CN101959523A - 革兰氏阳性细菌用抗菌剂 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了超越细菌的耐药性机制的新型革兰氏阳性细菌用抗菌剂。该抗菌剂含有下述粒子作为有效成分，所述粒子是粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的、粒径为5μm以下的粒子，且基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分。通过本发明的抗菌剂，还能够对以MRSA、VRE为代表的显示多药耐药性的革兰氏阳性细菌进行抗菌，而且还可以避免新的多药耐药菌出现这一抗生素使用中的重大问题。

Description

革兰氏阳性细菌用抗菌剂
技术领域
本发明涉及革兰氏阳性细菌用抗菌剂，其含有基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分的粒子作为有效成分。
背景技术
近年来，很多抗生剂被不断地开发，使得如今抱有细菌感染症已经被克服的错觉，然而，细菌一一掌握了针对多种抗生素的防御机理而幸存，并作为医院内感染的病原菌而引发重大的事态。耐甲氧西林黄色葡萄球菌(MRSA)以及耐万古霉素肠球菌(VRE)、耐万古霉素黄色葡萄球菌(VRSA)、进而多药耐药性铜绿假单胞菌(MDRP)等多数耐药菌对现存的几乎所有抗生剂有耐性，因而全世界都期待着尽快找到对策。
抗生素的耐药机理是针对各抗生素的特异性机制，多药耐药菌是运用其多样构造而由抗生素的多药联用疗法中幸存。为了应对该问题，开始了采用新抗生素的探索或结构改变、药物传递方法的改进、从耐药菌的全基因组解析到蛋白质组学技术、多位点测序(Multi-locus sequence typing)技术或常居菌干扰作用等各种各样的办法的多种研究。它们的成效还不充分，还需要同时包含多种耐药机理的对策。
为了通过药物释放系统(DDS)、缓释来提高药物的效果，药剂微粒化的研究不断发展，例如使药剂与氰基丙烯酸酯聚合物粒子结合的DDS是公知的(专利文献1、2及非专利文献1)。但是，在至今为止的任何研究中，目的都是药物的DDS和缓释，对于微粒单体的抗菌作用完全未知。
专利文献1：日本特表平11-503148号公报
专利文献2：日本特表2002-504526号公报
非专利文献1：Christine Vauthier et al.，Adv.Drug Deliv.Rev.，55，519-548(2003)
发明内容
发明要解决的课题
因此，本发明的目的在于，提供超出耐药菌所掌握的多种抗生素耐药机理，可以对多种多药耐药菌发挥抗菌作用的新手段。
解决课题的手段
本申请发明人等一直以来对抗菌药的利用丙烯酸系纳米微囊结合的药物传递方法进行了研究，但此次，基于由该研究获得的技术诀窍(know how)，首次将不结合抗菌药的粒子单体应用于细菌，结果发现粒子与细菌的细胞壁特异性粘附后的溶菌现象，从而完成了本发明。
即，本发明提供革兰氏阳性细菌用抗菌剂，其含有下述粒子作为有效成分，所述粒子是粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的、粒径为5μm以下的粒子，且基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分。另外，本发明还提供革兰氏阳性细菌的抗菌方法，其包括使有效量的粒子与要抗菌的革兰氏阳性细菌接触，所述粒子是粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的、粒径为5μm以下的粒子，且基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分。进而，本发明还提供粒子用于制造革兰氏阳性细菌用抗菌剂的用途，所述粒子是粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的、粒径为5μm以下的粒子，且基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分。
