JPH07203982A - Ｄ−リボースの製造法 - Google Patents
Ｄ−リボースの製造法Info
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- JPH07203982A JPH07203982A JP18720891A JP18720891A JPH07203982A JP H07203982 A JPH07203982 A JP H07203982A JP 18720891 A JP18720891 A JP 18720891A JP 18720891 A JP18720891 A JP 18720891A JP H07203982 A JPH07203982 A JP H07203982A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 Ｄ−リボースの発酵法による製造法を提供す
る。 【構成】 トランスケトラーゼを欠損し、高いＤ−リボ
ース耐性および高いＤ−グルコノキナーゼ活性を有する
バチルス属に属する微生物の培養により、Ｄ−グルコー
スからＤ−リボースを製造する。
る。 【構成】 トランスケトラーゼを欠損し、高いＤ−リボ
ース耐性および高いＤ−グルコノキナーゼ活性を有する
バチルス属に属する微生物の培養により、Ｄ−グルコー
スからＤ−リボースを製造する。
Description
【０００１】本発明は、発酵によってＤ−グルコースか
らＤ−リボースを産生する方法に関する。
らＤ−リボースを産生する方法に関する。
【０００２】Ｄ−リボースは、ビタミンＢ2 産生に関し
て極めて重要な物質であり、従ってＤ−リボース産生の
ためのより安価で、より効率的な工業的方法の開発が強
く望まれている。
て極めて重要な物質であり、従ってＤ−リボース産生の
ためのより安価で、より効率的な工業的方法の開発が強
く望まれている。
【０００３】Ｄ−リボースの産生のための多くの発酵法
が知られている。しかし、既知の発酵法は、収率の点で
Ｄ−リボース産生のための工業的方法として十分満足し
うるものではない。
が知られている。しかし、既知の発酵法は、収率の点で
Ｄ−リボース産生のための工業的方法として十分満足し
うるものではない。
【０００４】本発明によればより高い収率でＤ−リボー
スを産生することが可能である。本発明の発明者らは、
トランスケトラーゼを欠損し、高いＤ−リボース耐性お
よび高いＤ−グルコノキナーゼ活性を有するバチルス属
のバクテリアの変異株が著しく高いＤ−リボース蓄積能
を有することを発見した。本発明は、この発見に基いて
完成されたものである。
スを産生することが可能である。本発明の発明者らは、
トランスケトラーゼを欠損し、高いＤ−リボース耐性お
よび高いＤ−グルコノキナーゼ活性を有するバチルス属
のバクテリアの変異株が著しく高いＤ−リボース蓄積能
を有することを発見した。本発明は、この発見に基いて
完成されたものである。
【０００５】本発明は、トランスケトラーゼを欠損し、
高いＤ−リボース耐性および高いＤ−グルコノキナーゼ
活性を有し、Ｄ−グルコースからＤ−リボースを産生す
る能力を有するバチルス属に属する微生物をＤ−グルコ
ースの存在下にて培地中で培養し、得られたＤ−リボー
スを培養液から回収することを特徴とするＤ−リボース
の製造法に関するものである。
高いＤ−リボース耐性および高いＤ−グルコノキナーゼ
活性を有し、Ｄ−グルコースからＤ−リボースを産生す
る能力を有するバチルス属に属する微生物をＤ−グルコ
ースの存在下にて培地中で培養し、得られたＤ−リボー
スを培養液から回収することを特徴とするＤ−リボース
の製造法に関するものである。
【０００６】本明細書において、トランスケトラーゼの
欠損は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２３， １００９（１９５
６）、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ７４巻、３０６
ページ（１９５８）及び同７４巻、３１５ページ（１９
５８）、に記載してある方法にもとづいた。たとえば、
以下の方法によってニコチンアミド アデニン ジヌク
レオチドの還元形（ＮＡＤＨ）の酸化量を３４０nmにお
いて分光光度計（コントロンＫ．Ｋ．）で測定を行な
い、酵素活性を後に記載するような方法（実施例４参
照）で調製した無細胞抽出液に対して計算を行ない、そ
の値が０．０１単位／mg−タンパクを越えないというこ
とを意味する。
欠損は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２３， １００９（１９５
６）、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ７４巻、３０６
ページ（１９５８）及び同７４巻、３１５ページ（１９
５８）、に記載してある方法にもとづいた。たとえば、
以下の方法によってニコチンアミド アデニン ジヌク
レオチドの還元形（ＮＡＤＨ）の酸化量を３４０nmにお
いて分光光度計（コントロンＫ．Ｋ．）で測定を行な
い、酵素活性を後に記載するような方法（実施例４参
照）で調製した無細胞抽出液に対して計算を行ない、そ
の値が０．０１単位／mg−タンパクを越えないというこ
とを意味する。
【０００７】＜トランスケトラーゼ活性の分析方法＞ 1. 反応液Ａ（０．５５５ml）：Ｄ−リボース−５−フ
ォスフェート２０μモル、ＮＡＤＨ ０．３７５μモ
ル、Ｄ−リボース−５−ホスフェートケトール−イソメ
ラーゼ及びＤ−リブロース−５−ホスフェート−３−エ
ピメラーゼを各々０．５単位、アルファーグリセリンリ
ン酸デヒドロゲナーゼ（酵素コード１．１．１．８．）
０．３３単位、十分なトリオースホスフェートイソメラ
ーゼ（酵素コード５．３．１．１．）（Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）及びトリス−塩酸
緩衝液６０μモル（pH７．５）。
ォスフェート２０μモル、ＮＡＤＨ ０．３７５μモ
ル、Ｄ−リボース−５−ホスフェートケトール−イソメ
ラーゼ及びＤ−リブロース−５−ホスフェート−３−エ
ピメラーゼを各々０．５単位、アルファーグリセリンリ
ン酸デヒドロゲナーゼ（酵素コード１．１．１．８．）
０．３３単位、十分なトリオースホスフェートイソメラ
ーゼ（酵素コード５．３．１．１．）（Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）及びトリス−塩酸
緩衝液６０μモル（pH７．５）。
【０００８】2. 反応液Ｂ（０．４２５ml）：ＭｇＣｌ
2 １０μモル、チアミンピロリン酸０．２１５μモル
及びトリス塩酸緩衝液（pH７．５）４０μモル。
2 １０μモル、チアミンピロリン酸０．２１５μモル
及びトリス塩酸緩衝液（pH７．５）４０μモル。
【０００９】各反応液を３０℃、１０分間インキュベー
トし、反応液を混合した（総量は、１ml）。３４０nmに
おける吸光度の変化を分光光度計モデルＵＶＩＫＯＮ
８１０（コントロンＫ．Ｋ．）で測定し、ＮＡＤＨの酸
化率が直線になった後、前記の無細胞抽出液２０μｌを
反応液に加えた。ＮＡＤＨの酸化率が直線になった後、
３４０nmにおける吸光度の変化をそのプロットから計算
した。酵素活性の１単位は１分間あたりのＮＡＤＨ １
μモルの酸化を触媒する酵素の量として定義した。
トし、反応液を混合した（総量は、１ml）。３４０nmに
おける吸光度の変化を分光光度計モデルＵＶＩＫＯＮ
８１０（コントロンＫ．Ｋ．）で測定し、ＮＡＤＨの酸
化率が直線になった後、前記の無細胞抽出液２０μｌを
反応液に加えた。ＮＡＤＨの酸化率が直線になった後、
３４０nmにおける吸光度の変化をそのプロットから計算
した。酵素活性の１単位は１分間あたりのＮＡＤＨ １
μモルの酸化を触媒する酵素の量として定義した。
【００１０】本明細書において、高いグルコノキナーゼ
活性は、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．
７９８， ８８−９５（１９８４）に記載されている方
法にもとづいた、たとえば以下の方法によってニコチン
アミド アデニン ジヌクレオチドリン酸（以後ＮＡＤ
Ｐと言う）の酸化型の還元量を測定し、酵素活性は、上
記の無細胞抽出液で計算を行ない、その値は０．０１単
位／mg−タンパクより少なくないことを示す。
活性は、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．
７９８， ８８−９５（１９８４）に記載されている方
法にもとづいた、たとえば以下の方法によってニコチン
アミド アデニン ジヌクレオチドリン酸（以後ＮＡＤ
Ｐと言う）の酸化型の還元量を測定し、酵素活性は、上
記の無細胞抽出液で計算を行ない、その値は０．０１単
位／mg−タンパクより少なくないことを示す。
【００１１】＜グルコノキナーゼ活性の分析方法＞反応
混合物（０．５ml）は、トリス−塩酸緩衝液（pH８．
０）１００μモル、ＭｇＣｌ2 ６．６μモル、アデノ
シン 三リン酸３．２μモル、ＮＡＤＰ ０．４μモ
ル、グルコン酸ナトリウム１．０μモル、無細胞抽出液
２０μｌ及び基準６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナー
ゼ（酵素コード１．１．１．４４，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｅｄ．）０．００５単位を含
む。反応を、基質の添加によって開始させる。３４０nm
における吸光度の変化を室温下、分光光度計モデルＵＶ
ＩＫＯＮ ８１０を用いて測定した。酵素活性の１単位
は、１分あたりに、ＮＡＤＰ １μモルの還元を触媒す
る酵素の量として定義した。
混合物（０．５ml）は、トリス−塩酸緩衝液（pH８．
０）１００μモル、ＭｇＣｌ2 ６．６μモル、アデノ
シン 三リン酸３．２μモル、ＮＡＤＰ ０．４μモ
ル、グルコン酸ナトリウム１．０μモル、無細胞抽出液
２０μｌ及び基準６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナー
ゼ（酵素コード１．１．１．４４，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｅｄ．）０．００５単位を含
む。反応を、基質の添加によって開始させる。３４０nm
における吸光度の変化を室温下、分光光度計モデルＵＶ
ＩＫＯＮ ８１０を用いて測定した。酵素活性の１単位
は、１分あたりに、ＮＡＤＰ １μモルの還元を触媒す
る酵素の量として定義した。
【００１２】本明細書において、前記無細胞抽出液中で
のグルコースデヒドロゲナーゼ活性は、Ａｇｒｉｃ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４３， ２７１−２７８（１９７
９）に記載の方法に従って測定した。ＮＡＤＰの還元量
は、３４０nmにおいて分光光度計モデルＵＶＩＫＯＮ
８１０を用いて測定した。
のグルコースデヒドロゲナーゼ活性は、Ａｇｒｉｃ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４３， ２７１−２７８（１９７
９）に記載の方法に従って測定した。ＮＡＤＰの還元量
は、３４０nmにおいて分光光度計モデルＵＶＩＫＯＮ
８１０を用いて測定した。
