JP2002518994A

JP2002518994A - 実質的にｒｎａを含まない細胞成分の精製

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Publication number: JP2002518994A
Application number: JP2000543566A
Authority: JP
Inventors: ハナック，ジュリアン・アレクシス・ジョン; ウィリアムズ，スティーヴン・ジェレイント
Original assignee: コブラ・セラピューティクス・リミテッド
Priority date: 1998-04-14
Filing date: 1999-04-13
Publication date: 2002-07-02
Also published as: AU755520B2; EP1080179B1; WO1999053018A2; DE69931774T2; AU3434899A; HK1037884A1; WO1999053018A3; ATE329007T1; CA2325575A1; EP1080179A2; DE69931774D1

Abstract

(57)【要約】本発明は、宿主細胞と細胞成分を産生している細胞とを培地中で培養し、該細胞を溶解して細胞溶解液を産生することを含む、実質的にＲＮＡを含まない細胞成分の調製方法に関し、ここで、該細胞溶解液は、該細胞成分並びに該細胞溶解液に存在する実質的に全てのＲＮＡ分子を分解するのに十分なＲＮａｓｅ活性を含む。本発明はまた、実質的にＲＮＡを含まない細胞成分にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、ＲＮＡを含まない細胞成分の産生、並びに、細胞成分の調製物から
ＲＮＡを除去する方法に関する。

【０００２】（発明の背景）リボヌクレアーゼ酵素ファミリー（以後ＲＮａｓｅと呼ぶ）は広範に研究され
てきた。数多くのＲＮａｓｅが特徴づけられ、これらのタンパク質のいくつかを
コードしている遺伝子がクローニングされた。

【０００３】ＲＮａｓｅは、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ並びにＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド
のＲＮＡにおける１つ以上のホスホジエステル結合を加水分解する。ＲＮａｓｅ
は、特定のＲＮＡ基質の形（例えば、一本鎖、二本鎖またはＤＮＡ：ＲＮＡハイ
ブリッド中）へのその特異性またはその特異的なＲＮＡ切断の点において異なる
。

【０００４】ＲＮａｓｅ酵素の１つの生物活性は、前駆体の形態からのＲＮＡの成熟体分子
のプロセシングである（Ｇｅｎｅｓ、ＢｅｎｊａｍｉｎＬｅｗｉｎ編、Ｊｏｈ
ｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、第２版、ｐ．３９５、１９８５）。あるＲＮａ
ｓｅは、内因性抗腫瘍活性により哺乳動物細胞の増殖および分化に影響を与え得
る（Ｒｉｂｏら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．ａｎｄＰｕｒｉｆ．７：２５３
−２６１、１９９６内の参考文献）。

【０００５】ＲＮＡは細胞溶解液の調製物の主要な汚染物である。例えば、プラスミドＤＮ
Ａ調製物は、サイズ（ＳＥＣマトリックスによる排除に関して）および荷電がＤ
ＮＡに類似しているために、アニオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー
により除去し難いＲＮＡを含む。ＲＮａｓｅＡは、ピリミジンリボヌクレオチド
の３’−リン酸基と隣のヌクレオチドの５’−ヒドロキシル間を切断することに
より、ＣおよびＵ残基の後でＲＮＡを加水分解する。この酵素を使用して、ＲＮ
Ａを、プラスミドまたはゲノムＤＮＡともはや同時精製しない低分子量種に分解
する。ＲＮａｓｅＩを使用しても、プラスミドまたはゲノムＤＮＡの調製物から
ＲＮＡを除去できる。ＲＮａｓｅＡも、一般的に、大腸菌からの組換えタンパク
質の産生中の、宿主由来ＲＮＡの酵素的消化に使用される。

【０００６】サンプルからＲＮＡを除去する先行技術の方法は、大量の外因産生ＲＮａｓｅ
を加えることである。例えば、プラスミドＤＮＡからＲＮＡを除去するために、
ウシＲＮａｓｅＡを最終濃度が１００μｇ／ｍｌとなるまで加える（Ｑｉａｇｅ
ｎプラスミドハンドブック、１９９５年２月、ＱｉａｇｅｎＬｔｄ．Ｕｎｉ
ｔ１ＴｉｌｌｉｎｇｂｏｕｒｎｅＣｏｕｒｔ、ＤｏｒｋｉｎｇＢｕｓｉ
ｎｅｓｓＰａｒｋ，Ｄｏｒｋｉｎｇ，ＳｕｒｒｅｙＲＨ４１ＨＪ，ＵＫ
）。ウシＲＮａｓｅＡは、一般的に、約１０〜１００μｇ／ｍｌの最終濃度で、
大腸菌からの組換えタンパク質の産生の間、宿主由来ＲＮＡの酵素的消化に使用
されている。先行技術の方法の主な不都合は、これらの方法に従って処理した細
胞成分が、動物起源の残余ＲＮａｓｅをしばしば含むことである。

【０００７】外因産生ＲＮａｓｅの使用には限界がある。第一に、大量のＲＮａｓｅを起源
の組織から精製することは困難である。これは、おそらく、高濃度の活性ＲＮａ
ｓｅは、宿主細胞のＲＮＡを分解し、正常細胞の機能を、細胞に毒性となり得る
レベルまで障害するためであろう。それ故、高濃度の活性ＲＮａｓｅは細胞に毒
性であるので、細胞中での発現により大量の活性ＲＮａｓｅを産生することは困
難である。また、ＲＮａｓｅは合成される宿主のプロテアーゼに感受性であり得
るため、並びに、過剰産生され例えば大腸菌封入体中に蓄積されるＲＮａｓｅは
必ずしも常に正しく折り畳まれ得ないため、細胞中での発現により大量の活性Ｒ
Ｎａｓｅを産生することは困難である。外因産生ＲＮａｓｅ使用の最も有意な制
限は、外因的に加えたＲＮａｓｅが動物起源である場合、ＲＮａｓｅ処理後に残
余酵素の存在がＤＮＡ調製物を汚染し得、よって、遺伝子療法を含むある適用に
は許容不可能となる。第三に、大量のＲＮａｓｅの産生は費用が高い。

【０００８】当分野で、実質的に汚染ＲＮＡを含まないプラスミドＤＮＡおよびタンパク質
調製物が必要である。

【０００９】当分野で、ヒト被検者の投与に適切な、ＲＮＡを含まない細胞成分を産生する
方法が必要である。

【００１０】当分野で、細胞溶解液または精製成分を、外因の産生されたＲＮａｓｅを加え
てインキュベートすることに依拠しない、細胞成分からＲＮＡを除去する方法が
必要である。

【００１１】（発明の概要）本発明は、細胞成分を産生している細胞を培地中で培養し、該細胞を溶解して
細胞溶解液を産生することを含む、実質的にＲＮＡを含まない細胞成分の調製方
法を特徴とし、ここで、該細胞溶解液は、該細胞成分と、該細胞溶解液に存在す
る実質的に全てのＲＮＡ分子を分解するに十分なＲＮａｓｅ活性とを含む。

【００１２】好ましい実施形態において、ＲＮａｓｅは、細胞成分を産生している細胞によ
り産生される。

【００１３】別法として、ＲＮａｓｅは、細胞成分を産生している細胞以外の細胞により培
地中で産生される。

【００１４】本発明はまた、細胞成分を産生している細胞、並びに、調製物に存在する実質
的に全てのＲＮＡを分解するに十分な量のＲＮａｓｅを産生している細胞を培養
および溶解することを含む、実質的にＲＮＡを含まない細胞成分の調製法を特徴
とする。

【００１５】好ましくは、細胞成分を産生している細胞はＲＮａｓｅも産生し、培養液およ
び溶解液は、細胞成分を産生している細胞並びに調製物に存在する実質的に全て
のＲＮＡを分解するに十分な量のＲＮａｓｅを含む。好ましくは、細胞成分およ
びＲＮａｓｅは同細胞により産生される。

【００１６】両方の上記の本発明の方法の好ましい実施形態において、細胞成分は、ＤＮＡ
、タンパク質、および炭水化物の１つである。好ましくは、細胞成分は、組換え
ＤＮＡ、組換えタンパク質および組換え炭水化物の１つである。好ましくは、Ｒ
Ｎａｓｅは、プラスミド上にコードされ、細胞成分は、同プラスミド、別のプラ
スミドまたは細胞の染色体上にコードされている。

【００１７】両方の上記の本発明の方法の好ましい実施形態において、該ＲＮａｓｅをコー
ドしている遺伝子は、ＲＮａｓｅを産生している細胞のゲノムに組込まれている
。

【００１８】本発明のいくつかの方法において、ＲＮａｓｅは非特異的であることが好まし
い。かかる非特異的ＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＭ、またはＲＮａ
ｓｅＩであり得る。

【００１９】両方の上記の本発明の方法の好ましい実施形態において、ＲＮａｓｅを産生し
ている細胞は、調節された様式でＲＮａｓｅを産生する。

【００２０】好ましくは、宿主細胞により産生されたＲＮａｓｅは、誘導的産生または構成
的産生のいずれかにより過剰産生される。宿主細胞により過剰産生されたＲＮａ
ｓｅはまた、宿主細胞細胞質から分泌され得、例えば、宿主細胞ペリプラズムに
分泌され得るか、または宿主細胞から培地に分泌され得る。

【００２１】いくつかの方法で、ＲＮａｓｅは非特異的ＲＮａｓｅであることが好ましい。

【００２２】本発明はまた、組換えＤＮＡ、組換えタンパク質、または組換え炭水化物を産
生し、並びに、調節された様式でＲＮａｓｅも産生する宿主細胞を含む組成物を
特徴とする。

【００２３】上記の調節された様式で産生されたＲＮａｓｅは、過剰産生されるか、または
誘導的に過剰産生されるか、または構成的に過剰産生される。宿主細胞により産
生されたＲＮａｓｅはまた、宿主細胞細胞質から分泌され得、例えば、宿主細胞
ペリプラズムに分泌され得るか、または宿主細胞から培地に分泌され得る。

【００２４】いくつかの方法で、ＲＮａｓｅは非特異的ＲＮａｓｅであることが好ましい。

【００２５】本発明はまた、組換えＤＮＡ、組換えタンパク質、または組換え炭水化物を産
生し、調節された様式でＲＮａｓｅをも産生する宿主細胞を含む組成物を特徴と
する。

【００２６】上記の調節された様式で産生されたＲＮａｓｅは、過剰産生されるか、または
誘導的に過剰産生されるか、または構成的に過剰産生される。宿主細胞により産
生されたＲＮａｓｅはまた、宿主細胞細胞質から分泌することができ、例えば、
宿主細胞ペリプラズムに分泌され得るか、または宿主細胞から培地に分泌され得
る。

【００２７】本発明はまた、医薬的に許容される担体中に、実質的にＲＮＡを含まない細胞
成分を含む医薬組成物を特徴とする。本発明はまた、医薬的に許容される担体中
に、本発明の方法により得られ得る実質的にＲＮＡを含まない細胞成分を含む医
薬組成物を提供する。

【００２８】好ましくは、実質的にＲＮＡを含まない細胞成分は、本明細書に記載の方法に
従って製造される。

【００２９】本明細書で使用した「実質的にＲＮＡを含まない」および「実質的に全てのＲ
ＮＡ分子」は、ヒトへの投与に有用な細胞成分の調製に許容された、極めて少量
のＲＮＡを意味する。許容可能な極めて低いレベルのＲＮＡは以下の通りである
。

【００３０】「実質的にＲＮＡを含まないＤＮＡ」は、１％以下、好ましくは０．２％以下
、最も好ましくは０．１％〜０．０１％以下（サンプル中のＲＮＡ／ＤＮＡのｗ
／ｗ）の細胞成分を含む、サンプル中の存在を意味する。

【００３１】「実質的にＲＮＡを含まないタンパク質」は、１％以下、好ましくは０．２％
以下、最も好ましくは０．１％〜０．０１％以下（ｗ／ｗ）のＲＮＡ／タンパク
質を含む、タンパク質調製物を意味する。タンパク質が治療用タンパク質である
場合、「実質的にＲＮＡを含まないタンパク質」は、１０ｎｇ以下のＲＮＡ／投
与量、好ましくは５００ｐｇ以下のＲＮＡ／投与量、より好ましくは１００ｐｇ
以下のＲＮＡ／投与量、最も好ましくは５〜１０ｐｇ以下のＲＮＡ／投与量を含
む、治療用タンパク質調製物を意味する。

【００３２】「実質的にＲＮＡを含まない炭水化物」は、１％以下、好ましくは０．２％以
下、最も好ましくは０．１％〜０．０１％以下（ｗ／ｗ）のＲＮＡ／炭水化物を
含む、炭水化物調製物を意味する。

【００３３】「細胞溶解液」は、細胞溶解時に産生される組成物を意味し、ここで、該組成
物は外因産生ＲＮａｓｅを含まない。プロテアーゼまたはプロテアーゼ阻害剤な
どの他の外因産生成分を細胞溶解液に加えてもよい。

【００３４】好ましくは、細胞溶解液は、外因ＲＮａｓｅを細胞溶解液に加える先行技術の
方法よりも有意に少ないＲＮａｓｅタンパク質を含む。この脈絡での「有意に少
ない」は、１０μｇ〜５０μｇ以下のＲＮａｓｅ／溶解液のｍｌ、好ましくは１
０μｇ以下のＲＮａｓｅ／溶解液のｍｌ、より好ましくは１μｇ以下のＲＮａｓ
ｅ／ｍｌを意味する。

【００３５】本明細書で使用した「細胞成分」は、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ｙ
ａｃＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを含むがこれらに限定され
ないＤＮＡのいずれか１つや、組換えタンパク質、および組換え炭水化物を意味
する。

【００３６】本明細書で使用した「組換え」は、細胞に天然に存在しないか、または細胞に
より通常産生されない量で産生される、ＤＮＡ、タンパク質または炭水化物を意
味する。

【００３７】本明細書で使用した「細胞」は、任意の真核細胞または原核細胞を意味する。
好ましい真核細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯなどの骨髄腫細胞系、
Ｓｆ２１およびＳｆ９細胞などの昆虫細胞、植物細胞並びに酵母を含む下等真核
細胞を含む。最も好ましくは、「細胞」なる語は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ネ
ズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、バシラス属
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｐ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓｓｐｐ．）、およびシュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｈｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を含むがこれに限定されない、グラム陰性または
グラム陽性細菌を意味する。

【００３８】「調節された様式」は、例えば、構成的または誘導的に転写調節されている宿
主細胞における、例えば、ＲＮａｓｅ遺伝子の遺伝子発現を意味する。それはま
た、タンパク質産生レベルでの調節、例えば、タンパク質を宿主細胞ペリプラズ
ムに、または宿主細胞から宿主細胞を囲む培地へと指示する、シグナル配列また
は融合タンパク質の使用を意味する。

【００３９】「誘導的」または「誘導」は、転写活性化または抑制を意味し、「構成的」は
、しばしば一定レベルでの連続的な転写を意味し、「シグナル配列」は、タンパ
ク質をペリプラズムへのまたは細胞からの分泌を指示するアミノ酸配列を意味し
、「分泌」は、分泌タンパク質の宿主細胞細胞質からの、ペリプラズムまたは宿
主細胞培養培地への移動を意味し、「ペリプラズム」は、例えば大腸菌の内ない
し外細胞膜の間の宿主細胞区画を意味する。

【００４０】「過剰発現」または「過剰産生」は、宿主細胞で通常発現されるレベルよりも
高いレベルの遺伝子発現を意味し、「過剰産生」は、細胞により通常産生される
よりも高い量の産生を意味する。従って、ある遺伝子の過剰発現または遺伝子産
物若しくは組換えＤＮＡの過剰産生は、過剰発現遺伝子の非存在下で細胞が通常
産生するよりも、１０％以上、５０％以上、１００％以上またはさらには２００
〜５００％以上の遺伝子産物の産生を包含する。本発明は、実質的に汚染ＲＮＡ
を含まない、ＤＮＡ、タンパク質または炭水化物調製物を提供する。本発明は、
ヒトへの投与に関与する調製物の提供に特に有用であるが、また、２６０ｎｍ（
この波長ではＲＮＡも吸収する）での吸光度によるＤＮＡ濃度の正確な決定、Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡおよびＤＮＡ／タンパク質相互作用の両方の調査を含む、他の使用
にも有用である。実質的にＲＮＡを含まないタンパク質が、治療適用、２８０ｎ
ｍでの吸光度によるタンパク質濃度の推定、タンパク質結晶構造の解析、タンパ
ク質／ＤＮＡおよびタンパク質／ＲＮＡ相互作用の研究、およびあるタンパク質
精製プロトコル（ここで、核酸結合は、タンパク質のイオン交換体への親和性を
減少させるか、またはイオン交換体のタンパク質の容量を減少させる）に必要と
される。

【００４１】本発明は、実質的に汚染ＲＮＡを含まない、ＤＮＡ、タンパク質、炭水化物な
どの細胞成分の調製を必要とする任意の使用に、例えば、ヒトでの治療使用に適
切な、ＤＮＡまたはタンパク質または炭水化物などの細胞成分の調製に適用可能
である。

【００４２】本発明のさらなる特徴および利点は、以下の実施形態の説明並びにその図面、
並びに特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。

【００４３】（記載）本発明は、細胞（群）の溶解時に、溶解液中の実質的に全てのＲＮＡ分子を分
解するに十分なＲＮａｓｅ活性が存在するように共培養される、同宿主細胞また
は異なる宿主細胞中で、選択された細胞成分およびＲＮａｓｅを産生することを
含む、実質的にＲＮＡを含まない細胞成分を産生する方法を提供する。

【００４４】細胞成分は、本発明に従って実質的にＲＮＡを含まずに産生される、ＤＮＡ、
タンパク質または炭水化物であり得る。これは、例えば、ＲＮａｓｅタンパク質
を発現するように操作された宿主細胞に導入される細胞成分をコードしている遺
伝子を使用して、または、個々に細胞成分およびＲＮａｓｅを産生する２つの異
なる宿主細胞を培養および溶解することにより、達成され得る。

【００４５】本発明で有用なＲＮａｓｅ遺伝子およびＲＮａｓｅ様々なＲＮａｓｅタンパク質をコードしている遺伝子がクローニングされた。
理想的には、本発明のＲＮａｓｅは非特異的であり（例えば、高濃度で使用する
ウシＲＮａｓｅＡおよび大腸菌ＲＮａｓｅＭ）、それ故、全種類のＲＮＡ分子を
分解する。非特異的ＲＮａｓｅは、一本鎖または二本鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ／Ｄ
ＮＡ分子のホスホジエステル結合を、ＲＮＡ分子長のどの箇所でも加水分解する
。

【００４６】ウシＲＮａｓｅＡのタンパク質産物および遺伝子（Ｔｅｒｒａｇｏｎａ−Ｆｉ
ｏｌら、Ｇｅｎｅ、１１８：２３９−２４５、１９９２、Ｓｃｈｅｉｎら、Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２８３：１３７−１４４、１９９２、Ｌａｉｔｙら、ＰＮＡ
Ｓ９０：６１５−６１９、１９９３、ｄｅｌＣａｒｄａｙｒｅ、Ｐｒｏｔ．Ｅ
ｎｇｉｎｅｅｒ．８：２６１−２７３、１９９５、Ｏｋｏｒｏｋｏｖら、Ｐｒｏ
ｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．６：４７２−４８０）、並びに、ネズミおよ
びラットＲＮａｓｅＡホモログ（Ｓｃｈｅｉｎら、上記）がクローニングされ、
特徴付けられた。

【００４７】ＲＮａｓｅＨは、相補的ＤＮＡ鎖にハイブリッドするＲＮＡ分子を加水分解し
、分子生物学において、二本鎖ｃＤＮＡの産生の第一鎖合成後にＲＮＡ鎖を分解
するのに使用される。ＲＮａｓｅＨはまた、オリゴ−ｄＴ_12-18にハイブリッド
したｍＲＮＡからポリＡ尾を除去するのにも使用される（米国特許第５，４５９
，０５５号に記載）。

【００４８】ＲＮａｓｅＩは、任意のリボヌクレオシドの一本鎖ＲＮＡ３’のホスホジエス
テル結合を切断し、ＲＮａｓｅ保護アッセイ、ＲＮＡのマッピングおよび定量並
びにミスマッチ検出に使用される。大腸菌ＲＮａｓｅＩおよびＲＮａｓｅＭ（Ｍ
ｅａｄｏｒおよびＫｅｎｎｅｌｌ、１９９０、Ｒｉｂｏら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐｒ
ｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．７：２５３−２６１、１９９６）がクローニングされ、単
離され、特徴付けられた。

【００４９】ＲＮａｓｅＴ１は、優先的に、Ｇ残基の３’を切断し、ＲＮＡ配列解析および
ＲＮＡフィンガープリントに使用される。コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｏｒｙｚａｅ）ＲＮａｓｅＴ１およびＴ２（Ｆｕｊｉｍｕｒａら、ＦＥＢＳ、
２６５：７１−７４、１９９０、Ｑｕａｓｓら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１７３：６１７−６２２、１９８８）がクローニングされ、単離され、特徴付け
られた。

【００５０】ＲＮａｓｅ４（Ｓｅｎｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．ＥｔＢｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ
ａ、１２６１：４２４−４２６、１９９５）がクローニングされ、単離され、特
徴付けられた。

【００５１】ヒト膵臓ＲＮａｓｅ（Ｒｕｓｓｏら、ＦＥＢＳ３３３：２３３−２３７、１
９９３）がクローニングされ、単離され、特徴付けられた。

【００５２】バシラス・アミロリクエファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑ
ｕｅｆａｃｉｅｎｓ）ＢａＲＮａｓｅ（Ｈａｒｔｌｅｙ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．２０２：９１３−９１５、１９８８）が合成およびプロセシングに関して特徴
付けられた。

【００５３】宿主細胞における選択されたＲＮａｓｅ遺伝子の発現本発明に従って、ＲＮａｓｅ遺伝子を、ＲＮａｓｅタンパク質が細胞膜ペリプ
ラズム空間または細胞上清のいずれかに局在するように、例えば、シグナル配列
を使用してＲＮａｓｅの位置を指示することにより、または、分泌された融合タ
ンパク質を創製することにより、修飾できる。

【００５４】別法として、ＲＮａｓｅの発現は、誘導プロモーターの制御下にＲＮａｓｅ遺
伝子を配置することにより選択的に制御され得る。

【００５５】別法として、ＲＮａｓｅ遺伝子は、宿主細胞に導入され、宿主細胞の染色体に
組込まれ得る。

【００５６】ＲＮａｓｅの過剰産生に使用するベクターを修飾して、ＲＮａｓｅが産生され
る宿主細胞に対する不適切に折り畳まれたＲＮａｓｅの毒性作用、宿主細胞に存
在するプロテアーゼに対する折り畳まれていないＲＮａｓｅの感度、および封入
体中に産生されたいくつかのＲＮａｓｅの不適切な再折り畳みに起因する問題を
最小限とした。

【００５７】大腸菌宿主株の染色体へのＲＮａｓｅ遺伝子の組込み以下の方法を使用して、宿主細胞染色体に組み込まれたＲＮａｓｅ遺伝子を含
む宿主細胞が提供され得る。

【００５８】１．ｐＮ１へのＲＮａｓｅＡのクローニングＲＮａｓｅＡ遺伝子が、プライマー、５’−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＡＴＧＴＴＣＴＴＧＧＡＧＧＡＴＧＡＴＴＧ−３’
５’−ＴＡＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＣＴＴＡＧＧＴＡＧＡＧＡＣＣＴＡＣ−３’ を使用して、ＰＣＲにより（分子生物学の現在のプロトコル、Ａｕｓｕｂｅｌ，
Ｆ．Ｍ．ら編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＩｎｃ．）発現ベクター
ｐＱＲ１６３（Ｔｅｒｒａｇｏｎａ−Ｆｉｏｌら、上記）から単離した。

【００５９】単離されたＲＮａｓｅ遺伝子を、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位に挿入し、ｌａ
ｃＺ遺伝子ないしＲＮａｓｅＡ遺伝子の５’に位置するヘキサペプチドの間にイ
ンフレーム融合を創製した。ＲＮａｓｅＡ遺伝子およびヘキサペプチドの発現は
、ｌａｃＺプロモーターにより制御された。次いで、ＬａｃＺ−ＲＮａｓｅＡ構
築物を、ＨａｅＩＩ消化により切断し、平滑末端とし、ＳｔｙＩで前に消化した
ｐＮ１（図１）に挿入し、平滑末端とした。得られた構築物はｐＮ１ＲＮａｓｅＡと呼ぶ。

【００６０】２．大腸菌へのｐＮ１ＲＮａｓｅの導入得られた構築物（ｐＮ１ＲＮａｓｅＡと呼ぶ）は、染色体ＤＮＡ相同性を含む
大腸菌ｄｉｆ座位により両側上でフランキングされたＲＮａｓｅ発現カセットか
らなる。ｄｉｆ座位は、ＸｅｒＣおよびＸｅｒＤリコンビナーゼの認識部位を含
む、２８塩基対領域である（ＨａｙｅｓおよびＳｈｅｒｒａｔｔ、Ｊ．Ｍｏｌ．
Ｂｉｏｌ．２６６：５２５−５３７、１９９７、Ｋｕｅｍｐｅｌら、ＴｈｅＮ
ｅｗＢｉｏｌｏｇｉｓｔ３：７９９−８１１、１９９１）。

