DE819084C

DE819084C - Zuechtung von Hefe mit Nucleinsaeuren geaenderter Zusammensetzung

Info

Publication number: DE819084C
Application number: DEZ652A
Authority: DE
Inventors: Karl Dr Dimroth; Lothar Dr Jaenicke
Original assignee: Zellsloff Fabrik Waldhof AG
Current assignee: Zellsloff Fabrik Waldhof AG
Priority date: 1950-06-14
Filing date: 1950-06-14
Publication date: 1951-10-29

Description

Züchtung von Hefe mit Nucleinsäuren geänderter Zusammensetzung Die I'eiitosetiticleiiis<iure der Hefe wird allgemein @tls ein Naturstoff konstanter Zusammensetzung betrachtet. Nach den bisherigen wissenschaftlichen Erkenntnissen enthält diese Nucleinsäure neben ihren sonstigen Bestandteilen die Basen Guanin, Adenin, L'racil und Cytosin etwa in gleichmolaren Mengen.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß unter konstanten "Züchtungsbedingungen (Temperatur, Belüftung, Belichtung, eingeimpfte Hefemenge, Wasserstoftionenkonzentration) durch Zugabe bestimmter Stickstoffsubstrate zu dem sonst üblichen Nä hrmedium aus Zuckern und anorganischen Salzen nicht nur die durch 7ellzahl und Trockelige@vicht gemessene Wachstumsgeschwindigkeit der Hefe verändert werden kann, sondern auch der relative Gehalt an N ticleitisätire und deren Zusammensetzung. Die \-orliegencle Erfindung betrifft die durch eine Veränderung des Nährsubstrates gesteuerte Änderung der analytischen Zusammensetzung einer Hefeitucleinsäure in bezug auf die beiden Purine Guanin und Adenin. NVährend die Hefe bei der Züchtung mit Aminonstilfat oder mit Aminosäuren, wie Glykokoll, Serin ti. a., trotz unterschiedlicher WachstttmsgeschwIndigkeit und verschiedenen Nucleinsäuregehaltes Nucleinsäuren bildet, bei denen das Verhältnis von Guanin zu Adenin nahezu äquimolar ist, kann man durch Fütterung in Gegenwart von Guanin eine Hefe erzeugen, deren Nucleinsäure erheblich mehr Guanin enthält; umgekehrt enthält eine Hefe, die auf Adenin gewachsen ist, eine Nucleinsäure mit höherem Adeningehalt. In beiden Fällen handelt es sich tun chemisch in die Nucleinsäuren eingebaute 1'ttrine. Wenn man die Hefe auf Glykokoll oder auf Ammoniak als Stickstoffduelle wachsen läßt und das Wachstum noch vor dem völligen Verbrauch des Nährsubstrates durch Zugabe von Natriumazid hemmt, erhält man eine Hefe mit verhältnismäßig hohem Nucleinsäuregehalt und einer Zusammensetzung, die durch einen wesentlich erhöhten Adeningehalt ausgezeichnet ist: Der prozentuale Nucleinsäuregehalt steigt bei Fütterung mit Ammoniak und Hemmung mit i m/Mol Natriumazid vom Normalwert 3,4 bis 3,6% auf 5,4%, bei Fütterung mit Glykokoll und Hemmung mit i m/Mol Natriumazid vom Normalwert 7,o auf a90/0; das Verhältnis von Adenin zu Guanin steigt vom Normalwert i auf 1,6 bis 1,7 bzw. auf 1,3%.

Beispiel i In einem 2-Liter-Rundkolben im Thermostaten züchtet man Hefe unter Einleiten steriler Luft im Überschuß auf folgender Nährlösung:

15 g Rohrzucker je i Tropfen einer

i g Kaliumchlorid o,2-m-Lösungvon

-

0,79 Magnesiumsulfat # 7 H20 sulfEiat,sensulfHat,anZingan-

i g prim. Kaliumphosphat sulf

0,3g sek. Natriumphosphat at, Kupfer-

0,39

in 1 1 Leitungswasser gelöst.

