DE956098C

DE956098C - Verfahren zur Herstellung zinkreicher Insulin-Komplexverbindungen

Info

Publication number: DE956098C
Application number: DEW13271A
Authority: DE
Inventors: Dr Dr Guenther Weitzel
Original assignee: GUENTHER WEITZEL DR DR
Current assignee: GUENTHER WEITZEL DR DR
Priority date: 1954-02-18
Filing date: 1954-02-18
Publication date: 1957-01-10

Description

Verfahren zur Herstellung zinkreicher Insulin-Komplexverbindungen Unter »zinkreichen Insulin-Komplexverbindungen« sollen im folgenden solche mit einem Zinkgehalt von mehr als i % verstanden werden. Kristallinische Zink-Insuline mit bis zu 2°/o Zink sind bereits bekannt: Man erhält sie z. B. dadurch, daß zinkarme Insulinkristalle in einer Acetatpufferlösung, der etwas Zn CI2 zugesetzt ist, bei neutralem pA suspendiert werden. Hierbei dürfen jedoch keine zinkaffinen Substanzen, z. B. Phosphat-, Citrat-, Malationen, anwesend sein, da diese die Aufnahme des Zinks durch das Insulin verhindern.
Es wurde nun gefunden, daß man neue zinkreiche Insulin-Komplexverbindungen erhalten kann, indem man Insulin mit Zink-Komplexverbindungen von Aminosäuren mit hoher Zinkaffinität, z. B. Histidin, Kynurenin, Arginin und Cystein, umsetzt.
Man geht von einem möglichst kristallinen, sta-. bilen Zink-Komplex aus, in welchem das Zink mit zwei oder drei Liganden koordinativ fest verbunden ist. Nun ersetzt man einen der Liganden durch Insulin, so daß ein gemischter Zink-Komplex der schematischen Zusammensetzung Insulin-Zn-R entsteht.
Man geht dabei z. B. so vor, daß man in die wäßrige Lösung des -betreffenden Zink-Komplexes bei px 6 bis 8 amorphes oder kristallinisches zinkarmes Insulin einbringt, worauf spontan der Eintritt des Insulins in den Zink-Komplex erfolgt. Dabei ist es zweckmäßig, den Zink-Komplex, von dem man ausgeht, in erheblichem molarem Überschuß gegenüber dem Insulin einzusetzen.
In-den so gewonnenen InsulinJZn-R-V#erbindungen befindet sich der Rest R wie das Insulin in fester koordinativer Bindung am Zink; berechnet man den Zinkgehalt auf den Insulinanteil, so erge')en sich je nach den angewandten Versuchsbedingungen Präparate mit Zinkgehalten von etwa- i bis 2,50/0.
Arbeitet man z. B. mit a-Aminosäuren., etwa mit Histidin, so läuft schematisch- folgende Reaktion ab: Histidin-Zn-Histidin -I- Insulin> Insulin-Zink-Histidin + Histidin.
Der Beweis, daß es sich bei dem erhaltenen Produkt um einen Insulin-Zink-Histidin-Komplex handelt, läßt sich auf Grund des gegenüber dem Ausgangsinsulin erhöhten Zink- und N-Gehaltes sowie durch den papierchromatographischen Nachweis des in der neuen Verbindung enthaltenen Histidins führen.
Viele Substanzen, die als starke und stärkste Zink-Komplexbildner bekannt sind, eignen sich besonders gut für-das neue Verfahren. Daraus ergibt sich ein wesentlicher Unterschied zu den bisher bekannten Methoden (s. o.) : Das neue Verfahren gestattet die Gewinnung zinkreicher Insulinpräparate trotz Gegenwart und mit Hilfe zinkaffiner Substanzen.
