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Verfahren zur Reinigung von Vitamin-B12-Konzentraten
Die Erfindung
betrifft ein Verfahren zur Reinigung von Konzentraten, die Vitamine der B12-Gruppe
enthalten, mittels Lösungen halogenierter Phenole in geeigneten Lösungsmitteln.
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Konzentrate, die die Vitamine der Bj2-Gruppe enthalten, werden bekanntlich
nach. verschiedenen Methoden enthalten. Auch zur Reinigung derartiger Konzentrate
sind bereits die verschiedensten Verfahren bekanntgeworden. Eines von diesen macht
von der Beobachtung Gebrauch, daß antianämishe Stoffe in Phenol löslich sind und
so durch Ausschütteln mit Phenol gereinigt werden können. Bei einem neueren Verfahren
wird in der Weise vorgegangen, daß die Vitamin-Bl2;haltige Lösung bei einem pH-Wert
von 1,0 mit einem alkylierten Phenol, vorzugsweise Amylphenol, extrahiert wird.
Ein weiteres Verfahren beruht darauf, daß ein Vitamin B12haltiges wäßriges Konzentrat
mit einer Mischung von Phenol und einem »apolaren« Lösungsmittel, wie Benzol, Äther,
Tetrachlorkohlenstoff oder Chl;oroform, ausgeschüttelt wird. Schließlich wurde an
Stelle von Phenol auch Kresol, also gleichfalls ein atkyhertes Phenol, zur Extraktion
von Vitaminen der Bl2-Gruppe aus wäßrigen Lösungen verwendet.
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Die erwähnten Verfahren sind noch mit gewissen Nachteilen behaftet,
die erfindungsgemäß dadurch überwunden werden können, daß an Stelle von Phenyl oder
von alkylierten Phenolen halogenierte Phenole, gelöst in gewissen mit Wasser nicht
mischbaren Solventien, wie z. B. in gewissen Kohlenwasserstoffen oder halogenierten
Kolhlenwasserstoffen oder Schwefelkohlenstoff, zur Extraktion der Vitamine der Bl2-Gruppe
aus einer wäßrigen Phase zur Verwendung kommen. Unter »gewissen Solventien« werden
erfindungsgemäß solche Flüssig-
keiten verstanden, die den obengenannten
Stoffklassen angehören und ein genügendes Lösungsvermögen für halogenierte Phenole
besitzen. In der nachstehenden Tabelle sind die Zahlen für die Verteilungskoeffizienten
von Vitamin B12 im Lösungsmittelpaar Wasser/Phenolkörper + Trichloräthylen angeführt.
Diese Zahlen gelten für reines (einheitliches) Vitamin B12 (Cyanocobalamin).
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Selbstverständlich verschieben sich diese Zahlen, und zwar in proportionaler
Weise, wenn Mischungen verschiedener Vitamin-B12-Faktoren vorliegen, wie dies z.
B. bei Extrakten aus Faulschlamm der Fall ist. Die sehr beträchtliche und überraschende
Überlegenheit gegenüber Phenol und Kresolen gilt vor allem, wie aus der folgenden
Tabelle zu ersehen ist, für soilohe halogenierte Phenole, die das Halogen in Meta-
und Para-Steilung enthalten, wie z. B. m-Chlorphenol und p-Chlorphenol.
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Aus der Tabelle ist zu entnehmen, daß in Ortho-Stellung einfach halogenierte
Phenole ein schwaches Lösungsvermögen, in Ortho-Stellung zweifach halogenierte Phenole
kein Lösungsvermögen für Vitamine der Bl2-Gruppe besitzen; ferner, daß in Para-Stellung
halogenierte Phenole im allgemeinen ein besseres Lösungsvermögen für Vitamine der
B,2-Gruppe haben als nicht hailogenierte Phenole sowie daß ein Halogen in Meta-Stelllung
das Lösungsvermögen für Vitamine der Bl2-Gruppe außerordentlich steigern kann. Hallogenierung
der Kresole steigert im allgemeinen das Lösungsvermögen für Vitamine der Bl2-Gruppe
beträchtlich (hier werden vor allem die molaren Konzentrationen gemeint) ; einen
Ausnahmefall bildet 6-Chlor-2-kresol, das kein Lösungsvermögen für Vitamine der
Bl2-Gruppe besitzt.
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Die Überlegenheit von halogenierten Phenolen, vor allem gegenüber
Phenol, zeigt sich besonders bei Extraktionen mit kleinen Volumina an der organischen
Phase. So muß z. B. bei einer Extraktion mit 1/5 Volumen an Extraktionsmittel, z.
