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Publication number: DEF0014911MA
Authority: DE

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BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

Tag der Anmeldung: 8. Juni 1954 Bekanntgemacht am: 1. September 1955

DEUTSCHES PATENTAMT

Unter den antibiotischen Substanzen, die in den

letzten Jahren in die Therapie eingeführt wurden, hat das 5-rOxytetracyclin (»Terramycin«·) infolge seines breiten Wirkungsspektrums eine besondere Bedeutung

erlangt. . ■ . . ·

Das 5-Oxytetracyclin wird hergestellt durch Züchtung eines speziellen Streptomycesstammes, der in Amerika aufgefunden und als Streptomyces rimosus bezeichnet wurde (vgl. die USA.-Patentschrift 2 516 080 ίο und die deutsche Patentschrift 862647).

Es ist nun gelungen, aus einer asiatischen Bodenprobe einen Streptomycetenstamm zu isolieren, der unter geeigneten Züchtungsbedingungen in guter Ausbeute das 5-Oxytetracyclin (»Terramycin«) bildet und der von dem bekannten Streptomyces rimosus sowohl physiologisch als auch morphologisch verschieden ist.

Dieser Stamm zeichnet sich durch rasches Wachs^ tum und rasche Antibioticabildung bei besonderer Anspruchslosigkeit hinsichtlich des Nährsubstrates aus, so daß bei der Erzeugung des Antibioticums mit sehr billigen Nährböden gearbeitet werden kann.

Der neu aufgefundene Stamm wird in der Sammlung der Patentinhaberin als Stamm 998 geführt und im folgenden als Streptomyces nov. spec. 998 bezeichnet.

In Anlehnung an die Bestimmungstafeln des Werkes von Bergey »Manual of Determinative

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Bacteriology«, 6. Auflage, Seite 929 bis 933 sind in der Tabelle τ die Kulturcharakteristiken des Streptomycesstanimes nov. spec. 998 zusammengestellt.

Tabelle 2 zeigt die charakteristischen Unterschiede zwischen dem Stamm 998 und dem bekannten Streptomycin rimosus.

Die Züchtung des Streptomyces nov. spec. 998 zur Gewinnung von 5-Oxy tetracyclin erfolgt in der für die Antibioticaherstellung üblichen Weise, d. h. durch Ferment ierung unter Kühren und Belüftung auf einem Nährboden, der eine Kohlehydratquclle, z. B. Zucker, Stärke oder Glycerin, und eine anorganische oder organische Stickstoffquelle, z. B. Sojabohnenmehl, Distillers solubles, Cornsteep liquor, weiterhin Mineralsalze und Antischaummittel, enthält. Nach beendet cm Wachstum wird das Mycel abgetrennt und das Antibioticum in an sich bekannter Weise aus dem Kulturliltrat gewonnen.

Beispiel 1

Gewinnung des Impfmaterials:
Zur Anzucht des Impfmaterials dient der nachfolgend aufgeführte Nährboden:

Cornsteep liquor 10 g

Stärke 10 g

NaCl 5 g

CaCO., iog

Aq. (lest 1000 ecm

100 bzw. 50c ecm dieses Nährbodens werden nach Einstellen auf pn 7 in 300 ecm — bzw. 2000 ecm — Eiienmeyerkolben abgefüllt und 30 Minuten bei 127⁰ sterilisiert. Nach dem Abkühlen erfolgt die Beimpfung mit der Abschwemmung einer Schrägagarkultur des Stammes 998. Die Kultivierung erfolgt bei 25⁰ auf einer Schüttehnaschine mit 200 U/min.

