DE69931774T2

DE69931774T2 - Reinigung von zellulären Bestandteilen, die im wesentlichen RNA-frei sind

Info

Publication number: DE69931774T2
Application number: DE69931774T
Authority: DE
Inventors: Cobra Therapeutics Ltd Julian Alexis John Keele HANAK; Cobra Therapeutics Ltd Steven Geraint Keele WILLIAMS
Original assignee: Cobra Biologics Ltd
Current assignee: Cobra Biologics Ltd
Priority date: 1998-04-14
Filing date: 1999-04-13
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2019-04-14
Also published as: AU755520B2; EP1080179B1; WO1999053018A2; AU3434899A; HK1037884A1; WO1999053018A3; JP2002518994A; ATE329007T1; CA2325575A1; EP1080179A2; DE69931774D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Bildung von RNA-freien zellulären Bestandteilen und ein Verfahren zum Entfernen von DNA aus Präparationen von zellulären Bestandteilen.
Hintergrund der Erfindung
Die Ribonuklease Enzymfamilie (im Folgenden als RNasen bezeichnet) wurde intensiv untersucht. Zahlreiche RNasen wurden charakterisiert, und die Gene, die einige dieser Proteine kodieren, wurden kloniert.
RNasen hydrolysieren eine oder mehrere der Phosphodiester Bindungen in einzelsträngiger und doppelsträngiger RNA ebenso wie RNA in RNA:DNA Hybriden. RNasen unterscheiden sich in ihrer Spezifität entweder bezüglich einer bestimmten Form des RNA Substrats (zum Beispiel einzelsträngig, doppelsträngig oder in einem DNA:RNA Hybrid) oder ihrem spezifischen Punkt der RNA Spaltung.
Eine biologische Aktivität von RNase Enzymen ist die Prozessierung von reifen Molekülen von RNA aus Vorläuferformen (Genes, Benjamin Lewin, Hrsg., John Wiley & Sons, 2. Auflage, S. 395, 1985). Bestimmte RNasen können das Wachstum und die Differenzierung von Säugetierzellen durch eine intrinsische Antitumor Aktivität beeinflussen (Referenzen in Ribo et al., Prot. Express. and Purif. 7: 253–261, 1996).
RNA ist eine Hauptkontaminante von Präparationen aus Zelllysaten. Zum Beispiel enthalten Plasmid DNA Präparationen RNA, die schwierig durch eine Anionen Austausch oder Größen Austausch Chromatographie zu entfernen ist, weil sie in der Größe (bezüglich des Ausschlusses durch SEC Matrizen) und der Ladung zu DNA ähnlich ist. RNase A hydrolysiert RNA nach C und U Resten durch Spaltung zwischen der 3'-Phosphatgruppe des Pyrimidin Ribonukleotids und dem 5'-Hydroxyl des benachbarten Nukleotids. Dieses Enzym wird verwendet, um RNA zu Spezies mit niedrigem Moleku schen DNA kogereinigt werden. RNase I kann auch verwendet werden, um RNA aus Präparationen von Plasmid oder genomischer DNA zu entfernen. RNase A wird auch allgemein für die enzymatische Spaltung von wirtsabgeleiteter RNA während der Herstellung von rekombinantem Protein aus E. coli verwendet.
Ein Verfahren des Standes der Technik zum Entfernen von RNA aus einer Probe ist es, eine große Menge einer exogen hergestellten RNase zuzugeben. Zum Beispiel wird, um RNA aus Plasmid DNA zu entfernen, Rinder RNase A in einer Endkonzentration von 100 μg/ml zugegeben (Qiagen Pasmid Handbuch Februar 1995, Qiagen Ltd. Band 1 Tillingbourne Court, Dorking Business-Park, Dorking, Surrey RH4 1HJ, UK). Rinder RNase wird allgemein in einer Endkonzentration von ungefähr 10–100 μg/ml für die enzymatische Spaltung von wirtsabgeleiteter RNA während der Herstellung von rekombinantem Protein aus E. coli verwendet. Ein Hauptnachteil der Verfahren des Standes der Technik ist es, dass der gemäß diesem Verfahren behandelte zelluläre Bestandteil häufig Reste von RNase tierischen Ursprungs enthält.
Es gibt Beschränkungen bei der Verwendung von exogen hergestellten RNasen. Zunächst ist es schwierig, große Mengen von RNase aus dem Ursprungsgewebe zu reinigen. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass hohe Konzentrationen von aktiver RNase Wirtszell RNA degradieren werden und die normalen Zellfunktionen auf einer Ebene beeinflussen, die für eine Zelle toxisch sein können. Deshalb ist es schwierig, große Mengen von aktiver RNase durch Expression in Zellen zu bilden, weil hohe Konzentrationen von aktiver RNase toxisch für eine Zelle sein werden. Es ist auch schwierig, große Mengen an aktiver RNase durch Expression in Zellen zu bilden, weil RNase sensitiv gegenüber Proteasen des Wirts, in denen sie synthetisiert wird, sein kann, und weil RNasen, die übermäßig gebildet und in z.B. E. coli Einschlusskörperchen angehäuft sind, nicht immer korrekt zurückgefaltet werden können. Die signifikanteste Einschränkung bei der Verwendung von exogen hergestellter RNase ist, dass falls die exogen zugegebene RNase tierischen Ursprungs ist, die RNase Behandlung in Anwesenheit von Resten von Enzym eine DNA Präparation kontaminieren kann, wodurch sie für bestimmte Anwendungen, einschließlich Gentherapie inakzeptabel wird. Drittens ist es teuer, RNase in großen Mengen herzustellen.
Es gibt einen Bedarf im Stand der Technik für Plasmid DNA und Protein Präparationen, die im Wesentlichen frei von kontaminierender RNA sind.
Es gibt einen Bedarf im Stand der Technik für Verfahren zur Herstellung von RNA-freien zellulären Bestandteilen, die für die Verabreichung an humane Subjekte geeignet sind.
Es gibt einen Bedarf im Stand der Technik für ein Verfahren zum Entfernen von RNA aus zellulären Bestandteilen, das nicht auf dem Inkubieren eines zellulären Lysats oder eines gereinigten Bestandteils mit zugegebener exogen hergestellter RNase beruht.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines im Wesentlichen RNA-freien zellulären Bestandteils, umfassend das Kultivieren von Zellen, die den zellulären Bestandteil bilden, in einem Medium und das Lysieren der Zellen, um ein Zelllysat herzustellen, wobei das Zelllysat den zellulären Bestandteil und ausreichend RNase Aktivität enthält, um im Wesentlichen alle RNA Moleküle, die in dem Zelllysat anwesend sind, zu degradieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die RNase durch Zellen gebildet, die den zellulären Bestandteil bilden.
Alternativ wird die RNase durch Zellen in dem Medium gebildet, die von jenen Zellen verschieden sind, welche den zellulären Bestandteil bilden.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines im Wesentlichen RNA-freien zellulären Bestandteils, umfassend das Kultivieren und Lysieren von Zellen, die den zellulären Bestandteil bilden und von Zellen, die eine RNase in einer Menge bilden, die ausreichend ist, um im Wesentlichen die gesamte RNA zu degradieren, die in der Präparation anwesend ist.
Vorzugsweise bilden die Zellen, die den zellulären Bestandteil bilden, auch die RNase, und die Kultur und das Lysat enthalten Zellen, die den zellulären Bestandteil bilden und eine RNase in einer Menge, die ausreichend ist, um im Wesentlichen die gesamte RNA, die in der Präparation anwesend ist, zu degradieren. Vorzugsweise werden der zelluläre Bestandteil und die RNase durch dieselbe Zelle gebildet.
In bevorzugten Ausführungsformen von beiden der oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren ist der zelluläre Bestandteil einer von einer DNA, einem Protein und einem Kohlenhydrat. Vorzugsweise ist der zelluläre Bestandteil einer von einer rekombinanten DNA und einem rekombinanten Protein. Vorzugsweise wird die RNA auf einem Plasmid kodiert, und der zelluläre Bestandteil wird auf demselben Plasmid, einem anderen Plasmid oder auf einem Chromosom der Zelle kodiert.
In bevorzugten Ausführungsformen der beiden oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren ist das Gen, das die RNase kodiert, in das Genom der Zelle integriert, welche die RNase bildet.
In einigen erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, dass die RNase unspezifisch ist. Eine solche unspezifische RNase kann RNase A, RNase M oder RNase I sein.
In bevorzugten Ausführungsformen der beiden oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren bildet eine Zelle, die eine RNase bildet, die RNase in einer regulierten Weise.
Vorzugsweise wird die RNase, die durch die Wirtszelle gebildet wird, übermäßig gebildet, entweder durch induzierte Bildung oder durch konstitutive Bildung. Die RNase, die durch die Wirtszelle übermäßig gebildet wird, kann auch aus dem Cytoplasma der Wirtszelle segregiert, zum Beispiel in das Periplasma der Wirtszelle segregiert oder aus der Wirtszelle in das Medium segregiert werden.
In einigen Verfahren ist es bevorzugt, dass die RNase eine unspezifische RNase ist.
So wie hier verwendet, bedeutet "im Wesentlichen RNase-frei" und "im Wesentlichen alle RNA Moleküle" die übermäßig kleine Menge an RNA, die in einer Präparation eines zellulären Bestandteils, der für die Verabreichung an Menschen verwendet werden kann, erlaubt ist. Verträgliche übermäßig geringe Mengen an RNA sind wie folgt.
"Im Wesentlichen RNA-freie DNA" betrifft die Anwesenheit in einer Probe enthaltend den zellulären Bestandteil in weniger als 1%, vorzugsweise weniger als 0,2% und am meisten bevorzugt weniger als 0,1%–0,01% (w/w von RNA/DNA in der Probe).
"Im Wesentlichen RNA-freies Protein" betrifft eine Protein Präparation, die weniger als 1% und vorzugsweise weniger als 0,2% und am meisten bevorzugt weniger als 0,1%–0,01% (w/w) von RNA/Protein enthält. Wenn das Protein ein therapeutisches Protein ist, dann betrifft "im Wesentlichen RNA-freies Protein" eine therapeutische Protein Präparation, die weniger als 10 ng RNA/Dosis, vorzugsweise weniger als 500 pg RNA/Dosis, weiter bevorzugt weniger als 100 pg RNA/Dosis, am meisten bevorzugt weniger als 5–10 pg RNA/Dosis enthält.
"Im Wesentlichen RNA-freies Kohlenhydrat" betrifft eine Kohlenhydrat Präparation, die weniger als 1% und vorzugsweise weniger als 0,2% und am meisten bevorzugt weniger als 0,1%–0,01% (w/w) RNA/Kohlenhydrat enthält.
"Zelllysat" betrifft die Zusammensetzung, die durch das Lysieren von Zellen gebildet wird, wobei die Zusammensetzung keine exogen gebildete RNase enthält. Andere exogen hergestellte Bestandteile können zu dem Zelllysat zugegeben werden, wie Proteasen oder Protease Inhibitoren.
Vorzugsweise wird das Zelllysat signifikant weniger RNase Protein als Verfahren des Standes der Technik enthalten, wo exogene RNase zu dem Zelllysat zugegeben wird. "Signifikant weniger" bedeutet in diesem Zusammenhang weniger als 10 μg–50 μg RNase/ml Lysat, vorzugsweise weniger als 10 μg RNase/ml Lysat und vorzugsweise weniger als 1 μg RNase/ml.
So wie hier verwendet betrifft "zellulärer Bestandteil" irgendeine DNA, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Plasmid DNA, Cosmid DNA, yac DNA, episomale DNA oder genomische DNA und rekombinantes Protein.
So wie hier verwendet betrifft "rekombinant" eine DNA oder ein Protein, die/das nicht natürlich in einer Zelle auftreten oder die/das in einer Menge gebildet wird, die nicht natürlich durch die Zelle gebildet wird.
So wie hier verwendet, bedeutet "Zelle" jede eukaryonte oder prokaryonte Zelle. Bevorzugte eukaryonte Zellen schließen HeLa Zellen, CHO Zellen, Myelom Zelllinien, wie NSO, Insektenzellen, wie Sf21 und Sf9 Zellen, Pflanzenzellen und niedrige eukaryonte Zellen, einschließlich Hefen, ein. Am meisten bevorzugt betrifft der Begriff "Zelle" ein Gram negatives oder Gram positives Bakterium, einschließlich, aber nicht beschränkt auf E. coli, Salmonella typhimurium, Bacillus spp., Streptomyces ssp. und Pseudomonas aerguinosa.
"Regulierte Weise" betrifft eine Gen Expression, zum Beispiel eines RNase Gens in einer Wirtszelle, die transkriptionell reguliert ist, zum Beispiel konstitutiv oder induzierbar. Es betrifft auch die Regulation auf der Ebene der Protein Bildung, zum Beispiel die Verwendung einer Signalsequenz oder eines Fusionsproteins, um ein Protein an das Wirtszell Periplasma und aus der Wirtszelle und in das Medium, welches die Wirtszelle umgibt, zu leiten.
"Induzierbar" oder "Induktion" betrifft die transkriptionelle Aktivierung oder Derepression; "konstitutiv" betrifft die kontinuierliche Transkription häufig in einer konstanten Menge; "Signalsequenz" betrifft eine Aminosäuresequenz, welche die Sekretion eines Proteins in das Periplasma oder aus der Zelle leitet; "Sekretion" betrifft die Bewegung eines segregierten Proteins aus dem Wirtszell Cytoplasma und in das Periplasma oder das Wirtszell Kulturmedium; "Periplasma" betrifft das Wirtszell Kompartiment zwischen innerer und äußerer Zellmembran von zum Beispiel E. coli.
"Überexprimiert" oder "übermäßig gebildet" betrifft die Gen Expression in einer Menge, die größer ist als jene die normalerweise in der Wirtszelle exprimiert wird; "übermäßig gebildet" betrifft die Bildung in einer Menge, die größer ist als jene, die normalerweise durch die Zelle gebildet wird. Somit umfasst Überexpression eines gegebenen Gens oder übermäßige Bildung eines Gen Produkts oder einer rekombinanten DNA die Bildung von 10% oder mehr, 50% oder mehr, 100% oder mehr, oder sogar bis zu über 200–500% mehr des Gen Produkts als die Zelle normalerweise in der Abwesenheit des überexprimierten Gens bildet. Die Erfindung stellt DNA, Protein oder Kohlenhydrat Präparationen bereit, die im Wesentlichen frei von kontaminierender RNA sind. Die Erfindung ist insbesondere nützlich in der Bereitstellung von Präparationen, welche die Verabreichung an Menschen einschließen, aber auch für andere Verwendungen, einschließlich für die exakte Bestimmung von DNA Konzentrationen, durch Absorption bei 260 nm (wo RNA ebenfalls absorbiert) und für die Untersuchung von sowohl DNA/RNA als auch DNA/Protein Interaktionen. Im Wesentlichen RNA-freies Protein wird für therapeutische Anwendungen, für die Abschätzung von Protein Konzentrationen durch Absorption bei 280 nm, für die Analyse von Protein Kristallstrukturen, für die Untersuchung von Protein-DNA und Protein/RNA Interaktionen und für bestimmte Protein Reinigungsprotokolle, wo Nukleinsäure Bindung die Affinität von Protein hinsichtlich Ionenaustau schern verringert oder die Fähigkeit von Ionenaustauschern für Protein verringert, benötigt.
Die Erfindung ist für alle Verwendungen anwendbar, welche eine Präparation eines zellulären Bestandteils, wie DNA, Protein, Kohlenhydrat, benötigen, der im Wesentlichen frei von kontaminierender RNA ist, zum Beispiel für die Herstellung eines zellulären Bestandteils, wie DNA oder einem Protein oder einem Kohlenhydrat, das für therapeutische Verwendung in Menschen geeignet ist.
Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden vollständiger in der folgenden Beschreibung der Ausführungsformen und Zeichnungen und von den Patentansprüchen deutlich.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die Zeichnungen werden kurz beschrieben.
1 zeigt Plasmid pN1.
2 ist eine Diagrammdarstellung der Strategie für die Einführung und das Deletieren von Plasmid DNA in das E. coli Chromosom und für das Deletieren von chromosomaler DNA aus dem E. coli Chromosom durch Insertionsmutagenese und homologe Rekombination.
3 ist ein LB Agar Platten Assay, der die Expression von RNase I aus TOP10F Zellen, die mit pCR3.1 RNase I transformiert wurden, zeigt.
4 ist ein LB Agar Platten Assay, der die IPTG induzierbare Expression von DH5α Zellen, die mit pUC18RNase I transformiert wurden, zeigt.
5 ist ein LB Agar Platten Assay, der die Sensitivität von gereinigter pUC18 RNase I gegenüber alkalischer Lyse zeigt.
6 ist ein Ethidiumbromid gefärbtes Agarose Gel, das die Wirkungen von Lyse Bedingungen auf die Aktivität von pUC18RNase I zeigt.
7 zeigt das biscistronische rekombinante Plasmid pQR163, basierend auf dem Expressionsvektor pKK223.3, und das für ein Hexapeptid und eine RNase Vorläufer unter der Kontrolle des tac Promotors kodiert und Resistenz gegenüber Ampicillin und Tetracyclin zeigt.
8 zeigt ungespaltene und gespaltene Proben von isolierter Plasmid DNA, mit Resuspensionspuffer enthaltend RNase, isoliert unter Verwendung eines Verfahrens zur Miniherstellung. Die Spuren 1 & 16, 2 & 15 sind jeweils λPstI und λHindIII Marker. Die jeweils erste der Probenspuren ist die ungespaltene Probe, und die zweite Spur ist die gespaltene Probe. Ungespaltene Proben waren 5 μl DNA und 5 μl Auftragspuffer. Gespaltene Proben enthielten 5 μl DNA, 1 μl Restriktionspuffer, 1 μl EcoRI und wurden für 2 Stunden vor der Zugabe von 3 μl Auftragspuffer gespalten. Spuren 3 & 4 pQR162. Spuren 5 & 6 pQR163. Spuren 7 & 8 pKK223.3. Spuren 9 & 10 pUC18. Spuren 11 & 12 pBR322. Spuren 13 & 14 sind die ungespaltene und gespaltene Kontrolle pUC19. 5 μl der Marker wurden aufgetragen, und 1 μl des kommerziellen pUC19 wurde verwendet.
9 zeigt die Plasmid Minipräparationen von Durchfluss, Wasch- und Elutionsstufen des (a) Vektors pKK223.3, der das RNase Gen nicht enthält, (b) pQR163, (c) pQR162, (d) pUC18 und (e) pBR322 unter Verwendung eines Resuspensionspufters mit/ohne RNase. Die Vertiefungen enthielten eine 5 μl Stufe/DNA Probe, 5 μl steriles destilliertes Wasser und 3 μl Auftragspuffer. Die Spuren 1 & 2 und 15 & 16 entprechen jeweils λPstI und λHindIII (5 μl aufgetragen). Die Spuren 3–7 entsprechen Puffer mit RNase, und 8–12 entsprechen Puffer ohne RNase. Die Spuren 3 & 8 sind Durchfluss Proben, die Spuren 4 & 9 sind der Waschschritt der ersten Säule, die Spuren 5 & 10 sind der Waschschritt der zweiten Säule, die Spuren 6 & 7 und 11 & 12 sind ungespaltene eluierte DNA. Die Spuren 13 & 14 sind ungespaltene, kommerzielle pUC18 Kontrollen (1 μl aufgetragen).
10 zeigt die Wachstumskurven von pKK223.3 und pQR163, die durch Auslesungen von optischer Dichte, vor der Induktion mit IPTG, bestimmt wurde. 1 ml Proben wurden jede Stunde gesammelt, und Auslesungen bei 550 nm wurden gegenüber einem Hintergrund von 1 ml steriler Nährlösung aufgenommen. Die Auslesungen wurden bei Raumtemperatur in 1 ml, 1 cm Wegküvetten aufgenommen. Das exponentielle Wachstum wurde bei einer 0,600 OD bestimmt, und die Proben wurden mit IPTG in einer Endkonzentration von 0,5 mM induziert.
11 zeigt gespaltene und ungespaltene Plasmid DNA in der Abwesenheit/Anwesenheit von RNase, die unter Verwendung eines Midi Isolationsverfahrens isoliert wurde. Die Spuren 1 & 12 und 2 & 11 sind jeweils λPstI und λHindIII Marker (5 μl aufgetragen). Die erste jeder der DNA Spuren ist die ungespaltene Probe, und die zweite ist die gespaltene Probe. Ungespaltene Proben waren 5 μl DNA und 5 μl Auftragspuffer. Gespaltene Proben enthielten 5 μl DNA, 1 μl Restriktionspuffer, 1 μl EcoRI, und sie wurden für 2 Stunden vor der Zugabe von 3 μl Auftragspuffer gespalten. Spuren 3 & 4 pKK223.3 mit RNase. Spuren 5 & 6 pKK223.3 ohne RNase. Spuren 7 & 8 pQR163 mit RNase. Spuren 9 & 10 ohne RNase.
12 zeigt Plasmid Midi Präparationen von geklärtem Lysat, Durchfluss, Waschschritt und Elutionsstufen von pKK223.3 und pQR163 unter Verwendung eines Resuspensionpuffers mit/ohne RNase.
Die Vertiefungen enthielten 3 μl Probe, 4 μl steriles destilliertes Wasser und 5 μl Auftragspuffer. Die Spuren 1 & 2 und 19 & 20 entsprechen jeweils λPstI und λHindIII (5 μl aufgetragen). Die Spuren 3–6 und 11–14 entsprechen den Proben pKK223.3 und pQR163 mit Puffer enthaltend RNase. Die Spuren 7–10 und 15–18 entsprechen pKK223.3 und pQR163 mit Puffer, der keine RNase enthält. Die Spuren 3, 7, 11 & 15 sind geklärte Lysat Stufen. Die Spuren 4, 8, 12 & 16 sind Durchfluss durch die Stufen. Die Spuren 5, 9, 13 & 17 sind Waschstufen. Die Spuren 6, 10; 14 & 18 sind eluierte DNA.
13 zeigt die relativen Intensitäten von RNA Banden für pKK223.3 und pQR163 für geklärtes Lysat (CL) und Durchflussstufen (F) eines Midi präparatorischen Verfahrens (Qiagen), wenn sie mit der zweiten Triplet Bande des λPstI Markers verglichen werden.
14 zeigt die Banden Konzentrationen von RNA in geklärtem Lysat (CL) und Durchflussstufen (F) eines Midi präparatorischen Verfahrens unter Verwendung von pKK223.3 und pQR163, wie durch die Banden Konzentration der zweiten Triplet Bande des λPstI Markers bestimmt wurde.
15 zeigt A) das Plasmid pN1D274Ekan1, was pUC18 mit einer 5,2 kb Region flankierend den dif Locus eines Inserts ist. Das kan Gen wurde in eine NsiI Stelle inseriert, und lacl^qs zwischen zwei StyI Stellen. B) Das Ausschneiden mit BbsI erlaubt die Entfernung des meisten des lacl^qs und den Austausch durch trc-RNaseA. Dieses Plasmid (pRNaseA) ist linearisiert und wird verwendet, um trc-RNaseA in das E. coli Chromosom durch homologe Rekombination einzuführen.
16 zeigt eine Agarose Gelelektrophorese von Plasmid Minipräparationen von Klonen, die aus der Transformation von pQR163 in DH1(pTX0161) abgeleitet sind: Spuren 1 & 16: 1 kb Macker; Spur 2: pMMB66EH, Spur 3: pQR163 Kontrolle; Spuren 4–15: Klone 1–12 von DH1(pTX0161)(pQR163).
17 zeigt eine Agarose Gelelektrophorese von Plasmid Minipräparationen aus DH1(pTX0161)(pQR163) und DH1(pTX0340): Spuren 1 und 6: 1 kb Marker; Spur 2: DH1(pTX0161)(pQR163) + RNaseA; Spur 3: DH1(pTX0340) + RNaseA; Spur 4: DH1(pTX0161)(pQR163); Spur 5: DH1(pTX0340).
18 einen RNA Platten Assay, um RNaseA Aktivität nachzuweisen. 1: pMMB66EH (Negativkontrolle); 2–4: DH1(pTX0161)(pQR163) Klone 1–3; 5: 10 μg RNAseA (Positivkontrolle)
19 zeigt die Klonierungsstrategie des RNaseA Gens in pMMB66EH.
BESCHREIBUNG
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von im Wesentlichen RNA-freien zellulären Bestandteilen bereit, das die Herstellung eines ausgewählten zellulären Bestandteils und einer RNase in derselben Wirtszelle oder verschiedenen Wirtszellen, die kokultiviert werden, umfasst, so dass nach der Lyse der Zelle(n) ausreichend RNase Aktivität anwesend ist, um im Wesentlichen alle RNA Moleküle in dem Lysat zu degradieren.
Der zelluläre Bestandteil kann DNA, Protein oder Kohlenhydrat sein, das erfindungsgemäß im Wesentlichen RNA-frei hergestellt wird. Dies kann zum Beispiel erreicht werden, indem ein Gen verwendet wird, das einen zellulären Bestandteil kodiert, das in eine Wirtszelle eingeführt wird, die derart verändert wurde, dass sie ein RNase Protein exprimiert, oder durch Kultivieren und Lysieren von zwei verschiedenen Wirtszellen, die einzeln den zellulären Bestandteil und die RNase bilden.
RNase Gene und RNase, die erfindungsgemäß verwendet werden kann
Gene, die eine Vielzahl von RNase Proteinen kodieren, wurden kloniert. Idealerweise ist die erfindungsgemäße RNase unspezifisch (zum Beispiel Rinder RNase A und E. coli RNase M, die in hohen Konzentrationen verwendet werden), und sie wird deshalb alle Arten von RNA Molekülen degradieren. Unspezifische RNasen hydrolysieren Phospho diester Bindungen in einzelsträngiger oder doppelsträngiger RNA oder in RNA/DNA Molekülen, irgendwo entlang der Länge des RNA Moleküls.
Die Protein Produkte und die Gene für Rinder RNase A (Tarragona-Fiol et al., Gene, 118: 239–245, 1992; Schein et al., Biochem. J., 283: 137–144, 1992, Laity et al., PNAS 90: 615–619, 1993, delCardayre, Prot. Engineer. 8: 261–273, 1995, Okorokov et al., Prot. Express. Purif. 6: 472–480) und murine und Ratten RNase A Homologe (Schein et al., supra) wurden kloniert und charakterisiert.
RNase H hydrolysiert RNA Moleküle, die an einen komplementären DNA Strang hybridisiert sind, und sie wird in der Molekularbiologie verwendet, um den DNA Strang nach der Synthese des ersten Strangs bei der Herstellung von doppelsträngiger cDNA zu degradieren. Die RNase H wird auch verwendet, um polyA Schwänze von mRNA zu entfernen, die an oligo-dT_12–18 hybridisiert ist (beschrieben in dem US Patent Nr.: 5,459,055).
RNase I spaltet die Phosphodiester Bindung von einzelsträngiger RNA 3' irgendeines Ribonukleosids und wird für RNase Schutz Assays, die Kartierung und Quantifizierung von RNA und für den Fehlpaarungs (mismatch) Nachweis verwendet. E. coli RNase I und RNase M (Meador und Kennell, 1990, Ribo et al., Prot. Express. Purif. 7: 253–261, 1996) wurden kloniert, isoliert und charakterisiert.
RNase T1 spaltet vorzugsweise 3' von G Resten und wird für RNA Sequenzanalyse und RNA Fingerprinting verwendet. Aspergillus oryzae RNase T1 und T2 (Fujimura et al., FEBS, 265: 71–74, 1990, Quass et al., Eur. J. Biochem. 173: 617–622, 1988) wurden kloniert, isoliert und charakterisiert.
