JP5224313B2 - プラスミド送達用粒子 - Google Patents
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ポリマー粒子に抱合させるプラスミドDNA(pDNA)としては、J. Gene Med.(2003) 5:609-617に記載のDNAワクチンであるpCMVrev/envを用いた。該プラスミドは、プラスミドpIIIenv3-1(NIH Research and Reference Reagent Program, 国立衛生研究所、米国メリーランド州;カタログ番号289)から制限酵素SalI/XhoIで切り出した、HIVIIIBのエンベロープタンパク質gp160遺伝子とRev遺伝子とを含む核酸断片を、市販の発現プラスミドpcDNA3.1(Invitrogen社)に組み込んだものであり、gp160遺伝子及びRev遺伝子の発現はCMVプロモーターにより制御されるものであった。
DNA抱合量=DNA添加量−抱合されなかったDNA量
DNA抱合率(%)=DNA抱合量÷DNA添加量×100
マンナン100mgを0.002N塩酸溶液(pH2.8) 10mlに溶解し、上記したpDNA 0.3mgを該溶液に加えた。次いで、100μLのHistoacryl(登録商標)(反応液中濃度1.0v/v%)を撹拌下加えた。600rpmで30分間撹拌しながら重合反応を続けた。その後、0.1N水酸化ナトリウム溶液を滴下し、中和後15分間撹拌した。Millex-SV (5μm)filter(MILLIPORE社)で濾過後、濾液をCentriprep-YM10 Filter(MILLIPORE社)を用いて2000rpmで10分間遠心濾過した。フィルターを通過しなかった液に滅菌水を加え、再度遠心濾過することにより、粒子の洗浄を行なった。この洗浄操作を合計3回行ない、pDNA抱合粒子を得た。
マンノース200mgを0.002N塩酸溶液(pH3.4)12mlに溶解し、上記したpDNA 1mgを該溶液に加えた。撹拌しながらEtOH 8ml(反応液中濃度40v/v%)を加えた。次いで、200μLのHistoacryl (登録商標)(反応液中濃度1.0v/v%)を撹拌下加えた。600rpmで15分間撹拌しながら重合反応を続けた。その後、0.1N水酸化ナトリウム溶液を滴下し、中和後15分間撹拌した。Millex-SV (5μm)filter (MILLIPORE社)で濾過後、濾液をCentriprep-YM10 Filter (MILLIPORE社)を用いて2000rpmで10分間遠心濾過した。フィルターを通過しなかった液に2.5%グルコース水溶液を加え、再度遠心濾過することにより、粒子の洗浄を行なった。この洗浄操作を合計4回行ない、pDNA抱合粒子を得た。
マンナン20mgとマンノース200mgを0.002N塩酸溶液(pH3.4)12mlに溶解し、上記したpDNA 1mgを該溶液に加えた。撹拌しながらEtOH 8ml(反応液中濃度40v/v%)を加えた。次いで、200μLのHistoacryl (登録商標)(反応液中濃度1.0v/v%)を撹拌下加えた。600rpmで15分間撹拌しながら重合反応を続けた。その後、0.1N水酸化ナトリウム溶液を滴下し、中和後15分間撹拌した。Millex-SV (5μm)filter (MILLIPORE社)で濾過後、濾液をCentriprep-YM10 Filter (MILLIPORE社)を用いて2000rpmで10分間遠心濾過した。フィルターを通過しなかった液に2.5%グルコース水溶液を加え、再度遠心濾過することにより、粒子の洗浄を行なった。この洗浄操作を合計4回行ない、pDNA抱合粒子を得た。
糖類として、マンノース500mg(参考例1)、マンノース100mg(参考例2)、マンナン10mg(参考例3)又はマンナン10mg及びマンノース100mg(参考例4)を用いた。
実施例1で得られた粒子をマウスに投与し、J. Gene Med.(2003) 5:609-617に記載される方法によりテトラマーアッセイを行なって免疫誘導効果を評価した(J. Gene Med.(2003) 5:609-617)。
Claims (10)
- 生体細胞内で機能させるべき所望の核酸を含み、該核酸を発現可能なプラスミドを抱合したシアノアクリレートポリマー粒子を媒体中に含有する、前記核酸を生体細胞内に送達し且つ発現させるための経口医薬組成物であって、前記粒子が、シアノアクリレートモノマー、糖類及びプラスミドの共存下において、前記モノマーをアニオン重合させることにより製造された粒子である、経口医薬組成物。
- 前記糖類が、水酸基を有する単糖類、水酸基を有する二糖類及びマンナンから成る群より選ばれる少なくとも1種の糖類である請求項1記載の経口医薬組成物。
- 前記糖類がマンノース及び/又はマンナンである請求項2記載の経口医薬組成物。
- 前記アニオン重合がアルコール溶媒中で行なわれる請求項1ないし3のいずれか1項に記載の経口医薬組成物。
- 前記アルコール溶媒が20〜60v/v%エタノール水溶液である請求項4記載の経口医薬組成物。
- 前記シアノアクリレートがn−ブチルシアノアクリレートである請求項1ないし5のいずれか1項に記載の経口医薬組成物。
- 前記粒子の平均粒径が40nm〜800nmである請求項1ないし6のいずれか1項に記載の経口医薬組成物。
- 前記プラスミドが抗原物質をコードする核酸を含み、該抗原物質を発現可能なプラスミドである請求項1ないし7のいずれか1項に記載の経口医薬組成物。
- 前記プラスミドがDNAワクチンである請求項1ないし7のいずれか1項に記載の経口医薬組成物。
- DNAワクチンが、HIV用のDNAワクチンである請求項9記載の経口医薬組成物。
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