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Publication number: DEL0021111MA
Authority: DE

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 9. Februar 1955 Bekanntgemacht am 8· März 1956

DEUTSCHES PATENTAMT

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin durch submerse Vergärung eines Stammes von Streptomyces feofaciens, der auch mit Streptomyces P-19 bezeichnet wird. Ein Muster dieses Stammes befindet sich in dem Institut für Genetik der Universität Pavia' (Italien).

Der Stamm Streptomyces feofaciens zeigt folgende Eigenschaften:

Vegetatives Mycel: reichlich, braungelb bis braun in proteinreichen Nährböden. In Mineralsalze und Kohlenhydrate enthaltenden Nährböden spärlich mit Wachstum von flachen, durchscheinenden, hellbraun gefärbten Kolonien.

Luftmycel: Wenn es überhaupt vorhanden ist, tritt es nur spärlich auf. Die Kolonie wird nicht gleichmäßig von ihm bedeckt. Das Wachstum findet vorzugsweise in konzentrischen Zonen statt. .

Sporenbildung: kommt nur mit Mühe vor. Die Sporen sind von hellbrauner bis dunkelbrauner Farbe. ,

Lösliches Pigment: bildet sich stets nur spärlich und im allgemeinen nur bei Nährböden, die auch eine Sporenbildung ermöglichen. Das Pigment weist je nach den verschiedenen Nährböden hellbraune bis dunkelbraune Färbung auf, die beim Altern der Kultur in braungrünliche Schattierung übergeht.

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In kultureller Hinsicht weist der Stamm Streptomyces feofaciens folgende Eigenschaften auf:

Synthetisches Agar (Czapeck-Dox): dünnes Mycel;

; . kein Luftmycel; keine Spiralen; keine Sporen und gewöhnlich kein Pigment, von einigen Ausnahmen

■':* abgesehen, wo. ein bräunliches Pigment in winziger Menge gebildet wird.

Pepton-Dextrose-Agar: rasches und reichliches Wachstum, ohne Luftmycel- und ohne Sporenbildung.

ίο Dextrose-Asparagin-Agar: vegetatives hellgelbes bis hellbraunes Mycel; spärliches weißes bis hellgraues Luftmycel; geringe Bildung von hellbraunen bis dunkelbraunen Sporen. Diffusierbares, braungelbes Pigment in reichlicher Menge, das beim Altern

braungrünlich wircL., , /

Dextrose-Hefeex'trälrt-Agar.: tieferes und reichlicheres Wachstum -als in-'den synthetischen Nährböden, stark gehäufte Kolonien mit braunem bis gelblichem vegetativem Mycel, spärliches Luftmycel in Form eines hellbraunen Flaums, ohne Sporenbildung. Das Pigment hebt sich farblich von dem Nährböden nicht ab und ist deshalb nicht wahrzunehmen.

Hefeextrakt-Agar: sehr rasches und reichliches Wachstum eines gelblichen Mycels ohne Sporen-

a5 bildung.

Fleischextrakt-Agar: spärliches Wachstum ohne Sporenbildung.

Nähr-Agar: entspricht dem Dextrose-Hefeextrakt-Agar. Das Wachstum ist jedoch¹ spärlicher und weist eine hellere. Farbe auf.

Kartoffel-Agar: Wachstum von breiten, flachen Kolonien mit besonders spärlichem, braunem, vegetativem Mycel. Bildung von hellbraunen, seltenen Sporen, die aber nur dann vorkommen, wenn der

.35 Nährboden auf p_H 6,2 bis 6,4 eingestellt ist.

Stärke-Agar: sehr langsames. Wachstum nach längerer Zeit, mit sehr spärlichem, farblosem, vegetativem Mycel. '■'·'' ^!' ^; '■''■ ■■' ■■■ ■ '■ -

Asparagin-Glycerin-Agar: spärliches und flaches vegetatives Mycel, nur winziges Luftmycel, sehr geringe Sporenbildung von sehr heller bis hellbrauner Färbung, die beim Altern hellgrün wird.
. Diese Eigenschaften, die keinem der bisherigen Stämme entsprechen, waren der Anlaß dafür, daß Streptomyces P-19 als ein neuer Stamm angesehen wurde, der wegen des gebildeten Pigments den Namen Streptomyces feofaciens erhielt.