RNase4 (Seno et al., Biochim. Et Biosphys. Acta, 1261: 424–426, 1995) wurde kloniert, isoliert und charakterisiert.
Menschliche Pankreas RNase (Russo et al., FEBS 333: 233–237, 1993) wurde kloniert, isoliert und charakterisiert.
Bacillus amyloliquefaciens BaRNase (Hartley, J. Mol. Biol. 202: 913–915, 1998) wurde bezüglich der Synthese und der Verarbeitung charakterisiert.
Expression eines ausgewählten RNase Gens in einer Wirtszelle
Erfindungsgemäß kann ein RNase Gen derart modifiziert werden, dass das RNase Protein in entweder dem periplasmatischen Raum oder dem zellulären Überstand lokalisiert ist, zum Beispiel dadurch dass die Lage der RNase unter Verwendung einer Signalsequenz oder durch die Bildung eines Fusionsproteins, das segregiert wird, gesteuert wird.
Alternativ kann die Expression der RNase selektiv durch Anordnen des RNase Gens unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors kontrolliert werden.
Alternativ kann das RNase Gen in eine Wirtszelle eingeführt und in das Chromosom der Wirtszelle integriert werden.
Vektoren, die verwendet werden, um RNase übermäßig zu bilden, wurden modifiziert, um Probleme aufgrund der toxischen Wirkungen von nicht korrekt gefalteter RNase auf die Wirtszelle, in der die RNase gebildet wird, der Sensitivität von nicht gefalteter RNase gegenüber Proteasen, die in der Wirtszelle anwesend sind und der nicht korrekten Rückfaltung von einigen RNasen, die in Einschlusskörpern gebildet wurden, zu minimieren.
Integration eines RNase Gens in das Chromosom des E. coli Wirtsstamms
Die folgenden Verfahren können verwendet werden, um eine Wirtszelle mit einem RNase Gen integriert in das Wirtszell Chromosom bereitzustellen.
1. Klonierung von RNase A in pN1
Das RNase A Gen wurde aus dem Expressionsvektor pQR163 (Tarragona-Fiol et al., supra) durch PCR (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M. et al., Hrsg., John Wiley & Sons Inc.) unter Verwendung der Primer
5'-CTCGAATTCAATGTTCTTGGAGGATGATTG-3'
5'-TACGAATTCGGCCTTAGGTAGAGACCTAC-3'
isoliert. Das isolierte RNase Gen wurde in die EcoRI Stelle von pUC18 derart eingeführt, dass eine Fusion innerhalb des Leserahmens zwischen dem lacZ Gen und dem Hexapeptid gebildet wurde, das 5' des RNase A Gens angeordnet ist. Die Expression des RNase A Gens und des Hexapeptids wurde durch den lacZ Promotor kontrolliert. Das lacZ-RNase A Konstrukt wurde anschließend durch eine Hae II Spaltung ausgeschnitten, mit stumpfen Enden versehen und in pN1 (1), der zuvor mit Sty I gespalten und mit stumpfen Enden versehen worden war, eingebaut.
Das resultierende Konstrukt wird als pN1 RNase A bezeichnet.
2. Einführung von pN1RNase in E. coli
Das resultierende Konstrukt, als pN1 RNase A bezeichnet, besteht aus einer RNase Expressionskassette, flankiert an beiden Seiten durch den E. coli dif Locus, der chromosomale DNA Homologie enthält. Der dif Locus ist eine 28 Basenpaar Region, die eine Erkennungsstelle für XerC und XerD Rekombinasen aufweist (Hayes und Sherratt, J. Mol. Biol., 266: 525–537, 1997, Kuempel, et al., The New Biologist 3: 799–811, 1991).
Das resultierende pN1 RNase A Konstrukt wurde verwendet, um die RNase A Gen Kassette in die E. coli Stämme JC7623 und anschließend DH1 durch das folgende Verfahren zu shutteln/einzuführen.
pN1RNase A wurde mit Sal I (oder einem anderen geeigneten Restriktionsenzym) linearisiert oder einer teilweisen Spaltungsreaktion mit Sal I unterzogen. Das resultierende Fragment (das die ausgeschnittene aber intakte RNase Expressionskassette enthält) wurde verwendet, um Calcium kompetente JC7623 Zellen (recB21, sbcC201, recC22, sbcB15; Horii und Clark, J. Mol. Biol. 80: 327–344, 1973, Lloyd und Buckman, J. Bacteriol. 164: 836–844, 1985), durch lineare Transformation wie beschrieben bei Winans et al., J. Bacteriol. 161: 1291–1221, 1985 und Jasin und Schimmel, J. Bacteriol. 159: 783–786, 1984 zu transformieren.
Eine P1 Phagen Transduktion wurde anschließend verwendet, um dieses chromosomale Konstrukt in den dif Locus von E. coli DH1 (F-, supE44, recA1, endA1, gyrA96, thi-, hsdrl7, relA1 wie beschrieben in Hanahan, Mol. Biol. 166: 557–580, 1983, und Bachmann in Escherichia coli und Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology, Hrsg. Neidhardt, F. C. et al., ASM, S. 1190–1219, 1987) oder einen anderen geeigneten DNA Vektor Wirtsstamm, wie in 2 detailliert beschrieben ist, zu bewegen. Um die Integration des RNase Gens in das Wirtszell Chromosom zu erleichtern, wurde der Ziel Wirtsstamm zunächst transient RecA+ durch Transformation mit dem instabilen, recAenthaltenden Plasmid pPE13 gemacht (Hickson et al., Escherichia coli Mol. Gen. Genet, 184: 68–72, 1981). Die Transformation des Wirtsstamms mit pPE13 wurde unter Verwendung des Calciumphosphat Verfahrens zur Herstellung kompetenter Zellen durchgeführt, wie beschrieben ist in den Kurzprotokollen in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg. Wiley, 3. Auflage, 1993.
3. PCR Amplifikation von pN1 RNase I
Das RNase I Gen wurde aus dem E. coli Stamm DH1 durch PCR unter Verwendung der Primer 5'-GGTCCTGGGGTGATTATTTACGGCTGTGGC-3' und 5'-GTTTAACTCACATGATGATACTGACTGTTG-3' amplifiziert und in den TA Klonierungsvektor pCR3.1 (Invitrogen) kloniert, um pCR3.1 RNase I zu bilden.
Das RNase I Gen wurde anschließend aus pCR3.1 RNase I durch PCR unter Verwendung der Primer 5'-TCCAGAATTCCATGAAAGCATTCTGGGG-3' und 5'-GTTGAATTCACATGATGATACTGACTGTTG-3' (gemäß dem Verfahren von Ausubel et al., Current Protocols, supra) amplifiziert und in die EcoRI Stelle von pUC18 kloniert, so dass das RNase I Gen innerhalb des Leserahmens mit den verbleibenden Sequenzen des lacZ Gens fusioniert wurde.
Das resultierende Plasmid umfasste ein RNase I Gen unter der Kontrolle des lacZ Promotors, wobei die Expression des RNase I Gens durch die Anwesenheit von 0,5 mM IPTG gesteigert wurde. Das LacZ-RNase I Konstrukt wurde anschließend durch eine Hae II Spaltung ausgeschnitten, mit stumpfen Enden versehen und in pN1 eingeführt, der mit Sty I gespalten und mit stumpfen Enden versehen worden war. Das resultierende pN1 RNase I Konstrukt wurde wie oben verwendet, um die RNase I Gen Kassette in die E. coli Stämme JC7623 und anschließend DH1, wie oben, zu shutteln/einzuführen.
Integration eines RNase Gens in das Chromosom von anderen Zelltypen
1. Herstellung von zellulären Bestandteilen in anderen Zelltypen
1.1 S. typhimurium
Ein RNase Gen kann in das Chromosom von S. typhimurium wie in Bachmann et al., 1977 beschrieben, in E. coli und Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology, Hrsg. Neidhardt et al., ASM, oder wie beschrieben in Nakayama et al., Bio/Technology, 6: 693–697, 1988 eingeführt werden.
2. Herstellung von rekombinantem Protein in anderen Zelltypen
2.1 Bacillus spp.
Ein RNase Gen kann in das Chromosom von Bacillus spp. wie beschrieben in Solma et al., J. Bact., 173: 6889–6895 eingeführt werden.
2.2 Streptomyces spp.
Ein RNase Gen kann in das Chromosom von Streptomyces spp., wie in Kapitel 6 in Plasmide, Ein praktischer Ansatz (2. Auflage), herausgegeben von K. G. Hardy oder wie beschrieben in Motamedi et al., Gene, 160: 25–31, 1995 eingeführt werden.
Integrative Expressionsvektoren für die heterologe Expression von Genen in Streptomyces wurden entwickelt. Die Vektoren umfassen einen starken konstitutiven Promotor, P_E, eine synthetische Ribosomen Bindestelle, ein ATG Start Kodon, eine multiple Klonierungsstelle, einen Transkriptionsterminator und ein Hygromycin Resistenz kodierendes Gen (Hy^R). Die Vektoren enthalten auch ein ColE1 Replikon für die Vermehrung in Escherichia coli und ein Streptomyces Integrationselement mit weitem Wirtsbereich, den Minizyklus, um die Insertion der Vektoren in das Streptomyces Genom an der Minizyklus Anheftungsstelle zu steuern. Hy^R Transformanten sind in der Abwesenheit von Arzneimittel Selektion stabil. Konjugative Derivate können durch Einbauen des oriT, dem Transfer Ursprungspunkt des IncP Plasmids RK2, in diese Vektoren konstruiert werden, und der konjugale Transfer von einem geeigneten E. coli Donor in Streptomyces lividans (SI) kann durchgeführt werden. Derivate dieser Vektoren sind potenziell für die Gen Zerstörung nützlich, ebenso wie für die Komplementation, wie auch beschrieben wurde. Es wurde gezeigt, dass die replikativen Formen der hergestellten Minizyklus basierten Vektoren in SI mit der integrierten Kopie des Vektors ohne irgendwelche offensichtlichen Instabilitätsprobleme koexistieren kann. Die Nützlichkeit dieser Vektoren wurde durch die Expression des Gens, das eine 31-O-Methyltransferase kodiert, die in die Methylierung an der Position 31 des immunsuppressiven Arzneimittels FK506 in SI (Motamedi et al., supra) involviert ist, gezeigt.
2.3 Pseudomonas spp.
Ein RNase Gen kann in das Chromosom von Pseudomonas spp wie beschrieben in Gene replacement in Pseudomonas aeruginosa in Methods in Enzymology, 235: 466–474 1994, Molecular Microbiology, 6: 1195–1204, 1992 oder wie beschrieben wurde in Schweizer und Hoang, Gene, 158: 15–22, 1995 eingebaut werden.
Ein neuer pUC19 basierter Gen Austauschvektor wurde entwickelt. Dieser Vektor schließt (i) den gegenselektierbaren sacB Marker, (ii) ein lacα Allel für blauweiß Screening, (iii) einen oriT für konjugationsvermittelten Plasmid Transfer und (iv) einzigartige Klonierungsstellen für SmaI und die selten schneidende Meganuklease I-SceI, ein. Die seltenen Restriktionsstellen sind auch in dem Helferplasmid pUC19Sce anwesend. Der Austauschvektor ist derart gestaltet, dass er wenige Restriktionsstellen enthält, um einen größeren Zugang zu Restriktionsstellen innerhalb klonierter DNA Fragmente zu erlauben, was deren genetische Manipulation erleichtert. Die Nützlichkeit des Systems wurde durch chromosomale Integration einer neu konstruierten xylE::Gm^R Fusionskassette in das glpD Gen von Pseudomonas aeruginosa (Schweizer und Hoang, supra) gezeigt.
Herstellung von Zellen, die RNase und rekombinante DNA oder Protein exprimieren
Die Zellen, die ein RNase Gen und eine DNA oder ein Protein von Interesse exprimieren, werden wie folgt hergestellt.
E. coli Wirtsstämme DH1, DHSα, DH10B, JM109, DL795, XL1-Blue und TG1 können für die Herstellung von rekombinanter Plasmid DNA verwendet werden, und E. coli Stämme BL21(DE3), JM109(DE3) und HB101 können für die Herstellung von rekombinantem Protein verwendet werden.
1. Behandlung von E. coli mit Rec A enthaltendem Plasmid
Nach der Integration der heterologen RNase Expressionskassette in das Chromosom des DNA Vektor Wirtsstamms, wie beschrieben in dem Abschnitt mit der Überschrift Einführung von pN1RNase in E. coli, werden die Wirtszellen mit dem recA- enthaltenden Plasmid pPE13 durch eines der folgenden Verfahren "behandelt": Reihen Subkultur in der Abwesenheit des Selektionsmarker Arzneimittels, für welches das Plasmid kodiert (z.B. Selektion in der Abwesenheit von Ampicillin), Titration mit DNA Interkalatoren, wie Ethidiumbromid, oder Wachstum in 10% SDS (Tolmasky et al., Virulence plasmids. In Plasmids: a practical approach, Hrsg. K. G. Hardy, IRL Press Oxford, UK, 1993). Plasmid-freie Segregate werden durch Replika Plattierung (plus und minus Selektion) selektiert, und "die Behandlung" wird durch ein schnelles Verfahren für das Screenen nach der rekombinanten Plasmid DNA bestätigt (Birnboim und Doly, Nucleic Acids Res 7: 1513–1523, 1979).
2. Transformation von E. coli mit rekombinantem Plasmid
Sobald sie behandelt sind, werden die Wirtszellen für die DNA Transformation kompetent gemacht, mit dem rekombinanten Plasmid transformiert (Sheen, S. 1.8.5 in Ausubel, Current Protocols, supra) und unter den geeigneten Bedingungen selektiert.
3. Reinigung von rekombinanter/em DNA oder Protein
Rekombinante Plasmid DNA
Für die Herstellung von rekombinanter Plasmid DNA werden die transformierten Klone direkt verwendet, um Plasmid DNA zu propagieren. Die Plasmid DNA wird gemäß den Verfahren, die im Stand der Technik wohlbekannt sind, hergestellt. (Siehe zum Beispiel Birnboim und Doly, supra, Tolmasky et al., supra, und Ausubel, Current Protocols, supra).
Die Plasmid DNA kann hergestellt werden wie beschrieben in WO 97/29190, mit der Ausnahme, dass der Schritt des Zugebens von exogener RNase ausgelassen wird. Alternativ kann die Plasmid DNA gemäß dem Verfahren Horn et al., (Human Gene Therapy, 6: 565–573, 1995) hergestellt werden.
Herstellung von bakterieller Kultur
Die Fermentation in vollständigem TB Medium enthaltend die geeignete Konzentration von Antibiotikum für die Selektion (z.B. 50 μg/ml Kanamycin für kann selektierte Plasmide) wird in einem 10 Liter Braun Biostat ED Fermenter durchgeführt. Die Fermentationsbedingungen werden wie folgt aufrecht erhalten: die Temperatur wird bei 30°C, die Bewegung bei 600 rpm, der Luftfluss bei 10 Liter/Min. und der pH bei 7,0 kontrolliert. Die Bakterien werden in der späten Log Phase (10–11 Stunden nach der Inokulation) bei einer End OD₆₀₀ von ungefähr 30 in einer Jouan Zentrifuge bei 3000 × g für 30 Min. geerntet und bei –20°C gelagert. Ein 0,75 ml Aliquot wird bei der Ernte entnommen und für Minprep Analysen verarbeitet (Promega Wizard, Madison, WI). Gemäß diesem Verfahren sollte die durchschnittliche Fermentation 5 mg Plasmid DNA/Liter liefern (Horn et al., supra).
Lyse und Plasmid Gewinnung
Frische oder gefrorene Bakterien werden unter Verwendung einer Modifikation des Standard alkalischen Verfahrens lysiert. Die Ausbeute sollte zwischen frischen und gefrorener Zellpaste gleich sein. Ungefähr 180 Gramm Bakterien werden in 1,4 Liter 61 mM Glucose, 10 mM Tris, 50 nM EDTA, pH 8,0 Puffer, der auf 4–10°C vorgekühlt wurde, resuspendiert. Die Lyse wird nach der Zugabe von 2,8 Liter 0,2 N NaOH, 1% SDS Puffer, der auf 4–10°C vorgekühlt wurde, gefolgt durch Inkubation auf Eis für 10 Min. stattfinden. Der zelluläre Debris wird mit der Zugabe von 2,1 Liter 3 M Kaliumacetat pH 5,0, das auf 4–10°C vorgekühlt wurde, gefolgt durch Inkubation auf Eis für 10 Min., präzipitiert. Der zelluläre Debris in dem Lysat wird durch Zentrifugation durch Miracloth (Calbiochem, San Diego, CA) entfernt. Sobald der Zelldebris entfernt wurde, wird das Lysat zweimal durch ein Minimum von 16 Schichten Miracloth pro Passage gegossen. Die Plasmid DNA wird aus dem geklärten Lysat durch die Zugabe von 0,6 Volumina –20°C 2-Propanol gefolgt durch Inkubation für 1–2 h bei Raumtemperatur präzipitiert. Ungefähr 4,6 Liter der klaren Flüssigkeitsschicht über dem angereicherten Plasmid Präzipitat werden dekantiert. Das konzentrierte Plasmid DNA Präzipitat am Boden des Gefäßes wird in 250 ml Zentrifugenflaschen transferiert und bei 10.000 × g für 30 Min. in einem GSA Rotor und einer Sorvall RC5B Zentrifuge zentrifugiert. Die Überstände aus der Zentrifugation werden verworfen, und die Pellets werden abgegossen und in ungefähr 200 ml 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 8,0 (TE Puffer) resuspendiert. Festes Ammoniumacetat wird in der Plasmid DNA Lösung unter Rühren in einer Endkonzentration von 2,5 M gelöst. Die Ammoniumacetat Lösung enthaltend die Plasmid DNA wird anschließend auf Eis für 15 Min. inkubiert. Das resultierende Präzipitat wurde durch Zentrifugieren bei 10.000 × g für 20 Min. wie oben beschrieben entfernt. Der Überstand wird durch eine 0,8 μm Nitrocellulose wegwerfbare Membranfilter Flascheneinheit (The Naleg Company, Rochester, NY) gefiltert, und ausreichend 30% PEG-8000 in 1,6 M NaCl wird zugegeben, um eine Endkonzentration von 10% PEG-1000 (Lis und Schleif, 1975; Lis, 1980) zu erreichen. Die Plasmid DNA wird aus dieser Lösung für 8–24 h bei 4°C präzipitiert. Die Plasmid DNA wird durch Zentrifugieren bei 10.000 × g für 30 Min. wie oben beschrieben, gesammelt. Das Pellet, welches das Plasmid enthält, wird in 10 ml Säulenpuffer 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8,0) resuspendiert. Das Plasmid wird anschließend gefiltert und direkt auf die Säule wie oben beschrieben aufgetragen.
Pharmacia Sephacryl S-1000 Superfein Gel Filtrationschromatographie
Zwei Pharmacia XK26/100 Säulen werden unter Druck gepackt, unter Verwendung eines Pharmacia FPLC Systems, gemäß den Anweisungen des Herstellers für diesen Träger, bis zu Endbetthöhen von ungefähr jeweils 85 cm, was zu einem Gesamtsäulenvolumen von 900 ml führt. Der Laufpuffer ist 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, pH 8,0. Die Fließgeschwindigkeit ist 0,75 ml/Min. Teilweise gereinigte Plasmid DNA aus der oben beschriebenen PEG-8000 Präzipitation wird durch einen 0,1 bis 0,22 μm sterilen Cellulose Acetat Acrodisc Spritzenfilter (Gelman, Ann Arbor, MI) passagiert und auf die Säule geladen. Der Säulenbetrieb und das Sammeln der Fraktionen wird mit einer Pharmacia FPLC automatisiert. Fünf Milliliter Fraktionen werden in 15 ml wegwerfbaren konischen Gefäßen gesammelt. Nach der Chromatographie wird die Säule und die FPLC mit 2 Säulenvolumina von 0,2 M NaOH gespült. Die Fraktionen werden mit 0,8 Agarose Gelektrophorese analysiert, und die Fraktionen, die vorwiegend supercoiled Plasmid DNA enthalten, werden in sterilen wegwerfbaren Zentrifugengefäßen vereinigt; die Vereinigung wird mit zwei Volumina an kaltem Ethanol präzipitiert.
Herstellung von steriler Bulk Plasmid DNA
Die Ethanol präzipitierte Säulen gereinigte Plasmid DNA wird durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 30 Min. gesammelt. Das Zellpellet wird abgegossen und unter aseptischen Bedingungen in einer Laminarflusshood luftgetrocknet. Die getrockneten Pellets werden in Lactiertem Ringer's (Baxter, Deerfield, IL) resuspendiert und auf eine geeignete Konzentration für die beabsichtigte Dosierung verdünnt. Die resultierende Lösung wird einer Sterilfiltration durch einen Pyrogen freien 0,2 μM Acrodisc Filter (Gelman, Ann Arbor, MI) unterzogen. Die sterile Bulk Plasmid DNA wird aliquotiert und gefroren bei –70°C gelagert (Horn et al., supra).
Rekombinantes Protein
Für die Herstellung von rekombinantem Protein wird das transformierte Plasmid eine Expressionskassette für die Herstellung (Überexpression) eines rekombinanten (für gewöhnlich heterologen) Proteins umfassen. Ein weniger bevorzugtes Verfahren für die Herstellung von Protein wird das Transformieren eines nicht modifizierten Wirtsstamms mit einem einzelnen Plasmid, das RNase koexprimiert, und dem rekombinanten Protein einschließen.
Die RNA kann aus einer Protein Präparation wie folgt entfernt werden. Polyethylenimin, ein Polykation, das stark an Nukleinsäuren bindet, um ein Präzipitat zu bilden, kann zu einem geklärten Zelllysat enthaltend 10 mg/ml Protein in 0,1 M Tris-HCl, pH 8 bei 4°C zugegeben werden. Das Präzipitat wird durch Zentrifugation entfernt (Brewer, S.J. und Sassenfeld, H.M. Engineering proteins for purification. In Protein purification applications: a practical approach. E. Harris und S. Angal Hrsg., IRL Press Oxford, UK, 1990). Es sollte angemerkt werden, dass die Begriffe geklärtes Lysat und klares Lysat austauschbar innerhalb dieser Beschreibung verwendet werden, um ein klares und geklärtes Lysat (CL) zu beschreiben.
Die RNA kann aus einem zellulären Bestandteil, wie Protein, unter Verwendung von Kieselerde entfernt werden, wie beschrieben bei Horn et al. (US Patent Nr.: 5,576,196).
Protein wird aus einer Wirtszell Präparation gemäß einem Protein Reinigungsverfahren gereinigt, das spezifisch für das interessierende Protein ist, und das im Stand der Technik bekannt ist. Verfahren für die Protein Reinigung sind beschrieben in Protein Purification; Principles and Practice, R. Scopes, Hrsg., C.R. Cantor, Springer-Verlag, 1985. Im Allgemeinen werden solche Protein Reinigungsverfahren den Schritt des Kultivierens einer Wirtszelle enthaltend den Protein Expressionsvektor, das Induzieren der Protein Expression und das Extrahieren und Reinigen des interessierenden Proteins umfassen. Zum Beispiel kann Metallchelat Chromatographie verwendet werden, um Influenza Kernprotein zu reinigen, das mit Histidin Resten markiert wurde (beschrieben in Beispiel V).
Andere Wirtszellen als E. coli können mit einem RNase Gen und einem interessierenden Gen durch das Verfahren der PEG Transformation transformiert werden, wie beschrieben in PEG Transformation of Streptomyces: Wohlleben & Moth in Kapitel 6 der Plasmide; A practical Approach (supra).
Andere Wirtszellen als E. coli können auch mit einem RNase Gen und einem interessierenden Gen durch das Verfahren der Elektroporationstransformation transformiert werden, wie beschrieben in Electroporation Transformation of gram positive bacteria, Alonso & Espinosa, in Kapitel 2 von Plasmide; A Practical Approach, (supra).
Regulierte RNase Gen Expression
Um die toxischen Wirkungen von RNase auf die Wirtszeile zu verringern kann das RNase Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors exprimiert werden.
Induzierbare Promotoren, die verwendet wurden, um die Aktivität von RNase in E. coli zu regulieren, schließen trp, T7, Ptac und die P_R und P_L Promotoren des Phagen Lambda ein.
Verfahren zum Induzieren von RNase Expression im Cytoplasma
Die Expression des RNase Gens kann durch einen induzierbaren Promotor reguliert werden, der nur minimale Expression des RNase Gens unter nicht induzierten Bedingungen erlaubt, um toxische Wirkungen von RNase während des Zeitraums des nicht induzierten Wachstums zu verhindern.
Eine Vielzahl von induzierbaren Promotor Systemen kann verwendet werden, um die RNase gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren der beanspruchten Erfindung zu regulieren. Viele der Promotoren (oben beschrieben) können manipuliert werden, so dass die Expression des RNase Gens entweder gesteigert oder verringert ist.
Um RNase induzierbar in dem Cytoplasma zu exprimieren wird die RNase Expression 1-3 Stunden vor dem Ernten der Zellen, welche den interessierenden zellulären Bestandteil bilden, induziert, um zu erlauben, dass intrazelluläre RNA Degradation stattfindet.
Die Dauer des Induktionszeitraums ebenso wie des Zeitraums während dem die RNase exprimiert wird, wird optimiert, um zu erlauben, dass die maximale Degradation von RNA stattfindet ohne die Produktqualität oder zelluläre Integrität negativ zu beeinflussen. Dies wird durchgeführt indem Zellen, die RNase exprimieren, für 5 Min. bis 2 Stunden bei 4°–37°C oder 42°C inkubiert werden, wenn eine Induktion durch Temperatur eingesetzt wird, bei einem pH von 5–8 oder im Fall von RNase A einem pH von 5–10. Wenn zum Beispiel der gebildete zelluläre Bestandteil ein rekombinantes Plasmid ist, werden die Bedingungen derart modifiziert, um das Lysieren der Zellen als ein Ergebnis der Überexpression der intrazellulären RNase zu vermeiden.
Nach dem Abschluss der RNA Degradation (bestimmt wie unten beschrieben) werden die Zellen lysiert, und der zelluläre Bestandteil wird gereinigt (unten beschrieben).
RNase Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors
Die toxischen Wirkungen von RNase wurden auch durch das Exprimieren des RNase Gens unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors verringert. Induzierbare Promotoren, die verwendet wurden, um die Aktivität der RNase Gens zu regulieren, schließen trp, T7, trc, lac, P_tac und die P_R und P_L Promotoren des Phagen Lambda in E. coli (Fujimura et al, supra, Schein et al., supra, Laity et al., supra, Quaas et al., supra, Ribo of al., supra, DelCardayre et al., supra, Okorokov et al., supra, McGeehan und Brenner, et al., supra, Tarragona-Fiol et al., supra) ein. Durch die Verwendung eines induzierbaren Promotors, um die Expression des RNase Gens zu regulieren, kann die Menge von RNase Protein in einer niedrigen Menge unter nicht induzierenden Bedingungen aufrecht erhalten werden.
1. Trp Promotor
