voda-octan olovnatý pozitivií ' (ii) TSI agar: Obvykle negaaivní.

(iii) K.ieglerův agar: obvykle negaaivní.

7. Arnonnak: obvykle nevzniká.

8. Hdrolýza škrobu: obvykle negaaivní.

9. Růst'na citátoGé^m prostředí:

⁽ⁱ⁾ Siomonзnvn ^pm specii*: obvykle roťte.

(ii) Christensinzvz prostředí: obvykle roste.

^x Doplněno směsí vitmtoů. .

10. Růst s anorganickými zdrooi dusíku:

(i⁾ amonn^é ^uckerovo pros^eán s glu^zou*: obvykle rosto.

(ii.) ^rusⁱδnanzv^é (Dimmiotovo prostřed) s ^u^ozou*: ^pozoz*zvJ^άnϊ. růstu toenů SHS-2003, 2004, 2005, 2008, 2009, 2010, 2011, zatímco SHS-2006 neroste a SHS-2007 ' roste jenem slabě.

^x Djplněno smésí vitomtoů.

11. Pigment (desková kultura):

⁽ⁱ) Medrý pig^en^t (kvasničný extrak 1«, glukóza 1 %, CaCO^ ² % při teplotě 28 °C po dobu 7 dní); - obvykke negativu!.

(ii) Růžový difUrndovatelný pigment (atejné prostředí jako vpředu): obvykle negativní.

⁽1Н)· Žlutý · pi^ent bujónový agar ^při ^plotě ²⁸ °C po tobu 7 diO: obvykle nega' tivní.

12. UreVzt: obvykle negativní.

13. Kattlázt: obvykle pooitivní.

14. OxidVzt (bujónový šikmý tgar po dobu 18 až 24 hodin, obsahující tetrsmethylfenylenditmin):' obvykle negativní.

15. Závislost nt teplotě (Btcto kvtsničný extrakt 0,5 %, Btcto pepton 0,5 % t glukóz 0,5 %, při hodnotě pH 7):

Kmeny SH3-	Teplote růstu (°C)	Oopimální teplott růste ⁽°^C)
2003	?,5 tž 38,5	18 tž 31
2004	6,5 tž 40,0	20 tž 34
2005	6,5 tž 38,5	22 tž 28
2006	6,5 tž 38,5	21 tž 28
2007	4,0 tž 47,5	21 tž 27
2008	18,0 tž 40,0	19,5 tž 32,5
2009	8,5 tž 38,5	24 tž 30
2010	6,5 tž 40,0	24 tž 34
2011	4,0 tž 40,0	19,5 tž 24

15. Závislost nt pH (glycerol 1 %, Btcto kvtsničný extrakt·0,05 %, Btcto pepton 1 %, NaCC 0,5 ^^, v ^{0,1 M} pu^fru k^yse^ein^y 3»3-^dimeth^ulgiLu^ttroié^, při teplote ²⁸ °C po ^dobu · 2 tž 4 dní):

Kmeny JHS-	pH růstu	Optimální pH růstu
2003	5,5 tž 8,0	6,0 tž 7,5
2004	5,5 tž 8,5	6,0 tž 7,5
2005	5,5 tž 8,5	6,0 tž 7,5
2006	5,5 tž 8,5	6,0 tž 7,5
2007	5,5 tž 8,5	6,0 tž 7,5
2008	5,5 tž 7,5	6,0 tž 7,5
2009	5,5 tž 8,0	6,0 tž 7,5
2010	6,0 tž 8,0	6,0 tž 7,5
201 1	5,5 tž 7,5	6,0 tž 7,5

17. Požadavek nt kyslík: Obvykle ftkulttUiniě tnaerobní.

(i) Očkovtcí kultura uztvřenV tekutým ptrtfinem: (Živná prostředí BCP s glukózou, obsahující Bacto hovězí extrtk 1 %, Bacto pepton 1 %, Bacto kvtsničný extrtk 0,2 %, NaCl 0,5 %, bromcresolovou červeň 0,004 % t tgtrový prášek 1,5 % hodnott pH byte uprtvent.nt 7,0 tž 7,2, bylo rozděleno do zkumavek o průměru 18 mm ve vrstvě tsi 8 cm. Rozdělené pro^středí bylo sterilováno při te^plotě ¹²¹ °^C po ^dobu ¹5 Očkování vpíchem ^bylo provedeno před úplným ztuhnutím prostředí. Zkumavky byly potom uztvřeny sterinním tekutým p^^teem (5 t^ž 7 ml) 4 cm vrstvou. ^Zkumavk^y b^yl^y kultⁱoov^Vi^y při teplote ²⁸ °C t stedov^Vny po dobu 7 dní. Lze pozorovat zřetelný růst podél lteie očkování v prostředí od shora dolů během dvou tž tří dnů t kultura ztčínV jednotně žloutnout t uktzuje zřetelný rozdíl v btrvě ve srovnání s kuitivoc^í^r^ou uztvřenou zkumavkou, ^očkoveného kontrolního vzorku t u ktždého z uvedených kmenů. OOdtín žluté btrvy se · prohlubuje s postupem doby.

