WO2009084494A1 - グラム陽性細菌用抗菌剤 - Google Patents

グラム陽性細菌用抗菌剤 Download PDF

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WO2009084494A1
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gram
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antibacterial agent
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Shoichi Shirotake
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Public University Corporation Yokohama City University
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Definitions

  • the present invention relates to an antibacterial agent for Gram-positive bacteria, which contains, as an active ingredient, particles that are substantially free of antibacterial active ingredients against Gram-positive bacteria.
  • MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • VRE vancomycin-resistant enterococci
  • VRSA vancomycin-resistant Staphylococcus aureus
  • MDRP multidrug-resistant green-concentrated bacteria
  • Antibiotic resistance mechanisms are specific to each antibiotic, and multi-drug resistant bacteria have survived from antibiotic multiple-drug therapy using their various mechanisms.
  • various measures such as searching for new antibiotics, modifying the structure, improving the drug delivery method, whole genome analysis of resistant bacteria, proteomics method, Multi-locus sequence ⁇ typing method, resident bacteria interference action, etc.
  • Various studies have been started. Their results are still not sufficient, and measures to simultaneously contain multiple resistance mechanisms are necessary.
  • DDS drug delivery system
  • Patent Document 1 DDS in which drugs are conjugated to cyanoacrylate polymer particles
  • Patent Document 2 Non-Patent Document 1
  • the objective was DDS and sustained release of drugs, and the antibacterial action of the fine particles alone was not known at all.
  • an object of the present invention is to provide a novel means capable of exerting an antibacterial action against various multidrug-resistant bacteria, beyond the various antibiotic resistance mechanisms worn by resistant bacteria. .
  • the inventors of the present application have been researching drug delivery methods by conjugating acrylic nanocapsules with antibacterial drugs. Based on the know-how obtained from this research, the first application of particles that are not conjugated with antibacterial drugs to bacteria As a result, the inventors found a lysis phenomenon following specific adhesion between the particles and the bacterial cell wall, and completed the present invention.
  • the present invention is a particle having a particle size of 5 ⁇ m or less that adheres to the cell wall of Gram-positive bacteria and does not adhere to the mammalian cell membrane, and is substantially free of antibacterial active ingredients against Gram-positive bacteria.
  • an antibacterial agent for Gram-positive bacteria which is contained as an active ingredient.
  • the present invention is a particle having a particle size of 5 ⁇ m or less that adheres to the cell wall of Gram-positive bacteria and does not adhere to the mammalian cell membrane, and is substantially free of antibacterial active ingredients against Gram-positive bacteria.
  • an antibacterial method of Gram positive bacteria comprising contacting an effective amount with Gram positive bacteria to be antibacterial.
  • the present invention relates to a particle having a particle size of 5 ⁇ m or less that adheres to the cell wall of Gram-positive bacteria and does not adhere to a mammalian cell membrane, and is substantially free of antibacterial active ingredients against Gram-positive bacteria. Providing use for the manufacture of antibacterial agents for Gram-positive bacteria.
  • Disinfectants that do not use antibiotics include disinfectants, but these are topical drugs that cannot be administered internally because of their toxicity and cannot be used to treat infections. Since the particles used in the present invention can be prepared using materials that have already been confirmed to be safe for the human body and are in practical use, they can also be used for the treatment of infectious diseases. Since the antibacterial agent of the present invention is an antibacterial agent that transcends the drug resistance mechanism of bacteria, it can be applied to gram-positive bacteria exhibiting multidrug resistance typified by MRSA and VRE, and in the use of antibiotics. It is possible to avoid the emergence of new multi-drug resistant bacteria, which is a big problem. It is expected that the present invention not only opens the way for the treatment of multidrug-resistant bacterial infections, but also creates a completely new field in the research and development of antibacterial drugs, and leads to innovative development in antibacterial drug research.