Ein Vektor enthaltend ein RNase Gen unter der Kontrolle eines trp Promotors kann gemäß dem Verfahren von Fujimura et al., supra und Schein et al., supra konstruiert werden. In kürze werden der pGH-L9 Vektor enthaltend den trp Promotor und das hGH (humanes Wachstumshormon) Gen mit ClaI und SalI gespalten. Der linearisierte Vektor enthaltend den trp Promotor wird aus einem 1% Agarose Gel nach Elektrophorese isoliert. Ein RNase Gen wird aus einem Vektor durch Spalten mit ClaI und SalI ausgeschnitten oder durch PCR amplifiziert unter Verwendung von 5' und 3' RNase spezifischen Primern, die jeweils eine ClaI und eine SalI Stelle an dem 5' Ende aufweisen. Das DNA Fragment mit dem RNase Gen wird aus einem 5% Polyacrylamid Gel nach Elektrophorese isoliert. Der trp Promotor enthaltende Vektor und das RNase Gen werden gemischt und mit T4 DNA Ligase inkubiert, und das gewünschte Plasmid wird aus E. coli HB101 Transformanten durch Standardverfahren erhalten (Fujimura et al., supra).
2. T7 Promotor
Das RNase Gen kann unterhalb des T7 Promotors (von φ10) kloniert werden. Die Expression von T7 RNA Polymerase wird durch einen induzierbaren Promotor, wie den lacUVS Promotor aus E. coli BL21 (Neubauer und Hofmann, supra) oder λP_L Promotor in Verbindung mit dem c1857 Temperatur sensitiven Repressor (Tabor und Richardson, supra) kontrolliert.
Das lacUVS System beruht auf der lacUV5 kontrollierten Expression der T7 RNA Polymerase. Das RNase Gen kann hinter den starken φ10 Promotor des T7 Phagen kloniert werden, das nur durch die T7 spezifische RNA Polymerase transkribiert wird (Neubauer und Hofmann, supra). Dieses System kann verwendet werden, um die Expression eines RNase Gens durch den T7 Promotor gemäß dem folgenden Verfahren von Neubauer et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 36: 739–744, 1992 zu regulieren.
Escherichia coli BL21 (F- hsdS gal omp T r_B- m_B-), die das Lambda Derivat DE3 in der chromosomalen DNA tragen, auf welches das T7 RNA Polymerase Gen unter P_lac Kontrolle und das Plasmid plysS kloniert wurden. Ein BamH1-Alu1 Fragment enthaltend ein RNase Gen kann in das BamH1-AluI gespaltene Plasmid pET3 hinter den φ10 Promotor des T7 Phagen kloniert werden.
Dieser Promotor weist nur eine Erkennungsstelle für die T7 RNA Polymerase auf. Deshalb sollte die Expression des RNase Gens unter restriktiven Bedingungen sehr gering sein. Jedoch nach der Induktion der T7 RNA Synthese durch IPTG (Sigma, St. Louis, Mo, USA) sollte das RNase Gen sehr stark exprimiert werden (Neubauer et al., supra).
Das RNase Gen kann durch den λPL Promotor in Verbindung mit c1857 Temperatur sensitiven Repressor gemäß dem Verfahren, das in Tabor und Richardson, supra beschrieben ist, reguliert werden.
Die Expression eines RNase Gens kann in einem System reguliert werden, welches das klonierte T7 Gen 1 und einen T7 RNA Polymerase Promotor verwendet. Das Expressionssystem besteht aus zwei kompatiblen Plasmiden, pGP1-2 und pT7-1. pGP1-2, ein Derivat von pACYC177 liefert die Expression der T7 RNA Polymerase. pGP1-2 besteht aus dem Gen 1 des Phagen T7 unter der Kontrolle des induzierbaren λP_L Promotors, und dem Gen für den Hitze sensitiven λ Repressor, c1857.
Um ein gegebenes Gen zu exprimieren, wird das Gen in das zweite Plasmid, pT7-1 eingebaut. pT7-1 enthält einen T7 RNA Polymerase Promotor, φ10, isoliert aus einem 40 bp T7 Fragment. Ein Polylinker mit acht verschiedenen Restriktionsstellen liegt benachbart zu dem Promotor, um die Insertion von DNA Fragmenten zu erleichtern. Die Transkription von dem φ10 Promotor führt zu der Expression des klonierten Gens und des β-Lactamase Gens. Die exklusive Expression dieser Gene wird erreicht nach der Hitze Induktion von T7 RNA Polymerase durch die Zugabe von Rifampicin, um die E. coli RNA Polymerase Transkription abzuschalten (Tabor und Richardson, supra).
Ein Vektor mit einem RNase Gen unter der Kontrolle eines T7 Promotors kann auch gemäß dem Verfahren von Okorokov et al., supra, Laity et al., supra, delCardayre et al., supra und Ribo et al., supra konstruiert werden.
In kürze kann der Expressionsvektor pET21d(+) für die Insertion eines RNase A Gens in Verbindung mit dem Bakteriophagen DE3 lysogenen Stamm BL21(DE3) E. coli verwendet werden, der das T7 RNA Polymerase Gen unter der Kontrolle des lac UV5 Promotors, eingebaut in das Chromosom, aufweist. Das BamHI-HindIII Fragment von pUCBFRA mit der RNase A kodierenden Sequenz kann erneut in den pET21d(+) Vektor kloniert werden. Um den offenen Leserahmen zu erhalten wird ein 19 bp NcoI-BamHI Fragment aus der multiplen Klonierungsstelle von pTZ19RJL1 in die entsprechenden einzigartigen Stellen eingebaut. Dieses Verfahren wurde von Okorokov et al., verwendet, um das Plasmid pETFRA (Okorokov et al., supra) zu konstruieren. Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um einen Vektor herzustellen, der andere RNase Gene unter der Kontrolle eines T7 Promotors enthält.
3. tac Promotor
Ein Vektor mit einem RNase Gen unter der Kontrolle eines ptac Promotors wird gemäß den folgenden Verfahren von Tarragona-Fiol et al., supra konstruiert.
Primer, die komplementär zu dem 5' und dem 3' Ende der kodierenden Sequenz für einen RNase Vorläufer sind, können synthetisiert und für eine PCR Amplifikation verwendet werden. Der 5' Primer (Primer 10) wird eine zusätzliche Sequenzinformation enthalten, die einen kurzen ORF vor dem RNase Vorläufer und eine EcoRI Restrikti onsstelle mit vier zusätzlichen nt, um eine korrekte Spaltung sicherzustellen, einschließt. Der 3' Primer (Primer 11) wird das Terminationskodon für RNase, eine EcoRI Stelle und zusätzliche 4 nt, um eine korrekte Spaltung sicherzustellen, enthalten.
Das zwei Cistron Fragment, das von der PCR Amplifikation unter Verwendung dieser Primer stammt, wird zwei Sätze von kodierenden Sequenzen enthalten: einen für ein Hexapeptid und einen anderen für einen RNase Vorläufer. Die Transkription dieses Fragments wird bicistronische mRNA bilden, die nach der Translation ein Hexapeptid und die prä-RNase bildet.
Die PCR Reaktion wird pQR138 als Matrize (100 ng)/Primer 10 und 11 (jeweils 50 pmol)/alle vier dNTPs (jeweils 0,2 mm)/20 mM Tris-HCl pH 8,0/15 mM (NH₄)₂SO₄/2 mM Mg₂Cl/0,05% NP40/0,05% Tween 20, in einem Gesamtvolumen von 50 oder 100 μl enthalten. Die Reaktionsbestandteile werden schnell gemischt, gefolgt durch Zentrifugation bei 10.000 × g (durchschnittlich) für 2 s bei Raumtemperatur. Ein gleiches Volumen von Paraffinöl wird zugegeben, um Verdampfung während der Reaktion zu vermeiden. Die Matrizen DNA wird vollständig durch Inkubation für 5 Min. bei 92°C für 1,5 Min. denaturiert, bei 55°C für 1 Min. angelagert und bei 72°C für 1,5 Min. verlängert.
Das Plasmid pQR163 (siehe 7) enthält zwei Ribosomen Bindestellen, eine die den tac Promotor des Vektors liefert, und eine andere, für die Translation des zweiten Cistrons, ist innerhalb der kodierenden Sequenz des ersten Cistrons enthalten. Die mRNA, die durch die IPTG Induktion von E. coli Zellen, die pQR163 enthalten, gebildet wird, ist bicistronisch und beginnt von dem tac Promotor. Das erste Cistron kodiert ein 6-Aminosäurepeptid (Met-Phe-Leu-Glu-Asp-Asp). Das Stopp Kodon des ersten Cistrons und das Start Kodon des zweiten Cistrons überlappen, so dass das Ribosom die Translation der mRNA fortsetzen und die prä-RNase bilden wird (Tarragona-Fiol et al., supra).
Gemäß dem Verfahren von Tarragona-Fiol ist die endogene RNase Signalsequenz in dem RNase Expressionsvektor anwesend. Jedoch können andere Signalsequenzen auf das RNase Gen wie unten beschrieben kloniert werden.
Wenn die endogene Signalsequenz anwesend ist, wird die synthetisierte Vorläufer Form von RNase in das Periplasma transloziert. Eine N-terminate Sequenzierung wird verwendet, um zu zeigen, dass die Signalsequenz korrekt gespalten wurde. Die oxidative Umgebung des Periplasmas wird die korrekte Faltung der RNase erlauben, um das native Enzym zu bilden, wie durch die Gewinnung des vollständig aktiven Enzyms bewiesen wird (Tarragona-Fiol et al., supra).
4. P_R und P_L Promotoren von Phage Lambda
Ein Vektor mit einem RNase Gen unter der Kontrolle des P_R Promotors von Phage Lambda wird gemäß dem folgenden Verfahren von Okorokov et al., supra konstruiert.
Die P_R Expressionskassette kann aus dem Vektor pCQV2 mit dem P_R Promotor des E. coli λ Phagen unter cl Repressor Regulation isoliert werden. Die Kassette wird von einer EcoRI Restriktionsstelle unterhalb des cl kodierenden Leserahmens und einer BamHI Stelle unterhalb des P_R Promotors umgeben.
Die RNase Gene können aus einem Vektor unter Verwendung von geeigneten Restriktionsenzymen isoliert werden, die mit pCQV2 kompatibel sind. Das RNase Gen kann unter der Kontrolle des P_R Promotors in der Abwesenheit einer Signalsequenz kloniert werden. Die RNase Gene können auch aus einem Vektor durch PCR unter Verwendung von Primern isoliert werden, die ein amplifiziertes Fragment bilden, welches das RNase Gen enthält und die geeigneten Restriktionsstellen an den Enden aufweist.
Ein Vektor, der verwendet werden kann, um das Expressionskassetten Fragment mit dem RNase A Gen zu klonieren, ist pUC19. Die Fragmente EcoRI-BamHI aus pCQV2 und BamHI-HindIII aus pUCBFRA, mit dem phoA Signal Peptid-RNase A Fusionsleserahmen, kann mit pUC19, der mit EcoRI/HindIII gespalten ist, in einer drei Bestandteile Ligationsreaktion verbunden werden. Dieses Verfahren wurde von Okorokov et al., supra verwendet, um das Plasmid pEXFRA zu konstruieren.
Ein Vektor mit einem RNase Gen unter der Kontrolle des P_L Promotors von Phage Lambda wird gemäß dem folgenden Verfahren von McGeehan und Breener, supra, konstruiert.
Das Gen für RNase kann in den Vektor pN1 kloniert und in das Plasmid pAL181 zusammen mit einem Linker, der das Methionin Start Kodon enthält, transferiert werden. In diesem Plasmid wird das RNase Gen unmittelbar nach der Shine Dalgarno Sequenz in pAL181 beginnen.
5. Lac Promotor
Ein Vektor mit einem Gen, das durch den lac Operator/Promotor in Verbindung mit dem lac Repressor reguliert ist, kann konstruiert werden wie in dem Abschnitt mit der Überschrift Klonierung von RNase in pN1 oder gemäß Neubauer und Hofmann, supra beschrieben ist.
Ein Vektor mit einem RNase Gen unter der Kontrolle des lac Operators/Promotors wird gemäß dem folgenden Verfahren von Quass et al., supra konstruiert.
pIN-III-ompA2 wird mit HindIII und EcoRI gespalten. Ein RNase Gen, das mit denselben Enzymen gespalten ist, kann in pIN-III-ompA2 eingebaut werden. Weil das gesamte Gen unter der Kontrolle des lpp Promotors und dem lac Promotor-Operator steht, wird die Gen Expression durch den lac Repressor reguliert, d.h. sie ist durch die Zugabe von Isopropyl-β-D-thiogalactosid induzierbar.
Dieses Verfahren wurde von Quaas et al. verwendet, um das Plasmid pA2T1-1 herzustellen, in dem das RNase T₁ Gen innerhalb des Leserahmens mit dem ompA Signalpeptid Gen fusioniert ist. Jedoch kann der lac Promotor auch verwendet werden, um die Expression eines RNase Gens zu regulieren, das innerhalb des Leserahmens mit einer Vielzahl von Signalsequenzen (unten beschrieben) fusioniert ist.
6. Trc Promotor
Ein Vektor mit einem RNase Gen unter der Kontrolle des trc Promotors wird gemäß dem Verfahren von Okorokov et al., supra konstruiert.
Ein Expressionsvektor, der den starken induzierbaren trc Promotor bereitstellt, ist pKK233-2. pKK233-2 enthält die lacZ Ribosomen Bindestelle und ein ATG Initiationskodon, das durch Spaltung an der einzigartigen NcoI Restriktionsstelle zugänglich ist. Die multiple Klonierungsstelle wird von dem Gen gefolgt, das für 5S rRNA und die starken Transkriptionssignale T1 und T2 von rrnB E. coli (Okorokov et al., supra) kodiert. Ein RNase Gen kann aus einem Vektor durch Spaltung mit Enzymen isoliert werden, die mit der multiplen Klonierungsstelle von pKK233-2 kompatibel sind. Alternativ kann ein RNase Gen durch PCR unter Verwendung von Primern amplifiziert werden, welche die Synthese eines Fragments steuern, das Restriktionsenzymstellen aufweist, die mit der multiplen Klonierungsstelle von pKK233-2 kompatibel sind.
Induzierbare Promotor Systeme
1. Temperatur induzierbare Promotoren
Der P_L Promotor kann zusammen mit dem cl857I Repressor verwendet werden, um die Expression des RNase Gens zu regulieren.
Ein Vektor, der ein RNase Gen unter der Kontrolle des P_L Promotors exprimiert, kann wie in dem Abschnitt mit der Überschrift RNase Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors beschrieben, hergestellt werden.
Induktion
Die cl857I Repressor ist temperatursensitiv und reprimiert die Gen Expression bei 30°C. Wenn die Temperatur auf 42°C angehoben wird, wird der Repressor inaktiviert, und die Expression findet statt (Tabor und Richardson, supra).
Die Induktion kann gemäß dem folgenden Verfahren von McGeehan et al., supra durchgeführt werden. LB Medium (50 ml) mit Ampicillin (125 μg/ml) wird mit einer frischen Kolonie inokuliert, die aus dem Wachstum von E. coli stammt, das mit einem Vektor transformiert wurde, der ein RNase Gen unter der Kontrolle des P_L Promotors umfasst, und das anschließend bis zur Dichte über Nacht angezogen wurde. Diese Kultur wird verwendet, um vier 5L Erlenmeyer Kolben zu inokulieren, von denen jeder 1 Liter LB/amp (100 μg/ml) Medium enthält. Diese Kulturen werden bei 30°C bis zu einem A₅₅₀ Wert von 1,2 in einem Schüttler angezogen. Die Kolben werden in einen Schüttler, der auf 42°C aufgewärmt ist, transferiert, und LB Medium (400 ml), das auf 72°C vorgeheizt ist, wird zu jedem Kolben zugegeben, um die Temperatur schnell auf 42°C zu bringen. Das Schütteln wird für 25 Min. fortgesetzt, und die Zellen werden durch Zentrifugation (10 Min. bei 4000 × g) gewonnen. Die bakterielle Paste wird in 10 × (v/w) Denaturierungspuffer (8 M Harnstoff, 40 mM Sarcosin, 20 mM Tris, 40 mM Mercaptoethanol, 1 mM EDTA, pH 7,8) resuspendiert. Die Suspension wird durch eine französische Presse (4000 lb/Inch²) passagiert, und die unlöslichen Materialien werden durch Zentrifugation für 10 Min. bei 15000 × g entfernt. Das geklärte Material wird dialysiert (M_r > 3500 Auschluss) mit zwei Änderungen des Faltungspuffers (100 mM NaCl, 50 mM Tris, 4 mM oxidiertes Glutathion, 4 mM reduziertes Glutathion, 1 mM EDTA, 0,4 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,02% NaN₃, pH 7,6). Das Dialysat wird auf eine Sephadex G50 Größensäule geladen und mit einer linearen Fließgeschwindigkeit von 2,5–3 ml h^–1·cm^–2 unter Verwendung von Elutionspuffer (100 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,4 mM PMSF, 0,02% NaN₃) eluiert. Die Fraktionen, die RNase enthalten, werden durch katalytische Aktivität gegen eine synthetische RNA (UpA) identifiziert. Diese Fraktionen werden vereinigt und vierfach unter Verwendung einer Amicon Ultrafilter Vorrichtung mit einem YM5 Filter (M_r > 5000 Ausschluss) konzentriert. Diese Lösung wird in einen neuen Puffer (100 mM NH₄OAC, 0,02% NaN₃, pH 6,1) dialysiert und anschließend auf eine Säule mit Affinitätsharz (4 ml, pUp Sepharose, Pharmacia) durch Schwerkraft aufgetragen. Das Eluat unter diesen Bedingungen sollte im Wesentlichen frei von RNase Aktivität sein. Die Säule wird mit 10 – 20 Volumina Puffer gewaschen, und die RNase wird unter Verwendung eines neuen Puffers (200 mM NH₄OAc, 300 mM Cytidylsäure, pH 6,1) eluiert. Kleine Fraktionen (1,5 ml) werden gesammelt. Fraktionen mit RNase Aktivität werden vereinigt und gegen zwei Änderungen des Puffers (100 mM NH₄Oac pH 6,1) dialysiert, um die Cytidylsäure zu entfernen. Die Lösung wird in ein steriles Gefäß gegeben und bei 4°C gelagert (McGeehan und Benner, supra).
Ein Vektor, der ein RNase Gen unter der Kontrolle des P_R Promotors exprimiert, kann hergestellt werden wie in dem Abschnitt mit der Überschritt RNase Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors beschrieben ist.
Induktion
Die Induktion kann gemäß dem folgenden Verfahren von Okorokov et al, supra durchgeführt werden. Eine 6-h Kultur des E. coli Stamms, der den Expressionsvektor trägt, mit einem RNase Gen unter der Kontrolle des P_R Promotors, zum Beispiel pEXFRA, wird in LB Medium, das mit Ampicillin (125 μg/ml) ergänzt ist, bei 30°C bei 220 rpm angezogen. Diese Kultur wird für die Inokulation von reichem Medium mit 24 g/Liter Hefeextrakt, 12 g/Liter Trypton, 12,54 g/Liter K₂HPO₄, 12,54 g/Liter KH₂PO₄, 4 ml/Liter Glycerol und 125 mg/Liter Ampicillin und eingestellt bei pH 7,1 verwendet.
Nach dem Wachstum bei 28°C und 220 rpm in reichem Medium bis zu einer Dichte von OD₆₀₀ ~ 0,6 wird die Kultur durch Hitzeschock induziert. Die folgenden Hitzeschock Protokolle können verwendet werden. Die Temperatur der Kultur kann auf 42°C durch Zugabe eines halben Volumens von vorgewärmtem (85°C) reichem Medium angehoben werden. Die Kultur wird anschließend bei 42°C, 120 rpm für 30 Min. bewegt. Die Temperatur wird anschließend auf 37°C verringert, und das Schütteln (220 rpm) wird für weitere 10 bis 12 h fortgesetzt.
Alternativ kann die Temperatur der Kultur auf 37°C durch direktes Inokulieren in vorgewärmtes (37°C) reiches Medium angehoben werden. Die Kultur wird anschließend für weitere 16–18 h bei 37°C und 220 rpm angezogen.
2. Induktionskontrollierte Promotoren
Der lac Operator/Promotor in Verbindung mit dem lac Repressor kann verwendet werden, um die Expression des RNase Gens zu regulieren.
Ein Vektor, der das RNase Gen unter der Kontrolle des lac Operators/Promotors exprimiert, kann hergestellt werden wie in dem Abschnitt mit der Überschritt RNase Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors beschrieben ist.
Induktion
Die Fermentation wird in einem Medium durchgeführt, in dem der lac Operator reprimiert ist, zum Beispiel LB Medium ohne Lactose oder Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG).
Die Expression wird durch die Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 0,5 mM oder Lactose (Neubauer und Hofmann, FEMS, Micro. Reviews: 14, 99–102, 1994, Quass et al., supra und Donovan et al., J. Industrial Microbiology, 16: 145–154, 1996) induziert. Die Induktion mit IPTG kann durchgeführt werden wie im Beispiel 3 unten beschrieben ist, und gemäß dem Verfahren von Quass et al., supra.
Um die Transkription eines RNase Gens unter der Kontrolle des lac Promotors zu induzieren wird IPTG in einer Endkonzentration von 0,1 bis 0,5 mM zu einer flüssigen Kultur zugegeben, die bis zur einer Absorption von 0,5 bei 600 nm angezogen wurde. Die Zellen werden über Nacht angezogen und werden durch Zentrifugation (8500 × g, 15 Min., 4°C) geerntet. Die RNase wird aus den Zellen durch osmotischen Schock gemäß dem modifizierten Protokoll von Koshland und Botstein freigesetzt. Das Pellet einer 1 Liter Kultur wird in 40 ml eiskaltem Tris-HCl/EDTA Puffer (50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA) mit 15% Sucrose resuspendiert und auf Eis für 30 Min. gehalten. Nach der Zentrifugation werden die Zellen in eiskaltem Tris-HCl-EDTA Puffer resuspendiert, für weitere 30 Min. auf Eis inkubiert und erneut zentrifugiert. Die Überstände aus den zwei Waschschritten werden vereinigt, der pH auf 2,5 mit 15% HCl bei 4°C eingestellt und die präzipitierten Proteine durch Zentrifugation (12000 × g, 25 Min., 4°C) getrennt. Der pH des Überstands wird bei 7,5 mit 10 M NaOH eingestellt, auf 200 ml mit Tris/HCl-EDTA Puffer verdünnt und auf eine DEAE-Sepharose CL-6B Säule (12 ml Säulenvolumen) aufgetragen, die mit Tris-HCl-EDTA Puffer äquilibriert wurde. Die Gewinnung wird durch Gradientenelution (100–700 mM NaCl in Tris/HCl/EDTA Puffer) erreicht. Fraktionen, die RNase Aktivität enthalten, werden vereinigt und durch eine Bio-Gel P-30 Säule (1,5 × 50 cm) unter Verwendung von 50 mM Ammoniumacetat als Laufpuffer (Quass et al., supra) passagiert.
Die Stärke des lac Promotors könnte durch Klonieren des trp Promotors oberhalb des lac Promotors, um den tac Promotor zu bilden, manipuliert werden, um die Expression zu steigern.
Die Affinität des lac Repressors für seinen Operator kann manipuliert werden, um die Bindung und folglich die Expression des Gens unter der Kontrolle des lac Promotors zu steigern oder zu verringern (Müller, et al., J. Mol. Biol., 257: 21–29, 1996).
3. Durch Nährstoffentzug induzierbare Promotoren
Um die Menge von RNase zu kontrollieren, die in einer Wirtszelle gebildet wird, könnte das RNase Gen unter die Kontrolle des trp Operators in Verbindung mit dem trp Repressor angeordnet werden.
Ein Vektor, der ein RNase Gen unter der Kontrolle des trp Operators in Verbindung mit dem trp Repressor exprimiert, kann hergestellt werden, wie in dem Abschnitt mit der Überschrift RNase Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors beschrieben ist.
Induktion
Während des Wachstums in der Anwesenheit von Tryptophan wird die Expression des kontrollierten Gens reprimiert (Schein und Noteborn, Biotechnology, 6: 291–294, 1988), und nach dem Tryptophan Entzug wird die Expression des Gens induziert. Der trp Promotor kann auch durch die Einführung von IAAA (3-Indolacrylsäure) gemäß dem Verfahren von Fujimura et al., supra induziert werden.
E. coli, die ein Plasmid mit einem RNase Gen unter der Kontrolle eines trp Promotors, zum Beispiel pTPW1, tragen, werden bei 37°C in 4 Litern M9-Casaminosäure Medium mit Ampicillin (20 μg/ml) angezogen. Nach der Inkubation für 1,5 h (optische Dichte der Kultur bei 660 nm, 0,05–0,1) wird 3-Indolacrylsäure (IAA, 40 μg/ml) zu dem Medium zugegeben, um die Expression des Fusionsgens zu induzieren. Die Zellen werden für weitere 8 h angezogen, durch Zentrifugation geerntet (3500 x g, 10 Min., 4°C) und in isotonischer Salzlösung (Fujimura et al., supra) gewaschen.
Die folgenden Reinigungsschritte können verwendet werden, um ein RNase Protein zu reinigen, das in den periplasmatischen Raum segregiert wurde. Proteine in dem pe riplasmatischen Raum werden durch osmotische Schockbehandlung durch eine modifizierte Version des Protokolls von Cornelis et al., freigesetzt. Die mit Salzlösung gewaschenen Zellen werden in 1 Liter 25% Sucrose mit 1 mM EDTA und 30 mM Tris-HCl (pH 8,0) suspendiert, und die Suspension wird bei 37°C für 30 Min. geschüttelt. Die Zellen werden anschließend durch Zentrifugation (14000 × g, 1 h , 20°C) sedimentiert, in 1 Liter eiskaltem 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) resuspendiert und bei 0°C für 30 Min. geschüttelt. Die Suspension wird zentrifugiert (10000 × g, 15 Min., 4°C), und der resultierende Überstand wird als die periplasmatische Fraktion verwendet. Die cytoplasmatische Fraktion wird aus den sedimentierten Zellen durch Zerstören mit Lysosom in der Anwesenheit von SDS hergestellt. Die RNase wird aus der periplasmatischen Fraktion durch zwei Schritte der Säulenchromatographie gereinigt: zunächst Anionen Austausch Chromatographie auf einer Q-Sepharose Säule, die mit 0,15 M NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) äquilibriert wurde und eluiert mit einem linearen NaCl Gradienten (0,15 – 0,45 M) in 20 mM Tris-HCl (pH 7,5); anschließend Gel Chromatographie auf einer Sephadex G-50 Säule, aus der das Enzym mit 20 mM Ammoniumbicarbonat eluiert wurde. Das Enzym aus jedem Reinigungsschritt wird durch SDS-PAGE analysiert (Fujimura et al., supra).
4. Bakteriophagen Promotoren
Das T7 RNA Polymerase/Promotor System schließt einen Promotor ein, der stärker ist als die oben beschriebenen Promotor Systeme.
Ein Vektor, der ein RNase Gen unter der Kontrolle des T7 RNA Polymerase/Promotor Systems exprimiert, kann hergestellt werden wie in dem Abschnitt mit der Überschrift RNase Gen unter der Kontrolle eines induzierbaren Promotors beschrieben ist.
Ein RNase Gen wird unterhalb des T7 Promotors (φ10) kloniert. Die Expression von T7 RNA Polymerase wird durch einen induzierbaren Promotor, wie den lacUV5 Promotor, wie er in E. coli BL21 (Neubauer und Hofmann, supra) gefunden wird, oder den λP_L Promotor mit dem c1857 Temperatur sensitiven Repressor (Tabor und Richardson, 82: 1074–1078, 1985) kontrolliert.