Von dem Nährboden folgender Zusammensetzung:

Sojaschrot 15 g

Cornsteep liquor 15 g

Stärke 15 g

(ΝΗ,ΐ,ΙΓΡΟ, 2 g

KH,, PO., 2 g

MrSO₄-H₈O 0,25 g

CaCO., 5 g

Aq. dest 1000 ecm

werden 10 1 in einen 30 1 fassenden Fermenter eingefülll, der pu-Wert mit Natronlauge auf 7,2 eingestellt und 30 Minuten bei 127⁰ autoklaviert. Nach dem Abkühlen (p„ 6,8) erfolgt die Beimpfung mit einer 2 Tage alten Schüttelkultur wie unter Absatz 1 beschrieben, wobei die Impfmenge etwa 1 bis 2°/₀ des Fermentierinhaltes beträgt. Nach kräftigem Belüften unter ständigem Rühren (460 U/min) enthält die Nährlösung nach 48stündiger Kulturdauer etwa 500 bis 600 γ 5-Oxytetracyclinhydrochlorid/ccm.

Die Kulturlösung wird nach Abtrennung des Mycels gekühlt und mit 250 g Kochsalz je Liter versetzt. Die Extraktion der 8-1-Lösung erfolgt bei p„ 8 mit 40% des Volumens n-Butanol. Die extrahierte Kulturlösung ist praktisch inaktiv. Zur Entfernung von Begleitstoffen wird das Butanol zweimal mit 300 ecm destilliertem Wasser gewaschen und dann bei 50⁰ Badtemperatur im Vakuum auf ¹Z₁₀ des Volumens eingeengt. Der ausgefallene inaktive Niederschlag wird abgetrennt und die butanolische Lösung fünfmal mit je 50 ecm n/10 Salzsäure durchgewaschen. Danach wird die saure wäßrige Phase durch Zusatz eines Ionenaustauschers (z. B. Lewatit M I) auf p_n 3,5 eingestellt und mit Hilfe der Gefriertrocknung vom Wasser befreit. Die Ausbeute beträgt 6 g mit einer Aktivität von 500 γ s-Oxytetracyclinhydrochlorid/mg. Aus diesem Material läßt sich durch Behandlung mit methanolischer Salzsäure das kristallisierte 5-Oxytetracyclinhydrochlorid gewinnen.

Beispiel 2

40 1 einer gemäß Beispiel 1 gewonnenen und vom Mycel befreiten Kulturlösung werden gekühlt und mit 250 g Kochsalz je Liter versetzt. Die Aktivität entspricht einem Gehalt von 600 γ 5-Oxytetracyclinhydrochlorid/ccm. Nach Extraktion mit 16 1 n-Butanol enthält die Kulturlösung nur noch 15 y/cem. Die butanolische Lösung wird mit zweimal 2 1 destilliertem Wasser gewaschen und im Vakuum bei 50° Badtemperatur auf ¹Z₂₀ des Volumens eingeengt. Das ausgefallene inaktive Material wird abgetrennt. Nach Zugabe von 1,5 1 peroxydfreiem Äther fällt schwach aktives Material aus. Durch weitere 6 1 Äther erhält man 24 g einer Fällung, die ~ 700 γ 5-Oxytetracyclinhydrochlorid/mg enthält. Aus diesem Produkt erhält man durch Behandlung mit methanolischer Salzsäure nach bekannten Verfahren das kristallisierte 5-Oxytetracyclinhydrochlorid.

Beispiel 3

Gewinnung des Impfmaterials:

Zur Aufzucht des Impfmaterials dient der nachfolgend aufgeführte Nährboden:

Cornsteep liquor 1 °/₀

Rohrzucker 3 °/₀

Maiskeimlingsmehl 1 °/o

(NH₄J₂SO₄ 0,3 %

ZnSO₄-7 H.,0 0,003%

CaCO₃ 0,4 %.

Je 400 ecm dieses Nährbodens werden in i-1-Erlenmeyerkolben abgefüllt, 45 Minuten bei 121° sterilisiert, nach dem Abkühlen (30°) mit der Abschwemmung einer 10 bis 14 Tage alten, unversporten Haferschrägagarkultur beimpft und 30 Stunden bei 26⁰ und 200 U/min geschüttelt.