Dann werden 1,75 g Ammonsulfat und 1,75 g Adenin # H C1 zugegeben und das pH auf 5,8 eingestellt. Nach Sterilisation von Kolben und Nährlösung impft man in 1 1 der Nährlösung ioo mg einer Hefereinkultur (Torula aus einer Betriebshefe der Zellstofffabrik Waldhof, Mannheim-Waldhof) und verheft 2.4 Stunden bis zum Verbrauch der reduzierenden Substanz. Die Hefesuspension wird zentrifugiert und die Hefe mit Wasser gewaschen. Man setzt zu der Hefe die gleiche Gewichtsmenge einer 20% Kochsalzlösung und extrahiert die Nucleinsäure bei 80 bis 95° 8 Stunden. Dann separiert man die Hefe von dem Extrakt und säuert diesen mit 5 n-Sälzsäure bis Kongosauer an. Die Nucleinsäure scheidet sich flockig ab, sie wird abzentrifugiert, mit Alkohol, Aceton und Äther gewaschen und getrocknet. Die Nucleinsäure wird in der vierfachen Menge abs. Methanol suspendiert und durch Einleiten von H Cl-Gas bei 5o° hydrolysiert. Nach 5 Stunden ist die Hydrolyse beendet. Die Purinhydrochloride haben sich abgeschieden. Ihre Kristallisation wird durch Stehen im Eisschrank über Nacht beendet. Dann saugt man auf einer Glasfrittennutsche ab und kristallisiert das Hydro-Chlo-, rid-Gemisch aus der 5fachen 'Menge Wasser um. Guanin # H Cl scheidet sich zuerst ab. Aus den Mutterlaugen erhält man Adenin # HUI.

Es wurden erhalten: 25,0 g Feuchthefe mit 200/0 Trockengehalt, daraus 355 mg Nucleinsäure = 7,10/0 der Trockenhefe, daraus 35 mg Guanin (9,9%) und 44 mg Adenin (12,4%).
Beispiel 2 Zu der in Beispiel i angegebenen Nährlösung werden 1,75g Ammonsulfat und 2,00g Guaniiihydrochlorid gegeben. Das anfangs nur wenig gelöste Guanin verschwindet im Laufe der Verhefung. Diese ist nach 26 Stunden beendet. Die Aufarbeitung der Suspension und die weitere Analyse der Nucleinsäure folgen den Angaben des ersten Beispiels.
Es wurden erhalten: 23,6 g Fciiclitliefe = 4,7 g Trockenbefe, daraus 268 nig Nucleinsäure (5,7"10,), daraus 53 mg Guanin (19,8",'0) 1111<l 35 Mg _\deilin (i3,20/0). Beispiel 3 Zu der in Beispiel i angegebenen N;ilirlö;iitlg werden 2,7g Ammonchlorid gegehen. Nach @'erinehrung der Hefe auf i g Trockensubstanz (40 000 Zellen/mm3) setzt man 65 mg Natriuniazid zu und verheft weiter. Die Vermehrungsgesch-,vindigkeit sinkt sofort auf i/10 bis 1/z0, das pH in kurzer Zeit auf 4,0 bis 4,5 und bleibt dann konstant. N ach 4,': Stunden wird die Verhefung unterbrochen und der Ansatz wie in Beispiel i aufgearbeitet. Die Hefe hat sich während des Versuchs deutlich rot gefärbt, auch die isolierte Nucleinsäure ist rot.
Es wurden erhalten: 16,2 g Feuchthefe = 3,.: g Trockenhefe, daraus 175 nIg Nucleinsäure = 5,40/0, daraus 13,8 mg Guanin (27,70/0) Bild 23 mg Adenin (13,1 %). Beispiel Zu der in Beispiel i angegebenen Nährlösung, werden 3,7g Glykokoll gegeben und wie in Beispiel ä weitergearbeitet. Nach Hemmung mit Azid sinkt das pH auf 4,3. Die Aufarbeitung fölgt aus Beispiel i.
Es wurden erhalten: 14,9 g Feuchthefe = 2,98 g Trockenhefe, daraus 236 mg Nucleinsäure = 7,9% d. Tr., daraus 36,5 mg Guanin (15, 5 "/o) und 48 mg Adenin (20,30/0).

Claims

PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Züchtung von Hefen mit Nucleinsäure anomaler Zusammensetzung in bezug auf die Purine Adenin und Guanin, dadurch gekennzeichnet, daß dem Nährinediuin bei Konstanthaltung von Temperatur, Belüftung, eingeimpfter Hefemenge, Wasserstoffionenkonzentration je nach der gewünschten Änderung des Purinbasenanteils als. Stickstoffquelle, außzr Ammonsalz oder Aminosäuren bestimmte Substanzen, wie Adenin bzw. Guanin, oder Hemmstoffe, z. B. Natriumazid, zugesetzt werden.