(11) Gas-Pak anaerobní systém (BBL): (Bacto živná agarová deska, obsahující Bacto hovězí extrakt 1 %, Bacto pepton 1 %, NaCl 0,5 % a práškovítý agar 1,5 % nebo GYP agarová deska, obsahující glycerol 0,5 %, Bacto kvasničný extrakt 0,5 %, Bacto pepton 0,3 %, KHgPO^ 0,1 %, Mg SO^.7H₂O 0,02 % a agarový prášek 1,5 %» hodnota pH byla upravena na 7,0 až 7,2), slabě proužkové zaoSkování suspenze zkušebního organismu bylo kultivováno pH teplotě 28 °C po dobu 48 hodin poté, kdy kyslík byl odstraněn dvouhodinovou reakcí pH teplotě 45 °C v inkubátoru.

Byl pozorován jenom slabý růst. Růst je slabší než z Escherichia coli použité jako kontroly.

18. O-F zkouška (Hugh-Leifaonova metoda): obvykl* fermentativní.

Prostředí obsahující Bacto trypton 1 %, Bacto kvaaničný extrakt 0,1 %, bromkresolovou červeň 0,004 %, glukózu (nebo laktózu) 1 % a agarový prášek 0,2 %, hodnota pH byla nastavena na 7,0 až 7,2, bylo rozděleno do zkumavek (18 mm v průměru) ve vrstvě asi 8 cm. Rozdělené prostředí bylo sterilizováno při teplotě 121 °C po dobu 15 minut. Když teplota prostředí dosáhla asi 30 až 40 °C, s každým organismem uvedených kmenů bylo provedeno dvojité očkování a jedna zkumavka z každé dvojice byla potom uzavřena sterilním tekutým parafinem (5 až 7 ml) vrstvou asi 4 cm. Zkumavky byly kultivovány při teplotě 28 °C a pozorovány po dobu 7 dní.

Za aerobních a anaerobních podmínek vzniká z D-glukózy (rovněž z laktózy v případě SH3-2003) kyselna, nikoliv plyn. Lze pozorovat zřetelný růst podél linie očkování od shora dolů v uzavřené kultuře jako v neuzavřené kultuře.

Anaerobní tvorba kyseliny není tak rychlá jako u Escherichia coli, která byla použita jako kontrola.

19. Tvorba kyselin a plynů z uhlohydrátů:

(Modifikovaný Barsikowův způsob při teplotě 28 °C, po dobu 7 dní, stacionárně).

Kmeny ý л

Ctí J? <tí N

SHS-

л N

Ctí

N Ό

A. ΡΌ ω ·η

я

Сб

N Ό

*о •и

гЧ О

*O

N

P

0

го

Сб

•Н

Сб

N

•Н

х>

й

•P

*O

1 О

N

-Р

О

N

'О

о

Ф

Ad

a

Сб Л4

*о

Ό

•и

•н

*О

4->

•и

гЧ

О

5

3

r4

Р д

я

X)

я

гЧ

.М

гЧ

>>

U

r4

cd

ФгЧ

Сб

•н

го

(б

ctí

Ф

гЧ

R

e

o

х> ьо

я

«

я

©

X

3

О

2003	+	+	4-	4-	4-	4-	4-	4·	4-	4-	4-	+	4-
2004	+	+	+	+	+	4·	-	4-	+		4-	-	4-
2005	+	+	+	+	4-	+	-	4-	+		4-	4-	4-
2006	+	+	+	+	4-	4-	-	+	4·	-	4-	4-	-
2007	+	+	+	+	4-	4-	-	4-	4-	-	+	4-	-
2008	+	+	+	+	4-	4-	-	+	4·	-	4-	4·	4-
2009	+	+	+	+	4-	-	-	4-	4·	-	4-	4-	4-
2010	+	+	4-	+	+		-	4-	4-	-	4-	4-	-
2011	+	+	+	4-	4-	-	-	4-	4-	-	4-	4-	-

Tabulk a 2- pokračování

Kmeny ce _____ ct N

SHS-

Cti N *O

cc

a

N

«5 N

N *O P

r3 N O

Λ P Ό tu ~-ι

h

N

•H

•rl

Ό

P

*O

P

•H

tí

В со

P

rt

*O

h

rH

•rl

a

•.-4

•rl

N

•rl

1 О

Р

42

P

tí

•rl

Й

CJ

Φ

P

СО м

co

O

rH

X

Cti

$4

O

<H

rH

ς_( 3

О

CO

Cti

Ф

CO

4=

O

íti

Ό

Φ

£-4

ι-Ч г-4

a

CQ

a

Q

W

«

'0

*4

Q

g

rt bf)

H

2003	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
2004	-		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
2005	+	-	-	-	-	-		-	-	-	-	-	-
2006	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
2007	+	-	-	-	-	-	+	-	-	-	-	-	-
2008	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
2009	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
2010	+	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
2011	+	_-	_-	_-	-	_-	_-	_-	_-	_-	_-	_-	_-

Poznámka (i) Vzniká kyselina, nikoli plyn (±), di.) Nepatrně vzniká kyselina nikoOi plyn ⁽íí⁰⁾ Nevznite ani tyseltea ani ^pl^yn ⁽-⁾

20. Methylenová modř (bujónové živné prostřední, 18 až 24 hodin): Dochází obv^ykle k redukci.

21. Kfseeina D-glukonová: Je obvykle využívána.

22. Kyseina 2-keto-D-glukonová: Je obvykle využívána.

23. Produkce redukované sloučeniny ze sacharózy (Bergeyův Manual of determinative bacteriology 8. vydání (1974) str. 335, tabulka 8, 19, poznámka f): Obvykle pooitivní vyjímaje SHS-2003.