Von dem gleichen, für das Impfmaterial benutzten Nährboden werden 10 1 in einen 30 1 fassenden Fermenter eingefüllt und ohne besondere Einstellung des p_n-Wertes 60 Minuten bei 121⁰ autoklaviert. Nach dem Abkühlen zeigt die Lösung einen p_H-Wert von 7. Nun erfolgt die Beimpfung mit 200 ecm des oben beschriebenen Impfmaterials. Nach göstündiger Kulturdauer bei 29⁰ unter Rühren (400 U/min) und Luftzufuhr (50 lLuft je Liter Flüssigkeit je Stunde), wobei der p_n-Wert innerhalb der Grenzen von 6,3 bis 7 gehalten werden muß, enthält die Kulturlösung nach Säurebehandlung 16207/ccm 5-Oxy tetracyclin.

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Kulturcharaktenstica des Streptomyces nov. spec. 998 Tabelle 1

Nährboden

Glukose-Asparagin-
Agar

Gelatine-Platten

Lackmus-Milch

Glukose-Agar

Nähr-Agar

35	Kartoffel scheibe
40	Möhren scheibe
45	Calcium- Malat-Agar
50	Stärke-Agar

Synth.

Nährboden

Cellulose-Agar

Nitrat- .
Nährlösung

Wachstumsgrad

mäßig, Kolonie flach, dem Nährboden anliegend, bei 37⁰ milchigweiß gefärbt, bei 25⁰ dagegen kremfarben und besseres Wachstum

sehr spärlich, Kolonie untergetaucht

gut, teilweise Deckenbildung

sehr gut, bei Zimmertemperatur schwarzbraun gefärbt, bei 37⁰ eine noch intensivere Dunkelfärbung

bei 20° Wachstum mäßig, milchigweiß gefärbte Kolonien. Gutes Wachstum bei 37⁰, wobei die Kolonien dunkelbraun-schwarzbraun gefärbt sind

gut — sehr gut, bei Zimmertemperatur graubraun, bei 37° dunkelbraun bis schwarzbraun gefärbt. Kolonienoberfläche in beiden
Fällen gekräuselt

gut, bei Zimmertemperatur braun, bei 37⁰ dunkelbraun gefärbte Kolonien

schwach bei 20°, schmutzigbraun gefärbt, bei 30⁰ jedoch sehr gutes Wachstum und intensiv dunkelbraun gefärbt

schwach, sowohl bei 20° als auch bei 37°. Kolonie in beiden Fällen milchigweiß bis kremfarben, Oberfläche glatt

gut, bei Zimmertemperatur mittelbraun-rotbraun, bei 37° graubraun gefärbt

nur ganz schwaches Wachstum, ■ milchigweiß

gut, flockig, untergetaucht, bei 37° besser als bei Zimmertemperatur

Luftmycel und Sporen

fehlen

fehlen fehlen

fehlen

fehlen fehlen

fehlen

fehlen fehlen

Lösl. Pigment

fehlt

fehlt
fehlt

dunkelbraun

fehlt

humusfarben

fehlt

dunkelbraun,
jedoch nur bei
37⁰ gebildet

gelbbraun bis
humusfarben

Bemerkungen

Kolonie zeigt nie Risse oder Sprünge

Gelatineverflüssigung mäßig

starke Koagulation und 80 anschließende Peptonisierung, wobei der letztere Vorgang bei 20° bedeutend schneller verläuft als bei 37⁰ 85

Stärkehydrolyse in beiden Fällen gleich stark, sehr stark und 115 äußerst rasch

kein Celluloseabbau

Nitratreduktion fehlt 125

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Tabelle 2
Unterschiede zwischen Strept. rimosus und Strept. nov. spec. 998

Nithrbodfii

Strept. rimosus Strept. nov. spec. 998

Lackmus-Milch

Stärke-Agar

Calcium-Malal-Agar

_ao Glukose-Asparagin-Agar

Gelatine-Nährboden
Magennilch-Agar ..

Nitrat-Nährlösung ..
Synth. Nährboden ...

Sporenbildung

Farbstof'fbildung
Färbung der Kolonie.