【００６１】得られたｐＮ１ＲＮａｓｅＡ構築物を使用して、ＲＮａｓｅＡ遺伝子カセット
を、大腸菌株ＪＣ７６２３に、次いで、ＤＨ１に以下の方法により運搬した。

【００６２】ｐＮ１ＲＮａｓｅＡは、ＳａｌＩ（または別の適切な制限酵素）を用いて鎖状
化するか、またはＳａｌＩを用いて部分的消化反応をかけた。得られた断片（切
断されたが、無傷のＲＮａｓｅ発現カセットを含む）を使用して、カルシウムコ
ンピテントＪＣ７６２３細胞（ｒｅｃＢ２１、ｓｂｃＣ２０１、ｒｅｃＣ２２、
ｓｂｃＢ１５；ＨｏｒｉｉおよびＣｌａｒｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８０：３
２７−３４４、１９７３、ＬｌｏｙｄおよびＢｕｃｋｍａｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．１６４：８３６−８４４、１９８５）を、Ｗｉｎａｎｓら、Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．１６１：１２９１−１２２１、１９８５およびＪａｓｉｎおよび
Ｓｃｈｉｍｍｅｌ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９：７８３−７８６、１９８
４に記載の線形形質転換により形質転換した。

【００６３】その後、Ｐ１ファージ形質導入を使用してこの染色体構築物を、大腸菌ＤＨ１
のｄｉｆ座位（Ｈａｎａｈａｎ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：５５７−５８０、
１９８３、およびＢａｃｈｍａｎｎ、Ｅｓｃｈｅｒｉｓｈｉａｃｏｌｉａｎ
ｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｃｅｌｌｕｌａｒａ
ｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，Ｆ．Ｃ．ら
編、ＡＳＭ、ｐ．１１９０−１２１９、１９８７に記載の、Ｆ−、ｓｕｐＥ４４
、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−、ｈｓｄｒ１７、ｒｅｌＡ
１）、または図２に詳述した別の適切なＤＮＡベクター宿主株に移動した。ＲＮ
ａｓｅ遺伝子の宿主細胞染色体への組込みを容易にするために、標的宿主株を、
不安定なｒｅｃＡ含有プラスミドｐＰＥ１３（Ｈｉｃｋｓｏｎら、Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａｃｏｌｉ、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ、１８４：６８−７２、１
９８１）で形質転換することにより、最初に一時的にＲｅｃＡ＋とした。宿主株
のｐＰＥ１３を用いた形質転換は、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｗｉｌｅｙ編、第３版
、１９９３に記載のコンピテント細胞を調製するリン酸カルシウム法を使用して
実施した。

【００６４】３．ｐＮ１ＲＮａｓｅＩのＰＣＲ増幅ＲＮａｓｅＩ遺伝子は、プライマー、５’ＧＧＴＣＣＴＧＧＧＧＴＧＡＴＴＡＴＴＴＡＣＧＧＣＴＧＴＧＧＣ−３’、
および５’−ＧＴＴＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＡＣＴＧＴＴＧ−３’
を使用したＰＣＲにより、大腸菌株ＤＨ１から増幅し、ＴＡクローニングベクタ
ーｐＣＲ３．１（インビトロゲン）にクローニングして、ｐＣＲ３．１ＲＮａｓ
ｅＩを作成した。

【００６５】次いで、ＲＮａｓｅＩ遺伝子を、プライマー、５’−ＴＣＣＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＡＴＴＣＴＧＧＧＧ−３’ および５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＡＣＴＧＴＴＧ−３’
を使用してＰＣＲによりｐＣＲ３．１ＲＮａｓｅＩから（Ａｕｓｕｂｅｌら、現
在のプロトコル、上記に従って）増幅し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位にクロー
ニングして、ＲＮａｓｅＩ遺伝子を、ｌａｃＺ遺伝子の残りの配列にインフレー
ム融合した。

【００６６】得られたプラスミドは、ｌａｃＺプロモーターの制御下のＲＮａｓｅＩ遺伝子
を含み、ここで、ＲＮａｓｅＩ遺伝子の発現は、０．５ｍＭＩＰＴＧの存在下
で増加した。次いで、ＬａｃＺ−ＲＮａｓｅＩ構築物を、ＨａｅＩＩ消化により
切断し、平滑末端とし、ＳｔｙＩで消化したｐＮ１に挿入し、平滑末端とした。
得られたｐＮ１ＲＮａｓｅＩ構築物を上記のように使用して、ＲＮａｓｅＩ遺伝
子カセットを大腸菌株ＪＣ７６２３、次いでＤＨ１に上記のように運んだ。

【００６７】他の細胞型の染色体へのＲＮａｓｅ遺伝子の組込み１．他の細胞型における細胞成分の産生１．１．ネズミチフス菌ＲＮａｓｅ遺伝子は、Ｂａｃｈｍａｎｎら、１９７７、大腸菌およびネズミチ
フス菌、細胞および分子生物学、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら編、ＡＳＭ、またはＮａ
ｋａｙａｍａら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：６９３−６９７、１９８
８に記載のように、ネズミチフス菌の染色体に挿入し得る。

【００６８】２．他の細胞型における組換えタンパク質の産生２．１．バシラス属ＲＮａｓｅ遺伝子は、Ｓｏｌｍａら、Ｊ．Ｂａｃｔ、１７３：６８８９−６８
９５に記載のように、バシラス属の染色体に挿入し得る。

【００６９】２．２．ストレプトミセス属ＲＮａｓｅ遺伝子は、Ｋ．Ｇ．Ｈａｒｄｙにより編集されたプラスミド実践的
なアプローチ（第２版）の第６章に記載のように、またはＭｏｔａｍｅｄｉら、
Ｇｅｎｅ、１６０：２５−３１、１９９５に記載のようにストレプトミセス属の
染色体に挿入し得る。

【００７０】ストレプトミセスの遺伝子の異種発現の組込み発現ベクターが開発された。該
ベクターは、強力な構成プロモーター、Ｐ_E、合成リボソーム結合部位、ＡＴＧ
開始コドン、マルチクローニングサイト、転写終結因子およびヒグロマイシン耐
性をコードする遺伝子（Ｈｙ^R）からなる。該ベクターはまた、大腸菌中での増
殖のためのＣｏｌＥ１レプリコン、並びに小円付着部位でのストレプトミセスゲ
ノムへのベクターの挿入を指示する広い宿主範囲のストレプトミセス組込みエレ
メントである小円を含む。Ｈｙ^R形質転換体は、薬物選択がなければ安定である
。接合性誘導体は、ＩｎｃＰプラスミドＲＫ２の伝達の起源である、ｏｒｉＴを
これらのベクターに組込むことにより作成でき、適切な大腸菌ドナーからのスト
レプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ）（
ＳＩ）への接合性伝達が実施できる。遺伝子破損並びに補完に有用な可能性のあ
るこれらのベクターの誘導体も記載した。Ｓｌにおける作成された小円を基にし
たベクターの複製形は、目立った不安定性問題など全くなく、組込まれたベクタ
ーのコピーと共に存在できることが実証された。これらのベクターの有用性は、
Ｓｌの免疫抑制薬ＦＫ５０６の３１位のメチル化に関与している、３１−Ｏ−メ
チルトランスフェラーゼをコードしている遺伝子の発現により実証された。

【００７１】２．３．シュードモナス属ＲＮａｓｅ遺伝子は、酵素学の方法におけるシュードモナス・アエルギノーザ
の遺伝子置換、２３５：４６６−４７４、１９９４、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉ
ｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６：１１９５−１２０４、１９９２に記載のように、ま
たはＳｃｈｗｅｉｚｅｒおよびＨｏａｎｇ、Ｇｅｎｅ、１５８：１５−２２、１
９９５に記載のように、シュードモナス属の染色体に挿入し得る。

【００７２】新規なｐＵＣ１９を基にした遺伝子置換ベクターが開発された。このベクター
は、（ｉ）対抗選択ｓａｃＢマーカー、（ｉｉ）青−白スクリーニング用のｌａ
ｃＺα対立遺伝子、（ｉｉｉ）接合媒介プラスミド伝達用のｏｒｉＴおよび（ｉ
ｖ）ＳｍａＩの独特なクローニング部位、および稀な切断のメガヌクレアーゼの
Ｉ−ＳｃｅＩを取り込む。これらの稀な制限部位はまた、ヘルパープラスミドｐ
ＵＣ１９Ｓｃｅ上にも存在する。置換ベクターは、クローニングされたＤＮＡ断
片内の制限部位により近づけるように、僅かな制限部位を含むように操作され、
従って、その遺伝子操作は容易になる。系の有用性は、新規に作成されたｘｙｌ
Ｅ：：Ｇｍ^R融合カセットの、シュードモナス・アエルギノーザのｇｌｐＤ遺伝
子への染色体組込みにより実証された（ＳｃｈｗｅｉｚｅｒおよびＨｏａｎｇ、
上記）。

【００７３】ＲＮａｓｅおよび組換えＤＮＡまたはタンパク質を発現している細胞の調製ＲＮａｓｅ遺伝子並びに目的のＤＮＡまたはタンパク質を発現する細胞を、以
下の通り調製する。

【００７４】大腸菌宿主株ＤＨ１、ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、ＪＭ１０９、ＤＬ７９５、ＸＬ
１−Ｂｌｕｅ、およびＴＧ１を、組換えプラスミドＤＮＡの産生に使用でき、大
腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＪＭ１０９（ＤＥ３）およびＨＢ１０１は、組換え
タンパク質の産生に使用できる。

【００７５】１．ＲｅｃＡ含有プラスミドによる大腸菌の治癒ｐＮ１ＲＮａｓｅの大腸菌への導入と題した章に記載したように、ＤＮＡベク
ター宿主株の染色体へ異種ＲＮａｓｅ発現カセットを組込んだ後、宿主細胞を、
以下の方法の１つにより、ｒｅｃＡ含有プラスミドｐＰＥ１３で治癒する：プラ
スミドによりコードされる選択マーカー薬物の非存在下での連続継代培養（例え
ば、アンピシリンの非存在下での選択）、臭化エチジウムなどのＤＮＡ挿入剤で
の滴定、または１０％ＳＤＳ中での増殖（Ｔｏｌｍａｓｋｙら、ウイルス性プラ
スミド、プラスミド：実践的なアプローチ、Ｋ．Ｇ．Ｈａｒｄｙ編、ＩＲＬプレ
スオックスフォード、英国、１９９３）。プラスミドを含まない分離個体を、レ
プリカプレーティング（プラスおよびマイナス選択）により選択し、「治癒」は
、迅速な組換えプラスミドＤＮＡのスクリーニング手順により確認する（Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．７：１５１
３−１５２３、１９７９）。

【００７６】２．組換えプラスミドを用いた大腸菌の形質転換一旦治癒されると、宿主細胞は、ＤＮＡ形質転換にコンピテントになり、組換
えプラスミドで形質転換し（Ｓｈｅｅｎ、ｐ．１．８．５．、Ａｕｓｕｂｅｌ、
現在のプロトコル、上記）、適切な条件下で選択する。

【００７７】３．組変えＤＮＡまたはタンパク質の精製組換えプラスミドＤＮＡ組換えプラスミドＤＮＡの産生のために、形質転換したクローンを、プラスミ
ドＤＮＡの増殖に直接使用する。プラスミドＤＮＡは、当分野で公知の手順に従
って調製する。例えば、ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ、上記、Ｔｏｌｍａｓ
ｋｙら、上記およびＡｕｓｕｂｅｌ、現在のプロトコル、上記参照。

【００７８】プラスミドＤＮＡは、外因ＲＮａｓｅを加える段階を省略する以外は、ＷＯ９
７／２９１９０に記載の通りに調製できる。別法として、プラスミドＤＮＡは、
Ｈｏｒｎら（ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、６：５６５−５７３、１
９９５）の方法に従って調製できる。

【００７９】細菌培養物の産生選択用に適切な濃度の抗生物質を含む（例えば、ｋａｎ選択プラスミドには５
０μｇ／ｍｌのカナマイシン）完全ＴＢ培地における発酵は、１０リットルのブ
ラウン・バイオスタットＥＤ発酵槽で実施する。発酵条件は、以下の通りに維持
する：温度は３０℃に、撹拌は６００ｒｐｍに、空気流は１０リットル／分、お
よびｐＨは７．０に制御する。細菌は、後期ｌｏｇ期（接種の１０−１１時間後
）で、約３０の最終ＯＤ₆₀₀で、ジョウアン遠心機中、３，０００×ｇで３０分
間で収集し、−２０℃で貯蔵する。０．７５ｍｌのアリコートを、収集時に取り
出し、ミニ調製分析用に処理する（プロメガウィザード、マジソン、ウィスコン
シン）。この方法に従って、平均的発酵により、４ｍｇのプラスミドＤＮＡ／ｌ
が得られる（Ｈｏｒｎら、上記）。

【００８０】溶解およびプラスミド回収新鮮または凍結細菌を、標準的なアルカリ法の修飾形を使用して溶解する。収
率は、新鮮および凍結細胞ペーストで等しい。約１８０ｇの細菌を、前以て４−
１０℃に凍らせた、１．４リットルの６１ｍＭグルコース、１０ｍＭトリス、５
０ｎＭＥＤＴＡｐＨ８．０緩衝液に再度懸濁する。溶解は、前以て４〜１０
℃に凍らせた、２．８リットルの０．２ＮのＮａＯＨ、１％ＳＤＳ緩衝液を添加
し、続いて氷上で１０分間インキュベートした後に起こる。細胞破片は、予め４
〜１０℃に凍らせた２．１リットルの３Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．０）を添加し
、続いて氷上で１０分間インキュベートした後に沈殿する。溶解液中の細胞破片
は、ミラクロス（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、サンディエゴ、カリフォルニア）を通
した濾過により除去する。一旦細胞破片が除去されると、溶解液を、各通過につ
いて最少で１６層のミラクロスを通して２回注ぐ。プラスミドＤＮＡは、０．６
容量の−２０℃の２−プロパノールを添加し、続いて、１〜２時間室温でインキ
ュベートすることにより、透明な溶解液から沈殿する。濃縮プラスミド沈殿物の
上の約４．６リットルの透明な液体層をデカントする。容器の底の濃縮プラスミ
ドＤＮＡ沈殿物を、２５０ｍｌの遠心ボトルに移し、１０，０００×ｇで３０分
間ＧＳＡローターおよびソーバルＲＣ５Ｂ遠心機で遠心する。遠心分離の上清を
廃棄し、ペレットを流し、約２００ｍｌの１０ｍＭトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ（
ｐＨ８．０）（ＴＥ緩衝液）中に再度懸濁する。固体酢酸アンモニウムを、撹拌
しながら、プラスミドＤＮＡ溶液に溶解し、最終濃度を２．５Ｍとする。次いで
、プラスミドＤＮＡを含む酢酸アンモニウム溶液を、氷上で１５分間インキュベ
ートする。得られた沈殿物を、上記のように１０，０００×ｇで２０分間遠心す
ることにより除去した。上清を０．８μｍのニトロセルロース使い捨て膜フィル
ターボトルユニット（Ｎａｌｇｅ社、ロチェスター、ニューヨーク）を通して濾
過し、十分な１．６ＭＮａＣｌ中３０％ＰＥＧ−８０００を加えて、１０％Ｐ
ＥＧ−８０００の最終濃度を達成する（ＬｉｓおよびＳｃｈｌｅｉｆ、１９７５
；Ｌｉｓ、１９８０）。プラスミドＤＮＡを、４℃で８〜２４時間この溶液から
沈殿させる。プラスミドＤＮＡを、上記のように１０，０００×ｇで３０分間遠
心することにより集める。プラスミドを含むペレットを、１０ｍｌのカラム緩衝
液（１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８．０）
に再度懸濁する。次いで、プラスミドを濾過し、下記のようにカラムに直接適用
する。

【００８１】ファルマシアセファクリルＳ−１０００スーパーファインゲル濾過クロマトグラ
フィー２つのファルマシアＸＫ２６／１９９カラムを、この製造業者の指示に従って
、ファルマシアＦＰＬＣ系を使用して、加圧充填し、最終床高さを各約８５ｃｍ
とし、約９００ｍｌの総カラム容積が得られる。流す緩衝液は、１０ｍＭのトリ
ス、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．０）である。流速は、
０．７５ｍｌ／分である。上記のＰＥＧ−８０００沈殿物由来の部分精製プラス
ミドＤＮＡを、０．１〜０．２２μｍ滅菌セルロースアセテートアクロディスク
シリンジフィルター（ゲルマン、アナーバー、ミシガン）を通過させ、カラムに
のせる。カラム操作および画分捕集は、ファルマシアＦＰＬＣと共に自動化する
。５ｍｌ画分を、１５ｍｌの使い捨てコニカルチューブに集める。クロマトグラ
フィー後、カラムおよびＦＰＬＣは、０．２ＭのＮａＯＨの２カラム容量で衛生
化する。画分は、０．８％アガロースゲル電気泳動で分析し、主にスーパーコイ
ルプラスミドＤＮＡを含む画分を、滅菌使い捨て遠心ボトルにプールし、プール
を２容量の冷エタノールで沈殿させる。

【００８２】滅菌大量プラスミドＤＮＡの産生エタノール沈殿カラム精製プラスミドＤＮＡは、１０，０００×ｇで３０分間
遠心分離することにより集める。プラスミドペレットを出し、層流フード中無菌
条件下で、空気乾燥する。乾燥したペレットは、乳酸加リンガー溶液（バクスタ
ー、ディアフィールド、イリノイ）に再度懸濁し、目的の投与量に適切な濃度に
希釈する。得られた溶液を、発熱物質非含有０．２μｍアクロディスクフィルタ
ー（ゲルマン、アナーバー、ミシガン）を通した滅菌濾過にかける。滅菌大量プ
ラスミドＤＮＡを分取し、−７０℃で凍結貯蔵する（Ｈｏｒｎら、上記）。

【００８３】組換えタンパク質組換えタンパク質の産生のために、形質転換したプラスミドは、組換え（通常
異種）タンパク質の産生（過剰発現）用の発現カセットを含む。より好ましくな
いタンパク質産生法は、ＲＮａｓｅおよび組換えタンパク質を同時発現している
単一のプラスミドで非修飾宿主株を形質転換することを含む。

【００８４】ＲＮＡは、以下のようにタンパク質調製物から除去され得る。核酸に強力に結
合し、沈殿物を形成するポリカチオンであるポリエチレンイミンを、４℃で、０
．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）中１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む透明な細
胞溶解液に加えることができる。沈殿物は、遠心により除去する（Ｂｒｅｗｅｒ
，Ｓ．Ｊ．およびＳａｓｓｅｎｆｅｌｄ，Ｈ．Ｍ．、精製のためのタンパク質工
学、タンパク質精製適用：実践的なアプローチ、Ｅ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ａ
ｎｇａｌ編、ＩＲＬプレスオックスフォード、英国、１９９０）。透明化溶解液
および透明な溶解液なる語は、本明細書を通じて同義語として使用され、透明お
よび透明化溶解液（ＣＬ）と呼ぶ。

【００８５】ＲＮＡは、Ｈｏｒｎら（米国特許第５，５７６，１９６号）により記載のよう
に、珪藻土を使用して、タンパク質などの細胞成分から除去され得る。

【００８６】タンパク質は、宿主細胞調製物から、目的のタンパク質に特異的なタンパク質
精製法に従っておよび当分野で公知のように精製する。タンパク質精製法は、タ
ンパク質精製：原理と実践、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ編、Ｃ．Ｒ．Ｃａｎｔｏｒ、Ｓｐ
ｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９８５に記載されている。一般に、かかるタン
パク質精製手順は、タンパク質発現ベクターを含む宿主細胞を培養し、タンパク
質発現を誘導し、目的のタンパク質を抽出および精製する段階を含む。例えば、
金属キレートクロマトグラフィーを使用して、ヒスチジン残基で標識したインフ
ルエンザ核タンパク質を精製できる（実施例Ｖに記載）。

【００８７】大腸菌以外の宿主細胞は、ストレプトミセスのＰＥＧ形質転換：Ｗｏｈｌｌｅ
ｂｅｎ＆Ｍｏｔｈプラスミド；実践的なアプローチの第６章（上記）に記載の、
ＰＥＧ形質転換法により、ＲＮａｓｅ遺伝子および目的の遺伝子を用いて形質転
換できる。

【００８８】大腸菌以外の宿主細胞はまた、グラム陽性細菌の電気穿孔形質転換、Ａｌｏｎ
ｓｏ＆Ｅｓｐｉｎｏｓａ、プラスミド；実践的なアプローチの第２章（上記）に
記載の電気穿孔形質転換法により、ＲＮａｓｅ遺伝子および目的の遺伝子を用い
て形質転換できる。

【００８９】調節されたＲＮａｓｅ遺伝子発現宿主細胞に対するＲＮａｓｅの毒性作用を減少させるために、ＲＮａｓｅ遺伝
子は、誘導プロモーターの制御下で発現できる。

【００９０】大腸菌中のＲＮａｓｅ活性の調節に使用された誘導プロモーターは、ｔｒｐ、
Ｔ７、Ｐｔａｃ並びにλファージのＰ_RおよびＰ_Lプロモーターを含む。

【００９１】細胞質でＲＮａｓｅ発現を誘導する方法ＲＮａｓｅ遺伝子の発現は、非誘導増殖期間中のＲＮａｓｅの毒性作用を防ぐ
ために、非誘導条件下でのＲＮａｓｅ遺伝子の最小限の発現のみを可能とする誘
導プロモーターにより調節され得る。

【００９２】様々な誘導プロモーター系を使用して、特許請求された本発明の方法に従って
ＲＮａｓｅを調節できる。多くのプロモーター（上記）を、ＲＮａｓｅ遺伝子の
発現が増加または減少するように操作できる。

【００９３】細胞質においてＲＮａｓｅを誘導的に発現するために、ＲＮａｓｅ発現は、細
胞内ＲＮＡ分解を生じさせるために、目的の細胞成分を産生している細胞を収集
する１〜３時間前に誘導される。

【００９４】誘導期間並びにＲＮａｓｅが発現される期間は、産物の質または細胞完全性に
悪影響を及ぼすことなく、最大限のＲＮＡ分解が生じるように最適化する。これ
は、ＲＮａｓｅを発現している細胞を５分間から２時間、温度による誘導が使用
される場合、４℃から３７℃で、または４２℃で、ｐＨ５〜８で、またはＲＮａ
ｓｅＡの場合、ｐＨ５〜１０でインキュベートすることによりなされる。例えば
、産生される細胞成分が組換えプラスミドである場合、条件を修飾して、細胞内
ＲＮａｓｅの過剰発現の結果しての細胞の溶解を回避する。

【００９５】ＲＮＡ分解の完了時に（下記の通り決定する）、細胞を溶解し、細胞成分を精
製する（下記）。

【００９６】誘導プロモーター制御下のＲＮａｓｅ遺伝子ＲＮａｓｅの毒性作用は、誘導プロモーターの制御下でＲＮａｓｅ遺伝子を発
現することにより減少した。ＲＮａｓｅ遺伝子活性の調節に使用された誘導プロ
モーターは、ｔｒｐ、Ｔ７、ｔｒｃ、ｌａｃ、Ｐ_tac、並びに大腸菌のλファー
ジのＰ_RおよびＰ_Lプロモーターを含む（Ｆｕｊｉｍｕｒａら、上記、Ｓｃｈｅｉ
ｎら、上記、Ｌａｉｔｙら、上記、Ｑｕａａｓら、上記、Ｒｉｂｏら、上記、Ｄ
ｅｌＣａｒｄａｙｒｅら、上記、Ｏｋｏｒｏｋｏｖら、上記、ＭｃＧｅｅｈａｎ
およびＢｒｅｎｎｅｒら、上記、Ｔａｒｒａｇｏｎａ−Ｆｉｏｌら、上記）。Ｒ
Ｎａｓｅ遺伝子の発現を調節する誘導プロモーターを使用することにより、ＲＮ
ａｓｅタンパク質のレベルを、非誘導条件下で低レベルに維持できる。

【００９７】１．Ｔｒｐプロモーターｔｒｐプロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を含むベクターは、Ｆｕｊｉ
ｍｕｒａら、上記およびＳｃｈｅｉｎら、上記の方法に従って作成できる。簡潔
には、ｔｒｐプロモーターおよびｈＧＨ（ヒト成長ホルモン）遺伝子を含むｐＧ
Ｈ−Ｌ９ベクターを、ＣｌａＩおよびＳａｌＩで消化する。ｔｒｐプロモーター
を含む線形ベクターを、電気泳動後に１％アガロースゲルから単離する。ＲＮａ
ｓｅ遺伝子は、ＣｌａＩおよびＳａｌＩでの消化によりベクターから切出すか、
または５’末端にＣｌａＩまたはＳａｌＩ部位を含む５’および３’ＲＮａｓｅ
特異的プライマーをそれぞれ使用してＰＣＲにより増幅する。ＲＮａｓｅ遺伝子
を含むＤＮＡ断片を、電気泳動後に、５％ポリアクリルアミドゲルから単離する
。ｔｒｐプロモーター含有ベクターおよびＲＮａｓｅ遺伝子を混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼと共にインキュベートし、所望のプラスミドを、標準的な手順により
大腸菌ＨＢ１０１形質転換体から得る（Ｆｕｊｉｍｕｒａら、上記）。