24· Dekarboxylace různých aminokysslin:

(Shaw C. a Clarke P. Η, J. Gen. МсгоНо^, Ц. 155 až 161 (1955))· (i) Kyseina L-gluaamová: Neeaaivní u SHS-2003., 2008, 2009, 2010 a 2011. Po^tivní u SHS-2004, 2005, 2006 a 2007.

(ii) L-lyzin: obvykle negativní.

(iii) L-arginin: obvykle negativoí.

(iv) L-ornithin: obvykle ο^^ΙώοΙ.

25. Lipáza (moodfikovaná Starrova metoda, Starr Μ. P, Science ,23. 333 až 334 ( 1941): Obvykle negativΊÍ.

26. Oxidace D-glukonátu (Shaw C. a Clarke , P. Η., J. Gen. МкгоИ^., ,13. 155 až

161 (1955): Ppliiivní·

27. Degradace pektinů (A. M. Paton, Nátuře, 183. 1 812 až 1 813 (1959): Ниа^та!.

28. Hydrolýza kaseinu (D. W. Dye, N. Z. J. Sci., £1, 590 až 607, , (1968): H^e^aat-v^í.

29. Symplasmata (D. C. Gragam a W. Hodgkiss, J. Appl. Bacteriol., 30(11, 175 až 189, (1967): Negativní u SHS-2003, 2004, 2005, 2007, 2008 a 2009. Pozitivní u SHS-2006, 2010 a 2011.

30. DNáza (Bacto DNázový zkušební agar): Negativní.

31. Fenylalaninová deamináza (prostředí fenylalanin/kyselina malonová, dostupné od firmy Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.):

Kmeny SHS-2003, 2008, 2009, 2010 a 2011: Negativní nebo velice slabé, pozitivní.

Kmeny SHS-2004, 2005, 2006, 2007: Negativní.

32. Inhibice KCN: Pozitivní.

33. Růst v bujónu s 5% NaCl: Pozitivní.

34. Auxotrofie (prostředí Grayovo a Tatumovo): Vyžaduje kyselinu nikotinovou nebo nikotinamind.

35. Využití některých organických sloučen (D. W. Dye, N. Z. J. Sci., 11, 590 až 607 (1968), OY prostředí, teplota 28 °C, 20 až 44 hodin, za třepání):

Tabulka 2 - pokračování

Kmeny

SHS-	Acetát	Citrát	Formát	Fumarát	P 40 Д o й	P 40 03 S	-P ЧИ Cl •H и ,Μ '0	Benzoát	cl o £ -P r4 Ctí O	•P 40 Й O r4 CD s	P 40 r4 (0 И O	Propionát	P 40 £ cc •P £ <e E4	P 4D P Λ
2003	+	+	+	+	+	4-	+	-	-	-	-	-	-	+
2004	±	+	+	4-	4-	4-	4·	-	-	-	-	-	-	+
2005	4-	+	4-	4-	4-	4-	4-	-	-	-	-	-	-	±
2006	±	4-	4-	4-	4-	4-	4·	-	-	-	-	-	-
2007	4-	4-	4-	+	4-	4-	+	-	-	-	-	-	-	±
2008	4-	+	4-	4-	4-	4-	4-	-	-	-	-	-	-	4-
2009	+	+	4-	+	4-	4-		-	-	-	-	-	-	4-
2010	+	+	4-	4-	4-	4-	+	-	-	-	-	—	-	+
2011	+	+	4-	4-	4-	4-	4-	-	-	-	-	-	-	4-

Poznámka: (i) Využívá jako jediný zdroj uhlíku (+) (ii) Využívá málo nebo nevyužívá jako jediný zdroj uhlíku (-) (iii) Nevyužívá (-).

36. Ubichinon (Y. Yamada, K. Aida a T. Uamura, J. Gen. Appl. Microbiol., 15, 181 až

196 (1969) Kmeny SHS-2003, 2008: Ubichinon-8 (a ubichinon-7) Kmeny SHS-2004, 2005, 2006, 2007, 2009, 2010 a 2011: Ubichinon-8.

D. Původ

Kmeny SHS-2003, 2004, 2006, 2007, 2010 a 2011: mandarinky

Kmeny SHS-2005 a 2009: datlová slíva.

Kmeny SHS-2008: půda.

Kmeny uvedené v tabulce 1 byly určeny porovnáním výše uvedených taxonomických vlastností příslušných kmenů v tabulce 2 s popisy v Bergeyově Manual of Determinaaive BecCeelology, osmé vydání, 1974 (dále pro jednoduchost jenom jako ”Manuia), což vedlo k závěrům, které budou popsány níže.

1. Přidělení k čeledi:

Na základě výše popsaných výsledků pozorování, že všechny uvedené kmeny jsou krátké tyčinky gramLeeaatvních a fakultativně anaerobních mikroorganismů, které nevytvářej spory a mmCí katalázovou, nikom však oxidázovou a^ti-vLtu, bylo určeno, že náleží k čeledi Eilterobac teri ac ece.