发明效果
通过本发明，可以提供利用与公知的抗生素完全不同的机理的新型抗菌手段。作为不使用抗生素的杀菌剂，已有消毒药，但它们是外用药，由于其毒性而无法进行体内给药，无法用于感染症治疗。本发明中使用的粒子由于可以使用已确认了对人体的安全性、正被实际使用的原材料来制备，因此还可以用于感染症治疗。本发明的抗菌剂由于是超越了细菌的耐药机理的抗菌剂，因此对于以MRSA、VRE为代表的显示多药耐药性的革兰氏阳性细菌也能够适用，而且还可以避免新的多药耐药菌出现这一抗生素使用中的重大问题。通过本发明，不仅拓宽了对多药耐药菌感染症的治疗途径，而且创造了抗菌药研发的全新领域，可以期待在抗菌药研究中产生革命性的局面。
附图说明
[图1]VSE及VRE菌体的SEM照片。
[图2]万古霉素处理后的VRE NCTC12201株的SEM照片。
[图3]用制造例1中制备的0.01NHCl-Dex70+Glucose粒子处理过的、VRE NCTC12201株的SEM照片(粒子处理1小时后、3小时后及6小时后)。
[图4]用制造例1中制备的0.01NHCl-Dex70+Glucose粒子处理过的、VRE NCTC12201株及GTC02000株的SEM照片(粒子处理1小时后)。
[图5]用制造例1中制备的0.01NHCl-Dex70+Glucose粒子处理过的、MRSA JCM8703菌株的SEM照片(粒子处理1小时后、3小时后及6小时后)。
[图6]制造例3中制造的各粒子的粒径分布的曲线图。
[图7]制造例3中制造的各粒子的ζ-电位分布的曲线图。
具体实施方式
本发明的革兰氏阳性细菌用抗菌剂含有下述粒子作为有效成分，所述粒子是粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的粒子，且基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分。
本发明中使用的粒子具有下述特征，即粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜。如下地进行粒子是否粘附于细胞壁、细胞膜等细胞表面的判断。将粒子在生理盐水或Mueller Hinton Broth等培养液中悬浊(6μg/ml)，使用市售的24孔细胞培养板(通常，每1孔的容量为3.29ml、底面培养表面积为1.91cm2)，在每1孔105个～106个/1ml程度的革兰氏阳性细菌或哺乳动物细胞数中添加该悬浊液1ml。放置至少1小时后，用微量移液管向每1孔加入1ml生理盐水，缓缓振荡板2～3次后，吸除上清洗涤液。进而，将同样的洗涤操作重复2次。用电子显微镜对如此得到的细胞试样进行观察，在细胞表面发现粒子的情况判断为粘附，没有发现的情况判断为不粘附。需要说明的是，通过所述处理粒子有时会侵入细胞内，但在粘附性评价中不考虑有无侵入细胞内。众所周知，哺乳动物细胞表面没有细胞壁，而是被细胞膜覆盖，该细胞膜的结构由脂质双分子层构成，这种哺乳动物细胞的表面结构无论是来源于任何动物种类或组织，基本上都是相同的。因此，对于用于判断是否粘附于哺乳动物细胞膜的哺乳动物细胞的种类没有特别限定。另外，可以是从生物体采集的组织细胞块或将其分离而制备得到的细胞，也可以是经株化的培养细胞。例如，如下述实施例的记载，可以使用人培养细胞株即HeLa细胞或仓鼠CHO细胞等细胞，来评价对哺乳动物细胞膜的粘附性。以下，本说明书中，有时将不粘附于哺乳动物细胞膜而粘附于革兰氏阳性细菌细胞壁的该粒子的粘附性称为“特异性粘附”。
另外，该粒子是基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分的粒子。所谓“抗菌活性成分”，是指可以在生物化学上作用于革兰氏阳性细菌的代谢途径或生理机能而阻止该细菌发育的化学物质成分，具体地，是指能够利用于革兰氏阳性细菌的抗菌中的抗生素以外的化学物质成分。所谓“基本上不含”，意思是完全不含抗菌活性成分，或者即使含有也只不过含有对革兰氏阳性细菌(对该抗菌活性成分为敏感性)无法进行抗菌程度的微量的该抗菌活性成分。“无法进行抗菌程度的微量”的意思是，将每单位体积粒子所含的粒子中的抗菌活性成分量定义为粒子中的含有浓度，将与该含有浓度相同浓度的抗菌活性成分不与粒子结合而单独作用于敏感性革兰氏阳性细菌时，无法阻止该敏感性革兰氏阳性细菌的发育的量。作为本发明中使用的粒子，优选完全不含抗生素等抗菌活性成分。