【００９８】２．Ｔ７プロモーターＲＮａｓｅ遺伝子は、Ｔ７プロモーター（φ１０由来）の下流にクローニング
できる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現は、大腸菌ＢＬ２１由来のｌａｃＵＶ５
プロモーター（ＮｅｕｂａｕｅｒおよびＨｏｆｍａｎｎ、上記）、または、λＰ
Ｌプロモーターなどの誘導プロモーターによりｃＩ８５７温度感受性リプレッサ
ーと協同して制御される（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、上記）。

【００９９】ｌａｃＵＶ５系は、Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼのｌａｃＵＶ５制御発現に基づ
く。ＲＮａｓｅ遺伝子は、Ｔ７特異的ＲＮＡポリメラーゼによってのみ転写され
る、Ｔ７ファージの強力なφ１０プロモーターの後でクローニングできる（Ｎｅ
ｕｂａｕｅｒおよびＨｏｆｍａｎｎ、上記）。この系を使用して、Ｎｅｕｂａｕ
ｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：７３９
−７４４、１９９２の以下の方法に従って、Ｔ７プロモーターによりＲＮａｓｅ
遺伝子の発現を調節できる。

【０１００】染色体ＤＮＡにλ誘導体ＤＥ３を有する大腸菌ＢＬ２１（Ｆ−ｈｓｄＳｇａ
ｌｏｍｐＴｒ_B− ｍ_B−）上に、Ｐ_lac制御下のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺
伝子およびプラスミドｐｌｙｓＳがクローニングされた。ＲＮａｓｅ遺伝子を含
むＢａｍＨＩ−Ａｌｕ１断片を、Ｔ７ファージのφ１０プロモーター後の、Ｂａ
ｍＨＩ−ＡｌｕＩ消化プラスミドｐＥＴ３にクローニングできる。

【０１０１】このプロモーターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの認識部位のみを有する。それ
故、ＲＮａｓｅ遺伝子の発現は、拘束条件下で非常に低い。しかし、ＩＰＴＧ（
シグマ、セントルイス、ミズーリ、米国）によるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ合成の
誘導後、ＲＮａｓｅ遺伝子は非常に強力に発現される（Ｎｅｕｂａｕｅｒら、上
記）。

【０１０２】ＲＮａｓｅ遺伝子は、ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、上記に記載の
方法に従って、ｃＩ８５７温度感受性リプレッサーと協同してλＰＬプロモータ
ーにより調節され得る。

【０１０３】ＲＮａｓｅ遺伝子の発現は、クローン化Ｔ７遺伝子ＩおよびＴ７ＲＮＡポリメ
ラーゼプロモーターを利用する系で調節できる。発現系は、２つの適合性プラス
ミド、ｐＧＰ１−２およびｐＴ７−１からなる。ｐＡＣＹＣ１７７の誘導体であ
るＰＧＰ１−２は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現を提供する。ＰＧＰ１−２は
、誘導λＰ_Lプロモーターの制御下のファージＴ７の遺伝子Ｉ、および熱感受性
λリプレッサー遺伝子のｃＩ８５７からなる。

【０１０４】ある遺伝子を発現するために、遺伝子を、第二プラスミドｐＴ７−１に挿入す
る。ＰＴ７−１は、４０ｂｐのＴ７断片から単離された、Ｔ７ＲＮＡポリメラー
ゼプロモーターのφ１０を含む。８つの異なる制限部位を含むポリリンカーは、
ＤＮＡ断片の挿入を容易にするようにプロモーターの隣に存在する。φ１０プロ
モーターからの転写により、クローニングされた遺伝子およびβ−ラクタマーゼ
遺伝子が発現される。これらの遺伝子の排他的発現が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
の熱誘導後に、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ転写を遮断するリファンピシンの添加
により達成される（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、上記）。

【０１０５】Ｔ７プロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を含むベクターはまた、Ｏｋｏ
ｒｏｋｏｖら、上記、Ｌａｉｔｙら、上記、ｄｅｌＣａｒｄａｙｒｅら、上記お
よびＲｉｂｏら、上記の方法に従って作成できる。

【０１０６】簡潔には、発現ベクターｐＥＴ２１ｄ（＋）は、染色体に挿入されたｌａｃＵ
Ｖ５プロモーターの制御下のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する、バクテリ
オファージＤＥ３溶原株ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌と組合せて、ＲＮａｓｅＡ遺
伝子の挿入に使用できる。ｐＵＣＢＦＲＡのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片は
、ＲＮａｓｅＡコード配列と共に、ｐＥＴ２１ｄ（＋）ベクターに再度クローニ
ングできる。オープンリーディングフレームを維持するために、ｐＴＺ１９ＲＪ
Ｌ１のマルチクローニングサイト由来の１９ｂｐのＮｃｏＩ−ＢａｍＨＩ断片を
、対応する独特な部位に挿入する。この方法は、プラスミドｐＥＴＦＲＡの作成
にＯｋｏｒｏｋｏｖらにより使用されている（Ｏｋｏｒｏｋｏｖら、上記）。こ
の方法はまた、Ｔ７プロモーターの制御下の他のＲＮａｓｅ遺伝子を含むベクタ
ーの産生に使用できる。

【０１０７】３．ｔａｃプロモーターｐｔａｃプロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を含むベクターを、Ｔａｒ
ｒａｇｏｎａ−Ｆｉｏｌら、上記の以下の方法に従って作成する。

【０１０８】ＲＮａｓｅ前駆体のコード配列の５’および３’末端に相補的なプライマーを
合成でき、ＰＣＲ増幅に使用できる。５’プライマー（プライマー１０）は、Ｒ
Ｎａｓｅ前駆体の前に短いＯＲＦ並びにＥｃｏＲＩ制限部位を、正しい切断を確
かにする４つの追加のｎｔと共に取り込む、追加の配列情報を含む。３’プライ
マー（プライマー１１）は、ＲＮａｓｅの終結コドン、ＥｃｏＲＩ部位、および
正しい切断を確かにする追加の４ｎｔを含む。

【０１０９】これらのプライマーを使用してＰＣＲ増幅から得られた２シストロン断片は、
２セットのコード配列を含み：１つはヘキサペプチドであり、他方はＲＮａｓｅ
前駆体である。この断片の転写は、翻訳時にヘキサペプチドおよびプレＲＮａｓ
ｅを産生する２シストロンｍＲＮＡを産生する。

【０１１０】ＰＣＲ反応は、ｐＱＲ１３８を、全容量５０または１００μｌ中に、鋳型（１
００ｎｇ）／プライマー１０および１１（５０ｐｍｏｌ／各）／全４つのｄＮＴ
Ｐ（各０．２ｍＭ）／２０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．０／１５ｍＭ（ＮＨ₄
）₂ＳＯ₄／２ｍＭＭｇ₂Ｃｌ／０．０５％ＮＰ４０／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２
０として含む。反応成分は、迅速に混合し、次いで、１０，０００×ｇ（平均）
で２秒間室温で遠心分離する。等量のパラフィン油を反応中の蒸発を避けるため
に加える。鋳型ＤＮＡは、５分間インキュベート、９２℃で１．５分間により完
全に変性し、５５℃で１分間アニーリングし、７２℃で１．５分間伸長する。

【０１１１】プラスミドｐＱＲ１６３（図７参照）は、２つのリボソーム結合部位を含み、
１つは、ベクターのｔａｃプロモーターにより提供され、他方は、第二シストロ
ンの翻訳のために、第一シストロンのコード配列内に含まれる。ｐＱＲ１６３を
有する大腸菌細胞のＩＰＴＧ誘導時に産生されるｍＲＮＡは、２シストロン性で
あり、ｔａｃプロモーターから開始する。第一シストロンは、６アミノ酸ペプチ
ド（Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ）をコードする。第一シ
ストロンの停止コドンおよび第二シストロンの開始コドンは、リボソームがｍＲ
ＮＡの翻訳を継続し、プレＲＮａｓｅを産生するように重複する（Ｔａｒｒａｇ
ｏｎａ−Ｆｉｏｌら、上記）。

【０１１２】Ｔａｒｒａｇｏｎａ−Ｆｉｏｌの方法に従って、内因性ＲＮａｓｅシグナル配
列は、ＲＮａｓｅ発現ベクターに存在する。しかし、他のシグナル配列は、下記
したように、ＲＮａｓｅ遺伝子上にクローニングできる。

【０１１３】内因性シグナル配列が存在する場合、ＲＮａｓｅの合成前駆体は、ペリプラズ
ムに転座する。Ｎ末端シークエンスを使用して、シグナル配列が正しく切断され
たことを示す。ペリプラズムの酸化環境により、ＲＮａｓｅの正しい折り畳みが
可能となり、完全に活性な酵素の回復により証明されるように天然酵素が形成さ
れる（Ｔａｒｒａｇｏｎａ−Ｆｉｏｌら、上記）。

【０１１４】４．λファージのＰ_RおよびＰ_Lプロモーター λファージのＰ_Rプロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を含むベクターを
、Ｏｋｏｒｏｋｏｖら、上記の以下の方法に従って作成する。

【０１１５】Ｐ_R発現カセットは、ｃＩリプレッサー調節下の大腸菌λファージのＰ_Rプロモ
ーターを含むベクターｐＣＱＶ２から単離できる。カセットは、ｃＩコードフレ
ームの下流のＥｃｏＲＩ制限部位およびＰ_Rプロモーターの下流のＢａｍＨＩ部
位により囲まれる。

【０１１６】ＲＮａｓｅ遺伝子は、ｐＣＱＶ２と適合性の適切な制限酵素を使用することに
よりベクターから単離できる。ＲＮａｓｅ遺伝子は、シグナル配列の非存在下で
、Ｐ_Rプロモーターの制御下でクローニングできる。ＲＮａｓｅ遺伝子はまた、
ＲＮａｓｅ遺伝子を含み、末端に適切な制限部位を有する、増幅断片を産生する
プライマーを使用してＰＣＲによりベクターから単離できる。

【０１１７】ＲＮａｓｅＡ遺伝子を含む発現カセット断片をクローニングするのに使用でき
るベクターは、ｐＵＣ１９である。ｐｈｏＡシグナルペプチド−ＲＮａｓｅＡ融
合フレームを含む、ｐＣＱＶ２からの断片ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩおよびｐＵＣ
ＢＦＲＡからのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩを、３次元連結反応で、ＥｃｏＲＩ
／ＨｉｎｄＩＩＩで制限したｐＵＣ１９と連合できる。この方法は、プラスミド
ｐＥＸＦＲＡの作成のためにＯｋｏｒｏｋｏｖら、上記により使用されている。

【０１１８】 λファージのＰ_Lプロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を含むベクターは
、ＭｃＧｅｅｈａｎおよびＢｒｅｅｎｅｒ、上記の以下の方法に従って作成する
。

【０１１９】ＲＮａｓｅの遺伝子は、ベクターｐＮ１にクローニングでき、プラスミドｐＡ
Ｌ１８１に、メチオニン開始コドンを含むリンカーと共に移すことができる。こ
のプラスミドにおいて、ＲＮａｓｅ遺伝子は、ｐＡＬ１８１のシャインダルガー
ノ配列直後に始まる。

【０１２０】５．Ｌａｃプロモーターｌａｃリプレッサーと協同してｌａｃオペレーター／プロモーターにより調節
される遺伝子を含むベクターは、ＲＮａｓｅのｐＮ１へのクローニングと題した
章に記載の通り、またはＮｅｕｂａｕｅｒおよびＨｏｆｍａｎｎ、上記に従って
、作成し得る。

【０１２１】ｌａｃオペレーター／プロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を含むベクタ
ーは、Ｑｕａｓｓら、上記の以下の方法に従って作成する。

【０１２２】ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ２は、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化する
。同酵素で消化したＲＮａｓｅ遺伝子は、ｐＩＮ−ＩＩＩ−ｏｍｐＡ２に挿入で
きる。全遺伝子がｌｐｐプロモーターおよびｌａｃプロモーター−オペレーター
の制御下にあるので、遺伝子発現は、ｌａｃリプレッサーにより調節され、すな
わち、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドの添加により誘導できる。

【０１２３】この方法は、Ｑｕａｓｓらにより使用され、ＲＮａｓｅＴ₁遺伝子がｏｍｐＡ
シグナルペプチド遺伝子にインフレーム融合されている、プラスミドｐＡ２Ｔ１
−１を産生する。しかし、またｌａｃプロモーターを使用して、様々なシグナル
配列（下記）にインフレーム融合したＲＮａｓｅ遺伝子の発現を調節できる。

【０１２４】６．Ｔｒｃプロモーターｔｒｃプロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を含むベクターは、Ｏｋｏｒ
ｏｋｏｖら、上記の方法に従って作成する。

【０１２５】強力な誘導ｔｒｃプロモーターを提供する発現ベクターは、ｐＫＫ２３３−２
である。ＰＫＫ２３３−２は、ｌａｃＺリボソーム結合部位およびＡＴＧ開始コ
ドンを特徴とし、これは、独特なＮｃｏＩ制限部位での切断により到達できる。
マルチクローニングサイトに、５ＳｒＲＮＡをコードしている遺伝子およびｒｒ
ｎＢ大腸菌の強力な転写シグナルＴ１およびＴ２が続く（Ｏｋｏｒｏｋｏｖら
、上記）。ＲＮａｓｅ遺伝子は、ｐＫＫ２３３−２のマルチクローニングサイト
と適合性の酵素での消化によりベクターから単離できる。別に、ＲＮａｓｅ遺伝
子は、ｐＫＫ２３３−２のマルチクローニングサイトと適合性の制限酵素部位を
有する断片の合成を指示するプライマーを使用してＰＣＲにより増幅できる。

【０１２６】誘導プロモーター系１．温度誘導プロモーターＰ_Lプロモーターは、ｃＩ８５７１と組合せて使用して、ＲＮａｓｅ遺伝子の
発現を調節することができる。

【０１２７】Ｐ_Lプロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を発現しているベクターは、誘
導プロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子と題した章に記載の通りに産生でき
る。

【０１２８】誘導ｃＩ８５７１リプレッサーは、温度感受性であり、３０℃で遺伝子発現を抑制
する。温度を４２℃に増加すると、リプレッサーは不活性化され、発現が起こる
（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、上記）。

【０１２９】誘導は、ＭｃＧｅｅｈａｎら、上記の以下の方法に従って実施できる。アンピ
シリン（１２５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地（５０ｍｌ）に、Ｐ_Lプロモーター
の制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を含むベクターで形質転換した大腸菌の増殖から形
成された新鮮なコロニーを接種し、次いで、一晩増殖して濃くする。この培養物
を使用して、各１リットルのＬＢ／ａｍｐ（１００ｍｇ／ｍｌ）培地を含む４つ
の５Ｌエーレンマイヤーフラスコに接種する。これらの培養物を、振盪機中で３
０℃で増殖して、Ａ₅₅₀値を１．２とする。フラスコを４２℃に加温した振盪機
に移し、７２℃に前以て加熱したＬＢ培地（４００ｍｌ）を、各フラスコに加え
、温度を各々迅速に４２℃にする。振盪を２５分間続け、細胞を遠心分離（４０
００×ｇで１０分間）により回収する。細菌ペーストを、１０×（ｖ／ｗ）変性
緩衝液（８Ｍ尿素、４０ｍＭサクロシン、２０ｍＭトリス、３０ｍＭメルカプト
エタノール、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．８）に再度懸濁する。懸濁液を、フレ
ンチプレス（４０００Ｉｂ／インチ²）を通過させ、不溶性物質を、１５０００
×ｇで１０分間遠心分離して除去する。透明化物質を、再折り畳み緩衝液（１０
０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、４ｍＭ酸化グルタチオン、４ｍＭ還元グル
タチオン、１ｍＭＥＤＴＡ、０．４ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド
（ＰＭＳＦ）、０．０２％ＮａＮ₃、ｐＨ７．６）を２回交換して透析（Ｍ_r＞３
５００カットオフ）する。透析物を、セファデックスＧ５０分粒カラムにのせ、
溶出緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭトリス、０．４ｍＭＰＭＳＦ、
０．０２％ＮａＮ₃）を使用して線形流速２．５〜３ｍｌｈ^-1ｃｍ^-2で溶出する
。ＲＮａｓｅを含む画分を、合成ＲＮＡ（ＵｐＡ）に対する触媒活性により同定
する。これらの画分をプールし、ＹＭ５フィルター（Ｍ_r＞５０００カットオフ
）を有するアミコンウルトラフィルター装置を使用して４倍濃縮する。この溶液
を、新規な緩衝液（１００ｍＭＮＨ₄ＯＡ_c、０．０２％ＮａＮ₃、ｐＨ６．１
）に透析し、次いで、アフィニティーレジン（４ｍｌ、ｐＵｐセファロース、フ
ァルマシア）のカラムに重量により適用する。これらの条件下の溶出液は、実質
的にＲＮａｓｅ活性を含まない。カラムを、１０〜２０容量の緩衝液で洗浄し、
ＲＮａｓｅは、新規な緩衝液（２００ｍＭＮＨ₄ＯＡ_c、３００ｍＭシチジル酸
、ｐＨ６．１）を使用して溶出する。小画分（１．５ｍｌ）を集める。ＲＮａｓ
ｅ活性を含む画分をプールし、緩衝液（１００ｍＭＮＨ₄ＯＡ_c ｐＨ６．１）
を２回交換して透析して、シチジル酸を除去する。溶液は、滅菌チューブに入れ
、４℃で貯蔵する（ＭｃＧｅｅｈａｎおよびＢｅｎｎｅｒ、上記）。

【０１３０】Ｐ_Rプロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を発現しているベクターは、誘
導プロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子と題した章に記載の通りに産生でき
る。

【０１３１】誘導誘導は、Ｏｋｏｒｏｋｏｖら、上記の以下の方法に従って実施できる。Ｐ_Rプ
ロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を含む発現ベクター、例えばｐＥＸＦＲ
Ａを有する大腸菌株の６時間培養物を、アンピシリン（１２５μｇ／ｍｌ）を補
充したＬＢ培地中で３０℃で２２０ｒｐｍで増殖させる。この培養物は、２４ｇ
／ｌの酵母抽出物、１２ｇ／ｌのトリプトン、１２．５４ｇ／ｌ、１２．５４ｇ
／ｌのＫ₂ＨＰＯ₄、ＫＨ₂ＰＯ₄、４ｍｌ／ｌのグリセロール、および１２５ｍｇ
／ｌのアンピシリンを含みｐＨ７．１に調整したリッチ培地の接種に使用する。

【０１３２】２８℃および２２０ｒｐｍでリッチ培地中ＯＤ₆₀₀〜０．６まで増殖した後、
培養物を熱ショックにより誘導する。以下の熱ショックプロトコルを使用できる
。培養物の温度は、前以て加温（８５℃）した半容量のリッチ培地を添加するこ
とにより４２℃に変化できる。次いで、培養物を４２℃、１２０ｒｐｍで３０分
間撹拌する。次いで、温度を３７℃に減少させ、振盪（２２０ｒｐｍ）をさらに
１０〜１２時間続ける。

【０１３３】別に、培養物の温度を、前以て加温（３７℃）したリッチ培地に直接接種する
ことにより３７℃に変化できる。次いで、培養物をさらに１６〜１８時間３７℃
で２２０ｒｐｍで増殖する。

【０１３４】２．インデューサー制御プロモーターｌａｃリプレッサーと組合わせたｌａｃオペレーター／プロモーターを使用し
て、ＲＮａｓｅ遺伝子の発現を調節できる。

【０１３５】ｌａｃオペレーター／プロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を発現してい
るベクターを、誘導プロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子と題した章に記載
の通り産生できる。

【０１３６】誘導発酵は、ｌａｃオペレーターが抑制される培地、例えば、ラクトースまたはイ
ソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を含まないＬＢ培地で実施
される。

【０１３７】発現は、最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧまたはラクトースを添加することによ
り誘導される（ＮｅｕｂａｕｅｒおよびＨｏｆｍａｎｎ、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏ
．Ｒｅｖｉｅｗｓ：１４、９９−１０２、１９９４、Ｑｕａｓｓら、上記、およ
びＤｏｎｏｖａｎら、Ｊ．ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１
６：１４５−１５４、１９９６）。ＩＰＴＧでの誘導は、下記の実施例３に記載
の通りに、およびＱｕａｓｓら、上記の方法に従って実施できる。

【０１３８】ｌａｃプロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子の転写を誘導するために、Ｉ
ＰＴＧを、６００ｎｍで０．５の吸光度まで増殖させた液体培養物に、最終濃度
０．１から０．５ｍＭまで加える。細胞を、一晩増殖させ、遠心分離（８５００
×ｇ、１５分間、４℃）により収集する。ＲＮａｓｅは、Ｋｏｓｈｌａｎｄおよ
びＢｏｔｓｔｅｉｎの修飾プロトコルに従って浸透圧ショックにより細胞から放
出される。１リットル培養物のペレットを、１５％スクロースを含む４０ｍｌ氷
冷トリス／ＨＣｌ／ＥＤＴＡ緩衝液（５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１
０ｍＭＥＤＴＡ）に再度懸濁し、３０分間氷上に維持する。遠心分離後、細胞
を、氷冷トリス／ＨＣｌ／ＥＤＴＡ緩衝液に再度懸濁し、さらに３０分間氷上で
インキュベートし、再度遠心分離する。２つの洗浄段階由来の上清を合わせ、ｐ
Ｈを１５％ＨＣｌを用いて４℃でｐＨを２．５に調整し、沈殿タンパク質を遠心
分離（１２０００×ｇ、２５分間、４℃）により分離する。上清のｐＨは、１０
ＭＮａＯＨで７．５に調整し、トリス／ＨＣｌＥＤＴＡ緩衝液で２００ｍｌ
に希釈し、トリス／ＨＣｌ／ＥＤＴＡ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファロー
スＣＬ−６Ｂカラム（１２ｍｌのカラム容量）に適用する。回収は、勾配溶出（
トリス／ＨＣｌ／ＥＤＴＡ緩衝液中、１００〜７００ｍＭＮａＣｌ）により達
成する。ＲＮａｓｅ活性を含む画分を合わせ、流す緩衝液として５０ｍＭ酢酸ア
ンモニウムを使用して、バイオ−ゲルＰ−３０カラム（１．５×５０ｃｍ）を通
過させる。

【０１３９】ｌａｃプロモーターの強度を操作して、ｌａｃプロモーターの上流のｔｒｐプ
ロモーターをクローニングすることにより発現を増加させ、ｔａｃプロモーター
を創製できる。

【０１４０】ｌａｃリプレッサーのそのオペレーターへの親和性は、ｌａｃプロモーターの
制御下の遺伝子の結合および続く発現を増加または減少させるように操作できる
（Ｍuｌｌｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５７：２１−２９、１９９６）
。

【０１４１】３．飢餓誘導プロモーター宿主細胞中で産生されるＲＮａｓｅの量を制御するために、ＲＮａｓｅ遺伝子
を、ｔｒｐリプレッサーと組合せてｔｒｐオペレーターの制御下に配置すること
ができる。

【０１４２】ｔｒｐリプレッサーと組合せたｔｒｐオペレーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝
子を発現しているベクターを、誘導プロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子と
題した章に記載の通りに産生できる。

【０１４３】誘導トリプトファンの存在下で増殖中、制御された遺伝子の発現は抑制され（Ｓｃ
ｈｅｉｎ＆Ｎｏｔｅｂｏｒｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、６：２９１−２９
４、１９８８）、トリプトファン飢餓時に遺伝子の発現が誘導される。ｔｒｐプ
ロモーターはまた、Ｆｕｊｉｍｕｒａら、上記の方法に従って、ＩＡＡ（３−イ
ンドールアクリル酸）の導入によっても誘導できる。

【０１４４】ｔｒｐプロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を含むプラスミド、例えばｐ
ＴＰＷ１を有する大腸菌を、３７℃で、アンピシリン（２０μｇ／ｍｌ）を含む
４リットルのＭ９−カサミノ酸培地中で増殖する。１．５時間インキュベートし
た後（６６０ｎｍでの培養物の光学密度、０．０５〜０．１）、３−インドール
アクリル酸（ＩＡＡ、４０μｇ／ｍｌ）を培地に加え、融合遺伝子の発現を誘導
する。細胞をさらに８時間増殖させ、遠心分離（３５００×ｇ、１０分間、４℃
）により収集し、等張食塩水中で洗浄する（Ｆｕｊｉｍｕｒａら、上記）。

【０１４５】以下の精製段階を使用して、細胞膜周辺腔に分泌されたＲＮａｓｅタンパク質
を精製できる。細胞膜周辺腔のタンパク質は、Ｃｏｒｎｅｌｉｓらのプロトコル
の修飾形により浸透圧ショック処理により放出される。食塩水洗浄細胞を、１ｍ
ＭＥＤＴＡおよび３０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む１リットルの
２５％スクロースに懸濁し、懸濁液を３７℃で３０分間振盪する。次いで、細胞
を、遠心分離（１４０００×ｇ、１時間、２０℃）により沈降させ、１リットル
の氷冷２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に再度懸濁し、０℃で３０分間振
盪する。懸濁液を遠心分離（１００００×ｇ、１５分間、４℃）し、得られた上
清をペリプラズム画分として使用する。細胞質画分を、ＳＤＳの存在下でリソソ
ームで破壊することにより沈降細胞から調製する。ＲＮａｓｅは、２段階のカラ
ムクロマトグラフィー：第一に、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中０．
１５ＭＮａＣｌで平衡化し、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中線形Ｎ
ａＣｌ勾配（０．１５〜０．４５Ｍ）で溶出する、Ｑ−セファロースカラムのア
ニオン交換クロマトグラフィー；次いで、酵素を２０ｍＭ重炭酸アンモニウムで
溶出したセファデックスＧ−５０カラムのゲルクロマトグラフィーによりペリプ
ラズム画分から精製する。各精製段階の酵素は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析す
る（Ｆｕｊｉｍｕｒａら、上記）。