【００１３】＜グルコースデヒドロゲナーゼの分析方法
＞分析混合物（０．５ml）は、Ｄ−グルコース ５０μ
モル、ＮＡＤＰ ２μモル、トリス−塩酸緩衝液（pH
８．０）０．３ｍモル、ＭｎＳＯ4 ５ｎモルおよび無
細胞抽出液２０μｌを含む。反応を基質の添加によって
開始させた。酵素活性の１単位は、１分あたりにＮＡＤ
Ｐ １μモルの還元を触媒する酵素の量として定義し
た。
＞分析混合物（０．５ml）は、Ｄ−グルコース ５０μ
モル、ＮＡＤＰ ２μモル、トリス−塩酸緩衝液（pH
８．０）０．３ｍモル、ＭｎＳＯ4 ５ｎモルおよび無
細胞抽出液２０μｌを含む。反応を基質の添加によって
開始させた。酵素活性の１単位は、１分あたりにＮＡＤ
Ｐ １μモルの還元を触媒する酵素の量として定義し
た。
【００１４】本明細書において高いＤ−リボース耐性
は、トランスケトラーゼを欠損しているバチルス属のバ
クテリアの変異株を接種し、下記の様な培地中で、３
６．５℃、２８０rpm.でインキュベートした時、それら
はＤ−リボース 70 ｇ／ｌ以上の存在下で良好な発育を
示すことを意味する（590 nmでの光学密度（ＯＤ）は約
５．０より高い）。 Ｄ−グルコース １０．０％ Ｄ−ソルビトール ０．２ Ｄ−リボース ７．０ または ９．０ モラテイン（Ｍｏｌａｔｅｉｎ） ０．０７ コーンスティープリカー ０．５ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ０．５５ （ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 ０．２ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０１ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．０３ Ｌ−フェニルアラニン ０．０００２５ Ｌ−トリプトファン ０．０００２５ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０００３２ ＭｎＳＯ4 ４・６Ｈ2 Ｏ ０．０００１９ ＣａＣＯ3 ４．０
は、トランスケトラーゼを欠損しているバチルス属のバ
クテリアの変異株を接種し、下記の様な培地中で、３
６．５℃、２８０rpm.でインキュベートした時、それら
はＤ−リボース 70 ｇ／ｌ以上の存在下で良好な発育を
示すことを意味する（590 nmでの光学密度（ＯＤ）は約
５．０より高い）。 Ｄ−グルコース １０．０％ Ｄ−ソルビトール ０．２ Ｄ−リボース ７．０ または ９．０ モラテイン（Ｍｏｌａｔｅｉｎ） ０．０７ コーンスティープリカー ０．５ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ０．５５ （ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 ０．２ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０１ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．０３ Ｌ−フェニルアラニン ０．０００２５ Ｌ−トリプトファン ０．０００２５ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０００３２ ＭｎＳＯ4 ４・６Ｈ2 Ｏ ０．０００１９ ＣａＣＯ3 ４．０
【００１５】本発明で用いる微生物は、トランスケトラ
ーゼを欠損し、高いＤ−リボース耐性及び高いグルコノ
キナーゼ活性を有するバチルス属に属する全ての菌株が
含まれる。その様な菌株は、親株を紫外線、Ｘ−線、ガ
ンマー線などで照射するかまたは親株をＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ニトロジェン
マスタード、エチルメタンスルホン酸などの化学的変異
誘発物質の作用にさらすことによって、バチルス ブレ
ビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス
セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチル
ス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌ
ａｎｓ）、バチルス コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃｏｕｇｕｌａｎｓ）、バチルス リケニホルミス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、
バチルス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）、バチルス メセントリクス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｍｅｓｅｎｔｒｉｃｕｓ）、バチルス プミ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス
サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
などのバチルス属に属する微生物から誘導することがで
きる。
ーゼを欠損し、高いＤ−リボース耐性及び高いグルコノ
キナーゼ活性を有するバチルス属に属する全ての菌株が
含まれる。その様な菌株は、親株を紫外線、Ｘ−線、ガ
ンマー線などで照射するかまたは親株をＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ニトロジェン
マスタード、エチルメタンスルホン酸などの化学的変異
誘発物質の作用にさらすことによって、バチルス ブレ
ビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス
セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチル
ス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌ
ａｎｓ）、バチルス コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃｏｕｇｕｌａｎｓ）、バチルス リケニホルミス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、
バチルス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）、バチルス メセントリクス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｍｅｓｅｎｔｒｉｃｕｓ）、バチルス プミ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス
サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
などのバチルス属に属する微生物から誘導することがで
きる。
【００１６】本発明において最も好ましく用いられる変
異株の例としてはバチルス プミルスＲＣ１５，ＲＥ５
及びＲＸ１３などが挙げられる。これらの微生物は各々
以下の寄託番号で日本工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。 バチルス プミルス ＲＣ１５ FERM-BP No. 2834（１
９９０年３月２９日） バチルス プミルス ＲＥ５ FERM-BP No. 2833（１
９９０年３月２９日） バチルス プミルス ＲＸ１３ FERM-BP No. 2835（１
９９０年３月２９日）
異株の例としてはバチルス プミルスＲＣ１５，ＲＥ５
及びＲＸ１３などが挙げられる。これらの微生物は各々
以下の寄託番号で日本工業技術院微生物工業技術研究所
に寄託されている。 バチルス プミルス ＲＣ１５ FERM-BP No. 2834（１
９９０年３月２９日） バチルス プミルス ＲＥ５ FERM-BP No. 2833（１
９９０年３月２９日） バチルス プミルス ＲＸ１３ FERM-BP No. 2835（１
９９０年３月２９日）
【００１７】これらの変異株は、高いＤ−リボース耐性
を有する。例えば、これらの変異株は、７０ｇ／ｌ以
上、好ましくは１２０ｇ／ｌ以上の濃度のＤ−リボース
を含む培地中で成長しうる能力を有している。
を有する。例えば、これらの変異株は、７０ｇ／ｌ以
上、好ましくは１２０ｇ／ｌ以上の濃度のＤ−リボース
を含む培地中で成長しうる能力を有している。
【００１８】本発明の好ましい実施態様として、Ｄ−リ
ボース産生は、Ｄ−グルコースを含み適当な栄養物が補
われている水性培地中、好気的条件下、上記微生物を培
養することによって行なわれる。前記培地は、約５０ｇ
／ｌないし３００ｇ／ｌ、好ましくは約１００ｇ／ｌな
いし２５０ｇ／ｌの濃度のＤ−グルコースを含むことが
できる。
ボース産生は、Ｄ−グルコースを含み適当な栄養物が補
われている水性培地中、好気的条件下、上記微生物を培
養することによって行なわれる。前記培地は、約５０ｇ
／ｌないし３００ｇ／ｌ、好ましくは約１００ｇ／ｌな
いし２５０ｇ／ｌの濃度のＤ−グルコースを含むことが
できる。
【００１９】培地は、以下の様な栄養物を含むことが通
常必要である；Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ
−マンノース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、
ショ糖、糖みつ、澱粉水解物、澱粉、酢酸及びエタノー
ルなどの同化可能な炭素源；ペプトン、酵母抽出物、大
豆粉、コーンスティープリカー、綿実かす、乾燥酵母及
び肉抽出物などの有機物及び硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸カリウム及びリ
ン酸カリウムなどの無機物などの消化可能な窒素源；ビ
タミン、金属、アミノ酸及び微量元素。
常必要である；Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ
−マンノース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、
ショ糖、糖みつ、澱粉水解物、澱粉、酢酸及びエタノー
ルなどの同化可能な炭素源；ペプトン、酵母抽出物、大
豆粉、コーンスティープリカー、綿実かす、乾燥酵母及
び肉抽出物などの有機物及び硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸カリウム及びリ
ン酸カリウムなどの無機物などの消化可能な窒素源；ビ
タミン、金属、アミノ酸及び微量元素。
【００２０】培養は、pH約４．０ないし９．０、好まし
くは４．５ないし８．０で行われる。培養時間は、使用
される微生物及び栄養培地によって種々異なるが、好ま
しくは約１０ないし１００時間である。培養を行なうに
あたっての好ましい温度範囲は約２０ないし４５℃であ
り、更に好ましくは２５ないし４０℃である。
くは４．５ないし８．０で行われる。培養時間は、使用
される微生物及び栄養培地によって種々異なるが、好ま
しくは約１０ないし１００時間である。培養を行なうに
