DE69928776T2

DE69928776T2 - Nanopartikel die polyisobutylcyanoacrylate und cyclodextrine enthalten

Info

Publication number: DE69928776T2
Application number: DE69928776T
Authority: DE
Inventors: Airton Monza Da Silveira; Gilles Ponchel; Dominique Duchene; Patrick Couvreur; Francis Puisieux
Original assignee: Bioalliance Pharma SA
Current assignee: Bioalliance Pharma SA
Priority date: 1998-02-27
Filing date: 1999-02-24
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2019-02-25
Also published as: DE69928776D1; AU2628799A; WO1999043359A1; FR2775435B1; DK1056477T3; CA2320928A1; JP4651192B2; CA2320928C; US6881421B1; IL137882A; AU753573B2; IL137882A0; JP2002504526A; EP1056477B1; FR2775435A1; EP1056477A1; ATE311906T1; ES2255246T3

Description

Die Erfindung betrifft die Abgabe von Wirkstoffen, die besonders in Gebieten der Medikamente mit vorbeugendem, heilendem oder diagnostischem Ziel verwendet werden, und auch die Verbesserung ihres therapeutischen Index (Verbesserung des Verhältnisses Vorteile/Risiken).
Sie hat besonders zum Gegenstand neue Nanopartikel, die mindestens einen Wirkstoff enthalten.
Die Bereitstellung neuer Systeme zur Abgabe oder Freisetzung von Wirkstoffen hat zum Hauptzweck die kontrollierte Abgabe eines Wirkstoffs besonders eines pharmakologischen Wirkstoffs an seine Wirkungsstelle mit einer optimalen Geschwindigkeit und einer optimalen therapeutischen Dosierung (1). Die Verbesserung des therapeutischen Index kann durch Modifizierung der Verteilung des Wirkstoffs im Organismus erhalten werden. Die Vereinigung des Wirkstoffs mit dem Abgabesystem ermöglicht besonders seine spezifische Abgabe an der Wirkungsstelle oder seine kontrollierte Freisetzung nach der Zielansprache der Wirkungsstelle. Die Verringerung der Menge des Wirkstoffs in den Bereichen, wo seine Gegenwart nicht erwünscht ist, ermöglicht eine Steigerung der Wirksamkeit des Wirkstoff, eine Verringerung seiner schädlichen (giftigen) Nebenwirkungen und sogar die Modifizierung oder Wiederherstellung seiner Aktivität.
Die kolloidalen Systeme zur Abgabe von Wirkstoffen umfassen die Liposome, die Mikroemulsionen, die Nanokapseln, die Nanokugeln, die Mikropartikel und die Nanopartikel. Die Nanopartikel zeigen die Vorteile der Zielgenauigkeit, der Anpassung der Verteilung und Flexibilität der Formulierung und haben eine Polymerstruktur, die in einer für den verfolgten Zweck geeigneten Weise gewählt und realisiert werden kann. Sie habe sich als besonders vielversprechend erwiesen, um einen besseren therapeutischen Index im oben definierten Sinn zu erreichen, da sie fähig sind, eine kontrollierte Freisetzung, eine spezifische Abgabe an der Wirkungsstelle oder eine gezielte Abgabe zu gewährleisten, was gleichzeitig eine Erhöhung der Wirksamkeit und eine Verringerung von nachteiligen Nebenwirkungen bei anderen Organen ermöglicht.
Diese Art von Verabreichung erfordert die Verwendung von biologisch abbaubaren Polymeren. Von diesen sind die Polyalkylcyanoacrylate besonders interessant, da ihr biologischer Abbau rasch beobachtet wird, im Vergleich zu anderen biologisch abbaubaren Polymeren, und im Verlauf von Zeiten abläuft, die mit den therapeutischen oder diagnostischen Anwendungen verträglich sind.
Trotz dieser interessanten Eigenschaften ist die Kapazität der Nanopartikel von Polyalkylcyanoacrylaten zur Beladung mit Wirkstoffen ausgedrückt als Menge Wirkstoff, die mit einer Masseneinheit des Polymers vereinigt ist, oft begrenzt, besonders wenn der Wirkstoff in Wasser sehr gering löslich ist, da die Herstellung der Nanopartikel Polymerisationsverfahren in wäßrigem Milieu verwendet. Diese erhebliche Einschränkung der Beladung mit Wirkstoff findet man besonders bei den hydrophoben, amphiphilen und/oder unlöslichen Wirkstoffen.
Die verhältnismäßig geringe Fähigkeit üblicher Nanopartikel, eine ausreichende Menge von Wirkstoffen von der Stelle der Verabreichung zur Zielstelle im Organismus zu transportieren, birgt oft das Risiko der Notwendigkeit, erhebliche Mengen von Polymeren zu verabreichen.
Die Polyalkylcyanoacrylate werden verwendet, um Nanopartikel als Vektoren von Wirkstoffen herzustellen (3). Jedoch begrenzen aus den oben angegebenen Gründen die erhaltenen geringen Beladungen besonders mit hydrophoben, amphiphilen und/oder in Wasser unlöslichen Wirkstoffen ihre therapeutische Anwendung.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß man den Bereich der Verwendung von Polymeren, besonders von Polyalkylcyanoacrylaten erweitern kann, in dem man sie mit einer oder mehreren Verbindungen vereinigt, die Wirkstoffe komplex binden können, um so neue Nanopartikel mit originalen Eigenschaften zu erhalten.
Die Erfindung hat daher zum Gegenstand Nanopartikel, die mindestens einen Wirkstoff enthalten und dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die Vereinigung (Assoziierung) von mindestens einem Polymer, vorzugsweise einem Polyalkylcyanoacrylat, in dem die gradkettige oder verzweigte Alkylgruppe 1 bis 12 Kohlenstoffatome enthält, und mindestens einer Verbindung, die den Wirkstoffkomplex binden kann, aufweisen.
Die zur Komplexbindung des Wirkstoffs nach der Erfindung geeignete Verbindung ist vorzugsweise ausgewählt unter den cyclischen Oligosacchariden, besonders den Cyclodextrinen, die neutral oder geladen sein können, natürliche (Cyclodextrine α, β, γ, δ, ε), verzweigte oder polymerisierte oder auch chemisch modifizierte, beispielsweise durch Substitution eines oder mehrerer Hydroxypropylgruppen durch Gruppen wie Alkyl-, Aryl-, Arylalkyl-Glycosid-Gruppen oder durch Veretherung, Veresterung mit Alkoholen oder aliphatischen Säuren. Unter den obigen Gruppen werden besonders diejenigen bevorzugt, die ausgewählt sind unter den Hydroxypropyl-, Methyl- und Sulfobutylether-Gruppen.
In unerwarteter Weise ermöglicht die Gegenwart einer Verbindung, welche den Wirkstoff in der Vereinigung gemäß der Erfindung komplex binden kann, dem Wirkstoff, selbst wenn er hydrophob, amphiphil oder unlöslich ist, in das Innere der Polymerstruktur einzudringen, die durch die Vereinigung des oder der Polymeren und des oder der Verbindungen, die den Wirkstoffkomplex binden können, geschaffen wird, und das mit einer im Vergleich mit dem Stand der Technik signifikant gesteigerten Ausbeute der Verkapselung, einer Ausbeute die anscheinend zusammenhängt mit dem Gleichgewicht zwischen einerseits der Löslichmachung, die aus der Verwendung von Verbindungen folgt, welche den Wirkstoffkomplex binden können, und andererseits der Affinität des Wirkstoffs für die neue Polymerstruktur, was einen erheblichen Fortschritt in therapeutischer und technischer Hinsicht darstellt. Im übrigen stabilisieren die Nanopartikel auch wegen ihrer festen Natur den zwischen der (den) Verbindung(en) und dem (den) Polymer(en) gebildeten Komplex.
Erfindungsgemäß ist es jetzt möglich, Nanopartikel beispielsweise vom Typ Polyalkylcyanoacrylat nicht nur mit hydrophilen Wirkstoffen sondern auch mit hydrophoben, amphiphilen und/oder unlöslichen Wirkstoffen zu beladen.
Die Vereinigung eines Polymers und einer Verbindung, die den Wirkstoffkomplex binden kann, ermöglicht die Schaffung neuer Bindeplätze für den Wirkstoff, die mit den verwendeten Polymeren allein nicht auftreten. Das Auftreten dieser neuen Plätze und besonders das Auftreten eines hydrophoben Hohlraums mit den Verbindungen, welche die Wirkstoffkomplexe binden können, ermöglicht die Erhöhung der Beladung mit Wirkstoff, wobei die Fähigkeit zur kontrollierten und verzögerten Freisetzung desselben beibehalten wird, die nicht vorhanden ist, wenn man nur die zur Komplexbildung befähigten Verbindungen verwendet.
Im Stand der Technik ist beschrieben die Herstellung von Polymeren auf der Grundlage von Cyanoacrylat, wo die Alkylcyanoacrylate im Verlauf ihrer Herstellung vereinigt werden mit Dextranen (Egea, M. A. et al., Farmaco, 1994, 49, 211–17). In dieser Methode wird aber das Dextran in klassischer Weise als ein Stabilisierungsmittel verwendet und ermöglicht nicht die Komplexbindung eines Wirkstoffs. Außerdem ist das Dextran ein gradkettiges Polysaccharid mit hohem Molekulargewicht und daher grundsätzlich verschieden von Cyclodextrinen, die ein geringes Molekulargewicht aufweisen und fähig sind, andere Moleküle kom plex zu binden. So zeigen die erfindungsgemäßen Nanopartikel neue (originale) Eigenschaften:

– Modulierung ihrer Größe,
– erhöhte Verkapselung von wirksamen Molekülen, besonders hydrophoben, amphiphilen und/oder unlöslichen Molekülen,
– ggf. Abwesenheit eines Stabilisators wie Dextran.

Es wurde auch im Patent US-A 5 641 515 vorgeschlagen, Insulin mit einem Polyalkylcyanoacrylat-Polymer zu verkapseln. Diese Verkapselung beruht auf der Bildung von covalenten Bindungen zwischen dem Insulin und dem Polymer, was verschieden ist von der Komplexbildung auf der Grundlage von Nanopartikeln gemäß der Erfindung. Tatsächlich beruhen die erfindungsgemäßen Nanopartikel auf der Fähigkeit eines Moleküls eines Wirkstoffs sich mit einem oder mehreren Cyclodextrinmolekülen durch die Ausbildung von chemischen Bindungen mit geringer Energie, also nicht covalenten Bindungen unter Bildung eines Einschlußkomplexes zu vereinigen. Die Existenz dieses Komplexes ist das Ergebnis der Ausbildung eines Gleichgewichts zwischen einerseits den freien Formen des Wirkstoffs und des Cyclodextrins und andererseits des Einschlußkomplexes. Er ist auch quantitativ gekennzeichnet durch seine Stabilitätskonstante. Im Sinn der vorliegenden Erfindung beschreibt der Ausdruck Komplexbildung (Komplexierung) ausschließlich dieses letztgenannte Phänomen. So erfolgt die Komplexbildung des Wirkstoffs nicht nur im Verlauf der Herstellung der Nanopartikel sondern auch in den hergestellten Nanopartikeln, wo sie ein Mittel bildet, eine größere Menge an Wirkstoff damit zu vereinigen.
Es sei hier auch daran erinnert, daß allgemein die Vereinigung eines Wirkstoffs mit Nanopartikeln das Ergebnis einer einfachen Dispersion des Wirkstoffs in Form von Kristallen in den aus Partikeln bestehenden Polymer, einer Löslichkeit des Wirkstoffs im Polymer, einer Adsorption, welche auf sekundären chemischen Bindungen (geringe Bindeenergien) oder auch einer covalenten Bindung (starke Bindeenergie) mit dem Partikel bildenden Polymer sein kann.
In dieser Hinsicht sei daran erinnert, daß die Herstellung von Nanopartikeln die Polymerisation der in wäßriger Phase dispergierten Alkylcyanoacrylat-Monomeren erfordert. Die Synthese von Polyalkylcyanoacrylat ermöglicht also die Bildung von Nanopartikeln. Im allgemeinen wird dieser Verfahrensschritt in Gegenwart der zu verkapselnden Wirkstoffe durchgeführt. Er kann also in bestimmten Fällen die unerwünschte Entwicklung von covalenten chemischen Bindungen zwischen dem Wirkstoff und dem gebildeten Polymer zur Folge haben. Dieses Phänomen wurde beschrieben für Peptide (Grangier, J. I., J; Controlled Rel., 15, 3–13, 1991) oder andere Moleküle (Vinblastine, V. Guise et al., Pharm. Res, 7, 736–741, 1990).
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Behebung dieses Nachteils, da durch die Maskierung der potentiell reaktiven chemischen Gruppen die Komplexbildung dieses Wirkstoffs im Verlauf der Herstellung der erfindungsgemäßen Nanopartikel es ermöglicht, den Wirkstoff gegenüber chemischen Reaktionen zu schützen, die zur Bildung des Partikels erforderlich sind. So wird der Wirkstoff in vorteilhafter Weise in nicht covalenter Weise an das Partikel gebunden (mit ihm vereinigt).
Außerdem erfolgt die Vereinigung des Wirkstoffs mit den Nanopartikeln im allgemeinen in einem sauren wäßrigen Milieu. Daraus folgt aber für bestimmte unter diesen Bedingungen instabile Wirkstoffe ein Risiko des chemischen Abbaus, das zur unerwünschten Verkapselung von Hydrolysederivaten führen kann und außerdem nachteilig für die Erzielung einer hohen Verkapselungsrate des Wirkstoffs sein kann. Dagegen ermöglicht in der Erfindung die Komplexbildung der Wirkstoffe mit dem Cyclodextrinen die Behebung dieser Nachteile, da sie den Schutz der Wirkstoffe gegenüber dem äußeren Reaktionsmilieu ermöglicht.
Als Wirkstoffe, die in die Zusammensetzung der erfindungsgemäßen Nanopartikel Eingang finden können, seien erwähnt die Antikrebs-, die Antisense-, die antiviralen-, die antibiotischen Mittel, die Proteine, Polypeptide, Polynucleotide, Antisense-Nucleotide, die Impfstoffe, Immunomodulatoren, Steroide, Analgetika, Antimorphin-Mittel, Antipilz-Mittel und antiparasitäre Mittel. Unter diesen sieht die Erfindung besonders vor das Taxol oder eines seiner Derivate, das Doxorubicin oder eines seiner Derivate oder die Derivate von Platin.
Der Wirkstoff ist im allgemeinen in einer Menge von 0,01 bis 300 mg/g Nanopartikel vorhanden.
Der Anteil der Verbindung, die zur Bildung eines Komplexes mit dem Wirkstoff geeignet ist, beträgt im allgemeinen 0,1 bis 70 Gew.-%.
Der Anteil des Wirkstoffs und der der Verbindung, die einen Komplex mit ihm bilden kann, sind voneinander unabhängig.
Die Erfindung betrifft selbstverständlich auch die pharmazeutischen oder diagnostischen Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Nanopartikel und mindestens ein pharmazeutisch annehmbares und verträgliches Vehikel enthalten.
Die Erfindung hat auch zum Gegenstand die Herstellung der oben beschriebenen Nanopartikel.
Ein erstes Verfahren zur Herstellung der Nanopartikel auf der Grundlage eines Polymers und besonders von Polyalkylcyanoacrylat, wie oben definiert, ist dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

a) Herstellen eines Komplexes von mindestens einem Wirkstoff mit mindestens einer Verbindung, die mit ihm einen Komplex bilden kann, in Lösung in einem wäßrigen oder nicht wäßrigen Lösungsmittel,
b) allmähliche Zugabe von mindestens einem Monomer des Polymers und besonders von Alkylcyanoacrylatmonomer in die im Schritt a) erhaltene Lösung und
c) Durchführung einer Polymerisation dieses Monomers, vorzugsweise anionisch, jedoch induzierbar durch andere besonders photochemische Mittel, ggf. in Gegenwart eines oder mehrerer Tenside und/oder Stabilisatoren.