2. Přidělení rodu:

Bylo určeno, že na základě taxonomických vlastností všechny uvedené kmeny náleží k rodu Erwinia, zejména na základě toho, že produkuj kyseliny z btta-methylglukosiUu a sacha-’ rózy (s výjimkou BHo-2003, který nevytváří kyselinu ze sacharózy, ale využívá ji jako jediného zdroje uhlíku), bik^oi z adomitu, dulcitu nebo metetitózt; ne^jy^lží^í^ají benzoátu, oxalátu a proplo^tu, přčeemž jsou neschopné hydrolyzovat škrob, jsou neschopné dekarboxylovat kyselinu gluCamovou, arginin, lysin a ornithin (s výjimkou SHB-2004, 2005, 2006 a 2007, které dekaabboyyu j kyselinu gluCamovou) a nernaCí u^ázov^ nebo líáázovou akkiviti.

3. Přidělení druhu:

Kmen nHB-2003:

AAkkoi se předpokládá, že tento kmen je blízce příbuzný s Erwinia ste^iatt^:! ze skupiny herbicola, definované v Manualu na základě toho, že nevytváří bičíky, má ještě mnoho jiiých toxonomických vlastností velmi odliStých od Erwinia stewiatti v následdjcích bodech:

(i) Požadavek kyseliny nikotinové nebo ni^^o^n^i^mi^du k růstu, (ii) tvorba sirovodíku z cysteinu, (iii) redukce dusičnanu na dusitan, (iv) nevytváří kyse^tin^y ze s^han^y'* arabinozy, raíhnc^ neto sorbity (v) vytváří kyseliny ze salicinu, ceUobiózy a gl^e^li a (vi) nevyužívá tartarát jako jediný zdroj uhlíku.

(k Ačkkoi není schopen tvorby ktsetint ze sacharózy, může se ji vynžívat jako jediný zdroj uhlíku).

Dále, protože tento kmen nevykazuje shodu s kterým^o! jinými známými, druhy v rodu, definovanými v Mannulu, bylo rozhodnuto, že by měl být přidělen k novému rodu nazvanému autory Erwinia citreus.

Kmeny Blb-2004, 2005, 2006 n 2007: ·

АА^Ш se má zn to, že tyto kmeny jsou úzce příbuzné s Erwinia stewarti!, se zřeteeem k tomu, že ntvvtvááej bičíky, maCí ještě mnoho společných taynnnmických vlastností velice odlišných od .Erwinia stť#iatli v následu jcích bodech:

(i) Požadavek kyseliny nikotinové a nikotinamidu к růstu.

(ii) Produkce sirovodíku z cysteinu.

(iii) Redukce dusičnanu na dusitan.

(iv) Dekarboxylace glutamové kyseliny.

(v) Netvoří kyseliny z arabinózy, manitu, laktózy nebo sorbitu.

(vi) Tvorba kyselin ze salicinu a celobiózy a (vii) nevyužívání tartarátu jako jediného zdroje uhlíku.

Dále bylo pozorováno, že tyto kmeny se liší od dříve popsaného kmene 3HS-2003 v následujících bodech: dekarboxylace, kyseliny glutamové; jsou stéží schopné využívání laktózy, acetátu a laktátu jako jediného zdroje uhlíku; jsou neschopné tvorby kyseliny z manitu a laktózy a nepůsobí na lakmusové mléko.

Mimoto, poněvadž se tyto kmeny neshodují se žádným známým druhem v rodě definovaném v Manualu, bylo rozhodnuto, že by měly být přiděleny novému druhu nazvanému autory Erwinia punctata.

Z těchto kmenů jsou si kmeny JHS-2004 a 2006 blízké v taxonomických vlastnostech v následujících bodech:

(i) Nevyužívá se kyselina z rafinózy a (ii) nevyužívá se manit, acetát nebo laktát.

Avšak oHo-2004 se liší od 3HS-2006 v následujících bodech:

(i) Tvorba acetoinu z glukózy.

(ii) Využívání dusičnanu jako zdroje dusíku.

(iii) Tvorba kyseliny z glycerolu a (iv) využívání formátu jako jediného zdroje uhlíku.

Na druhé straně kmen SH3-2005 má stejné toxonomické vlastnosti jako SHS-2006 v tom, že je skrovně schopný využívání manitu, acetátu a laktátu jako jediného zdroje uhlíku, avšak liší se v těchto bodech:

(i) Tvorba kyseliny z glycerolu.

(ii) Tvorba acetoinu z glukózy.

(iii) Tvorba fluorescentních pigmentů v Kingově prostředí B.

(iv) Skrovná tvorba kyseliny z rafinózy a (v) využívání formátu jako jediného zdroje uhlíku.

Dále, kmen SH3-2007 podobně má vlastnosti jako kmen óHS-2006 v těch bodech, že je schopen skrovného využívání manitu, acetátu a laktátu jako jediných zdrojů uhlíku, liší ae však v těchto bodech:

(i) Tvorba kyseliny z rafinózy.

(ii) Tvorba acetoinu z glukózy.