あたっての好ましい温度範囲は約２０ないし４５℃であ
り、更に好ましくは２５ないし４０℃である。
【００２１】かくして蓄積されたＤ−リボースは例えば
以下の方法によって容易に回収することができる。すな
わち培養液を最初にろ過又は遠心分離し、それによって
細胞は極めて簡単に除去しうる。次に、ろ液を活性炭及
びイオン交換樹脂で処理することによって脱塩、脱色し
た後、濃縮する。濃縮液にエタノールなどの有機溶媒を
加え、Ｄ−リボース結晶が分離される。上記方法であろ
うと他の方法であろうと、Ｄ−リボースは容易に回収さ
れうる。
以下の方法によって容易に回収することができる。すな
わち培養液を最初にろ過又は遠心分離し、それによって
細胞は極めて簡単に除去しうる。次に、ろ液を活性炭及
びイオン交換樹脂で処理することによって脱塩、脱色し
た後、濃縮する。濃縮液にエタノールなどの有機溶媒を
加え、Ｄ−リボース結晶が分離される。上記方法であろ
うと他の方法であろうと、Ｄ−リボースは容易に回収さ
れうる。
【００２２】以下の実施例は本発明をさらに説明する一
例であるが本発明は決してこれだけに限定されるもので
はない。
例であるが本発明は決してこれだけに限定されるもので
はない。
【００２３】変異株ＲＡ８の調製 寒天培地上で生育するバチルス プミルス ＡＴＣＣ
３１０９３の一白金耳を、下記に示す成分の種培養用培
地１００mlに接種した。 Ｄ−ソルビトール ２％ コーンスティープリカー ２％ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．３％ Ｌ−フェニルアラニン ０．００２５％ Ｌ−トリプトファン ０．００２５％ （滅菌前 pH６．７）
３１０９３の一白金耳を、下記に示す成分の種培養用培
地１００mlに接種した。 Ｄ−ソルビトール ２％ コーンスティープリカー ２％ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．３％ Ｌ−フェニルアラニン ０．００２５％ Ｌ−トリプトファン ０．００２５％ （滅菌前 pH６．７）
【００２４】フラスコを３０℃で、１８時間インキュベ
ートした。細胞を遠心分離で採取し、５０mMリン酸緩衝
液（pH８．０）５０mlに懸濁した。細胞懸濁液の一部
（３ml）に、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン（ＭＮＮＧ）１００μｇ／ml（最終濃度）を
加え、３０℃で３０分間、処理した。処理細胞を遠心分
離で採取し、滅菌水で１回洗浄し、種用培地５mlに再懸
濁し、更に３０℃で２時間インキュベートした。この様
にして調製した培養液を滅菌水で適当に希釈し、下記に
示すような寒天培地に塗布した。 Ｄ−ソルビトール ０．５％ バクト ペプトン（Ｄｉｆｃｏ） １％ 酵母抽出物（オリエンタル酵母） ０．２％ ＮａＣｌ ０．２％ 寒天 １．５％ （pH７．０） プレートを３６．５℃で２日間インキュベートした。プ
レート上で成育したコロニーを、新鮮寒天プレート上で
継代培養し、更に下記に示した様な試験管培養のための
細胞を十分量得るために３６．５℃で、２４時間インキ
ュベートした。
ートした。細胞を遠心分離で採取し、５０mMリン酸緩衝
液（pH８．０）５０mlに懸濁した。細胞懸濁液の一部
（３ml）に、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン（ＭＮＮＧ）１００μｇ／ml（最終濃度）を
加え、３０℃で３０分間、処理した。処理細胞を遠心分
離で採取し、滅菌水で１回洗浄し、種用培地５mlに再懸
濁し、更に３０℃で２時間インキュベートした。この様
にして調製した培養液を滅菌水で適当に希釈し、下記に
示すような寒天培地に塗布した。 Ｄ−ソルビトール ０．５％ バクト ペプトン（Ｄｉｆｃｏ） １％ 酵母抽出物（オリエンタル酵母） ０．２％ ＮａＣｌ ０．２％ 寒天 １．５％ （pH７．０） プレートを３６．５℃で２日間インキュベートした。プ
レート上で成育したコロニーを、新鮮寒天プレート上で
継代培養し、更に下記に示した様な試験管培養のための
細胞を十分量得るために３６．５℃で、２４時間インキ
ュベートした。
【００２５】このように調製した寒天培養の各々を以下
に示す産生培地５mlに接種するのに用いた。 Ｄ−グルコース １４．５％ モラティン（乾燥酵母） ０．０７％ （鐘淵化学） Ｄ−ソルビトール ０．２％ コーンスティープリカー ０．５％ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ０．５５％ （ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 ０．２％ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０１％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．０３％ Ｌ−フェニルアラニン ０．０００２５％ Ｌ−トリプトファン ０．０００２５％ ＦｅＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ ０．０００３２％ ＭｎＳＯ4 ４ ６Ｈ2 Ｏ ０．０００１９％ ＣａＣＯ3 ４％
に示す産生培地５mlに接種するのに用いた。 Ｄ−グルコース １４．５％ モラティン（乾燥酵母） ０．０７％ （鐘淵化学） Ｄ−ソルビトール ０．２％ コーンスティープリカー ０．５％ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ０．５５％ （ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 ０．２％ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．０１％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．０３％ Ｌ−フェニルアラニン ０．０００２５％ Ｌ−トリプトファン ０．０００２５％ ＦｅＳＯ4 ７Ｈ2 Ｏ ０．０００３２％ ＭｎＳＯ4 ４ ６Ｈ2 Ｏ ０．０００１９％ ＣａＣＯ3 ４％
【００２６】試験管を３６．５℃で５日間、インキュベ
ートした。次に培養液の上清を遠心分離で得、薄層クロ
マトグラフィーでＤ−リボース生産レベルの分析を行っ
た。上清１μｌをシリカゲルプレート（Ｋｉｅｓｅｌｇ
ｅｌ ６０ Ｆ254 ，Ｍｅｒｃｋ）上にスポットし、ア
セトン、ｎ−ブタノール及び水（５：４：１）から成る
溶媒系で展開した。次にシリカゲルプレートに、ナフト
レゾルシノール−Ｈ2 ＳＯ4 試薬をふきつけ、１００℃
で２〜３分間加熱し、リボースのスポットを視覚化させ
た。培養された変異株の中からその親株よりも優れたＤ
−リボース高生産株としてＲＡ８を選択した。
ートした。次に培養液の上清を遠心分離で得、薄層クロ
マトグラフィーでＤ−リボース生産レベルの分析を行っ
た。上清１μｌをシリカゲルプレート（Ｋｉｅｓｅｌｇ
ｅｌ ６０ Ｆ254 ，Ｍｅｒｃｋ）上にスポットし、ア
セトン、ｎ−ブタノール及び水（５：４：１）から成る
溶媒系で展開した。次にシリカゲルプレートに、ナフト
レゾルシノール−Ｈ2 ＳＯ4 試薬をふきつけ、１００℃
で２〜３分間加熱し、リボースのスポットを視覚化させ
た。培養された変異株の中からその親株よりも優れたＤ
−リボース高生産株としてＲＡ８を選択した。
【００２７】変異株ＲＣ１５の調製 変異株ＲＡ８の調製法に記載したものと同様な方法でＲ
Ａ８株を、ＭＮＮＧ（１００μｇ／ml最終濃度）及び２
−メトキシ−６−クロロ−９−〔３−（エチル−２−ク
ロロエチル）アミノプロピルアミノ〕−アクリジン−ジ
ヒドロクロライド（１０μｇ／ml最終濃度）の混合液で
処理した。処理細胞を、Ｄ−ソルビトール（０．５
％）；バクト ペプトン（１％）（Ｄｉｆｃｏ）；酵母
抽出物（０．２％）（オリエンタル酵母）、ＮａＣｌ
（０．２％）及びＤ−リボース７０ｇ／ｌを含む培地に
接種し、３６．５℃で１日、インキュベートした。培養
液の一部をＤ−リボース９０ｇ／ｌが補なわれているが
上記と同じ新鮮培地に移し、３６．５℃で、２日間イン
キュベートした。得られた培養液を滅菌水で適当に希釈
し、Ｄ−リボース９０ｇ／ｌを補った寒天培地に塗り、
３６．５℃で２日間インキュベートした。その結果とし
て、多くのＤ−リボース耐性株が得られた。これらの変
異株のＤ−リボース産生能を、変異株ＲＡ８の調製に記
載したのと同様な方法で評価し、変異株ＲＣ１５をＤ−
リボース−高−生産株として選択した。
Ａ８株を、ＭＮＮＧ（１００μｇ／ml最終濃度）及び２
−メトキシ−６−クロロ−９−〔３−（エチル−２−ク
ロロエチル）アミノプロピルアミノ〕−アクリジン−ジ
ヒドロクロライド（１０μｇ／ml最終濃度）の混合液で
処理した。処理細胞を、Ｄ−ソルビトール（０．５
％）；バクト ペプトン（１％）（Ｄｉｆｃｏ）；酵母
抽出物（０．２％）（オリエンタル酵母）、ＮａＣｌ
（０．２％）及びＤ−リボース７０ｇ／ｌを含む培地に
接種し、３６．５℃で１日、インキュベートした。培養
液の一部をＤ−リボース９０ｇ／ｌが補なわれているが
上記と同じ新鮮培地に移し、３６．５℃で、２日間イン
キュベートした。得られた培養液を滅菌水で適当に希釈
し、Ｄ−リボース９０ｇ／ｌを補った寒天培地に塗り、
３６．５℃で２日間インキュベートした。その結果とし
て、多くのＤ−リボース耐性株が得られた。これらの変
異株のＤ−リボース産生能を、変異株ＲＡ８の調製に記
載したのと同様な方法で評価し、変異株ＲＣ１５をＤ−
リボース−高−生産株として選択した。
【００２８】変異株ＲＥ５の調製 変異株ＲＣ１５の調製に記載したのと同様な方法で、Ｒ
Ｃ１５株を、ＭＮＮＧ１００μｇ／ml（最終濃度）で処
理し、処理細胞を、Ｄ−リボース７０ｇ／ｌが補われた
寒天培地に塗った。Ｄ−リボース耐性変異株の中から、
変異株ＲＥ５を、その親株より優れているＤ−リボース
−高−生産株として選択した。
Ｃ１５株を、ＭＮＮＧ１００μｇ／ml（最終濃度）で処
理し、処理細胞を、Ｄ−リボース７０ｇ／ｌが補われた
寒天培地に塗った。Ｄ−リボース耐性変異株の中から、
変異株ＲＥ５を、その親株より優れているＤ−リボース
−高−生産株として選択した。
【００２９】変異株ＲＸ１３の調製 変異株ＲＣ１５の調製において記載したものと同様な方
法で、ＲＥ５株の反復変異誘発によってＤ−リボース−
耐性変異株を得た。Ｄ−リボース−耐性変異株の中から
変異株ＲＸ１３をその親株より優れているＤ−リボース
−高−生産株として選択した。
法で、ＲＥ５株の反復変異誘発によってＤ−リボース−
耐性変異株を得た。Ｄ−リボース−耐性変異株の中から
変異株ＲＸ１３をその親株より優れているＤ−リボース
−高−生産株として選択した。
【００３０】実施例１ 変異株ＲＡ８，ＲＣ１５，ＲＥ５又はＲＸ１３の寒天培
養の一白金耳を試験管中の種用培地７mlに接種した。培
地の成分は下記に示す通りである。 Ｄ−ソルビトール ２．０％ コーンスティープリカー ２．０％ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．３％ Ｌ−フェニルアラニン ０．００２５％ Ｌ−トリプトファン ０．００２５％ （pH６．７）
養の一白金耳を試験管中の種用培地７mlに接種した。培