Die Kulturen dieses neuen Streptomycesstammes vermögen ein Antibioticum, Tetracyclin, herzustellen, dessen breites antibakterielles Wirkungsspektrum grampositive wie auch gramnegative Bakterien um-

:r faßt. ; ■".; . . ;

■ Das antibakterielle Wirkungsspektrum des in den Streptomyces-feofaciens-Kulturen enthaltenen Antibioticums wuide auf festen Nährböden nach der Platten-Strich-Methode untersucht und hat sich gegen folgende grampositive Bakterien: Staphylococcus aureus, Streptococcus haemolyticus, Streptococcus faecalis, Sarcina lutea, Mycobacterium Cow 70 sowie die gramnegativen Bakterien: Escherichia coli, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Proteus vulgari's,

_;;. Pseudomonas aeruginosa, Klebsieila pneumoniae wirksam erwiesen.

Zur Herstellung des Antibioticums werden die Kulturen unter submerser Belüftung in Nährböden vergoren, die eine Quelle für Stickstoff, für Kohlenhydrate und Mineralsalze erhalten müssen.

Als Quelle für Stickstoff haben sich Gerstenmalzextrakt, Weizenmalzextrakt, Corn steep liquor (Maiseinweichwasser), enzymatisch^- Caseinhydrolysate, Erdnußmehl, Soyamehl und Baumwollsamenmehl als besonders'geeignet, erwiesen. . '■ ., . .^:

Von den Kohlehydratquellen geben Saccharose und Dextrose die besten Ausbeuten. Gute Ergebnisse wurden jedoch auch mit Maltose, Stärke und Dextrin erzielt.

Als Mineralsalze sind vor allem Calcium- und Ammoniumphosphat als stabilisierende Mittel, Calciumcarbonat ebenfalls als ein p_H-stabüisierendes Mittel ■und weiterhin Mg-Ionen in der üblichen Menge, Spulen von Co++-, Zn++- und Cu++-Ionen undSO^- Ionen in ausreichender Menge, wobei ihre Bedeutung für die Gärung in der angegebenen Reihenfolge abnimmt.

Die Mengenverhältnisse der verschiedenen Bestandteile' des Gärungsbodens untereinander haben, wie eine genaue Bestimmung ergab, folgende Werte:

Stickstoffquelle 1,0 bis 2,0 °/₀

Kohlenstoffquelle 1,0 - 3,0%

Phosphate 0,1 - 0,3 °/₀

Sulfate ;: 0,03 - 0,1 %

CaCO₃ 0,1 - 0,5%

Spurenelemente 0,0001 - 0,0005 °/₀.

Die genauen Mengen aller Stoffe sind in den einzelnen Beispielen angegeben.

Optimale Ausbeuten werden bei dem Gärverfahren dann erzielt, wenn der p_H-Wert am Anfang 6,6 beträgt. Im Laufe der ersten 48 bis 60 Stunden fällt er gewöhnlich auf 5,8 bis 5,4 ab, um dann gegen Ende der Gärung wieder auf 6,8 bis 7 anzusteigen;"

Entscheidend wird die Ausbeute durch die Belüftung während der Vergärung beeinflußt. Das Verhältnis zwischen der Luftmenge, die dem Gärungsbehälter zugeführt werden muß, und der darin enthaltenen Menge an Kulturflüssigkeit wechselt bei den verschiedenen Gärphasen zwischen 0,1 und 0,6.

Die Vergärung wird in der Weise durchgeführt, daß man die Gärflüssigkeit mit 3 bis 6 % des in 36 bis 48 Stunden vorgebildeten Inoculums beimpft.

An Hand der Beispiele soll die Erfindung .näher erläutert werden, ohne sie jedoch zu beschränken.

Beispiel 1

Aus praktischen Gründen wird zur Herstellung aller Kulturböden Trinkwasser verwendet.

Sporen Von Streptomyces feofaciens, welche in zwei flächen Kuchen von Asparagin, Glucose und Agar enthaltendem Nährboden vorgebildet wurden, werden durch Waschen ausgezogen und damit zwei Erlenmeyerkolben, die einen vegetativen Nährboden folgender Zusammensetzung enthalten, beimpft:

Hefeextrakt 0,5 %

Fleischextrakt 0,5 °/₀

Dextrose i,5°/n

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Dieser Nährboden hat nach dem Sterilisieren ein p_H von 7,2. Die Kolben werden bei 25° unter Schütteln bebrütet.

Nach 48 Stunden werden 0,3 °/₀ der Nährlösung in einen io-1-Gärungsbehälter eingebracht, der den oben angegebenen Nährboden enthält, wobei man nach 24 Stunden bei 25⁰ ein gutes Mycelwachstum erreicht. Der anfängliche p_H-Wert des Nährbodens fällt bis auf 6,6 ab.