Ein zweites Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Nanopartikel, das eine Alternative zum obigen ersten Verfahren bildet, besteht dann, zunächst Nanopartikel auf der Grundlage eines Polymers und besonders von Polyalkylcyanoacrylaten und einer Verbindung, die einen Komplex mit einem Wirkstoff bilden kann, herzustellen, die auch als "leere Nanopartikel" bezeichnet werden, und dann den Wirkstoff mit diesen leeren Nanopartikeln zu vereinigen. Genauer weist dieses Verfahren die folgenden Schritte auf

a) Herstellen einer Lösung von wenigstens einer Verbindung, die einen Komplex mit einem Wirkstoff bilden kann, in einem wäßrigen oder nicht wäßrigen Lösungsmittel,
b) allmähliche Zugabe mindestens eines Monomers des Polymers und besonders von Alkylcyanoacrylatmonomer zu der Lösung des Schritts a) und
c) Durchführung einer Polymerisation dieses Monomers vorzugsweise anionisch aber auch induzierbar durch andere besonders photochemische Mittel, ggf. in Gegenwart eines oder mehrerer Tenside und/oder Stabilisatoren,
d) nach einer Kontrolle und ggf. Reinigung der im Schritt c) erhaltenen Nanopartikel Inkubieren der Partikel in einer Lösung des Wirkstoffs in einem wäßrigen oder nicht wäßrigen Lösungsmittel.

Wie im ersten Verfahren hängt die Vereinigung des Wirkstoffs mit den leeren Nanopartikeln von der Menge der mit den Nanopartikeln vereinigten Cyclodextrine ab. Dieses zweite Verfahren weist zwei Vorteile auf:

– Es ermöglicht zu vermeiden, daß man die Schritte der Reinigung an mit Wirkstoff beladenen Nanopartikeln durchführen muß, was zu Verlusten an Wirkstoff führen kann,
– es ermöglicht die Realisierung eines Systems, das aus dem Stegreif mit Wirkstoff beladen werden kann, beispielsweise im Fall wo ein Wirkstoff in Lösung sehr instabil ist.