地の成分は下記に示す通りである。 Ｄ−ソルビトール ２．０％ コーンスティープリカー ２．０％ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．３％ Ｌ−フェニルアラニン ０．００２５％ Ｌ−トリプトファン ０．００２５％ （pH６．７）
【００３１】接種した試験管を試験管振とう機上、３
６．５℃で、６時間インキュベートした。このように調
製した種培養（４ml）を、５００mlエレン マイヤー
フラスコ内の産生培地に接種し、４０mlとした。産生培
地の成分は以下の通りである。 モラティン ０．０７％ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ０．５５％ （ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 ０．２％ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０００３２％ ＭｎＳＯ4 ・６Ｈ2 Ｏ ０．０００１９％ ＣａＣＯ3 ４％ Ｄ−グルコース （表１に示す） コーンスティープリカー （表１に示す） （pH約７．０）
６．５℃で、６時間インキュベートした。このように調
製した種培養（４ml）を、５００mlエレン マイヤー
フラスコ内の産生培地に接種し、４０mlとした。産生培
地の成分は以下の通りである。 モラティン ０．０７％ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ０．５５％ （ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 ０．２％ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０００３２％ ＭｎＳＯ4 ・６Ｈ2 Ｏ ０．０００１９％ ＣａＣＯ3 ４％ Ｄ−グルコース （表１に示す） コーンスティープリカー （表１に示す） （pH約７．０）
【００３２】フラスコを、３６．５℃及び２２０rpm
で、４日間インキュベートした。変異株ＲＡ８，ＲＣ１
５，ＲＥ５及びＲＸ１３のＤ−リボース生産性を表１に
示す。親株、バチルス プミルス、ＡＴＣＣ ３１０９
３を、上記と同様な方法で培養し、その結果を同じ表に
示す。変異株ＲＥ５およびＲＸ１３は、各々親株より
１．５及び１．７倍高いＤ−リボース生産性を示した。
で、４日間インキュベートした。変異株ＲＡ８，ＲＣ１
５，ＲＥ５及びＲＸ１３のＤ−リボース生産性を表１に
示す。親株、バチルス プミルス、ＡＴＣＣ ３１０９
３を、上記と同様な方法で培養し、その結果を同じ表に
示す。変異株ＲＥ５およびＲＸ１３は、各々親株より
１．５及び１．７倍高いＤ−リボース生産性を示した。
【００３３】
【表１】 表 １ 変異株ＲＡ８，ＲＣ１５，ＲＥ５及びＲＸ１３のＤ−リボース生産性 Ｄ−リボース生産量 株 Ｄ−グルコース コーンスティープリカー （ｇ／ｌ） （ｇ／ｌ） （ｇ／ｌ） ３日間 ４日間 ＲＡ８ １４５ ３ ７０．９ ７３．８ ＲＣ１５ １４５ ３ ６８．９ ７７．８ ＲＥ５ １４５ ３ ８３．７ ８５．１ ＲＥ５ １７２ ６ ９４．５ １００．３ ＲＸ１３ ２００ ３ ７７．５ １１８．８ 親 株 １４５ ３ ６８．５ ６６．６ 親 株 １７２ ６ ６７．９ ６８．９
【００３４】実施例２ 実施例１に記載したのと同様な方法で、変異株ＲＥ５の
種培養を調製し、Ｄ−グルコース及びコーンスティープ
リカー（Ｌｏｔ．No. ６３０３１５Ｂ 日本食品化工株
式会社）の濃度が各々１４５及び４．５ｇ／ｌであるこ
と以外は同一の産生培地に接種した。日立自動アミノ酸
分析機、モデル８３５で測定されたコーンスティープリ
カー中の遊離アミノ酸濃度は以下の通りである。 アミノ酸 濃 度 （m モル／100g コーンスティープリカー） Ｌ−アスパラギン酸 ０．１７ Ｌ−スレオニン １．７５ Ｌ−セリン ２．７９ Ｌ−グルタミン酸 ２．６８ Ｌ−プロリン ７．４１ Ｌ−グリシン １．９３ Ｌ−アラニン １０．８７ Ｌ−シスチン 測定せず Ｌ−バリン ３．６０ Ｌ−メチオニン １．５５ Ｌ−イソロイシン １．５７ Ｌ−ロイシン ６．１６ Ｌ−チロシン ２．１１ Ｌ−フェニルアラニン ２．３８ Ｌ−リジン ２．８２ Ｌ−ヒスチジン １．０５ Ｌ−トリプトファン ０．１８ Ｌ−アルギニン ３．５６ フラスコを３日間インキュベートし、Ｄ−リボース８
７．０ｇ／ｌを得た。
種培養を調製し、Ｄ−グルコース及びコーンスティープ
リカー（Ｌｏｔ．No. ６３０３１５Ｂ 日本食品化工株
式会社）の濃度が各々１４５及び４．５ｇ／ｌであるこ
と以外は同一の産生培地に接種した。日立自動アミノ酸
分析機、モデル８３５で測定されたコーンスティープリ
カー中の遊離アミノ酸濃度は以下の通りである。 アミノ酸 濃 度 （m モル／100g コーンスティープリカー） Ｌ−アスパラギン酸 ０．１７ Ｌ−スレオニン １．７５ Ｌ−セリン ２．７９ Ｌ−グルタミン酸 ２．６８ Ｌ−プロリン ７．４１ Ｌ−グリシン １．９３ Ｌ−アラニン １０．８７ Ｌ−シスチン 測定せず Ｌ−バリン ３．６０ Ｌ−メチオニン １．５５ Ｌ−イソロイシン １．５７ Ｌ−ロイシン ６．１６ Ｌ−チロシン ２．１１ Ｌ−フェニルアラニン ２．３８ Ｌ−リジン ２．８２ Ｌ−ヒスチジン １．０５ Ｌ−トリプトファン ０．１８ Ｌ−アルギニン ３．５６ フラスコを３日間インキュベートし、Ｄ−リボース８
７．０ｇ／ｌを得た。
【００３５】実施例３ 変異株ＲＥ５の寒天培養の一白金耳を、５００mlエレン
マイヤー フラスコ中の下記種用培地１００mlに接種
した。 Ｄ−ソルビトール ２％ バクトペプトン ０．２５％ 酵母抽出物 ０．２％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．３％ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％ Ｌ−フェニルアラニン ０．００２５％ Ｌ−トリプトファン ０．００２５％ Ｌ−チロシン ０．００２５％ Ｌ−バリン ０．００２５％
マイヤー フラスコ中の下記種用培地１００mlに接種
した。 Ｄ−ソルビトール ２％ バクトペプトン ０．２５％ 酵母抽出物 ０．２％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．３％ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．１％ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０５％ Ｌ−フェニルアラニン ０．００２５％ Ｌ−トリプトファン ０．００２５％ Ｌ−チロシン ０．００２５％ Ｌ−バリン ０．００２５％
【００３６】フラスコを３６．５℃及び２２０rpm で９
時間インキュベートし、下記に示す培地成分の種用培地
１５０mlを含む２つの５００mlエレン マイヤー フラ
スコに、それぞれ培養液０．１mlを移した。 Ｄ−ソルビトール ４％ コーンスティープリカー ４％ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．２％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．６％ Ｌ−フェニルアラニン ０．００５％ Ｌ−トリプトファン ０．００５％
時間インキュベートし、下記に示す培地成分の種用培地
１５０mlを含む２つの５００mlエレン マイヤー フラ
スコに、それぞれ培養液０．１mlを移した。 Ｄ−ソルビトール ４％ コーンスティープリカー ４％ ＫＨ2 ＰＯ4 ０．２％ Ｋ2 ＨＰＯ4 ０．６％ Ｌ−フェニルアラニン ０．００５％ Ｌ−トリプトファン ０．００５％
【００３７】フラスコを、３６．５℃及び２２０rpm で
１９時間インキュベートし、得られた培養液を、３リッ
トル ジャー ファーメンテイションの接種用として用
いた。種培養液（１７０ml）を、接種後、１．７リット
ルになるように調製した産生用培地に接種した。産生用
培地の成分を以下に示す。 Ｄ−グルコース １７．２％ モラテイン ０．０７％ コーンスティープリカー ０．３％ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ０．５５％ （ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 ０．２％ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０００３２％ ＭｎＳＯ4 ・６Ｈ2 Ｏ ０．０００１９％
１９時間インキュベートし、得られた培養液を、３リッ
トル ジャー ファーメンテイションの接種用として用
いた。種培養液（１７０ml）を、接種後、１．７リット
ルになるように調製した産生用培地に接種した。産生用
培地の成分を以下に示す。 Ｄ−グルコース １７．２％ モラテイン ０．０７％ コーンスティープリカー ０．３％ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 ０．５５％ （ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 ０．２％ ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．０００３２％ ＭｎＳＯ4 ・６Ｈ2 Ｏ ０．０００１９％
【００３８】培養を、３６．５℃、及び５００rpm で行
ない、０．８５リットル／分の通気を行った。培養中、
培地のpHを６Ｎ水酸化ナトリウムを用いて５．３から
７．０の間に調節した。７１時間の培養において、Ｄ−
リボース産生量は９４．０ｇ／ｌであった。この培養液
から、細胞をろ過によって除去し、ろ液をもとの容積の
半分まで濃縮した。次にその容積の約 1／4 量のエタノ
ールを加え、沈澱物を除去した。残渣を陽イオン及び陰
イオン交換樹脂で脱塩し、次いで活性炭カラムにて脱色
した。脱色した溶液を濃縮し、その容積の約４倍量のエ
タノールを加え、それによってＤ−リボース結晶１５
９．８ｇを得た。
ない、０．８５リットル／分の通気を行った。培養中、
培地のpHを６Ｎ水酸化ナトリウムを用いて５．３から
７．０の間に調節した。７１時間の培養において、Ｄ−
リボース産生量は９４．０ｇ／ｌであった。この培養液
から、細胞をろ過によって除去し、ろ液をもとの容積の
半分まで濃縮した。次にその容積の約 1／4 量のエタノ
ールを加え、沈澱物を除去した。残渣を陽イオン及び陰
イオン交換樹脂で脱塩し、次いで活性炭カラムにて脱色
した。脱色した溶液を濃縮し、その容積の約４倍量のエ
タノールを加え、それによってＤ−リボース結晶１５
９．８ｇを得た。
【００３９】実施例４ バチルス プミルス ＡＴＣＣ ３１０９３、変異株Ｒ
Ａ８、ＲＣ１５、ＲＥ５、又はＲＸ１３の一白金耳を、
変異株ＲＡ８についての調製において記載した様な成分
の種用培地７mlを入れた試験管に接種し、３６．５℃及
び２８０rpm で、５時間インキュベートした。次にＤ−
グルコース濃度が１００ｇ／ｌであり、何例かではＤ−
リボースが最終濃度７０、９０又は１２０ｇ／ｌになる
ように加えられたことを除く外は変異株ＲＡ８の調製に
おいて記載した産生培地６mlにそれぞれ種培養０．６ml
を接種した。
Ａ８、ＲＣ１５、ＲＥ５、又はＲＸ１３の一白金耳を、