本发明的抗菌剂不是利用抗生素的抗菌活性的物质，而是通过粒子对细胞壁粘附的作用引起溶菌，阻止细菌发育的物质。虽然粒子的上述特异性粘附性引起溶菌的详细原理不明，本发明的范围不拘于理论，但考虑如下。即，细胞壁合成基本是形成UDP-MurNAc-五肽、以及接着与细胞膜的脂肪酸结合后，与GluNAc结合得到的脂质-MurNAc(GluNAc)-五肽，该MurNAc与合成中的肽聚糖的GluNAc结合而构建出多枝结构的细胞壁。该细胞壁合成是在细胞壁的外侧进行的，因此，粒子通过粘附于细菌表面而阻碍细胞壁合成，导致溶菌。
本发明的抗菌剂的抗菌作用受上述粒子的粒径和ζ-电位影响(参照下述实施例)。本发明中所用的粒子的粒径为5μm以下，优选为2μm以下，更优选为1μm以下。需要说明的是，粒径的下限没有特别限定，例如在用如下述实施例中所记载的方法通过丙烯酸酯系单体的聚合来制造丙烯酸酯系聚合物粒子时，粒子的粒径通常为7nm左右以上(图6)。抗菌剂所含有的粒子全体的平均粒径优选为20nm～500nm，特别优选为20nm～300nm。另外，ζ-电位表示粒子表面的电荷，因此是粒子的分散性的指标。本发明中使用的粒子粘附于数百nm～数μm程度的尺寸的细菌表面而起作用，因此优选具有不发生凝集的程度的分散性，虽没有特别限定，但ζ-电位优选为-3mV～-80mV。粒子尺寸及ζ-电位，如下述实施例记载那样，通过使用了He·Ne激光的市售装置(实施机种：Zetasizer Nano，Malvern Inst.UK社制)就可以容易地测定。通过该装置，可以得到如图6及图7所示的粒径分布及ζ-电位分布的曲线图，可以算出平均粒径和ζ-电位。需要说明的是，通过该装置测定平均粒径的原理是，通过由被粒子布朗运动散射的激光的强度变动求出粒径的光子相关法(动态散射法)算出；另外，ζ-电位的测定原理是粒子的电泳。
具有上述特异性粘附性的粒子优选为在重复单元中具有下述通式(I)
[化1]
Figure BPA00001211601300051
(式中、Z表示给电子基团)
所表示的结构的聚合物粒子。式中的波浪线表示与通式(I)所示的结构结合的、聚合物结构中的其他结构部分。具有给电子基团和存在于α位的羧基的通式(I)的结构显示出与糖蛋白质的高亲和性。因此，显示出与由存在于细菌细胞表层的肽聚糖构成的细胞壁多枝结构的亲和性，能够优选地发挥上述特异性粘附性。
作为给电子基团Z，优选氰基、氨基或亚氨基，其中，优选氰基。
作为通式(I)所示的结构，没有特别限定，可以举出例如下述通式(II)所示的结构。
[化2]
Figure BPA00001211601300061
(式中，Z与上述通式(I)中的定义相同，R为氢、羟基、碳原子数1～10的烷基、碳原子数1～10的烷氧基、碳原子数6～15的芳基、碳原子数6～15的芳氧基、碳原子数7～16的芳烷基或碳原子数7～16的芳烷氧基。构成R中的碳链的1个以上的碳原子可以被氮、硫或氧替代。)
通式(II)中，优选R为羟基或碳原子数1～10的烷氧基的结构，特别优选R为正丁氧基的结构。Z的优选例如上所述。因此，作为通式(II)的结构，特别优选Z为氰基且R为正丁氧基的结构。
本发明中使用的粒子中，在重复单元中具有上述通式(II)所表示的结构的聚合物粒子可以通过例如使下述通式(III)
[化3]
Figure BPA00001211601300062
[Z及R与上述通式(II)中的定义相同，X及Y各自独立地表示末端具有碳-碳双键的原子团、或X及Y合在一起表示亚甲基。]
所表示的单体在具有羟基的糖类和/或聚山梨醇酯的共存下进行聚合来制造。作为具有这种结构的单体，可以举出例如丙烯酸酯系单体，丙烯酸酯系单体有各种各样的市售品，可以优选地使用这样的市售品。另外，其他单体，例如可以采用化学合成领域中公知的常规方法由市售的丙烯酸酯系单体容易地制备。