Die Expression des RNase Gens hängt von der Expression der Bakteriophagen RNA Polymerase ab. In dem Fall, dass die Expression der RNase von dem T7 Promotor unter nicht induzierten Bedingungen geringfügig stattfindet (engl.: leaky expression), kann ein transkriptioneller Terminator für die E. coli RNA Polymerase in den gewünschten Promotor für die T7 RNA Polymerase eingebaut werden, so dass die Expression der Polymerase von der transkriptionellen Durchlesung abhängig ist (Tabor und Richardson, supra).
Die Expression eines RNase Gens unter der Kontrolle des T7 Promotors kann durch das folgende Verfahren von Okorokov et al., supra erhalten werden.
Eine 6-h Kultur des E. coli Stamms, der einen Expressionsvektor umfassend ein RNase Gen unter der Kontrolle des T7 Promotors, zum Beispiel pETFRA trägt, wird in LB Medium, das mit Ampicillin (125 μg/ml) ergänzt bei 30°C bei 220 rpm angezogen. Diese Kultur wird für die Inokulation von reichem Medium mit 24 g/Liter Hefeextrakt, 12 g/Liter Trypton, 12,54 g/Liter K₂HPO₄, 12,54 g/Liter KH₂PO₄, 4 ml/Liter Glycerol und 125 mg/Liter Ampicillin verwendet und auf pH 7,1 eingestellt. Nach dem Wachstum bei 28°C und 220 rpm in reichem Medium auf eine Dichte von OD₆₀₀ ~ 0,6 wird die Expression durch die Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 1 mM mit einer weiteren Inkubation für 10 h (Okorokov et al., supra) induziert.
5. Inhibitor Induktion
Die Bacillus RNase, baRNase, ist in der Anwesenheit ihres spezifischen intrazellulären Inhibitors Barstar (Hartley, supra) inaktiv. Die Anwesenheit des Barstar Gens in der Wirtszelle, die baRNase exprimiert, supprimiert die letale Wirkung von baRNase Aktivität, wenn beide Gene gleichzeitig exprimiert werden. Die Anwesenheit des Barstar Gens unter der Kontrolle eines reprimierbaren Promotors könnte verwendet werden, um die baRNase Aktivität zum Ende der Fermentation zu exprimieren.
Wenn das Gen für Wildtyp baRNase, die allein letal ist, auf demselben Plasmid wie das Barstar Gen auf einem pUC19-PC194 Shuttle Vektor angeordnet ist, dann wird die baRNase korrekt prozessiert und durch Bacillus subtilis segregiert, aber sie bleibt in E. coli zellgebunden. Mit Barstar und dem phoA Promotor-Signalsequenz Konstrukt, das eine E. coli Signal Peptidasestelle an dem N-Terminus der reifen baRNase aufweist, nach der Induktion durch wenig Phosphat, wird authentische baRNase durch E. coli in einer Menge von 20 mg/l segregiert. Eine variable Menge dieser baRNase, für gewöhnlich ungefähr die Hälfte, wird in dem Kulturmedium auftreten, der Rest verbleibt im periplasmatischen Raum. Nach der Zugabe von Essigsäure auf 5% wird jedoch die gesamte baRNase in das Medium freigesetzt, von wo aus es direkt auf Phosphocellulose absorbiert werden kann. Mehr als 90% des Proteins, das von der Phosphocellulose bei hohem Salzgehalt eluiert, ist baRNase. Im Wesentlichen reine baRNase kann anschließend durch Salzgradienten Chromatographie auf einem starken Anionen Austauscher, wie SP-Trisacryl (Pharmacia) Hartley, supra) erhalten werden.
2. Induzierbare RNase Expression in dem periplasmatischen Raum oder dem zellulären Cytoplasma
RNase Gen, das in das Periplasma oder den zellulären Überstand segregiert wird
Um beide toxische Wirkungen von übermäßig gebildeter RNase auf die Wirtszelle zu verhindern und um Proteolyse der exogenen RNase durch Wirtszell Proteasen zu verhindern, wird das RNase Gen modifiziert, um ein Protein zu kodieren, das nicht in das Cytoplasma der Wirtszelle segregiert wird. Die RNasen können als Fusionsproteine mit Signalpeptiden gebildet werden, welche die Sekretion des Enzyms auf entweder den periplasmatischen Raum oder den Kulturüberstand richten. Die Signalpeptide, die erfolgreich verwendet wurden, um die RNase aus dem Cytoplasma zu leiten, schließen das endogene RNase Sekretionssignal (Schein et al., supra, Tarragona-Fiol et al., supra, Russo et al., supra), das E. coli alkalische Phosphatase Signalpeptid (phoA) (Fujimura et al., supra, Okorokov et al., supra), die pelB Sequenz (Ribo et al., supra, DelCardayre et al., supra) und das Signalpeptid des OmpA Proteins der E. coli äußeren Membran (Quaas et al., supra) ein.
Die RNase Gene können auch als Fusionsproteine exprimiert werden. Zum Beispiel wird ein RNase A Gen 10 Fusionsprotein als ein Einschlusskörper exprimiert (Laity et al., supra, Nambier of al., Eur. J. Biochem. 163: 67–71, 1987).
Die Anwesenheit des Gens, das für das Bakteroicin Freisetzungsprotein (BRP) (engl.: Bacteroicin Release Protein) in der Wirtszelle kodiert, erlaubt die Sekretion der überexprimierten RNase in den Kulturüberstand anstatt in das Periplasma. Wenn das BRP Gen mittelmäßig induziert wird, wird die Lyse der Wirtszelle vermieden, was eine Protein Herstellung in großem Maßstab in kontinuierlicher Kultur erlaubt (van der Wal et al, FEMS Microbiol. Rev. 17: 381–399, 1995). Dieses System kann für die Sekretion von RNase verwendet werden.
Indem der Transport des RNase Enzyms auf einen Ort außerhalb des Wirtscytoplasma gerichtet wird, werden die Probleme von RNase Toxizität und RNase Degradation durch Proteolyse minimiert.
Die Induktion von RNase Expression wird gemäß den Parametern reguliert, die in dem Abschnitt definiert sind, der die Überschrift induzierbare RNase Expression im Cytoplasma trägt. Jedoch wird RNase in den periplasmatischen Raum segregiert und wird bis zur Zelllyse nicht das intrazelluläre Produkt kontaktieren.
Um die neu hergestellte RNase A aus dem Cytoplasma zu leiten, kann eine Leadersequenz an das RNase Gen kloniert werden, so dass das Protein entweder in den Kultur Überstand oder in den periplasmatischen Raum segregiert wird.
1. Endogenes RNase Sekretionssignal
Das E. coli RNase I Gen weist eine endogene Leadersequenz auf, die das Gen Produkt in das Periplasma leitet, und, wenn sie auf einem Plasmid mit einer hohen Kopienzahl überexprimiert wird, beeinflusst sie nicht das Zeltwachstum (Meador und Kennell, Gene, 95: 1–7, 1990).
Die endogene RNase Leadersequenz kann an ein RNase Gen kloniert werden, wie beschrieben ist in dem Abschnitt mit der Überschrift RNase Gen, segregiert in das Periplasma oder den zellulären Überstand.
Eine Vielzahl von Signalpeptiden wurden erfolgreich verwendet, um die Sekretion eines RNase Proteins in den periplasmatischen Raum oder den zellulären Überstand zu leiten. Diese schließen ein endogenes RNase Sekretionssignal, das E. coli alkalische Phosphatase Signalpeptid (phoA) und die pelB Sequenz (Fujimura et al., supra, Schein et al., supra, DelCardayre et al., supra, Okorokov et al., Tarragona-Fiol et al., supra), ein.
2. Pho A
Die Einführung einer phoA Leadersequenz in das baRNase Gen, das unter der Kontrolle eines tac Promotors steht, hat zu Ausbeuten von bis zu 1 g/l BaRNase (Hartley, supra) geführt. Diese Sequenz erlaubt die wirksame Prozessierung und Sekretion von RNase in den Kulturüberstand und den periplasmatischen Raum des E. coli Wirtes.
Die Pho A Sequenz kann an ein RNase Gen gemäß den Verfahren von Fujimura et al., supra kloniert werden.
Ein Vektor mit einem RNase Gen unter der Kontrolle eines trp Promotors wird gemäß den Verfahren von Fujimura et al., supra, wie beschrieben, konstruiert. Der trp Promotor enthaltende Vektor, das RNase Gen und das synthetische Gen für das APase Signalpeptid werden gemischt und mit T4 DNA Ligase inkubiert, und das gewünschte Plasmid wird aus E. coli HB101 Transformanten durch Standardverfahren erhalten (Fujimura et al., supra). Fujimura et al. haben dieses Verfahren verwendet, um pTPW1 zu konstruieren, einen Vektor, der das RNase T1 Gen unter der Kontrolle des trp Promotors umfasst. Dieses Verfahren kann derart modifiziert werden, dass das synthetische Gen für das APase Signalpeptid an andere RNase Gene (einschließlich der beschriebenen) unter der Kontrolle entweder eines konstitutiven Promotors oder einem der oben beschriebenen induzierbaren Promotoren kloniert werden kann.
3. Pel B
Die Pel B Sequenz wurde verwendet, um die Sekretion von RNase in das Periplasma in einer Form zu leiten, die nach einem Lösungsschritt aktiv ist (Ribo et al., supra, delCardayre et al., supra).
Die Pel B Sequenz kann an ein RNase Gen durch das folgende Verfahren, das in delCardayre et al., beschrieben ist, kloniert werden. Das Plasmid pBXR (wobei BXR die bakterielle Expression von RNase A betrifft) wird wie folgt konstruiert. Ein Fragment, das die cDNA für RNase A trägt, das zwischen die MscI und SalI Stellen von pET22B(+) eingebaut werden kann, wird durch PCR gebildet. Das amplifizierte Fragment wird Banden gereinigt, mit T4 DNA Polymerase behandelt, um irgendwelche überhängenden Basen, die durch taq Polymerase zurückgelassen wurden, zu entfernen, und mit SalI gespalten. Das resultierende Fragment weist die RNase A cDNA, flankiert an ihrem 5' Ende durch zwei CG Basenpaaren (die ein stumpfes Ende bilden) und an ihrem 3' Ende durch ein SalI überhängendes Ende auf. Dieses Fragment wird anschließend mit dem Banden gereinigten MscI-SalI Fragment des E. coli Expressionsplasmids pET22B(+) durch T4 DNA Ligase ligiert. Eine PstI Stelle in dem Amp Gen wird an schließend durch seitengerichtete Mutagenese unter Verwendung des Oligonukleotids JHH16 entfernt, was die PstI Stelle in der RNase A cDNA zu der einzigen solchen Stelle in dem Plasmid macht. Die Integrität dieser Konstruktion wird durch Restriktions- und Sequenzanalyse bewertet.
Plasmide, welche die pel B Sequenz kloniert an andere RNase Gene aufweisen, können ebenfalls konstruiert werden. Ein Fragment mit dem RNase Gen und den geeigneten Restriktionsenzymen (z.B. Stellen, die mit dem linearisierten pET22B(+) kompatibel sind) können wie beschrieben ligiert werden.
4. Bacteroicin Freisetzungsprotein
Die Anwesenheit des Gens, das für das Bacteroicin Freisetzungsprotein (BRP) in der Wirtszelle kodiert, erlaubt die Sekretion der überexprimierten RNase in den Kulturüberstand anstelle in das Periplasma. Wenn das BRP Gen mäßig induziert wird, wird die Lyse der Wirtszelle vermieden, was die Protein Herstellung in der kontinuierlichen Kultur im großen Maßstab erlaubt (van der Wal et al., FEMS Microbiol. Reviews 17, 1995, 381–399).
Zellen, die sowohl ein RNase Protein als auch BRP exprimieren, können durch Kotransformation eines Plasmids mit dem RNase Gen mit einem kompatiblen Plasmid mit dem BRP Gen hergestellt werden. Alternativ können beide Gene auf demselben Plasmid kodiert sein.
Die Expression des BRP Gens kann durch die Zugabe von MitomycinC (Plasmid pSW1 MoBiTec GmbH) oder IPTG (Plasmid pJL3, MoBiTec GmbH) (siehe die Protokolle von MoBiTec GmbH, Wagenstief 5: D-37077 oder Van der Wal et al., supra) induziert werden.
Die segregierte RNase kann aus dem Überstand gereinigt werden, wie von Tarragona-Fiol et al. (supra) für RNase A beschrieben ist, oder unter Verwendung von ThioBond^TM Harz, wenn die RNase als eine Thioredoxin Fusion (Invitrogen) markiert ist oder unter Verwendung von ProBond^TM Metallbindungsharz, wenn die RNase mit His markiert ist (Invitrogen).
Die gereinigte RNase kann anschließend zu dem Zelllysat/Überstand (abhängig von der Anordnung des gewünschten Produkts, z.B. intrazelluläres Plasmid/Protein oder extrazelluläres Protein) zugegeben werden und bis zur vollständigen RNA Spaltung inkubiert werden. Das Plasmid/Protein wird anschließend gereinigt, wie in dem Abschnitt mit der Überschrift Herstellung von rekombinanter DNA oder Protein beschrieben ist (Horn et al., supra).
5. Fusionsproteine
Das RNase Gen kann auch mit einem Gen fusioniert werden, das es erlaubt, dass das RNase Protein in einer löslichen Form oder als Einschlusskörper exprimiert wird. Zum Beispiel könnte das RNase Gen mit dem Thioredoxin Gen fusioniert werden (R&D Systems, LaVallie et al., BIO/Technology 11, 1993, 187–193), und nach der Tryptophan Induktion könnte es nach dem Einfrieren/Auftauen des bakteriellen Pellets selektiv freigesetzt werden. Wenn das Thioredoxin-RNase Fusionsprotein aktiv ist, besteht kein Bedarf, das Thioredoxin durch Protease Spaltung freizusetzen.
Das gewählte RNase Gen kann innerhalb des Leserahmens mit dem Thioredoxin Gen in den Polylinker von pTRXFUS (Invitrogen) (LaVallie et al., supra) kloniert werden. Dieser Vektor wird anschließend verwendet, um den Herstellungswirt E. coli G1724 zu transformieren. E. coli Zellen werden bis zu einer OD550 von 0,5 kultiviert, und Tryptophan wird in einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml, um die Fusionsprotein Synthese zu induzieren, zugegeben.
Wenn der obige Herstellungswirt auch der Wirt für heterologe Gen Expression oder für die Herstellung von Plasmid ist, dann werden die Zellen solange inkubiert, bis die RNA ausreichend gespalten wurde. Die Protein oder Plasmid Reinigung kann anschließend wie beschrieben durchgeführt werden.
Wenn der obige Herstellungswirt nicht der Wirt ist, der für die heterologe Gen Expression oder für die Herstellung eines heterologen Plasmids verwendet wird, dann kann das RNase Fusionsprotein durch Zelllyse (französische Presse) oder durch osmotischen Schock, wie von LaVallie et al., supra beschrieben ist, oder durch Einfrieren/Auftauen, wie von Johnson & Hecht, M.H. Bio/Technology 12: 1357–1359, 1994 beschrieben ist, freigesetzt werden. Das freigesetzte Protein kann anschließend unter Verwendung eines ThioBond Harzes, wie von Invitrogen beschrieben ist oder wie von Tarragona-Fiol et al., supra beschrieben ist, gereinigt werden.
Die gereinigte RNase kann anschließend zu dem Zelllysat der Wirtszelle, die das heterologe Gen oder das Plasmid bildet, zugegeben werden, wie beschrieben wurde (siehe Birnboim und Doly, supra und Ausubel, Current Protocols, supra).
RNase Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors
In diesen erfindungsgemäßen Verfahren und Wirtszellen ist es bevorzugt, das RNase Gen konstitutiv zu exprimieren. Somit wird das RNase Gen unter der transkriptionellen Kontrolle eines konstitutiven Promotors angeordnet, der in der gewählten Wirtszelle funktionell ist. Konstitutive Promotoren sind im Stand der Technik für viele verschiedene Typen von Bakterien gut bekannt. Zum Beispiel schließen in E. coli solche Promotoren den Glukokinase Promotor des 6-Phosphoglukonat Dehydrogenase Promotors ein (Neidhart, in Salmonella typhimurium und Escherichia coli Cellular and Molecular Biology ASM, Fraenkel, D., Kapitel 12, 0.142, 1987).
Konstitutive periplasmatische Expression von RNase
Ein RNase Gen kann derart verändert werden, um Protein herzustellen, das konstitutiv exprimiert und in dem Periplasma angeordnet ist, wie in dem Abschnitt mit der Überschrift RNase Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors beschrieben ist.
Um eine konstitutive RNase Expression in dem Periplasma zu erreichen, wird kein Induktionszeitraum benötigt. Die RNase wird sich in dem Periplasma anreichern, wenn die Zellen wachsen (Tarragona-Fiol et al., supra).
RNase Spaltung in Wirtszellen, die RNase in den Kultur Überstand segregieren
Wenn sowohl der interessierende zelluläre Bestandteil als auch die RNase in den Überstand segregiert werden, egal ob von derselben Zelle oder von verschiedenen Zellen, sollte die Zelllyse vermieden werden, weil das interessierende Produkt durch Bestandteile kontaminiert sein wird, die von platzenden/sterbenden Zellen freigesetzt werden. Zum Beispiel ist Rinder RNase A sehr stabil und ist in einer Fermentationsnährlösung bei pH 6,8–7,4 immer noch aktiv.
Die zellulären Bestandteile können direkt aus dem Kulturüberstand ohne Freisetzung anderer Kontaminanten, die zellulär von lysierenden Zellen abgeleitet sind, gesammelt werden. Die Zellen werden aus dem Überstand durch Zentrifugation für 25 Min. bei 10.000 g entfernt. Der zellfreie Überstand, der sowohl den zellulären Bestandteil als auch die RNase enthält, wird inkubiert, bis im Wesentlichen die gesamte RNA degradiert ist.
Der optimale Inkubationszeitraum ist die Zeit, die benötigt wird, um im Wesentlichen die gesamte RNA von einem zellulären Bestandteil zu degradieren, der entweder ein Protein, DNA oder CHO (wie hier definiert) ist. Der optimale Inkubationszeitraum, der benötigt wird, um im Wesentlichen die gesamte RNA aus einem zellulären Bestandteil zu degradieren, wird durch die folgenden Schritte bestimmt. Bei geeigneten Zeitpunkten (5 Minuten Intervalle, bis zu einer Stunde oder mehr, wenn die nicht degradierte RNA immer noch anwesend ist, wie durch hier beschriebene Verfahren bestimmt wird) werden Aliquots entfernt und hinsichtlich der Anwesenheit von RNA durch hier beschriebene Verfahren untersucht.
Nach dem Entfernen von RNA wird der zelluläre Bestandteil wie unten beschrieben gereinigt.
Alternativ ist es möglich, das Produkt direkt zu fangen, indem das Kulturmedium auf eine erweiterte Bett Chromatographie Säule aufgetragen wird. Gemäß diesem Protokoll werden die Zellen und die RNase direkt durch die Säule passagiert, während das Produkt an das Chromatographie Medium gemäß dem Verfahren von Hansson et al., Bio/Technology, 12: 285–288, 1994, wie unten beschrieben, binden wird.
Ausstattung für erweiterte Bett Adsorption. Eine STREAMLINE^TM 50 (innerer Durchmesser von 50 mm) Borsilikat Glassäule (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), ausgestattet mit einem auf den Zweck ausgerichteten Flüssigverteiler am Boden der Säule, kann zusammen mit dem STREAMLINE^TM DEAE Adsorptionsmittel (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) für die Ionenaustausch Adsorption in einem erweiterten Bett Verfahren verwendet werden. Die Absorptionsmatrix besteht aus sphärischen, makroporösen, vernetzten Agarose Partikeln mit kristallinem Quarz, um die Dichte der Kügelchen zu steigern (durchschnittliche Dichte der Teilchen = 1,2 g/ml). Die ionische Kapazität für das Diethylaminoethyl (DEAE) Absorptionsmittel beträgt 0,13 – 0,21 mmol/ml. Die Partikel Größenverteilung reicht von ungefähr 100 bis 300 μm mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 200 μm. Das Adsorptionsmittel ist autoklavierbar, weist eine operationelle pH Stabilität zwischen 3 und 9 auf und widersteht 1 M NaOH. Die Bett Höhe in sedimentierter Konfiguration beträgt 10 cm. Die empfohlene lineare Fließgeschwindigkeit, um eine geeignete Expansion des Betts zu ergeben, beträgt 200– 400 cm/h. Die Kapazität des Adsorptionsmittels, das Zielprotein zu binden, sollte in gepackten Bett Säulen Experimenten vor Versuchsbeginn untersucht werden.
Erweiterte Bett Adsorption. Am Ende der Fermentation fällt der pH auf 5,5 durch Entfernen der Basenzugabe für die pH Kontrolle, NH₃ Regulation oder NaOH Regulation. Zusätzlich wird die Glycerol Zuführung beendet, und die Temperatur wird auf 60°C für 20 Minuten ansteigen, um die Wanderung (engl.: leakage) von periplasmatischen Proteinen in das Kulturmedium zu steigern. Die Kultur wird danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Vor der Beladung wird das Bett zwei- oder dreimal mit Beladungspuffer vorerweitert (50 mM NaCl) bei einer linearen Fließgeschwindigkeit von 200 cm/h. Die rohe Fermentationsnährlösung wird anschließend von unten nach oben auf das erweiterte Bett als ein 1:1 Gemisch mit Beladungspuffer aufgetragen, bei der gleichen Gesamt Fließgeschwindigkeit (200 cm/h), unter Verwendung einer Zwei Pumpenanordnung, die ein gleichzeitiges Mischen erlaubt. Wenn der gesamte Fermentationsgehalt aufgetragen wurde, wird das erweiterte Bett in einem expandierten Zustand durch Steigern der Beladungspuffer Fließgeschwindigkeit auf 200 cm/h gehalten. Ungefähr 1/4 des Volumens des Beladungspuffers und danach 1/2 Volumen des Waschpuffers (100 mM NaCl) werden durch das erweiterte Bett passagiert, um verbleibende Zellen und geringfügig adsorbierte Proteine auszuwaschen. Das anionische Adsorptionsmittel wird anschließend durch Umkehren der Fließrichtung und Absenken des Adaptors auf das obere Ende des gepackten Betts sedimentiert, das mit dem Waschpuffer gewaschen wurde. Das gepackte Bett wird anschließend von oben nach unten unter Verwendung von 0,5 M NaCl (Fließgeschwindigkeit 100 cm/h) eluiert, und 50 ml Fraktionen werden gesammelt.
Die Analyse durch Lebendzählung und OD Messungen der Zellentfernungseffizienz des gepackten Betts. Proben von dem Bett Auslass werden während des Waschvorgangs gesammelt. Für die Lebendzählanalyse werden die Proben in zwei getrennten Verdünnungen (die sich 100-fach unterscheiden) verdünnt. Ein Volumen von 100 μl jeder Probe wird auf Trypiase Blut Agar Basenplatten, die mit Ampicillin (0,1 g/l) ergänzt sind, ausplattiert. Diese Platten werden bei 37°C über Nacht inkubiert, und die Zahl der Kolonien wird gezählt. Für die OD Messungen werden die Proben verdünnt, um A600 nm Werte von 0,2–0,8 zu ergeben. Für geringere Zellgehalte als A600 nm = 0,01 wird nur eine Lebendzählung durchgeführt. Ein Zellgehalt von bis zu 10⁶ cfu/ml liegt unter der Nachweisgrenze von OD Messungen, was anzeigt, dass ein optisch klares Kulturmedium 100.000 Zellen pro ml enthalten könnte (Hansson et al., supra).
Lyse und RNase Spaltung in Zellen die RNase im Periplasma oder im Cytoplasma exprimieren
Wenn die RNase extrazellulär in dem Zellkultur Überstand akkumuliert und der zelluläre Bestandteil innerhalb der Zelle (Cytoplasma oder Periplasma) akkumuliert, wird eine Zelllyse benötigt, um es dem Produkt und der kontaminierenden RNA zu erlauben, in Kontakt mit der extrazellulären RNase zu treten.
Zellen, die RNase in dem Periplasma oder in dem Cytoplasma exprimieren, können gemäß den Verfahren, die in Scopes, supra oder LaVallie et al., supra beschrieben sind, lysiert werden.
Bestimmung von Rest RNA
Die Erfindung umfasst Verfahren zur Herstellung eines zellulären Bestandteils, der im Wesentlichen RNase-frei ist. Um zu bestimmen, ob ein zellulärer Bestandteil, der gemäß den erfinderischen Verfahren hergestellt ist, im Wesentlichen RNA-frei ist, können die folgenden Protokolle verwendet werden.
RNA in der DNA Probe
1. Agarose Gelektrophorese basierte Verfahren für den RNA Nachweis
Proben Herstellung
Jede DNA Probe wird anfänglich auf eine Konzentration von ungefähr 0,2 μg/μl verdünnt. Die Proben werden anschließend in einem 1:1 Verhältnis mit 2 × Auftragungspuffer auf eine Endkonzentration von ungefähr 0,1 μg/μl gemischt. 10 × Stock Auftragungspuffer ist 20% w/v Glycerol, 1% w/v SDS, 0,25% w/v Bromphenol blau in 0,1 M Na₂EDTA (pH 8,0). RNA Kontrollstandards werden hergestellt durch Zugeben von 1 μl einer ungefähr 1 mg/ml RNA Stock Lösung für jeweils 50 μl der Probe, um Proben von DNA zu replizieren. 10 μl jeder Probe werden auf einem 1% Agarose Gel zusammen mit einem Aliquot eines 1 kb Leiter Markers (Life Technologies Ltd.) analysiert. Die Agarose Gele werden in 1 × TAE Puffer (40 mM Tris Acetat, 2 mM EDTA), der aus einer 50 × Stock Lösung hergestellt wurde, gefahren.
Standards für Elektrophorese
Die Elektrophorse Standards werden durch das folgende Verfahren hergestellt. Herstellung einer Lösung von RNA Typ III (aus Bäckerhefe (Sigma)) bei einer Konzentration von 1 mg/ml in deionisiertem Wasser. Diese Lösung wird anschließend 1:5 auf eine Konzentration von 0,2 μg/μl, und anschließend 1:1 mit 2 × Auftragungspuffer (siehe Rezeptur oben) auf eine Konzentration von ~ 0,1 μg/μl verdünnt. Auftragen von 10 μl dieser Lösung auf das Gel für einen 1 μg RNA Standard. Zusätzliches Beladen von 10 μl von Reihenverdünnungen dieser Lösung, die gemäß dem folgenden Verfahren hergestellt wurden.
Zugeben von 100 μl der 0,1 μg/μl Stock Lösung (in Auftragungspuffer), in Gefäß 1, wie oben beschrieben. Entfernen von 50 μl aus Gefäß 1 und Zugeben dieser Probe zu 50 μl 1 × Auftragungspuffer (Gefäß 2). Gutes Mischen durch Pipettieren. Entfernen von 50 μl aus Gefäß 2 und Zugeben dieser Probe zu 50 μl 1 × Auftragungspuffer (Gefäß 3). Fortsetzen des Verdünnens der Standardlösung bis 12 Gefäße hergestellt wurden. Auftragen von 10 μl gemäß jeder Standardlösung auf ein Agarose Gel. Elektrophorese Bedingungen