  • VRE NCTC12201 strain treated with vancomycin It is a SEM image of VRE NCTC12201 strain treated with 0.01N HCl-Dex70 + Glucose particles prepared in Production Example 1 (1 hour, 3 hours and 6 hours after particle treatment). It is a SEM image of VRE NCTC12201 strain and GTC02000 strain treated with 0.01N HCl-Dex70 + Glucose particles prepared in Production Example 1 (1 hour after the particle treatment).
  • the antibacterial agent for Gram-positive bacteria of the present invention is a particle that adheres to the cell wall of Gram-positive bacteria and does not adhere to the mammalian cell membrane, and is an active ingredient that does not substantially contain antibacterial active ingredients against Gram-positive bacteria. It is contained as
  • the particles used in the present invention are characterized by adhering to the cell wall of Gram-positive bacteria and not adhering to mammalian cell membranes. Whether or not the particles adhere to the cell surface such as the cell wall or cell membrane is determined as follows. Suspend particles in a culture solution such as saline or Mueller Hinton Broth (6 ⁇ g / ml) and use a commercially available 24-well cell culture plate (usually 3.29 ml per well, bottom culture surface area 1.91 cm 2 ). 1 ml of the suspension is added to the number of Gram-positive bacteria or mammalian cells of about 10 5 to 10 6 / ml per well.
  • a culture solution such as saline or Mueller Hinton Broth
  • Mammalian cells as is well known, have no cell wall on the surface and are covered with a cell membrane, and the structure of the cell membrane consists of a lipid bilayer.
  • the surface structure of such a mammalian cell is not limited to any animal species or Even if it is derived from a tissue, it is basically the same. Accordingly, the type of mammalian cell used for determining whether or not to adhere to the mammalian cell membrane is not particularly limited. Further, it may be a tissue cell mass collected from a living body, a cell prepared by separating it, or a cultured cell established.
  • adhesion to a mammalian cell membrane can be evaluated using cells such as HeLa cells or hamster CHO cells which are human cultured cell lines.
  • cells such as HeLa cells or hamster CHO cells which are human cultured cell lines.
  • specific adhesion the adhesion of the particles that adhere to the Gram-positive bacterial cell wall without adhering to the mammalian cell membrane.
  • the particles are particles substantially free of an antibacterial active ingredient against gram positive bacteria.
  • antibacterial active ingredient refers to a chemical substance component that can biochemically affect the metabolic pathway or physiological function of Gram-positive bacteria and inhibit the growth of the bacteria. Antibiotics and other chemical components that can be used for antibacterial purposes. “Substantially free” means that the antibacterial active ingredient is not contained at all, or even if it is contained, the antibacterial active ingredient is sensitive to the antibacterial active ingredient, and the antibacterial activity is limited to such a small amount that it cannot be antibacterial. It means that it contains no active ingredients.
  • a trace amount that does not allow antibacterial activity means that the amount of antibacterial active ingredient contained in a particle per unit volume of the particle is defined as the concentration contained in the particle, and an antibacterial active ingredient having the same concentration as that contained in the particle. It means an amount that cannot inhibit the growth of sensitive Gram-positive bacteria when it is allowed to act on sensitive Gram-positive bacteria alone without conjugation.
  • the particles used in the present invention preferably do not contain any antibacterial active ingredients such as antibiotics.
  • the antibacterial agent of the present invention does not use the antibacterial activity of an antibiotic, but causes lysis by the adhesion action of particles to the cell wall and inhibits the growth of bacteria.
  • the details of the principle by which the above-mentioned specific adhesiveness of the particles causes lysis are unknown, and the scope of the present invention is not limited by theory, but the following can be considered.
  • the basis of cell wall synthesis is UDP-MurNAc-pentapeptide, and then lipid-MurNAc (GluNAc) -pentapeptide which binds to cell membrane fatty acid and then binds to GluNAc, and that MurNAc is the peptidoglycan being synthesized.
  • a multi-branched cell wall is constructed by binding to GluNAc. Since the cell wall synthesis is carried out outside the cell wall, it is considered that the particles adhere to the bacterial surface, thereby interfering with the cell wall synthesis and leading to lysis.