【０１４６】４．バクテリオファージプロモーターＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、上記のプロモーター系よりも強
力なプロモーターを含む。

【０１４７】Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系の制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を発現
しているベクターは、誘導プロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子と題した章
で記載の通りに産生できる。

【０１４８】ＲＮａｓｅ遺伝子は、Ｔ７プロモーター（φ１０）の下流にクローニングする
。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの発現は、大腸菌ＢＬ２１に見られるようなｌａｃＵ
Ｖ５プロモーターなどの誘導プロモーターにより、または、ｃＩ８５７温度感受
性リプレッサーを有するλＰ_Lプロモーターにより制御される（Ｔａｂｏｒおよ
びＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、８２：１０７４−１０７８、１９８５）。

【０１４９】ＲＮａｓｅ遺伝子の発現は、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼの発現に
依存する。Ｔ７プロモーターからのＲＮａｓｅの発現が非誘導条件下で漏出して
いる場合、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼの転写終結因子を、ポリメラーゼの発現が
転写通読に依存するようにＴ７ＤＮＡポリメラーゼの所望のプロモーターに挿入
できる（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、上記）。

【０１５０】Ｔ７プロモーター制御下のＲＮａｓｅ遺伝子の発現は、Ｏｋｏｒｏｋｏｖら、
上記の以下の方法により得ることができる。

【０１５１】Ｔ７プロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を含む発現ベクター、例えばｐ
ＥＴＦＲＡを有する大腸菌株の６時間培養物を、３０℃、２２０ｒｐｍで、アン
ピシリン（１２５μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ培地中で増殖させる。この培養物
は、２４ｇ／ｌの酵母抽出物、１２ｇ／ｌのトリプトン、１２．５４ｇ／ｌ、１
２．５４ｇ／ｌのＫ₂ＨＰＯ₄、ＫＨ₂ＰＯ₄、４ｍｌ／ｌのグリセロール、および
１２５ｍｇ／ｌのアンピシリンを含みｐＨ７．１に調整したリッチ培地の接種に
使用する。２８℃および２２０ｒｐｍでリッチ培地中ＯＤ₆₀₀〜０．６の密度ま
で増殖した後、発現を、ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭとなるまで加え、さらに１
０時間インキュベートすることにより誘導する（Ｏｋｏｒｏｋｏｖら、上記）。

【０１５２】５．阻害剤誘導バシラスＲＮａｓｅ、ＢａＲＮａｓｅは、その特異的な細胞内阻害剤バースタ
ーの存在下で不活性である（Ｈａｒｔｌｅｙ、上記）。ｂａＲＮａｓｅを発現す
る、宿主細胞でのバースター遺伝子の存在は、両方の遺伝子が等しく発現される
場合には、ｂａＲＮａｓｅ活性の致死的作用を抑制する。抑制プロモーターの制
御下のバースター遺伝子の存在を使用して、発酵の終結時にｂａＲＮａｓｅ活性
を発現できる。

【０１５３】単独では致死的である、野生型ｂａＲＮａｓｅの遺伝子が、ｐＵＣ１９−ｐＣ
１９４シャトルベクター上のバースター遺伝子として同プラスミド上に会合する
場合、ｂａＲＮａｓｅは正しく処理され、枯草菌により分泌されるが、大腸菌中
では細胞に結合したままである。成熟ｂａＲＮａｓｅのＮ末端に大腸菌シグナル
ペプチダーゼ部位を有する、バースターおよびｐｈｏＡプロモーター−シグナル
配列構築物では、低リン酸による誘導後、真正ｂａＲＮａｓｅが、２０ｍｇ／ｌ
のレベルで大腸菌により分泌される。可変量のこのｂａＲＮａｓｅ、一般的に約
半分が、培養培地に出現し、残りは細胞膜周辺腔に残存する。しかし、酢酸を５
％まで添加すると、全てのｂａＲＮａｓｅが培地に放出され、これから、ホスホ
セルロースに直接吸収され得る。高塩中ホスホセルロースから溶出しているタン
パク質の９０％以上が、ｂａＲＮａｓｅである。次いで、実質的に純粋なｂａＲ
Ｎａｓｅが、ＳＰ−トリスアクリル（ファルマシア）などの強力なアニオン交換
体上での塩勾配クロマトグラフィーにより得られ得る（Ｈａｒｔｌｅｙ、上記）
。

【０１５４】２．細胞膜周辺腔または細胞性細胞質における誘導性ＲＮａｓｅ発現ペリプラズムまたは細胞上清に分泌されたＲＮａｓｅ遺伝子宿主細胞に対する過剰産生ＲＮａｓｅの毒性作用、並びに宿主細胞プロテアー
ゼによる外因性ＲＮａｓｅのタンパク質分解を防ぐために、ＲＮａｓｅ遺伝子を
、宿主細胞の細胞質に分泌されないタンパク質をコードするように修飾する。Ｒ
Ｎａｓｅは、酵素の、細胞質周辺腔または培養上清への分泌を支持するシグナル
ペプチドをもつ融合タンパク質として産生され得る。ＲＮａｓｅを細胞質外に指
示するために成功裡に使用されるシグナルペプチドは、内因性ＲＮａｓｅ分泌シ
グナル（Ｓｃｈｅｉｎら、上記、Ｔａｒｒａｇｏｎａ−Ｆｉｏｌら、上記、Ｒｕ
ｓｓｏら、上記）、大腸菌アルカリホスファターゼシグナルペプチド（ｐｈｏＡ
）（Ｆｕｊｉｍｕｒａら、上記、Ｏｋｏｒｏｋｏｖら、上記）、ｐｅｌＢ配列（
Ｒｉｂｏら、上記、ＤｅｌＣａｒｄａｙｒｅら、上記）、および大腸菌外膜のｏ
ｍｐＡタンパク質のシグナルペプチド（Ｑｕａａｓら、上記）を含む。ＲＮａｓ
ｅ遺伝子もまた融合タンパク質として発現され得る。例えば、ＲＮａｓｅＡ遺伝
子１０融合タンパク質は、封入体として発現される（Ｌａｉｔｙら、上記、Ｎａ
ｍｂｉｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６３：６７−７１、１９８７）
。

【０１５５】宿主細胞においてバクテリオシン放出タンパク質（ＢＲＰ）をコードしている
遺伝子の存在により、過剰発現ＲＮａｓｅが、ペリプラズムよりも培養上清に分
泌されることが可能となる。ＢＲＰ遺伝子が中程度に誘導されている場合、宿主
細胞の溶解は回避され、連続培養における大量タンパク質産生が可能となる（ｖ
ａｎｄｅｒＷａｌら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１７：３８
１−３９９、１９９５）。この系は、ＲＮａｓｅの分泌に使用され得る。

【０１５６】ＲＮａｓｅ酵素の、宿主細胞質外の位置への搬出を指示することにより、ＲＮ
ａｓｅ毒性およびタンパク質分解によるＲＮａｓｅ分解の問題は最小限となる。

【０１５７】ＲＮａｓｅ発現の誘導は、細胞質での誘導性ＲＮａｓｅ発現と題した章で定義
されたパラメーターに従って調節される。しかし、ＲＮａｓｅは、細胞質周辺腔
に分泌され、細胞が溶解するまで細胞内産物とは接触しない。

【０１５８】新規に作成されたＲＮａｓｅＡを細胞質外に標的するために、タンパク質が培
養上清または細胞質周辺腔に分泌されるように、リーダー配列をＲＮａｓｅ遺伝
子上にクローニングできる。

【０１５９】１．内因性ＲＮａｓｅ分泌シグナル大腸菌ＲＮａｓｅＩ遺伝子は、遺伝子産物をペリプラズムに指示する内因性リ
ーダー配列を有し、高コピー数プラスミドで過剰発現された場合に細胞増殖に影
響を及ぼさない（ＭｅａｄｏｒおよびＫｅｎｎｅｌｌ、Ｇｅｎｅ、９５：１−７
、１９９０）。

【０１６０】内因性ＲＮａｓｅリーダー配列は、ペリプラズムまたは細胞上清へ分泌される
ＲＮａｓｅ遺伝子と題した章で記載のようにＲＮａｓｅ遺伝子上にクローニング
できる。

【０１６１】多くのシグナルペプチドが、細胞周辺腔または細胞上清へのＲＮａｓｅタンパ
ク質の分泌を指示するのに成功裡に使用されてきた。これらは、内因性ＲＮａｓ
ｅ分泌シグナル、大腸菌アルカリホスファターゼシグナルペプチド（ｐｈｏＡ）
およびｐｅｌＢ配列を含む（Ｆｕｊｉｍｕｒａら、上記、Ｓｃｈｅｉｎら、上記
、ＤｅｌＣａｒｄａｙｒｅら、上記、Ｏｋｏｒｏｋｏｖら、上記、Ｔａｒｒａｇ
ｏｎａ−Ｆｉｏｌら、上記）。

【０１６２】２．ＰｈｏＡｔａｃプロモーターの制御下のｂａＲＮａｓｅ遺伝子上へのｐｈｏＡリーダー
配列の誘導により、１ｇ／ｌまでのＢａＲＮａｓｅの収率が得られた（Ｈａｒｔ
ｌｅｙ、上記）。この配列は、効率的なプロセシングおよびＲＮａｓｅの、大腸
菌宿主の培養上清および細胞質周辺腔への分泌を可能とする。

【０１６３】ＰｈｏＡ配列は、Ｆｕｊｉｍｕｒａら、上記の方法に従って、ＲＮａｓｅ遺伝
子上にクローニングできる。

【０１６４】ｔｒｐプロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子を含むベクターを、記載した
ようにＦｕｊｉｍｕｒａらの方法に従って作成する。ｔｒｐプロモーター含有ベ
クター、ＲＮａｓｅ遺伝子、およびＡＰアーゼシグナルペプチドの合成遺伝子を
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと共にインキュベートし、所望のプラスミドが標準
的な手順により大腸菌ＨＢ１０１形質転換体から得られる（Ｆｕｊｉｍｕｒａら
、上記）。Ｆｕｊｉｍｕｒａらは、この方法を使用して、ｔｒｐプロモーターの
制御下のＲＮａｓｅＴ１遺伝子を含むベクターである、ｐＴＰＷ１を作成した。
この方法を修飾して、ＡＰアーゼシグナルペプチドの合成遺伝子が、構成プロモ
ーターまたは上記の誘導プロモーターの１つの制御下の他のＲＮａｓｅ遺伝子（
記載したものを含む）上にクローニングできる。

【０１６５】３．ＰｅｌＢＰｅｌＢ配列を、可溶化段階後に活性な形でペリプラズムへのＲＮａｓｅの分
泌を指示するために使用した（Ｒｉｂｏら、上記、ｄｅｌＣａｒｄａｙｒｅら、
上記）。

【０１６６】ＰｅｌＢ配列は、ｄｅｌＣａｒｄａｙｒｅらに記載の以下の方法によりＲＮａ
ｓｅ遺伝子上にクローニングできる。プラスミドｐＢＸＲ（ここで、ＢＸＲは、
ＲＮａｓｅＡの細菌発現を意味する）を以下の通りに作成する。ｐＥＴ２２Ｂ（
＋）のＭｓｃＩとＳａｌＩ部位の間に挿入できるＲＮａｓｅＡのｃＤＮＡを有す
る断片は、ＰＣＲにより作成する。増幅した断片はバンド精製し、Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼで処理し、ｔａｑポリメラーゼにより残された任意のオーバーハング
塩基を除去し、ＳａｌＩで消化する。得られた断片は、その５’末端に、２つの
ＣＧ塩基対（これは平滑末端を形成）により、およびその３’末端に、ＳａｌＩ
粘着末端によりフランキングされたＲＮａｓｅＡｃＤＮＡを有する。次いで、こ
の断片は、大腸菌発現プラスミドｐＥＴ２２Ｂ（＋）のバンド精製ＭｓｃＩ−Ｓ
ａｌＩ断片にＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結する。次いで、Ａｍｐ遺伝子のＰｓ
ｔＩ部位は、オリゴヌクレオチドＪＨＨ１６を使用して部位突然変異により除去
され、ＲＮａｓｅＡｃＤＮＡのＰｓｔＩ部位を、プラスミド中の唯一のかかる部
位にしている。この構築物の完全性は、制限および配列解析により評価される。

【０１６７】他のＲＮａｓｅ遺伝子上にクローニングされたｐｅｌＢ配列を含むプラスミド
もまた作成できる。ＲＮａｓｅ遺伝子および適切な制限酵素（例えば、線形ｐＥ
Ｔ２２Ｂ（＋）と適合性の部位）を含む断片を記載の通りに連結できる。

【０１６８】４．バクテリオシン放出タンパク質宿主細胞においてバクテリオシン放出タンパク質（ＢＲＰ）をコードしている
遺伝子の存在により、過剰発現ＲＮａｓｅが、ペリプラズムよりも培養上清に分
泌されることが可能となる。ＢＲＰ遺伝子が中程度に誘導されている場合、宿主
細胞の溶解は回避され、連続培養における大量タンパク質産生が可能となる（ｖ
ａｎｄｅｒＷａｌら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖｉｅｗｓ．１
７、１９９５、３８１−３９９）。

【０１６９】ＲＮａｓｅタンパク質およびＢＲＰの両方を発現している細胞は、ＲＮａｓｅ
遺伝子を含むプラスミドを、ＢＲＰ遺伝子を含む適合性プラスミドと同時形質転
換することにより製造できる。別に両方の遺伝子は、同プラスミド上にコードさ
れ得る。

【０１７０】ＢＲＰ遺伝子の発現は、マイトマイシンＣ（プラスミドｐＳＷ１ＭｏＢｉＴ
ｅｃＧｍｂＨ）またはＩＰＴＧ（プラスミドｐＪＬ３、ＭｏＢｉＴｅｃＧｍ
ｂＨ）の添加により誘導できる（プロトコルＭｏＢｉＴｅｃＧｍｂＨ、Ｗａｇ
ｅｎｓｔｉｅｆ、５：Ｄ−３７０７７またはＶａｎｄｅｒＷａｌら、上記）
。

【０１７１】分泌されたＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅＡについてＴａｒｒａｇｏｎａ−Ｆｉｏ
ｌら（上記）により記載のように、またはＲＮａｓｅをチオレドキシン融合物（
インビトロゲン）として標識する場合にはチオボンド（登録商標）レジンを使用
して、またはＲＮａｓｅをＨｉｓ標識（インビトロゲン）する場合にはプロボン
ド（登録商標）金属結合レジンを使用して、上清から精製できる。

【０１７２】次いで、精製ＲＮａｓｅは、細胞溶解液／上清（所望の産物、例えば細胞内プ
ラスミド／タンパク質または細胞外タンパク質の位置に応じて）に加えることが
でき、ＲＮＡ消化が完了するまでインキュベートできる。次いで、プラスミド／
タンパク質を、組換えＤＮＡまたはタンパク質の産生と題した章で記載した通り
に精製する（Ｈｏｒｎら、上記）。

【０１７３】５．融合タンパク質ＲＮａｓｅ遺伝子はまた、ＲＮａｓｅタンパク質を可溶形または封入体として
発現することを可能とする遺伝子と融合できる。例えば、ＲＮａｓｅ遺伝子は、
チオレドキシン遺伝子と融合でき（Ｒ＆Ｄシステムズ、ＬａＶａｌｌｉｅら、
ＢＩＯ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１１、１９９３、１８７−１９３）、トリプト
ファン誘導後、細菌ペレットの凍結／解凍時に選択的に放出できる。チオレドキ
シン−ＲＮａｓｅ融合タンパク質が活性である場合、プロテアーゼ切断によりチ
オレドキシンを放出する必要は全くない。

【０１７４】選択したＲＮａｓｅ遺伝子がｐＴＲＸＦＵＳ（インビトロゲン）のポリリンカ
ーのチオレドキシン遺伝子とインフレームでクローニングできる（ＬａＶａｌ
ｌｉｅら、上記）。次いで、このベクターを使用して、産生宿主大腸菌Ｇ１７２
４を形質転換する。大腸菌細胞は、ＯＤ５５０が０．５になるまで培養し、トリ
プトファンを最終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌとなるまで加え、融合タンパク質合成
を誘導する。

【０１７５】上記の産生宿主が、異種遺伝子発現またはプラスミドの産生の宿主である場合
、細胞を、ＲＮＡが十分に消化されるまでインキュベートする。次いで、タンパ
ク質またはプラスミド精製を記載の通り進行できる。

【０１７６】上記の産物宿主が、異種遺伝子発現または異種プラスミドの産生に使用された
宿主ではない場合、ＲＮａｓｅ融合タンパク質は、ＬａＶａｌｌｉｅら、上記
により記載の細胞溶解（フレンチプレス）または浸透圧ショックにより、または
、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｈｅｃｈｔ、Ｍ．Ｈ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２
：１３５７−１３５９、１９９４に記載の凍結解凍により放出できる。次いで、
放出されたタンパク質は、インビトロゲンにより記載のように、またはＴａｒｒ
ａｇｏｎａ−Ｆｉｏｌら、上記に記載のように、チオボンドレジンを使用して精
製できる。

【０１７７】精製ＲＮａｓｅは、記載のように、異種遺伝子またはプラスミドを産生する宿
主細胞の細胞溶解液に加えることができる（ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ、
上記およびＡｕｓｕｂｅｌ、現在のプロトコル、上記参照）。

【０１７８】構成プロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子本発明に記載のいくつかの方法および宿主細胞において、ＲＮａｓｅ遺伝子を
構成的に発現することが好ましい。従って、ＲＮａｓｅ遺伝子は、選択宿主細胞
で操作可能な構成プロモーターの転写制御下に配置する。構成プロモーターは、
多くの異なる種類の細菌について当分野で公知である。例えば、大腸菌では、か
かるプロモーターは、６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼプロモーターの
グルコキナーゼプロモーターを含む（Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ、ネズミチフス菌およ
び大腸菌細胞および分子生物学ＡＳＭ、Ｆｒａｅｎｋｅｌ，Ｄ．、第１２章、０
−１４２、１９８７）。

【０１７９】ＲＮａｓｅの構成的ペリプラズム発現ＲＮａｓｅ遺伝子は、構成プロモーターの制御下のＲＮａｓｅ遺伝子と題した
章に記載のように、構成的に発現およびペリプラズムに局在するタンパク質を産
生するように工学できる。

【０１８０】ペリプラズムで構成的なＲＮａｓｅ発現を達成するために、誘導期間は必要な
い。ＲＮａｓｅは、細胞が増殖するとペリプラズムに蓄積する（Ｔａｒｒａｇｏ
ｎａ−Ｆｉｏｌら、上記）。

【０１８１】ＲＮａｓｅを培養上清に分泌している宿主細胞におけるＲＮａｓｅ消化目的の細胞成分およびＲＮａｓｅの両方が、同一細胞または異なる細胞により
、上清に分泌される場合、目的の産物が、破裂／死滅細胞から放出された成分に
より汚染されるので細胞溶解を回避する。例えば、ウシＲＮａｓｅＡは非常に安
定であり、ｐＨ６．８−７．４で発酵ブロス中で依然として活性である。

【０１８２】細胞成分は、細胞を溶解することによる他の細胞由来汚染物を放出することな
く、培養上清から直接に集めることができる。細胞は、１０，０００ｇで２５分
間遠心分離することにより、上清から除去される。細胞成分およびＲＮａｓｅの
両方を含む、細胞非含有上清を、実質的に全てのＲＮＡが分解されるまでインキ
ュベートする。

【０１８３】最適のインキュベート期間は、タンパク質、ＤＮＡまたはＣＨＯである細胞成
分から実質的に全てのＲＮＡを分解するに必要な時間である（上記で定義した通
り）。細胞成分から実質的に全てのＲＮＡを分解するに必要な最適なインキュベ
ート期間は、以下の段階により決定する。適切な時間点（５分間間隔から１時間
または未分解ＲＮＡが依然として存在する場合にはそれ以上まで、下記の方法に
より決定）で、アリコートを取り出し、下記の方法によりＲＮＡの存在について
アッセイする。

【０１８４】ＲＮＡを除去した後、細胞成分を、下記の通り精製できる。別法として、膨張
床クロマトグラフィーカラムに培養培地を適用することにより産物を直接捕獲す
ることが可能である。このプロトコルでは、細胞およびＲＮａｓｅは、カラムを
直接に通過し、一方、産物は、下記のＨａｎｓｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ、１２：２８５−２８８、１９９４の方法に従って、クロマトグラフィ
ー培地に結合する。

【０１８５】膨張床吸収の設備。カラムの底に、特定の目的に応じるように設計された液体
分配器を具備した、ストリームライン（登録商標）５０（内直径５０ｍｍ）ホウ
ケイ酸ガラスカラム（ファルマシア・バイオテック、ウプサラ、スウェーデン）
を、膨張床手順のイオン交換吸着用のストリームライン（登録商標）ＤＥＡＥ吸
着剤（ファルマシア・バイオテック、ウプサラ、スウェーデン）と共に使用でき
る。吸着剤マトリックスは、ビーズ密度（平均粒子密度＝１．２ｇ／ｍｌ）を増
加させるために結晶石英を含む、球状マクロ多孔性架橋アガロース粒子からなる
。ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）吸着剤のイオン容量は、０．１３〜０．２
１ｍｍｏｌ／ｍｌである。粒子サイズ分布は、約１００〜３００μｍの範囲であ
り、平均粒子サイズは２００μｍである。吸着剤はオートクレーブにかけること
ができ、３〜９の操作上のｐＨ安定性を有し、１ＭＮａＯＨに抵抗する。沈降
配置の床高さは、１０ｃｍである。適切な床膨張を与える推奨される線形流速は
、２００〜４００ｃｍ／時間である。吸着剤が標的タンパク質に結合する容量は
、プロセスを設定する前に、充填床カラム実験で調査する。

【０１８６】膨張床吸着。発酵の終了時に、ｐＨ制御ＮＨ₃調節またはＮａＯＨ調節のため
に、塩基追加の除去により、ｐＨを５．５に下降させる。さらに、グリセロール
供給を終了し、温度を２０分間６０℃に上げ、ペリプラズムタンパク質の培養培
地への漏出を増加させる。その後、培養物を室温まで冷却する。添加する前に、
床を、線形流速２００ｃｍ／時間で、添加緩衝液（５０ｍＭＮａＣｌ）を用い
て２から３回予備膨張させる。次いで、粗培養発酵ブロスを、底から上端まで、
膨張床に添加緩衝液との１：１混合物として、同じ全流速（２００ｃｍ／時間）
で、ライン混合を可能とする２つのポンプ配列を使用して適用する。全発酵内容
物が添加されると、膨張床を、添加緩衝液流速を２００ｃｍ／時間に増加するこ
とにより膨張状態に維持する。約１／４容量の添加緩衝液およびその後１／２の
容量の洗浄緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ）を、膨張床を通過させて、残りの細
胞および緩く吸着したタンパク質を洗い流す。次いで、アニオン性吸着剤を、流
れを逆転させ、洗浄緩衝液で洗浄しておいた充填床の上端までアダプターを下げ
ることにより沈降させる。次いで、充填床は、上端から底まで、０．５ＭＮａ
Ｃｌ（流速１００ｃｍ／時間）を使用して溶出し、５０ｍｌ画分を集める。

【０１８７】膨張床の細胞除去効率の生細胞数計測およびＯＤ測定による分析。床出口から
のサンプルを、洗浄手順中に集める。生細胞数計測分析のために、サンプルを、
２つの別々の希釈（１００倍異なる）に希釈する。１００μｌの容量の各サンプ
ルを、アンピシリン（０．１ｇ／ｌ）を補充したトリピアス血液寒天ベースプレ
ートにプレーティングする。プレートを、３７℃で一晩インキュベートし、コロ
ニーの数を計測する。ＯＤ測定のために、サンプルを、Ａ６００ｎｍ値が０．２
〜０．８になるまで希釈する。Ａ６００ｎｍ＝０．０１よりも低い細胞含量につ
いては、生細胞数計測のみを実施する。１０⁶ｃｆｕ／ｍｌまでの細胞含量は、
ＯＤ測定の検出レベル以下であり、これは、視覚的に明らかな培養培地は１ｍｌ
あたり１００，０００細胞を含み得ることを示唆する（Ｈａｎｓｓｏｎら、上記
）。

【０１８８】ペリプラズムまたは細胞質におけるＲＮａｓｅを発現している細胞における溶解
およびＲＮａｓｅ消化ＲＮａｓｅが、培養上清中に細胞外に蓄積し、細胞成分が細胞内（細胞質また
はペリプラズム）に蓄積する場合、産物および汚染ＲＮＡが、細胞外ＲＮａｓｅ
と接触するために細胞溶解が必要とされる。ペリプラズムまたは細胞質でＲＮａｓｅを発現している細胞は、Ｓｃｏｐｅｓ
、上記またはＬａＶａｌｌｉｅら、上記に記載の方法に従って溶解できる。

【０１８９】残余ＲＮＡの決定本発明は、実質的にＲＮＡを含まない、細胞成分を産生する方法を考える。本
発明の方法に従って調製した細胞成分が実質的にＲＮＡを含まないかを決定する
ために、以下のプロトコルを使用し得る。