変異株ＲＡ８についての調製において記載した様な成分
の種用培地７mlを入れた試験管に接種し、３６．５℃及
び２８０rpm で、５時間インキュベートした。次にＤ−
グルコース濃度が１００ｇ／ｌであり、何例かではＤ−
リボースが最終濃度７０、９０又は１２０ｇ／ｌになる
ように加えられたことを除く外は変異株ＲＡ８の調製に
おいて記載した産生培地６mlにそれぞれ種培養０．６ml
を接種した。
【００４０】試験管を３６．５℃及び２８０rpm で、２
日間インキュベートした。試験を行った微生物の生育を
１日目及び２日目に、５９０nmにおいて光学的に測定し
た。その結果を表２に示す。変異株ＲＣ１５、ＲＥ５及
びＲＸ１３は、親株であるバチルス プミルス ＡＴＣ
Ｃ ３１０９３、および変異株ＲＡ８よりもＤ−リボー
ス７０及び９０ｇ／ｌに対して著しく高い耐性を示し
た。
日間インキュベートした。試験を行った微生物の生育を
１日目及び２日目に、５９０nmにおいて光学的に測定し
た。その結果を表２に示す。変異株ＲＣ１５、ＲＥ５及
びＲＸ１３は、親株であるバチルス プミルス ＡＴＣ
Ｃ ３１０９３、および変異株ＲＡ８よりもＤ−リボー
ス７０及び９０ｇ／ｌに対して著しく高い耐性を示し
た。
【００４１】
【表２】 表 ２ Ｄ−リボース存在下での変異株ＲＡ８、ＲＣ１５、ＲＥ５及びＲＸ１３の生育 細 胞 生 育 株 Ｄ−リボース濃度 (590nmにおけるOD） バチルスプミルス （ｇ／ｌ） １日目 ２日目 ＡＴＣＣ ３１０９３ ０ ５．６ ５．６ ７０ ３．１ ３．６ ９０ ０．５ ０．４ １２０ ０．２ ０．２ 変異株 ＲＡ８ ０ ５．８ ６．４ ７０ ３．２ ３．４ ９０ １．２ ０．４ １２０ ０．３ ０．４ 変異株 ＲＣ１５ ０ ５．４ ６．６ ７０ ８．２ １１．６ ９０ １．７ ８．８ １２０ ０．３ ０．４ 変異株 ＲＥ５ ０ ５．８ ６．０ ７０ ８．９ １１．６ ９０ ４．９ １１．０ １２０ ０．６ ０．４ 変異株 ＲＸ１３ ０ ３．７ ３．６ ７０ ６．２ １１．６ ９０ ６．０ ９．８ １２０ ０．５ １．６
【００４２】酵素活性 実施例３に記載したのと同様な方法で、バチルス プミ
ルス ＡＴＣＣ ３１０９３、及び変異株ＲＡ８、ＲＣ
１５、ＲＥ５及びＲＸ１３を、３リットル ジャーファ
ーメンター中で培養した。培地中のＤ−グルコースが完
全になくなった時、培養液５０mlをファーメンターから
引き出した。培養液を６，０００×ｇで１０分間遠心分
離し、沈澱した細胞を１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH
７．５）１０mlに懸濁した。細胞懸濁液を６，０００×
ｇで１０分間遠心分離し、沈澱した細胞を前記したのと
同様な方法で再び洗浄した。得られた細胞を使用するま
で−２０℃で凍結した。
ルス ＡＴＣＣ ３１０９３、及び変異株ＲＡ８、ＲＣ
１５、ＲＥ５及びＲＸ１３を、３リットル ジャーファ
ーメンター中で培養した。培地中のＤ−グルコースが完
全になくなった時、培養液５０mlをファーメンターから
引き出した。培養液を６，０００×ｇで１０分間遠心分
離し、沈澱した細胞を１０mMトリス−塩酸緩衝液（pH
７．５）１０mlに懸濁した。細胞懸濁液を６，０００×
ｇで１０分間遠心分離し、沈澱した細胞を前記したのと
同様な方法で再び洗浄した。得られた細胞を使用するま
で−２０℃で凍結した。
【００４３】凍結細胞を解凍し、１０mMトリス−塩酸緩
衝液（pH７．５）１０mlに懸濁し、６，０００×ｇで１
０分間遠心分離した。沈澱した細胞を同一の緩衝液２ml
に再懸濁し、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．）を加え、２００μｇ／mlの最終濃度にし
た。次に混合液を攪拌（２４０rpm ）しながら、３７℃
で１時間インキュベートし、細胞を溶解した。このよう
にして得られた溶解物を６，０００×ｇで１０分間遠心
分離した。得られた上清を、無細胞抽出液として使用し
た。
衝液（pH７．５）１０mlに懸濁し、６，０００×ｇで１
０分間遠心分離した。沈澱した細胞を同一の緩衝液２ml
に再懸濁し、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ Ｃｏ．）を加え、２００μｇ／mlの最終濃度にし
た。次に混合液を攪拌（２４０rpm ）しながら、３７℃
で１時間インキュベートし、細胞を溶解した。このよう
にして得られた溶解物を６，０００×ｇで１０分間遠心
分離した。得られた上清を、無細胞抽出液として使用し
た。
【００４４】バチルス プミルス ＡＴＣＣ ３１０９
３及び、変異株ＲＡ８、ＲＣ１５、ＲＥ５並びにＲＸ１
３の無細胞抽出液中のグルコース デヒドロゲナーゼ
（ＧＤＨ）、Ｄ−グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、グルコノキナーゼ（ＧＡＫ）及び
６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤＨ）
の酵素活性を測定したその結果を表３に示す。変異株Ｒ
Ｅ５及びＲＸ１３は、親株よりも１０倍高いグルコノキ
ナーゼ活性を有することが見出された。
３及び、変異株ＲＡ８、ＲＣ１５、ＲＥ５並びにＲＸ１
３の無細胞抽出液中のグルコース デヒドロゲナーゼ
（ＧＤＨ）、Ｄ−グルコース−６−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、グルコノキナーゼ（ＧＡＫ）及び
６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤＨ）
の酵素活性を測定したその結果を表３に示す。変異株Ｒ
Ｅ５及びＲＸ１３は、親株よりも１０倍高いグルコノキ
ナーゼ活性を有することが見出された。
【００４５】
【表３】 表 ３ バチルス プミルス ＡＴＣＣ ３１０９３及び変異株 ＲＡ８、ＲＣ１５、ＲＥ５並びにＲＸ１３の無細胞抽出 液中の酵素活性 酵 素 活 性 バチルス 酵 素 プミルス 変異株 変異株 変異株 変異株 ATCC 31093 RA8 RC15 RE5 RX13 GDH 0.067* 0.073 0.074 0.091 0.088 (0.019)** (0.023) (0.025) (0.036) (0.035) GAK 0.009 0.021 0.051 0.075 0.083 (0.003) (0.007) (0.017) (0.030) (0.041) * 単位／ml−培養液 ** 単位／mg−タンパク
【００４６】形態 実施例１に示したのと同様にして、バチルス プミルス
ＡＴＣＣ ３１０９３、及び変異株ＲＥ５を試験管
中、種培養培地にて培養した。培養５．５時間後、培養
のサンプルを引き出し、上記変異株の形態学的観察を顕
微鏡下で行った。それらの顕微鏡写真を図１に示した。
バチルス プミルス ＡＴＣＣ ３１０９３による２又
は３個の細胞からなる短鎖の形成に対比して、変異株Ｒ
Ｅ５の１０個以上の細胞からなる長いフィラメントの形
成が観察された。
ＡＴＣＣ ３１０９３、及び変異株ＲＥ５を試験管
中、種培養培地にて培養した。培養５．５時間後、培養
のサンプルを引き出し、上記変異株の形態学的観察を顕
微鏡下で行った。それらの顕微鏡写真を図１に示した。
バチルス プミルス ＡＴＣＣ ３１０９３による２又
は３個の細胞からなる短鎖の形成に対比して、変異株Ｒ
Ｅ５の１０個以上の細胞からなる長いフィラメントの形
成が観察された。
【００４７】
【図１】バチルス プミルス ＡＴＣＣ ３１０９３及
び変異株ＲＥ５の形態を示す顕微鏡写真（１，１００倍
及び２，８００倍）である。
び変異株ＲＥ５の形態を示す顕微鏡写真（１，１００倍
及び２，８００倍）である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成３年１０月７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００６】本明細書において、トランスケトラーゼの
欠損は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２３， １００９（１９５
６）、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ７４巻、３０６
ページ（１９５８）及び同７４巻、３１５ページ（１９
５８）、に記載してある方法にもとづいた。たとえば、
以下の方法によってニコチンアミド アデニン ジヌク
レオチドの還元形（ＮＡＤＨ）の酸化量を３４０ｎｍに
おいて分光光度計（コントロンＫ．Ｋ．）で測定を行な
い、酵素活性を後に記載するような方法（実施例４参
照）で調製した無細胞抽出液に対して計算を行ない、そ
の値が０．０１単位／ｍｇ−タンパクを越えないという
ことを意味する。
欠損は、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２３， １００９（１９５
６）、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ７４巻、３０６
ページ（１９５８）及び同７４巻、３１５ページ（１９
５８）、に記載してある方法にもとづいた。たとえば、
以下の方法によってニコチンアミド アデニン ジヌク
レオチドの還元形（ＮＡＤＨ）の酸化量を３４０ｎｍに
おいて分光光度計（コントロンＫ．Ｋ．）で測定を行な
い、酵素活性を後に記載するような方法（実施例４参
照）で調製した無細胞抽出液に対して計算を行ない、そ
の値が０．０１単位／ｍｇ−タンパクを越えないという
ことを意味する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】＜トランスケトラーゼ活性の分析方法＞ １． 反応液Ａ（０．５５５ｍｌ）：Ｄ−リボース−５
−フォスフェート２０μモル、ＮＡＤＨ ０．３７５μ
モル、Ｄ−リボース−５−ホスフェートケトール−イソ
メラーゼ及びＤ−リブロース−５−ホスフェート−３−
エピメラーゼを各々０．５単位、アルファーグリセリン
リン酸デヒドロゲナーゼ（酵素コード１．１．１．
８．）０．３３単位、十分なトリオースホスフェートイ
ソメラーゼ（酵素コード５．３．１．１．）（Ｓｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）及びトリス
−塩酸緩衝液６０μモル（ｐＨ７．５）。
−フォスフェート２０μモル、ＮＡＤＨ ０．３７５μ
モル、Ｄ−リボース−５−ホスフェートケトール−イソ
メラーゼ及びＤ−リブロース−５−ホスフェート−３−
エピメラーゼを各々０．５単位、アルファーグリセリン
リン酸デヒドロゲナーゼ（酵素コード１．１．１．
８．）０．３３単位、十分なトリオースホスフェートイ
ソメラーゼ（酵素コード５．３．１．１．）（Ｓｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）及びトリス
−塩酸緩衝液６０μモル（ｐＨ７．５）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００９】各反応液を３０℃、１０分間インキュベー
トし、反応液を混合した（総量は、１ｍｌ）。３４０ｎ
ｍにおける吸光度の変化を分光光度計モデルＵＶＩＫＯ
Ｎ８１０（コントロンＫ．Ｋ．）で測定し、ＮＡＤＨの