(iii) Využití formátu jako jediného zdroje uhlíku a (iv) široké rozmezí teploty růstu, například 4,0 až 47,5 °C.

Na základě výše uvedených výsledků pozorování bylo nalezeno, že všechny kmeny SHS-204, 2005, 2006 a 2007 náleží к uvedené Erwinia punctata a tvoří jednotlivě mezi sebou Varianty.

Kmeny SHS-2008 a 2010:

Ačkoli se předpokldá, že jsou tyto kmeny úzce příbuzné s Erwinia tracheiphila nebo Erwinia quercina vzhledem к jejich pohyblivosti s monolaterálním bičíkem, jejich taxonomické vlastnosti jsou ještě více odlišné od Erwinia trachephila, definované v Manualu, v následujících bodech:

(i) Růst při teplotě vyšší než 36 °C.

(ii) Bohatý růst v bujónovém agarovém prostředí.

(iii) Mukoidní růst.

(iv) Redukce dusičnanu v dusitanu.

(v) Produkce kyselin ze salicinu, xylózy, malibiózy a manózy.

(vi) Využití laktátu jako jediného zdroje uhlíku.

Na druhé straně jsou rozdíly v jejich taxonomických vlastnostech od vlastností prwinia quercina, definovaných v Manualu, v následujících bodech:

(i) Oxidace glukonové kyseliny.

(ii) Redukce dusičnanu v dusitan.

(iii) Tvorba kyselin z melibiózy a cellobiózy.

(iv) Netvoří se kyselina z mahitu, alfa-methylglukosidu, eskulinu a sorbitu a (v) netvoří se plyn na glukózo-peptonovém médiu.

Navíc, poněvadž se tyto kmeny· neshodují s žádným jiným známým druhem v rodu, který je definován v Manuálu, bylo nalezeno, Že by bylo vhodné přidělit je к novému druhu, pojmenovanému autory vynálezu Erwinia terreus.

Dále, kmen SHS-2010 se v podstatě shoduje s kmenem SHS-2008, s výjimkou některých rozdílů, pozorovaných v těchto bodech:

(i) Netvoří kyselinu z glycerolu.

(ii) Tvorba kyseliny z ribózy kmenem SHS-2008 na rozdíl od velmi skrovné tvorby kmenem SHS-2010.

(iii) Slabě pozitivní v testu s methylčervení.

(iv) Tvorba fluorescentních pigmentů v Kingově prostředí B.

Kmen 3HJ-2009:

Tento kmen se pokládá za blízce příbuzný Erwinia tracheiphhla, E. quercina a E. herbicola, var. herblcola, se zřetelem k pohhbbivosSi pomocí monnlaaerálního bičíku.

Jsou však znatelné rozdíly v taxonomických vlastnostech tohoto kmene při srovnání s vlastnostmi Erwinia tracheiphhla, definovanými v v následujících bodech:

(i) Bohatý růst v bujónových agarových prostředcích.- (ii) pM teplotě ^šší ^než 36 °C.

. (iii) Mukoodní růst., (iv) Redukce dusičnanu v dusitan a (v) produktce kyselin ze salicinu, xylózy,·maaibiózy, ' celiobiózy, glycerolu a , manózy.'

Kromě toho bylý, nalezeny i význačné rozdíly od Erwinia quercina v následujících bodech:

(i) Oxidace glukonátu.

(ii) Redukce dusičnanu v dusitan.

(iii) Nepatrná tvorba acetoinu z glukózy.

(iv) Tvorba kyselin z xylózy, maaibiózy a cellobiózy.

(v) Z mmaitu, alefa-mlthylgiyknзidu_t eslkilinu, ribózy nebo sorbitu nevzniká kyselina.

(vi) Tartarát není využíván jako jediný zdroj uhlíku a (vii) z glukózo-peptonového prostředí nevzniká plyn.

Dále byly nalezeny ještě·pozoruhodné rozdíly vlastností 3HS-2010 od Erwinia herblcola» var. herbicola · v následnících bodech:

(i) Požadavek kyseliny nikotinové a nikotnnamidu k růstu.

(ii) Nepatrná tvorba acetoinu z glukózy.

(iii) Želatina se neztekucuje.

(iv) Tvorba kyselin z meHbiózy, cellobiózy a gl^em^ a (v) z Babinózy, maantu, mdtózy, dextrinu, rharanózy, ribózy nebo aorbitu nevzniká kyselina.

Při srovnávání a výše uvedeným kmenem áHS-2008 však zůattáwa^ ještě některé rozdíly v těchto bodech:

(i) nepatrná tvorba acetonu z glukózy a (ii) z ribózy nevzniká kyselina.

Předcházející kmen se shoddje s posledním kmenem v dalších dominujících vlastnostech a tak je identifikován jako varianta výše uvedeného Erwinia terreus.

Kmen SHS-2011 ‘

Tento kmen se pokládá za blízce příbuzný a Erwinia tracheiphila nebo Erwinia amylovora v důsedlku jeho pohyblivosti pomocí monolaterálního bičíku.

Když se vlastnosti tohoto kmene srovnávají nejprve s vlastnostmi Erwinia tracheiphila, definovanými v Manualu, lze rozeznat významné rozdíly v následujících bodech:

(i) Mírný růst v bujónovém agarovém prostředí.