Anschließend überführt man ein 5 "/„-Inoculum in einen ioo-1-Gärungsbehälter mit folgender Nährbodenzusammensetzung :

Gerstenmalzextrakt !,2⁰Zo

(NHJ₂HPO₄ 0,25%

CaCO₃ '. 0,25V

ZnSO₄ · 7 H₂O 0,0003 °/o

CuSO₄ ■ 5 H₂O 0,0001 °/₀

Saccharose 2,5 °/₀

Der p_H-Wert beträgt nach dem Sterelisieren 6,6, die Bebrütungstemperatur 25°.

Die Farbe des Nährbodens ändert sich im Laufe der Vergärung von Blaßgelb nach Orange; bei 24stündiger Bebrütungszeit zeigt das p_H und die Antibioticumausbeute folgende Werte:

Gärungszeit in Stunden	Ph	y/ccm Antibioticum
O	6,6	O
12	6,6	—
24	6,3	30
36	6,0	58
48	5,8	71
60	5,7	95
72	6,0	117
84	6,1	134
96	6,4	136
' 108	7,o	135
120	7,o	120

Zu 30 1 der nach dieser Methode hergestellten Gärflüssigkeit werden Kalkwasser mit einem io°/₀igen Gehalt an Ca(OH)₂, bis der p_H-Wert 7,8 beträgt, und dann 300 g Filterhilfe hinzugefügt. Man schüttelt die Mischung bei Raumtemperatur 15 Minuten, filtriert sie, wäscht das Filtergut mit 3 1 Wasser sorgfältig aus, suspendiert es nach nochmaliger Filtration in 5 1 Wasser und gibt 25°/₀ige Schwefelsäure zunächst rasch, bis das p_H 4,8 erreicht ist, und dann langsam hinzu, bis das pp, 1,5 beträgt.

Die Mischung wird filtriert, das Filtergut mit 5 I verdünnter Schwefelsäure wieder extrahiert, die Mischung wiederum filtriert und die vereinigten Auszüge bei 30⁰ auf 3 1 eingeengt. Der eingeengten Lösung.gibt man dann 150 ecm n-Butanol und 800 g NaCl hinzu, rührt die Masse 15 Minuten, läßt sie über Nacht im Kühlschrank stehen, saugt die gebildeten Tetracyclin-Hydrochlorid-Kristalle auf einem Vakuumfilter ab, wäscht sie mit einer kleinen Menge Methanol oder wasserfreiem Äthyläther und trocknet sie im Vakuum.

Beispiel 2

Die nach Beispiel 1 erhaltene Gärflüssigkeit wurde mit Salzsäure auf p_H 1,5 bis 2 angesäuert, vom Mycel abfiltriert, das Filtrat mit 10% Ca(OH)₂ enthaltendem Kalkwasser versetzt. und abgesaugt, der Filterrückstand in Wasser suspendiert, die Suspension mit Oxalsäure bis auf p_H 3,5 angesäuert und die Masse 15 Minuten lang gut durchgerührt und filtriert. Dann wird der Filterrückstand mit Wasser gut durchgewaschen, die Mischung wiederum filtriert und die vereinigten Auszüge mit n-Butanol und NaCl versetzt, wie es in den vorhergehenden Beispielen angegeben ist.

Beispiel 3

Die nach Beispiel 1 erhaltene Gärflüssigkeit wird mit 25°/₀iger Schwefelsäure auf p_H 1,2 bis 2 angesäuert, vom Mycel abfiltriert, das Filtrat mit ^x/₂₀ des Volumens n-Butanol und mit NaCl bis zu einem Gehalt von 30% versetzt. Man rührt die Masse bis zur vollständigen Lösung; extrahiert danach mit mehreren Portionen n-Butanol, läßt die vereinigten Butanolauszüge über Nacht im Kühlschrank stehen und arbeitet die ausgeschiedenen Kristalle, wie es in den vorhergehenden Beispielen angegeben ist, weiter auf.

Claims

PATENTANSPRUCH:

Die Verwendung eines Stammes von Streptomyces feofaciens zur gärtechnischen Herstellung von Tetracyclin durch Züchtung in üblichen Nährlösungen unter submersen Bedingungen und Gewinnung des Antibioticums durch Extraktion der vom Mycel befreiten Nährlösung und gegebenenfalls Überführung in das Hydrochloridsalz.

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