通式(III)所示的单体中，优选R为羟基或碳原子数1～10的烷氧基的单体、即被给电子基团Z取代的丙烯酸酯系单体。另外，作为给电子基团Z，如上所述，优选氰基、氨基或亚氨基，其中优选氰基。即，作为上述单体，特别优选氰基丙烯酸酯系单体。作为氰基丙烯酸酯系单体的优选例，例如可以举出下式表示的正丁基-2-氰基丙烯酸酯(nBCA)。nBCA是以往在外科领域中作为缝合伤口用的粘附剂而被使用的物质，对人体的安全性受到保证。
[化4]
Figure BPA00001211601300071
上述单体可以通过阴离子聚合来进行聚合。阴离子聚合中，没有特别限定，为了聚合引发及聚合稳定化，可以使用糖类和/或聚山梨醇酯。因此，可以在本发明中使用的“聚合物粒子”也包括含有糖类、聚山梨醇酯这样的聚合引发及稳定剂的物质。通过使用糖类和/或聚山梨醇酯，可以优选地制备粒径不均少的均匀的粒子。
糖类没有特别限定，可以是具有羟基的单糖类、具有羟基的二糖类及具有羟基的多糖类的任一种。作为单糖类，可以举出例如葡萄糖、甘露糖、核糖及果糖等。作为二糖类，可以举出例如麦芽糖、海藻糖、乳糖及蔗糖等。作为多糖类，可以使用以往公知的氰基丙烯酸酯聚合物粒子的聚合中所使用的葡聚糖、甘露聚糖等。这些糖可以是环状、链状的任意形态，另外，环状的情形，可以是吡喃糖型或呋喃糖型等的任一种。另外，糖存在各种各样的异构体，这些异构体的任一种都是可以的。通常，单糖以吡喃糖型或呋喃糖型的形态存在，二糖是单糖进行α结合或β结合而成的，处于上述通常形态的糖可以直接使用。另外，作为聚山梨醇酯，没有特别限定，可以是聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯(商品名Tween 20)、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯(商品名Tween 80)等公知的Tween系表面活性剂的任一种。单糖类、二糖类及多糖类以及聚山梨醇酯可以单独使用，也可以将2种以上组合使用。上述的糖类及聚山梨醇酯中，优选葡萄糖、核糖、乳糖、海藻糖、葡聚糖、Tween 20(商品名)，作为葡聚糖，优选平均分子量7万以上的聚合度的葡聚糖。葡聚糖的分子量的上限没有特别限定，但通常为分子量50万左右以下。
聚合反应的溶剂通常使用水。因为阴离子聚合是由氢氧根粒子引发的，所以反应液的pH会影响聚合速度。反应液的pH高时，由于氢氧根离子的浓度增高因而聚合快，pH低时则聚合减慢。通常，在pH为2～4左右的酸性下，能够得到合适的聚合速度。作为用于使反应液为酸性而添加的酸，没有特别限定，可以优选使用对反应没有不良影响，反应后会挥发的盐酸。
反应开始时的聚合反应液中的单体的浓度，没有特别限定，但通常为0.5v/v％～2.0v/v％左右，优选为0.8v/v％～1.5v/v％左右。聚合反应中使用糖类和/或聚山梨醇酯时，反应开始时的聚合反应液中的糖类和/或聚山梨醇酯的浓度(使用多种时为它们的合计浓度)，没有特别限定，但通常为0.5％～10％左右，优选为0.75％～7.5％左右。需要说明的是，糖类的浓度意指w/v％，聚山梨醇酯的浓度意指v/v％，例如单独使用糖类时，上述的浓度范围分别意指“0.5w/v％～10w/v％”、“0.75w/v％～7.5w/v％”。另外，并用糖类5w/v％、聚山梨醇酯1v/v％时，它们的合计浓度则为6％。但是，仅使用单糖类(例如葡萄糖)时，优选使用2.5w/v％～10w/v％左右。另外，反应温度没有特别限定，在室温下进行是简便的，因而优选。反应时间没有特别限定，但通常为15分钟～4小时左右，优选为30分钟～3小时左右。聚合反应优选在搅拌下进行。需要说明的是，粒子通常是作为中性粒子来使用的，因此优选在反应结束后，向反应液中添加氢氧化钠水溶液等碱来进行中和。
通过上述聚合反应，单体发生阴离子聚合而生成聚合物粒子。生成的粒子可以通过离心式超滤等常规方法来回收。通过上述方法，可以得到平均粒径为20nm～500nm左右、优选为20nm～300nm左右，ζ-电位为-3mV～-80mV左右的聚合物粒子，可以将该粒子作为上述的粒子而优选地用于本发明。需要说明的是，粒子的尺寸能够通过调节反应液中的单体的浓度或反应时间来调节。另外，使用糖类和/或聚山梨醇酯作为聚合引发-稳定剂时，也可以通过改变该聚合引发-稳定剂的浓度或种类来调节粒子尺寸(参照下述实施例)。