(ii) Růst při teplotě vyšSÍ neí 36 °C.

(iii) Mukoidní růst.

(iv) Redukce dusičnanu v dusitan.

(v) Tvorba kyselin ze salicinu, xylózy, malibiózy, cellobiózy a manózy a (vi) využívání laktátu jako jediného zdroje uhlíku.

Když se tyto vlastnosti srovnávají s vlastnostmi Erwinia amylovora, lze rozeznat významné rozdíly v následujících bodech:

(i) Tvorba sirovodíku z cysteinu.

(ii) Růst při teplotě do 36 °C nebo vyšší.

(iii) Redukce dusičnanu v dusitan.

(iv) Želatina se neztekucuje.

(v) Tvorba kyselin ze salicinu, xylózy, melibiózy, cellobiózy a manózy a (vi) z ribózy nevzniká kyselina.

Na druhé straně, když je tento kmen srovnáván s óHS-2008, lze konstatovat, že se svými vlastnostmi shoduje s předešlým kmenem, kromě toho, že netvoří kyselinu z ribózy nebo glycerolu a je identifikován jako varianta výše uvedeného kmene Erwinia terreus.

Kromě těchto izolovaných mikroorganismů (divoké kmeny lze způsobem podle vynálezu s výhodou využívat, kterékoli jejich spontánní mutanty, pokud jsou schopny produkovat kyselinu 2,5-diketo-D-glukonovou a není zapotřebí se zmiňovat, že kterékoli kmeny získané uměle nebo induktivně mutací nebo modifikací těchto izolovaných mikroorganismů, tak, že vykazují požadované vlastnosti, mohou být využity při provádění způsobu podle vynálezu snadnou cestou vhodným šlechtěním kmenů.

Výše uvedené mikroorganismy rostou bohatě ve vodném živném prostředí obsahujícím D-glukózu jako hlavní zdroj uhlíku, kukuřičný výluh jako zdroj dusíku a malé množství anorganických solí. Pěstují-li se aerobně, rostou na prostředí a vysokou koncentrací ^«glukózy a dostatečnou stabilitou za tvcxb.y kyseliny 2,5-diketo-D-glukonové (2,5-DKG) v dobrém výtěžku ve srovnání se známými mikroorganismy, kterých bylo použito při výrobě téhož produktu.

&>oncnnrace D· glukózy v žínám . prostředí může být, je-li to žádoucí, ' vysoká, například hsoOt/obj· %, pro ekonomickou výrobu 2,5-DKG je obvykle výhodné udržovat tuto koncentraci v rozmezí 15 až 25 hnoo./obj. % a zejména s výhodou okolo 20 hnoo./obj. %.

Teplota feraentačníto žíraéto ^prostře^dí může být v rozmezí 15 až 35 °C, s výhodou v rozmezí ²⁰ a^ž 3⁰ °C a nej^lépe okolo 28 °C. Počáteční bodiota pH méidia může ^být v rozmezí 5,5 až 7,5 a a výhodou v rozmezí 6,0 až 7,0.

Hodnotu ' pH žiného prostředí lze udržovat ▼ požadovaném rozmezí 4,0 až 5,5 během fermentace přísadou vhodných anorganických solí, které piufrují výchozí Živnou látku, nebo postupxým přidáváním vhodných do žiné ' půdy béhem fermentace. Jako soli lze pouuít například uhliSitan vápenatý a jako bázi hydroxid sodný.

Očkovaná feramtační půda se míchá kontinuálně míchadlem (asi 1 740 ot. za min ) za vzdušnění . ryc№.ostí asi 600 N m./min.

Fermennace je skončena, když přeměna D--glukózy v 2,5-DKG dosáhne hodnoty odpovídsajcí asi 90« výtěžku, kterážto doba je asi 17 až 31 hodin od začátku·

Nahromaděnou 2,5-DKG nebo její soli lze izolovat ve formě krystalů z fermentační půdy po předchozí úpravě, například hodnoty pH, nebo půdu lze případně po^ít s výhodou například pro živné prostředí p^JLŠt^do stupně. N^j^p^říkíLad půdu obsahujcí 2,5—DKG'lze pouuít přímo k výrobě kyseliny 0-0etv-L·-gulvnvvé, kterou lze takto získat ve vysokém výtěžku jednoduchým postupem ve srovnání s obvyklým způsobem.

Kromě výěe popsané fermentace lze vynález provádět jednoduše tak, Že se uvádějí ve styk kterékoli produkty produkované mikroorganimmem s jakýmikooi substráty obsah^ícími D·glukózu. V těchto případech lze používat podobných podmínek jaké jsou popsány ve spojitosti s kultivací živých buněk k inkubaci produktů v substrátu a konverze začne bezprostředně po uvedení ve styk.

Popis výhodného provedení

V následujícím popisu bude vynález vysvětlen podrobuji pomooí příkladu.