  • the antibacterial action of the antibacterial agent of the present invention is affected by the particle size and zeta potential of the above particles (see Examples below).
  • the particle size of the particles used in the present invention is 5 ⁇ m or less, preferably 2 ⁇ m or less, more preferably 1 ⁇ m or less.
  • the lower limit of the particle size is not particularly limited, but for example, when producing acrylate polymer particles by polymerization of acrylate monomers by the method as described in the following examples, the particle size of the particles is usually about 7 nm or more (FIG. 6).
  • the average particle size of the whole particles contained in the antibacterial agent is preferably 20 nm to 500 nm, particularly preferably 20 nm to 300 nm.
  • the zeta potential indicates the charge on the particle surface and is an index of particle dispersibility. Since the particles used in the present invention act by adhering to the surface of bacteria having a size of several hundred nm to several ⁇ m, it is preferable that the particles have a dispersibility that does not cause aggregation, and the zeta potential is not particularly limited. Preferably, it is ⁇ 3 mV to ⁇ 80 mV.
  • the particle size and zeta potential can be easily measured with a commercially available apparatus using He / Ne laser (implemented model: Zetasizer Nano, manufactured by Malvern Inst. UK) as described in the following examples. According to this apparatus, graphs of particle size distribution and zeta potential distribution as shown in FIGS.
  • the measurement principle of the average particle diameter by this apparatus is calculated by the photon correlation method (dynamic scattering method) for obtaining the particle diameter from the fluctuation of the intensity of the laser light scattered by the Brownian motion of the particles,
  • the measurement principle of zeta potential is particle electrophoresis.
  • Z represents an electron donating group
  • It is a polymer particle which has the structure represented by in a repeating unit.
  • the wavy lines in the formula indicate other structural parts in the polymer structure to which the structure represented by the general formula (I) is bonded.
  • the structure of the general formula (I) having an electron donating group and a carboxyl group present at the ⁇ -position shows a high affinity for glycoproteins. Therefore, it exhibits affinity with the cell wall multi-branch structure composed of peptidoglycan existing on the surface of bacterial cells, and can preferably exhibit the above-mentioned specific adhesion.
  • a cyano group an amino group or an imino group is preferable, and among them, a cyano group is preferable.
  • the structure represented by the general formula (I) is not particularly limited, and examples thereof include a structure represented by the following general formula (II).
  • Z is the same as defined in the general formula (I), and R is hydrogen, a hydroxy group, an alkyl group having 1 to 10 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms, or an alkyl group having 6 to 15 carbon atoms.
  • a structure in which R is a hydroxy group or an alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms is preferable, and a structure in which R is an n-butoxy group is particularly preferable.
  • Preferred examples of Z are as described above. Therefore, as the structure of the general formula (II), a structure in which Z is a cyano group and R is an n-butoxy group is particularly preferable.
  • polymer particles having a structure represented by the above general formula (II) in the repeating unit include, for example, the following general formula (III)
  • [Z and R are the same as defined in the general formula (II), and X and Y each independently represent an atomic group having a carbon-carbon double bond at the terminal, or X and Y are combined together. Represents a methylidene group.
  • a monomer in which R is a hydroxy group or an alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms, that is, an acrylate monomer substituted with an electron donating group Z is preferable.
  • the electron donating group Z is preferably a cyano group, an amino group or an imino group, and more preferably a cyano group. That is, as the monomer, a cyanoacrylate monomer is particularly preferable.
  • the cyanoacrylate monomer include n-butyl-2-cyanoacrylate (nBCA) represented by the following formula.
  • nBCA has been conventionally used as an adhesive for suturing wounds in the surgical field, and safety to the human body is guaranteed.
  • the above monomers can be polymerized by anionic polymerization.
  • anionic polymerization although not particularly limited, a saccharide and / or a polysorbate can be used for initiating polymerization and stabilizing the polymerization.
  • polymer particles that can be used in the present invention include those containing polymerization initiators and stabilizers such as sugars and polysorbates. By using saccharides and / or polysorbate, uniform particles with little variation in particle size can be preferably prepared.