B. Trichloräthylen + Phenolkörper, das letztere 19,3% Phenol, jedoch nur 9,1%6-Chlor-3-kresol,
10,3%-p-Chlorphenol oder 7,7 0/o m-Chlorphenol enthalten, wenn der Verteilungskoeffizient
für die Vitamine der B,2-Gruppe den Wert I besitzen soll.
| Phenolgehalt in Trichloräthylen, bei dem der Verteilungs- |
| S t e l l u n g koeffizient für B,2 etwa I ist |
| Lfd. |
| in Mol/l in % |
| des des |
| Phenolderivat |
| Nr. |
| Halogens Methyls |
| Volumverhältnis wäss./org. Volumverhältnis wäss./org. |
| Phase Phase |
| 1 : 1 5 : 1 10 : 1 1 : 1 5 : 1 10 : 1 |
| I Phenol 0,95 2,05 3,3 8,93 I9,3 31,0 |
| 2 o-Chlorphenol ...........| ortho 2,24 28,8 |
| 3 m-Chlorphenol ..........| meta 0,42 o,6 0,76 5,4 7,7 9,8 |
| 4 p-Chlorphenol............. para 0,6 0,8 1,12 7,7 10,3 14,4 |
| 5 2,5-Dichlorphenol......... ortho 1,67 27,2 |
| meta In gesättigter Lösung keine Extrahierbarkeit von |
| 6 2, 6-Dichlorphenol ....| ortho Vitamin B12 |
| ortho |
| 7 2,4-Dichlorphenol......... ortho |
| para 1,76 27,5 |
| 8 2, 4, 6-Trichlorphenol .....| ortho - In gesättigter Lösung
keine Extrahierbarkeit von |
| ortho Vitamin B,2 |
| para |
| 9 | 2, 4, 6-Trichbromphenol ...| ortho | | In gesättigter Lösung
keine Extrahierbarkeit von |
| ortho Vitamin B,2 |
| para |
| 10 o-Kresol ................. ortho 1,56 16,8 |
| 11 m-Kresol ................ meta 0,94 10,1 |
| r2 | p-Kresol para o,86 9,3 |
| 13 | 6-Chlor-3-kresol ..........| para | meta | 0,64 | 0,64
| 0,64 | 9,1 | 9,1 | 9,1 |
| 14 6-Chlor-2-kresol .........| meta ortho In gesättigter Lösung
keine Extrahierbarkeit von |
| Vitamin B12 |
| 15 5-Chlor-2-kresol .......... para ortho 1,02 14,6 |
Eine noch größere Überlegenheit der halogenierten Phenole gegeniiber z. B. dem Phenol
ergibt sich bei Extraktionen mit l/lo Volumen an dem Extraktionsmittel. Man benötigt
dann z. B. nur 14,4% an p-Chlorphenol in Trichloräthylen gegenüber der doppelten
Menge an Phenol (31,0%). Bezieht man die Verhältnisse auf molare Konzentrationen,
so kommt, wie die Tabelle zeigt, die Überlegenheit gewisser halogenierter Phenole
noch deutlicher zum Ausdruck. Das rasche Ansteigen des
Bedarfes
an Phenol mit der Verringerung des Volumens an Extraktionsmitteln ist auf die verhältnismäßig
hohe Löslichkeit von Phenol in Wasser zurückzuführen. Das Phenol verteilt sich zwischen
Wasser und Phenolträger, z. B. Trichloräthylen, und je größer das relative Volumen
der wäßrilgen Phase ist, desto mehr Phenol geht für die Extraktion verloren. Diese
Erscheinung tritt bei halogenierten Phenolen nur in einem sehr geringen Maße auf,
was auf die geringe Löslichkeit dieser Stoffe in Wasser zurückzuführen ist. So steigt
z. B. der Bedarf an 6-Cihlor-3-kresdl mit Verringerung des Volumens an Extraktionsmittel
praktisch gar nicht an, was aus der Tabelle zu ersehen ist.
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Die bei diesem Extraktionsprozeß anzuwendenden Konzentrationen an
halogenierten Phenolen in der organischen Phase sind aus der oben angeführten Tabelle
ersichtlidh.