Die Festigkeit der in den. gewonnenen Insulin-Zn-R-Verbindungen vorliegenden Chelatbindungen geht unter anderem daraus hervor, daß trotz intensiven Waschens mit Wasser nur Spuren von Zink oder des. Liganden R daraus zu entfernen sind. Als qualitive und quantitative Nachweismethoden für den in den Insulin-Zn-R-Präparaten enthaltenden Liganden R sind geeignet: 1. Papierchromatographie im sauren Medium, z. B. Insulin-Zink-Histidin, Insulin-Zink-Arginin; 2. Kolorimetrie des sauer gelösten Präparates, z. B. bei Insulin-Zink-Xanthurensäure, Insulin-Zink-Kynurensäure; 3. N-Analyse, falls der Ligand der N-Gehalt des Ausgangsinsulins verändert, z. B. bei Insulin-Zink-Histidin, Insulin-Zink-Arginin.
Die durch das beschriebene Verfahren erhaltenen Präparate sind in Wasser bei neutralem pH sehr schwer löslich; in saurem Mittel dissoziieren sie wie die meisten Zink-Komplexe. Injiziert man sie intravenös, so tritt die blutzuckersenkende Wirkung praktisch ebenso rasch wie bei gewöhnlichem Insulin ein. Bei intramuskulärer oder subcutaner Injektion ist die Wirkung jedoch mehr oder weniger stark verzögert.
Mit dem vorliegenden Verfahren gelingt es, einen gemischten Zink-Komplex des Insulins herzustellen, in welchem sich der betreffende Ligand in fester Bindung befindet. Dadurch, daß die Valenzen des Zinks teils im Insulin, teils von dem betreffenden Liganden abgesättigt werden, unterscheiden sich die beanspruchten Produkte von den bisherigen Zink-Insulin-Verbii.,iungen, in welchen sämtliche Valenzen des Zinks vom Insulin selbst abgesättigt sind. In den neuen Insulin-Zink-Präparaten liegen zumeist Komplexe vor, die einen geringeren Dissoziationsgrad besitzen als gewöhnliches Zink-Insulin. Für das Verhalten im lebenden Gewebe hat die Geschwindigkeit des Komplexzerfalls bekanntlich große Bedeutung. Ein weiterer Fortschritt des Verfahrens liegt darin, daß z. B. Löslichkeit und Eigen-p11, je nach der Art des als Zink-Komplex eingeführten, stark zinkaffinen Liganden, variiert werden können, denn man kann z. B. stark basische, aliphatische oder cyclische, von Aminosäuren sich ableitende Liganden fest mit Insulin verknüpfen. Beispiels Insulin-Zink-Kynurenin 2o,8 mg (o,i mMol) d, 1-Kynurenin löst man in Acetatpuffer und gibt 4m9 Zink hinzu. Nach Stehenlassen über Nacht filtriert man von einem etwaigen Niederschlag ab, stellt den PH auf 6,8 ein und gibt 2omg kristallines Insulin mit einem Zinkgehalt von 0,3 % zu. Nach 2stündigem gelindem Schütteln, Abzentrifugieren und Waschen mit Wasser, Aceton und Äther trocknet man das Verfahrensprodukt im Exsikkator. Die Ausbeute beträgt 16,9 mg. Der Zinkgehalt des erhaltenen Insialin-Zink-Kynurenins beträgt 1,8°/o. Papderchromatographisch beträgt sein Kynureningehalt etwa 5 0/0. Beispiel'2 Insulin-Zink-Histidin 30 mg kristallisiertes Zink-Histidin (Zinkgehalt 15 0/c,) löst man in 3ö ccm Wasser und gibt Zoo mg Insulin (Zinkgehalt o,2 bis o,5 °/o) hinzu. Nach 2stündigem gelindem Aufwirbeln der entstandenen Suspension zentrifugiert man ab, wäscht zweimal finit Wasser, einmal mit Aceton und Äther und trocknet im Vakuum. Das erhaltene Insulin-Zink-Histidin besitzt einen Zinkgehalt von 1,5 bis 2% und einen im Vergleich. zum Ausgangsinsulin um t 1/o oder mehr erhöhten N-Gehalt.

Claims

PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung zinkreicher Insulin-Komplexverbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man Insulin mit Zink-Komplexverhindungen von Aminosäuren mit hoher Zinkaffinität, z. B. Histidin, Kynurenin, Arginin und Cystein; umsetzt. In Betracht gezogene Druckschriften: Deutsche Patentanmeldung N4671 IVa/3oh.