  • the saccharide is not particularly limited, and may be any of a monosaccharide having a hydroxyl group, a disaccharide having a hydroxyl group, and a polysaccharide having a hydroxyl group.
  • monosaccharides include glucose, mannose, ribose and fructose.
  • disaccharide include maltose, trehalose, lactose and sucrose.
  • polysaccharide dextran, mannan, or the like used for the polymerization of conventionally known cyanoacrylate polymer particles can be used. These sugars may be either cyclic or chain-like, and when they are cyclic, they may be any one of pyranose type, furanose type and the like.
  • sugar there are various isomers of sugar, and any of them may be used.
  • monosaccharides exist in a pyranose type or furanose type form, and disaccharides are those in which they are ⁇ -bonded or ⁇ -bonded, and sugars in such a normal form can be used as they are.
  • the polysorbate is not particularly limited, and any of known Tween surfactants such as polyoxyethylene sorbitan monolaurate (trade name Tween 20) and polyoxyethylene sorbitan monooleate (trade name Tween 80) can be used. There may be.
  • Monosaccharides, disaccharides, polysaccharides and polysorbates can be used alone or in combination of two or more.
  • glucose, ribose, lactose, trehalose, dextran, and Tween 20 are preferable, and dextran having a degree of polymerization with an average molecular weight of 70,000 or more is preferable.
  • molecular weight of dextran There is no particular upper limit on the molecular weight of dextran, but it is usually about 500,000 or less.
  • Water is usually used as a solvent for the polymerization reaction. Since anionic polymerization is initiated by hydroxide ions, the pH of the reaction solution affects the polymerization rate. When the pH of the reaction solution is high, the hydroxyl ion concentration is high, so that the polymerization is fast, and when the pH is low, the polymerization is slow. Usually, a moderate polymerization rate can be obtained under acidic conditions of pH 2 to 4. Although it does not specifically limit as an acid added in order to make a reaction liquid acidic, Hydrochloric acid which does not have a bad influence on reaction but volatilizes after reaction can be used preferably.
  • the concentration of the monomer in the polymerization reaction solution at the start of the reaction is not particularly limited, but is usually about 0.5 v / v% to 2.0 v / v%, preferably about 0.8 v / v% to 1.5 v / v%. .
  • the concentration of saccharides and / or polysorbates in the polymerization reaction solution at the start of the reaction is not particularly limited, but usually 0.5% to It is about 10%, preferably about 0.75% to 7.5%.
  • the concentration of saccharides means w / v%, and the concentration of polysorbate means v / v%.
  • the above concentration ranges are “0.5 w / v% to 10 w / v%”, respectively. ”,“ 0.75 w / v% to 7.5 w / v% ”.
  • the saccharide is used at 5 w / v% and the polysorbate is used at 1 v / v%, the total concentration of these is 6%.
  • a monosaccharide eg glucose
  • the reaction temperature is not particularly limited, but it is convenient and preferable to carry out the reaction at room temperature.
  • the reaction time is not particularly limited, but is usually about 15 minutes to 4 hours, preferably about 30 minutes to 3 hours.
  • the polymerization reaction is preferably performed with stirring. Since the particles are usually used as neutral particles, it is preferable to neutralize the reaction solution by adding a base such as an aqueous sodium hydroxide solution to the reaction solution after completion of the reaction.
  • the monomer is anionically polymerized to produce polymer particles.
  • the generated particles can be collected by a conventional method such as centrifugal ultrafiltration. According to the above method, polymer particles having an average particle diameter of about 20 nm to 500 nm, preferably about 20 nm to 300 nm, and a zeta potential of about ⁇ 3 mV to ⁇ 80 mV can be obtained. Can be preferably used in the present invention.
  • the particle size can be adjusted by adjusting the monomer concentration and reaction time in the reaction solution. In addition, when a saccharide and / or polysorbate is used as a polymerization initiator / stabilizer, the particle size can also be adjusted by changing the concentration and type of the polymerization initiator / stabilizer (see the following examples).