Spannung 100 V (kontrolliert)

Strom: 400 mA (Maximum)

Leistung: 100 W (Maximum)

Zeit: 30 Minuten
Analyse der Ergebnisse
Das Gel wird gefärbt, um Nukleinsäure zu visualisieren und auf einem UV Transilluminator bei 254 nm fotografiert.
Um RNA nach der Agarose Elektrophorese nachzuweisen, wird das Gel mit entweder Ethidiumbromid oder sybr Green II gefärbt. Die RNA wird unter UV Licht visualisiert. Die Nachweisgrenze für Ethidiumbromid und sybr Green II Färbung beträgt jeweils ungefähr 3,2% w/w (RNA/Gesamt Nukleinsäure) und 1,6% w/w (RNA/Gesamt Nukleinsäure).
Ethidiumbromid
Wenn das Gel durch Ethidiumbromid Färbung visualisiert werden soll, Zugeben von Ethidiumbromid zu dem Agarose Gel in einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml und zu dem Laufpuffer in einer Konzentration von 0,5 μg/ml. Ethidiumbromid wird aus einer 10 mg/ml Stock Lösung (1 Tablette Ethidiumbromid pro 100 ml sterilem Wasser – SIGMA, Lot 35H0868), gelagert bei 4°C, zugegeben.
Die Grenzen der Nachweisbarkeit können durch Beobachten bestimmt werden, welche Standardverdünnung keine Visualisierung von RNA erlaubt. Die vorhergehende Standardbeladung wird anschließend als ein Prozentsatz der Stock Standardbeladung (1 μg) ausgedrückt. Wenn keine RNA in der Probenspur beobachtet wird, wird das Ergeb nis als "geringer als X% w/w" ausgedrückt, wobei X die berechnete Sensitivität ist. Sollte eine Bande beobachtet werden, wird die Intensität mit jener des Standards verglichen, und die Menge wird als eine Menge zwischen den zwei Standards abgeschätzt, zwischen denen das Probenergebnis liegt. Das Ergebnis wird auf der Basis geringer als/größer als angegeben. Eine im Wesentlichen RNA-freie Probe, gemäß diesem Verfahren, beträgt weniger als 3,2% w/v, d.h. es wird keine RNA nachgewiesen.
sybr Green II
Um eine SYBR Green II Lösung herzustellen, wird die Stock Lösung von SYBR Green II Farbstoff (von Molecular Probes) durch 1:10.000 in TBE Puffer (89 mM Tris Base, 89 mM Borsäure, 1 mM EDTA, pH 8,0) verdünnt. Die Lösung kann in einer Polypropylen Flasche, umwickelt mit Aluminiumfolie bei 4°C gelagert werden.
Nach der Elektrophorese wird das Gel mit SYBR Green II Farbstoff, der hergestellt wurde, wie oben beschrieben, für 30 Minuten bei 4°C in der Dunkelheit gefärbt.
Die Sensitivität des Gels wird durch Beobachten, welche Standardverdünnung gleich ist zu keiner beobachtbaren RNA bestimmt. Die vorhergehende Standardbeladung wird anschließend als ein Prozentsatz der Stock Standardbeladung (1 μg) ausgedrückt. Wenn keine RNA in der Probenspur beobachtet wird, dann wird das Ergebnis als "weniger als X% w/w" ausgedrückt, wobei X die berechnete Sensitivität ist. Sollte eine Bande beobachtet werden, wird die Intensität mit jener des Standards verglichen und abgeschätzt, zwischen welchen zwei Standards der Probe das Ergebnis liegt. Das Ergebnis wird auf einer weniger als/mehr als Basis angegeben. Eine im Wesentlichen RNA-freie Probe, gemäß diesem Verfahren, beträgt weniger als 3,2% w/v, und vorzugsweise weniger als 1,6% w/w (d.h. es wird keine RNA nachgewiesen).
Material und Methoden zum Färben mit Ethidiumbromid oder Sybr Green
Ausstattung: Pharmacia Biotech elektrischer Power Supply (oder ähnliches) und Anachem Elektrophorese Einheiten (16 Probenvertiefungen/zwei Reihen Minimum) und ein UV Transilluminator mit 254 nm Beleuchtung.
2. Northern Blot Analyse
Die Northern Blot Analyse einer experimentellen Probe und Standards für Elektrophorese (wie in dem Abschnitt mit der Überschrift Agarose Gelelektrophorese basierte Verfahren für den RNA Nachweis), kann gemäß dem Verfahren durchgeführt werden, das in Current Protocols, supra beschrieben ist. Um restliche RNA nachzuweisen wird Ethidiumbromid zu dem Formaldehyd/Agarose Gel in einer Endkonzentration von 0,5 μg/ml und zu dem MOPS Laufpuffer in einer Konzentration von 0,5 μg/ml zugegeben. Nach der Agarose/Formaldehyd Elektrophorese wird das Gel in destilliertem H₂O für 30 Min. gespült. Die RNA wird anschließend unter UV Licht optisch sichtbar gemacht.
Die Grenzen der Nachweisbarkeit können durch das Beobachten bestimmt werden, welche Standardverdünnung keine optische Sichtbarmachung der RNA mehr erlaubt. Die vorgegebene Standardbeladung wird anschließend als ein Prozentsatz der Stock Standardbeladung (1 μg) ausgedrückt. Wenn keine RNA in der Probenspur mehr beobachtet wird, dann wird das Ergebnis als "weniger als X% w/w" ausgedrückt, wobei X die berechnete Sensitivität ist. Sollte eine Bande beobachtet werden, wird die Intensität mit jener der Standards verglichen, und die Menge wird als eine Menge zwischen den zwei Standards abgeschätzt, zwischen denen das Probenergebnis liegt. Das Ergebnis wird auf einer weniger als/mehr als Basis angegeben. Eine im Wesentlichen RNA-freie Probe, gemäß diesem Verfahren, beträgt weniger als 3,2% w/v, d.h. es wird keine RNA nachgewiesen.
2. RNA Nachweis durch HPLC Assay
Gemäß dieses Verfahrens wird restliche RNA in ihre bestehenden Ribonukleotide unter milden basischen Bedingungen hydrolysiert. Die Ribonukleotide werden mit einem alkalischen Phosphatase Enzym behandelt, um Ribonukleoside herzustellen, die unter reverser Phasen Hochleistungsflüssigchromatographie (RPHPLC) aufgelöst werden können. Um sicherzustellen, dass die DNA, die in der Probe anwesend ist, nicht mit dem Assay interferiert, wird ein Schleuder Filtrationsschritt durchgeführt, um die DNA aus der Probe vor der Analyse zu entfernen.
Die RPHPLC Bedingungen wurden hinsichtlich der Sensitivität optimiert, so dass dieses Verfahren eine Nachweisgrenze im Pikomolarbereich aufweist; oder ungefähr 0,1%, wenn es als der Prozentsatz der Gesamtkonzentration von DNA oder Protein ausgedrückt wird.
RPHPLC Bedingungen:

Instrument: Hewlett Packard 1100 HPLC System. Oder äquivalentes System, das zur Gradientenelution und dem Nachweis im UV Bereich geeignet ist.

Säule:	Supelcosil LC-18S 25 cm × 2,1 mm 5 μm (oder ähnliches)
Mobile Phase:	A = 10 mM NaH₂PO₄ pH 6,0 (97,5%); Methanol (2,5%) B = Methanol
Gradient:	0 bis 20% B über 30 Minuten
Laufzeit:	45 Minuten insgesamt
Fließgeschwindigkeit:	0,21 ml/min
Beladung:	5 μl
Nachweis:	UV bei 260 nm

RPHPLC Standard Präparation
Um Standards herzustellen werden ungefähr 15 mg jedes Ribonukleosids in eine 50 ml volumetrische Flasche transferiert. Die Ribonukleoside werden gelöst und auf ein Volumen in der mobilen Phase A gebracht. 200 μl jedes Ribonukleosids werden in einem 1,5 ml Eppendorf Gefäß vereinigt und zwei Serienverdünnungen, siebenfach, werden durchgeführt. Die resultierende Lösung kann direkt unter Verwendung der obigen Bedingungen chromatographiert werden. Der Guanosin Standard kann ein Erwärmen und die Ultraschall Behandlung nötig machen, um beim Lösen zu helfen. Die Standardbeladung wird für jedes Ribonukleosid wie folgt berechnet (der RMM des Ribonukleosids sollte verwendet werden, und das Ergebnis sollte in Pikomol ausgedrückt werden):
(Gewicht(g) × 0,2 × 1000 × 5 × 1)/(RMM × 0,8 × 50 × 1000000 × 2⁷)
RPHPLC Proben Herstellung:
Herstellen von Proben durch Zugeben von 5 μl einer 3 M Lösung an Kaliumhydroxid zu 50 μl Proben Plasmid DNA. Zum Beispiel können die Proben Plasmid DNA bei 2 bis 3 mg/ml in Wasser für die Injektion, (engl.: Water for Injection) (WFI)) sein. Die Lösung wird kurz durch Vortexen gemischt und wird anschließend bei 37°C für ein Minimum von 16 Stunden inkubiert. Gleiche Volumina 3 M Essigsäure und 1 M Tris Puffer (pH 8) werden anschließend zugegeben; gefolgt von der Zugabe von 10 μl einer 100 U/ml Suspension von bakterieller alkalischer Phosphatase (BAP). Die resultierende Lösung wird anschließend kurz durch Vortexen gemischt und bei 37°C für weitere zwei Stunden inkubiert. Unmittelbar vor der Analyse werden die Proben in Schleuderfilter mit Membranen eines Molekulargewichts Ausschlusses von 10.000 Dalton (oder wie geeignet) gegeben und bei 13.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Das Filtrat wird ohne weitere Behandlung gemäß den oben beschriebenen Bedingungen chromatographiert.
Ergebnisse:
Um die Ergebnisse zu interpretieren werden die Spitzen, die Cytidin, Uridin, Guanosin und Adenosin entsprechen (die Spitzen werden in dieser Reihenfolge eluiert) in die Probe und in die Standard Chromatogramme integriert. Die Menge jedes Ribonukleotids in der Probe wird anschließend wie folgt berechnet (der hier verwendete RMM ist jener der Monophosphat Ribonukleotide, wenn die Standardbeladung in Pikomol angegeben wird, dann wird das Ergebnis in Nanogramm angegeben). Die Nachweisgrenze für dieses Verfahren beträgt ungefähr 0,1% w/w. Eine im Wesentlichen RNA-freie Probe gemäß diesem Nachweisverfahren beträgt weniger als 1,6% und vorzugsweise weniger als 0,1 bis 0,5% w/w.
(A × C × D × 75)/(B × 5)
Worin:

A: Beladung des Standard Ribonukleosids in Pikomol.
B: Bereich unter der Spitze aufgrund des Standard Ribonukleosids.
C: Bereich unter der Spitze aufgrund des Proben Ribonukleosids.
D: RMM des Ribonukleotid Monophosphats.