【０１９０】ＤＮＡサンプル中のＲＮＡ１．ＲＮＡ検出のためのアガロースゲル電気泳動を基にした方法サンプル調製各ＤＮＡサンプルは、最初に、約０．２μｇ／μｌの濃度に希釈する。次いで
、サンプルを、２×添加緩衝液を用いて１：１比に混合し、最終濃度を約０．１
μｇ／μｌとする。１０×保存添加緩衝液は、０．１ＭＮａ₂ＥＤＴＡ（ｐＨ
８．０）中、２０％ｗ／ｖグリセロール、１％ｗ／ｖＳＤＳ、０．２５％ｗ／ｖ
ブロモフェノールブルーである。ＲＮＡ対照標準液は、ＤＮＡのサンプルを複製
するために、５０μｌのサンプル毎に、１μｌの約１ｍｇ／ｍｌのＲＮＡ保存溶
液を添加することにより調製する。１０μｌの各サンプルを、１ｋｂラダーマー
カー（ライフテクノロジーリミテッド）のアリコートと共に、１％アガロースゲ
ル上で分析する。アガロースゲルを、５０×保存溶液から作成した、１×ＴＡＥ
緩衝液（４０ｍＭトリスアセテート、２ｍＭＥＤＴＡ）中で操作する。

【０１９１】電気泳動の標準液電気泳動標準液を、以下の方法により調製できる。脱イオン水中１ｍｇ／ｍｌ
の濃度で、ＩＩＩ型ＲＮＡ（ベーカー酵母（シグマ））の溶液を調製する。次い
で、この溶液を、１：５に希釈し、０．２μｇ／μｌの濃度にし、次いで、２×
添加緩衝液（上記のレシピ参照）で１：１に希釈し、〜０．１μｇ／μｌの濃度
にする。１０μｌのこの溶液を、１μｇのＲＮＡ標準液に対しゲル上に添加する
。以下の方法に従って調製したこの溶液の連続希釈液１０μｌをさらに添加する
。

【０１９２】１００μｌの０．１μｇ／μｌの上記保存溶液（添加緩衝液中）をチューブ１
に加える。チューブ１から５０μｌを取り出し、このサンプルを５０μｌの１×
添加緩衝液（チューブ２）に加える。ピペッティングにより十分に混合する。チ
ューブ２から５０μｌを取り出し、このサンプルを、５０μｋの１×添加緩衝液
（チューブ３）に加える。１２個のチューブが調製されるまで標準溶液を希釈し
続ける。１０μｌの各標準溶液をアガロースゲル上に添加する。

【０１９３】電気泳動条件電圧：１００Ｖ（制御）電流：４００ｍＡ（最大）電力：１００Ｗ（最大）時間：３０分間

【０１９４】結果の分析ゲルを染色して、核酸を可視化し、２５４ｎｍでＵＶトランスイルミネーター
上で写真を撮影した。

【０１９５】ＲＮＡを検出するために、アガロース電気泳動後に、ゲルを臭化エチジウムま
たはｓｙｂｒグリーンＩＩで染色する。ＲＮＡを、ＵＶ照明下で可視化する。臭
化エチジウムおよびｓｙｂｒグリーンＩＩ染色の検出限界は、それぞれ、約３．
２％ｗ／ｗ（ＲＮＡ／全核酸）および１．６％ｗ／ｗ（ＲＮＡ／全核酸）である
。

【０１９６】臭化エチジウムゲルを臭化エチジウム染色により可視化する場合、臭化エチジウムを最終濃度
０．５μｇ／ｍｌでアガロースゲル、および０．５μｇ／ｍｌの濃度で流す緩衝
液に加える。臭化エチジウムを、４℃で貯蔵した１ｍｇ／ｍｌの保存溶液（１０
０ｍｌの滅菌水あたり１錠剤の臭化エチジウム−シグマロット３５Ｈ０８６８）
から加える。

【０１９７】検出限界は、どの標準希釈液がＲＮＡの可視化が不可能であるかを観察するこ
とにより決定できる。次いで、先行標準液添加は、保存標準液添加（１μｇ）の
比率として表現する。ＲＮＡがサンプルトラックに全く観察されない場合、「Ｘ
％ｗ／ｗ以下」として結果を引用し、ここで、Ｘは、計算された感度である。バ
ンドが観察されれば、その強度を、標準液の強度と比較し、サンプルの結果が存
する２つの標準液の量の間の量として量を推定する。結果を、基準以下／以上で
引用する。この方法による、実質的にＲＮＡを含まないサンプルは、３．２％ｗ
／ｖ以下であり、すなわちＲＮＡは全く検出されない。

【０１９８】ｓｙｂｒグリーンＩＩＳＹＢＲグリーンＩＩ溶液を調製するために、ＳＹＢＲグリーンＩＩダイ（モ
レキュラープローブから）の保存溶液を、ＴＢＥ緩衝液（８９ｍＭトリス塩基、
８９ｍＭホウ酸、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で１：１０，０００で希釈す
る。この溶液を、アルミニウムホイルに包んだポリプロピレンチューブに４℃で
貯蔵できる。

【０１９９】電気泳動後、ゲルを、上記のように調製したＳＹＢＲグリーンＩＩダイで３０
分間４℃で暗闇中で染色する。

【０２００】どの標準希釈液がＲＮＡが全く観察されないことに等しいかを観察することに
より、ゲルの感度を決定する。次いで、先行の標準液添加は、保存標準液添加（
１μｇ）の比率として表現する。ＲＮＡがサンプルトラックに全く観察されない
場合、「Ｘ％ｗ／ｗ以下」として結果を引用し、ここで、Ｘは、計算された感度
である。バンドが観察されれば、その強度を、標準液の強度と比較し、サンプル
の結果が存する２つの標準液の間を推定する。結果を、基準以下／以上で引用す
る。この方法による、実質的にＲＮＡを含まないサンプルは、３．２％ｗ／ｖ以
下であり、好ましくは１．６％ｗ／ｗ以下である（すなわちＲＮＡは全く検出さ
れない）。

【０２０１】臭化エチジウムまたはＳｙｂｒグリーンで染色するための材料および方法設備：ファルマシアバイオテック電気電力供給（または類似）アナケム電気泳
動単位（１６サンプルウェル／２列最少）および２５４ｎｍの照明を有するＵＶ
トランスイルミネーター。

【０２０２】２．ノザンブロット解析電気泳動（ＲＮＡ検出のためのアガロースゲル電気泳動を基にした方法と題し
た章に記載）の実験サンプルおよび標準液のノザンブロット解析を、現在のプロ
トコルに、上記に記載の方法に従って実施できる。残余ＲＮＡを検出するために
、臭化エチジウムをホルムアルデヒド／アガロースゲルに、最終濃度０．５μｇ
／ｍｌで、および０．５μｇ／ｍｌの濃度でＭＯＰＳの流す緩衝液に加える。ア
ガロース／ホルムアルデヒド電気泳動後、ゲルを、３０分間、蒸留Ｈ₂Ｏで濯ぐ
。次いで、ＲＮＡをＵＶ照明下で可視化する。

【０２０３】検出限界は、どの標準希釈液がＲＮＡの可視化が不可能であるかを観察するこ
とにより決定できる。次いで、先行標準液添加は、保存標準液添加（１μｇ）の
比率として表現する。ＲＮＡがサンプルトラックに全く観察されない場合、「Ｘ
％ｗ／ｗ以下」として結果を引用し、ここで、Ｘは、計算された感度である。バ
ンドが観察されれば、その強度を、標準液の強度と比較し、サンプルの結果が存
する２つの標準液の量の間の量として量を推定する。結果を、基準以下／以上で
引用する。この方法による、実質的にＲＮＡを含まないサンプルは、３．２％ｗ
／ｖ以下であり、すなわちＲＮＡは全く検出されない。

【０２０４】２．ＨＰＬＣアッセイによるＲＮＡ検出この方法に従って、残余ＲＮＡを、穏やかな塩基性条件下でその構成リボヌク
レオチドに加水分解する。リボヌクレオチドを、アルカリホスファターゼ酵素で
処理して、リボヌクレオシドを産生し、これは、逆相高速液体クロマトグラフィ
ー（ＲＰＨＰＬＣ）下で分解し得る。サンプル中に存在するＤＮＡがアッセイを
妨害しないことを確かにするために、スピン濾過段階を実施して、分析前にサン
プルからＤＮＡを除去する。

【０２０５】ＲＰＨＰＬＣ条件を、この方法がピコモル領域、またはＤＮＡまたはタンパク
質の全濃度の比率として表現する場合に約０．１％の検出限界を有するように感
度を最適化する。

【０２０６】ＲＰＨＰＬＣ条件；機器：ヒューレットパッカード１１００ＨＰＬＣ系。または勾配溶出およびＵＶ
領域での検出が可能な等価な系。カラム：ＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌＬＣ−１８Ｓ２５ｃｍ＊２．１ｍｍ５μ
ｍ（または類似）移動相：Ａ＝１０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄ｐＨ６．０（９７．５％）；メタノール（
２．５％）Ｂ＝メタノール勾配：３０分間かけて０〜２０％のＢ操作時間：全部で４５分間流速：０．２１ｍｌ／分添加：５μｌ検出：２６０ｎｍのＵＶＲＰＨＰＬＣ標準液調製

【０２０７】標準液を調製するために、約１５ｍｇの各リボヌクレオシドを、５０ｍｌのメ
スフラスコに移す。リボヌクレオシドを溶かし、移動相Ａの容量にもってくる。
２００μｌの各リボヌクレオシドを１．５ｍｌエッペンドルフに合わせ、連続的
な２倍希釈を７回実施する。得られた溶液を、上記の条件を使用して直接クロマ
トグラフィーにかけることができる。グアノシン標準液は、溶解を補助するため
に加温および超音波処理を必要とし得る。以下のように各リボヌクレオシドの標
準液添加を計算する（リボヌクレオシドのＲＭＭを使用し、結果はピコモルで引
用する）。

【０２０８】（Ｗｔ（ｇ）×０．２×１０００×５×１）／（ＲＭＭ×０．８×５０×１００
００００×２⁷）

【０２０９】ＲＰＨＰＬＣサンプル調製：５μｌの３Ｍ水酸化カリウム溶液を５０μｌのプラスミドＤＮＡに添加するこ
とによりサンプルを調製する。例えば、サンプルは、注射用水（ＷＦＩ）中２〜
３ｍｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡであり得る。溶液を簡潔にボルテックスで混合
し、次いで、３７℃で最低１６時間インキュベートする。次いで、等量の３Ｍ酢
酸および１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）を加え；次いで、１０μｌの１００Ｕ／ｍ
ｌの細菌アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）懸濁液を加える。次いで、得られた
溶液を簡潔にボルテックスで混合し、３７℃でさらに２時間インキュベートする
。分析する直前に、サンプルを、１０，０００ダルトン（または適宜）で操作す
る分子量カットオフ膜を有するスピンフィルターに配置し、１０分間１３，００
０で遠心分離する。濾液を、上記の条件に従ってさらに処理することなくクロマ
トグラフィーにかける。

【０２１０】結果：結果を解釈するために、サンプルおよび標準クロマトグラムの、シチジン、ウ
リジン、グアノシンおよびアデノシン（ピークはこの順に溶出する）に対応する
ピークを積分する。次いで、サンプル中の各リボヌクレオチドの量を以下のよう
に計算する（ここで使用したＲＭＭは、一リン酸リボヌクレオチドのものであり
、標準添加がピコモルで引用される場合、結果はナノグラムで与える）。この方
法の検出限界は約０．１％ｗ／ｗである。この検出法に従って実質的にＲＮＡを
含まないサンプルは、１．６％以下であり、好ましくは０．１〜０．５％ｗ／ｗ
以下である。

【０２１１】（Ａ×Ｃ×Ｄ×７５）／（Ｂ×５）ここで、Ａ＝ピコモルでの標準リボヌクレオシドの添加Ｂ＝標準リボヌクレオシドによるピーク下の面積Ｃ＝サンプルリボヌクレオシドによるピーク下の面積Ｄ＝リボヌクレオチド一リン酸のＲＭＭ

【０２１２】各リボヌクレオチドで得られた結果を合計すると、全ＲＮＡ含量が得られる。
最終結果は、質量として引用し、ＤＮＡまたはタンパク質含量（％ｗ／ｗ）の、
または溶液容量（％ｗ／ｖ）の比率として結果を引用するために使用され得る。

【０２１３】２．タンパク質サンプル中のＲＮＡ残余ＲＮＡは、アガロースゲル染色法（記載）または記載のＨＰＬＣアッセイ
によりタンパク質サンプル中で検出できる。この方法の検出限界は約０．１％ｗ
／ｗである。この検出法により実質的にＲＮＡを含まないサンプルは、３．２％
ｗ／ｗ以下、好ましくは１．６％以下、好ましくは０．１〜０．５％ｗ／ｗ以下
である。

【０２１４】治療プラスミドＤＮＡのＲＮＡ汚染の許容可能なレベルは、＜１％ｗ／ｗであ
る。治療タンパク質のＲＮＡ汚染の許容可能なレベルは＜１０ｎｇ／投与量であ
る。

【０２１５】細胞溶解液中のＲＮａｓｅの量の決定本発明の利点は、有意に少ないＲＮａｓｅタンパク質が細胞溶解液中の実質的
に全てのＲＮＡ分子を除去するのに必要であり、従って、有意に少ないＲＮａｓ
ｅタンパク質が溶解液中に存在する。

【０２１６】細胞溶解液中に存在するＲＮａｓｅタンパク質の量は、以下の方法により決定
され得る。

【０２１７】ＲＮａｓｅＩアッセイＲＮａｓｅＩの３つの異なるアッセイを使用して、細胞抽出物中の酵素を推定
できる。アッセイＡは、ＲＮＡから放出された酸可溶性紫外線吸収物質を測定す
る。アッセイＢは、アッセイＡよりも感度が高く、より特異的な修飾形である。 ³² Ｐ標識ＲＮＡが基質であり、酸可溶性放射活性物質を測定する。アッセイＣは
、リボソーム調製物においてＲＮａｓｅＩをアッセイする感度の高い方法である
。これは、尿素含有緩衝液に対して透析されたリボソームからの紫外線吸収物質
の放出を測定することからなる。全３つのアッセイにより、潜伏ＲＮａｓｅＩが
判明する。なぜなら、ＡおよびＢでは、ＥＤＴＡは酵素の活性化をもたらし、Ｃ
では、尿素は活性化を引き起こすからである。ポリヌクレオチドホスホリラーゼ
およびＲＮａｓｅＩＩは、ＥＤＴＡおよび尿素により阻害され、ＲＮＡに対して
比較的不活性である。

【０２１８】（ｉ）アッセイＡ０．１ｍｌの反応混合物は、１０μｍｏｌのリン酸カリウム緩衝液、および１
．０μｍｏｌのＥＤＴＡ（これらは全てｐＨ７．０に調整する）および酵素画分
を含む。３７℃で４０分間インキュベートした後、０．３ｍｌの冷３％ＨＣｌＯ ₄ を加え、混合物を氷中で１５分間冷却する。２０００ｇで１５分間冷やしなが
ら遠心分離した後、０．１ｍｌの上清溶液を１．０ｍｌの蒸留水に希釈し、ＯＤ ₂₆₀ を決定する。全アッセイを二重に実施し、数値を酵素画分中の任意の酸可溶
性紫外線吸収物質について修正する。活性は、μμｍｏｌの酸可溶性ヌクレオチ
ド／反応混合物／時間として表現され、ヌクレオチドについてのモル吸光係数を
１０，０００と想定する（Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：
６７−８４）。

【０２１９】（ｉｉ）アッセイＢ ³²Ｐ標識ＲＮＡを、アッセイＡで反応混合物に加え、全基質濃度を一定に保つ
。ＲＮＡの最終比活性は、２０００〜５０００ｃｔｓ／分／０．１ｍｇである。
Ａと同様にインキュベート、沈殿および遠心分離後、０．２ｍｌの上清溶液を取
り出し、５ｃｍアルミニウムプランシェットに配置し、計測のために乾燥させる
。アッセイＡと同様に、活性は、反応混合物のＲＮＡの比活性に基づいたμμｍ
ｏｌ／時間として表現する（Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ、上記）。

【０２２０】（ｉｉｉ）アッセイＣヴィスキング透析チュービング（８／２２）を、２０分間希Ｎａ₃ＣＯ₂中で煮
沸し、十分に蒸留水で洗浄し、０．１ｍｌｍＭＥＤＴＡに貯蔵する。使用直
前に、チュービングを、再度蒸留水で洗浄する。全てのガラス容器を滅菌し、使
い捨てプラスチックグローブを、ＲＮａｓｅ汚染を最小限にするために、透析チ
ュービングの取扱に使用する。０．０１Ｍ酢酸マグネシウム、０．００５Ｍトリ
ス（ｐＨ７．５）中で３回洗浄した、１．０ｍｌ（３０μｍｏｌのヌクレオチド
を含む）のリボソーム溶液を、１００ｍｌの４Ｍ尿素、０．００５Ｍトリス（ｐ
Ｈ７．５）、０．０５Ｍ−ＫＣｌに対して４℃で透析する。様々な時間に、透析
緩衝液のサンプルを取り出し、ＯＤ₂₈₀を測定する。結果は、放出ヌクレオチド
のｍμｍｏｌ／分／元のリボソーム中のヌクレオチドのμｍｏｌとして表現する
（Ｇｅｓｔｅｌａｎｄ、上記）。

【０２２１】ＲＮａｓｅＡアッセイ（全ての非特異的ＲＮａｓｅに適切）ＲＮＡ寒天プレートに対する組換えＲＮａｓｅ活性２％（ｗ／ｖ）寒天（バクト−寒天）／１００ｍＭＭＥＳｐＨ６．５０．
３％（ｗ／ｖ）酵母ＲＮＡを含む溶液をオートクレーブにかけ、ペトリ皿に注ぐ
。丸い穴を滅菌コルク穴開け機を使用してＲＮＡ寒天中に作り、１５０μｌの容
量の組換えまたは市販のＲＮａｓｅ（０．１〜２５μｇ）を適用する。プレート
を２〜４時間３７℃でインキュベートする。ＲＮａｓｅ活性を可視化するために
、２ＭＨＣｌをプレート上に注ぐ。活性なＲＮａｓｅが導入された場合には透
明なゾーンが穴の周辺にでき、加水分解されていないＲＮＡは濁った沈殿物を形
成する（Ｔａｒｒａｇｏｎａ−Ｆｉｏｌら、上記）。

【０２２２】細胞溶解液中のＲＮａｓｅの量はまた、ＲＮａｓｅによるシチジルイル−３’
，５’−アデノシンの加水分解速度を決定することにより測定できる。ＲＮａｓ
ｅによるＣｐＡの加水分解は、室温で、１ｍｌで１ｃｍ経路のキュベット（Ｈｅ
ｌｌｍａ）中で実施できる。反応容量は１ｍｌである。０．１トリスアセテート
ｐＨ６．５中０．１ｍＭＣｐＡを含む反応物は、ＲＮａｓｅを含む溶解液を添
加することにより開始される。ＣｐＡの加水分解を、Ａ₂₆₅ｎｍの増加により、
０．１ＭトリスアセテートｐＨ６．５および０．１ｍＭＣｐＡを含むブランク
に対して測定する（Ｔａｒｒａｇｏｎａ−Ｆｉｏｌら、上記）。

【０２２３】（実施例１）ＲＮａｓｅＡ処理なしの大腸菌ＤＨ５ａからのｐＵＣ１８基本大腸菌ＲＮａｓｅ
Ｉ発現プラスミドの小規模精製ＲＮａｓｅＩ遺伝子を、プライマー５’−ＧＧＴＣＣＴＧＧＧＧＴＧＡＴＴＡＴＴＴＡＣＧＧＣＴＧＴＧＧＣ−３’
および５’−ＧＴＴＴＡＡＣＴＣＡＣＡＴＧＡＴＧＡＴＡＣＴＧＡＣＴＧＴＴＧ−３’
を用いたＰＣＲによって大腸菌菌株ＤＨ１から増幅させ、そして記述されるとお
り、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ３．１（インビトロゲン・インク（Ｉｎｖ
ｉｔｒｏｇｅｎＩｎｃ．））にクローニングさせた。

【０２２４】ＲＮａｓｅＩプレートアッセイでは、生じたベクターが、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ
（図３）およびＤＨ５α（データは示されず）中にＲＮａｓｅＩ遺伝子を過剰発
現することが示された。ＲＮａｓｅプレートアッセイを、以下の方法によって行
った。ＬＢ寒天（カナマイシンで３０μｇ／ｍｌに補足された）を、１．（頂部
左）ＴＯＰ１０Ｆクローン１（ｐＣＲ３．１）、２．（頂部右）ＴＯＰ１０Ｆク
ローン２（ｐＣＲ３．１ＲＮａｓｅＩ）、３．（中央左）ＴＯＰ１０Ｆクローン
３（ｐＣＲ３．１ＲＮａｓｅＩ）、４．（中央右）ＴＯＰ１０Ｆクローン４（ｐ
ＣＲ３．１）、５．（底部左）ＴＯＰ１０Ｆクローン５（ｐＣＲ３．１ＲＮａｓ
ｅＩ）および６．（底部右）ＴＯＰ１０Ｆクローン６（ｐＣＲ３．１ＲＮａｓｅ
Ｉ）の１０μｌの一夜培養物でスポット付けし、そして３７℃で一夜インキュベ
ートした。以下の日数、プレートを、パン酵母ＲＮＡ（１１ｍＭのＥＤＴＡ中０
．３％）を含む６ｍｌの軟質寒天で覆った。３７℃で、４時間のインキュベーシ
ョン後、プレートを、１０ｍｌの１ＭＨＣｌを添加することによって展開させ
、そして写真を撮った。

【０２２５】その後、ＲＮａｓｅＩ遺伝子を、その発現が、０．５ｍＭの最終濃度までＩＰ
ＴＧを添加して増大されるようにＩａｃＺプロモーターの下流でｐＵＣ１８にク
ローニングさせた。プレートアッセイでは、ｐＵＣ１８構築物から得られる発現
が、誘導に続くＤＨ５α中のｐＣＲ３．１構築物からのものよりほんの僅かに高
いことが示された（図４）。ＬＢ寒天（５０μｇ／ｍｌでアンピシリンおよびＩ
ＰＴＧ０．５ｍＭで補足された）を、１．（頂部）ＤＨ５α（ｐＣＲ３．１ＲＮ
ａｓｅＩ）および２．（底部）ＤＨ５α（ｐＵＣ１８ＲＮａｓｅＩ）培養物の一
夜培養物５０μｌでスポットをつけ、そして３７℃で一夜インキュベートした。
以下の日数、プレートを、ＥＤＴＡ（１１ｍＭ）中にパン酵母ＲＮＡ（０．３％
）を含む軟質寒天６ｍｌで被覆した。３７℃で、４時間インキュベートした後、
１ＭのＨＣｌ１０ｍｌを添加することによってプレートを展開させ、そして写
真を撮った。

【０２２６】これらの構築物を含む菌株からアルカリ性溶解によってプラスミドを単離した
とき、過剰発現ＲＮａｓｅＩは、これらのサンプルからＲＮＡを除去することが
不可能である一方で、外因性ウシＲＮａｓｅＡを添加すると、複製サンプルから
ＲＮＡを除去できたことは明らかであった。プレートアッセイでは、ＲＮａｓｅ
Ｉが、十分な量で合成されないか、またはアルカリ性溶解手段（図５）に、そし
て特に、ＳＤＳおよび水酸化ナトリウムの存在下での変性化段階に敏感であるか
のいずれかであることが示唆された。

【０２２７】パン酵母ＲＮＡ（０．３％）、トリス緩衝液（１０ｍＭ）およびＥＤＴＡ（１
１ｍＭ）を含むＬＢ寒天（１％）プレートを、以下のサンプルにかけた。

【０２２８】１．（頂部左）ＤＨ５α（ｐＵＣ１８ＲＮａｓｅＩ）細胞を、ＴＥ緩衝液で再
懸濁させ、０．２ＭのＮａＯＨおよび１％ＳＤＳを添加することによって溶解さ
せ、そして３Ｍ酢酸カリウムで中和させた。これらの細胞から得られる上清を、
遠心分離によって透明にし、そして６０μｌを、プレート中のウエルにかけた。

【０２２９】２．（頂部右）ＤＨ５α（ｐＵＣ１８ＲＮａｓｅＩ）細胞を、ＴＥ緩衝液で再
懸濁させ、凍結および迅速な解凍の３回のサイクルによって溶解させた。これら
の細胞から得られる上清を、遠心分離によって透明にし、そして２０μｌを、プ
レート中のウエルにかけた。

【０２３０】３．（底部左）ＤＨ５α（ｐＵＣ１８ＲＮａｓｅＩ）細胞を、ＴＥ緩衝液で再
懸濁させ、超音波処理で溶解させた。これらの細胞から得られる上清を、遠心分
離によって透明にし、そして２０μｌを、プレート中のウエルにかけた、そして

【０２３１】４．（底部右）２０μｌのＴＥ緩衝液中のウシＲＮａｓｅＡ２μｇを、プレー
ト中のウエルにかけた。そのプレートを、３７℃で、４時間インキュベートし、
そしてその後、１０ｍｌの１ＭＨＣｌを添加することによって展開させ、その
後写真を撮った。

【０２３２】ＲＮａｓｅＩ発現菌株から得られる組換えプラスミドＤＮＡの小規模精製のた
めのプロトコールは、延長したインキュベーション期間（Ｂｉｒｎｂｏｉｍおよ
びＤｏｌｙ、１９７９年）を含むように修正した場合、過剰発現したＲＮａｓｅ
Ｉは、プラスミドＤＮＡの調製から得られるＲＮＡが混入している部分を取除い
た（図６）。

