HU188073B - Process for the preparation of 2,5-diketo-d-gluconic acid - Google Patents

Process for the preparation of 2,5-diketo-d-gluconic acid Download PDF

Info

Publication number
HU188073B
HU188073B HU812376A HU237681A HU188073B HU 188073 B HU188073 B HU 188073B HU 812376 A HU812376 A HU 812376A HU 237681 A HU237681 A HU 237681A HU 188073 B HU188073 B HU 188073B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
acid
shs
erwinia
glucose
medium
Prior art date
Application number
HU812376A
Other languages
English (en)
Inventor
Takayasu Sonoyama
Shiego Yagi
Bunji Kageyama
Masahiro Tanimoto
Original Assignee
Shionogi And Co Ltd,Jp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shionogi And Co Ltd,Jp filed Critical Shionogi And Co Ltd,Jp
Publication of HU188073B publication Critical patent/HU188073B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
    • C12P7/60—2-Ketogulonic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/58—Aldonic, ketoaldonic or saccharic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/18—Erwinia
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/847—Erwinia

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

A találmány tárgya új mikrobiológiai eljárás 2,5diketo-D-glukonsavnak (a következőkben 2,5DKG-nak nevezzük) D-glükózból való előállítására. Részletesebben a találmány a 2,5-DKG előállításának olyan módszerére vonatkozik, amelyet az Erwinia fajba tartozó új mikroorganizmusok fermentálásával vagy a D-glükóznak az említett mikroorganizmusokkal vagy ezek kezelt termékeivel, például nyugalomban levő sejtjeikkel, rögzített sejtjeikkel, őrölt sejtjeikkel, vagy a belőlük extrahált enzimekkel való egyszerű érintkeztetéssel hajtunk végre, és ezek a sejtek folyékony közegben szuszpendálva vagy stacionárius ágy felületén rögzítve lehetnek.
A 2,5-diketo-D-glukonsav az L-aszkorbinsav gyártásában hasznos közbenső termék. Ugyanis a 2,5-DKG szelektíven és sztereospecifikusan 2-ketoL-glukonsavvá, az L-aszkorbinsav elővegyületévé redukálható, és ez az L-aszkorbinsav előállítására sokat ígérő új módszernek bizonyul (lásd a 3 922 194, 3 959 076, 3 963 574 és 3 998 697 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásokat).
Mindezekben az ismert eljáráokban a 2,5-diketoD-glukonsav előállítását kizárólag az Acetobacter, Acetomonas, Gluconobacter és Pseudomonas nemekbe tartozó aerob mikroorganizmus törzsek tenyésztésével érték el. Mindezideig egyetlen esetet sem közöltek arra vonatkozóan, hogy a vegyület előállítását az Erwinia nembe tartozó fakultatív anaerob törzsek tenyésztésével érték volna el.
Ezért a találmány elsődleges tárgya eljárás a 2,5diketo-D-glukonsavnak az Erwinia nembe tartozó, újólag izolált mikroorganizmusok használatával való előállítására.
A találmány további tárgya eljárás a 2,5-diketoD-glukonsavnak nagy kitermeléssel, folyékony táptalajban nagy koncentrációban való előállítására, hogy az előbb említett sokat ígérő új módszer gazdasági hasznosítását megkönnyítsük.
A 2,5-diketo-D-glukonsav előállítására szolgáló találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy az Erwinia nem 2,5-diketo-D-glukonsavat termelő mikroorganizmusát vagy ebből előállított bármely terméket (az említett mikroorganizmus sejtjeinek kezelésével kapott bármely terméket) D-glükózzal érintkeztetünk.
A találmány szerinti eljárás sokféle módon valósítható meg; például az említett mikroorganizmusnak legalább egy törzsét D-glükózt tartalmazó vizes táptalajban tenyésztjük, vagy egyszerűen az említett mikroorganizmusokat vagy ezek kezelt termékeit, például nyugalomban levő sejtjeit, rögzített sejtjeit, belőlük extrahált sejtmentes enzimeket D-glükóztartalmú hordozóalappal érintkeztetjük.
Aza egész leírásban és az igénypontokban mindenütt használt „tenyésztés” kifejezés minden olyan mikrobiológiai műveletet magában foglal, amelyben a mikroorganizmusokat a táptalajba azért oltjuk be és inkubáljuk, hogy ebben fermentá- θθ ló hatást idézzünk elő. Az „érintkeztetés” kifejezés esetünkben azt jelenti, hogy a mikroorganizmusokat vagy ezek bármely kezelt termékét a hordozóalappal úgy egyesítjük, hogy tekintet nélkül az érintkeztetés, azaz az inkubálás időtartamára, a 65 2
D-glükóznak 2,5-diketo-D-glukonsavvá való alakulását elérjük.
A találmány szerinti eljárásban az Erwinia nembe tartozó bármely mikroorganizmust használhat5 juk, amennyiben ezek a mikroorganizmusok a D-glükózt szelektíve oxidálni és 2,5-diketo-Dglukonsavvá alakítani képesek. Az izolált és a feltalálók által az Erwinia nem új fajába tartozóként meghatározott ilyen törzsek példáit az alábbi 1. 10 táblázatban foglaltuk össze. Mindezeket a törzseket Japánban a Fermentation Research Instituteban és Washington D. C.-ben az American Type Culture Collection-ban FERM-P, illetve ATCC számokkal megjelölve letétbe helyeztük; ezeket három új fajba tartozónak találtuk, és mindegyik faj a fajon belül a többihez képest új változatot alkot.
7. táblázat
20 SHS- jel Az izolált mikroorganizmusok elnevezése FERM-P i \TCC
2003 Erwinia citreus 5449 31 623
2006 Erwinia punctata 5452 31 626
25 2004 Erwinia punctata var. 5450 31 624
2005 Erwinia punctata var. 5451 31 625
2007 Erwinia punctata var. 5453 31 627
2008 Erwinia terreus 5454 31 628
2009 Erwinia terreus var. 5455 31 629
2010 Erwinia terreus var. 5456 31 630
30 2011 Erwinia terreus var. 5457 31 631
Ezen mikroorganizmusok rendszertani tanulmányozásának részleteit együttesen az alábbi 2. táblázatban írjuk le.
2. táblázat
A. Megfigyelések 1. A sejtek alakja (Húslé-agar ferde lemezen 28 ’C-on, 24,72 és 168 40 óra hosszat inkubálva.)
Mindegyik megfigyelt törzs közös tulajdonsága · az, hogy főleg egyedülálló, a felsorolt méretű, lekerekített végű pálcika alakú sejtekből áll. Egyes törzseknél néha a feltüntetett méretű deformált sejtek 45 jelenlétét figyeltük meg.
Sejtek túlnyomó többsége: Megnyúlt Deformált sejtek:
50 SHS Méretek (μ) sejtek Kiszélese- ... . , , , dett sejtek éretek (μ)
2003 0,8-1,2 x 1,0-2,9megfigyelt megfigyelt 1,6 x 6,0-7,0 2004' 1,0-1,5 x 1,5-3,3megfigyelt megfigyelt 0,7-0,8 x 4,0-5,0
2005 1,0-1,3 x 1,6-2,1 megfigyelt megfigyelt 0,7-0,8 x 2,4-3,0
2006 1,1-1,3 x l,3-l,9megfigyeltmegfigyelt 0,6-0,8x2,4-2,7
2007 1,0-1,2 x 1,7-2,3 nincs nincs -
2008 0,8-0,9 x 1,5-1,7 nincs nincs -
2009 1,0 x 1,2-2,1 nincs nincs
2010 1,0 x 1,0-2,0 nincs nincs -
2011 1,1 x 1,3-2,0 nincs nincs -
2. Ostorosság és mozgékonyság (Húslé-agar ferde lemezen 20 és 25 ’C-on, 18-24 óra hosszat inkubálva).
A mozgékonyságot függő-csepp módszerrel határoztuk meg.
Az ostorosságot Toda módszerével való megfes-21
188 073 !
tés után optikai mikroszkóppal vagy transzmissziós típusú elektronmikroszkóppal határoztuk meg, miután hosszantartó hártyatenyésztési módszerrel tenyésztettük.
Az SHS-2003, 2004, 2005, 2006 és 2007 törzsek általánosan nem mozgékonyak.
Az SHS-2008 törzs egyoldalú ostorral mozgékony.
Az SHS-2009, 2010 és 2011 törzsek egy vagy két oldalostorral mozgékonyak.
3. Spórák
Általánosan a felsorolt törzsek egyike sem alkot spórákat.