Die Erfindung betrifft also auch leere, d. h. nicht beladene Nanopartikel, die nach den Schritten a) bis c) des zweiten obigen Verfahrens erhalten wurden. Außerdem sind diese leeren Partikeln von therapeutischem Interesse wegen der Wirksamkeit von Cyclodextrinen besonders auf dem Gebiet von Krebs (Grosse, P. Y. et al., British Journal of Cancer, 78 : 9, 1165–1169, 1998).
In den Schritten a) und b) des ersten erfindungsgemäßen Verfahrens wird das Lösungsmittel vorteilhafterweise so gewählt, daß unter Beachtung der für die Polymerisation der Polymeren und besonders der Polyalkylcyanoacrylate günstigen Bedingungen die Löslichkeit des Wirkstoffs und der zur Komplexbildung mit diesem fähigen Verbindung in dem durch dieses Lösungsmittel definierten Milieu möglichst groß ist. Vorteilhafterweise wird ein solches Lösungsmittel ausgewählt unter vorzugsweise den wäßrigen oder wäßrig-alkoholischen Lösungsmitteln. Das Lösungsmittel wird auf diese Weise in den Schritten a), b) und d) des zweiten erfindungsgemäßen Verfahrens gewählt.
Die Gegenwart eines Tensids oder eines Stabilisators ist erforderlich, um die Nanopartikel des Standes der Technik herzustellen. Wie die folgenden Beispiele zeigen, sind solche Mittel im Rahmen der Erfindung nicht mehr erforderlich. Tatsächlich hat die Verbindung, welche einen Komplex mit dem Wirkstoff bilden kann, wie die Cyclodextrine, paradoxerweise eine stabilisierende Wirkung, die ausreicht, daß auf das gewöhnlich verwendete Tensid verzichtet wird. Das stellt auf der technisch gewerblichen Ebene einen erheblichen wirtschaftlichen Vorteil dar. Ebenso wurde gefunden, daß das Polyalkylcyanoacrylat den vom Wirkstoff und der zur Komplexbildung mit dem Wirkstoff geeigneten Verbindung gebildeten Komplex stabilisiert.
Wenn jedoch das erfindungsgemäße Verfahren die Verwendung eines Stabilisators und/oder Tensids umfassen soll, wird ein Dextran oder ein Poloxamer bevorzugt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ermöglichen die Potentiale der Cyclodextrine gegenüber den Wirkstoffen, den Partikeln neue Eigenschaften zu verleihen. Tatsächlich ermöglicht die Gegenwart von Cyclodextrinen in den Partikeln die Stabilisierung von Wirkstoffen, welche in Lösungen instabil wären, oder auch bestimmte ungünstige Eigenschaften der Wirkstoffe, wie eine irritierende Wirkung, zu maskieren.
Die bisher bekannten Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln weisen Mängel auf hinsichtlich der Möglichkeiten der Einstellung der Größe der Nanopartikel. Das erfindungs gemäße Verfahren ermöglicht in unerwarteter und bemerkenswerter Weise die Einstellung der Größe der Nanopartikel direkt im Verlauf ihrer Herstellung ohne irgendeinen zusätzlichen besonderen Verfahrensschritt.
Wie die folgenden Beispiele zeigen, hängt die Größe der erfindungsgemäßen Nanopartikel im wesentlichen von der Konzentration der Verbindung ab, die mit dem Wirkstoff einen Komplex bilden kann. Im Fall der Cyclodextrine kann man so diese Größe in einem sehr weiten Bereich von 300 bis weniger als 50 nm verändern. Die Erfindung ermöglicht also mithilfe von einfachen Vorversuchen, die Größe der Nanopartikel in den Zusammensetzungen insbesondere therapeutischen Zusammensetzungen der Erfindung entsprechend der gewünschten besonderen Wirkung anzupassen. Die Wahl der Größe ermöglicht a priori falls gewünscht gewisse physische Schranken zu überwinden, welche der Verteilung der Nanopartikel im Organismus entgegenstehen, oder ein Einfangen der Nanopartikel der Zusammensetzung durch das Reticulo-Endothelial-System zu vermeiden. Sie ermöglicht auch eine neue Zielrichtung auf Organe.
In Folge des Schritts a) des erfindungsgemäßen Verfahrens beträgt der Anteil der zur Komplexbildung mit dem Wirkstoff geeigneten Verbindung im allgemeinen 0,1 bis 70 Gew.-% bezogen auf den Wirkstoff. Tatsächlich ermöglicht wie oben angegeben die Wahl der Konzentration der zur Komplexbildung mit dem Wirkstoff geeigneten Verbindung die Veränderung der Größe der durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltenen Nanopartikel. Man erhält so Nanopartikel mit einer Größe zwischen 40 und 300 nm.
Die Untersuchungen zur Freisetzung der mit dem Wirkstoff einen Komplex bildenden Verbindung einerseits und des Wirkstoffs andererseits zeigen, daß der Verlauf der Freisetzung der mit dem Wirkstoff einen Komplex bildenden Verbindung sehr rasch ist und die Freisetzung nahezu 100% erreicht, während die Freisetzung des Wirkstoffs eine erste rasche Phase aufweist, auf die eine langsamere zweite Phase folgt, die auf dem für die Polyalkylcyanoacrylate klassisch beschriebenen biologischem Abbau (Bioerosion) beruht.
In den Versuchen zur Freisetzung des Wirkstoffs zeigt die Verwendung von Esterasen, welche die Nanopartikel abbauen, daß der Wirkstoff zum großen Teil im Nanopartikel-Netzwerk enthalten ist, was wichtig ist im Hinblick auf die erwartete Aktivität (4).
Die verschiedenen Untersuchungen, die an einem Bereich von mehr hydrophilen Steroiden (Hydrocortison) oder mehr hydrophoben Steroiden (Progesteron) durchgeführt wurden, haben gezeigt, daß in den erfindungsgemäßen Nanopartikeln sehr verschiedene Wirkstoffe mit hohen Konzentrationen enthalten sein können, die von ihren physikochemischen Eigenschaften abhängen, wie besonders ihrem Grad von Hydrophobizität.
So hat das in den folgenden Beispielen als Modell verwendete Progesteron eine sehr geringe Löslichkeit in Wasser (0,01 mg/ml) die in den klassischen Verfahren der Emulsionspolymerisation in Wasser nur eine sehr geringe Beladung mit Wirkstoff zulassen, die kein praktisches Interesse hat. Diese Beladung ist also gering, wenn man die Herstellungsverfahren des Standes der Technik anwendet. Es ist besonders überraschend und interessant, daß diese Beladung in den erfindungsgemäßen Nanopartikeln mehr als 50 mal höher ist. Die Erfindung ermöglicht also zu hydrophoben, amphiphilen und/oder unlöslichen Wirkstoffen und damit zu einer Erneuerung ihres therapeutischen Index zu gelangen.
Die Erfindung hat also auch zum Ziel die Verwendung der oben beschriebenen Verfahren zur Herstellung eines Medikaments mit zielgerichteter Wirkung und verbessertem therapeutischem Index.
Die Erfindung wird mit weiteren Vorteilen und Einzelheiten erläutert durch die folgende Beschreibung von Ausführungsbeispielen, die sich auf die beigefügten Zeichnungen beziehen.
Figurenbeschreibung
1 zeigt die Veränderungen der Teilchengröße oder Granulometrie und des Zeta-Potentials (Mittelwert von drei Versuchen ± SEM) von Nanopartikeln von Polyisobutylcyanoacrylat (PIBCA) hergestellt in Gegenwart von 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) in Abhängigkeit von der Anfangskonzentration an HPβCD.
2 zeigt die Veränderungen der Granulometrie und des Zeta-Potentials (Mittelwert von drei Versuchen ± SEM) von Nanopartikeln von PIBCA hergestellt in Gegenwart des Komplexes Progesteron : 2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD) in Abhängigkeit von der Anfangskonzentration von HPβCD.
3 zeigt die Veränderungen des Gehalts an HPβCD (Mittelwert von drei Versuchen ± SEM) von Nanopartikeln von PIBCA hergestellt in Gegenwart von HPβCD in Abhängigkeit von der Anfangskonzentration an HPβCD.
4 zeigt die Veränderungen des Gehalts an HPβCD (Mittelwert von drei Versuchen ± SEM) von Nanopartikeln von PIBCA hergestellt in Gegenwart des Komplexes Progesteron : HPβCD in Abhängigkeit von der Anfangskonzentration an HPβCD.
5 zeigt die Veränderungen des Gehalts an Progesteron (Mittelwert von drei Versuchen ± SEM) von Nanopartikeln von PIBCA/HPβCD in Abhängigkeit von der Anfangskonzentration an HPβCD.
6 zeigt den Einfluß der Größe der Partikel auf die Geschwindigkeit der Freisetzung des Progesterons aus Nanopartikeln von PIBCA/HPβCD im alkalischen Boratpuffer (ABB) (pH 8,4).