【０２３３】特に、アルカリ性溶解手段は、インキュベーション、続いて中和段階、または
続いて超音波処理／凍結解凍による、そして水酸化ナトリウムおよびＳＤＳでの
変性の前のＲＮａｓｅＩの放出を含めて修正された。このインキュベーション期
間じゅう、ＲＮＡを、発現ＲＮａｓｅによって消化させた。

【０２３４】図６は、記述されるとおり調製された５μｌの以下のサンプルにかけた臭化エ
チジウムで染色した０．８％アガロースゲルである。

【０２３５】レーン１．ＤＮＡ断片サイズマーカー１ＢｓｔＥＩＩ；レーン２．ＤＨ５α（ｐＵＣ１８）細胞を、ＴＥ緩衝液で再懸濁させ、０．２
ＭのＮａＯＨおよび１％ＳＤＳを添加することによって溶解させ、３Ｍ酢酸カリ
ウムで中和し、そして氷上で２時間インキュベートさせた。上清を、遠心分離に
よって透明にし、エタノール沈降させ、そして２０μｌのＴＥ緩衝液で再懸濁さ
せる。

【０２３６】レーン３．ＤＨ５α（ｐＵＣ１８）細胞を、ＴＥ緩衝液で再懸濁させ、凍結お
よび迅速な解凍の３回のサイクルにより溶解させ、そして氷上で２時間インキュ
ベートさせた。その後、サンプルを、０．２ＭのＮａＯＨおよび１％ＳＤＳで処
理し、３Ｍ酢酸カリウムにより中和し、そして遠心分離によって透明にした。Ｄ
ＮＡを、エタノール沈降させ、そして２０μｌのＴＥ緩衝液で再懸濁させ、レーン４．ＤＨ５α（ｐＵＣ１８）細胞を、ＴＥ緩衝液で再懸濁させ、そして
超音波処理によって溶解させた。氷上で２時間インキュベートさせた後、サンプ
ルを、０．２ＭのＮａＯＨおよび１％ＳＤＳで処理し、３Ｍ酢酸カリウムにより
中和し、そして遠心分離によって透明にした。ＤＮＡを、エタノール沈降させ、
そして２０μｌのＴＥ緩衝液で再懸濁させ、レーン５．空、レーン６．ＤＨ５α（ｐＵＣ１８ＲＮａｓｅＩ）細胞を、ＴＥ緩衝液で再懸濁
させ、そして０．２ＭのＮａＯＨおよび１％ＳＤＳを添加することによって溶解
させ、そして３Ｍ酢酸カリウムにより中和し、氷上で２時間インキュベートさせ
た。上清を、遠心分離によって透明にし、エタノール沈降させ、そして２０μｌ
のＴＥ緩衝液で再懸濁させた。

【０２３７】レーン７．ＤＨ５α（ｐＵＣ１８ＲＮａｓｅＩ）細胞を、ＴＥ緩衝液で再懸濁
させ、凍結および迅速な解凍の３回のサイクルにより溶解させ、氷上で２時間イ
ンキュベートさせた。その後、サンプルを、０．２ＭのＮａＯＨおよび１％ＳＤ
Ｓで処理し、３Ｍ酢酸カリウムにより中和し、そして遠心分離によって透明にし
た。ＤＮＡをエタノール沈降させ、そして２０μｌのＴＥ緩衝液で再懸濁させた
。

【０２３８】レーン８．ＤＨ５α（ｐＵＣ１８ＲＮａｓｅＩ）細胞を、ＴＥ緩衝液で再懸濁
させ、超音波処理により溶解させた。氷上で２時間インキュベートさせた後、サ
ンプルを、０．２ＭのＮａＯＨおよび１％ＳＤＳで処理し、３Ｍ酢酸カリウムに
より中和し、そして遠心分離によって透明にした。ＤＮＡをエタノール沈降させ
、そして２０μｌのＴＥ緩衝液で再懸濁させた。

【０２３９】（実施例ＩＩ）プラスミドｐＵＣ１９ｔｅｔおよびタンパク質の産生についての大腸菌ＤＨ１Ｒ
ＮａｓｅＡ（構築的に発現するＲＮａｓｅＡ）の使用ＲＮａｓｅＡ遺伝子を、構築的に活性なグリコキナーゼ・プロモーターの制御
下でクローニングさせ、そして中間体プラスミド（ＲＮａｓｅＡ遺伝子の染色体
への組込みと題されるセクションで記載されるとおり）としてｐＮ１を使用して
、大腸菌宿主菌株ＤＨ１の染色体に挿入することができる。ＲＮａｓｅＡタンパ
ク質は、その内在性リーダー配列によって周辺に向けられる。

【０２４０】組換えＤＮＡまたはタンパク質の精製と題されるセクションで上で記述される
とおり、目的のプラスミド（例えば、国際公開番号第９７／２９１９０号に記述
されるｐＵＣ１９ｔｅｔΔＡｍｐまたはｐＴＸ０１６１）で形質転換された、構
築的に発現されたグリコキナーゼ・プロモーターの制御下で染色体ＲＮａｓｅＡ
遺伝子も発現し、育成し、そしてアルカリ性溶解により溶解させた、ＤＨ１ＲＮ
ａｓｅＡ大腸菌細胞中でのプラスミド産生を、国際公開番号第第９７／２９１９
０号に記述される方法によって行う。溶解プロトコールを修正し、その結果、そ
の方法は、サンプルが、外因で付加したＲＮａｓｅＡと一緒にインキュベートさ
れるが、しかしその代わりに、その同一生物で産生される組換えＲＮａｓｅＡと
インキュベートする段階を含まない。

【０２４１】ＤＨ１ＲＮａｓｅＡ大腸菌細胞を、発現ベクターｐＴＲＣＨｉｓ（インビトロ
ゲン）内に枠内でクローニングされたインフルエンザ核内タンパク質（ＮＰ）の
ための遺伝子を含むプラスミドで形質転換させる。Ｈｏｒｎら、上記文献の方法
によって、組換えＤＮＡまたはタンパク質の精製と題されるセクションで上に記
述されるとおり、細胞を培養できる。細胞を、インフルエンザウイルス核内タン
パク質（ＮＰ）を構築的に合成する。本発明によって、細胞は、細胞ホモジナイ
ザーを使用して溶解させ、そして実質的にＲＮＡ不含の組換えタンパク質を産生
するのに十分な長さの時間、インキュベートする。残余ＲＮＡの存在は、残余Ｒ
ＮＡの検出と題されるセクションで記述される方法によって検出される。ＮＰタ
ンパク質を、以下の方法によって精製する。

【０２４２】抽出および精製遠心分離によって細胞を回収し、１％溶解緩衝液（５０ｍＭＮａＰＯ₄、１
ＭＮａＣｌ、０．５％サルコシル）に再懸濁させ、そして−８０℃で凍結させ
る。細胞を、プロテアーゼ阻害剤（ベーリンガー・マンハイム社の完全ＥＤＴＡ
不含プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤、１錠／５０ｍｌの細胞再懸濁液）の存在
下で氷上で凍解させる。ＤＮエースＩを５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加する。
コンスタント・システムズ・リミテッドのホモジナイザーでの単回通過を用いて
、３０Ｋｐｓｉで均質化させることによって細胞ペレットを溶解させた。選択的
均質化方法は、上記文献の範囲で見ることができる。溶解液を、１０，０００ｇ
で遠心分離にかけて、細胞破砕物を除去する。サルコシルを最終濃度０．５％ま
で添加して、タンパク質安定性および内毒素除去を助ける。５０％Ｎｉ−ＮＴＡ
アガロース（キアゲン・インク）６０ｍｌを添加することに続いて、溶解液を、
４℃で、１時間インキュベートして、タンパク質のバッチ結合を起させうる。

【０２４３】塊状の溶解液を、２００ｇで遠心分離することによって樹脂から除去する。樹
脂を、残りの溶解液中で再懸濁させ、そしてファルマシアＸＫ２６カラムを注ぐ
のに使用する。カラムを４００ｍｌ洗浄用緩衝液（５０ｍＭＮａＰＯ₄、１Ｍ
ＮａＣｌ、０．５％サルコシル、２０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロー
ル）で洗浄する。洗浄用緩衝液中の０％から２２％の０．５Ｍイミダゾールの勾
配を用いて、混入物を溶出させる。フラクションコレクターを用いて、洗浄用緩
衝液中の１００％から０．５％イミダゾールの段階勾配で組換えＮＰ（ｒＮＰ）
を溶出させる。

【０２４４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって適切な分画を分析して、ｒＮＰの存在を確認する。
最高濃度のｒＮＰを含む分画を貯蔵する（プール１）。さらに、最小濃度のｒＮ
Ｐを含む分画を貯蔵する（プール２）。

【０２４５】貯蔵されたｒＮＰを、２５ｍＭヘペス、０．５％サルコシル中で透析する。バ
イオラッド（ＢＩＯＲＡＤ）のタンパク質アッセイを用いて、タンパク質濃度を
測定する。ＫＱＣＬアッセイ（バイオホワイトテイカー（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋ
ｅｒ））によって、残余内毒素の存在を測定する。残余ＲＮＡの測定と題される
セクションに記述される方法によって、残余ＲＮＡの存在を測定する。

【０２４６】（実施例ＩＩＩ）プラスミドｐＵＣ１８およびタンパク質の生成のための大腸菌ＤＨ１ＲＮａｓｅ
Ａ（誘導性および周辺性）の使用上に記述される方法によって、ＲＮａｓｅＡ遺伝子を、誘導性ｌａｃプロモー
ターの制御下でクローニングさせ、そして中間体プラスミドとしてｐＮ１を使用
して、ＤＨ１の染色体に安定に組込むことができる。ＲＮａｓｅは、その内在性
リーダー配列によって周辺に向けられる。

【０２４７】その後、国際公開番号第９７／２９１９０号に記述される方法にしたがって、
組換えＤＮＡまたはタンパク質の精製と題されるセクションで上に記述される方
法にしたがって、育成された、精製されるべきプラスミドベクター（例えば、ｐ
ＵＣ１９ｔｅｔΔＡｍｐまたはｐＴＸ０１６１）で大腸菌細胞を形質転換させる
。発酵の終了前に、０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって、ＲＮａｓｅ
Ａ産生を誘導する。実施例ＩＩで記述される修正アルカリ溶解手段、および国際
公開番号第９７／２９１９０号に記述される手段によって精製されたプラスミド
によって、細胞を溶解させる。

【０２４８】大腸菌細胞を、発現ベクターｐＴＲＣＨｉｓ（インビトロゲン）に枠内でクロ
ーニングされたＮＰ遺伝子を含むベクターで形質転換させ、そして国際公開番号
第９７／２９１９０号に記述される方法にしたがって、組換えＤＮＡまたはタン
パク質の精製と題されるセクションで上に記述されるとおり培養することができ
る。細胞を誘導して、上に記述されるとおり０．５ｍＭのＩＰＴＧを添加するこ
とによってＲＮａｓｅおよびＮＰタンパク質を同時に合成し、細胞ホモジナイザ
ーを用いて溶解させ、そして１０から６０分間インキュベートして、ＲＮＡを除
去することができる。上に記述される方法（実施例ＩＩおよび上記文献、スコー
プス）によって、ＮＰタンパク質を精製する。

【０２４９】（実施例ＩＶ）プラスミドおよびタンパク質の産生のための大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＮａｓ
ｅＡ（誘導性および周辺性）の使用上に記述の方法にしたがって、ＲＮａｓｅＡ遺伝子を、誘導性Ｔ７プロモータ
ーの制御下でクローニングし、中間体プラスミドとしてｐＮ１を使用して、ＢＬ
２１（ＤＥ３）の染色体に安定に組込ませることができる。ＲＮａｓｅＡタンパ
ク質は、その内在性リーダー配列によって周辺に向けられる。

【０２５０】目的の、そしてＴ７プロモーターの制御下でＲＮａｓｅＡ遺伝子を含む染色体
発現カセットＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＮａｓｅＡを担持するプラスミド（例えば、
ｐＵＣ１９ｔｅｔΔＡｍｐまたはｐＴＸ０１６１）で形質転換させた大腸菌細胞
を、ＬＢ培地中で振蘯フラスコ内で育成させることができる。ＲＮａｓｅＡ産生
は、以下の実施例Ｖで記述されるとおり、または誘導性プロモーターシステムと
題されるセクションに記述される方法にしたがって誘導される。実施例ＩＩに記
述される修正アルカリ溶解手段、および国際公開番号第９７／２９１９０号に記
述されるとおり精製されたプラスミドによって、細胞を溶解させる。

【０２５１】大腸菌細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＮａｓｅＡを、発現ベクターｐＥＴ（Ｔ７プ
ロモーターの制御下で）中に枠内でクローニングされたＮＰ−遺伝子を含むベク
ターで形質転換させることができる。このベクターを、ｐＴＸ０３０と呼ばれ、
そして下に実施例Ｖで記述される。そのベクターは、下に記述のとおり培養させ
る。細胞を誘導して、下に記述のとおりＮＰを合成し、細胞ホモジナイザーを使
用して溶解させ、そして１０から６０分間インキュベートして、ＲＮＡを除去で
きる。ＮＰタンパク質を、上に記述される方法（実施例ＩＩおよび上記文献、ス
コープス）にしたがって精製する。

【０２５２】（実施例Ｖ）大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＮａｓｅＡでのＲＮＡ不含インフルエンザウイルス
核内タンパク質産生Ｐ１形質導入段階でＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＮａｓｅＡを生成する標的株ＢＬ２
１（ＤＥ３）を使用して、大腸菌ＢＬ２（ＤＥ３）ＲＮａｓｅＡを、ＤＨ１ＲＮ
ａｓｅＡの産生について記述される方法にしたがって産生できる。

【０２５３】ベクターＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＮａｓｅＡを含有する大腸菌細胞を、ｐＴＸ０
３３０で形質転換させ、そしてカナマイシン（ＬＢｋａｎ）（３０ｍｇ／Ｌ）で
補足したＬＢ寒天に被せる。ｐＴＸ０３３０は、ＮＰコーディング配列をｐＥＴ
−２８ａ（＋）（ノブゲン・インク．（ＮｏｖｇｅｎＩｎｃ．））にクローニ
ングすることによって生成される、６個のＮ−末端ヒスチジン残基でタグ付けさ
れた「流感」ＮＰタンパク質のＴ７ポリメラーゼ・プロモーターで駆動される発
現についてのベクターである。Ｎ末端タグは、金属キレートクロマトグラフィー
によってＮＰの精製を可能にする。ＰＴＸ０３３０は、カナマイシン耐性遺伝子
ｋａｎを担持する。

【０２５４】単独コロニーを使用して、３０μｇ／ｍｌカナマイシン（ＬＢｋａｎ）で補
足された２５ｍｌのＬＢに接種し、そして生じた培養物を、２００ｒｐｍで３７
℃で一夜育成する。この培養物のアリコート量を使用して、２００ｍｌのＬＢＫ
ａｎを接種する。この予備培養物を、１単位のＯＤ６００ｎｍまで生育させる。
６つの１．５Ｌアリコート量のＬＢＫａｎに、この２００ｍｌ予備培養物の内の
３０ｍｌを接種する。５時間、０．５ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）を添加するこ
とによって、タンパク質発現を誘導する。その後、遠心分離によって細胞を回収
し、１％溶解緩衝液（５０ｍＭのＮａＰＯ₄、１ＭのＮａＣｌ、０．５％サルコ
シル）で再懸濁させ、そして−８０℃で凍結させる。

【０２５５】抽出および精製細胞を、プロテアーゼ阻害剤（ベーリンガー・マンハイム社の完全ＥＤＴＡ不
含プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤、１錠／５０ｍｌの細胞再懸濁液）の存在下
、氷上で解凍させる。ＤＮエースＩを５ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで添加する。コ
ンスタント・システムズ・リミテッドのホモジナイザーでの単回通過を使用した
３０Ｋｐｓｉでの均質化によって細胞ペレットを溶解させる。代替的均質化法は
、上記文献のスコープスに見ることができる。溶解液を、１０，０００ｇで遠心
分離にかけて、細胞破砕物を除去する。サルコシルを０．５％の最終濃度まで添
加して、タンパク質安定性および内毒素除去を助ける。６０ｍｌの５０％Ｎｉ−
ＮＴＡアガロース（キアゲン・インク．）を添加することに続いて、溶解液を、
１時間、４℃でインキュベートして、タンパク質のバッチ結合を起させる。

【０２５６】塊状の溶解液を、２００ｇでの遠心分離により樹脂から取除く。樹脂を、残余
溶解液に再懸濁させ、そしてファルマシアＸＫ２６カラムに注ぐのに使用する。
そのカラムを、４００ｍｌ洗浄用緩衝液（５０ｍＭＮａＰＯ₄、１ＭＮａＣ
ｌ、０．５％サルコシル、２０ｍＭイミダゾール、１０％グリセロール）で洗
浄する。洗浄用緩衝液中の０％から２２％の０．５Ｍイミダゾールの勾配を用い
て、混入物を溶出させる。フラクションコレクターを用いて、洗浄用緩衝液中の
１００％から０．５％イミダゾールの段階勾配で組換えＮＰ（ｒＮＰ）を溶出さ
せる。

【０２５７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって適切な分画を分析して、ｒＮＰの存在を確認する。
最高濃度のｒＮＰを含む分画を貯蔵する（プール１）。さらに、最小濃度のｒＮ
Ｐを含む分画を貯蔵する（プール２）。

【０２５８】貯蔵したｒＮＰを、２５ｍＭヘペス、０．５％サルコシル中で透析する。バイ
オラッドのタンパク質アッセイを用いて、タンパク質濃度を測定する。ＫＱＣＬ
アッセイ（バイオホワイトテイカー）によって、残余内毒素の存在を測定する。
残余ＲＮＡの測定と題されるセクションに記述される方法によって、残余ＲＮＡ
の存在を測定する。

【０２５９】（実施例ＶＩ）大腸菌から得られるｐＱＲ１６３の産生および単離（ａ）細菌、プラスミドおよび培地エッシェリキア・コリ株ＪＭ１０７を、ウシ脾臓ＲＮａｓｅ発現の研究用のプ
ラスミド宿主として使用した。対照ベクターとしては、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２
２、ｐＫＫ２２３．３（ベクターは、ＲＮａｓｅ遺伝子を含有しない）およびｐ
ＱＲ１６２（２つのシストロン断片を含むが、誤った方向である）が挙げられる
。

【０２６０】栄養寒天（２％（ｗ／ｖ）細菌学上の寒天で固化させたオキソイド栄養ブロス
）または栄養ブロス（オキソイド）のいずれかで一夜、育成を行った。プラスミ
ドレベルを維持するために、毎週、プレートを予備培養し、それによりグリセロ
ール・ストックから最初に培養した。新たなプレートから得られる単独コロニー
を使用して、出発培地に接種した。３０℃で、ＲＮａｓｅを産生する細胞の育成
を行い、そして対照を３７℃で育成した。

【０２６１】（ｂ）ＩＰＴＧを用いたｐＱＲ１６３細胞の誘導プラスミドｐＱＲ１６３で形質転換された大腸菌株ＪＭ１０７細胞（図７）を
、４〜５時間、２８℃で１００μｇＡｐ／ｍｌを含有する２００ｍｌの栄養ブロ
スで育成した。１ｍｌのアリコート量を取り、そして５５０ｎｍでの吸光度読取
によって成長を評価した。いったん、指数的段階（およそ０．６００ＯＤ₅₅₀）
にあると決定されると、ＩＰＴＧを、０．５ｍＭの最終濃度まで添加した。一夜
成長を継続し、そしてその後、細胞を回収した。

【０２６２】（ｃ）プラスミド単離ＢｉｒｎｂｏｉｍおよびＤｏｌｙ法（１９７９年）に基づいてキアゲン・キッ
トを使用して、小規模プラスミド単離を行った。サンプルを２つの群に等量に分
割した。１つの群の回転沈降ペレットを、ＲＮａｓｅを含有する緩衝液に再懸濁
させ、そして他方は、ＲＮａｓｅを含まない緩衝液に再懸濁させた。調製段階の
サンプルを取り、そして未消化およびＥｃｏＲＩ消化したＤＮＡサンプルと一緒
に、１％アガロースゲル（１ＭのＴＥ緩衝液、ＥｔＢｒ０．５μｇｍｌ^-1）にか
けた。

【０２６３】（ｄ）ｐＱＲ１６３およびｐＫＫ２２３．３ＲＮＡ濃度の定量コンピューター・ソフトウエアー・パッケージを用いて、中程度の規模の調製
用ゲルを分析した。λＰｓｔＩおよびλＨｉｎｄＩＩＩマーカーの相対的強度お
よび濃度を使用して、ｐＫＫ２２３．３（対照）およびｐＱＲ１６３の透明溶解
液およびフロー段階でのＲＮＡの相対的強度および濃度を測定した。

【０２６４】結果（ａ）ミニ調製プラスミドｐＫＫ２２３．３、ｐＱＲ１６３、ｐＱＲ１６２、ｐＵＣ１８およ
びｐＢＲ３２２を、全て精製し、そしてフロー、２回の洗浄および溶出段階を維
持した。その後、精製プラスミドＤＮＡを、ＥｃｏＲＩで消化し、そして図８に
見られるとおり１％アガロースゲルに掛けた。ＤＮＡサンプルに見られる２つの
バンドの最も遠くまで移動するのは、スーパーコイルプラスミドであり、そして
他方は、プラスミドの開放環状形態である。ＥｃｏＲＩでの消化で、線状バンド
が見られ、それにより、プラスミドが、制限酵素のための部位を含むことが示さ
れている。ｐＱＲ１６２およびｐＫＫ２２３．３は、追加のバンドを示す。ｐＱ
Ｒ１６２は、二量体形態のプラスミドを含むのに対して、ｐＫＫ２２３．３の場
合には、染色体ＤＮＡを、その方法の溶解段階で共有するため、カラムに掛ける
ことができた。ｐＱＲ１６２で消化したレーンでの汚れは、おそらく、外来ＤＮ
Ａ流入か、またはゲルに組込まれるためである。その後、ミニ・プラスミド調製
の段階も、ゲルにかけた（図９参照）。比較では、再懸濁緩衝液中のＲＮａｓｅ
の存在または不在は、ｐＫＫ２２３．３のためのゲル上に見られるＲＮＡの量に
明確な影響を及ぼすことが明らかに分かることができる。しかし、ｐＱＲ１６３
における影響は、緩衝液中のＲＮａｓｅなしのサンプルに存在するＲＮＡの量で
僅かな増加をしながらも、ただほんのわずかである。両方のプラスミド調製では
、ＲＮＡの主要部は、カラムの第一の洗浄段階によって除去される。

【０２６５】（ｂ）ミニ調製その後、対照プラスミドｐＫＫ２２３．３およびｐＱＲ１６３を使用してミ
ニ調製を行った。接種後、４〜５時間、振蘯フラスコ内にある２００ｍｌの培地
中で細胞を育成した。Ａ_bs５５０ｎｍで分光光度計を用いて成長を監視した（図
１０）。

【０２６６】ｐＫＫ２２３．３およびｐＱＲ１６３の両方を、ｔａｃプロモーターによって
制御し、それで、ＩＰＴＧで誘導することができる。この成長曲線は、２つのプ
ラスミド中での密接に相互に関連した成長を示し、そして成長が指数期に近づい
ているときを示す。これが、大量死が起こる前に最大細胞容量がある所である場
合、それは、培養物が指数期で誘導されるのに有益である。

【０２６７】誘導に続いて、培養物を一夜育成し、そしてその後、ミニ調製法（キノゲン）
を使用して、プラスミドを単離した。さらに、サンプルを、再懸濁緩衝液中にＲ
Ｎａｓｅを有するもの、および有しないものに分割し、そして消化および未消化
ＤＮＡを、１％アガロースゲルに掛けた（図１１）。

【０２６８】ｐＫＫ２２３．３およびｐＱＲ１６３の両方は、スーパーコイル化および開放
環状プラスミドバンドを示している。他のバンドの存在は、レーン３、５、７お
よび９に見られるとおりモノマーおよびダイマー形態のプラスミドの存在を示す
。さらに、染色体ＤＮＡの存在を示す多くのバンドがあり、そしてそれは、溶解
の時間を超過することによるか、または溶解段階の間荒っぽく混合することによ
り引起され得た。ＤＮＡのこれらの形態全ては、ＥｃｏＲＩで消化させたときに
直線状になるように見える。ＲＮＡが、カラムによって除去されたときに、ＲＮ
ａｓｅを用いるか、またはなしの調製のこの段階で、見られるＲＮＡはない。し
かし、それは、他の混入物除去のためのカラムの効力に影響を及ぼす。その後、
透明にした溶解液、洗浄、フローおよび溶出段階のＤＮＡを、１％アガロースゲ
ルに掛けた（図１２）。

【０２６９】ｐＱＲ１６３が、ｐＫＫ２２３．３のものよりわずかに少ない程度のＲＮＡを
有しながら、ＲＮＡ濃度は、透明にした溶解およびフロー段階でＲＮａｓｅを含
む緩衝液を有する両方のプラスミドでほんのわずかに高いことが分かる。しかし
、なんらＲＮＡが、再懸濁緩衝液に添加されていないサンプルでは、ｐＫＫ２２
３．３が、ＲＮａｓｅ産生プラスミドｐＱＲ１６３のものよりいっそう多い量の
ＲＮＡを有することが明らかに分かる。実際は、ｐＱＲ１６３は、別のＲＮａｓ
ｅが存在するサンプルのものよりほんのわずかに多いＲＮＡを含む。ＲＮＡは、
最初の２つのプラスミド単離段階に存在し、透明化溶解液およびフローサンプル
のものであることのみが分かった。