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Die Extraktion der wäßrigen Phase mit den oben angeführten Lösungsmittelgemischen
kann in Scheidetridhtern bzw. nach dem Gegenstromprinzip in Scheidetrichterbatterien
oder in Solvent-Zentrifugal-Extra'ktoren durchgeführt werden. Sie kann aber auch
mit Hi!lfe einer Säule, die mit feuchtem Silicagel gefüllt ist, vorgenommen werden.
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Lösungen halogenierter Penole in gewissen Kohlenwasserstoffen bzw.
halogenierten Kohlenwasserstoffen und anderen Solventien, wie z. B.
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Trichloräthylen, Tetrachlorkohlenstoff, Schwefelkohlenstoff, Chloroform,
C'hlorbenzol, Benzol, Toluol usw., können vorteilhafterweise auch zur Extraktion
der Vitamine der B12-Gruppe aus festen Stoffen dienen. Diese Extraktion kann durch
Verrühren des festen, die Vitamine der Bt2-Gruppe enthaltenden Stoffes mit Lösungen
halogenierter Phenole und Abtrennen der flüssigen Phase oder aber durch fraktionierte
Perkolation bewerkstelligt werden. Als Perlçolierungslmittel eignet sich z. B. eine
5- bis Is°/oige Lösung von p-Chlorphenol in Trichlorätlhylen, Tetrachlorkohlenstoff,
Benzol, Toluol u. dgl.
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Zur weiteren Entfernung von Verunreinigungen werden dieHalogenphenolextrakte,
die dieVitamine der Bt2-Gruppe enthalten, mit Natriumbicarbonatlösung oder einer
geeigneten Pufferlösung und schließlich gründlich mit Wasser gewaschen, Die in der
geschilderten Weise gereinigten Extrakte können mit Vorteil auf kristallisiertes
Vitamin B,2 verarbeitet werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren soll an Hand von einigen Beispielen
noch näher erläutert werden.
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Beispiel I 100 ccm eines rotbraungefärbten Vitamin-B,,-Konzentrates,
das aus Faulschlamm gewonnen wurde und nach dem mikrobiologischen Test mit der E.coli-Mutante
II3-3 30 Gamma Vitamin B,2 je ccm, also insgesamt 3 mg enthält, wird auf -Pn 7,0
gebracht und mit 20, IO und IO ccm einer 2oo/oigen Lösung von p-Chlorphenol in Trichloräthylen
extrahiert. Die dunkelroten Extrchte werden vereinigt und einmal mit IO ccm einer
5%igen Natriumbicarbonatlösung und anschließend noch dreimal mit je IO ccm Wasser
gewaschen. Der so gereinigte Extrakt von 40 ccm kann mit Vorteil zur weiteren Reinigung
und Gewinnung von kristallisiertem Vitamin B12 Verwendung finden.
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Beispiel 2 I36 ccm eines wäßrigen Vitamin-Bl2-Konzentrates, das aus
Faulschlamm gewonnen wurde und 40 Gamma Vitamin B12 je ccm enthält, wird auf Ps
7,0 gebracht und mit I,4 g Kieselgur und 78 g Ammoniumsulfat versetzt. Nach dem
Lösen des Ammoniumsulfates fällt ein rötlicher, flockiger Niederschlag aus, der
abgesaugt wird. Der feuchte, rotgefärbte Filterrückstand, etwa 8,2 g, wird durch
Verreiben mit 7,6 g wasserfreiem Natriumsulfat in ein trockenes Pulver übergeführt.
Das so erhaltene Trockenprodukt wird anschließend im Mörser fein pulverisiert und
mit 25 ccm Trichloräthylen vermischt. Der so erhaltene Brei gelangt nun in einen
Perkolator. Sobald der Flüssigkeitsspiegel fast das obere Niveau erreicht hat, wird
ein Gemisch von Trichloräthylen mit 5 0/0 Chlorphenol eingefüllt.
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Dieses Gemisch extrahiert nur unbedeutende Mengen an Vitaminen der
B,2-Gruppe sowie gelbe Farbstoffe. Erst nach Erhöhung der p-Clhlorphenolkonzentration
im Trichloräthylen auf I0°/o werden etwa 35 ccm eines dunkeirotgefärbten Perkolats
erhalten. Die weitere Perkolation mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch liefert
einen nur schwach gelblichgefärbten Durchlauf. Die Säule ist nach der Perkolation
braungefärbt und enthält die Hauptmenge an Verunreinigungen. Das die Vitamine der
B12-Gruppe enthaltende zweite Perkolat dient zur weiteren Reinigung der Vitamine
der B,2-Gruppe bis zu deren Kristallisation.