Příklad 1

1, Očkovací prostředí

Vodný roztok obetOnujcí: hmoot/obj. %

D--glukózu (hydrátovanou, obsah 91 «)1,0 kukuřičný výluh (CSL)í,»0 dihyteogotfosfát draselný (K^FO^)OJ síran hořečnatý (MgSO^HgO) < 00 02 uiHčitan vápenatý (CaCOj0,5 ee upraví na hodnotu pH 6,8 až 7,0 přidáním 10« vodného roztoku hydroxidu sodného, rozdělí se na 50 ml podíly a uníítí ve sterilovaných 500 ml konických baňkách, aby se získalo očkovací prostředí*

2. Očkcovací kultura

Kíždé uvedené proetředí v baňkách se očkuje jednou plnou kličkou kmenů uvedených v tabiúce ' 3 nOe a tř^e se ⁽z^ív¹¹: Л mm, ²⁷⁰ za minuti teplotě ²⁸ °C po dobu ⁸ todta.

Kultivace se ukončí, když optická hustota (O.D.) prostředí je zhruba 8 (konečná hodnota) .

3. Fermentační prostředí

Vodný roztok obsahující:

A hmot./obj· %

D~glukózu	20,0
CóL	3,0
KH₂P0₄	0,»
CaCO^	6,3

se upraví na hodnotu pH 6,8 až 7,0, rozdělí na 455 ml podíly a umístí do jednotlivých fermentorů, aby se získalo fermentační prostředí, do kterého se přidává vždy po 45 ml uvedeného očkovacího prostředí.

4. Fermentace:

Fermentace se provádí za následujících podmínek:

Teplota:	2Θ °C
Míchání:	1 740 otáček za min
Vzdušnění:	600 N ml/min

Doba:

až 31 hodin

5. Hodnocení:

Produkt se chrometografuje sestupnou chromatografií na papíru za podmínek uvedených níže a skvrny se kvantitativně hodnotí denzitometricky.

i) Nosič: Toyo Roshi č. 50 ii) Vyvíjecí činidlo: fenol : kyselina mravenčí : voda = 75:4:25 iii) Vybarvení:

Nastříkání roztokem AHF (roztok vody nasycené n-butanolem /100 ml/ obsahující 0,93 g anilinu a 1,66 g kyseliny flátové), barva se vyvíjí po zéhřevu na teplotu 105 °C po dobu 2 minut.

iv) Barva a R^ hodnota:

	Látka:	Barva:	»f=
4	kyselina 2,5-diketo-D-glukonová kyselina 2-keto-D-felukonová D-glukóza	hnědá růžová hnědá	0,16 až 0,18 0,27 až 0,29 0,48 až 0,50

Kromě toho se provádí rovněž chromatografie na tenké vrstvě ”TCL alumiaheet cellulose (obchodní název firmy Merck A. G.) za použití stejného vyvíjecího systému a vybarvování, jak je popsáno vpředu· V tomto připadá se provádí srovnání chromatogramu s chromátogramem získaným z autentického vzorku·

6. Ukončení

Fermentace je skončena tehdy, když na uvedeném papíru nebo na chromatogramu na tenké vrstvě zmizí růžová skvrna kyseliny 2-keto-D-glukonové.

Výsledky:

Tabulka 3

Kmeny Očkovací kultura Fermentační kultura 2,^-diketo-D-glukonová

SHS- Při ukončení Při ukončení kyselina

	PH	OD	Boba (hod.)	pH	OD	Doba (hod.)	Konc· (hmot./ /obj. %)	Výtěžek z D-glukózy (%)
2003	7.0	10,0	8	5,4	12,3	18	19	88
2004	6,0	8,5	6	4,9	12,0	17	19	89
2005	6,9	9,5	9	5,1	12,6	20	19	86
2006	5,9	7,5	6	4,7	12,0	21	19	89
2007	6,0	7,0	8	4,9	12,6	17	19	89
2008	5,6	3,1	10	5,3	12,4	29	17	70
2009	5,8	3,4	10	5,7	12,4	21	18	79
2010	5,4	2,5	10	5,4	12,8	31	18	75
2011	5,3	2,4	10	5,1	12,2	31	17	75
Pří	klady	2 a 3

(produkce buněčnou suspenzí a surovým extraktem enzymu)

1. Prostředí použité к získání buněk mikroorganismu:

vodný roztok obsahující;

kvasničný extrakt (dostupný od firmy Daigo Eiyo Yaknhin К. K.) KH₂P0₄ Na₂S0₄.7H₂0 CaCO^

0,1 hmot./obj. % 0,1 hmot./obj. % 0,2 hmot./obj. % 0,6 hmot./obj. %

se upraví na hodnotu pH 7,0, rozdělí na 60 ml podíly a umístí v kuželovitých baňkách (500 ml).

2. Kultury pro izolaci buněk mikroorganismů а к oddělení surového enzymového extraktu:

Každé uvedené prostředí se očkuje kmeny uvedenými v tabulce 4 níže, podobně jak je to popsáno u očkovací kultury v příkladu 1 a třepe se (zdroh 71 mm, 270x za minutu) při teplotě 28 °C po dobu 16 hodin.

Po třepání se buňky mikroorganismu izolují odstředěním kultivačního prostředí a pro* myjí se dvakrát roztokem chloridu sodného a rozdělí se do dvou podílů.

Jeden z uvedených podílů se suspenduje znovu v roztoku chloridu sodného za vzniku buněčné suspenze. Druhý podíl se suspenduje v 1/50 M tris-HCl pufru (pH 7,5) va kterém jsou buňky rozdrceny působením ultrazvuku a odstředěny, aby se oddtriani nerozpustný zbytek 2a účelem získání bezbuněčného extraktu surového enzymu jako jeho supernatantu.