4. Gram-festés (Húslé-agar ferde lemezen 28 “C-on, 24,72 és 168 óra, hosszat tenyésztve):
Általánosan a felsorolt törzsek mindegyike Gram-negatív.
5. Savállóság: Általánosan negatív.
B. Fejlődés különféle táptalajokon
1. Húslé-agar lemezen 28 ’C-on, 24, 48, 72 és 168 óra alatt fejlődött telepek.
Kezdetben a telepek általában kör alakúak, ép szélűek, simák, áttetszőek és vajszerűek.
Törzs SHS Növeke- dés Fényesség Szín Tenyészet (és változása)
halvány
5 2007 gyér fakó vöröses- sárga
2008 bőséges fakó- fényes halvány vöröses- sárga fakó, de fokozatosan fényessé válik
10 2009 bőséges fakó- fényes halvány vöröses- sárga halvány fakó, de fokozatosan fényessé válik
2010 mérsékelt fényes vöröses- sárga halvány
15 2011 mérsékelt fényes vöröses- sárga
3. Húsleves folyékony táptalajban 28 ’C-on 24-128 20 óra alatt
Törzs P. , „ . 7T en.yéTl „ „„„ Fényesség Szín (Telepek esetleges változása)
Felületi tenyészet Süllyesztett tenyészet
Törzs SHS Gyűrű a kémcső- Hártyás fal tenyészet mentén Pelyhes tenyészet Zavaros- ság Pelyhes üledék
2003 3. napon és utána - csekély gyér
2004 6. napon - csekély- a kezdetben
2003 fényes halvány sárga vöröses
2004 fényes halvány sárga barnás-
2005 fényes halvány sárga barnás-
2006 fényes halvány sárga ba rnás-
2007 fényes halvány sárga barnás-
2008 fakófé- halvány vöröses-
nyes sárga
2009 fényes halvány sárga barnás-
2010 fényes halvány sárga barnás-
2011 fényes halvány sárga vöröses-
domború sima, de fokozatosan érdessé válik domború, de fokozatosan kiemelkedővé válik domború, de fokozatosan kúposodottá válik kiemelkedő, de fokozatosan kúposodottá válik sima, de fokozatosan érdessé és domborúvá válik. Fakó, de fokozatosan fényessé válik.
sima, de fokozatosan érdessé és kiemelkedővé válik domború, de fokozatosan kipúposodik domború, de fokozatosan lapossá válik. Nyúlós, de lassan vajszerűvé válik.
mérsékelt tömör csapa-
dék pelyhes dékké zik gyér, üle- válto-
2005 - 6. napon - csekély gyér
2006 * 6. napon — csekély- mérsékelt gyér
2007 3. napon 7. napon - csekély gyér
2008 7. napon - 3. napon csekély gyér
2009 3.-6. napon 7. napon csekély gyér
2010 6. napon csekély- mérsékelt gyér
2011 4. napon - csekély gyér
2. Húslé-agar ferde lemezen, 28 ’C-on, 24-168 óra alatt: Kezdetben a telepek általában fonalasak és vajszerűek.
Törzs NövekeSHS dés
Fényesség Szín
Tenyészet (és változása)
2003
2004
2005
2006 bőséges bőséges mérsékelt mérsékelt fényes fényesfakó fényes fakófényes halvány vörösessárga halvány sárgásbarna halvány barnássárga halvány vörösessárga fakó, de fokozatosan fényessé válik fakó, de fokozatosan fényessé válik
4. Húsleves-zselatin táptalajon szúrt tenyészet 20 45 ’C-on. 40 nap alatt.
Általánosan nem folyósodik el. Tenyészet a szúrás vonala mentén.
5. Lakmusz-tejben 28 ’C-on 40 napig tenyésztve. SHS-2003 törzs: Savképződés 7 napon belül 50 megkezdődik. A gyenge és egyenletes koagulálás körülbelül a 18. napon kezdődik, és a 38. napon teljessé válik. A 18. naptól kezdve egészen a 32. napig a felső réteg rózsaszínűvé és az alsó réteg szürkés-barnává válik, de a 38. napon mindkét réteg egyenletesen rózsaszínű lesz.
SHS-2004,2005, 2006,2007,2008, 2009, 2010 és
2011 törzsek: Az inkubálás időtartama alatt általánosan nem figyeltünk meg változásokat.
6. Burgonya ferde lemezen 28 ’C-on, 24-168 óra alatt:
A tenyészet általánosan fonalas, vajszerű és fényes.
188 073
I
Törzs SHS Tenyészet Szín
2003 bőséges halvány vörösessárga
2004 bőséges bamássárga
2005 mérsékelt barnássárga
2006 mérsékelt halvány barnássárga
2007 mérsékelt barnássárga
2008 bőséges barnássárga
2009 bőséges barnássárga
2010 mérsékelt barnássárga
2011 mérsékelt barnássárga
C Fiziológiai tulajdonságok (Más megjelölés híján az eredmények 28 °C-on 14 nap alatt kapott megfigyeléseken alapulnak.)
1. Nitrit: Nitrátból általánosan nitritet termelnek.
2. Nitrát kilégzés: Parafinnal lezárt, 1% káliumnitrátot tartalmazó húsleves folyékony táptalajban általánosan sem növekedést, sem gázfejlődést nem figyeltünk meg.
3. Metilvörös próba: Általában pozitív, kivéve az SHS-2010 törzset, amely csak nagyon gyengén pozitív.
4. Voges-Proskauer reakció (glükóz):
SHS-2003 törzs: nagyon gyengén pozitív.
SHS-2004, 2005, 2007, 2008, 2010 és 2011 törzsek: pozitívak.
SHS-2006 és 2009 törzsek: negatívak, vagy nagyon gyengén pozitívak.
5. Indok Általánosan negatívak.
6. Hidrogénszulfid:
(i) Bakto-pepton-viz-ólomacetát papír: Általánosan pozitívak.
(ii) TS1 agar: Általánosan negatívak.
(iii) Klieger agar: Általánosan negatívak.
7. Ammónia: Ammóniát általánosan nem termelnek.
8. Keményítő hidrolizálása: Általánosan negatív.
9. Citrátot tartalmazó táptalajon való növekedés:
(i) Simmon féle táptalajon (vitaminkeverékkel kiegészítve): Általánosan növekednek.
(ii) Christensin féle táptalajon: általánosan növekednek.
10. Növekedés szervetlen nitrogénforrással:
(i) Ammónia (vitaminkeverékkel kiegészített glükóz-Hucker féle táptalajon: általánosan növekednek.
(ii) Nitrát (vitaminkeverékkel kiegészített glükóz-Dimmick féle táptalajon): az SHS-2003, 2004, 2005, 2008, 2009, 2010 és 2011 törzseknél növekedést figyeltünk meg, de az SHS-2006 nem növekszik, és az az SHS-2007 törzs csak nagyon gyengén fejlődik.
11. Pigment: (lemezen szélesztett tenyészet):
(i) Kék pigment (1% élesztőkivonat, 1% glükóz, 2% kalciumkarbonát tartalmú táptalajon, 28 ’C, 7 napig tenyésztve); általánosan negatív.
(ii) Rózsaszínű diffundáló pigment (fentiek szerint tenyésztve): általánosan negatív.
(iii) Sárga pigment (húslé-agar táptalajon, 28 °C-on, 7 nap alatt tenyésztve): általánosan negatív.
12. Ugreáz: Általánosan negatív.
13. Kataláz: Általánosan pozitív.
14. Oxidáz: (húslé-agar ferde lemezen, 18-24 óra hosszat tenyésztve, tetrametilfeniléndiamint tartalmazó): általánosan negatív.
15. Hőmérsékleti körülmények (0,5% Bacto 5 élesztőkivonatot, 0,5% Bacto peptont és 0,5% glükózt tartalmazó táptalajon, 7 pH-nál tenyésztve):
Törzs SHS Növekedési hőmérséklet ’C Növekedés legkedvezőbb hőmérséklete *C
2003 8,5-38,5 18-31
2004 6,5-40,0 20-34
2005 6,5-38,5 22-28
2006 6,5-38,5 21-28
2007 4,0-47,5 21-27
2008 18,0-40,0 19,5-32,5
2009 8,5-38,5 24-30
2010 6,5-40,0 20-34
2011 4,0-40,0 19,5-24
16. pH-körülmények (0,1 mólos 3,3-dimetilglutársav-puffer-oldatban 1% glicerint, 0,05% Bacto élesztőkivonatot, 1% Bacto peptont, 0,5% nátriumkloridot tartalmazó táptalajon 28 ’C-on 2-4 napig tenyésztve):
Törzs SHS Növekedési pH Optimális növekedési pH
2003 5,5-8,0 6,0-7,5
2004 5,5-8,5 6,0-7,5
2005 5,5-8,5 6,0-7,5
2006 5,5-8,5 6,0-7,5
2007 5,5-8,5 6,0-7,5
2008 5,5-7,5 6,0-7,5
2009 5,5-8,0 6,0-7,5
2010 6,0-8,0 6,0-7,5
2011 5,5-7,5 6,0-7,5
17. Oxigénigény: Általánosan fakultatív anaerob 40 törzsek.
(i) Folyékony paraffinnal lezárt szúrt tenyészet: 18 mm átmérőjű kémcsövekbe 1% Bacto marhahúskivonatot, 1% Bacto peptont, 0,2% Bacto élesztőkivonatot, 0,5% nátriumkloridot, 0,004% 45 brómkrezolvöröst és 1,5% agarport tartalmazó, 7,0-7,2 pH-ra beállított glükóz-BCP folyékony táptalajt 8 cm magasságig töltünk be, és 121 'C-on 15 percig sterilizáljuk. A szúrással való beoltást a táptalaj teljes megszilárdulása előtt hajtjuk végre. Ezután a kémcsöveket 5-7 ml steril folyékony paraffin 4 cm magas rétegével lezárjuk. A kémcsöveket 28 ’C-on inkubáljuk, és 7 napon át megfigyeljük.