7 zeigt den Einfluß der Zusammensetzung des Freisetzungsmilieus auf die Geschwindigkeit der Freisetzung des Progesterons aus Nanopartikeln von PIBCA/HPβCD im Milieu ABB (pH 8,4).
A: ABB : PEG 400 (80 : 20)
B: ABB : PEG 400 (60 : 40)
8 zeigt den Einfluß der Gegenwart von Enzymen vom Typ Esterase auf die Geschwindigkeit der Freisetzung des Progesterons aus Nanopartikeln von PIBCA/HPβCD im Milieu ABB (pH 8,4).
A: Freisetzungsmilieu mit 25 UI Esterase
B: Freisetzungsmilieu mit 100 UI Esterase
9 zeigt die Geschwindigkeit der Freisetzung des HPβCD im Milieu ABB bei 37°C.
10 zeigt die Kurven der Kalorimetrie mittels Differentialanalyse (DSC) die bei einer Geschwindigkeit des Temperaturanstiegs von 10°C/min erhalten wurden.
In den folgenden Beispielen wurden das Isobutylcyanoacrylat, das Hydrocortison, das Prednisolon und das Danazol, das Progesteron und die Esterasen, (19 UI/ml) von Sigma Chemicals (St. Loius, Mo, USA) erhalten, das Spironolacton, das Testosteron, das Megestrolacetat wurden jeweils erhalten von Sophartex, Besin-Iscovesco und Upjohn, die α-, β-, und γ-Cyclodextrine, die 2-Hydroxypropyl-α-, 2-Hydroxypropyl-β- und 2-Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrine, deren mittlere MS-Werte jeweils 0,9, 0,6 und 0,6 betrugen, wurden von Wacker Chemie GmbH (München, Deutschland) erhalten und der Sulfobutylether von β-Cyclodextrin (hiernach SBEβCD) wurde von CyDex L. C. (Overland Park, Kansas, USA) erhalten. Das Poloxamer 188 (Lutrol F68^®) ist eine Spende von BASF (Ludwigshafen, Deutschland). Die anderen chemischen Produkte und die Lösungsmittel sind von analytischer und HPLC-Qualität.
BEISPIEL 1: Herstellung von Nanopartikeln in Gegenwart verschiedener Cyclodextrine und von Poloxamer
Die Nanopartikel werden hergestellt durch anionische Polymerisation (2) von 100 μl Isobutylcyanoacrylat in 10 ml 0,01 M Chlorwasserstoffsäure (pH 2,0) enthaltend 1% G/V Poloxamer 188 und in Gegenwart von 5 mg/ml von α-, β-, γ-, 2-Hydroxypropyl-α-, 2-Hydroxypropyl-β, oder 2-Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrin oder von Sulfobutylether von β-Cyclodextrin. Die Cyclodextrin-Lösung wird mit einem Magnetrührer (1000 UpM) bei Raumtemperatur gerührt und das Monomer wird tropfenweise zugesetzt. Nach 6 Stunden Rühren wird die Suspension mit einem Vorfilter von 2,0 μm (Millex AP 500^®) filtriert und dann charakterisiert.
BEISPIEL 2: Herstellung von Nanopartikeln in Gegenwart verschiedener Cyclodextrine
Die Nanopartikel werden durch anionische Polymerisation (2) von 100 μl Isobutylcyanoacrylat in 10 ml 0, 01 M Chlorwasserstoffsäure (pH 2,0) und in Gegenwart von 5 mg/ml α-, β-, γ-, 2-Hydroxypropyl-α, 2-Hydroxypropyl-β- oder 2-Hydroxypropyl-γ-Cyclodextrin oder von Sulfobutylether von β-Cyclodextrin hergestellt. Die Cyclodextrin-Lösung wird mit einem Magnetrührer (1000 UpM) bei Raumtemperatur gerührt und das Monomer wird tropfenweise zugesetzt. Nach 6 Stunden Rühren wird die Suspension mittels eines Vorfilters von 2,0 μm (Millex AP 500^®) filtriert und dann charakterisiert.
BEISPIEL 3: Herstellung von Progesteron/Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin (HPβCD)-Komplexen
Die Progesteron/HPβCD-Komplexe werden hergestellt indem man 3,615 g HPβCD mit 3,0 g Progesteron in 150 ml Wasser unter Rühren mit einem Magnetrührer während 24 Stunden bei Raumtemperatur vermischt. Danach wird die Mischung filtriert (0,45 μm). In der filtrierten Lösung werden das HPβCD und das Progesteron quantitativ bestimmt bevor die Lösung zur Herstellung von mit Progesteron beladenen Nanopartikeln verwendet wird.
BEISPIEL 4: Herstellung von mit Progesteron beladenen Nanopartikeln von Polyisobutylcyanoacrylat/HPβCD (PIBCA/HPβCD)
Die wie oben im Beispiel 3 erhaltene Lösung des Komplexes Progesteron/HPβCD wird verdünnt, um Konzentrationen von 2,5, 5,0, 7,5, 10,0, 12,5, 15,0 und 20,0 mg/ml HPβCD im Polymerisationsmilieu zu erhalten. Die Nanopartikel werden wie im Beispiel 1 in Abwesenheit oder in Gegenwart von 1% (G/V) Poloxamer 188 hergestellt.
BEISPIEL 5 (Vergleich): Herstellung von mit Progesteron beladenen und von HPβCD freien Nanopartikeln von Polyisobututlcyanoacrylat
Nanopartikel von Polyisobutylcyanoacrylat werden in Abwesenheit von Cyclodextrin im Polymerisationsmilieu zum Zweck des Vergleichs hergestellt. Die mit Progesteron beladenen Nanopartikel werden hergestellt, indem man den Wirkstoff in verdünnter Chlorwasserstoffsäure (pH 2,0) in Gegenwart von 1% (G/V) Poloxamer 188 (etwa 60 μg/ml entsprechend der maximalen Löslichkeit in diesem Milieu) herstellt. Das Polymerisationsverfahren wird wie im Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
BEISPIEL 6: Messung des Progesterons und von HPβCD in den erhaltenen Nanopartikeln
Die verschiedenen Suspensionen von Nanopartikeln werden bei 82 000 g während 30 bis 40 Minuten bei 25°C zentrifugiert (Beckman, L5-65 Ultrazentrifuge, Rotor-Typ 70,1 Ti) und in 5 ml destilliertem Wasser erneut suspendiert. Die Suspensionen werden schließlich lyophilisiert (Christ HED Gefriertrockner, Deutschland).
Zur Bestimmung der Beladung der Nanopartikel mit Progesteron werden die lyophilisierten Produkte in Acetonitril mit HPLC-Qualität verdünnt und die Lösungen werden durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) analysiert. Das HPLC-System besteht aus einer Einheit zur Abgabe von Lösungsmittel 510 von Waters (Saint-Quentin-en-Yvelines, Frankreich), einem automatischen Probenehmer WISP 712, einer Säule (250 × 4,6 mm) Nova-Pak C18 4 μm, einem Absorptionsdetektor 486, der bei 245 nm arbeitet und eine Schnittstelle mit einem Datenmodul 746 hat. Der Durchsatz trägt 1,0 ml/min und die mobile Phase besteht aus Wasser und Acetonitril (40 : 60), wobei die Retentionsdauer etwa 12 Minuten beträgt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert von drei Messungen angegeben.
Um das HPβCD quantitativ zu bestimmen, werden die lyophilisierten Nanopartikel mittels 0,2 M NaOH während 12 Stunden hydrolysiert, der pH wird auf 7,0 (±0,5) eingestellt und das HPβCD wird quantitativ bestimmt durch spektrophotometrische Messung der Entfärbung von Phenolphthalein-Lösungen in Gegenwart von HPβCD. Das Phenolphthalein bildet stabile und ungefärbte Einschlußkomplexe mit den Cyclodextrinen (CD) (5). In Folge dessen nimmt die Farbintensität einer Phenolphthalein-Lösung im alkalischen Boratpuffer proportional zur Menge von in Lösung befindlichem CD ab.
Referenzlösungen wurden hergestellt durch Verdünnen von Mutterlösungen von CD in der alkalischen Boratpuffer-Lösung bei pH 10,0 die 2% einer 0,006 M ethanolischen Lösung von Phenolphthalein enthielt. Die Referenzkurven (λ = 550 nm) sind linear für die CD-Konzentration von 1 bis 100 μg/ml. Die Proben werden mit 4 Teilen der das Phenolphthalein enthaltenden Puffer-Lösung versetzt und direkt getestet.
BEISPIEL 7: Charakterisierung der Nanopartikel
Die granulometrische Verteilung, die mittlere Größe und Polydispersität der Nanopartikel werden abgeschätzt durch Streuung des Laserlichts unter Verwendung eines NS Coulter Nanosizer-Geräts (Coultronics, Margency, Frankreich). Die Proben werden im MilliQ-Wasser (spezifischer Widerstand > als 18 MΩ, Millipore, Saint-Quentin-en-Yvelines, Frankreich) dispergiert. Jede Analyse dauert 200 s. Die Temperatur beträgt 20°C und der Analysewinkel beträgt 90°. Das Zeta-Potential der im MilliQ-Wasser suspendierten Partikel wird durch Doppler-Geschwindigkeitsmessung mit dem Laser (Zetasizer 4, Malvern, England) bestimmt.
ERGEBNISSE DER BEISPIELE 1 bis 7
Die Eigenschaften der in Gegenwart von 5 mg/ml verschiedener Cyclodextrine und von 1% Poloxamer 188 hergestellten Partikel sind in der folgenden Tabelle 1 zusammengestellt (Mittelwert von 3 wiederholten Herstellungen ± SEM). Tabelle I