【０２７０】ｃ）コンピューター分析コンピューター・ソフトウエアーは、第二の三重線λＰｓｔＩバンド（１４．
３２ｋｂ）と比較する上でＲＮＡの濃度を定量するために、追加のＲＮａｓｅな
しのＲＮＡバンドの強度に関連して使用された。しかし、ｐＱＲ１６３バンドは
、厳密に正確な分析が行われ得た前に、拡散した。したがって、ｐＱＲ１６３バ
ンドのバンド強度は、写真の使用による強度に関連した。取られた透明化溶解液
段階は、マーカー強度の３分の２であり、そしてフロー段階は、３分の１である
。強度において莫大な差異のため、明確な写真記録を生じるために、強度を記録
した（図１３）。

【０２７１】ＲＮＡバンドは、フロー段階より透明化溶解液で両方のプラスミドに強度が高
いことを示した。ｐＫＫ２２３．３は、ＲＮＡが、ＲＮａｓｅ遺伝子を含有する
プラスミドによって分解されるべきであることを示すｐＱＲ１６３に見られるも
のより平均６４倍（ＣＬ＝５８、Ｆ＝７０）大きいＲＮＡ結合の強度を示すこと
が分かった。

【０２７２】その後、マーカーのバンド濃度を、測定し、そしてＲＮＡバンド濃度を分析す
るのに使用した（図１４）。

【０２７３】ＲＮＡバンド濃度は、ｐＫＫ２２３．３については２２４．０ｎｇ・μｌ^-1（
ＣＬ）および１４７．４０ｎｇ・μｌ^-1（Ｆ）であり、そしてｐＱＲ１６３につ
いては４．２１ｎｇ・μｌ^-1（ＣＬ）および２．１１ｎｇ・μｌ^-1（Ｆ）である
ことが決定された。これは、ｐＱＲ１６３でのＲＮａｓｅ遺伝子は、ＲＮａｓｅ
を十分に発現していることを示す。

【０２７４】検討プラスミド単離物は、スーパーコイル化し、そして開放環状種のプラスミドＤ
ＮＡを一定して産生し（図８、９、１０、１１および１２）、それにより、技術
の効力が示された。移動したスーパーコイル化形態は、さらに、分子の極度の小
型化のためであるのに対して、開放環状形態は、プラスミドを複製するときに見
られる。しかし、ある種の場合では、プラスミドおよび染色体ＤＮＡの単量体お
よび二量体のような他のバンド化パターンが見られた（図８および１２）。制限
消化を使用して染色体ＤＮＡから多量体形態を区別できる。多くの形態を示すプ
ラスミドは、１つの定義されたバンドへの消化で線状になる（図８）。ゲノムＤ
ＮＡは、消化に続いて線状にならず、そしてゲルに汚れが観察される（図１２）
。染色体ＤＮＡは、荷電により溶解および中和段階の間に産生されうる。

【０２７５】追加のＲＮａｓｅの不在下でのＲＮＡバンド強度の分析（図１３および１４）
は、ｐＫＫ２３３．３が、ｐＱＲ１６３で見られるものより、透明な溶解および
フロー段階についておよそ５８および７０倍大きな強度のバンドを示すことを表
した。これは、それぞれ、透明な溶液およびフロー段階についておよそ２２０ｎ
ｇμｌ^-1および１４５ｎｇμｌ^-1のバンド濃度における差異であると計算される
。しかし、ｐＱＲ１６３バンドのＲＮＡの強度を測定する視覚的指針を使用する
ことは、不確実である可能性があり、したがって、適切な値を重要視する。しか
し、一般のバンド差異が明らかに見られ（図１２）、したがって、ｐＱＲ１６３
が、有効な濃度のＲＮａｓｅを産生していることが示される。実際に、ＲＮａｓ
ｅを有するか、または有しないｐＱＲ１６３サンプルの間にバンド差異はほとん
ど見られないのに対して、ＲＮａｓｅ遺伝子を有しないベクターｐＫＫ２２３．
３は、際立ったＲＮＡ差異を示す（図９および１２）。将来、コンピューターバ
ンド分析の別の定量法を使用し、そしてバンド強度は、マーカーバンドよりむし
ろ市販のＲＮＡサンプルの既知濃度に関連する。

【０２７６】ここで使用される小規模プラスミド単離は、３つの基本的段階から構成される
。すなわち、（ｉ）細菌溶解液の調製および透明化、（ｉｉ）カラム膜上へのＤ
ＮＡの吸着、および（ｉｉｉ）プラスミドＤＮＡの洗浄および溶出である。カラ
ムでは、高塩緩衝液条件下でプラスミドＤＮＡを選択的に吸着し、そして低塩緩
衝液で溶出するシリカゲル膜（キアゲン）が使用される。ＲＮＡは、プラスミド
単離手段の透明な溶解液およびフロー段階に存在することが分かった（図９およ
び１２）。継続段階には、選択的に吸着されない場合、ＲＮＡ、細胞タンパク質
および代謝物のような混入物を除去する、カラムの洗浄のため、ＲＮＡは現れな
かった。しかし、そのカラムは、「最適化緩衝液」（キアゲン）、すなわち、Ｒ
ＮａｓｅＡを含有するものを使用するときに使いやすいとのみ記述される。した
がって、再懸濁緩衝液中にＲＮａｓｅの添加をしないサンプルが、ｐＫＫ２２３
．３サンプル中で高い濃度のＲＮＡを産生したが、さらに、結合部位についてＤ
ＮＡと競合することによって、クロマトグラフィー段階の有効性を減少させる可
能性もある。

【０２７７】したがって、ＲＮａｓｅ産生のための遺伝子を含むプラスミドを使用すること
は、別々のＲＮａｓｅ添加の必要性を回避し、なお、カラム分離の有効性は、さ
らに維持される。したがって、安全な医薬グレードの純粋なプラスミド産物は、
本発明の方法を使用して単離することができる。

【０２７８】（実施例ＶＩＩ）ＲＮａｓｅＡの染色体挿入物のための攻略法この攻略法は、ＲＮａｓｅ遺伝子を、宿主株の染色体に挿入するための選択的
攻略法であり、そして、大腸菌宿主株の染色体へのＲＮａｓｅ遺伝子の組込みと
題される先のセクションに記述されるものに加えてである。

【０２７９】ｐＱＲ１６３から得られるｔｒｃ−ＲＮａｓｅＡ融合物を、ＢａｍＨＩ断片（
７７５ｂｐ）として削り、そしてＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で満たし
た５‘’オーバーハングによって平滑末端にした。プラスミドｐＮ１Ｄ２７４Ｅ
ｋａｎＩを、ＢｂｓＩで切断し、そして８６５１ｂｐ線状プラスミドを残してｌ
ａｃｌ^qsコーディング配列のほとんどを含む領域を除去した。これを、５‘’オ
ーバーハング充填によって平滑末端にさせ、そして仔ウシ腸アルカリホスファタ
ーゼ（ＣＩＡＰ）を使用して脱リン酸化されて、挿入物の不在下で再循環（リサ
ークラリゼーション）を予防した。３’を充填することは、クレノーポリメラー
ゼでＤＮＡ断片末端を凹ませ、そしてＣＩＡＰでの脱リン酸化を、米国マサチュ
ーセッツ州ビバリー、トーザー・ロード３２のニュー・イングランド・バイオラ
ボズ・インク．のザ・ニューイングランド・バイオラボズのカタログ（１９９８
／１９９９）に記述されるとおり行った。ｔｒｃ−ＲＮａｓｅＡ融合体を含む平
滑ＢａｍＨＩ断片を、ｐＮ１Ｄ２７４Ｅｋａｎｌにライゲートさせて、挿入プラ
スミドｐＲＮａｓｅＡを形成する。ｐＲＮａｓｅＡの構築は、図１５に例示され
る。

【０２８０】カルシウム競合株ＪＭ１０７細胞（ｅｎｄＡ１、ｔｈｉ、ｇｙｒＡ９６、ｈｓ
ｄＲ１７（ｒ_k ^-、ｍ_k ⁺）、ｒｅｌＡ１、ｓｕｐＥ４４、Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ
）、［Ｆ‘’ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩ９ＺΔＭ１５］）を、プラス
ミドｐＴＰ２２３で形質転換させて、それにより１２μｇ μｌ^-1テトラサイク
リン（Ｔｅｔ）を含有するＬＢ寒天プレート上で形質転換体が選択された。ｐＴ
Ｐ２２３は、ｔｅｔおよびλｒｅｄ組換え機能ｂｅｔおよびｅｘｏ、およびＲｅ
ｃＢＣＤ阻害λｇａｍ（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０巻、２
０６３−２０７１頁、１９９７年）を含む。ＲｅｃＡ⁺株は、このシステムを使
用すると組換え効率が高いので選択される。カルシウム競合株細胞を調製し、そ
して形質転換は、Ａｕｓｕｂｅｌら（分子生物学における最近のプロトコール、
上記文献）に記述のとおりに行われた。

【０２８１】ＡａｔＩＩ、ＮｄｅＩ、ＳａｃＩおよびＸｍｎＩのような、ｐＵＣ１８骨格で
のみ切断する酵素を使用して、ｐＲＮａｓｅＡを線状にさせる。カルシウム競合
株ＪＭ１０７（ｐＴＰ２２３）を調製し、そして線状ｐＲＮａｓｅＡで形質転換
させて、それにより５０μｇ μｌ^-1カナマイシンを含むＬＢ寒天プレート上で
組換え体が選択される。生じる株は、ＪＭＲＮａｓｅＡと称される。

【０２８２】プレートアッセイおよびアガロースゲル電気泳動によってＲＮａｓｅＡ活性に
ついて試験するために、ＪＭＲＮａｓｅＡ（ｐＴＰ２２３）およびＪＭ１０７（
ｐＴＰ２２３）（陰性対照）を、Ｔｅｔを有するＬＢブロス中で中期指数期まで
育成し、そして回収の前に２時間、０．５ｍＭＩＰＴＧを添加することによっ
て誘導する。対照は、ＩＰＴＧの添加なしに行う。ＲＮａｓｅプレートアッセイ
を、以下のとおり行う。Ｔｅｔを有するＬＢ寒天プレート上で、１０μｌのＨ₂
Ｏ中の０．１μｇの市販のＲＮａｓｅＡと一緒に１０μｌの各培養液をそこにス
ポット付けする。これを、一夜３７℃でインキュベートし、その後、１１．０ｍ
ＭのＥＤＴＡ中の０．３％（ｗ／ｖ）パン酵母を含む６．０ｍｌ軟質寒天を被せ
、そしてさらに４時間インキュベートする。その後、１０ｍｌの１．０ＭＨＣ
ｌを添加することによってプレートを展開させ、そして写真を撮った。予測され
る結果は、表１に示される。アガロースゲル電気泳動については、キアゲンのミ
ニ調製を、細胞再懸濁緩衝液（１００μｇｍｌ^-1）にＲＮａｓｅＡを添加する
ことを伴うか、または伴わない、培養基（製造者のプロトコールにしたがって）
で行う。その後、５μｌの各プラスミド調製品を、０．８％アガロースゲルにか
け、そして電気泳動を、５Ｖｃｍ^-1で行う。そのゲルを、Ｓｙｂｒ緑染料で後
染色し、そして５４５ｎｍでのモレキュラー・ダイナミックス・フルオイメージ
ャーで可視化させて、ＲＮＡを検出する。予測される結果は、表２に要約される
。

【０２８３】

【表１】

【０２８４】

【表２】

【０２８５】（実施例ＶＩＩＩ）周辺に配置されたＲＮａｓｅＡの活性を示す２つのプラスミド・システムの使用
治療用プラスミドｐＴＸ０１６１を、癌の化学療法、遺伝子特異的酵素プロド
ラッグ療法の形態として使用して、影響された細胞中のＤＮＡの架橋を促進する
。これは、プロドラッグＣＢ１９５４（Ｄｒａｂｅｋ，Ｄ．、Ｇｕｙ，Ｊ．、Ｃ
ｒａｉｇ，Ｒ．およびＧｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．、トランスジェニックマウスでの
細菌性ニトロリダクターゼの発現は、プロドラッグＣＢ１９５４による特異的細
胞死滅を起す、ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、４巻、９３−１００頁、１９９７年
）による大腸菌Ｂニトロリダクターゼ酵素の活性化によって達成される。ｐＴＸ
０１６１（ＣｏｌＥＩｏｒｉ）を担持する菌株でＲＮａｓｅ活性を試験するた
めに、低コピー数のプラスミドｐＱＲ１６３から得られるＲＮａｓｅＡ遺伝子（
ＣｏｌＥＩｏｒｉも）を、適合性のある起点を有する別のプラスミドに主にｐ
ＭＭＢ６６ＥＨをクローニングする。ＰＭＭＢ６６ＥＨは、アンピシリン耐性を
供与する８．８ｋｂ低コピー数プラスミドである。このベクターから生じるＲＮ
ａｓｅＡ活性の発現は、宿主細胞のゲノムへの組込み前に、コピー数を減らせる
効果の決定を可能にする。ＲＮａｓｅＡ遺伝子をｐＭＭＢ６６ＥＨにクローニン
グさせるための攻略法は、図１９に示され、そして以下のとおり記述される。

【０２８６】１．ＥｃｏＲＩでの消化を介してｐＱＲ１６３から生じる、生来のシグナル配列
を含めたＲＮａｓｅＡＯＲＦを得て、＜５００ｂｐの断片を得る。２．分離用１％アガロースゲルを介してＲＮａｓｅＡ断片を単離する。３．ＰＭＭＢ６６ＥＨを、ＥｃｏＲＩで消化し、そして続いて、仔ウシ腸のアル
カリ性ホスファターゼで処理することによって５’ホスフェートを除去する。４．ＥｃｏＲＩ断片のＲＮａｓｅＡ遺伝子の、ＥｃｏＲＩで線状にしたｐＭＭＢ
６６ＥＨへのライゲーション。５．構築物での競合体大腸菌ＪＭ１０７の形質転換、およびアンピシリンを含む
栄養寒天プレート上で形質転換体の選択。６．ＥｃｏＲＩで消化された形質転換体コロニーから育成される培養物からＤＮ
Ａをミニ調製することによって、正しいクローンをスクリーニングして、挿入物
およびＰｓｔＩの存在を確認して、配向性を決定する。７．酵母ＲＮＡを含む平衡栄養寒天（０．１ＭトリスＣｌ、ｐＨ７．０）上に形
質転換体を再度載せることによって、挿入物の正しい配向性および発現を確認す
る。ＲＮａｓｅ活性は、２ＭＨＣｌをそのプレートに添加し、続いて一夜育成
することによって検出することができる。ＲＮａｓｅ活性を発現するコロニーを
囲んで透明な領域が存在する一方で、ＲＮＡの領域は、ＨＣｌを添加した後、白
色沈殿物を産生する。

【０２８７】しかし、ｐＱＲ１６３およびｐＴＸ０１６１の両方が、異なる抗生物質耐性遺
伝子（ｐＱＲ１６３は、ａｍｐを有し、ｐＴＸ０１６１は、ｔｅｔを有する）を
担持したときに、両方が、複製の起点から由来するＣｏｌＥＩを含有するという
事実の代わりに、培地が、アンピシリンおよびテトラサイクリンで補足された場
合に同じ細胞中のｐＱＲ１６３およびｐＴＸ０１６１を維持することが可能であ
った。

【０２８８】ｐＱＲ１６３を、カルシウム競合体ＤＨ１（ｐＴＸ０１６１）に形質転換させ
た。二重抗生物質選択プレート上でコロニーを得た。これらの内１２個を単離し
、そしてＤＮＡを、キアゲンのミニ調製によって抽出させた。結果では、不適合
なプラスミドであるにもかかわらず、ｐＱＲ１６３およびｐＴＸ０１６１が、宿
主細胞中で同時に存在していることが示された（図１６）。

【０２８９】ＲＮａｓｅＡ遺伝子がまだ機能性があるかどうかを決定するために、ＤＨ１（
ｐＴＸ０１６１）（ｐＱＲ１６３）のクローンを、ＲＮａｓｅ遺伝子を含まない
ＤＨ１（ｐＴＸ０３４０）の対照と一緒に分析した。これらを、中期指数期まで
それらの対応の抗生物質を有するＬＢブロス中で培養し、その後、ＩＰＴＧを加
えて、ＲＮａｓｅＡ遺伝子を誘導し、そしてさらに１．５時間、インキュベーシ
ョンを継続した。ミニ調製溶液（先に記述されるように）中にＲＮａｓｅＡを有
するか、または有しないプラスミドＤＮＡ抽出物を、アガロースゲル電気泳動に
掛け、臭化エチジウムで染色し、そしてＵＶ遷移照明装置で可視化させた。ＤＨ
１（ｐＴＸ０３４０）対照に存在するより小さな、ＤＨ１（ｐＴＸ０１６１）（
ｐＱＲ１６３）中のＲＮＡバンドの形態でＲＮａｓｅ活性の証拠がある（図１７
）。

【０２９０】ＤＨ１（ｐＴＸ０１６１）（ｐＱＲ１６３）中のＲＮａｓｅＡの活性を例示す
るために、先に記述されるとおりプレートアッセイを行った。試験コロニーおよ
びウシのＲＮａｓｅＡ陽性対照を囲むＲＮＡ消化のゾーンがあったが、ＤＨ１（
ｐＭＭＢ６６ＥＨ）の陰性対照を囲むものはなかった（図１８）。

【０２９１】本発明に有用な細胞成分本発明に有用なタンパク質本発明の方法に有用なタンパク質は、本発明に有用であるとされるタンパク質
に限定されないが、レセプター、酵素、リガンド、制御因子、および構造タンパ
ク質のようなものが挙げられる。治療用タンパク質としても、核内タンパク質、
細胞質タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、分泌タンパク質、原形質膜結合
タンパク質、血清タンパク質、ウイルス性抗原、細菌性抗原、原生動物抗原およ
び寄生生物抗原が挙げられる。

【０２９２】本発明に有用な治療用タンパク質として、脂質タンパク質、糖タンパク質およ
びリン酸タンパク質も挙げられる。本発明の方法を用いて発現させることができ
るタンパク質またはポリペプチドとしては、ホルモン、成長因子、神経伝達物質
、酵素、凝固因子、アポ脂質タンパク質、レセプター、医薬品、癌遺伝子、腫瘍
抗原、腫瘍サプレッサー、構造タンパク質、ウイルス性抗原、寄生生物抗原およ
び細菌性抗原が挙げられる。これらの化合物の特定の例としては、プロインシュ
リン、成長ホルモン、ダイストロフィン、アンドロゲンレセプター、インシュリ
ン様成長因子Ｉ、インシュリン様成長因子ＩＩ、インシュリン様成長因子結合タ
ンパク質、表皮成長因子ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＰＤＧＦ、血管新生因子（酸
性線維芽成長因子、塩基性線維芽成長因子およびアンギオゲニン）、マトリック
スタンパク質（ＩＶ型コラーゲン、ＶＩＩ型コラーゲン、ラミニン）、フェニル
アラニン・ヒドロキシラーゼ、トリプシン・ヒドロキシラーゼ、癌遺伝子（ｒａ
ｓ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｓｉｓ、ｊｕｎ）、Ｅ６またはＥ７形質
転換配列ｐ５３タンパク質、Ｒｂ遺伝子産物、サイトカイン・レセプターＩｌ−
１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ウイルス性カプシドタンパク質、および免疫応答を誘
導するのに使用できるウイルス、細菌および寄生生物から得られるタンパク質、
および体内で有用な重大さのある他のタンパク質が挙げられる。組込むことがで
きる化合物は、組込むべきタンパク質またはポリペプチドのための核酸配列の利
用可能性によってのみ制限される。当業者は、さらに多くのタンパク質およびポ
リペプチドが確認できる場合に、それらを、選択の非ウイルス性ベクターに組込
まさせ、本発明の方法によって形質導入させ、そしてヒトの組織を含めて哺乳類
組織で発現させることができることを容易に認識する。

【０２９３】本発明に有用なＤＮＡ配列１．毒素をコードする遺伝子本発明に有用な遺伝子の例としては、限定されないが、以下のとおりジフテリ
ア毒素、シュードモナス属内毒素、コレラ毒素、百日咳毒素などをコードする遺
伝子が含まれるこのような薬剤をコードするものが挙げられる。すなわち、ＨＩ
Ｖ−１感染を阻害するためのジフテリア毒素−ＩＬ２融合体（Ｚｈａｎｇら、１
９２、Ｊｏｕｒ．ＡｃｑｉｒｅｄＩｍｍｕｎｅＤｅｆｉｃｉｅｎｃｙＳｙ
ｎｄｒｏｍｅ５巻；１１８１頁）、ＨＩＶウイスル産生を阻害するためのジフ
テリア毒素Ａ鎖（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、ＡＩＤＳＲｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏ
．８巻：３９頁、１９９２年およびＣｕｒｅｌら、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ
．４巻：７１頁、１９９３年）；ウシ白血病ウイルス感染の抑制用のジフテリア
毒素Ａ鎖・リポソーム複合体（Ｋａｋｉｄａｎｉら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．３７巻、７１３頁、１９９３年）；Ｂ細胞毒性についての免疫グロ
ブリン・エンハンサーおよびプロモーターと結合したジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子
（Ｍａｘｗｅｌｌら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５１巻、４２９９頁、１９９１年
）；Ｔａｔ−およびＲｅｖ−活性化発現のジフテリア毒素Ａ遺伝子（Ｈｒｒｉｓ
ｏｎ、Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．２巻、５３頁、１９９１年）；ＨＩＶ感
染細胞を死滅させるためのジフテリア毒素−ＣＤ４融合体（Ａｕｉｌｏら、Ｅｕ
ｒ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｏｒｇ．Ｊｏｕｒ．、１１巻、５７５頁、１９９２年）
である。

【０２９４】本発明に有用である他の毒素としては、限定されないが、以下のものが挙げら
れる。調製した毒性レトロウイルスは、Ｂｒａｄｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃ
ａ．Ｓｃｉ．９１巻、３６５頁、１９９４年およびＣａｒｕｓｏら、Ｂｏｎｅ
ＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔ、９巻、１８７頁、１９９２年で開示さ
れる。ＥＢＶ感染に対する毒素は、Ｈａｒｒｉｓら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１３４巻、８５頁、１９９１年に開示され、そしてポリオウイスルに対して
は、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｊｏｕｒ．Ｖｉｒｏｌ．６６巻、１９７１頁、１
９９２年に開示される。インフルエンザウイルスに対する毒素は、Ｂｒｏｎら、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３３巻、９１１０頁、１９９４年に開示される。

【０２９５】２．免疫活性剤をコードする遺伝子本発明に有用である別の剤としては、免疫活性剤、すなわち、ウイルスに対す
る免疫応答を活性化させることによってウイルス感染または産生と戦う剤が挙げ
られる。このような剤としては、限定されないが、一般にウイルスに対するサイ
トカイン（Ｂｉｒｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻、５３０
頁、１９９４年）；ＳＩＶに対して可溶性のＣＤ４（Ｗａｔａｎａｂｅら、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．８８巻、１２６頁、１９９１年）；ＨＩＶ−
１およびＳＩＶに対するＣＤ４−免疫グロブリン融合体（Ｌａｎｇｎｅｒら、Ａ
ｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１３０巻、１５７頁、１９９３年）；ＨＩＶ感染に対す
るＣＤ４（８１−９２）基本のペプチド誘導体（Ｒａｕｓｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｐａｒｍａｃｏｌ．４３巻、１７８５頁、１９９２年）；ＨＩＶ感染に対
するリンパ細胞内毒性抗体（Ｓｚａｂｏら、Ａｃｔａ．Ｖｉｒｏｌ．３８巻、
３９２頁、１９９２年）；ＨＩＶ感染に対するＩＬ−２（Ｂｅｌｌら、Ｃｌｉｎ
．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９０巻、６頁、１９９２年）；および一般にウイ
ルスに対する抗Ｔ細胞レセプター（Ｎｅｗｅｌｌら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａ．
Ｓｃｉ．６３６巻、２７９頁、１９９１年）が挙げられる。