Mindegyik felsorolt törzsnél 2-3 nap alatt a táp55 talaj tetejétől az aljáig a szúrás vonala mentén határozott növekedést figyeltünk meg, a tenyészet egyenletesen kissé sárgásán elszíneződött; és a lezárt inkubált kémcsövek mindegyikének színe ezáltal a be nem oltott kontroll kémcsövekkel összehasonlítva, határozott különbséget mutatott. A sárga szín az idő múlásával tovább erősödött.
(ii) Gas-Pak anaerob rendszer (BBL) (1% Bacto marhahúskivonatot, 1% Bacto peptont, 0,5% nátriumkloridot és 1,5% agarport tartalmazó Bacto táptalaj agar lemezt vagy 0,5% glice-
-4188 073 rint, 0,5% Bacto élesztőkivonatot, 0,3% Bacto peptont, 0,1% káliumdihidrogénfoszfátot, 0,02% magnézium-szulfát 7 H2O-t és 1,5% agarport tartalmazó GYP agar lemezt használunk, és a pH-t 7,0-7,2re állítjuk be.) A vizsgálandó mikroorganizmus 5 szuszpenziójának vékony vonalával beoltva, 28 ’Con, 48 óra hosszat inkubálunk, miután 45 ’C-on az inkubátorban 2 óra hosszat tartó kezeléssel áz oxigént eltávolítottuk.
Általában gyenge növekedést figyeltünk meg. 10 A növekedés kisebb, mint a kontrollként használt Escheríchia coli növekedése.
18. D-F próba (Hugh-Leifson féle módszer): Általában fermentál. Az 1% Bacto triptont, 0,1% Bacto élesztőkivonatot, 0,004% brómkrezolvöröst, 1% 15 glükózt (vagy laktózt), 0,2% agarport tartalmazó táptalaj pH-ját 7,0-7,2-re állítjuk be, és 18 mm átmérőjű kémcsövekbe 8 cm magasságig visszük be, majd 15 percig 121 ’C-on sterilizáljuk. Miután a táptalaj hőmérséklete 30-40 ’C-ra csökkent, a 20 felsorolt törzsek mindegyik mikroorganizmusával két-két kémcövet beoltottunk, és mindegyik kémcsőpár egyikét 5-7 ml steril folyékony paraffinnal 4 cm magasságban feltöltve, lezártuk. A kémcsöveket 28 ’C-on inkubáltuk, és 7 napon át megfigyel- 25 tűk.
Mind aerob, mind anaerob körülmények között D-glukózból (az SHS-2003 törzs esetében laktózból is) sav keletkezett, de gáz nem fejlődött. Mind a lezárt, mind a le nem zárt kémcsövek tetejétől az 30 aljáig húzódó szúrási vonal mentén határozott növekedést figyeltünk meg.
Az anaerob savképződés nem annyira gyors, mint a kontrollként használt Escheríchia coli esetében. 35
19. Sav- és gáztermelés szénhidrátokból:
(Módosított Barsikov-féle módszer, 28 ’C-on 7 napig tartó mozdulatlan tenyésztés.) •o n c £ c -o -c 3
Törzs SHS
N
-O Η ·2 a -o j* Jí <É eb Sí «3 JD ~ c :g :2 e
S ·Γί N «ό .G *C .2 n '2 ο o q « ή ί 2 ö = .2
E S -5 E
2003 + + + + + + + + + + + + +
2004 + + + + + + - + + - + - +
2005 + + + + + + - + + - + + +
2006 + + + + + + - + + - + + -
2007 + + + + + + + + - + + -
2008 + + + + + + - + + + + +
2009 + + + + + - - + + + + +
2010 + + + + + ± - + + - + + -
2011 + + + + + - + + - + + -
*9 o 4*
Έο -Ö -L
Törzs SHS n * — Ώ ‘O e ·**
Έ = = £ é g '5 8 '£ g H
2003
2004 +
2005
2006
2007 θ5
Törzs SHS S E -S
2008
2009
2010 +
2011 +
-SS E δ SS
N _ ‘g 5 8 « -g <X) «_ 03
T3 •R o
N M •o -O — Ή .5 o ü Jd ja E «
Megjegyzés:
(i) savat termel, de gázt nem ( + ) (ii) kevés savat termel, de gázt nem (±) (iii) sem savat, sem gázt nem termel (-)
20. Metilénkék (Húsleves folyékony táptalajon 18-24 óra hosszat tenyésztve): Általánosan redukálnak.
21. D-glukonsav: Általánosan hasznosítják.
22. 2-keto-D-glukonsav: Általában hasznosítják.
23. Szacharózból redukált vegyület termelése [Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiadás (1974), 335. old., 8.19. táblázat, f. lábjegyzet]: az SHS-2003 törzs kivételével általában pozitív.
24. Különféle aminosavak karboxilmentesítése: [Shaw, C. és Clarké, P. H., J. Gén. Microbiol., 13, 155-161 (1955)].
(i) L-glutaminsav: SHS-2003,2008,2009,2010 és 2011 törzsekkel negatív. SHS-2004, 2005, 2006 és 2007 törzsekkel pozitív.
(ii) L-lizin: Általánosan negatív.
(iii) L-arginin: Általánosan negatív.
(iv) L-omitin: Általánosan negatív.
25. Lipáz (Módosított Starr féle módszer [Starr, Μ. P., Science, 93, 333-334 (1941)]: Általánosan negatív.
26. D-glükóz oxidálása [Shaw, C. és Clarké, P. H., J. Gén. Microbiol., 13,155-161 (1955)]: Általánosan pozitív.
27. Pektát lebontás [A. M. Paton, Natúré, 183, 1812-1813 (1959)]: Általánosan negatív.
28. Kazein hidrolízis (D. W. Dye, N. Z. J. Sci., 11, 590-607 (1968)]: Általánosan negatív.
29. Szimplazmata [Graham, D. C. és Hodgkiss, W., J. Appl. Bacteriol. 30(1), 175-189 (1967)]: Az SHS-2003, 2004, 2005, 2007, 2008 és 2009 törzsekkel negatív; SHS-2006, 2010 és 2011 törzsekkel pozitív.
30. DNase (Bacto DNase-próba agar táptalaj): Általánosan negatív.
31. Fenilinanin-dezamináz (fenilalanin/malonsav táptalaj, beszerezhető a Nissui Pharmaceutical Co. Ltd.-től): Az SHS-2003, 2008, 2009, 2010 és 2011 törzsek negatívok vagy nagyon gyengén pozitívok. Az SHS-2004, 2005, 2006 és 2007 törzsek negatívok.
32. Káliumcianid gátlás: Általánosan pozitív.
33. 5% nátriumkloridot tartalmazó húslevesben a fejlődés: Általánosan pozitív.
34. Auxotrophia (Gray és Tatum féle táptalajon): Általánosan nikotinsavat vagy nikotinamidot igényelnek.
-5188 073
35. Egyes szerves vegyűletek hasznosítása [D. W. Dye, N. Z. J. Sci., 11.590-607 (1968)] (OY táptalajban 28 °C-on 20 és 44 órai rázás közben tenyésztve):
2003 + + + + + + +- -- -- - +
2004 T + + + + + + -- -- -- ±
2005 ± + + + + + +- -- -- - ±
2006 £ + + + + + +- -- -- - ±
2007 ± + + + + + + - -- -- - ±
2008 + + + + + + +- -- -- - +
2000 + + + + + + +- -- -- - +
2010 +++ + + + +- -- -- - +
2011 + + + + + + +- -- -- - +
Megjegyzés:
(i) Egyetlen szénforrásként hasznosít ( + ).
(ii) Egyetlen szénforrásként kevéssé vagy egyáltalán nem hasznosít (±).
(iii) Nem hasznosít (-).
36. Ubikinon [Y. Yamada, K. Aida és T. Uemura, J. Gén. Appl. Microbiol., 75, 181-196 (1969)]: Az SHS-2003, 2008 törzsek: Ubikinon-8 (és Ubikinon-7); az SHS-2004, 2005, 2006, 2007, 2009, 2010 és 2011 törzsek: Ubikinon-8.
D. Származás
Az SHS-2003, 2004, 2006, 2007, 2010 és 2011 törzse'·: mandarain narancsból.
Az SHS-2005 és 2009 törzsek: datolyaszilvából.
Az SHS-2008: talajból.
Az 1. táblázatban felsorolt törzseket úgy határoztuk meg, hogy ezeknek a törzseknek a 2. táblázatban összefoglalt rendszertani tulajdonságait a Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 8. kiadás (1974), (a továbbiakban egyszerűen „Manual” néven említjük) leírásaival összehasonlítottuk, és így az alábbi következtetésre jutottunk:
1. Elhelyezés a „Család” fogalomkörén belül:
A megfigyelések a fent leírt azon eredményei alapján, hogy a felsorolt törzsek mindegyike fakultatív anaerob, Gram-negtív, spórát nem termelő, rövid pálcika alakú, kataláz-aktivitást igen, de oxidáz-aktivitást nem mutató törzs, ezért ezeket az Enterobacteriaceae családba tartozónak határoztuk meg.
2. Elhelyezés a „Nem” fogalomkörén belül:
Rendszertani tulajdonságaik alapján a felsorolt törzsek mindegyikét az Erwinia nembe tartozónak határoztuk meg, különösen azért, mert β-metilglükozidból és szacharózból savat termelnek (kivételt képez az SHS-2003 törzs, amely szacharózból nem termel savat, hanem ezt egyedüli szénforrásként hasznosítja), de adónkból, dulcitból vagy melezitózból nem képesek savat termelni; benzoátot, oxalátot és propionátot nem hasznosítanak; keményítőt nem hidrolizálnak; glutaminsav, arginin, lizin és ornitin dekarboxilezésére nem képesek (kivéve az SHS-2004, 2005, 2006 és 2007 törzseket, amelyek a glutaminsavat dekarboxilezik); és sem ureáz-, sem lipáz-aktivitást nem mutatnak.
3. Elhelyezés a „Faj” fogalomkörén belül:
SHS-2003 törzs:
Bár ez a törzs az ostorosság hiánya miatt a „Manual”-ban meghatározott herbicola csoport Erwinia stewartii törzse közeli rokonának tekinthető, mégis egyéb rendszertani tulajdonságai az alábbi pontokban nagymértékben eltérnek az Erwinia stewartii tulajdonságaitól:
(i) Nikotinsavat vagy nikotinamidot igényel a növekedéshez.
(ii) Ciszteinből hidrogénszulfidot fejleszt.
(iii) Nitrátot nitritté redukál.
(iv) Szacharózból(*), arabinózból, raffinózból vagy szorbitból nem termel savat.
(v) Szalacinból, cellobiózból és glicerinből savat termel.
(vi) Egyetlen szénforrásként tartarátot nem hasznosít.
(*) Megjegyzés: Bár szacharózból nem képes savat termelni, de ezt egyedüli szénforrásként hasznosíthatja.
Továbbá, mivel ez a törzs a „Manual”-ban meghatározott semmi más ismert fajjal nem mutat azonosságot, a feltalálók úgy döntöttek, hogy ezt Erwinia citreus néven új fajként sorolhatják be.
SHS-2004, 2005, 2006 és 2007 törzsek:
Bár ezek a törzsek az ostorosság hiánya következtében szintén az Erwinia stewartii törzs közeli rokonának tekinthetők, a többi közös rendszertani tulajdonságaik a következő pontokban nagymértékben eltérnek az Erwinia stewartii tulajdonságaitól:
(i) Nikotinsavat vagy nikotinamidot igényelnek a növekedésre.
(ii) Ciszteinből hidrogénszulfidot fejlesztenek.
(iii) Nitrátot nitritté redukálnak.
(vi) Glutaminsavat dekarboxileznek.
(v) Arabinózból, mannitból, laktózból vagy szorbitból savat nem termelnek.
(vi) Szalacinból és cellobizózból savat termelnek.
(vii) Egyetlen szénforrásként tartarátot nem hasznosítanak.
Ezen felül megfigyeléseink szerint ezek a törzsek az előzőekben leírt SHS-2003 törzstől a következő szempontokból különböznek: glutaminsavat dekarboxileznek; egyetlen szénforrásként laktózt, acetátot és laktátot kevéssé képesek hasznosítani; mannitból és laktózból nem termelnek savat, Iakmusz-tejen nem mutatnak aktivitást.
Mivel ezek a törzsek a „Manual”-ban meghatározott nembe tartozó semmi más ismert fajjal nem azonosak, a feltalálók úgy döntöttek, hogy ezeket Erwinia punctata néven új fajként sorolhatják be.
Ezek közül az SHS-2004 és 2006 törzsek módszertani tulajdonságai a következő pontok tekintetében közösek:
(i) Raffinózból nem termelnek savat és (ii) mannitot, acetátot vagy laktátot nem hasznosítanak.
De ez az SHS-2004 törzs az SHS-2006-tól is különbözik, mert:
(i) Glükózból acetoint termei.
(ii) Nitrogénforrásként nitrátot hasznosít.
(iii) Glicerinből savat termel.
(iv) Egyetlen szénforrásként formiátot hasznos'».
188 073
Másrészt az SHS-2005 törzs módszertani tulajdonságai abból a szempontból azonosak az SHS2006 törzsével, hogy mannitot, acetátot és laktatót egyedüli szénforrásként kevéssé képes hasznosítani, de az előbbi a következő szempontokból eltér az utóbbitól:
(i) Glicerinből savat termel.
(ii) Glükózból acetoint termel.
(iii) King B táptalajon fluoreszkáló pigmentet termel.
(iv) Raffinózból gyéren termel savat.
(v) Egyetlen szénforrásként formiátot hasznosít.
Hasonlóképpen az SHS-2007 törzs tulajdonságai annyiban azonosak az SHS-2006 törzsével, hogy egyedüli szénforrásként mannitot, acetátot és laktatót kevéssé képes hasznosítani, de az előbbi törzs az utóbbitól a következőkben különbözik:
(i) Raffinózból savat termel.
(ii) Glükózból acetoint termel.
(iii) Egyedüli szénforrásként formiátot hasznosít.
(iv) Tág hőmérséklethatárok között, például 4,0 ’C és 47,5 ‘C között növekedik.
A megfigyelések fent jelzett eredményei alapján azt találtuk, hogy az SHS-2004, 2005, 2006 és 20Q7 törzsek szintén az említett Erwinia punctata faj közé tartoznak, és mindegyik a többihez képest variánsnak tekinthető.
SHS-2008 és 2010 törzsek
Bár ezek a törzsek az egyoldalú ostorosságuk általi mozgékonyságuk miatt az Erwinia tracheiphila vagy Erwinia quercina közeli rokonainak tekinthetők, mégis a „Manual”-ban meghatározott Erwinia tracheiphila törzstől a következő pontok tekintetében nagyon eltérő módszertani tulajdonságokat mutatnak:
(i) 36 ’C-nál magasabb hőmérsékleten növekednek.
(ii) Húslé-agar táptalajon bőségesen fejlődnek.
(iii) Nyálkásan fejlődnek.
(iv) Nitrátot nitritté redukálnak.
(v) Szalicinból, xilózból, melibiózból és mannózból savat termelnek.
(vi) Egyetlen szénforrásként laktátot hasznosítanak.
Másrészt ezek a törzsek a „Manual”-ban meghatározott Erwinia quercina tulajdonságaitól a következő pontokban különböznek:
(i) Glukonsavat oxidálnak.
(ii) Nitrátot nitritté redukálnak.
(iii) Melibiózból és cellobiózból savat termelnek.
(iv) Mannitból, α-metilglükozidból, eszkulinból és szorbitból savat nem termelnek.
(v) Glükóz-pepton táptalajon gázt nem fejlesztenek.
Mivel ezek a törzsek a „Manual”-ban meghatározott, ilyen nembeli egyik ismert fajjal sem azonos tulajdonságúak, a feltalálók úgy döntöttek, hogy ezeket Erwinia terreus néven új fajként sorolják be.
Az SHS-2010 tulajdonságai lényegileg megegyeznek az SHS-2008-éival, kivéve a következő egyes megfigyelt különbségeket:
(i) Glicerinből nem termel savat.
(ii) Ribózból az SHS-2008 savat termel, viszont az SHS-2010 csak gyéren termel savat.
(iii) A metilvörös próbában gyengén pozitív.
(iv) King B táptalajon fluoreszkáló pigmentet termel.
SHS-2009 törzs
Egyoldalú ostora általi mozgékonysága miatt ezt a törzset az Erwinia tracheiphila, Erwinia quercina és Erwinia herbicola var. herbicola közeli rokonának tekinthetjük.
Azonban a „Manual”-ban meghatározott Erwinia tracheiphila módszertani tulajdonságaival öszszehasonlítva a következő jelentős különbségeket találtuk:
(i) Húslé-agar táptalajon bőségesen fejlődik.
(ii) 36 ’C-nál magasabb hőmérsékleten tenyészik.
(iii) Nyálkásan fejlődik.
(iv) Nitrátot nitritté redukál.
(v) Szalicinból, xilózból, melibiózból, cellobiózból, glicerinből és mannózból savat termel.
Ezenkívül a következő tulajdonságai miatt az Erwinia quercina törzstől is jelentősen különbözik:
(i) Glükonátot oxidál.
(ii) Nitrátot nitritté redukál.
(iii) Glükózból gyengén termel acetoint.
(iv) Xilózból, melibiózból é cellobiózból savat termel.
(v) Mannitból, α-metilglükozidból, eszkulinból, ribózból vagy szorbitból nem termel savat.
(vi) Egyetlen szénforrásként tartarátot nem hasznosít.
(vii) Glükóz-pepton táptalajon gázt nem fejleszt.
Ezenkívül jelentős különbségeket találtunk az
SHS-2010 tulajdonságaiban, amikor az Erwinia herbicola var. herbicola tulajdonságaival hasonlítottuk össze:
(i) Növekedésére nikotinsavra és nikotinamidra van szüksége.
(ii) Glükózból gyengén termel acetoint.
(iii) Zselatint nem folyósít.
(iv) Melibiózból, cellobiózból és glicerinből savat termel.
(v) Arabinózból, mannitból, maltózból, dextrinből, ramnózból, ribózból és szorbitból nem termel savat.