CD: = Cyclodextrin
HP: = Hydroxypropyl
SBE: = Sulfobutylether

Die Größe der Partikel, das Zeta-Potential, der Gehalt an Cyclodextrin und die Stabilität (nicht dargestellte Werte) werden durch die An des Cyclodextrins beeinflußt.
Die Menge der verschiedenen Cyclodextrine, die mit den Partikeln verbunden sind, liegt im Bereich von 20 bis 35% (G/G) des Gesamtgewichts der Partikel.
Die mit dem HPβCD formulierten Nanopartikel sind die interessantesten, da sie eine mittlere Granulometrie unter 100 nm und ein Zeta-Potential in der Nähe von 0 mV aufweisen. Außerdem zeigt das HPβCD eine sehr große Löslichkeit im Polymerisationsmilieu und ausgezeichnete Verträglichkeit. Es ermöglicht im übrigen die Verkapselung zahlreicher Substanzen. Infolgedessen wurden die ergänzenden Untersuchungen mit dem HPβCD durchgeführt.
In Gegenwart von HPβCD im Polymerisationsmilieu ist der Zusatz des Tensids Poloxamer 188 nicht notwendig für die Herstellung der Nanopartikel.
Einerseits werden wie 1 zeigt die Größe und das Zeta-Potential der Partikel durch die Gegenwart von Poloxamer 188 nicht modifiziert.
Andererseits beeinflußt die Konzentration an HPβCD erheblich die Größe und das Zeta-Potential. Eine Erhöhung der Konzentration an HPβCD von 0 auf 12, 5 mg/ml führt zu einer Verringerung der Größe der Partikel von 300 nm auf weniger als 50 nm. Ebenso nimmt das Zeta-Potential der Partikel fortlaufend von stark negativen Werten (–40 mV) auf ein Oberflächen-Potential nahe bei 0 mV ab. Diese Tendenzen bleiben im allgemeinen erhalten, wenn die Nanopartikel in Gegenwart von Progesteron hergestellt werden, wie 2 zeigt. Im Vergleich mit Partikeln ohne Progesteron ist das Zeta-Potential im Bereich der HPβCD-Konzentration beim Versuch leicht negativ. Außerdem beobachtet man bei Abwesenheit von Poloxamer 188 eine rasche Erhöhung der Größe der Nanopartikel bis auf 450 nm, gefolgt von einer raschen Verringerung, wenn die Konzentration an HPβCD über 10 mg/ml liegt. Diese Erscheinung wird in Gegenwart von Poloxamer 188 unterdrückt. Der Zusatz von HPβCD zum Polarisationsmilieu führt zu Assoziierung von großen Mengen HPβCD mit den Nanopartikeln, wie 3 zeigt. Die mit den Partikeln assoziierte (vereinigte) Menge an HPβCD steigt kontinuierlich und kann 60% des Gewichts der Partikel erreichen. Wenn die Anfangsmassen von HPβCD und Isobutylcyanoacrylat im Polymerisationsmilieu gleich sind, beträgt die Menge von mit den Partikeln vereinigtem HPβCD etwa 35%. Außerdem wird die Vereinigung von HPβCD mit den Partikeln durch die Anwesenheit von Poloxamer 188 nicht beeinflußt. Der Gehalt der Nanopartikel an HPβCD wird erheblich beeinflußt durch die Anwesenheit von Progesteron im Polymerisationsmilieu, wie 4 zeigt. Die Beladung der Partikel mit Progesteron erhöht sich in spektakulärer Weise, wenn die Partikel in Gegenwart von HPβCD hergestellt werden. Die Beladung mit Progesteron beträgt in Abwesenheit von HPβCD 0,79 μg/mg Partikel und steigt allmählich bis auf den 50-fachen Wert, was 45 μg/mg Partikel entspricht, wie 5 zeigt. Es gibt keine signifikanten Unterschiede zwischen den mit oder ohne Poloxamer 188 hergestellten Partikeln.
Die Eigenschaften der in den folgenden Beispielen 8 bis 10 verwendeten Nanopartikel sind in der folgenden Tabelle II angegeben. Tabelle II