Die Summe der erhaltenen Ergebnisse für jedes Ribonukleotid ergibt einen Gesamt RNA Gehalt. Das Endergebnis wird als eine Masse ausgedrückt und kann verwendet werden, um das Ergebnis als einen Prozentsatz des DNA oder Protein Gehalts (% w/w) oder des Lösungsvolumens (% w/v) anzugeben.
2. RNA in Protein Proben
Restliche RNA kann in den Protein Proben entweder durch die Agarose Gel Färbungsverfahren (wie beschrieben) oder den HPLC Assay, wie beschrieben, nachgewiesen werden. Die Nachweisgrenze für dieses Verfahren beträgt ungefähr 0,1% w/w. Eine im Wesentlichen RNA-freie Probe gemäß diesem Nachweisverfahren beträgt weniger als 3,2% w/w, vorzugsweise weniger als 1,6 und vorzugsweise weniger als 0,1 bis 0,5% w/w.
Eine akzeptable Menge an RNA Kontamination von therapeutischer Plasmid DNA beträgt < 1% w/w. Eine akzeptable Menge an RNA Kontamination von therapeutischem Protein beträgt < 10 ng/Dosierung.
Bestimmung der Menge von RNase in einem Zelllysat
Ein Vorteil der Erfindung ist es, dass signifikant weniger RNase Protein benötigt wird, um im Wesentlichen alle RNA Moleküle in einem Zelllysat zu entfernen, und somit ist signifikant weniger RNase Protein in dem Lysat anwesend.
Die Menge von RNase Protein, das in einem Zelllysat anwesend ist, kann durch die folgenden Verfahren bestimmt werden.
RNase I Assays
Drei verschiedene Assays für RNase I können verwendet werden, um das Enzym in Zellextrakten abzuschätzen. Assay A misst säurelösliches Ultraviolett absorbierendes Material, das von RNA freigesetzt wird. Assay B ist sensitiver und eine spezifischere Modifikation von Assay A. ³²P-markierte RNA ist das Substrat, und säurelösliches radioaktives Material wird gemessen. Assay C ist ein sensitiveres Verfahren für die Untersuchung von RNase I in Ribosomen Präparationen. Er besteht aus dem Messen der Freisetzung von Ulraviolett absorbierendem Material aus Ribosomen, die gegen Harnstoff enthaltende Puffer dialysiert werden. Alle drei Assays zeigen latente RNase I, weil in A und B EDTA zu der Aktivierung des Enzyms führt, und in C der Harnstoff die Aktivierung verursacht. Polynukleotid Phosphorylase und RNase II werden durch EDTA und Harnstoff inhibiert und sind relativ inaktiv auf RNA.
(i) Assay A
Ein 0,1 ml Reaktionsgemisch wird 10 μmol Kaliumphosphat Puffer und 1,0 μmol EDTA, alle eingestellt auf pH 7,0, plus die Enzymfraktion enthalten. Nach der Inkubation bei 37°C für 40 Min. werden 0,3 ml kaltes 3% HClO₄ zugegeben, und das Gemisch wird auf Eis für 15 Min. gekühlt. Nach der Zentrifugation für 15 Min. bei 2000 g in der Kälte werden 0,1 ml der Überstand Lösung in 1,0 ml destilliertem Wasser verdünnt, und die OD₂₆₀ wird bestimmt. Alle Assays werden doppelt durchgeführt, und die Werte werden hinsichtlich irgendwelchem säurelöslichen Ultraviolett absorbierenden Materials in der Enzymfraktion korrigiert. Die Aktivität wird als μmol säurelösliches Nukleotid/Reaktionsgemisch/h ausgedrückt, unter der Annahme eines molaren Extinktionskoeffizienten von 10.000 für die Nukleotide (Gesteland, J. Mol. Biol. 16: 67–84).
(ii) Assay B
³²P-markierte RNA wird zu dem Reaktionsgemisch in Assay A zugegeben, während die Gesamt Substratkonzentration konstant gehalten wird. Die endspezifische Aktivität der RNA wird 2000 bis 5000 cts/Min./0,1 mg betragen. Nach der Inkubation, Präzipitation und Zentrifugation wie in A wird 0,2 ml der Lösung des Überstandes entfernt und auf ein 5 cm Aluminium Probenschälchen aufgetragen und zum Zählen getrocknet. Wie in Assay A wird die Aktivität als μmol/h, bezogen auf die spezifische Aktivität von RNA in dem Reaktionsgemisch, ausgedrückt (Gesteland, supra).
(iii) Assay C
Visking Dialyse Gefäße (8/22) werden in verdünntem NasCO₂ für 20 Min. gekocht, kräftig in destilliertem Wasser gewaschen und in 0,1 ml mM EDTA gelagert. Unmittelbar vor der Verwendung wird das Gefäß erneut mit destilliertem Wasser gewaschen. Alle Glaswaren werden sterilisiert, und wegwerfbare Plastikhandschuhe werden bei der Handhabung der Dialyse Gefäße verwendet, um die RNase Kontamination zu minimie ren. 1,0 ml (enthaltend 30 μmol Nukleotide) einer Lösung aus Ribosomen, die dreimal in 0,01 M Magnesiumacetat, 0,005 M Tris (pH 7,5) gewaschen wurden, werden gegen 100 ml 4 M Harnstoff, 0,005 M Tris (pH 7,5), 0,05 M KCl bei 4°C dialysiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wird eine Probe des Dialyse Puffers entfernt und die OD₂₈₀ gemessen. Die Ergebnisse werden als mμmol des freigesetzten Nukleotids/Min./μmol der Nukleotide in den Original Ribosomen ausgedrückt (Gesteland, supra).
RNase A Assays (geeignet für alle unspezifischen RNasen)
Rekombinante RNase Aktivität auf RNA Agar Platten
Eine Lösung mit 2% (w/v) Agar (Bacto-Agar)/100 mM MES pH 6,5, 0,3% (w/v) Hefe RNA wird autoklaviert und in Petri Schalen gegossen. Runde Löcher werden aus dem RNA Agar unter Verwendung eines sterilen Korkbohrers ausgestanzt, und rekombinante oder kommerzielle RNase (0,1–25 μg) wird in einem Volumen von 150 μl aufgetragen. Die Platten werden für 2–4 h bei 37°C inkubiert. Um die RNase Aktivität zu visualisieren, wird 2 M HCl über die Platte gegossen. Eine klare Zone bildet sich um das Loch, wo aktive RNase eingeführt wurde, und RNA, die nicht hydrolysiert wurde, bildet ein wolkiges Präzipitat (Tarragona-Fiol et al., supra).
Die Menge an RNase in einem Zelllysat kann auch durch das Bestimmen der Geschwindigkeit der Hydrolyse von Cytidylyl-3':5'-Adenosin durch RNase gemessen werden. Die Hydrolyse von CpA durch RNase kann bei Raumtemperatur in 1 ml, 1 cm Weg Küvetten (Hellma) durchgeführt werden. Das Volumen der Reaktion ist 1 ml. Die Reaktionen mit 0,1 mM CpA in 0,1 Tris-Acetat pH 6,5 werden durch die Zugabe eines Lysats mit RNase initiiert. Die Hydrolyse von CpA wird gegenüber einen Leerwert mit 0,1 M Tris-Acetat pH 6,5 und 0,1 mM CpA durch den Anstieg in der A₂₆₅ nm gemessen (Tarragona-Fiol et al, supra).
BEISPIEL I
Reinigung eines pUC18 basierten E. coli RNase I Expressionsplasmids aus E. coli DH5α mit RNase A Behandlung im kleinen Maßstab
Das RNase I Gen wurde aus E. coli Stamm DH1 durch PCR unter Verwendung der Primer 5'-GGTCCTGGGGTGATTATTTACGGCTGTGGC-3' und 5'-GTTTAACTCACATGATGATACTGACTGTTG-3' amplifiziert und in den TA Klonierungsvektor pCR3.1 (Invitrogen Inc.) wie beschrieben kloniert.
Der RNase I Platten Assay zeigte, dass der resultierende Vektor das RNase I Gen in E. coli TOP10F (3) und DH5α (Daten nicht gezeigt) überexprimierte. Die RNase Platten Assays wurden durch das folgende Verfahren durchgeführt. LB Agar (ergänzt mit Kanamycin bei 30 μg/ml) wurde mit 10 μl von Übernacht Kulturen von: 1. (oben links) TOP10F Klon 1 (pCR3.1), 2. (oben rechts) TOP10F Klon 2 (pCR3.1 RNase I), 3. (Mitte links) TOP10F Klon 3 (pCR3.1 RNase I), 4. (Mitte rechts) TOP10F Klon 4 (pCR3.1), 5. (unten links) TOP10F Klon 5 (pCR3.1 RNase I) und 6. (unten rechts) TOP10F Klon 6 (pCR3.1 RNase I) aufgespottet und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurde die Platte mit 6 ml Soft Agar mit Bäckerhefe RNA (0,3% in 11 mM EDTA) überschichtet. Nach der Inkubation bei 37°C für 4 Stunden wurde die Platte durch die Zugabe von 10 ml von 1 M HCl entwickelt und fotografiert.
Das RNase I Gen wurde anschließend in pUC18 unterhalb des lacZ Promotors kloniert, so dass seine Expression durch die Zugabe von IPTG in einer Endkonzentration von 0,5 mM gesteigert wurde. Die Platten Assays zeigten, dass die Expression von dem pUC18 Konstrukt geringfügig höher war als von dem pCR3.1 Konstrukt in DH5α nach der Induktion (4). LB Agar (ergänzt mit Ampicillin bei 50 μg/ml und IPTG 0,5 mM) wurde mit 50 μl von Übernacht Kulturen von 1. (oben) DH5α (pCR3.1 RNase I) und 2. (unten) DH5α (pUC18 RNase I) Kulturen aufgespottet und bei 37°C über Nacht inkubiert. Am folgenden Tag wurden die Platten mit 6 ml Soft Agar mit Bäckerhefe RNA (0,3%) in EDTA (11 mM) überschichtet. Nach Inkubation bei 37°C für 4 Stunden wurde die Platte durch die Zugabe von 10 ml 1 M HCl entwickelt und fotografiert.
Wenn Plasmide durch alkalische Lyse aus den Stämmen, die diese Konstrukte enthalten, isoliert wurden, war offensichtlich, dass die überexprimierte RNase I nicht in der Lage war RNA aus diesen Proben zu entfernen, wohingegen die Zugabe von exogener Rinder RNase I die RNA aus den Replika Proben entfernen konnte. Die Platten Assays legten nahe, dass die RNase I entweder nicht in ausreichenden Mengen synthetisiert wurde oder gegenüber dem alkalischen Lyse Verfahren (5), und insbesondere gegenüber dem Denaturierungsschritt in der Anwesenheit von SDS und Natriumhydroxid sensitiv war.
LB Agar (1%) Platten mit Bäckerhefe RNA (0,3%), Tris Puffer (10 mM) und EDTA (11 mM) wurden mit den folgenden Proben beladen.

1. (oben links) DH5α (pUC18 RNase I) Zellen, resuspendiert in TE Puffer, lysiert durch die Zugabe von 0,2 M NaOH und 1% SDS und neuralisiert durch 3 M Kaliumacetat. Der Überstand aus diesen Zellen wurde durch Zentrifugation geklärt, und 60 μl wurden in eine Vertiefung der Platte geladen;
2. (oben rechts) DH5α (pUC18 RNase I) Zellen, resuspendiert in TE Puffer und lysiert durch drei Zyklen Einfrieren und schnelles Auftauen. Der Überstand aus diesen Zellen wurde durch Zentrifugation geklärt, und 20 μl wurden in eine Vertiefung in der Platte geladen;
3. (unten links) DH5α (pUC18 RNase I) Zellen, resuspendiert in TE Puffer und durch Ultraschall lysiert. Der Überstand aus diesen Zellen wurde durch Zentrifugation geklärt, und 20 μl wurden in eine Vertiefung in der Platte geladen; und
4. (unten rechts) 2 μg Rinder RNase A in 20 μl TE Puffer, aufgetragen in eine Vertiefung in der Platte. Die Platte wurde bei 37°C für 4 Stunden inkubiert und anschließend durch die Zugabe von 10 ml 1 M HCl entwickelt, bevor sie fotografiert wurde.

Wenn das Protokoll für die Reinigung von rekombinanter Plasmid DNA aus RNase I exprimierenden Stämmen für den kleinen Maßstab modifiziert wurde, um einen erweiterten Inkubationszeitraum einzuschließen (Birnboim und Doly, 1979), dann entfernte überexprimierte RNase I einen Anteil der kontaminierenden RNA aus der Präparation von Plasmid DNA (6).
Insbesondere wurde das alkalische Lyse Verfahren modifiziert, um einen Inkubationszeitraum nach dem Neutralisationsschritt oder nach der Freisetzung von RNase I durch Ultraschall/Einfrieren-Auftauen und vor der Denaturierung mit Natriumhydroxid und SDS einzuschließen. Während dieses Inkubationszeitraums wurde RNA durch die exprimierte RNase gespalten.
6 ist ein Ethidiumbromid gefärbtes 0,8% Agarose Gel, das mit 5 μl der folgenden Proben geladen wurde, die wie beschrieben hergestellt wurden:

Spur 1. DNA Fragment Größen Marker 1 BstEII;
Spur 2. DH5α (pUC18) Zellen, resuspendiert in TE Puffer, lysiert durch die Zugabe von 0,2 M NaOH und 1% SDS, neutralisiert mit 3 M Kaliumacetat und inkubiert auf Eis für 2 Stunden. Der Überstand wurde durch Zentrifugation geklärt, Ethanol präzipitiert und in 20 μl TE Puffer resuspendiert;
Spur 3. DH5α (pUC18) Zellen, resuspendiert in TE Puffer und durch 3 Zyklen Einfreien und schnelles Auftauen lysiert und auf Eis für 2 Stunden inkubiert. Die Probe wurde anschließend mit 0,2 M NaOH und 1% SDS behandelt, durch 3 M Kaliumacetat neutralisiert und durch Zentrifugation geklärt. Die DNA wurde Ethanol präzipitiert und in 20 μl TE Puffer resuspendiert;
Spur 4. DH5α (pUC18) Zellen, resuspendiert in TE Puffer und durch Ultraschall lysiert. Nach Inkubation auf Eis für 2 Stunden wurde die Probe mit 0,2 M NaOH und 1% SDS behandelt, durch 3 M Kaliumacetat neutralisiert und durch Zentrifugation geklärt. Die DNA wurde Ethanol präzipitiert und in 20 μl TE Puffer resuspendiert; Spur 5. Leer;
Spur 6. DH5α (pUC18 RNase I) Zellen, resuspendiert in TE Puffer, lysiert durch die Zugabe von 0,2 M NaOH und 1% SDS und neutralisiert durch 3 M Kaliumacetat und inkubiert auf Eis für 2 Stunden. Der Überstand wurde durch Zentrifugation geklärt, Ethanol präzipitiert und in 2 μl TE Puffer resuspendiert;
Spur 7. DH5α (pUC18 RNase I) Zellen, resuspendiert in TE Puffer, lysiert durch 3 Zyklen Einfrieren und schnelles Auftauen und inkubiert auf Eis für 2 Stunden. Die Probe wurde anschließend mit 0,2 M NaOH und 1% SDS behandelt, durch 3 M Kaliumacetat neutralisiert und durch Zentrifugation geklärt. Die DNA wurde Ethanol präzipitiert und in 20 μl TE Puffer resuspendiert;
Spur 8. DH5α (pUC18 RNase I) Zellen, resuspendiert in TE Puffer und durch Ultraschall lysiert. Nach Inkubation auf Eis für 2 Stunden wurde die Probe mit 0,2 M NaOH und 1% SDS behandelt, durch 3 M Kaliumacetat neutralisiert und durch Zentrifugation geklärt. Die DNA wurde Ethanol präzipitiert und in 20 μl TE Puffer resuspendiert.