Dacára annak, hogy ha ezt a törzset a fent definiált SHS-2008 törzzsel összehasonlítjuk, némi különbséget találhatunk a következő pontokban:
(i) Glükózból gyengén termel acetoint és (ii) ribózból nem termel savat, mégis a többi jelentős tulajdonságokban mindkét törzs megegyezik, és ezért az SHS-2010 törzset aza Erwinia terreus variánsaként határozzuk meg.
SHS-2011 törzs
Egyoldalú ostor általi mozgékonysága miatt ezt a törzset az Erwinia tracheiphila vagy Erwinia amylovora közeli rokonának tekinthetjük.
Amikor ennek a törzsnek tulajdonságait á „Manual”-ban meghatározott Erwinia tracheiphila tulajdonságaival összehasonlítottuk, a következő jelentős különbségeket állapítottuk meg:
(i) Húslé-agar táptalajon mérsékelten fejlődik.
(ii) 36 ’C-nál magasabb hőmérsékleten tenyészik.
(iii) Nyálkásan fejlődik.
(iv) Nitrátot nitritté redukál.
(v) Szalacinból, xilózból, melibiózból, cellobiózból és mannózból savat termel.
(vi) Egyetlen szénforrásként laktátot hasznosít.
-7I
188 073
Amikor az Erwinia amylovora tulajdonságaival hasonlítottuk össze, a következő jelentős különbségeket állapítottuk meg:
(i) Ciszteinből hidrogénszulfidot fejleszt.
(ii) 36 ’C-on vagy ennél magasabb hőmérsékleten tenyészik.
(iii) Nitrátot nitritté redukál.
(ív) Zselatint nem folyósít el.
(v) Szalicinból, xilózból, melibiózból, cellobiózból és mannózból savat termel. . 0 (vi) Ribózból savat nem termel.
Másrészt, amikor ezt a törzset az SHS-2008 törzzsel hasonlítottuk össze, azt találtuk, hogy ennek tulajdonságaival megegyezik, kivéve azt a pontot, hogy ribózból vagy glicerinből nem termel sa- 5 vat; ezért az SHS-2011 törzset a fentebb definiált Erwinia terreus variánsaként azonosítjuk.
Az elkülönített mikroorganizmusokon (vad törzsek) kívül bármely ezekből kapott spontán mutánst a találmány szerinti eljárásban szintén előnyösen használni lehet, feltéve, hogy 2,5-diketo-Dglukonsavat képesek termelni, és ezért felesleges külön hangsúlyozni, hogy bármely, az ilyen izolált mikroorganizmusból mesterséges vagy induktív mutációval vagy módosítással kapott törzs, amely 25 a kívánt tulajdonságokat mutatja, a törzsek alkalmas szelídítésével a jelen találmány kivitelezésére szintén akadálytalanul felhasználható.
Az említett mikroorganizmusok fő szénforrásként D-glükózt, nitrogénforrásként folyékony ku- 30 koricalekvárt és kis mennyiségű szervetlen sót tartalmazó vizes táptalajban bőségesen fejlődnek. Aerob tenyésztés esetén nagyon nagy D-glükózkoncentrációjú közegben a 2,5-diketo-D-glukonsav (2,5-DKG) termelésére használt más ismert 35 mikroorganizmusokkal összehasonlítva, igen jó kitermeléssel, elegendő stabilitással termelik ezt a kívánt vegyületet.
A D-glükóz koncentrációja a folyékony táptalajban különleges kívánság esetén 40 súly/térfogatszá- 40 zalék is lehet, de általában a 2,5-diketo-D-glukonsav gazdaságos termelése érdekében ezt a koncentrációt 15 súly/térfogatszázalék és 25 súly/térfogatszázalék között, előnyösen körülbelül 20 súly/térfogatszázalékon célszerű tartani. 45
A fermentlé hőmérséklete 15 ’C és 35 ’C között, előnyösen 20 ’C és 30 ’C között, különösen előnyösen 28 ’C lehet. A közeg pH értéke kezdetben 5,5-7,5, előnyösen 6,0-7,0.
A folyékony táptalaj pH-értékét a fermentálás 50 folyamán előnyösen 4,0 és 5,5 között tartjuk, hogy pufferoló hatású alkalmas szervetlen sókat adunk a fermentálás megkezdésekor a folyékony táptalajhoz, vagy a fermentálás előrehaladtával folyamatosan alkalmas bázist adagolunk. A só például kalci- 55 umkarbonát és a bázis például nátriumhidroxid lehet.
A beoltott fermentlét percenként 1740 fordulattal működő keverővei állandóan keverjük, és percenként 600 ml nitrogénnel levegőztetjük. 60
A fermentálást akkor fejezzük be, amikor a D-glükóz 2,4-diketo-D-glukonsavvá való átalakulása 90% kitermelésnek felel meg; ezt a fermentálás megindítása után 17-31 óra alatt érjük el.
A keletkezett 2,5-diketo-D-glukonsavat vagy só- 65 ját a fermentléből bizonyos kezelés, például pHbeállítás után kristályos alakban különíthetjük el, vagy másképpen a fermentlét mint olyant a következő lépésben előnyösen táptalajként hasznosíthatjuk. A 2,5-diketo-D-glukonsavat tartalmazó fermentlét például közvetlenül lehet 2-keto-L-gIukonsav előállítására használni, és így a szokásos módszerrel összehasonlítva, ezt az utóbbi vegyületet egyszerű eljárással és nagy kitermeléssel lehet kinyerni.
Az előbb ismertetett fermentáláson kívül a jelen találmány úgy is kivitelezhető, hogy a mikroorganizmusok bármely kezelt termékét D-glükózt tartalmazó vivőanyaggal érintkeztetjük. Ilyen esetekben a fent leírthoz hasonló körülményeket a csíraképes sejtek tenyésztővel kapcsolatban szintén lehet a vivőanyagban levő termékek inkubálására alkalmazni, és az átalakulás az érintkeztetés kezdetekor azonnal megindul.
Az előnyös megvalósítások ismertetése
A következő példákban a találmányt részletesebben magyarázzuk.
1. példa
1. Oltóanyag táptalaj A vizes oldatban van:
D-glükóz (víztartalmú, 91%-os) kukoricalekvár káliumdihidrogénfoszfát magnéziumszulfát· •7 H2O kalciumkarbonát
1,0 súly/térfogatszázalék
5,0 súly/térfogatszázalék 0,1 súly/térfogatszázalék
0,02 súly/térfogatszázalék
0,5 súly/térfogatszázalék
Az oldat pH-ját nátriumhidroxid vizes oldatával 6,8-7,0-ra állítjuk be, és 50 ml-es részletekben 500 ml-es sterilizált Erlenmeyer lombikokba töltve, oltóanyag táptalajként használjuk.
2. -Oltóanyag tenyésztés
A lombikba töltött táptalajok mindegyikét a 3. táblázatban felsorolt törzsek egy huroknyí mennyiségével beoltjuk, és 28 ’C-on 8 óra hosszat percenként 270 lökettel (lökethossz 71 mm) rázzuk. A tenyésztést akkor fejezzük be, amikor a közeg optikai sűrűsége 8 (végpont).
3. Fermentle A vizes oldatban van:
D-glükóz kukoricalekvár káliumdihidrofoszfát kalciumkarbonát
20,0 súly/térfogatszázalék
3,0 súly/térfogatszázalék 0,1 súly/térfogatszázalék 0,3 súly/térfogatszázalék
Az oldat pH-ját 6,8-7,0-ra állítjuk be, és 455 ml-es részletekben 1 literes fermentáló edényekbe töltjük. Az így kapott fermentlé mindegyikébe 45 ml fentiek szerinti oltóanyagot adunk.
4. Fermentálás
A fermentálást a következő körülmények között hajtjuk végre:
188 073 hőmérséklet 28 ‘C; keverés percenként 1740 fordulattal; levegőztetés percenként 600 ml nitrogénnel; fermentálás időtartama 17-31 óra.
5. Meghatározás '
A terméket szűrőpapíron felfelé szálló papírkromatografiával az alábbi körülmények között határozzuk meg, és a foltokat denzitometria segítségével mennyiségileg is meghatározzuk.
(i) Vivő szűrőpapír: Toyo Roshi 50 sz.
(ii) Futtató oldószer: 75:4:25 arányú fenolhangyasav-víz elegy (iii) Foltok előhívása: A futtatás után a szűrőpapírt olyan 100 ml n-butalollal porlasztjuk be, amely vízzel van telítve, és 0,93 g anilint és 1,66 g ftálsavat tartalmaz. A kromatogramot 2 percig 105 °C-on kezeljük.
(iv) Szín és Rf érték:
Anyag Szín Rf érték
2,5-diketo-D-glukonsav barna 0,16-0,18
2-keto-D-glukonsav rózsaszínű 0,27-0,29
D-glukóz barna 0,48-0,50