a = Anfangskonzentration von HPβCD im Polymerisationsmilieu (mg/ml)
b = μg HPβCD pro mg Nanopartikel
c = μg Progesteron pro mg Nanopartikel

BEISPIEL 8: In vitro-Freisetzung des Progesterons aus Nanopartikeln von PIBCA/HPβCD
Eine gewogene Menge lyophilisierte Nanopartikel (enthaltend 1% (G/V) Glucose) wird in einen Kolben gegeben, der 15 ml einer alkalischen Boratpufferlösung (ABB) (pH 8,4) oder ABB mit Gehalt an Esterasen (25 und 100 UI) oder ABB/Polyethylenglykol 400 (PEG) mit 20 und 40% (V/V) enthält. Die Proben werden mit einem Magnetrührer mit 200 UpM bei 37°C gerührt und in bestimmten Intervallen abgenommen. Die Suspensionen werden mit 82000 g während 30 Minuten bei 20°C zentrifugiert und dann wird der Progesteron-Gehalt des Überstands für alle Milieus und der HPβCD-Gehalt für die Milieus mit PEG bestimmt. Der Progesteron-Gehalt wird mittels HPLC wie oben beschrieben bestimmt mit Injektionen von 100 μl für die in den Milieus mit ABB inkubierten Proben und 20 μl für die Milieus mit PEG.
Alle Versuche werden unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß die Konzentration an Wirkstoff in der Phase der Freisetzung unterhalb 10% Sättigung gehalten wird.
BEISPIEL 9: In vitro-Freisetzung von HPβCD aus Nanopartikeln von PIBCA/HPβCD
Die Untersuchung der Freisetzung von HPβCD wird wie diejenige des Progesterons im Milieu ABB mit quantitativer Bestimmung des Gehalts an CD nach Ultrazentrifugieren durch Komplexbildung mit Phenolphthalein wie oben beschrieben durchgeführt. Die Konzentration an CD bei 100% Freisetzung beträgt etwa 100 μg/ml.
BEISPIEL 10: Kalorimetrie durch Differentialanalyse (DSC)
Die DSC-Untersuchungen wurden unter Verwendung eines Differentialanalyse-Kalorimeters Perkin Elmer DSC-7 durchgeführt. Die Temperatur wird geeicht unter Verwendung des Übergangspunktes des Schmelzens von Indium. Proben mit etwa 4 mg Gewicht wurden in Aluminiumkapseln gebracht und mit einer Untersuchungsgeschwindigkeit von 10°C/min von 0 bis 250°C erwärmt.
ERGEBNISSE DER BEISPIELE 8 bis 10
6 der beigefügten Zeichnungen zeigt den Verlauf der Freisetzung des Progesterons aus kombinierten PIBCA/HPβCD-Nanopartikeln in ABB (pH 8,4). In dieser Graphik erkennt man eine Kurve der zwei-phasigen Freisetzung mit einer raschen Anfangsfreisetzung (Wirkung des Platzens) in der ersten Stunde für die zwei getesteten Formulierungen (etwa 10 und 34% jeweils von Nanopartikeln von 150 und 70 nm). Diese rasche Freisetzung kann zurückgeführt werden auf die Progesteron-Fraktion, die adsorbiert oder schwach gebunden ist an die große Oberfläche, welche durch die Bildung von Nanopartikeln erzeugt wird, mehr als auf den im Polymergitter eingebauten Progesteron/CD-Komplex. Die zweite Phase entspricht einer langsameren exponentiellen Freisetzung mit etwa 35 und 62% aus Nanopartikeln von 150 bzw. 70 nm freigesetztem Progesteron. Die Phase der verlangsamten Freisetzung kann das Ergebnis einer einfachen Diffusion des Progesterons aus den Nanopartikeln nach außen oder des Eindringens der Freisetzungslösung in die Nanopartikel mit Auflösung des Progesterons gefolgt von seiner Diffusion nach außen sein.
Die Untersuchungen in vitro zeigen, daß verschiedene Faktoren die Freisetzung von Wirkstoffen aus kolloidalen Systemen beeinflussen können. Zu diesen Faktoren gehören die Größe und die Morphologie der Partikel, die Beladung mit Wirkstoff und die Löslichkeit desselben (6, 7, 8). Entsprechend dem was in den früheren Arbeiten beobachtet wurde, zeigen die kleinsten Nanopartikel (70 nm) mit einer höheren Beladung an Wirkstoff (24 μg/mg) eine raschere Freisetzung als die größeren Partikel (170 nm) mit einer geringeren Beladung an Progesteron (10,5 μg/mg). Die mittlere Größe der Nanopartikel und ihre Beladung mit Wirkstoff sind die Hauptfaktoren der Geschwindigkeit der Freisetzung mit einer Herabsetzung der raschen Phase für die größeren Nanopartikeln.
7 zeigt die Profile der Freisetzung des Progesterons aus Nanopartikeln von PIBCA/HPβD in Gegenwart von PEG 400 (20 und 40%) als Lösungsvermittler. Die Verwendung dieser An von Milieu ermöglicht die Verringerung des Volumens des Freisetzungsmilieus und infolgedessen die Konzentrierung an Wirkstoff was eine bessere Erfassung ermöglicht (9). In einem Fall wie diesem, wo nichtwäßrige Lösungsmittel oder Lösungsvermittler verwendet werden, kann man Informationen über den Mechanismus der Freisetzung erhalten. Wie 7 zeigt, ist das Profil der Freisetzung für die zwei Milieus nicht identisch was zeigt, daß die Freisetzung stark von der Konzentration an PEG beeinflußt ist. Infolgedessen muß die Freisetzung des Progesterons bestimmt sein durch das Eindringen des Lösungsmittels in die Polymermatrix mit Auflösung und Diffusion des Wirkstoffs aus den Nanopartikeln nach außen. Wenn dagegen die Freisetzung des Wirkstoffs das Ergebnis einer einfachen Diffusion durch eine Polymermatrix wäre, würde die Zusammensetzung des Lösungsmittels zur Freisetzung die Freisetzung des Wirkstoffs nicht beeinflussen können (10).
Das Verfahren der Herstellung von Nanopartikeln, das darin besteht, das Monomer zu einer wäßrigen Lösung eines Tensids zu geben und zu rühren, um Micellen zu erhalten (2) kann die Verteilung des Wirkstoffs in den Micellen während des Polymerisationsschritts bestimmen.
Die in den 6 und 7 beobachtete rasche Freisetzung läßt vermuten, daß die Oberfläche der Partikel im Verlauf des Polymerisationsschritts an Progesteron angereichert wurde. Im übrigen konnte ein hoher Anteil des Wirkstoffs im Polymergitter gefangen sein, das eine stark poröse innere Struktur haben könnte (11). Das könnte die Erhöhung der Geschwindigkeit der Freisetzung mit steigender Konzentration an PEG klären (7), da das PEG je nach der Zusammensetzung des Freisetzungsmilieus mit verschiedenen Geschwindigkeiten in die Struktur eindringt und dann die Diffusion des Wirkstoffs nach außen modifiziert.
Trotz einer sehr erheblichen Erhöhung der Freisetzungsgeschwindigkeit, die durch den Zusatz von PEG in das Freisetzungsmilieu erhalten wird, erreicht die Freisetzung des Progesterons nicht 100% (sie liegt bei etwa 75 bzw. 82% mit 40% PEG).
Im Gegensatz dazu führt die Anwesenheit von Enzymen vom Typ Esterase im Freisetzungsmilieu zu einer rascheren Freisetzung als in einer esterasefreien Lösung und die freigesetzte Menge an Progesteron liegt sehr nahe bei 100% für die zwei getesteten Formulierungen und für die zwei Enzymkonzentrationen (8). Diese Ergebnisse lassen annehmen, daß die Progesteron-Moleküle mindestens teilweise im molekularen Zustand in der Polymermatrix der erfindungsgemäßen Nanopartikel gefangen und/oder mit dem Isobutylcyanoacrylat-Gitter verbunden sind (12). Die Verwendung von Enzymen vom Typ Esterase im Freiset zungsmilieu führt zu einem Abbau oder einer Auflösung der Polymerketten der Nanopartikel des Polycyanoacrylats. In diesem Fall werden die in der Matrix festgehaltenen Wirkstoffe durch fortschreitenden Abbau derselben freigesetzt.
Der durch die Hydrolyse der Esterbindung der Seitenketten der PIBCA hervorgerufene biologische Abbau ist der Mechanismus, der eine signifikante Beschleunigung der Freisetzung von Progesteron ermöglicht, was den von anderen Autoren berichteten Ergebnissen entspricht (12, 13). Gelegentlich führten die Untersuchungen der Freisetzung von Wirkstoffen, die in Esterasen enthaltenden Milieus durchgeführt wurden, nicht zu einer Freisetzung von 100% des eingebauten Wirkstoffs (12, 14, 15). Es wird daher angenommen, daß die Möglichkeit einer Bindung zwischen den Ketten von PIBCA und den Molekülen des Wirkstoffs besteht (12, 14). Die Profile der Freisetzung des Cyclodextrins aus Nanopartikeln, die in 9 dargestellt sind, zeigen eine sehr rasche und sehr nah bei 100% liegende Freisetzung in der ersten Stunde, was zeigt, daß diese Moleküle nicht chemisch an das Polymer gebunden sondern wahrscheinlich einfach adsorbiert oder im Polymer gefangen sind.
Die DSC-Profile der HPβCD enthaltenden Proben zeigen einen breiten endothermischen Übergang, der im Bereich von 30 bis 90°C mit in diesem Bereich liegenden Ausgangstemperaturen reproduzierbar ist (10a, c und d). Dieser asymmetrische Spitzenwert wurde der Beseitigung von Wasser zugeordnet. Die Progesteron enthaltenden Proben (physische Mischung und Progesteron allein) zeigen eine ausgeprägte endothermische Spitze bei etwa 130°C, was der Übergangstemperatur beim Schmelzen des Progesterons in kristalliner Form entspricht (10b und c). Der Komplex HPβCD-Progesteron zeigt nur den endothermischen Übergang im Bereich von 30 bis 90°C wie oben beschrieben mit Verschwinden des Schmelzübergangs der kristallinen Form des Progesterons (10d), was annehmen läßt, daß der Wirkstoff im molekularen Zustand im Hohlraum der Cyclodextrin-Moleküle dispergiert ist. Unter der gleichen Form zeigen Proben von mit Progesteron beladenen Nanopartikeln von PIBCA/HPβCD keine ausgeprägte endothermische Spitze, die in diesem Fall ersetzt ist durch einen breiten endothermischen Übergang im Bereich von 130 bis 170°C (10e und f). Dieses Phänomen läßt annehmen, daß das Progesteron sich im molekularen Zustand entweder gelöst im Polymer oder eingeschlossen in den Cyclodextrinen befindet, die mit den erfindungsgemäßen Nanopartikeln vereinigt sind. In dieser Form zeigt die Gesamtheit der Ergebnisse, welche die Freisetzung des Cyclodextrins und des Progesterons in den verschiedenen Milieus und die DSC-Kurven betreffen, zusammen mit den Daten der Literatur, daß die Morphologie der Nanopartikel dargestellt werden könnte durch einen Polymerkern, der eine Fraktion des Wirkstoffs im molekularen Zustand enthält, mit einer Oberfläche, die mit Cyclodex trin : Progesteron-Komplexen angereichert ist. Diese Struktur könnte die zwei-phasige Freisetzung des Progesterons erklären mit einer ersten raschen Phase, die vielleicht auf die Desorption des Cyclodextrin : Progesteron-Komplexes ausgehend von der Oberfläche zu erklären ist, und einer zweiten sehr langsamen Phase, welche die Diffusion des Progesterons durch das Polymergitter nach außen umfaßt.
BEISPIEL 11: Herstellung von Nanopartikeln von Polyisobutylcyanoacrylat/HPβCD, die mit verschiedenen Wirkstoffen beladen sind
Komplexe von Prednisolon, Spironolacton, Testosteron, Progesteron, Danazol und Megestrolacetat wurden erhalten, indem man 300 mg HPβCD mit 15 mg der Steroide in 15 ml Wasser bei 37°C während 72 Stunden unter magnetischer Rührung mischte. Die Suspensionen wurden filtriert (0,45 μm) und die Konzentrationen an Cyclodextrin und Wirkstoff wurden entsprechend dem folgenden Beispiel 12 gemessen. Nanopartikel von Polyisobutylcyanoacrylat/HPβCD wurden wie im Beispiel 1 hergestellt, indem man eine Lösung der verwendeten Komplexe mit einem Gehalt von 10 mg/ml HPβCD zu einer Lösung von 1% (G/V) Poloxamer zufügte.
BEISPIEL 12 (Vergleich): Herstellung von Nanopartikeln von Polyisobutylcyanoacrylat, die mit verschiedenen Wirkstoffen beladen sind
Lösungen von Hydrocortison, Prednisolon, Spironolacton, Testosteron, Progesteron, Danazol und Megestrolacetat mit Konzentrationen entsprechend der Sättigungskonzentration in Poloxamer 188 (1% G/V) wurden getrennt den Polymerisationsmilieus zugesetzt. Nanopartikel von Polyisobutylcyanoacrylat beladen mit verschiedenen Wirkstoffen wurden dann nach dem Beispiel 1 jedoch in Abwesenheit von HPβCD hergestellt.
BEISPIEL 13: Bestimmung von Hydrocortison Prednisolon Spironolacton Testosteron, Progesteron, Danazol, Megestrolacetat und HPβCD
Die verschiedenen Steroide wurden quantitativ nach Beispiel 6 bestimmt, welches die Messung dieser verschiedenen Stoffe unter den gleichen analytischen Bedingungen ermöglicht.
Das HPβCD wurde ebenfalls nach Beispiel 6 quantitativ bestimmt.
BEISPIEL 14: Charakteristika der Größe und des Zeta-Potentials von Nanopartikeln, die erfindungsgemäß in Gegenwart oder Abwesenheit von Poloxamer 188 hergestellt wurden
Die nach Beispiel 11 und 12 hergestellten Nanopartikel wurden gemäß Beispiel 7 charakterisiert. Die Größe der mit Steroiden beladenen Partikel war im allgemeinen verringert und lag nahe etwa 100 nm, wenn die erfindungsgemäßen Nanopartikel in Abwesenheit von Poloxamer 188 und nur in Gegenwart von HPβCD hergestellt waren, was annehmen läßt, daß eine Maskierung von Ladungen durch die an der Oberfläche der Partikel lokalisierten Cyclodextrin-Moleküle vorliegt.
Die folgende Tabelle III gibt die Beladung mit dem Mittel (Medikament) von Nanopartikeln von Polyalkylcyanoacrylat oder Nanopartikeln von Polyalkylcyanoacrylat und Hydroxypropyl-β-Cyclodextrin und den entsprechenden Gehalt von Cyclodextrin an (Mittelwert von 3 Werten).
Tabelle III
ERGEBNISSE DER BEISPIELE 11 bis 14: Erhöhung der Beladung mit Steroiden von erfindungsgemäßen Nanopartikeln
Die Werte der Beladungen mit Steroiden ausgedrückt in absoluten Werten für die erfindungsgemäßen Nanopartikel oder die Vergleichspartikel sind in der Tabelle IV zusammengestellt (Mittelwert von drei Herstellungen). Die Berechnung der Werte der Steigerung der Beladung der Partikel zeigt, daß die Erhöhung der Beladung das 129-fache im Fall von Prednisolon erreichen kann.
Tabelle IV
REFERENZEN