3. Inkubace suspenzí buněk:

Připraví se směs 1/10 M pufiu kyseliny 3_?3”dimethylglutsr*ové (pH 5,0), obsetaujícího asi 5 hno^/oUj. % D-glukózy, ve které, se koncentrace buněk upraví tak, že 0. D. při 680 mj je asi 10. Směs se rozdělí na 10 ml poddly, umíítí do zkumavek o průměru 23 na a 196 mm délky a l.nkubuje se ^při teplot^{ě 28} °C ^po ^do^bu 3 todin.

oměs se odstředí za vzniku supernatantu, který se analyzuje pomooí ' papírové chromatografťLe. Výsledky jsou shrnuty níže v tabulce 4, kde je udána rovněž koncentrace glukózy ve soOsí před inkubací.

Tabulka 4 (koncentrace po třech hodinách třepání)

Kmeny SHo-	D-glukóza (%) Před inkubací	2-keto-D-gjukonová kyšelina (%)	2, >-diketo»I>-gjkЮonová kyselina (%)
2003	4,9	2,7	0,8	1,9
2004	5,0	1,9	0,7	1,5
2005	5,0	2,6	0,6	0,7
2006	5,0	1,9	0,9	1,1
2007	5,0	1,4	0,3	1,4
2008	5,0	1,3	0,8	1,2
2009	5,2	1,9	0,7	1,3
2010	5,0	2,9	0,5	0,9
2011	5,0	2,8	0,7	0,9

4« Inkubace se surovým extraktem enzymu:

Ke soOsí připravené podobně jako je popsáno u 3. nahoře se přidá extrakt surového enzymu tak, že jeho koncentrace je 0,25 mg/ml, stanoveno jako mnnossví bílkoviny (Folinovou m^e^<^<^0L^u. Po třepání, jak je popsáno vpředu, se přidají ke směsi dvě kapky 10 hmo^/obje % roztoku kyseliny trichloroctové, aby se odíraní poddl bílkovin a cUгomajooз·eďujt se na í^il^t^aanim pappru. Výsledky jsou uvedeny , v tabulce 5 níže.

T a b u 1 ka 5 (koncentrace po 3 hodinách třepání)

Kmen SHó-	2-ktto-I>-gjukonová kyselina ’ (%)	2,5-di k eto-D-gunkonová ^selina (%)
2003	1,0	l',0
2004	0,6	0,8
2005	0,4	0,4
2006	0,5	0,5
2007	0,3	0»4

Tabulka 5 - pokračován

Kmen 8HS-	2^^-1--gunkonová kyselina (%)	2,5-di.teto-D-gkkkontvá kyselina (%)
2008	0,8	0,5
2009	0,4	0,6
2010	0,3	0,3
2011	0,3	0,3

Claims

1. Způsob výroby tys<e.iny 2,5-diketo?D-glukonové nebo jejich solí, vyznaačjící se tím, že se D-glukóza převádí na kyselinu 2,5-dtkθto-I--gjktínovtk v přítomnosti alespoň jednoho kmene mikroorganismů rodu Erwinla, s výhodou druhů Erwinia citreus ATCC 31623, Erwina puncata ATCC 31626, 21624, 21625, 31627 a Ewinia terreus ATCC 31628, 21629, 31630 a 31631 produk^ících tyselinu 2,5-diketo-I>-gjuOontvtu, nebo produktu produkovaného uvedenými mikroorganismy, popřípadě za aerobních podmínek, v reakčním proesíředí, načež se popřípadě kyselina 2,^-diketo-D-gkukontvá nebo něěterrájeeí sůl, nahromaděná během převáděn, izoluje ze vzniklé emměl, vysrážením přídavkem rozkptuštědlč ^rozpoi^tjícího uvedenou kyselinu nebo její soU, například methιaíolk, ethano^ nebo acetonu, - do prostředí.

reakčního

2. Způsob podle prostředí.činí áž 40 bodu 1, vyznačuje í hmot./hmot. %.

ee tím, že koncentrace D-glukózy v reakčním

3* Způsob - podle bodu vyznaččUící ae tím, že převádění se provádí za vzdušněn.

4. Způsob podle až 35 °C.

bodu vyznaččUící se tím, že převádění se provádí při teplotě 15

5. Způsob podle bodu převáděn udržuje při 4,0 ,

až vyznačČLjící

7,5.

ae tím, že hodnota pH reakčního prostředí se během

6. Způsob podle bodu dí, kterým je vodné živné nismů. ~ se tím, že převádění ae provádí v reakčním prostřevyzna^ujcí prostředí, a během kultivace alespoň jednoho z uvedených íitrttrga1 vyznačuje! se tím, že se uvádí alespoň jeden produkt produko

7. Způsob podle bodu vaný uvedenými mikroorganismy do styku se substrátem obsahuuícím D-glukózu

8. Způsob podle bodu 7, vyznnačjjcí se tím, že produkovaným produktem je buněčná suspenze uvedených mikroorganismů.

9· Způsob podle bodu 7, vyznačuje í se tím, že produkovaným produktem je enzym extrahovaný z uváděných mikroorganismů.