  • the bacteria for which the antibacterial agent of the present invention exhibits antibacterial activity are gram-positive bacteria. It is not particularly limited as long as it is a Gram-positive bacterium, even if it is a bacteria sensitive to antibiotics such as MSSA (methicillin-sensitive Staphylococcus aureus) or VSE (vancomycin-sensitive enterococci), MRSA (methicillin-resistant yellow grapes) Multi-drug resistant bacteria such as cocci) and VRE (vancomycin resistant enterococci) can be antibacterial by the antibacterial agent of the present invention.
  • the antibacterial agent of the present invention suppresses the growth by lysing the Gram-positive bacteria by specific adhesion of the particles irrespective of the antibiotic resistance of the Gram-positive bacteria. Therefore, according to the antibacterial agent of the present invention, an existing multidrug-resistant bacterium can be antibacterial and there is no possibility that a new multidrug-resistant bacterium will appear, which is extremely advantageous for clinical application.
  • the antibacterial agent of the present invention may be composed only of the above-mentioned particles, and when used for the treatment of Gram-positive bacterial infection, it is mixed with known excipients, carriers and the like and suitable for the administration method. It may be prepared in a different form.
  • the particles may be composed of a single type of particle, or a mixture of two or more types of particles.
  • Examples of the method of administering the antibacterial agent of the present invention include subcutaneous administration, intramuscular, intraperitoneal, intraarterial, intravenous, intrarectal administration, and oral administration.
  • particles can be suspended in physiologically buffered saline and administered parenterally by injection or the like, and can be orally administered as capsules or syrups, but is not limited thereto.
  • grains should just be disperse
  • the Gram-positive bacteria can be antibacterized by bringing the Gram-positive bacteria to be antibacterial into contact with the particles.
  • the strength of the antibacterial activity (MIC value and MBC value) of the particles is influenced by the particle size, zeta potential, etc. of the particles, and also varies depending on the type of resistant bacteria. It exhibits antibacterial action at a concentration of about mg / ml to 25 mg / ml.
  • particles composed of a cyanoacrylate polymer described in the following examples are about 0.025 mg / ml to 6.4 mg / ml in vitro against various S. aureus strains and enterococci used in the following examples. Shows antibacterial effect at concentration.
  • the particles are usually administered to an adult at a dose of usually about 0.1 g to 100 g, particularly about 0.1 g to 25 g.
  • cyanoacrylate polymer particles (dextran, dextran + glucose reaction system) Cyanoacrylate polymer particles were prepared using nBCA (Histoacryl (registered trademark), Braun, Melsungen, Germany) as a monomer. As the polymerization initiator / stabilizer, dextran alone or dextran + glucose was used. Dextran having an average molecular weight of 70K was used (Dex70).
  • the reaction solution was filtered through a 5 ⁇ m sized Milex filter (trade name, MILLIPORE), and the filtrate was subjected to centrifugal filtration at 3000 rpm / 15 minutes using a Centriprep filter (trade name, MILLIPORE).
  • the liquid that did not pass through the Centriprep filter was further suspended by adding DW and centrifuging at 3000 rpm / 15 minutes.
  • polycyanoacrylate particles 0.05NHCl-Dex70, 0.05NHCl-Dex70 + Glucose, 0.01 NHCl-Dex70, 0.01NHCl + Glucose, 0.001NHCl-Dex70, 0.001NHCl-Dex70 + Glucose).
  • the average particle size and zeta potential of the obtained particles were measured using a commercially available measuring device (implemented model: Zetasizer Nano, manufactured by Malvern Inst. UK) using a He / Ne laser scattered light method. The results are shown in Table 1.
  • Example 1 Antibacterial activity of cyanoacrylate polymer particles (dextran, dextran + glucose reaction system) The antibacterial activity (minimum growth inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC)) of the particles produced in Production Example 1 against various strains was examined. Ampicillin (ABPC) was used as a positive control. The measuring method was based on the micro liquid dilution method (NCCLS). In other words, for APBC, 256 ⁇ g / ml was used as the stock solution (1-fold dilution), and for particles, 6.4 mg / ml was used as the stock solution (1-fold dilution). And antibacterial activity was evaluated.