酸化速度が直線になった後、前記の無細胞抽出液２０μ
ｌを反応液に加えた。ＮＡＤＨの酸化速度が直線になっ
た後、３４０ｎｍにおける吸光度の変化をそのプロット
から計算した。酵素活性の１単位は１分間あたりのＮＡ
ＤＨ １μモルの酸化を触媒する酵素の量として定義し
た。
トし、反応液を混合した（総量は、１ｍｌ）。３４０ｎ
ｍにおける吸光度の変化を分光光度計モデルＵＶＩＫＯ
Ｎ８１０（コントロンＫ．Ｋ．）で測定し、ＮＡＤＨの
酸化速度が直線になった後、前記の無細胞抽出液２０μ
ｌを反応液に加えた。ＮＡＤＨの酸化速度が直線になっ
た後、３４０ｎｍにおける吸光度の変化をそのプロット
から計算した。酵素活性の１単位は１分間あたりのＮＡ
ＤＨ １μモルの酸化を触媒する酵素の量として定義し
た。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１０】本明細書において、高いグルコノキナーゼ
活性とは、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ．７９８， ８８−９５（１９８４）に記載されてい
る方法にもとづいた、以下に示す方法によってニコチン
アミド アデニン ジヌクレオチドリン酸（以後ＮＡＤ
Ｐと言う）の酸化型の還元量を測定し、酵素活性が、上
記の無細胞抽出液で計算を行ない、その値は０．０１単
位／ｍｇ−タンパクより少なくないことを示す。
活性とは、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ．７９８， ８８−９５（１９８４）に記載されてい
る方法にもとづいた、以下に示す方法によってニコチン
アミド アデニン ジヌクレオチドリン酸（以後ＮＡＤ
Ｐと言う）の酸化型の還元量を測定し、酵素活性が、上
記の無細胞抽出液で計算を行ない、その値は０．０１単
位／ｍｇ−タンパクより少なくないことを示す。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１１】＜グルコノキナーゼ活性の分析方法＞反応
混合物（０．５ｍｌ）は、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）１００μモル、ＭｇＣｌ２ ６．６μモル、ア
デノシン 三リン酸３．２μモル、ＮＡＤＰ０．４μモ
ル、グルコン酸ナトリウム１．０μモル、無細胞抽出液
２０μｌ及び基準６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナー
ゼ（酵素コード１．１．１．４４，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｅｄ．）０．００５単位を含
む。反応を、基質の添加によって開始させる。３４０ｎ
ｍにおける吸光度の変化を室温下、分光光度計ＵＶＩＫ
ＯＮ モデル８１０を用いて測定した。酵素活性の１単
位は、１分あたりに、ＮＡＤＰ １μモルの還元を触媒
する酵素の量として定義した。
混合物（０．５ｍｌ）は、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）１００μモル、ＭｇＣｌ２ ６．６μモル、ア
デノシン 三リン酸３．２μモル、ＮＡＤＰ０．４μモ
ル、グルコン酸ナトリウム１．０μモル、無細胞抽出液
２０μｌ及び基準６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナー
ゼ（酵素コード１．１．１．４４，Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｅｄ．）０．００５単位を含
む。反応を、基質の添加によって開始させる。３４０ｎ
ｍにおける吸光度の変化を室温下、分光光度計ＵＶＩＫ
ＯＮ モデル８１０を用いて測定した。酵素活性の１単
位は、１分あたりに、ＮＡＤＰ １μモルの還元を触媒
する酵素の量として定義した。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】本明細書において、前記無細胞抽出液中で
のグルコースデヒドロゲナーゼ活性は、Ａｇｒｉｃ・Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４３， ２７１−２７８（１９７
９）に記載の方法に従って測定した。ＮＡＤＰの還元量
は、３４０ｎｍにおいて分光光度計ＵＶＩＫＯＮ モデ
ル８１０を用いて測定した。
のグルコースデヒドロゲナーゼ活性は、Ａｇｒｉｃ・Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４３， ２７１−２７８（１９７
９）に記載の方法に従って測定した。ＮＡＤＰの還元量
は、３４０ｎｍにおいて分光光度計ＵＶＩＫＯＮ モデ
ル８１０を用いて測定した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】＜グルコースデヒドロゲナーゼの分析方法
＞分析混合液（０．５ｍｌ）は、Ｄ−グルコース ５０
μモル、ＮＡＤＰ ２μモル、トリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）０．３ｍモル、ＭｎＳＯ４ ５ｎモルおよび
無細胞抽出液２０μｌを含む。反応を基質の添加によっ
て開始させた。酵素活性の１単位は、１分あたりにＮＡ
ＤＰ １μモルの還元を触媒する酵素の量として定義し
た。
＞分析混合液（０．５ｍｌ）は、Ｄ−グルコース ５０
μモル、ＮＡＤＰ ２μモル、トリス−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）０．３ｍモル、ＭｎＳＯ４ ５ｎモルおよび
無細胞抽出液２０μｌを含む。反応を基質の添加によっ
て開始させた。酵素活性の１単位は、１分あたりにＮＡ
ＤＰ １μモルの還元を触媒する酵素の量として定義し
た。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】本明細書において高いＤ−リボース耐性
は、トランスケトラーゼを欠損しているバチルス属のバ
クテリアの変異株を接種し、下記の様な培地中で、３
６．５℃、２８０ｒｐｍ．でインキュベートした時、そ
れらはＤ−リボース７０ｇ／ｌ以上の存在下で良好な発
育を示すことを意味する（５９０ｎｍでの吸光度（Ｏ
Ｄ）は約５．０より高い）。 Ｄ−グルコース １０．０％ Ｄ−ソルビトール ０．２ Ｄ−リボース ７．０ または ９．０ モラテイン（Ｍｏｌａｔｅｉｎ） ０．０７ コーンスティープリカー ０．５ （ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．５５ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．２ ＫＨ２ＰＯ４ ０．０１ Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０３ Ｌ−フェニルアラニン ０．０００２５ Ｌ−トリプトファン ０．０００２５ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００３２ ＭｎＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ０．０００１９ ＣａＣＯ３ ４．０
は、トランスケトラーゼを欠損しているバチルス属のバ
クテリアの変異株を接種し、下記の様な培地中で、３
６．５℃、２８０ｒｐｍ．でインキュベートした時、そ
れらはＤ−リボース７０ｇ／ｌ以上の存在下で良好な発
育を示すことを意味する（５９０ｎｍでの吸光度（Ｏ
Ｄ）は約５．０より高い）。 Ｄ−グルコース １０．０％ Ｄ−ソルビトール ０．２ Ｄ−リボース ７．０ または ９．０ モラテイン（Ｍｏｌａｔｅｉｎ） ０．０７ コーンスティープリカー ０．５ （ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．５５ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．２ ＫＨ２ＰＯ４ ０．０１ Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０３ Ｌ−フェニルアラニン ０．０００２５ Ｌ−トリプトファン ０．０００２５ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００３２ ＭｎＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ０．０００１９ ＣａＣＯ３ ４．０
【提出日】平成６年１１月１８日
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１５】本発明で用いる微生物は、トランスケトラ
ーゼを欠損し、高いＤ−リボース耐性及び高いグルコノ
キナーゼ活性を有するバチルス属に属する全ての菌株が
含まれる。その様な菌株は、親株を紫外線、Ｘ−線、ガ
ンマー線などで照射するかまたは親株をＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ニトロジェン
マスタード、エチルメタンスルホン酸などの化学的変異
誘発物質の作用にさらすことによって、バチルス ブレ
ビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス
セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチル
ス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌ
ａｎｓ）、バチルス コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃｏｕｇｕｌａｎｓ）、バチルス リケニホルミス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、
バチルス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）、バチルス メセントリクス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｍｅｓｅｎｔｒｉｃｕｓ）、バチルス プミ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス
サプチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
などのバチルス属に属する微生物から誘導することがで
きる。
ーゼを欠損し、高いＤ−リボース耐性及び高いグルコノ
キナーゼ活性を有するバチルス属に属する全ての菌株が
含まれる。その様な菌株は、親株を紫外線、Ｘ−線、ガ
ンマー線などで照射するかまたは親株をＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、ニトロジェン
マスタード、エチルメタンスルホン酸などの化学的変異
誘発物質の作用にさらすことによって、バチルス ブレ
ビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス
セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチル
ス サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌ
ａｎｓ）、バチルス コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｃｏｕｇｕｌａｎｓ）、バチルス リケニホルミス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、
バチルス メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）、バチルス メセントリクス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｍｅｓｅｎｔｒｉｃｕｓ）、バチルス プミ
ルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス
サプチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
などのバチルス属に属する微生物から誘導することがで
きる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１７】これらの変異株は、高いＤ−リボース耐性
を有する。例えば、これらの変異株は、７０ｇ／ｌ以
上、好ましくは１２０ｇ／ｌ以上の濃度のＤ−リボース
を含む培地中で成育しうる能力を有している。
を有する。例えば、これらの変異株は、７０ｇ／ｌ以
上、好ましくは１２０ｇ／ｌ以上の濃度のＤ−リボース
を含む培地中で成育しうる能力を有している。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２４】フラスコを３０℃で、１８時間インキュベ
ートした。細胞を遠心分離で採取し、５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）５０ｍｌに懸濁した。細胞懸濁液の
一部（３ｍｌ）に、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（ＭＮＮＧ）１００μｇ／ｍｌ（最終
濃度）を加え、３０℃で３０分間、処理した。処理細胞
を遠心分離で採取し、滅菌水で１回洗浄し、種用培地５
ｍｌに再懸濁し、更に３０℃で２時間インキュベートし
た。この様にして調製した培養液を滅菌水で適当に希釈
し、下記に示すような寒天培地に塗布した。 Ｄ−ソルビトール ０．５％ バクト ペプトン（Ｄｉｆｃｏ） １％ 酵母抽出物（オリエンタル酵母） ０．２％ Ｎａｃｌ ０．２％ 寒天 １．５％ （ｐＨ７．０） プレートを３６．５℃で２日間インキュベートした。プ
レート上で成育したコロニーを、新鮮寒天プレート上で
継代培養し、更に下記に示した様な試験管培養のための
細胞を十分量得るために３６．５℃で、２４時間インキ
ュベートした。
ートした。細胞を遠心分離で採取し、５０ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）５０ｍｌに懸濁した。細胞懸濁液の
一部（３ｍｌ）に、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン（ＭＮＮＧ）１００μｇ／ｍｌ（最終
濃度）を加え、３０℃で３０分間、処理した。処理細胞
を遠心分離で採取し、滅菌水で１回洗浄し、種用培地５
ｍｌに再懸濁し、更に３０℃で２時間インキュベートし
た。この様にして調製した培養液を滅菌水で適当に希釈
し、下記に示すような寒天培地に塗布した。 Ｄ−ソルビトール ０．５％ バクト ペプトン（Ｄｉｆｃｏ） １％ 酵母抽出物（オリエンタル酵母） ０．２％ Ｎａｃｌ ０．２％ 寒天 １．５％ （ｐＨ７．０） プレートを３６．５℃で２日間インキュベートした。プ
レート上で成育したコロニーを、新鮮寒天プレート上で
継代培養し、更に下記に示した様な試験管培養のための
細胞を十分量得るために３６．５℃で、２４時間インキ
ュベートした。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】このように調製した寒天培養の各々を以下
に示す産生培地５ｍｌに接種するのに用いた。 Ｄ−グルコース １４．５％ モラティン（乾燥酵母） ０．０７％ （鐘淵化学） Ｄ−ソルビトール ０．２％ コーンスティープリカー ０．５％ （ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．５５％ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．２％ ＫＨ２ＰＯ４ ０．０１％ Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０３％ Ｌ−フェニルアラニン ０．０００２５％ Ｌ−トリプトファン ０．０００２５％ ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．０００３２％ ＭｎＳＯ４６Ｈ２Ｏ ０．０００１９％ ＣａＣＯ３ ４％
に示す産生培地５ｍｌに接種するのに用いた。 Ｄ−グルコース １４．５％ モラティン（乾燥酵母） ０．０７％ （鐘淵化学） Ｄ−ソルビトール ０．２％ コーンスティープリカー ０．５％ （ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．５５％ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．２％ ＫＨ２ＰＯ４ ０．０１％ Ｋ２ＨＰＯ４ ０．０３％ Ｌ−フェニルアラニン ０．０００２５％ Ｌ−トリプトファン ０．０００２５％ ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ ０．０００３２％ ＭｎＳＯ４６Ｈ２Ｏ ０．０００１９％ ＣａＣＯ３ ４％
【提出日】平成６年１１月１８日
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】変異株ＲＣ１５の調製 変異株ＲＡ８の調製法に記載したものと同様な方法でＲ
Ａ８株を、ＭＮＮＧ（１００μｇ／ｍｌ最終濃度）及び
２−メトキシ−６−クロロ−９−〔３−（エチル−２−
クロロエチル）アミノプロピルアミノ〕−アクリジン−
ジヒドロクロライド（１０μｇ／ｍｌ最終濃度）の混合
液で処理した。処理細胞を、Ｄ−ソルビトール（０．５
％）；バクト ペプトン（１％）（Ｄｉｆｃｏ）；酵母
抽出物（０．２％）（オリエンタル酵母）、ＮａＣｌ
（０．２％）及びＤ−リボース７０ｇ／ｌを含む培地に
接種し、３６．５℃で１日、インキュベートした。培養
液の一部をＤ−リボース９０ｇ／ｌが補なわれているが
上記と同じ新鮮培地に移し、３６．５℃で、２日間イン
キュベートした。得られた培養液を滅菌水で適当に希釈
し、Ｄ−リボース９０ｇ／ｌを補った寒天培地に塗り、
３６．５℃で２日間インキュベートした。その結果とし
て、多くのＤ−リボース耐性株が得られた。これらの変
異株のＤ−リボース産生能を、変異株ＲＡ８の調製に記
載したのと同様な方法で評価し、変異株ＲＣ１５をＤ−
リボースー高生産株として選択した。
Ａ８株を、ＭＮＮＧ（１００μｇ／ｍｌ最終濃度）及び
２−メトキシ−６−クロロ−９−〔３−（エチル−２−
クロロエチル）アミノプロピルアミノ〕−アクリジン−
ジヒドロクロライド（１０μｇ／ｍｌ最終濃度）の混合
液で処理した。処理細胞を、Ｄ−ソルビトール（０．５
％）；バクト ペプトン（１％）（Ｄｉｆｃｏ）；酵母
抽出物（０．２％）（オリエンタル酵母）、ＮａＣｌ
（０．２％）及びＤ−リボース７０ｇ／ｌを含む培地に
接種し、３６．５℃で１日、インキュベートした。培養
液の一部をＤ−リボース９０ｇ／ｌが補なわれているが
上記と同じ新鮮培地に移し、３６．５℃で、２日間イン
キュベートした。得られた培養液を滅菌水で適当に希釈
し、Ｄ−リボース９０ｇ／ｌを補った寒天培地に塗り、
３６．５℃で２日間インキュベートした。その結果とし
て、多くのＤ−リボース耐性株が得られた。これらの変
異株のＤ−リボース産生能を、変異株ＲＡ８の調製に記
載したのと同様な方法で評価し、変異株ＲＣ１５をＤ−
リボースー高生産株として選択した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】変異株ＲＥ５の調製 変異株ＲＣ１５の調製に記載したのと同様な方法で、Ｒ
Ｃ１５株を、ＭＮＮＧ１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）で
処理し、処理細胞を、Ｄ−リボース７０ｇ／ｌが補われ
た寒天培地に塗った。Ｄ−リボース耐性変異株の中か
ら、変異株ＲＥ５を、その親株より優れているＤ−リボ
ース−高生産株として選択した。
Ｃ１５株を、ＭＮＮＧ１００μｇ／ｍｌ（最終濃度）で
処理し、処理細胞を、Ｄ−リボース７０ｇ／ｌが補われ
た寒天培地に塗った。Ｄ−リボース耐性変異株の中か
ら、変異株ＲＥ５を、その親株より優れているＤ−リボ
ース−高生産株として選択した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２９】変異株ＲＸ１３の調製 変異株ＲＣ１５の調製において記載したものと同様な方
法で、ＲＥ５株の反復変異誘発によってＤ−リボース−
耐性変異株を得た。Ｄ−リボース−耐性変異株の中から
変異株ＲＸ１３をその親株より優れているＤ−リボース
−高生産株として選択した。
法で、ＲＥ５株の反復変異誘発によってＤ−リボース−
耐性変異株を得た。Ｄ−リボース−耐性変異株の中から
変異株ＲＸ１３をその親株より優れているＤ−リボース
−高生産株として選択した。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３１】接種した試験管を試験管振とう機上、３
６．５℃で、６時間インキュベートした。このように調
製した種培養（４ｍｌ）を、５００ｍｌエルレンマイヤ
ー フラスコ内の産生培地に接種し、４０ｍｌとした。
産生培地の成分は以下の通りである。 モラティン ０．０７％ （ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．５５％ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．２％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００３２％ ＭｎＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ０．０００１９％ ＣａＣＯ３ ４％ Ｄ−グルコース （表１に示す） コーンスティープリカー （表１に示す） （ｐＨ約７．０）
６．５℃で、６時間インキュベートした。このように調
製した種培養（４ｍｌ）を、５００ｍｌエルレンマイヤ
ー フラスコ内の産生培地に接種し、４０ｍｌとした。
産生培地の成分は以下の通りである。 モラティン ０．０７％ （ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．５５％ （ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ０．２％ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００３２％ ＭｎＳＯ４・６Ｈ２Ｏ ０．０００１９％ ＣａＣＯ３ ４％ Ｄ−グルコース （表１に示す） コーンスティープリカー （表１に示す） （ｐＨ約７．０）