BEISPIEL II
Verwendung von E. coli DH1 RNase A (konstitutiv exprimierte RNase A) für die Herstellung von Plasmid pUC19tet und Protein
Ein RNase A Gen kann unter der Kontrolle des konstitutiv aktiven Glukokinase Promotors kloniert und in das Chromosom des E. coli Wirtsstamms DH1 unter Verwendung von pN1 als einem Zwischenplasmid (wie beschrieben in dem Abschnitt mit der Überschrift Integration eines RNase Gens in das Chromosom) eingebaut werden. Das RNase A Protein wird in das Periplasma durch seine endogene Leadersequenz geleitet.
Die Plasmid Herstellung in DH1 RNase A E. coli Zellen, die mit dem interessierenden Plasmid transformiert wurden (zum Beispiel pUC19tetΔAmp oder pTX0161, beschrieben in der WO 97/29190), die auch ein chromosomales RNase A Gen unter der Kontrolle des konstitutiv exprimierten Glukokinase Promotors exprimieren, angezogen und durch alkalische Lyse lysiert, wie oben in dem Abschnitt mit der Überschrift Reinigung von rekombinanter/m DNA oder Protein beschrieben ist, wird gemäß dem Verfahren, das in der WO 97/29190 beschrieben ist, durchgeführt. Das Lyse Protokoll wird modifiziert, so dass es keinen Schritt einschließt, in dem die Probe mit exogen zugefügter RNase A inkubiert wird, sondern stattdessen mit seiner autolog hergestellten rekombinanten RNase A inkubiert wird.
DH1 RNase A E. coli Zellen werden mit einem Plasmid transformiert, welches das Gen für das Influenza Kern Protein (NP), kloniert innerhalb des Leserahmens in dem Expressionsvektor pTRCHis (Invitrogen) enthält. Die Zellen können wie oben in dem Abschnitt mit der Überschrift Reinigung von rekombinanter/m DNA oder Protein beschrieben, gemäß dem Verfahren von Horn et al., supra kultiviert werden. Die Zellen werden konstitutiv Influenza Virus Kern Protein (NP) synthetisieren. Die Zellen werden unter Verwendung eines Zellhomogenisators lysiert und für einen Zeitraum inkubiert, der ausreichend ist, um ein erfindungsgemäßes, im Wesentlichen RNA-freies, rekombinantes Protein herzustellen. Die Anwesenheit von Rest RNA wird gemäß den Verfahren, die in dem Abschnitt mit der Überschrift Nachweis von Rest RNA beschrieben sind, nachgewiesen. Das NP Protein wird gemäß den folgenden Verfahren gereinigt.
Extraktion und Reinigung
Die Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, in 1% Lyse Puffer (50 mM NaPO₄, 1 mM NaCl, 0,5% Sarkosyl) resuspendiert und bei –80°C gefroren. Die Zellen werden auf Eis in der Anwesenheit von Protease Inhibitoren (Boehringer Mannheim, Tabletten eines vollständigen EDTA freien Protease Inhibitor Cocktails, eine Tablette/50 ml Zellsuspension) aufgetaut. DNase I wird in einer Endkonzentration von 5 mg/ml zugegeben. Das Zellpellet wird durch Homogenisation bei 30 Kpsi unter Verwendung eines einzelnen Schrittes in einem Constant System Ltd. Homogenisator lysiert. Alternative Homogenisationsverfahren können in Scopes, supra gefunden werden. Das Lysat wird einer Zentrifugation bei 10.000 g unterzogen, um Zelldebris zu entfernen. Sarkosyl wird in einer Endkonzentration von 0,5% zugegeben, um der Protein Löslichkeit und dem Entfernen von Endotoxin zu helfen. Nach der Zugabe von 60 ml 50% Ni-NTA Agarose (Qiagen Inc.) wird das Lysat für 1 Stunde bei 4°C inkubiert, um zu erlauben, dass das Batchbinden des Proteins stattfindet.
Die Masse des Lysats wird von dem Harz durch Zentrifugation bei 200 g entfernt. Das Harz wird in dem verbleibenden Lysat resuspendiert und verwendet, um es auf eine Pharmacia XK 26 Säule zu gießen. Die Säule wurde mit 400 ml Waschpuffer (50 mM NaPO₄, 1 M NaCl, 0,5% Sarkosyl, 20 mM Imidazol, 10% Glycerol) gewaschen. Kontaminanten werden mit einem Gradienten von 0% bis 22% 0,5 M Imidazol in Waschpuffer eluiert. Das rekombinante NP (rNP) wird mit einem schrittweisen Gradienten von 100% 0,5 Imidazol in Waschpuffer unter Verwendung eines Fraktionensammlers eluiert.
Die geeignete Fraktion wird durch SDS-PAGE analysiert, um die Anwesenheit von rNP zu verifizieren. Die Fraktionen mit der höchsten Konzentration an rNP werden vereinigt (Pool 1). Zusätzlich werden die Fraktionen mit der geringsten Konzentration an rNP vereinigt (Pool 2).
Vereinigtes rNP wird gegen 25 mM Hepes, 0,5% Sarkosyl dialysiert. Die Protein Konzentration wird unter Verwendung eines BIORAD Protein Assays bestimmt. Die Anwesenheit von restlichem Endotoxin wird durch KQCL Assay (Biowhittaker) bestimmt. Die Anwesenheit von Rest RNA wird gemäß den Verfahren bestimmt, die in dem Abschnitt mit der Überschrift Bestimmung von Rest RNA beschrieben sind.
BEISPIEL III
Verwendung von E. coli DH1 RNase A (induzierbar und periplasmatisch) für die Herstellung des Plasmids pUC18 und Protein
Ein RNase A Gen kann unter die Kontrolle des induzierbaren lac Promotors kloniert und stabil in das Chromosom von DH1 unter Verwendung von pN1 als einem Zwischenplasmid, gemäß den oben beschriebenen Verfahren integriert werden. RNase A Protein wird in das Periplasma durch seine endogene Leadersequenz geleitet.
Die E. coli Zellen werden anschließend mit dem zu reinigenden Plasmid Vektor transformiert (zum Beispiel pUC19tetΔAmp oder pTX0161), die gemäß den Verfahren, die oben in dem Abschnitt mit der Überschrift Reinigung von rekombinanter/m DNA oder Protein, gemäß dem Verfahren, das in der WO 97/29190 beschrieben ist, angezogen wurden. Die RNase A Herstellung wird durch die Zugabe von 0,5 mM IPTG vor dem Ende der Fermentation induziert. Die Zellen werden durch das modifizierte alkalische Lyse Verfahren lysiert, das in Beispiel II beschrieben ist, und das Plasmid wird durch das Verfahren gereinigt, das in der WO 97/29190 beschrieben ist.
E. coli Zellen, die mit einem Vektor umfassend das NP Gen, kloniert innerhalb des Leserahmens mit dem Expressionsvektor pTRCHis (Invitrogen) transformiert wurden, können wie oben in dem Abschnitt mit der Überschrift Reinigung von rekombinanter/m DNA oder Protein gemäß dem Verfahren, das in der WO 97/29190 beschrieben ist, kultiviert werden. Die Zellen können induziert werden, um gleichzeitig RNase und NP Protein zu synthetisieren, durch die Zugabe von 0,5 mM IPTG, wie oben beschrieben, unter Verwendung eines Zellhomogenisators lysiert und für 10 bis 16 Minuten um RNA zu entfernen, inkubiert werden. Das NP Protein wird gemäß den oben beschriebenen Verfahren gereinigt (Beispiel II und Scopes, supra).
BEISPIEL IV
Verwendung von E. coli BL21(DE3)RNase A (induzierbar und periplasmatisch) für die Herstellung von Plasmid und Protein
Ein RNase A Gen kann unter die Kontrolle des induzierbaren T7 Promotors kloniert und stabil in das Chromosom von BL21 (DE3) unter Verwendung von pN1 als einem Zwischenplasmid gemäß den oben beschriebenen Verfahren integriert werden. Das RNase A Protein wird in das Periplasma durch seine endogene Leadersequenz geleitet.
Die E. coli Zellen, die mit dem interessierenden Plasmid (zum Beispiel pUC19tetΔAmp oder pTX0161) transformiert wurden und die chromosomale Expressionskassette BL21 (DE3) RNase A mit einem RNase A Gen unter der Kontrolle des T7 Promotors tragen, können in Schüttelflaschen in LB Medium angezogen werden. Die RNase A Herstellung wird wie in Beispiel 5 unten beschrieben oder gemäß den Verfahren, die in dem Abschnitt mit der Überschritt induzierbare Promotor Systeme beschrieben sind, induziert. Die Zellen werden durch das modifizierte alkalische Lyse Verfahren, das in Beispiel II beschrieben ist, lysiert, und das Plasmid wird gereinigt, wie in der WO 97/29190 beschrieben.
E. coli Zellen BL21 (DE3) RNase A kann mit dem Vektor, der das NP Gen, kloniert innerhalb des Leserahmens in den Expressionsvektor pET (unter der Kontrolle des T7 Promotors) aufweist, transformiert werden. Dieser Vektor wird als pTX030 bezeichnet und ist in Beispiel V unten beschrieben. Der Vektor wird wie unten beschrieben kultiviert. Die Zellen können wie unten beschrieben induziert werden, um NP zu synthetisieren, unter Verwendung eines Zellhomogenisators lysiert und für 10 bis 60 Minuten inkubiert werden, um die RNA zu entfernen. Das NP Protein wird gemäß den oben beschriebenen Verfahren gereinigt (Beispiel II und Scopes, supra).
BEISPIEL V
RNA-freie Influenza Virus Kern Protein Herstellung in E coli BL21(DE3) RNase A
E. coli BL21(DE3) RNase A kann gemäß den Verfahren, die für die Herstellung von DH1 RNase A beschrieben sind, unter Verwendung des Zielstamms BL21(DE3) hergestellt werden, um BL21(DE3)RNase A in dem P1 Transduktionsschritt zu bilden.
Die E. coli Zellen mit dem Vektor BL21(DE3) RNase A werden mit pTX0330 transformiert und auf LB Agar Platten, die mit Kanamycin (LBkan) (30 mg/l) ergänzt wurden, ausplattiert. pTX0330 ist ein Vektor für T7 Polymerase Promotor vermittelte Expression von "flu" NP Protein, das mit sechs N-terminalen Histidin Resten markiert ist, das durch Klonieren der NP kodierenden Sequenz in pET-28a(+) gebildet wird (Novagen Inc.). Die N-terminale Markierung erlaubt die Reinigung von NP durch Metallchelat Chromatographie. pTX0330 trägt das Kanamycin Resistenzgen kan.
Einzelne Kolonien werden verwendet, um 25 ml LB zu inokulieren, das mit 30 μg/ml Kanamycin (LB kan) ergänzt wurde, und die resultierende Kultur wird über Nacht bei 37°C bei 200 rpm angezogen. Ein Aliquot dieser Kultur wird verwendet, um 200 ml LBkan zu inokulieren. Diese Subkultur wird bis zu einer OD600 nm von 1 Einheit angezogen. Sechs 1,5 l Aliquots LBkan werden mit 30 ml dieser 200 ml Subkultur inokuliert. Die Protein Expression wird durch die Zugabe von 0,5 mM IPTG (Endkonzentration) für 5 Stunden induziert. Die Zellen werden anschließend durch Zentrifugation geerntet, in 1 Lyse Puffer (50 mM NaPO₄, 1 M NaCl, 0,5% Sarkosyl) resuspendiert und bei –80°C eingefroren.
Extraktion und Reinigung
Die Zellen werden auf Eis in der Gegenwart von Protease Inhibitoren (Boehringer Mannheim, Tabletten mit vollständigem EDTA freiem Protease Inhibitor Cocktail, 1 Tablette/50 ml Zellresuspension) aufgetaut. DNase I wird in einer Endkonzentration von 5 mg/ml zugegeben. Das Zellpellet wird durch Homogenisation bei 30 Kpsi unter Verwendung eines einzelnen Schrittes in einem Constant System Ltd. Homogenisator lysiert. Alternative Homogenisationsverfahren können in Scopes, supra gefunden werden. Das Lysat wird einer Zentrifugation bei 10.000 g unterzogen, um Zelldebris zu entfernen. Sarkosyl wird in einer Endkonzentration von 0,5% zugegeben, um der Protein Löslichkeit und dem Entfernen von Endotoxin zu helfen. Nach der Zugabe von 60 ml 50% Ni-NTA Agarose (Qiagen Inc.) wird das Lysat für 1 Stunde bei 4°C inkubiert, um zu erlauben, dass das Batchbinden des Proteins stattfindet.
Die Masse des Lysats wird von dem Harz durch Zentrifugation bei 200 g entfernt. Das Harz wird in dem verbleibenden Lysat resuspendiert und verwendet, um es auf eine Pharmacia XK 26 Säule zu gießen. Die Säule wurde mit 400 ml Waschpuffer (50 mM NaPO₄, 1 M NaCl, 0,5% Sarkosyl, 20 mM Imidazol, 10% Glycerol) gewaschen. Kontaminanten werden mit einem Gradienten von 0% bis 22% 0,5 M Imidazol in Waschpuffer eluiert. Das rekombinante NP (rNP) wird mit einem schrittweisen Gradienten von 100% 0,5 Imidazol in Waschpuffer unter Verwendung eines Fraktionensammlers eluiert.
Die geeignete Fraktion wird durch SDS-PAGE analysiert, um die Anwesenheit von rNP zu verifizieren. Die Fraktionen mit der höchsten Konzentration an rNP werden vereinigt (Pool 1). Zusätzlich werden die Fraktionen mit der geringsten Konzentration an rNP vereinigt (Pool 2).
Vereinigtes rNP wird gegen 25 mM Hepes, 0,5% Sarkosyl dialysiert. Die Protein Konzentration wird unter Verwendung eines BIORAD Protein Assays bestimmt. Die Anwesenheit von restlichem Endotoxin wird durch KQCL Assay (Biowhittaker) bestimmt. Die Anwesenheit von Rest RNA wird gemäß den Verfahren bestimmt, die in dem Abschnitt mit der Überschrift Bestimmung von Rest RNA beschrieben sind.
BEISPIEL VI
Herstellung und Isolierung von pQR163 aus E. coli
(a) Bakterien, Plasmide und Medien
Der Escherichia coli Stamm JM107 wurde als ein Plasmid Wirt für die Untersuchung von Rinder pankreatischer RNase Expression verwendet. Kontrollvektoren schlossen pUC18, pBR322, pKK223.3 (der Vektor, der kein RNase Gen enthält) und pQR162 (enthält zwei Cistron Fragmente, aber in der falschen Orientierung) ein.
Das Wachstum wurde entweder in Nähragar (Oxoid Nährlösung, verfestigt mit 2% (w/v) bakteriologischem Agar) oder in Nährlösung (Oxoid) durchgeführt. Die Platten wurden wöchentlich subkultiviert, um die Plasmid Mengen aufrecht zu erhalten, die ursprünglich aus den Glycerol Stocks kultiviert wurden. Einzelne Kolonien von frischen Platten wurden verwendet, um die Startkulturen zu inokulieren. Das Wachstum von Zellen, die RNase bildeten, wurde bei 30°C durchgeführt, und die Kontrollen wuchsen bei 37°C.
(b) Induktion von pQR163 Zellen mit IPTG
E. coli Stamm JM107 Zellen, die mit dem Plasmid pQR163 (7) transformiert wurden, wurden in 200 ml Nährlösung mit 100 μg Ap/ml für 4–5 Stunden bei 28°C angezogen. 1 ml Aliquots wurden entnommen, und das Wachstum wurde durch Absorpti onsauslesungen bei 550 nm bewertet. Sobald bestimmt wurde, dass sie sich in der exponentiellen Stufe (ungefähr 0,600 OD₅₅₀) befanden, wurde IPTG in einer Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben. Das Wachstum wurde über Nacht fortgesetzt, und anschließend wurden die Zellen geerntet.
(c) Plasmid Isolierungen
Plasmid Isolierungen wurden im kleinen Maßstab unter Verwendung von Qiagen Kits durchgeführt, die auf dem Birnboim und Doly Verfahren (1979) beruhen. Die Proben wurden gleichmäßig in zwei Gruppen aufgeteilt; die herunter zentrifugierten Pellets der einen Gruppe wurden in Puffer mit RNase resuspendiert, und die anderen in Puffer, der keine RNase enthielt. Die Proben der präparatorischen Stufe wurden verwendet und auf 1% Agarose Gele (1 M TE Puffer, EtBr 0,5 μg ml^–1) zusammen mit ungespaltenen und EcoRI gespaltenen DNA Proben geladen.
(d) Quantifizierung von pQR163 und pKK223.3 RNA Konzentrationen
Gelpräparationen im mittleren Maßstab wurden unter Verwendung eines Computer Software Pakets analysiert. Die relativen Intensitäten und Konzentrationen von λPstI und λHindIII Marker wurden verwendet, um die relativen Intensitäten und Konzentrationen von RNA in dem geklärten Lysat und den Durchflussstufen von pKK223.3 (Kontrolle) und pQR163 zu bestimmen.
Ergebnisse
(a) Minipräparationen
Die Plasmide pKK223.3, pQR163, pQR162, pUC18 und pBR322 wurden alle gereinigt, und der Durchfluss, zwei Waschschritte und die Elutionsschritte wurden zurückgehalten. Die gereinigte Plasmid DNA wurde anschließend mit EcoRI gespalten und auf 1% Agarose Gelen, wie in 8 gesehen werden kann, gefahren. Die am weitesten laufende der zwei Banden, die in den DNA Proben beobachtet wird, ist das supercoiled Plasmid, und die andere ist die offen zirkuläre Form des Plasmids. Bei Spaltung mit EcoRI werden lineare Banden beobachtet, die anzeigen, dass das Plasmid keine Stellen für das Restriktionsenzym aufweist. pQR162 und pKK223.3 weisen zusätzliche Banden auf; pQR162 enthält dimere Formen des Plasmids, wohingegen im Fall von pKK223.3 chromosomale DNA auf die Säule geladen sein könnte aufgrund des Scherens in der Lyse Stufe des Vorgangs. Der Schmier in der pQR162 gespaltenen Linie geht wahrscheinlich auf Fremd DNA zurück, die ausgefallen ist oder in das Gel integriert ist.
Die Stufen der Mini Plasmid Präparation wurden anschließend auch auf Gele geladen (siehe 9). Beim Vergleich kann eindeutig gesehen werden, dass die Anwesenheit oder Abwesenheit von RNase in dem Resuspensionspuffer eine merkliche Wirkung auf die Menge von RNA aufweist, die auf dem Gel für pKK223.3 beobachtet wird. Jedoch ist die Wirkung auf pQR163 nur marginal, mit einem leichten Anstieg in der Menge von RNA, die in den Proben ohne RNase im Puffer anwesend ist. In beiden Plasmid Präparationen wird der Hauptteil von RNA durch den ersten Waschschritt der Säule entfernt.
(b) Midipräparationen
Midipräparationen wurden anschließend unternommen, wobei das Kontrollplasmid pKK223.3 und pQR163 verwendet wurden. Die Zellen wurden in 200 ml Medium in einer Schüttelflasche für 4–5 Stunden nach der Inokulation angezogen. Das Wachstum wurde unter Verwendung eines Spektrophotometers bei A_bs 550 nm (10) überwacht.
Sowohl pKK223.3 als auch pQR163 wurden durch den tac Promotor kontrolliert und können deshalb mit IPTG induziert werden. Diese Wachstumskurve zeigt nahe korreliertes Wachstum in den beiden Plasmiden und zeigt, wann das Wachstum die expo nentielle Phase erreicht. Es ist vorteilhaft für die Kultur, dass sie in der exponentiellen Phase induziert wird, weil dies die Phase mit dem maximalen Zellvolumen ist, bevor die Mortalität stattfindet.
Nach der Induktion wurden die Kulturen über Nacht angezogen, und anschließend wurden die Plasmide unter Verwendung eines Midi präparatorischen Verfahrens (Qiagen) isoliert. Wiederum wurden die Proben in jene mit und jene ohne RNase in dem Resuspensionspuffer aufgeteilt, und gespaltene und ungespaltene DNA wurde auf 1% Agarose Gelen fahren gelassen (11).
Sowohl pKK223.3 als auch pQR163 zeigten supercoiled und offen zirkuläre Plasmid Banden. Die Anwesenheit von anderen Banden zeigt die Anwesenheit von Monomer und Dimer Formen des Plasmids, wie in den Spuren 3, 5, 7 und 9 beobachtet wird. Zusätzlich gibt es mehr Banden, welche die Anwesenheit von chromosomaler DNA anzeigen, die durch die verlängerte Lyse Zeit oder durch das kräftige Mischen während des Lyse Schritts verursacht werden konnten. Alle diese Formen von DNA werden als linear beobachtet, wenn mit EcoRI gespalten wird. Es wird in dieser Stufe der Präparation keine RNA mit oder ohne RNase beobachtet, weil die RNA durch die Säule entfernt wurde; es würde jedoch die Wirksamkeit der Säule für die Entfernung von anderen Kontaminanten beeinflussen.
Das geklärte Lysat, die Waschschritte, der Durchfluss und die Elutionsstufen von DNA wurden anschließend auf ein 1% Agarose Gel (12) geladen.
Es wird beobachtet, dass die RNA Mengen marginal höher in beiden Plasmiden mit Puffern sind, die RNase in dem geklärten Lysat und den Durchflussstufen enthalten, wobei pQR163 einen geringfügig geringen Grad an RNA aufweist als jener von pKK223.3. Jedoch wird in Proben, in denen keine RNase zu dem Resuspensionspuffer zugegeben wurde, eindeutig beobachtet, dass pKK223.3 viel größere Mengen an RNA aufweist, als jene der RNase, die durch das Plasmid pQR163 gebildet wird. Tatsächlich enthält pQR163 nur geringfügig mehr RNA als jene in den Proben, in denen zusätzliche RNase anwesend war. RNA wurde nur in den ersten zwei Plasmid Isolierungsstufen beobachtet, in jener des geklärten Lysats und den Durchflussproben.
c) Computeranalyse
Eine Computersoftware wurde verwendet, um die Intensitäten der RNA Banden ohne zusätzliche RNase miteinander in Beziehung zu setzen, um die Konzentrationen von RNA beim Vergleich mit der zweiten Triplet λPstI Bande (14,32 kb) zu vergleichen. Jedoch waren die pQR163 Banden diffundiert bevor eine eindeutig korrekte Analyse stattfinden konnte. Deshalb wurden die Banden Intensitäten der pQR163 Banden mit den Intensitäten durch Verwendung der Fotografie verglichen; die geklärte Lysat Stufe wurde als zwei Drittel der Marker Intensität, und die Durchflussstufe als ein Drittel angenommen. Aufgrund der großen Unterschiede in den Intensitäten wurden die Intensitäten in logarithmischen Stufen angegeben, um eine eindeutige graphische Aufnahme herzustellen (13).
Die RNA Banden zeigten höhere Intensitäten in beiden Plasmiden in dem geklärten Lysat als in den Durchflussstufen. Es wurde beobachtet, dass pKK223.3 durchschnittlich 64 mal (CL = 58, F = 70) größere Intensitäten der RNA Bande aufweist als in pQR163 beobachtet werden, was anzeigt, dass die RNA durch das Plasmid, welches das RNase Gen enthält, degradiert wird.
Die Bandenkonzentration des Markers wurde anschließend bestimmt und verwendet, um die RNA Bandenkonzentrationen zu analysieren (14).
Die RNA Bandenkonzentrationen wurden bei 224,0 ng μl^–1 (CL) und 147,40 ng μl^–1 (F) für pKK223.3 und 4,21 ng μl^–1 (Cl) und 2,11 ng μl^–1 (F) für pQR163 bestimmt. Dies zeigt, dass das RNase Gen in pQR163 wirksam RNase exprimiert.
Diskussion
Die Plasmid Isolierungen bildeten übereinstimmend supercoiled und offen zirkuläre Spezies von Plasmid DNA (8, 9, 10, 11 und 12), wodurch die Wirksamkeit der Technik gezeigt wurde; supercoiled Formen laufen aufgrund der dichten Packung der Moleküle weiter, wohingegen offen zirkuläre Formen in replizierende Plasmide gebunden sind. Jedoch werden in einigen Fällen andere Bandenmuster beobachtet, wie Monomer und Dimer Formen des Plasmids und der chromosomalen DNA (8 & 12). Multimere Formen können von chromsomaler DNA unter Verwendung von Restriktionsspaltung unterschieden werden; ein Plasmid das viele Formen zeigt, wird bei der Spaltung in eine definierte Bande linearisiert (8). Die genomische DNA wird nach der Spaltung linearisiert, und ein Schmier wird auf dem Gel beobachtet (12). Die chromosomale DNA kann während der Lyse und der Neutralisationsschritte aufgrund des Vortexens gebildet werden.
Die Analyse von RNA Bandenintensitäten in der Abwesenheit von zusätzlicher RNase (13 & 14) zeigte, dass pKK223.3 ungefähr 58 und 70 mal intensivere Banden für das geklärte Lysat und die Durchflussstufen zeigte als in pQR163 beobachtet wurde. Dies wird als ein Unterschied in der Bandenkonzentration von ungefähr 200 ng μl^–1 und 145 ng μl^–1 für jeweils das geklärte Lysat und die Durchflussstufen berechnet. Jedoch kann die Verwendung von optischen Leitlinien, um die Intensitäten von RNA der pQR163 Banden zu bestimmen, nicht korrekt sein, weil die Betonung auf ungefähren Werten liegt. Jedoch können die allgemeinen Bandenunterschiede eindeutig gesehen werden (12), was anzeigt, dass das pQR163 wirksame Konzentrationen von RNase bildet. Tatsächlich wird ein geringer Bandenunterschied zwischen pQR163 Proben mit und ohne RNase beobachtet, wohingegen der Vektor pKK223.3 ohne RNase Gen deutliche RNA Unterschiede zeigt (9 & 12). In der Zukunft werden weitere quantitative Verfahren der Computerbanden Analyse eingesetzt, und die Bandenintensitäten werden mit bekannten Konzentrationen von kommerziellen RNA Proben anstelle von Markerbanden in Verbindung gesetzt.
Die hier verwendeten Plasmid Isolierungen im kleinen Maßstab bestehen aus drei grundlegenden Schritten: (i) Herstellung und Klären eines bakteriellen Lysats, (ii) Adsorption von DNA an die Säulenmembran und (iii) das Waschen und die Elution der Plasmid DNA. Die Säulen verwenden eine Silikagel Membran, um selektiv Plasmid DNA in Hochsalzpuffer Bedingungen zu adsorbieren und um in Niedrigsalzpuffern zu eluieren (Qiagen). Es wurde beobachtet, dass RNA in dem geklärten Lysat und den Durchflussstufen der Plasmid Isolierungsverfahren (9 & 12) anwesend sind. Nachfolgende Schritte zeigten keine RNA aufgrund von Waschungen der Säule, die Kontaminanten, wie RNA, zelluläre Proteine und Metabolite entfernen, die nicht selektiv adsorbiert sind. Jedoch sind die Säulen nur wirksam wenn "optimierte Puffer" (Qiagen) verwendet werden, d.h. jene, die RNase A enthalten. Deshalb bildeten die Proben ohne die Zugabe von RNase in dem Resuspensionspuffer hohe Konzentrationen an RNA in pKK223.3 Proben, und sie können auch die Wirksamkeit der Chromatographie Schritte durch den Wettbewerb mit DNA hinsichtlich der Bindungsstellen verringern.
Somit verhindert die Verwendung eines Plasmids mit einem Gen für die RNase Bildung die Notwendigkeit von getrennten RNase Zugaben, obwohl die Wirksamkeit der Säulentrennung immer noch aufrechterhalten wird. Folglich kann ein sicheres, pharmazeutisch reines Plasmid Produkt unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren isoliert werden.
BEISPIEL VII
Strategie für die chromosomale Insertion von RNase A
Diese Strategie ist eine alternative Strategie für das Einbauen eines RNase Gens in das Chromosom eines Wirtsstamms, und es wird zusätzlich zu jenen angegeben, die in dem vorherigen Abschnitt mit der Überschrift Integration eines RNase Gens in das Chromosom des E. coli Wirtsstamms beschrieben sind.
Die trc-RNaseA Fusion von pQR163 wurde als ein BamHI Fragment (775 bp) ausgeschnitten und durch Entfernen des 5' Überhangs durch Auffüllen mit dem Klenow Fragment von DNA Polymerase I mit stumpfen Enden versehen. Das Plasmid pN1D274Ekan1 wurde mit BbsI gespalten, was eine Region einschließlich des größten Anteils der lacl^qs kodierenden Sequenz entfernt, was ein lineares 8651 bp Plasmid zurücklässt. Dieses wurde durch das Auffüllen des 5' Überhangs mit stumpfen Enden versehen und unter Verwendung von Kälber intestinaler alkalischer Phosphatase (CIAP) dephosphoryliert, um die Rezirkularisierung in der Abwesenheit eines Inserts zu verhindern. Das Auffüllen von 3' geschnittenen DNA Fragment Enden mit Klenow Polymerase und Dephosphorylierung mit CIAP wurde wie in dem New England Biolabs Katalog (1998/1999) beschrieben, durchgeführt, New England Biolabs Inc., 32 Tozer Road, Beverly, MA, USA. Das mit stumpfen Enden versehene BamHI Fragment mit der trc-RNase A Fusion wird in pN1D274Ekan1 ligiert, um das Insertionsplasmid zu bilden: pRNaseA. Die Herstellung von pRNaseA ist in 15 dargestellt.
Calcium kompetente JM107 Zellen (endA1, thi, gyrA96, hsdR17 (r_k ^–, m_k ⁺), relA1, supE44, Δ(lac-proAB), [F' traD36, proAB, lacl^qZΔM15]) wurden mit dem Plasmid pTP223 transformiert, was Transformanten auf LB Agar Platten mit 12 μg μl^–1 Tetracyclin (Tet) selektioniert. pTP223 enthält tet und die λ red Rekombinationsfunktionen bet und exo, und das RecBCD-inhibierende λ gam (Murphy 1997, J. Bacteriol. 180: 2063–2071). Ein RecA+ Stamm wird ausgewählt, weil die Rekombinationseffizienz unter Verwendung dieses Systems höher ist. Calcium kompentente Zellen werden hergestellt, und Transformationen werden wie in Ausubel et al., (Current Protocols in Molecular Biology, supra) beschrieben, durchgeführt.
pRNaseA wird unter Verwendung von Enzymen linearisiert, die nur in dem pUC18 Rückgrat schneiden, wie AatII, NdeI, SacI und XmnI. Calcium komponente JM107(pTP223) wurden hergestellt und mit linearer pRNaseA transformiert, und es wurden Rekombinanten auf LB Agar Platten mit 50 μg μl^–1 Kanamycin selektiert. Der resultierende Stamm wird als JMRNaseA bezeichnet.
Für die Untersuchung der RNase A Aktivität durch Platten Assay und Agarose Gelelektrophorese werden JMRNaseA(pTP223) und JM107(pTP223) (Negativkontrolle) bis zur mittleren logarithmischen Phase in LB Nährlösung mit Tet angezogen und durch die Zugabe von 0,5 mM IPTG 2 Stunden vor der Ernte induziert. Die Kontrollen werden ohne die Zugabe von IPTG durchgeführt. Der RNase Platten Assay wird wie folgt durchgeführt. Auf eine LB Agar Platte mit Tet werden 10 μl jeder Kultur, zusammen mit 0,1 μg kommerzieller RNase A in 10 μl H₂O aufgespottet. Diese wird bei 37°C über Nacht inkubiert, anschließend mit 6,0 ml Soft Agar mit 0,3% (w/v) Bäckerhefe in 11,0 mM EDTA überschichtet und für weitere 4 Stunden inkubiert. Die Platte wird anschließend durch die Zugabe von 10 ml 1,0 M HCl entwickelt und fotografiert. Die erwarteten Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt. Für die Agarose Gelelektrophorese werden Qiagen Minipräparationen mit den Kulturen (nach dem Protokoll des Herstellers) mit und ohne die Zugabe von RNase A zu dem Zellresuspensionspuffer (100 μg ml^–1) durchgeführt. Anschließend werden 5 μl jeder Plasmid Präparation auf ein 0,8% Agarose Gel geladen, und die Elektrophorese findet bei 5 V cm^–1 statt. Das Gel wird nachträglich mit Sybr Green Farbstoff gefärbt und auf einem Molecular Dynamics Fluoremitter bei 545 nm optisch dargestellt, um RNA nachzuweisen. Die erwarteten Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
TABELLE 1: RNase A Aktivität, wiedurch einen RNase A Platten Assay bestimmt.
TABELLE 2: Nachweisen von RNA durch Agarose Gelelektrophorese nach der Plasmid Präparation.
BEISPIEL VIII
Verwendung eines zwei Plasmid Systems um die Aktivität von periplasmatisch lokalisierter RNaseA zu zeigen
Das therapeutische Plasmid pTX0161 wird als eine Form von Krebs Chemotherapie, Gen vermittelter Enzym Vorläufer Arzneimittel Therapie, um die Vernetzung von DNA in betroffenen Zellen zu fördern, verwendet. Dies wird durch die Aktivierung von E. coli B. Nitroreduktase Enzym durch das Vorläufer Arzneimittel CB1954 erreicht (Drabek, D., Guy, J., Craig, R. und Grosveld, F. 1997. Die Expression der bakteriellen Nitroreduktase in transgenen Mäusen führt zum spezifischen Abtöten von Zellen durch das Vorläufer Arzneimittel CB1954 Gene Therapy 4: 93–100). Um die RNase Aktivität in einem Stamm, der pTX0161 (ColEl ori) trägt, zu testen, wird das RNaseA Gen von dem Plasmid pQR163 mit einer niedrigen Kopienzahl (ebenfalls ColEI ori) in ein anderes Plasmid mit einem kompatiblen Ursprungspunkt kloniert, nämlich pMMB66EH. pMMB66EH ist ein 8,8 kb Plasmid mit niedriger Kopienzahl, das Ampicillin Resistenz verleiht. Die Expression von RNaseA Aktivität von diesem Vektor erlaubt die Bestimmung der Wirkung von abfallender Kopienzahl vor dem Integrieren in das Genom einer Wirtszelle. Die Strategie für die Klonierung des RNaseA Gens in pMMB66EH ist in 19 gezeigt und wird im Folgenden beschrieben:

1. Erhalten von RNaseA ORF, einschließlich nativer Signalsequenz, von pQR163 über Spalten mit EcoRI, was zu einem Fragment < 500 bp führt.
2. Isolieren des RNaseA Fragments über präparatives 1% Agarose Gel.
3. pMMB66EH wird mit EcoRI gespalten, und anschließend wird das 5' Phosphat durch Behandeln mit Kälber intestinaler alkalischer Phosphatase entfernt.
4. Ligation des RNaseA Gens des EcoRI Fragments in pMMB66EH, der mit EcoRI linearisiert wurde.
5. Transformation von kompetenten E. coli JM107 mit dem Konstrukt und Selektieren hinsichtlich Transformanten auf Nähragar Platten mit Ampicillin.
6. Richtige Klone werden durch Miniprep DNA aus Kulturen gescreent, die aus Transformanten Kolonien angezogen wurden, die mit EcoRI, um die Anwesenheit des Inserts zu bestätigen, und PstI, um die Orientierung zu bestimmen, gespalten wurden.
7. Sicherstellen der korrekten Orientierung und Expression des Inserts durch erneutes Ausplattieren der Transformanten auf gepuffertem Nähragar (0,1 M Tris Cl, pH 7,0) mit Hefe RNA. Die RNase Aktivität wird durch die Zugabe von 2 M HCl zu den Platten nach dem Wachstum über Nacht nachgewiesen. Klare Bereiche sind anwesend, welche die Kolonien umgeben, die RNase Aktivität exprimieren, während Bereiche von RNA ein weißes Präzipitat nach der Zugabe von HCl bilden.