本发明的抗菌剂显示出抗菌作用的菌是革兰氏阳性细菌。只要是革兰氏阳性细菌就没有特别限定，可以是MSSA(甲氧西林敏感性黄色葡萄球菌)、VSE(万古霉素敏感性肠球菌)等对抗生素有敏感性的细菌，另外，也可以是MRSA(甲氧西林耐性黄色葡萄球菌)、VRE(耐万古霉素肠球菌)等多药耐药菌，都可以用本发明的抗菌剂进行抗菌。本发明的抗菌剂与革兰氏阳性细菌的抗生素耐性没有关系，是利用上述粒子的特异性粘附而使革兰氏阳性细菌溶菌，从而抑制其增殖的物质。因此，利用本发明的抗菌剂，除了可以针对现存的多药耐药菌进行抗菌，还不会引起新的多药耐药菌，因此在临床应用上极为有利。
本发明的抗菌剂可以仅由上述粒子构成，另外，在用于治疗革兰氏阳性细菌感染症时，也可以与公知的赋形剂、载体等混合，制备成适于给药方法的形态。该粒子可以仅由单一种类的粒子构成，或者也可以将2种以上的粒子混合使用。作为本发明的抗菌剂的给药方法，可以举出皮下、肌肉内、腹腔内、动脉内、静脉内、直肠内等非口服给药、以及口服给药。具体地，例如可以通过将粒子悬浊于生理缓冲盐水中，通过注射等来进行非口服给药，或者可以制成胶囊剂或糖浆剂等来进行口服给药，但并限定于这些方式。另外，将本发明的抗菌剂用于医疗器具等的杀菌时，例如使上述粒子分散于水、醇溶剂等，将医疗器具等浸渍于其中即可。通过将上述粒子给药至生物体或使上述粒子与器具类等接触，使要抗菌的革兰氏阳性细菌与上述粒子接触，从而可以对革兰氏阳性细菌进行抗菌。
上述粒子的抗菌活性的强度(MIC值及MBC值)受粒子的粒径、ζ-电位等的影响，另外，也会根据耐药菌的种类而不同，但通常该粒子在体外在0.01mg/ml～25mg/ml左右的浓度就显示出抗菌作用。例如，由下述实施例中记载的氰基丙烯酸酯聚合物形成的粒子，对于下述实施例中使用的各种黄色葡萄球菌株及肠球菌株，在体外在0.025mg/ml～6.4mg/ml左右的浓度显示出抗菌作用。将本发明的抗菌剂用于感染症治疗时，没有特别限定，对于成年人，通常每次给药上述粒子0.1g～100g左右，特别是0.1g～25g左右即可。
实施例
以下，基于实施例来具体说明本发明。但本发明不受下述实施例的限定。
制造例1
氰基丙烯酸酯系聚合物粒子的制造
(葡聚糖、葡聚糖+葡萄糖反应体系)
使用nBCA(Histoacryl(注册商标)、Braun社、德国Melsungen)作为单体来制造氰基丙烯酸酯系聚合物粒子。作为聚合引发-稳定剂，单独使用葡聚糖或使用葡聚糖+葡萄糖。葡聚糖使用的是平均分子量70K的葡聚糖(Dex70)。
在100ml的盐酸中溶解(1)1g的Dex70、或(2)1g的Dex70和5g的葡萄糖。盐酸浓度为0.05N、0.01N、0.001N的3种。在对各溶液搅拌下，加入1.2mL的nBCA(反应液中浓度1.2v/v％)，在室温继续搅拌2小时(600rpm)，进行聚合反应。在聚合后的反应液中加入0.1NNaOH进行中和，之后搅拌15分钟。用5μm尺寸的Milex过滤器(商品名、MILLIPORE社)过滤该反应液后，使用Centriprep过滤器(商品名、MILLIPORE社)，以3000rpm/15分钟对滤液进行离心过滤。对于没有通过Centriprep过滤器的液体，再加入DW进行悬浊后，以3000rpm/15分钟离心，同样的操作进行3次，得到聚氰基丙烯酸酯粒子(0.05NHCl-Dex70，0.05NHCl-Dex70+Glucose，0.01NHCl-Dex70，0.01NHCl+Glucose，0.001NHCl-Dex70，0.001NHCl-Dex70+Glucose)。
对于得到的粒子，使用利用了He·Ne激光散射光方式的市售的测定装置(实施机种：Zetasizer Nano，Malvern Inst.UK社制)，测定平均粒径和ζ-电位。结果示于表1。
[表1]
Figure BPA00001211601300111