Ezenkívül vékonyrétegkromatografálást is végeztünk, és erre a célra Merck-féle E jelű alumíniumlemez-cellulóz vékonyréteget és a fent leírt futtató oldószerrendszert és foltelőhívó módszert alkalmaztunk. Ebben az esetben a meghatározást úgy hajtottuk végre, hogy a vizsgált anyag kromatogramját a hiteles mintával kapott kromatogrammal hasonlítottuk össze.
6. A fermentálás befejezése
A fermentálást abban az időpontban fejezzük be, amikor a 2-keto-D-glukonsav rózsaszínű foltja a papirkromatogramon vagy vékonyrétegkromatogramon eltűnik.
7. Eredmények
3. táblázat
SHS törzsek
Oltótenyészet
Fermentáló tenyészet
Befejezéskor
Befejezéskor
2,5-diketo-Dglukonsav kon- glü-
pHH érték opti- kai sűrű- ség időtar- tam órák PH érték °pt!· időtar-cen.t.rá‘k°zr? kai . cio számi-
sűrű- ség órák súly/ térfogat % tott kiter- melés %
2003 7,0 10,0 ' 8 5,4 12,3 18 19 88
2004 6,0 8,5 8 4,9 12,0 17 19 89
2005 6,9 9,5 9 5,1 12,6 20 19 86
2006 5,9 7,5 8 4,7 12,0 21 19 89
2007 6,0 7,0 8 4,9 12,6 17 19 89
2008 5,6 3,1 10 5,3 12,4 29 17 70
2009 5,8 3,4 10 5,7 12,4 21 18 79
2010 5,4 2,5 10 5,4 12,8 31 18 75
2011 5,3 2,4 10 5,1 12,2 31 17 75
2. és 3. példák
Termelés sejtszuszpenzióval és nyers enzimkivonattal:
l. A mikroorganizmus sejtek tenyésztésére használt táptalaj:
A vizes oldat a következő anyagokat tartalmazza:
Élesztőkivonat (Daigo Eiyo Yakuhin K. K. cég 1 θ gyártmánya)
0,1 súly/térfogatszázalék káliumdihidrogénfoszfát 0,1 súly/térfogatszázalék nátriumszulfát-7 H2O 0,02 súly/térfogatszázalék kalciumkarbonát 0,6 súly/térfogatszázalék
Az oldat pH-ját 7,0-ra állítjuk be, és 80 ml-es részletekre osztva, 500 ml-es Erlenmeyer lombikokba töltjük.
2. A mikroorganizmus sejtek összegyűjtésére és a 20 nyers enzimkivonat elválasztására szolgáló tenyészetek
Ezeknek a táptalajoknak mindegyikét a 4. táblázatban felsorolt törzsek egyikével az 1. példában leírt módon beoltjuk, és 28 °C-on, 16 óra hosszat 25 percenként 270 lökettel (lökethossz 71 mm) rázzuk.
A rázás befejezése után a mikroorganizmus sejtjeit a tenyészet centrifugálásával elválasztjuk, nátriumklorid oldattal kétszer mossuk, és két részre osztjuk.
Az egyik részt nátriumklorid oldatban újra szuszpendáljuk, és így sejtszuszpenziót kapunk. A másik részt 1/50 mólos trisz-sósav pufferoldatban (pH-ja 7,5) szuszpendáljuk, a sejteket ultrahanggal kezelve roncsoljuk, és az oldhatatlan ma35 radékot centrifugálással eltávolítjuk, hogy felülúszóként sejtmentes nyers enzimkivonatot kapjunk.
3. Inkubálás sejtszuszpenzióval
5 súly/térfogatszázalék D-glükózt tartalmazó
1/10 mólos 3,3-dimetil-glutársav pufferoldatban (pH értéke 5,0) a sejt szuszpenzió koncentrációját úgy állítjuk be, hogy az optikai sűrűség 660 mp-nél 10 legyen. A keveréket 10 ml-es részletekre osztjuk fel, 23 mm átmérőjű s 196 mm magas kémcsövekbe töltjük, és 28 ’C-on, 3 óra hosszat inkubáljuk.
Ezután a keveréket tartalmazó kémcsöveket centrifugáljuk, és a kapott felülúszó folyadékot papírkromatográfia segítségével elemezzük. A kapott 50 eredményeket a 4. táblázatban foglaljuk össze. A táblázatban a keverék inkubálása előtti
D-glukóz koncentrációját szintén feltüntettük.
4. táblázat
Koncentrációk 3 órai rázás után
SHStörzsek
D-glükóz % inkubálás előtt
2-keto-D- 2,5-diketo-Dglukonsav % glukonsav %
2003 4,9 2,7 0,8 1,9
2004 5,0 1,9 0,7 1,5
2005 5,0 2,6 0,6 0,7
2006 5,0 1,9 0,9 1,1
2007 5,0 1,4 0,3 1,4
188 073
4. táblázat folytatása Koncentrációk 3 órai rázás után
SHS- ’/^kubáíás 2-keto-D- 2,5-diketo-Dtörzsek /o glukonsav % glukonsav %
2008 5,0 1,3 0,8 1,2
2009 5,2 1,9 0,7 1,3
2010 5,0 2,9 0,5 0,9
2011 5,0 2,8 0,7 0,9
4. Inkubálás nyers enzimkivonattal A 3. szakaszban leírt módon előállított keverékhez úgy adunk nyers enzimkivonatot, hogy a Folinmódszerrel mennyiségileg meghatározott protein koncentráció ml-enként 0,25 mg legyen. A keveréket az előbbiekben leírt módon rázzuk, majd 2 csepp 10 súly/térfogatszázalékos triklórecetsav oldatot adunk hozzá, hogy a proteint eltávolitsuk, majd szűrőpapíron kromatografáljuk. Az eredményeket az 5. táblázat tartalmazza.
5. táblázat
Koncentrációk 3 órai rázás után
Törzs SHS 2-keto-Dglukonsav (%) 2,5-diketo-Dglukonsav (%)
2003 1,0 1,0
2004 0,6 0,8
2005 0,4 0,4
2006 0,5 0,5
2007 0,3 0,4
2008 0,8 0,5
2009 0,4 0,6
2010 0,3 0,3
2011 0,3 0,3
A 2,5-diketo-D-glukonsavat termelő, Erwinia nembe tartozó mikroorganizmusok izolálást módszerének folyamata
Gyümölcs, zöldség vagy talaj-szuszpenzió (1-10 g/50 ml pepton-viz) i
Sorozathígítás i
Agár lemez felületén megfelelő hígításban szélesztés (A közeg) i
Inkubálás 28 ’C-on 38 vagy 72 óra hosszat ' i ,
A világos zónával körülvett telepek azonosítása a közegben kalcium-karbonátot oldva
Az azonosított telepeknek steril tűvel való kiemelése és ferde tenyészetre való átoltása (B közeg)
Inkubálás 28 ’C-on 16-24 óra hosszat i
1-3 mm széles foltok rétegezése szelekciós agar lemezekre (C közeg)
Inkubálás 28 ’C-on 48-72 óra hosszat i
Tenyészetük körül világos zónát mutató törzsek azonosítása és az azonosított törzsek ferde tenyészetéből származó törzsek sejtjeinek átoltása 8 ml D közeget tartalmazó nagy kémcsövekbe
Inkubálás 28 ’C-on 24 óra hosszat a kémcsövet rázva (199/perc, amplitúdó 2 cm) i
Termékek papírkromatográfiás analízise I
A megfelelő 2,5-diketo-D-glukonsav termelőket kiválasztjuk, majd az elsődleges ferde tenyészetről D közeget tartalmazó, frissen készített ferde tenyészetekre juttatjuk i
Inkubálás 28 ’C-on 24 óra hosszat i
Egy kacsnyi frissen készült ferde tenyészetet átoltunk nagy kémcsövekben lévő F közeget tartalmazó táptalajra i
Inkubálás 28 ’C-on 10-14 óra hosszat rázás közben (199/perc; amplitúdó: 2 cm) i
A 2,5-diketo-D-glukonsav termelők második kiválasztása 5 ml tenyészettel beoltott 50 ml fermentációs táptalajt (G közeg) tartalmazó 500 ml-es Erlenmeyer lombikban i
Inkubálás 28 ’C-on 48 óra hosszat forgó rázógépen (270/perc, amplitúdó: 7 cm) i
2,5-diketo-D-glukonsav és más termékek azonosítása papírkromatográfiával l ....
A papírkromatográfiás analízis alapján az eredményes 2,5-diketo-D-glukonsav termelők kiválasztása.
A 2,5-diketo-D-glukonsavat termelő mikroorganizmusok kiválasztásához alkalmazott táptalajok összetétele (g/liter)
Alkotórész A B C D E F G
glükóz glicerin mannit 20 5 150 100 25 10 200
élesztőkivo-
nat (Difco)
polipepton 1 2 3
(Daigo) kukoricalek- vár kálium-dihid- rogén-foszfát 1 1 15 1 10 1 50 1 30 1
kristályos magnézium- szulfát 0,2 0,2 0,5 0,5 0,2
nátrium- klorid kalcium- karbonát 7 43,5 29 1 5 63
agar 20 20 20
PH 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0
A pH-t a külön sterilizált kalcium-karbonát hozzáadása előtt állítottuk be.
-101
188 073
Analitikai módszer
A papírkromatográfiás analízist Toyo Roshi No. 50 papíron felszálló módszerrel fenol, hangyasav és víz 75:4:25 arányú elegyével végeztük. A termékeket 0,93 s/tf.% anilint és 1,66 s/tf.% ftálsavat tartalmazó, vízzel telített butanollal való permetezéssel, majd 105 ’C-on 2 percig végzett színelőhívással azonosítottuk.
Szín- és Rf-értékek
Vegyület Szín Rf-érték
2,5-diketo-D-glukonsav 2-keto-D-glukonsav glükóz barna rózsaszín barna 0,16-0,18 0,27-0,29 0,48-0,50
A termékek meghatározását kromatogramjuknak hiteles mintával való összehasonlításával végeztük.