Weil jedoch die beiden Plasmide pQR163 und pTX0161 verschiedene Antibiotika Resistenz Gene tragen (pQR163 weist amp, pTX0161 weist tet auf), ist es möglich, pQR163 und pTX0161 in derselben Zelle aufrecht zu erhalten, vorausgesetzt, dass das Medium mit Ampicillin und Tetracyclin ergänzt wurde, trotz der Tatsache, dass beide einen ColEl abgeleiteten ori der Replikation enthalten.
pQR163 wurde in Calcium kompetente DH1(pTX0161) transformiert. Kolonien wurden auf den Selektionsplatten mit beiden Antibiotika erhalten. Zwölf davon wurden isoliert, und die DNA wurde durch eine Qiagen Minipräparation extrahiert. Das Ergebnis zeigte (16), dass pQR163 und pTX0161, obwohl sie unverträgliche Plasmide sind, in der Wirtszelle koexistierten.
Um zu bestimmen, ob das RNaseA Gen immer noch funktionell ist, wurde ein Klon aus DH1(pTX0161)(pQR163) zusammen mit einer Kontrolle von DH1(pTX0340) analysiert, der kein RNase Gen enthält. Diese wurden in LB Nährlösung mit ihren korrespondierenden Antibiotika bis zur mittleren logarithmischen Phase kultiviert, anschließend wurde IPTG zugegeben, um das RNaseA Gen zu induzieren, und die Inkubation wurde für weitere 1,5 Stunden fortgesetzt. Die Plasmid DNA Extrakte mit und ohne RNaseA in den Minipräp Lösungen (wie zuvor beschrieben) wurden einer Agarose Gelelektrophorese unterzogen, mit Ethidiumbromid gefärbt, und sie wurden auf einen UV Transilluminator optisch dargestellt. Es gibt einen Beweis für die RNase Aktivität in der Form einer kleineren RNA Bande in DH1(pTX0161)(pQR163), die in der DH1(pTX0340) Kontrolle (17) anwesend ist.
Um die Aktivität von RNaseA in DH1(pTX0161)(pQR163) darzustellen, wurde ein Platten Assay wie zuvor beschrieben durchgeführt. Es gab Zonen von RNA Spaltung, welche die Testkolonien und die Rinder RNaseA Positivkontrolle umgaben, aber keine, welche die DH1(pMMB66EH) Negativkontrolle (18) umgab.
Nützliche erfindungsgemäße zelluläre Bestandteile Nützliche erfindungsgemäße Proteine
Proteine, die gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren nützlich sind, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf erfindungsgemäß nützliche Proteine, wie Rezeptoren, Enzyme, Liganden, regulatorische Faktoren und strukturelle Proteine. Therapeutische Proteine schließen auch Kern Proteine, cytoplasmatische Proteine, mitochondriale Proteine, segregierte Proteine, Plasmalemma assoziierte Proteine, Serum Proteine, virale Antigene, bakterielle Antigene, Protozoen Antigene und parasitische Antigene ein.
Erfindungsgemäß nützliche therapeutische Proteine schließen Lipoproteine, Glykoproteine und Phosphoproteine ein. Proteine oder Polypeptide, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren exprimiert werden können, schließen Hormone, Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter, Enzyme, Gerinnungsfaktoren, Apolipoproteine, Rezeptoren, Arzneimittel, Onkogene, Tumor Antigene, Tumor Suppressoren, strukturelle Proteine, vitale Antigene, parasitische Antigene und bakterielle Antigene ein. Spezifische Beispiele dieser Verbindungen schließen Proinsulin, Wachstumshormone, Dystrophin, Androgen Rezeptoren, den Insulin ähnlichen Wachstumsfaktor I, den Insulin ähnlichen Wachstumsfaktor II, Insulin ähnliche Wachstumsfaktor bindende Proteine, den epidermalen Wachstumsfaktor TGF-α, TGF-β, PDGF, Angiogenese Faktoren (saurer Fibroblasten Wachstumsfaktor, basischer Fibroblasten Wachstumsfaktor und Angiogenin), Matrix Proteine (Typ IV Kollagen, Typ VII Kollagen, Laminin), Phenylalaninhydroxylase, Tyrosinhydroxylase, Onkogene (ras, fos, myc, erb, src, sis, jun), E6 oder E7 transformierende Sequenz, p53 Protein, RB Gen Produkt, Cytokin Rezeptor, IL-1, IL-6, IL-8, vitales Kapsid Protein und Proteine von vitalen, bakteriellen und parasitischen Organismen, die verwendet werden können, um eine immunologische Antwort zu induzieren, und andere Proteine mit nützlicher Signifikanz im Körper, ein.
Die Verbindungen, die eingeschlossen werden können, sind nur durch die Verfügbarkeit der Nukleinsäuresequenz für das Protein oder Polypeptid, das eingeschlossen werden soll, begrenzt. Der Fachmann wird sofort erkennen, dass mehr Proteine und Polypeptide identifiziert werden, die in den nicht vitalen Vektor der Wahl integriert werden können, gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung transfiziert und in einem Säugetiergewebe, einschließlich menschlichem Gewebe exprimiert werden können.
Erfindungsgemäße nützliche DNA Sequenzen
1. Gene, die Toxine kodieren
Beispiele für Gene die erfindungsgemäß nützlich sind, schließen jene ein, die solche Agenzien kodieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Gene, die Diphtheria Toxin, Pseudomonas Exotoxin, Cholera Toxin, Pertussis Toxin, etc., wie folgt kodieren. Diphtheria Toxin IL2 Fusionen für die Inhibierung von HIV-1 Infektion (Zhang et al., 192, Jour. Acquired Immune Deficiency Syndrome 5:1181); Diphtheria Toxin A Kette für die Inhibierung von HIV Virus Produktion (Harrison et al., 1992, AIDS Res. Hum. Retro. 8:39 und Curel et al., 1993, Hum. Gene Ther. 4:71); Diphtheria Toxin A Kette Liposomenkomplexe für die Suppression von Rinder Leukämie Virus Infektion (Kakidani et al., 1993, Microbiol. Immunol. 37:713); Diphtheria Toxin A Kette Gen, gekoppelt mit Immunglobulin Enhancern und Promotoren für B Zell Toxizität (Maxwell et al., Cancer Res., 1991, 51:4299); Tat und Rev aktivierte Expression eines Diphtheria Toxin A Gens (Harrison, 1991, Hum. Gene Ther. 2:53); Diphtheria Toxin-CD4 Fusion für das Abtöten von HIV infizierten Zellen (Auilo of al., 1992, Eur. Mol. Biol. Org. Jour. 11:575).
Andere Toxine, die erfindungsgemäß nützlich sind, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf die Folgenden. Konditionell toxische Retroviren sind in Brady et al., 1994, Proc. Nat. Aca. Sci. 91:365 und in Caruso et al., 1992, Bone Marrow Transplant, 9:187 offenbart. Toxine gegen EBV Infektion sind in Harris et al., 1991, Cell. Immunol. 134:85 und gegen Poliovirus in Rodriguez et al., 1992, Jour. Virol. 66:1971 offenbart. Toxine gegen Influenza Virus sind in Bron et al., 1994, Biochemistry 33:9110 offenbart.
2. Gene, die immunaktive Agenzien kodieren
Andere Mittel, die erfindungsgemäß nützlich sind, schließen immunreaktive Agenzien, d.h. Mittel, die virale Infektionen oder die Herstellung durch Aktivieren einer Immunantwort gegen das Virus bekämpfen. Solche Mittel schließen ein, aber sind nicht be schränkt auf Cytokine gegen Viren im Allgemeinen (Biron. 1994, Curr. Opin. Immunol. 6:530); lösliches CD4 gegen SIV (Watanabe et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sic. 88:126); CD4-Immunglobulin Fusionen gegen HIV-1 und SIV (Langner et al., 1993, Arch. Virol. 130:157); CD4(81-92) basierte Peptid Derivate gegen HIV Infektion (Rausch et al, 1992, Biochem. Pharmacol. 43:1785); lymphocytotoxische Antikörper gegen HIV Infektion (Szabo et al., 1992, Acta. Virol. 38:392); IL-2 gegen HIV Infektion (Bell et al., 1992, Clin Exp. Immunol. 90:6); und anti-T Zellrezeptor Antikörper gegen Viren im Allgemeinen (Newell et al., 1991, Ann. N.Y. Aca. Sci. 636:279).
3. Gene, die antivirale Arzneimittel kodieren
Andere antivitale Mittel, die erfindungsgemäß nützlich sind, schließen Arzneimittel mit antiviraler Aktivität und welche das direkte Produkt eines Gen oder die ein Produkt eines Gens sind, das einen Vorläufer des Arzneimittels kodiert, wobei das Arzneimittel anschließend durch einen biosynthetischen Weg in der Zelle synthetisiert wird, ein. Ziele von Arzneimittel Interventionen in dem replikativen Zyklus eines beispielsweise Retrovirus schließen (i) Bindung und Eintritt, (2) reverse Transkriptase, (3) Transkription und Translation, und (4) virale Reifung und Knospung, ein. Repräsentative Inhibitoren von viraler Bindung und dem Eintritt für HIV schließen rekombinantes lösliches CD4, Immunadhäsionen, Peptid T und Hypericin ein. Nukleosid reverse Transkriptase Inhibitoren schließen Zidovudin, Didanosin, Zalcitabin und Starudin ein. Foscarnet, Tetrahydroimidazolbenzodiazepinthion Verbindungen und Nevirapin sind einige nicht Nukleotid reverse Transkriptase Inhibitoren. Inhibitoren von Transkription und Translation schließen Antagonisten des TAT Gens und GLQ223 ein. Castanospermin und Protease Inhibitoren interferieren mit der vitalen Knospung und der Reifung. Solche Arzneimittel schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Nukleosid und Nukleotid Analoga und Produkte eines zellulären biosynthetischen Weges, wie beschrieben in Harrell et al., 1994, Drug. Metab. Dispos. 22:124 (Desoxyguanin); Fillon et al., 1993, Clin. Invest. Med. 16:339 (Daunorubicin); Ohrvi et al., 1990, Nucleic Acids Symp. 26:93 (antivitale Nukleoside); Hudson et al., 1993, Photochem. Photobiol. 57:675 (Thiarubine); Salhany et al., 1993, Jour. Biol. Chem. 268:7643 (Pyridoxal 5'-Phosphat); Damaso et al., 1994, Arch. Viral. 134:303 (Cyclosporin A); Gallicchio et al., 1993. Int. Jvur. Immunol. 15:263 (Didesoxynukleosid Arzneimittel); und Fiore of al., 1990, Biol. Soc. Ital. Biol. Sper. 66:601 (AZT).
4. Gene, die Proteine oder Enzyme kodieren, die für die Behandlung von Patienten durch Gen Therapie nützlich sind
Gene, die Proteine oder Enzyme kodieren, die für die Behandlung von Patienten durch Gen Therapie nützlich sind, schließen Gene ein, die β-Glucocerbrosid für Gaucher'sche Erkrankung, Faktor XIII und IX für Hämophilie und Vorläufer Arzneimittel aktivierende Enzyme für die Verwendung in Vorläufer Arzneimittel Behandlungen (z.B. bakterielle Nitroreduktasen für die Verwendung in Gen vermittelter Enzym Vorläufer Therapie (GDEPT)) kodieren.
Erfindungsgemäß nützliche Vektoren
Erfindungsgemäß nützliche Vektoren schließen einen Vektor ein, der die folgenden Eigenschaften besitzt:
i) Bakterieller Replikationsursprung mit hoher Kopienzahl
Vektoren mit einer relativ hohen Kopienzahl, d.h. im Bereich von 20–40 Kopien/Zelle bis zu 1000–2000 Kopien/Zelle sind erfindungsgemäß besonders nützlich. Zum Beispiel ist ein Vektor, der den pUC Replikationsursprung einschließt, gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt. Der pUC Replikationsursprung erlaubt eine wirksamere Replikation von Plasmid DNA und führt zu einem zehnfachen Anstieg in der Plasmid Kopienzahl/Zelle gegenüber einem z.B. pBR322 Ursprungspunkt. Die resultierende hohe Kopienzahl steigert stark das Verhältnis von Plasmid DNA zu chromosoma ler DNA, RNA, zellulären Proteinen und Kofaktoren, verbessert die Plasmid Ausbeute und ermöglicht die leichtere nachfolgende Reinigung.
ii) Kleines und stabile Vektor Rückgrat
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass das Rückgrat eines Vektors, der in dem hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, klein ist, d.h. weniger als 5 kb, und vorzugsweise 1–3 kb. Der Begriff "Vektor Rückgrat" betrifft die bakterielle DNA, die notwendig ist, um den Vektor in einem bakteriellen Wirt aufrecht zu erhalten und zu propagieren. Erfindungsgemäße Vektoren, die sowohl Rückgrat als auch Insert einschließen, liegen in der Größenordnung von 15–50 kb in der Größe, oder noch größer. Somit wird ein erfindungsgemäß nützliches Vektor Rückgrat in der Lage sein, Inserts von ungefähr 10–50 kb oder größer zu tragen. Das Insert kann DNA von irgendeinem Organismus einschließen, aber es wird vorzugsweise von Säugerursprung sein, und kann zusätzlich zu einem Gen, das ein therapeutisches Protein kodiert, regulatorische Sequenzen, wie Promotoren, Polyadenylierungssequenzen, Enhancer, Locus Kontroll Regionen, etc. einschließen. Das Gen, das ein therapeutisches Protein kodiert, kann genomischen Ursprungs sein, und es kann deshalb Exons und Introns enthalten, wie in seiner genomischen Organisation reflektiert ist, oder es kann von der komplementären DNA abgeleitet sein.
Der Vektor sollte stabil vererbt werden; dies bedeutet, dass das Vektor Rückgrat vorzugsweise keine intrinsisch unstabilen Elemente, die dem Rearrangement, der Deletion, etc. zuträglich sind, wie Transposons, enthält, und er wird stabil in der Anwesenheit eines Selektionsmittels vererbt.
Erfindungsgemäß nützliche Vektoren schließen pEAβGlu, pUC18/19tetΔAmp, pTX0161, pUC19tet, pGL2RSV, pGL2RSVluc, pAl6tet und pCD2tatRZfull ein.
iii) Polylinker, die für den Einbau von therapeutischen Genen und regulatorischen Sequenzen geeignet sind
Erfindungsgemäß nützliche Vektoren schließen einen Polylinker umfassend eine Vielzahl von Restriktionsstellen ein, die in der Spaltung des Vektors und dem Einbau von therapeutischen Genen nützlich sind.
iv) Abwesenheit von anderen bakteriellen Protein Genen
Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass keine anderen bakteriellen Gene von dem Vektor Rückgrat getragen werden. Die Abwesenheit von anderen bakteriellen Genen minimiert die Möglichkeit, dass ein Patient eine Immunantwort gegen ein Fremdgen oder sein kodiertes Produkt entwickelt, wo das Gen in den Zellen des Patienten anwesend ist und/oder exprimiert wird, auf die der therapeutische Vektor abgezielt hat. Andere bakterielle Gene, die von dem Wirtsstamm während der Fermentation exprimiert werden, führen zu einer metabolischen Last in dem Wirt und reduzieren die Biomasse und Plasmid Ausbeuten.
v) Selektive Marker Gene
Erfindungsgemäß nützliche Vektoren können ein Gen einschließen, das einen selektierbaren Marker kodiert, z.B. ein Antibiotika Resistenz Gen, wie das bakterielle Tetracyclin Resistenz Gen. Der Einbau des Tetracyclin Resistenz Gens erlaubt die Verwendung von Tetracyclin als einem Selektionsmittel in der erfindungsgemäßen Plasmid Präparation. Ein Vorteil der Verwendung eines Tetracyclin Resistenz Gens ist es, dass Tetracyclin nicht in E. coli degradiert wird, und dass deshalb nicht mehr Tetracyclin während der Fermentation zugegeben werden muss. Zusätzlich ist das Tetracyclin Resistenz Gen gegenüber einem Gen, das für Ampicillin Resistenz kodiert, bevorzugt, weil Tetracyclin weniger häufig als ein Antibiotikum in der klinischen Umgebung ver schrieben wird und negative Antworten auf tet weniger häufig sind als für amp und andere β-Lactam Antibiotika.
Dosierung, Art der Verabreichung und pharmazeutische Formulierungen
Die Erfindung umfasst Verfahren zum Entfernen von RNA aus Präprationen von zellulären Bestandteilen.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen zellulären Bestandteil umfasst, der von einer Wirtszelle hergestellt wird, die auch eine RNase bildet, kann aus vorzugsweise 10⁵–10⁸ Wirtszellen und weiter bevorzugt aus 10⁶–10⁷ Wirtszellen hergestellt werde. Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die einen zellulären Bestandteil umfasst, der von einer Wirtszelle gebildet wird, die mit einer davon verschiedenen Wirtszelle kokultiviert wird, die eine RNase bildet, kann aus vorzugsweise 10⁵–10⁸ der jeweiligen Wirtszelle und weiter bevorzugt aus 10⁶–10⁷ der jeweiligen Wirtszelle hergestellt werden. In der zuletzt genannten Ausführungsform sind die zwei Wirtszellen vorzugsweise in der Kultur in einem 1:1 Verhältnis anwesend, oder sie werden zu dem Zeitpunkt der Lyse in einem 1:1 Verhältnis gemischt.
Die hier beschriebenen zellulären Bestandteile können als Injektionslösungen, entweder als Flüssiglösungen oder Suspensionen hergestellt werden; feste Formen, die für die Lösung in oder Suspension in Flüssigkeiten vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. Die Präparation kann auch emulgiert sein, oder der zelluläre Bestandteil kann in Liposomen verkapselt sein. Der Begriff "pharmazeutisch verträglicher Träger" betrifft einen Träger, der keine allergische Reaktion oder andere gegenteilige Wirkungen in Subjekten, an welche er verabreicht wird, verursacht. Geeignete pharmazeutisch verträglich Träger schließen zum Beispiel eines oder mehrere von Wasser, Salzlösung, Phosphat gepufferter Salzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol und ähnliches oder Kombinationen davon ein. Wenn gewünscht, kann die Zusammensetzung zusätzlich kleine Menge an Hilfssubstanzen, wie Benetzungs- oder emulgierende Mittel, pH puffernde Mittel und/oder Adjuvanzien enthalten, welche die Wirksamkeit des Impfstoffs verstärken. Beispiele von Adjuvanzien, die wirksam sein können, schließen ein aber sind nicht beschränkt auf: Aluminiumhydroxid, N-Acetyl-muramyl-L-threonyl-D-isoglutamin (thr-MDP), N-Acetyl-nor-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin (CGP 11637 bezeichnet als nor-MDP), N-Acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1'-2'dipalmitoyl-s-n-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamin (COP) 19835A, bezeichnet als MTP-PE) und RIBI, was drei Bestandteile enthält, die aus Bakterien isoliert wurden, Monosphosphoryllipid A, Trehalosedimycolat und Zellwandskelett (MPL + TDM + CWS) in einer 2% Squalen/Tween 80 Emulsion. Andere Beispiele von Adjuvanzien schließen DDA (Dimethyldioctadecylammoniumbromid), Freund'sches vollständiges und unvollständiges Adjuvans und QuilA ein.
Erfindungsgemäße zelluläre Bestandteile können parenteral, durch Injektion, zum Beispiel entweder subkutan oder intramuskulär verabreicht werden. Zusätzliche Formulierungen, die für andere Verabreichungsarten geeignet sind, schließen Zäpfchen, und in einigen Fällen orale Formulierungen und Formulierungen, die für die Verteilung als Aerosole geeignet sind, ein. Für Zäpfchen können herkömmliche Bindemittel und Träger eingeschlossen werden, zum Beispiel Polyalkylenglykole oder Triglyceride; solche Zäpfchen können aus Gemischen mit dem aktiven Bestandteil im Bereich von 0,5% bis 10%, vorzugweise 1–2% formuliert werden. Orale Formulierungen schließen solche normalerweise eingesetzte Trägermittel, wie zum Beispiel, pharmazeutisch reines Mannitol, Lactose, Stärkemagnesiumstearat, Natriumsaccharin, Zellulose, Magnesiumcarbonat und ähnliches ein. Diese Zusammensetzungen nehmen die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen zur verzögerten Freisetzung und Pulver an und enthalten 10%–95% des aktiven Bestandteils, vorzugsweise 25–70%.
Andere Ausführungsformen
Andere Ausführungsformen liegen innerhalb der folgenden Patentansprüche. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines im wesentlichen RNA-freien zellulären Bestandteils, umfassend das Kultivieren und Lysieren von Zellen, die RNA enthalten, wobei diese Zellen: i) einen zellulären Bestandteil; und ii) eine RNase in einer Menge, die ausreichend ist, um im wesentlichen alle anwesende RNA zu degradieren, bilden, und wobei die RNase durch die Zellen gebildet wird, die den zellulären Bestandteil bilden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 zur Herstellung eines in wesentlichen RNA-freien zellulären Bestandteils, umfassend das Kultivieren von Zellen, die einen zellulären Bestandteil bilden, in einem Medium und das Lysieren der Zellen, um ein Zelllysat zu bilden, wobei das Zelllysat den zellulären Bestandteil und ausreichend RNase Aktivität enthält, die durch Zellen in dem Medium gebildet wird, um im wesentlichen alle RNA Moleküle zu degradieren, die in dem Zelllysat anwesend sind, wobei die RNase von den Zellen gebildet wird, die den zellulären Bestandteil bilden.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der zelluläre Bestandteil einer ist von einer rekombinanten DNA und einem rekombinanten Protein.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Gen, das die RNase kodiert, in das Genom der Zelle, welche die RNase bildet, integriert ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die RNase unspezifisch ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die unspezifische RNase RNase A, RNase M oder RNase I ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle, welche die RNase bildet, die RNase in einer regulierten Weise bildet.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die RNase, die in der regulierten Weise gebildet wird, durch die Zelle, welche die RNase bildet, übermäßig gebildet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die RNase, die in der regulierten Weise gebildet wird, induzierbar von der Zelle, welche die RNase bildet, gebildet wird.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei die RNase, die in der regulierten Weise gebildet wird, konstitutiv von der Zelle, welche die RNase bildet, gebildet wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei die RNase, die in der regulierten Weise gebildet wird, aus dem Cytoplasma der Zelle, welche die RNase bildet, segregiert wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei die RNase in das Periplasma der Zelle, welche die RNase bildet, segregiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 11 oder Anspruch 12, wobei die Zelle in einem Medium enthalten ist und die RNase aus der Zelle in das Medium segregiert wird.