实施例1
氰基丙烯酸酯系聚合物粒子的抗菌活性
(葡聚糖、葡聚糖+葡萄糖反应体系)
调查制造例1中制造的粒子针对各种菌株的抗菌活性(最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC))。作为阳性对照，使用了氨苄青霉素(ABPC)。测定方法是按照微量液体稀释法(NCCLS)。即，APBC以256μg/ml作为原液(1倍稀释)，粒子以6.4mg/ml作为原液(1倍稀释)，各自制备2倍稀释～2048倍稀释的12等级的稀释系列，对抗菌活性进行评价。将这些稀释系列添加到96孔板中，向各孔加入菌株使其达到105CFU/ml，在35℃孵育18小时，将目测观察到混浊的情形作为菌株有发育，将没有发现发育的最低浓度作为MIC。从没有发现发育的孔中采集溶液，添加到不含抗生素的培养基中，在35℃孵育18小时后，目测观察有无混浊。将没有观察到混浊的最低浓度作为MBC。结果示于表2～表4。表中的数值为，ABPC：μg/ml、聚合物粒子：mg/ml、括号内表示稀释倍率。
[表2]
[表3]
Figure BPA00001211601300131
[表4]
Figure BPA00001211601300132
在葡聚糖反应体系和葡聚糖+葡萄糖反应体系中，得到的粒子的抗菌活性是相同程度的。关于盐酸浓度，与0.05N相比，0.01N的抗菌活性有增高的倾向。
针对黄色葡萄球菌的MIC为0.025～0.4mg/ml，M SSA和MRSA表现出相同程度的抗菌活性。MBC在不同株间存在差异。
另外，针对肠球菌的MIC为0.1～0.2mg/ml，针对VSE和VRE的抗菌活性没有差别。MBC有时被发现在株间有显著差异(1.6mg/ml和0.1mg/ml)。
制造例2
氰基丙烯酸酯系聚合物粒子的制造
(葡萄糖、核糖、乳糖、海藻糖反应体系)
使用nBCA(Histoacryl(注册商标)、Braun社、德国Melsungen)作为单体来制造氰基丙烯酸酯系聚合物粒子。作为聚合引发-稳定剂，使用葡萄糖、核糖、乳糖、海藻糖。
除了使用5g上述单糖类及二糖类的任一种作为糖类以外，进行与制造例1同样的操作，制造聚氰基丙烯酸酯粒子(0.05NHCl-Glucose，0.05NHCl-Ribose，0.05NHCl-Lactose，0.05NHCl-Trehalose，0.01NHC1-Glucose，0.01NHCl-Ribose，0.01NHCl-Lactose，0.01NHCl-Trehalose，0.001NHCl-Glucose)。
对于得到的粒子，用市售的测定装置(上述)进行He·Ne激光散射光解析，测定平均粒径和ζ-电位。结果示于表5。
[表5]
Figure BPA00001211601300151
实施例2
氰基丙烯酸酯系聚合物粒子的抗菌活性
(葡萄糖、核糖、乳糖、海藻糖反应体系)
按照与实施例1同样的操作，调查制造例2中制造的粒子对各种菌株的抗菌活性(最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC))。结果示于表6～表8。
[表6]
Figure BPA00001211601300161
[表7]
Figure BPA00001211601300162
[表8]
Figure BPA00001211601300171
比较单糖系和二糖系时，则单糖系的聚合物粒子的抗菌活性更高。就盐酸浓度的影响来看，抗菌活性为，在单糖系中0.01NHCl系＞0.05NHCl系，在二糖系中0.01NHCl系≤0.05NHCl系。
针对黄色葡萄球菌的MIC为0.4～3.2mg/ml，MSSA和MRSA表现出相同程度的抗菌活性。MBC在不同株间存在差异。
针对肠球菌的MIC为1.6～3.2mg/ml，对VSE和VRE的抗菌活性没有差别(未显示数据)。MBC有时被发现在株间有显著差异(1.6mg/ml和＞6.4mg/ml)。
制造例3
氰基丙烯酸酯系聚合物粒子的制造
(Tween20、Tween20+葡萄糖反应体系)