Claims (6)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás 2,5-diketo-D-glukonsav vagy sói előállítására azzal jellemezve, hogy D-glükózt Erwinia citreus, Erwinia punctata vagy Erwinia terreus mikroorganizmussal 15-35 ’C-on és 4,0-7,5 pHértéken levegőztetés közben táptalajon vagy a mikT roorganizmusok sejtszuszpenziójával vagy az abból izolált enzimmel 2,5-diketo-D-glukonsavvá vagy sójává alakítunk, majd a kapott 2,5-diketo-Dglukonsavat vagy sóját elkülönítjük.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a táptalajhoz a D-glükózt 40 s%-nyi menynyiségben adjuk.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmust D-glükóz jelenlétében vizes táptalajon tenyésztjük.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként az Erwinia citreus ATCC 31 623 törzset használjuk.
  5. 5. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként az Erwinia punctata ATCC 31 624, 31 625, 31 626 vagy 31 627 törzset használjuk.
  6. 6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként az Erwinia terreus ATCC 31 628, 31 629, 31 630 vagy 31 631 törzset használjuk.
HU812376A 1980-08-14 1981-08-13 Process for the preparation of 2,5-diketo-d-gluconic acid HU188073B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP55112406A JPS6041596B2 (ja) 1980-08-14 1980-08-14 ２，５−ジケト−ｄ−グルコン酸の製造方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HU188073B true HU188073B (en) 1986-03-28