【０２９６】３．抗ウイルス薬をコードする遺伝子本発明に有用な別の抗ウイルス剤としては、抗ウイルス活性を示し、そして遺
伝子の直接産物であるか、または薬剤の前駆体をコードする遺伝子の産物である
薬剤が挙げられ、それにより、その薬剤は、細胞中での生合成経路によって合成
される。例えばレトロウイルスについての複製サイクルでの薬剤組込みの標的と
しては、（１）結合および進入、（２）逆転写酵素、（３）転写および翻訳、お
よび（４）ウイルス突然変異および出芽が挙げられる。ＨＩＶについてのウイル
スの結合および進入の代表的阻害剤としては、組換え体可溶性ＣＤ４、免疫接着
物、ペプチドＴおよびハイペリシンが挙げられる。ヌクレオシド逆転写酵素阻害
剤としては、ジドブジン、ジダノシン、ザルシタビンおよびスタルジンが挙げら
れる。ホスカルネット、テトラヒドロイミダゾベンゾジアゼピンエチオン化合物
、およびネビラピンは、ある種の非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤である。転写
および翻訳の阻害剤としては、ＴＡＴ遺伝子およびＧＬＱ２２３のアンタゴニス
トが挙げられる。カスタノスペルミンおよびプロテアーゼ阻害剤は、ウイルスの
発芽および成熟に干渉する。このような薬剤としては、それに限定されないが、
ヌクレオシドまたはヌクレオチド類縁体、およびＨａｒｒｅｌｌら、Ｄｒｕｇ
Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２２巻、１２４頁、１９９４年（デオキシ−グアニ
ン）；Ｆｉｌｌｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．１６巻、３３９頁、
１９９３年（ダイモ−ルビシン）；Ｏｈｒｖｉら、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ
Ｓｙｍｐ．２６巻、９３頁、１９９０年（抗ウイルス性ヌクレオシド）；Ｈｕ
ｄｓｏｎら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．５７巻、６７５頁、１
９９３年（チアルビン）；Ｓａｌｈａｎｙら、Ｊｏｕｒ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６８巻、７６４３頁、１９９３年（５’−リン酸ピリドキサル）；Ｄａｍａｓ
ｏら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒａｌ．１３４巻、３０３頁、１９９４年（シクロスポリ
ンＡ）；Ｇａｌｌｉｃｃｈｉｏら、Ｉｎｔ．Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５巻
、２６３頁、１９９３年（ジデオキシヌクレオシド薬剤）；およびＦｉｏｒｅら
、Ｂｉｏｌ．Ｓｏｃ．Ｉｔａｌ．Ｂｉｏｌ．Ｓｐｅｒ．６６巻：６０１頁、１９
９０年（ＡＺＴ）に記述されるような細胞の生合成経路の産物が挙げられる。

【０２９７】４．遺伝子療法による患者の治療のために有用なタンパク質または酵素をコード
する遺伝子遺伝子療法による患者の治療のために有用なタンパク質または酵素をコードす
る遺伝子としては、ゴーシェ病用のβ−グルコセルブロシダーゼをコードする遺
伝子、血友病のためのＸＩＩＩおよびＩＸ因子、およびプロドラッグ治療に使用
するための酵素を活性化するプロドラッグ（例えば、遺伝子特異的酵素のプロド
ラッグ療法に使用するための細菌のニトロリダクターゼ（ＧＤＥＰＴ））が挙げ
られる。

【０２９８】本発明に有用なベクター本発明に有用なベクターとしては、以下の特徴を保有するベクターが挙げられ
る。

【０２９９】ｉ）高コピー数の複製のための細菌の起点比較的高いコピー数を、すなわち、２０〜４０コピー／細胞から１０００〜２
０００コピー／細胞の範囲で有するベクターは、本発明に特に有用である。例え
ば、複製のｐＵＣ起点を含むベクターは、本発明の方法に好ましい。複製のｐＵ
Ｃ起点は、プラスミドＤＮＡのさらに有効な複製を可能にし、そして例えば、ｐ
ＢＲ３２２起点よりプラスミドコピー数／細胞で１０倍増大を生じる。生じる高
いコピー数は、染色体ＤＮＡ、ＲＮＡ、細胞タンパク質およびコファクターに対
するプラスミドＤＮＡの比を大いに増大させ、プラスミド収量を改善し、そして
より簡単な下流精製を促進する。

【０３００】ｉｉ）小さな、そして安定なベクター骨格ここに記述される方法により使用されるベクターの骨格が、小さい、すなわち
、５ｋｂ未満、そして好ましくは１〜３ｋｂであることが本発明に好ましい。語
句「ベクター骨格」は、細菌宿主中のベクターを維持しそして増殖させるのに必
要な細菌のＤＮＡに該当する。骨格および挿入物の両方を含めて本発明のベクタ
ーは、寸法で１５〜５０ｋｂの桁にあるか、またはいっそう大きい。したがって
、本発明に有用なベクター骨格は、およそ１０〜５０ｋｂの、またはそれ以上の
挿入物を担持する能力がある。挿入物としては、任意の生物から得られるＤＮＡ
を挙げることができるが、好ましくは、哺乳類起源のものであり、そして治療用
タンパク質をコードする遺伝子に加えて、プロモーター、ポリアルデヒド化配列
、エンハンサー、遺伝子座制御領域のような制御配列を挙げることが可能である
。治療用タンパク質をコードする遺伝子は、ゲノム起源のものであってよく、そ
してしたがって、そのゲノム組織に反映されるときにエキソンおよびイントロン
を含有するか、または相補的ＤＮＡに由来しうる。

【０３０１】ベクターは、安定的に受継がれ、すなわち、ベクター骨格は、好ましくは、ト
ランスポゾンのように、再配列、失欠などをしやすい不安定な構成要素を含まず
、そして選択的剤の存在下で安定に受継がれる。

【０３０２】本発明による有用なベクターとしては、ｐＥＡβＧｌｕ、ｐＵＣ１８／１９ｔ
ｅｔΔＡｍｐ、ｐＴＸ０１６１、ｐＵＣ１９ｔｅｔ、ｐＧＬ２ＲＳＶ、ｐＧＬ２
ＲＳＶｌｕｃ、ｐＡＩ６ｔｅｔおよびｐＣＤ２ｔａｔＲＺｆｕｌｌが挙げられる
。

【０３０３】ｉｉｉ）治療用遺伝子および制御配列の挿入について安定なポリリンカー本発明による有用なベクターとしては、ベクターを切断すること、および治療
用遺伝子を組込むことにおいて有用である多様な制御部位を含むポリリンカーが
挙げられる。

【０３０４】ｉｖ）他の細菌のタンパク質遺伝子の不在別の細菌遺伝子で、ベクター骨格に担持されるものはないことが本発明に好ま
しい。遺伝子が、治療用ベクターに標的にされた患者の細胞内に存在する、およ
び／または発現する場合、他の細菌遺伝子の不在は、患者が、外来遺伝子または
そのコードされた産物に対する免疫応答を発生する可能性を最小にする。発酵の
間に宿主菌株によって発現される他の細菌遺伝子は、宿主内の代謝負担を生じ、
そしてバイオマスおよびプラスミド収量を減少させる。

【０３０５】ｖ）選択的マーカー遺伝子本発明により有用なベクターとしては、選択可能なマーカー、例えば、細菌テ
トラサイクリン耐性遺伝子のような抗生物質耐性遺伝子を挙げることができる。
テトラサイクリン耐性遺伝子を組込むと、本発明によるプラスミド調製手段での
選択性剤としてテトラサイクリンを使用することを可能にする。テトラサイクリ
ン耐性遺伝子を使用する１つの利点は、テトラサイクリンが、大腸菌で分解され
ず、したがって、いっそう多くのテトラサイクリンを、発酵の間に添加する必要
がないことである。さらに、テトラサイクリンが、医療設定で抗生物質としてよ
り少ない頻度で処方され、そしてｔｅｔに対する有害な応答が、ａｍｐおよび他
のβ−ラクタム抗生物質についてより少ない頻度であるので、テトラサイクリン
耐性遺伝子が、アンピシリン耐性をコードする遺伝子より好ましい。

【０３０６】用量、投与の形態および医薬処方本発明は、ＲＮＡを、細胞成分の調製物から除去する方法を包含する。ＲＮａｓｅも産生する宿主細胞から産生される細胞成分から構成される医薬組
成物は、好ましくは１０⁵〜１０⁸宿主細胞、そしてさらに好ましくは１０⁶〜１
０⁷宿主細胞から調製することが可能である。ＲＮａｓｅを産生する様々の宿主
細胞と同時培養された宿主細胞から産生される細胞の成分から構成される医薬組
成物は、好ましくは、１０⁵〜１０⁸の各々それぞれの宿主細胞、そしてさらに好
ましくは１０⁶〜１０⁷の各々それぞれの宿主細胞から調製されうる。後者の具体
例では、２つの宿主細胞は、１：１比にある培養液に存在するか、または１：１
比にある溶解の点で混合されるのが好ましい。

【０３０７】ここに記述される細胞の成分は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射
可能物として調製しうる。感染前に、液体中の溶液または懸濁液として適切な固
形形態も、調製できる。調製物を、乳化することもできるか、または細胞の成分
を、リポソームに被包させることができる。語句「医薬上許容しうる担体」は、
それが投与される対象においてエレルギー性反応または他の不利な影響を生じな
い担体に該当する。適切な医薬上許容しうる担体としては、例えば、水、生理食
塩水、リン酸緩衝された生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノー
ルなどの内の１つまたはそれ以上、およびそれらの組合せが挙げられる。さらに
、所望の場合、組成物は、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／またはアジ
ュバントのような、少量の助剤物質を含むことができ、そしてそれは、ワクチン
の効力を増強する。有効でありうるアジュバントの例としては、それに限定され
ないが、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−
イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラ
ニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ぶ）、Ｎ−
アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−
（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリル
オキシ）−エチルアミン（ＣＯＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ぶ）、およ
び２％スクアレン／ツイーン８０乳液中の細菌、モノホスホリル脂質Ａ、トレハ
ロース・ジマイコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）から抽出
される３つの成分を含有するＲＩＢＩが挙げられる。アジュバントの他の例とし
ては、ＤＤＡ（臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム）、フロイントの完全
および不完全アジュバントおよびキルＡ（ＱｕｉｌＡ）が挙げられる。

【０３０８】本発明の細胞の成分は、注射、例えば、皮膚内または筋肉内のいずれかによっ
て、非経口に投与することができる。投与の他の形態に適する別の処方としては
、座剤、そしてある種の場合には、経口処方またはエアロゾルとして分布に適切
な処方が挙げられる。座剤としては、従来のバインダーおよび担体は、例えば、
ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドを挙げうる。このような座剤は
、０．５％から１０％まで、好ましくは１％〜２％の範囲で活性成分を含む混合
物から形成しうる。経口処方としては、例えば、医薬グレードのマンニトール、
ラクトース、スターチ・ステアリン酸マグネシウム、サッカリン・ナトリウム、
セルロース、マグネシウムカルボネートなどのように正常に使用される助剤が挙
げられる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続性
放出処方または粉末の形態を取り、そして１０％〜９５％、好ましくは２５〜７
０％の活性成分を含む。

【０３０９】他の具体例他の具体例は、以下の請求項の範囲内にある。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、プラスミドｐＮ１を示す。

【図２】図２は、プラスミドＤＮＡを大腸菌染色体に導入および欠失するための、並び
に、挿入的突然変異誘発および相同的組換えによる大腸菌染色体からの染色体Ｄ
ＮＡの欠失のための、戦略の概略図である。

【図３】図３は、ｐＣＲ３．１ＲＮａｓｅＩで形質転換したＴＯＰ１０Ｆ細胞からのＲ
ＮａｓｅＩの発現を実証している、ＬＢ寒天プレートアッセイである。

【図４】図４は、ｐＵＣ１８ＲＮａｓｅＩで形質転換したＤＨ５α細胞からのＩＰＴＧ
誘導発現を実証している、ＬＢ寒天プレートアッセイである。

【図５】図５は、精製ｐＵＣ１８ＲＮａｓｅＩのアルカリ溶解に対する感度を実証して
いる、ＬＢ寒天プレートアッセイである。

【図６】図６は、ｐＵＣ１８ＲＮａｓｅＩの活性に対する溶解条件の影響を実証してい
る、臭化エチジウムで染色したアガロースゲルである。

【図７】図７は、発現ベクターｐＫＫ２２３．３を基にした、ヘキサペプチドおよびＲ
Ｎａｓｅ前駆体をｔａｃプロモーターの制御下でコードし、アンピシリンとテト
ラサイクリンに耐性を示す、２シストロン組換えプラスミドｐＱＲ１６３を示す
。

【図８】図８は、ミニ調製法を使用して単離した、ＲＮａｓｅを含む懸濁緩衝液による
、単離プラスミドＤＮＡの非消化および消化サンプルを示す。レーン１＆１６、
２＆１５は、それぞれ、λＰｓｔＩおよびλＨｉｎｄＩＩＩマーカーである。各
サンプルのレーンの最初は、非消化サンプルであり、第二のレーンは、消化サン
プルである。非消化サンプルは、５μｌＤＮＡおよび５μｌ添加緩衝液であっ
た。消化サンプルは、５μｌＤＮＡ、１μｌ制限緩衝液、１μｌＥｃｏＲＩ
を含み、３μｌの添加緩衝液を加える前に、２時間消化した。レーン３＆４はｐ
ＱＲ１６２。レーン５＆６はｐＱＲ１６３。レーン７＆８はｐＫＫ２２３．３。
レーン９＆１０はｐＵＣ１８。レーン１１＆１２はｐＢＲ３２２。レーン１３＆
１４は、非消化および消化対照ｐＵＣ１９である。５μｌのマーカーを添加し、
１μｌの市販のｐＵＣ１９を使用した。

【図９】図９は、ＲＮａｓｅ含有／非含有再懸濁緩衝液を使用した、（ａ）ＲＮａｓｅ
遺伝子を含まないベクターｐＫＫ２２３．３、（ｂ）ｐＱＲ１６３、（ｃ）ｐＱ
Ｒ１６２、（ｄ）ｐＵＣ１８および（ｅ）ｐＢＲ３２２の、流動、洗浄および溶
出段階のプラスミドのミニ調製物を示す。ウェルは、５μｌの段階／ＤＮＡサン
プル、５μｌの滅菌蒸留水、および３μｌの添加緩衝液を含んだ。レーン１＆２
および１５＆１６は、それぞれ、λＰｓｔＩおよびλＨｉｎｄＩＩＩ（５μｌ添
加）に対応する。レーン３〜７は、ＲＮａｓｅを含む緩衝液に対応し、８〜１２
は、ＲＮａｓｅを含まない緩衝液に対応する。レーン３＆８は、フロースルーサ
ンプルであり、レーン４＆９は、第一のカラム洗浄であり、レーン５＆１０は、
第二のカラム洗浄であり、レーン６＆７および１１＆１２は、非消化溶出ＤＮＡ
である。レーン１３＆１４は、非消化の市販ｐＵＣ１８対照（１μｌ添加）であ
る。

【図１０】図１０は、ＩＰＴＧを用いて誘導する前の、光学密度の読みにより決定した、
ｐＫＫ２２３．３およびｐＱＲ１６３の増殖曲線を示す。１ｍｌのサンプルを１
時間毎に集め、５５０ｎｍでの読みを、１ｍｌの滅菌栄養ブロスのブランクに対
して測定した。読みは、室温で１ｍｌで１ｃｍの経路のキュベット中で測定した
。指数関数的増殖は０．６００の吸光度であると決定され、その後、サンプルを
ＩＰＴＧで誘導して最終濃度を０．５ｍＭとした。

【図１１】図１１は、中単離法を使用して単離したＲＮａｓｅの存在下／非存在下での消
化および非消化プラスミドＤＮＡを示す。レーン１＆１２および２＆１１は、そ
れぞれ、λＰｓｔＩおよびλＨｉｎｄＩＩＩ（５μｌ添加）である。各ＤＮＡレ
ーンの最初は、非消化サンプルであり、第二は消化サンプルである。非消化サン
プルは、５μｌＤＮＡおよび５μｌ添加緩衝液であった。消化サンプルは、５
μｌＤＮＡ、１μｌ制限緩衝液、１μｌＥｃｏＲＩを含み、３μｌの添加緩
衝液を加える前に、２時間消化した。レーン３＆４はＲＮａｓｅを含むｐＫＫ２
２３．３。レーン５＆６はＲＮａｓｅを含まないｐＫＫ２２３．３。レーン７＆
８はＲＮａｓｅを含むｐＱＲ１６３。レーン９＆１０はＲＮａｓｅを含まない。

【図１２】図１２は、ＲＮａｓｅ含有／非含有再懸濁緩衝液を使用した、ｐＫＫ２２３．
３およびｐＱＲ１６３の、透明溶解液、流動、洗浄および溶出段階のプラスミド
の中調製を示す。ウェルは、３μｌのサンプル、４μｌの滅菌蒸留水、および５
μｌの添加緩衝液を含んだ。レーン１＆２および１９＆２０は、それぞれ、λＰ
ｓｔＩおよびλＨｉｎｄＩＩＩ（５μｌ添加）に対応する。レーン３〜６および
１１〜１４は、ＲＮａｓｅを含む緩衝液を有する、サンプルｐＫＫ２２３．３お
よびｐＱＲ１６３に対応する。レーン７〜１０および１５〜１８は、ＲＮａｓｅ
を含まない緩衝液を有する、ｐＫＫ２３．３およびｐＱＲ１６３に対応する。レ
ーン３、７、１１＆１５は、透明な溶解液の段階である。レーン４、８、１２＆
１６は、フロースルー段階である。レーン５、９、１３＆１７は、洗浄段階であ
る。レーン６、１０、１４＆１８は、溶出ＤＮＡである。

【図１３】図１３は、λＰｓｔＩマーカーの第二の三重バンドと比較した場合の、中調製
法（Ｑｉａｇｅｎ）の透明溶解液（ＣＬ）および流動段階（Ｆ）のｐＫＫ２２３
．３およびｐＱＲ１６３のＲＮＡバンドの相対強度を示す。

【図１４】図１４は、λＰｓｔＩマーカーの第二の三重バンドのバンド濃度により決定し
た、ｐＫＫ２２３．３およびｐＱＲ１６３を使用した、中調製プロセスの透明溶
解液（ＣＬ）および流動段階（Ｆ）のＲＮＡのバンド濃度を示す。

【図１５】図１５は、Ａ）挿入断片としてｄｉｆ座位をフランキングしている５．２ｋｂ
領域を有するｐＵＣ１８である、プラスミドｐＮ１Ｄ２７４Ｅｋａｎ１を示す。
ｋａｎ遺伝子はＮｓｉＩ部位に、ｌａｃｌ^qsは２つのＳｔｙＩ部位の間に挿入さ
れた。Ｂ）ＢｂｓＩを用いた切断により、ほとんどのｌａｃｌ^qsが除去され、ｔ
ｒｃ−ＲＮａｓｅＡにより置換される。このプラスミド（ｐＲＮａｓｅＡ）を線
形化し、相同的組換えによる大腸菌染色体へのｔｒｃ−ＲＮａｓｅＡの挿入に使
用する。

【図１６】図１６は、ｐＱＲ１６３のＤＨ１（ｐＴＸ０１６１）への形質転換から得られ
たクローンのプラスミドミニ調製物のアガロースゲル電気泳動を示す：レーン１
＆１６：１ｋｂマーカー、レーン２：ｐＭＭＢ６６ＥＨ；レーン３：ｐＱＲ１６
３対照；レーン４〜１５：ＤＨ１（ｐＴＸ０１６１）（ｐＱＲ１６３）のクロー
ン１〜１２。

【図１７】図１７は、ＤＨ１（ｐＴＸ０１６１）（ｐＱＲ１６３）およびＤＨ１（ｐＴＸ
０３４０）からのプラスミドミニ調製のアガロースゲル電気泳動を示す：レーン
１および６：１ｋｂマーカー；レーン２：ＤＨ１（ｐＴＸ０１６１）（ｐＱＲ１
６３）＋ＲＮａｓｅＡ；レーン３：ＤＨ１（ｐＴＸ０３４０）＋ＲＮａｓｅＡ；
レーン４：ＤＨ１（ＰＴＸ０１６１）（ｐＱＲ１６３）；レーン５：ＤＨ１（ｐ
ＴＸ０３４０）。

【図１８】図１８は、ＲＮａｓｅＡ活性を検出するためのＲＮＡプレートアッセイを示す
；１：ｐＭＭＢ６６ＥＨ（陰性対照）；２〜４：ＤＨ１（ｐＴＸ０１６１）（ｐ
ＱＲ１６３）クローン１〜３；５：１０μｇのＲＮａｓｅＡ（陽性対照）。

【図１９】図１９は、ＲＮａｓｅＡをｐＭＭＢ６６ＥＨにクローニングする戦略を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号９８１７１５１．５ (32)優先日平成10年８月６日(1998．8．6) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ウィリアムズ，スティーヴン・ジェレイントイギリス国、エスティー５５エスピースタッフォードシャー、キール、ユニヴァーシティ・オヴ・キール、ザ・サイエンス・パーク、コブラ・セラピューティクス・リミテッド内Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA11 CA04 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 HA12 HA15 4B050 CC03 DD02 DD03 DD11 LL01 LL02 4B065 AA15X AA15Y AA26X AA26Y AA42X AA50X AA63Y AA93Y AB01 AC14 BA02 BA25 CA31 CA41 CA44

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】細胞成分を産生している細胞を培地中で培養し、該細胞を溶
解して細胞溶解液を生成することを含む、実質的にＲＮＡを含まない細胞成分を
調製する方法であって、該細胞溶解液が、該細胞成分と、該細胞溶解液に存在す
る実質的に全てのＲＮＡ分子を分解するのに十分なＲＮａｓｅ活性とを含む上記
方法。
【請求項２】ＲＮａｓｅが、細胞成分を産生している上記細胞により産生
される請求項１に記載の方法。
【請求項３】ＲＮａｓｅが、細胞成分を産生している上記細胞以外の培地
中の上記細胞により産生される請求項１に記載の方法。
【請求項４】細胞成分を産生している細胞と、調製物に存在する実質的に
全てのＲＮＡを分解するのに十分な量のＲＮａｓｅを産生している細胞とを培養
し、溶解することを含む実質的にＲＮＡを含まない細胞成分を調製する方法。
【請求項５】細胞成分を産生している細胞が、ＲＮａｓｅをも産生する請
求項４に記載の方法。
【請求項６】細胞成分およびＲＮａｓｅが、同じ細胞により産生されるこ
とがない請求項４に記載の方法。
【請求項７】上記細胞成分が、組換えＤＮＡ、組換えタンパク質、および
組換え炭水化物の１つである請求項１または４に記載の方法。
【請求項８】上記ＲＮａｓｅをコードしている遺伝子が、ＲＮａｓｅを産
生している細胞のゲノムに組込まれている請求項１または４に記載の方法。
【請求項９】上記ＲＮａｓｅが、非特異的である請求項１または４に記載
の方法。
【請求項１０】上記非特異的ＲＮａｓｅが、ＲＮａｓｅＡ、ＲＮａｓｅＭ
またはＲＮａｓｅＩである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】上記ＲＮａｓｅを産生している上記細胞が、調節された様
式で上記ＲＮａｓｅを産生する請求項１または４に記載の方法。
【請求項１２】上記の調節された様式で産生された上記ＲＮａｓｅが、上
記ＲＮａｓｅを産生している上記細胞により過剰産生される請求項１１に記載の
方法。
【請求項１３】上記の調節された様式で産生された上記ＲＮａｓｅが、上
記ＲＮａｓｅを産生している上記細胞により誘導的に産生される請求項１１に記
載の方法。
【請求項１４】上記の調節された様式で産生された上記ＲＮａｓｅが、上
記ＲＮａｓｅを産生している上記細胞により構成的に産生される請求項１１に記
載の方法。
【請求項１５】上記の調節された様式で産生された上記ＲＮａｓｅが、上
記ＲＮａｓｅを産生している細胞の細胞質から分泌される請求項１１に記載の方
法。
【請求項１６】上記ＲＮａｓｅが、ＲＮａｓｅを産生している細胞のペリ
プラズムに分泌される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】細胞が培地に含まれ、上記ＲＮａｓｅが細胞から該培地に
分泌される請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】上記ＲＮａｓｅが、非特異的ＲＮａｓｅである請求項１１
に記載の方法。
【請求項１９】組換えＤＮＡ、組換えタンパク質、または組換え炭水化物
を産生し、調節された様式でＲＮａｓｅをも産生する宿主細胞。
【請求項２０】上記の調節された様式で産生された上記ＲＮａｓｅが、過
剰産生される請求項１９の宿主細胞。
【請求項２１】上記の調節された様式で産生された上記ＲＮａｓｅが、誘
導的に産生される請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２２】上記の調節された様式で産生された上記ＲＮａｓｅが、構
成的に産生される請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２３】上記の調節された様式で産生された上記ＲＮａｓｅが、宿
主細胞細胞質から分泌される請求項１９に記載の宿主細胞。
【請求項２４】上記ＲＮａｓｅが、宿主細胞ペリプラズムに分泌される請
求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】宿主細胞が培地に含まれるとき、上記ＲＮａｓｅが宿主細
胞から上記培地に分泌される請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２６】上記ＲＮａｓｅが、非特異的ＲＮａｓｅである請求項１９
の宿主細胞。
【請求項２７】組換えＤＮＡ、組換えタンパク質、または組換え炭水化物
を産生する宿主細胞と、調節された様式でＲＮａｓｅを産生する宿主細胞とを含
む組成物。
【請求項２８】上記の調節された様式で産生された上記ＲＮａｓｅが、過
剰産生される請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】上記の調節された様式で産生された上記ＲＮａｓｅが、誘
導的に産生される請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】上記の調節された様式で産生された上記ＲＮａｓｅが、構
成的に産生される請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】上記の調節された様式で産生された上記ＲＮａｓｅが、宿
主細胞細胞質から分泌される請求項２７に記載の組成物。
【請求項３２】上記ＲＮａｓｅが、宿主細胞ペリプラズムに分泌される請
求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】宿主細胞が培地に含まれるとき、上記ＲＮａｓｅが宿主細
胞から上記培地に分泌される請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】医薬的に許容される担体中に、実質的にＲＮＡを含まない
細胞成分を含む医薬組成物。
【請求項３５】医薬的に許容される担体中に、請求項１または請求項４に
記載の方法により得ることのできる実質的にＲＮＡを含まない細胞成分を含む医
薬組成物。