使用nBCA(Histoacryl(注册商标)、Braun社、德国Melsungen)作为单体来制造氰基丙烯酸酯系聚合物粒子。作为聚合引发-稳定剂，使用Tween20、Tween20+葡萄糖。聚合反应时间为1小时，对于制造例1中研究的Dex70及Dex70+葡萄糖，再次进行研究。
在0.01N的盐酸100ml中溶解(1)1ml的Tween20、(2)1ml的Tween20和5g的葡萄糖、(3)1g的Dex70、(4)1g的Dex70和5g的葡萄糖。在对各溶液搅拌下，加入1.2mL的nBCA(反应液中浓度1.2v/v％)，在室温继续搅拌1小时(600rpm)，进行聚合反应。在聚合后的反应液中加入0.1N NaOH进行中和，之后搅拌15分钟。使用5μm尺寸的Milex过滤器(商品名、MILLIPORE社)过滤该反应液后、用Centriprep过滤器(商品名、MILLIPORE社)以3000rpm/15分钟对滤液进行离心过滤。对于没有通过Centriprep过滤器的液体，再加入DW进行悬浊后，以3000rpm/15分钟离心，同样的操作进行4次，得到聚氰基丙烯酸酯粒子(0.01NHCl-Tw20、0.01NHCl-Tw20+Glucose、0.01NHCl-Dex70(1hr)、0.01NHCl-Dex70+Glu(1hr))。
对于得到的粒子，用市售的测定装置(上述)进行He·Ne激光散射光解析，测定平均粒径和ζ-电位。结果示于表9。由利用该装置的解析而得到的粒径分布的曲线图示于图6，ζ-电位分布的曲线图示于图7。
[表9]
Figure BPA00001211601300181
实施例3
氰基丙烯酸酯系聚合物粒子的抗菌活性
(Tween20、Tween20+葡萄糖反应体系)
按照与实施例1同样的操作，调查制造例3中制造的粒子对各种菌株的抗菌活性(最低抑菌浓度(MIC))。结果示于表10。
[表10]
在使用Tween20的反应体系中，有无使用葡萄糖所得到的聚合物粒子的抗菌活性都没有差异，是相同程度。另外，与使用葡聚糖的反应体系对比，聚合物粒子的抗菌活性也是相同程度。针对黄色葡萄球菌和肠球菌的MIC为0.05～0.1mg/ml，对敏感性菌和耐药菌均显示出同等的抗菌活性。
实施例4
聚合物粒子的粘附性及溶菌现象的确认
通过电子显微镜，对用制造例1中制备的0.01NHCl-Dex70+Glucose粒子处理过的革兰氏阳性细菌的形态变化进行观察。利用聚合物粒子的处理如下进行。
将上述粒子悬浊于生理盐水中，制备粒子悬浊液(6μg/ml)。使用市售的24孔细胞培养板，向每1孔105个～106个/1ml程度的革兰氏阳性细菌或哺乳动物细胞数中添加每1孔1ml的粒子悬浊液，在孔中于室温使粒子和细菌混合浮游1小时。然后，添加1ml/孔的生理盐水，将板振动2～3次，吸除洗涤液。该洗涤操作重复2次，进行合计3次的洗涤操作，用扫描型电子显微镜(SEM)观察洗涤后的细菌。
即便使万古霉素作用于耐万古霉素的多药耐药菌即VRE的NCTC12201株，也完全看不到变化(图2)，但如果用上述聚合物粒子进行处理，则观察到粒子粘附于细菌表面，菌体溶胀而发生溶菌的形态(图3)。对于VRE之外的其他菌株，也同样观察到粒子的粘附和溶菌现象，在菌株间没有发现形态变化上的差异(图4)。在甲氧西林耐性的多药耐药菌即MRSA的JCM8703菌株中，也与VRE同样地观察到聚合物粒子对细菌表面的粘附和溶菌现象(图5)。
另一方面，为了研究对哺乳动物细胞的粘附性，对于在24孔细胞培养板中培养的HeLa细胞或CHO细胞，进行与上述同样的粒子处理及洗涤操作，并用SEM观察细胞，结果没有发现粒子对细胞表面的粘附。由此可以确认，该粒子不具有对哺乳动物细胞膜的粘附性。需要说明的是，对于该粒子对生物体的毒性，使用小鼠进行了日本药典的亚急性毒性试验，没有发现毒性症状。
参考例关于聚合物粒子洗涤外液(洗浄外液)的抗菌活性
利用在制造例1至3中用Centriprep过滤器通过离心过滤洗涤聚合物粒子时的洗涤外液，对来自聚合物粒子的溶出成分显示抗菌活性的可能性进行了研究。使用第4次的洗涤外液，通过与实施例1记载的方法同样的方法来调查抗菌活性。结果，即使使用在制造例1至3中制造的任意粒子的洗涤外液，也没能抑制MSSA及MRSA的增殖。