Family

ID=14585848

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU812376A HU188073B (en) 1980-08-14 1981-08-13 Process for the preparation of 2,5-diketo-d-gluconic acid

Country Status (17)

Country Link
US (2) US4879229A (hu)
EP (1) EP0046284B1 (hu)
JP (1) JPS6041596B2 (hu)
KR (1) KR840001257B1 (hu)
AU (1) AU546761B2 (hu)
BG (1) BG41824A3 (hu)
CA (1) CA1168999A (hu)
CS (1) CS224624B2 (hu)
DE (1) DE3167468D1 (hu)
DK (1) DK149963C (hu)
ES (1) ES8204762A1 (hu)
GB (1) GB2083028B (hu)
HU (1) HU188073B (hu)
IE (1) IE51496B1 (hu)
MX (1) MX7115E (hu)
SU (1) SU1190992A3 (hu)
YU (1) YU43032B (hu)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5234819A (en) * 1980-08-14 1993-08-10 Shiongi & Co., Ltd. Method for preparing 2,5-diketo-D-gluconic acid
JPS6041596B2 (ja) * 1980-08-14 1985-09-18 塩野義製薬株式会社 ２，５−ジケト−ｄ−グルコン酸の製造方法
US4543331A (en) * 1982-03-05 1985-09-24 Shionogi & Co., Ltd. Fermentative or enzymatic production of 2-keto-L-gulonic acid
JPS58162298A (ja) * 1982-03-05 1983-09-26 Shionogi & Co Ltd ２−ケト−ｌ−グロン酸の製造方法
IL72225A (en) * 1983-06-28 1990-08-31 Genentech Inc 2,5-diketogluconic acid reductase,its preparation and use in converting 2,5-diketogluconic acid into 2-keto-l-gluconic acid
US4757012A (en) * 1983-06-28 1988-07-12 Genentech, Inc. Ascorbic acid intermediates and process enzymes
US5004690A (en) * 1983-06-28 1991-04-02 Genetech, Inc. Ascorbic acid intermediates and process enzymes
US4758514A (en) * 1983-06-28 1988-07-19 Genentech, Inc. Ascorbic acid intermediates and process enzymes
US5008193A (en) * 1984-06-14 1991-04-16 Genentech, Inc. Ascorbic acid intermediates and process enzymes
GB8519536D0 (en) * 1985-08-02 1985-09-11 Biogen Nv Vitamin c precursor
US4933289A (en) * 1986-06-05 1990-06-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Biologically pure cultures of Pseudomonas sorbosoxidans useful for producing 2-keto-L-gulonic acid
JP2834871B2 (ja) * 1990-08-07 1998-12-14 塩水港精糖株式会社 フラクトース含有オリゴ糖の製造法
US5376544A (en) * 1992-09-08 1994-12-27 Rutgers The State University Of New Jersey Enzymes for the production of 2-keto-L-gulonic acid
US5795761A (en) * 1996-01-11 1998-08-18 Rutgers, The State University Of New Jersey Mutants of 2,5-diketo-D-gluconic acid (2,5-DKG) reductase A
US6599722B2 (en) * 1998-12-22 2003-07-29 Genencor International, Inc. Method for producing ascorbic acid intermediates
US7256027B1 (en) 1999-06-15 2007-08-14 Rutgers, The State University Of New Jersey Enzymes for the production of 2-keto-L-gulonic acid
WO2003071879A1 (en) * 2002-02-22 2003-09-04 Genencor International, Inc. Browning agent
US6727277B1 (en) 2002-11-12 2004-04-27 Kansas State University Research Foundation Compounds affecting cholesterol absorption
US8327005B2 (en) 2011-02-24 2012-12-04 Jibe Mobile Method to set up application to application communication over a network between applications running on endpoint devices

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5021559B2 (hu) * 1973-03-22 1975-07-23
JPS5135486A (en) * 1974-09-20 1976-03-25 Shionogi Seiyaku Kk 22 keto ll guronsan no seizohoho
JPS5135487A (en) * 1974-09-20 1976-03-25 Shionogi Seiyaku Kk 22 keto ll guronsan no seizohoho
JPS5135485A (en) * 1974-09-20 1976-03-25 Shionogi Seiyaku Kk 22 keto ll guronsan no seizohoho
US4316960A (en) * 1979-09-28 1982-02-23 Pfizer Inc. Preparation of 2,5-diketogluconic acid
JPS6041596B2 (ja) * 1980-08-14 1985-09-18 塩野義製薬株式会社 ２，５−ジケト−ｄ−グルコン酸の製造方法
US4543331A (en) * 1982-03-05 1985-09-24 Shionogi & Co., Ltd. Fermentative or enzymatic production of 2-keto-L-gulonic acid

Also Published As

Publication number Publication date
DE3167468D1 (en) 1985-01-10
EP0046284B1 (en) 1984-11-28
CA1168999A (en) 1984-06-12
EP0046284A3 (en) 1982-04-21
BG41824A3 (en) 1987-08-14
US4879229A (en) 1989-11-07
CS224624B2 (en) 1984-01-16
AU7420481A (en) 1982-02-18
KR840001257B1 (ko) 1984-09-01
ES504732A0 (es) 1982-05-16
JPS6041596B2 (ja) 1985-09-18
DK149963B (da) 1986-11-03
KR830006428A (ko) 1983-09-24
SU1190992A3 (ru) 1985-11-07
ES8204762A1 (es) 1982-05-16
GB2083028A (en) 1982-03-17
IE51496B1 (en) 1987-01-07
US5134077A (en) 1992-07-28
JPS5736991A (en) 1982-02-27
YU198281A (en) 1983-12-31
AU546761B2 (en) 1985-09-19
GB2083028B (en) 1984-09-19
IE811847L (en) 1982-02-14
DK361281A (da) 1982-02-15
YU43032B (en) 1989-02-28
EP0046284A2 (en) 1982-02-24
DK149963C (da) 1987-05-04
MX7115E (es) 1987-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bahl et al. Nutritional factors affecting the ratio of solvents produced by Clostridium acetobutylicum
HU188073B (en) Process for the preparation of 2,5-diketo-d-gluconic acid
US5554532A (en) Bacteria useful for production of optically active 3-phenyl-1,3-propanediol
HU201804B (en) Process for producing 2-keto-l-gulon acid in microbiological way
US3998697A (en) Process for preparing 2-keto-L-gulonic acid
JPH02150287A (ja) 発酵方法
US3959076A (en) Process for producing 2-keto-L-gulonic acid
KR900009050B1 (ko) 2-케토-l-굴론산의 제조방법
US3963574A (en) Process for producing 2-keto-L-gulonic acid
DE3307095A1 (de) Mikrobiologisch hergestellte l-phenylalanin-dehydrogenase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung
Yoshida et al. Isolation and identification of a pyrogallol producing bacterium from soil
US4933289A (en) Biologically pure cultures of Pseudomonas sorbosoxidans useful for producing 2-keto-L-gulonic acid
Singh et al. Isolation and characterization of a potent fungal strain Aspergillus niger ORS-4 for gluconic acid production
Rode et al. Adaptation of Rhodopseudomonas sphaeroides to Growth on d-(—)-Tartrate and Large-Scale Production of a Constitutive d-(—)-Tartrate Dehydratase During Growth on dl-Malate
IL95692A (en) 5-Decanolide and 5-Dodecanolide are natural and a process for their production
DK172133B1 (da) Fremgangsmåde til fremstilling af L-sorbose
CH651316A5 (de) Verfahren zur mikrobiologischen umwandlung von c(3)-c(6)-n-alkanen oder c(3)-c(6)-sec.-alkoholen in c(3)-c(6)-sek.-alkohole oder entsprechende methylketone.
Kanamaru et al. Isolation and characterization of a Hyphomicrobium species and its polysaccharide formation from methanol
US3994781A (en) Process for the production of protein
US5496715A (en) Process for preparing indigo
US5234819A (en) Method for preparing 2,5-diketo-D-gluconic acid
US6727088B2 (en) Process for preparation of (R)-1, 2-propanediol by microbes
EP0089640B1 (de) L(+)-Tartrat-Dehydrogenase, Verfahren zu deren Herstellung sowie Verfahren und Reagens zur Bestimmung von L(+)-Tartrat und D(+)-Malat
US5962286A (en) Process for the production of gluconic acid with a strain of Aureobasidium pullulans (de bary) Arnaud
SUZUKI et al. Microbiological studies of phytopathogenic bacteria part II. Comparative studies of oxidative fermentation by various species of the genus Erwinia

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628