1) J. Kreuter, Colloidal Drug Delivery Systems, Marcel Decker, New York, 1994, 219–342.
2) Patente EP-B-0 007 895 (US-A-4,329,332 & US-A-4,489,055) und EP-B-0 064 967 (US-A-4,913,908).
3) C. Cuvier et coll., Biochem. Pharmacol., 44, 509–517 (1992).
4) AC de Verdiere et coll., British Journal of Cancer 76(2), 198–205 (1997).
5) M. Vikmon, Proceed. First International Symposium on Cyclodextrins, Budapest, 1981, 69–74.
6) E. Allémann et coll., Pharm. Res., 10, 1732–1737 (1993).
7) J.-C. Leroux et coll., J. Control. Rel., 39, 339–350 (1996).
8) N. Erden et coll., International Journal of Pharmaceutics, 137, 57–66 (1996).
9) J.-P. Benoit et coll., Microspheres and Drug Therapy. Pharmaceutical, Immunological and Medical Aspects, Elsevier, Amsterdam, 1984, 91–102.
10) C. Washington, Int. J. Pharm., 58, 1–12 (1990).
11) P. Couvreur et coll., J. Pharm. Sci., 68, 1521–1524 (1979).
12) F. Fawaz et coll., International Journal of Pharmaceutics, 154, 191–203 (1997).
13) J. L. Grangier et coll., J. Control. Rel., 15, 3–13 (1991).
14) Ch. Tasset et coll., J. Control. Rel., 33, 23–30 (1995).
15) B. Seijo et coll., Int. J. Pharm., 62, 1–7 (1990).

Claims

Nanopartikel, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens ein Polymer, mindestens einen Wirkstoff und mindestens ein cyclisches Oligosaccharid enthalten.
Nanopartikel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eines der Polymeren ein Poly-alkylcyanoacrylat ist, in dem die lineare oder verzweigte Alkylgruppe zwischen 1 und 12 Kohlenstoffatome enthält.
Nanopartikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das cyclische Oligosaccharid ein neutrales oder geladenes, ein natürlich vorkommendes, verzweigtes oder polymerisiertes oder chemisch verändertes Cyclodextrin ist.
Nanopartikel gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das cyclische Oligosaccharid ein Cyclodextrin ist, das durch Substitution eines oder mehrerer Hydroxypropyle durch Alkyl-, Aryl-, Aralkyl-, Glykosidgruppen, oder durch Veretherung, Veresterung mit Alkoholen oder mit aliphatischen Säuren chemisch verändert wurde.
Nanopartikel gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Größe zwischen 300 und unter 50 nm haben.
Nanopartikel gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff hydrophil, hydrophob, amphiphil und/oder unlöslich ist.
Nanopartikel gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff aus nicht krebserregenden Wirkstoffen, antisensen Molekülen, antiviralen Stoffen, Antibiotika, Proteinen, Polypeptiden, Polynukleotiden, immunisierenden Stoffen, Immunmodulatoren, Steroiden, Analgetika, Antimorphinen, Antimykotika und Schädlingsbekämpfungsmitteln ausgewählt wird.
Nanopartikel gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff Taxol oder eines seiner Derivate ist.
Nanopartikel gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff Doxorubicin oder eines seiner Derivate ist.
Nanopartikel gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff ein Platin-Derivat ist.
Nanopartikel gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Wirkstoff in einer Menge zwischen 0,01 und 300 mg/g der Nanopartikel vorliegt.
Nanopartikel gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Anteil des cyclischen Oligosaccharids zwischen 0,1 und 70 Gewicht-% liegt.
Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln auf Basis eines Polymers, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt: a) Herstellung eines Komplexes von mindestens einem Wirkstoff mit mindestens einem cyclischen Oligosaccharid, gelöst in einem wäßrigen oder nicht wäßrigen Lösungsmittel, b) Schrittweises Hinzufügen von mindestens einem Monomer des Polymers zu der in dem Schritt (a) erhaltenen Lösung und c) Durchführung einer Polymerisation dieses Monomers, zum Beispiel anionisch oder induzierbar durch andere, insbesondere photochemische Reagenzien, eventuell in Gegenwart eines oder mehrerer grenzflächenaktiver und/oder stabilisierender Reagenzien.
Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln auf Basis eines Polymers, gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt: – Herstellung der Nanopartikel auf Basis eines Polymers und besonders von Poly-alkylcyanoacrylat und eines cyclischen Oligosaccharids, – Hinzufügen des Wirkstoffs zu den besagten Nanopartikeln.
Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln auf Basis eines Polymers, gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Schritte umfaßt: a) Herstellung einer Lösung mit mindestens einem cyclischen Oligosaccharid in einer wäßrigen oder nicht wäßrigen Lösung, b) Schrittweises Hinzufügen von mindestens einem Monomer des Polymers und besonders von Alkyl-cyanoacrylat-Monomer in die Lösung des Schritts (a) und c) Durchführung einer Polymerisation dieses Monomers, vorzugsweise anionisch aber auch induzierbar durch andere, insbesondere photochemische Reagenzien, eventuell in Gegenwart eines oder mehrerer grenzflächenaktiver und/oder stabilisierender Reagenzien, d) nach einer Kontrolle und einer eventuellen Reinigung der im Schritt (c) erhaltenen Nanopartikel, Inkubieren der besagten Partikel in einer Lösung des Wirkstoffs in einem wäßrigen oder nicht wäßrigen Lösungsmittel.
Verfahren zur Herstellung von Nanopartikeln auf Basis von Poly-alkylcyanoacrylat gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man im Schritt (b) schrittweise mindestens ein Alkyl-cyanoacrylat-Monomer hinzufügt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß bei den Schritten (a), (b) und (d) das Lösungsmittel vorteilhafterweise so ausgewählt wird, daß bei der Polymerisation der Polymeren und besonders der Poly-alkylcyanoacrylate für die Polymerisation günstige Bedingungen aufrecht erhalten werden, wobei die Löslichkeit des Wirkstoffs und des cyclischen Oligosaccharids in der durch dieses Lösungsmittel festgelegten Umgebung maximal ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt (c) ohne grenzflächenaktives und/oder stabilisierendes Mittel durchgeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt (a) das Mengenverhältnis des cyclischen Oligosaccharids im Vergleich zu dem besagten Wirkstoff im allgemeinen zwischen 0,1 und 70 Gewicht-% liegt.
Einsatz des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 13 bis 19 zur Herstellung eines Medikaments mit gezielter Wirkung und mit einem verbesserten therapeutischen Index.
Nanopartikel, das die Vereinigung eines Polymers und besonders von Poly-alkylcyanoacrylaten und einem cyclischen Oligosaccharid enthält, das man durch die Schritte (a) bis (c) eines Verfahrens gemäß dem Anspruch 15 erhalten kann.
Nanopartikel gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das cyclische Oligosaccharid ein neutrales oder geladenes, ein natürlich vorkommendes, verzweigtes oder polymerisiertes oder chemisch verändertes Cyclodextrin ist.