Claims (18)

1.革兰氏阳性细菌用抗菌剂，其含有粒子作为有效成分，所述粒子是粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的、粒径为5μm以下的粒子，且基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分。
2.根据权利要求1所述的抗菌剂，其中，所述粒子的粒径为1μm以下。
3.根据权利要求2所述的抗菌剂，其中，所述粒子的平均粒径为20nm～500nm。
4.根据权利要求3所述的抗菌剂，其中，所述粒子的平均粒径为20nm～300nm。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的抗菌剂，其中，所述粒子的ζ-电位为-3mV～-80mV。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的抗菌剂，其中，所述粒子为在重复单元中具有下述通式(I)
Figure FPA00001211601200011
[式中，Z表示给电子基团]
所表示的结构的聚合物粒子。
7.根据权利要求6所述的抗菌剂，其中，所述通式(I)中，Z为氰基、氨基或亚氨基。
8.根据权利要求6或7所述的抗菌剂，其中，所述通式(I)所表示的结构是下述通式(II)所表示的结构，
Figure FPA00001211601200012
[式中，Z与上述通式(I)中的定义相同，R为氢、羟基、碳原子数1～10的烷基、碳原子数1～10的烷氧基、碳原子数6～15的芳基、碳原子数6～15的芳氧基、碳原子数7～16的芳烷基或碳原子数7～16的芳烷氧基，构成R中的碳链的1个以上的碳原子可以被氮、硫或氧替代]。
9.根据权利要求8所述的抗菌剂，其中，所述通式(II)中，R为羟基或碳原子数1～10的烷氧基。
10.根据权利要求9所述的抗菌剂，其中，所述通式(II)中，Z为氰基，R为正丁氧基。
11.根据权利要求6～10中任一项所述的抗菌剂，其中，所述聚合物粒子是通过在下述通式(III)
[Z及R与上述通式(II)中的定义相同，X及Y各自独立地表示末端具有碳-碳双键的原子团、或X及Y合在一起表示亚甲基]
所表示的单体以及具有羟基的糖类和/或聚山梨醇酯的共存下，使所述单体聚合而制造。
12.根据权利要求11所述的抗菌剂，其中，所述通式(III)中，Z为氰基、氨基或亚氨基，R为羟基或碳原子数1～10的烷氧基，X及Y合在一起表示亚甲基。
13.根据权利要求12所述的抗菌剂，其中，所述通式(III)所表示的单体为正丁基-2-氰基丙烯酸酯。
14.根据权利要求11～13中任一项所述的抗菌剂，其中，所述糖类是选自由葡萄糖、核糖、果糖、甘露糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖、蔗糖、甘露聚糖及平均分子量70,000以上的葡聚糖组成的组中的至少1种。
15.根据权利要求14所述的抗菌剂，其中，所述糖类是选自由葡萄糖、核糖、乳糖、海藻糖及平均分子量70,000以上的葡聚糖组成的组中的至少1种。
16.根据权利要求11～15中任一项所述的抗菌剂，其中，所述聚山梨醇酯是聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯。
17.革兰氏阳性细菌的抗菌方法，其包括使有效量的粒子与要抗菌的革兰氏阳性细菌接触，所述粒子是粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的、粒径为5μm以下的粒子，且基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分。
18.粒子用于制造革兰氏阳性细菌用抗菌剂的用途，所述粒子是粘附于革兰氏阳性细菌的细胞壁而不粘附于哺乳动物的细胞膜的、粒径为5μm以下的粒子，且基本上不含针对革兰氏阳性细菌的抗菌活性成分。
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