Milch wird weder hydrolysiert noch peptonisiert

Stärkehydrolyse bei Zimmertemperatur wesentlich stärker als bei

Verhältnis Kolonie- 0 zu Hydrolysezonen-

bei Zimmertemperatur 28 : bei 37° 30 :

kein lösliches Pigment
Luftmycel und Sporen vorhanden

Luftmycel vorhanden

Kaseinabbau bei 37⁰ besser als bei Zimmertemperatur

Verhältnis Kolonie-0 zu Zonen-0 bei Zimmertemperatur 20 : bei 37° 20 :

Nitratreduktion positiv
keine Farbstoffproduktion

in einigen Fällen vorhanden

spärlich — schwachgelb

gelb bis ocker, jedoch nie dunkelbraun oder schwarzbraun

Milch wird nach Koagulation peptonisiert

Stärkehydrolyse bei Zimmertemperatur

und 37⁰ gleich stark
Verhältnis Kolonie- 0 zu Zonen- 0

bei Zimmertemperatur 19 : 50
bei 37° 20 : 54

dunkelbraunes humusfarbenes,
lösliches Pigment

Luftmycel und Sporen fehlen

kein Luftmycel vorhanden

Kaseinabbau bei Zimmertemperatur

besser als bei 37⁰
Verhältnis Kolonie-0 zu Zonen-0
bei Zimmertemperatur 24 : 52
bei 37° 23 : 29

Nitratreduktion negativ

bei 37⁰ dunkelbraune Farbstoffbildung

auf keinem der verwendeten Nährböden vorhanden

dunkelbraun-humusfarben

in zahlreichen Fällen dunkelbraun bis tiefschwarzbraun gefärbt, besonders intensiv bei 37⁰

Bei der Säurebehandlung wird die Kulturlösung mit Salzsäure auf P]| 2 eingestellt, 30 Minuten gerührt und danach das Mycel abfiltriert.

Zur Aufarbeitung wird die vom Mycel befreite, vorher aufgeschlossene Kulturlösung mit Salzsäure auf einen p_H-Wert von 1,5 bis 1,8 eingestellt; 37,5 ecm 2o"/₀iger Eisen(IIl)-chloridlösung werden zugesetzt und nach 5 Minuten 440 ecm einer 5%igen NatriumdodecylsiilfaÜösung unter Rühren eingetragen. Nach kurzer Stehzeit wird der entstandene Niederschlag ab/entrifugierl. Im Anschluß daran suspendiert man den Niederschlag in 250 ecm n/2 Salzsäure, fügt 75 g des Tetranatriumsalzes der Diaminoäthylentetraessigsäure hinzu, stellt den ρ,,-Wert der Suspension auf 2 ein, setzt 50 g Kochsalz hinzu und versetzt mit 450 ecm Hutanol.

Nach inniger Durchmischung werden die Schichten getrennt, und die wäßrige Phase wird mit 50 ecm Butanol naeliextrahiert. Die Butanolphase wird mit 25 ecm 2O^u/„iger Kochsalzlösung in n/100 Salzsäure naehgewaschen und der Butanolextrakt im Vakuum

bei einer 40° nicht übersteigenden Temperatur bis zur Hälfte eingeengt, der entstandene Niederschlag abgeschleudert, mit Butanol ausgewaschen, das Waschbutanol zur Hauptmenge gegeben und zur Trockne gebracht. no

Der trockene Butanolrückstand wird in 100 ecm Methanol gelöst, und in die methanolische Lösung werden unter Kühlen und Rühren langsam 15 ecm konzentrierte Salzsäure eingetragen. Nach mehrstündigem Stehen wird der Kristallbrei abgesaugt und mit Isopropylalkohol und Äther naehgewaschen.

Man erhält 15 g kristallines 5-Oxytetracyclinhydrochlorid.

Claims

Patentanspruch: iao

Die Verwendung des Stammes Streptomyces nov. spec. 998 zur Herstellung von 5-Oxytetracyclin durch Züchtung in wäßriger Nährlösung unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise in Submerskultur und Gewinnung des 5-Oxytetracyclins aus der Kulturlösung in an sich bekannter Weise.

© 509 546/80 8.