【提出日】平成６年１１月１８日
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３２】フラスコを、３６．５℃及び２２０ｒｐｍ
で、４日間インキュベートした。変異株ＲＡ８，ＲＣ１
５，ＲＥ５及びＲＸ１３のＤ−リボース生産性を表１に
示す。親株、バチルス プミルスＡＴＣＣ ３１０９３
を、上記と同様な方法で培養し、その結果を同じ表に示
す。変異株ＲＥ５およびＲＸ１３は、各々親株より１．
５及び１．７倍高いＤ−リボース生産性を示した。
で、４日間インキュベートした。変異株ＲＡ８，ＲＣ１
５，ＲＥ５及びＲＸ１３のＤ−リボース生産性を表１に
示す。親株、バチルス プミルスＡＴＣＣ ３１０９３
を、上記と同様な方法で培養し、その結果を同じ表に示
す。変異株ＲＥ５およびＲＸ１３は、各々親株より１．
５及び１．７倍高いＤ−リボース生産性を示した。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】実施例３ 変異株ＲＥ５の寒天培養の一白金耳を、５００ｍｌエル
レンマイヤー フラスコ中の下記種用培地１００ｍｌに
接種した。 Ｄ−ソルビトール ２％ バクトペプトン ０．２５％ 酵母抽出物 ０．２％ Ｋ２ＨＰＯ４ ０．３％ ＫＨ２ＰＯ４ ０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％ Ｌ−フェニルアラニン ０．００２５％ Ｌ−トリプトファン ０．００２５％ Ｌ−チロシン ０．００２５％ Ｌ−バリン ０．００２５％
レンマイヤー フラスコ中の下記種用培地１００ｍｌに
接種した。 Ｄ−ソルビトール ２％ バクトペプトン ０．２５％ 酵母抽出物 ０．２％ Ｋ２ＨＰＯ４ ０．３％ ＫＨ２ＰＯ４ ０．１％ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０５％ Ｌ−フェニルアラニン ０．００２５％ Ｌ−トリプトファン ０．００２５％ Ｌ−チロシン ０．００２５％ Ｌ−バリン ０．００２５％
【提出日】平成６年１１月１８日
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３６】フラスコを３６．５℃及び２２０ｒｐｍで
９時間インキュベートし、下記に示す培地成分の種用培
地１５０ｍｌを含む２つの５００ｍｌエルレンマイヤー
フラスコに、それぞれ培養液０．１ｍｌを移した。 Ｄ−ソルビトール ４％ コーンスティープリカー ４％ ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％ Ｋ２ＨＰＯ４ ０．６％ Ｌ−フェニルアラニン ０．００５％ Ｌ−トリプトファン ０．００５％
９時間インキュベートし、下記に示す培地成分の種用培
地１５０ｍｌを含む２つの５００ｍｌエルレンマイヤー
フラスコに、それぞれ培養液０．１ｍｌを移した。 Ｄ−ソルビトール ４％ コーンスティープリカー ４％ ＫＨ２ＰＯ４ ０．２％ Ｋ２ＨＰＯ４ ０．６％ Ｌ−フェニルアラニン ０．００５％ Ｌ−トリプトファン ０．００５％
【提出日】平成６年１１月１８日
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】
【表２】
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】バチルス プミルス ＡＴＣＣ ３１０９
３及び、変異株ＲＡ８、ＲＣ１５、ＲＥ５並びにＲＸ１
３の無細胞抽出液中のＤ−グルコース デヒドロゲナー
ゼ（ＧＤＨ）、Ｄ−グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、グルコノキナーゼ（ＧＡＫ）及
び６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤ
Ｈ）の酵素活性を測定したその結果を表３に示す。変異
株ＲＥ５及びＲＸ１３は、親株よりも１０倍高いグルコ
ノキナーゼ活性を有することが見出された。
３及び、変異株ＲＡ８、ＲＣ１５、ＲＥ５並びにＲＸ１
３の無細胞抽出液中のＤ−グルコース デヒドロゲナー
ゼ（ＧＤＨ）、Ｄ−グルコース−６−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（Ｇ６ＰＤＨ）、グルコノキナーゼ（ＧＡＫ）及
び６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ（６ＰＧＤ
Ｈ）の酵素活性を測定したその結果を表３に示す。変異
株ＲＥ５及びＲＸ１３は、親株よりも１０倍高いグルコ
ノキナーゼ活性を有することが見出された。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４６】形態 実施例１に示したのと同様にして、バチルス プミルス
ＡＴＣＣ ３１０９３、及び変異株ＲＥ５を試験管
中、種培養培地にて培養した。培養５．５時間後、培養
のサンプルを引き出し、上記変異株の形態学的観察を顕
微鏡下で行った。それらの顕微鏡写真を図１に示した。
バチルス プミルス ＡＴＣＣ ３１０９３では２又は
３個の細胞からなる短鎖の形成に対比して、変異株ＲＥ
５では１０個以上の細胞からなる長いフィラメントの形
成が観察された。
ＡＴＣＣ ３１０９３、及び変異株ＲＥ５を試験管
中、種培養培地にて培養した。培養５．５時間後、培養
のサンプルを引き出し、上記変異株の形態学的観察を顕
微鏡下で行った。それらの顕微鏡写真を図１に示した。
バチルス プミルス ＡＴＣＣ ３１０９３では２又は
３個の細胞からなる短鎖の形成に対比して、変異株ＲＥ
５では１０個以上の細胞からなる長いフィラメントの形
成が観察された。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
Claims (8)
- 【請求項１】 トランスケトラーゼを欠損し、高いＤ−
リボース耐性および高いＤ−グルコノキナーゼ活性を有
し、Ｄ−グルコースからＤ−リボースを産生する能力を
有するバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物
を、Ｄ−グルコースの存在下にて培地中で培養し、得ら
れたＤ−リボースを培養液から回収することを特徴とす
る、Ｄ−リボースの製造法。 - 【請求項２】 バチルス属に属する微生物が７０ｇ／ｌ
以上、好ましくは１２０ｇ／ｌ以上の濃度のＤ−グルコ
ースを含む培養液中で成育する能力を有する請求項１に
記載の製造法。 - 【請求項３】 バチルス属に属する微生物が、０．０１
単位／mgタンパク以上のＤ−グルコノキナーゼ活性を有
する請求項１に記載の製造法。 - 【請求項４】 微生物が、バチルス ブレビス種（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス セレウス種
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス サー
キュランス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎ
ｓ）、バチルスコアグランス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃ
ｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス リケニフォルミス種
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、
バチルスメガテリウム種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａ
ｔｅｒｉｕｍ）、バチルス メセントリカス種（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ ｍｅｓｅｎｔｒｉｃｕｓ）、バチルス プ
ミルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）及びバ
チルス サブチリス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）に属する請求項１に記載の製造法。 - 【請求項５】 微生物が、バチルス プミルスＲＣ１５
（ＦＥＲＭ−ＢＰNo. ２８３４）、バチルス プミルス
ＲＥ５（ＦＥＲＭ−ＢＰ No. ２８３３）又はＲＸ１３
（ＦＥＲＭ−ＢＰ No. ２８３５）である請求項１に記
載の製造法。 - 【請求項６】 培養液中のＤ−グルコースの初期濃度
が、約５０ｇ／ｌないし３００ｇ／ｌ、好ましくは約１
００ｇ／ｌないし２５０ｇ／ｌである請求項１〜５のい
ずれか１項に記載の製造法。 - 【請求項７】 pH約４．０ないし９．０、好ましくは
５．０ないし８．０の範囲内において培養を行う請求項
１〜６のいずれか１項に記載の製造法。 - 【請求項８】 約２０ないし４５℃、好ましくは約２５
ないし４０℃の範囲内の温度で培養を行う請求項１〜７
のいずれか１項に記載の製造法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT901144279 | 1990-07-27 | ||
| EP90114427 | 1990-07-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07203982A true JPH07203982A (ja) | 1995-08-08 |
| JP3129773B2 JP3129773B2 (ja) | 2001-01-31 |
Family
ID=8204274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18720891A Expired - Fee Related JP3129773B2 (ja) | 1990-07-27 | 1991-07-26 | Ｄ−リボースの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3129773B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6190888B1 (en) | 1997-12-04 | 2001-02-20 | Roche Vitamins Inc. | Process for making riboflavin glucoside |
-
1991
- 1991-07-26 JP JP18720891A patent/JP3129773B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6190888B1 (en) | 1997-12-04 | 2001-02-20 | Roche Vitamins Inc. | Process for making riboflavin glucoside |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3129773B2 (ja) | 2001-01-31 |
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