  • NCCLS micro liquid dilution method
  • the antibacterial activity of the obtained particles was comparable.
  • the concentration of hydrochloric acid tended to be higher at 0.01N than at 0.05N.
  • the MIC against Staphylococcus aureus was 0.025 to 0.4 mg / ml, which showed similar antibacterial activity to MSSA and MRSA. MBC was different between stocks.
  • the MIC against enterococci was 0.1 to 0.2 mg / ml, and there was no difference in antibacterial activity against VSE and VRE. MBC was sometimes significantly different between strains (1.6 mg / ml and 0.1 mg / ml).
  • cyanoacrylate polymer particles (glucose, ribose, lactose, trehalose reaction system) Cyanoacrylate polymer particles were prepared using nBCA (Histoacryl (registered trademark), Braun, Melsungen, Germany) as a monomer. Glucose, ribose, lactose, and trehalose were used as polymerization initiators / stabilizers.
  • Polycyanoacrylate particles (0.05NHCl-Glucose, 0.05NHCl-Ribose, 0.05NHCl-Lactose, 0.05NHCl-Trehalose) were prepared in the same manner as in Production Example 1 except that 5 g of any of the above monosaccharides and disaccharides was used as the saccharide. 0.01NHCl-Glucose, 0.01NHCl-Ribose, -0.01NHCl-Lactose, 0.01NHCl-Trehalose, 0.001NHCl-Glucose).
  • the obtained particles were subjected to He / Ne laser scattered light analysis using a commercially available measuring apparatus (described above), and the average particle diameter and zeta potential were measured. The results are shown in Table 5.
  • Example 2 Antibacterial activity of cyanoacrylate polymer particles (glucose, ribose, lactose, trehalose reaction system) In the same manner as in Example 1, antibacterial activity (minimum growth inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC)) of the particles produced in Production Example 2 against various strains was examined. The results are shown in Tables 6-8.
  • MIC minimum growth inhibitory concentration
  • MMC minimum bactericidal concentration
  • the antimicrobial activity of the polymer particles was higher in the monosaccharide system.
  • the antibacterial activity was 0.01NHCl> 0.05NHCl in the monosaccharide system and 0.01NHCl ⁇ 0.05NHCl in the disaccharide system.
  • the MIC against Staphylococcus aureus was 0.4 to 3.2 mg / ml, which showed similar antibacterial activity to MSSA and MRSA.
  • MBC was different between stocks.
  • MIC against enterococci was 1.6-3.2 mg / ml, and there was no difference in antibacterial activity against VSE and VRE (data not shown). MBC could be significantly different between strains (1.6 mg / ml and> 6.4 mg / ml).
  • the reaction solution was filtered through a 5 ⁇ m sized Milex filter (trade name, MILLIPORE), and the filtrate was subjected to centrifugal filtration at 3000 rpm / 15 minutes using a Centriprep filter (trade name, MILLIPORE).
  • the liquid that did not pass through the Centriprep filter was further suspended by adding DW and centrifuging at 3000 rpm / 15 minutes.
  • the same operation was repeated 4 times to obtain polycyanoacrylate particles (0.01NHCl-Tw20, 0.01NHCl-Tw20 + Glucose, 0.01). NHCl-Dex70 (1 hr), 0.01 NHCl-Dex70 + Glu (1 hr)) were obtained.
  • the obtained particles were subjected to He / Ne laser scattered light analysis using a commercially available measuring apparatus (described above), and the average particle diameter and zeta potential were measured. The results are shown in Table 9.
  • a graph of particle size distribution obtained by analysis using the apparatus is shown in FIG. 6, and a graph of zeta potential distribution is shown in FIG.
  • Example 3 Antibacterial activity of cyanoacrylate polymer particles (Tween20, Tween20 + glucose reaction system) In the same manner as in Example 1, antibacterial activity (minimum growth inhibitory concentration (MIC)) of the particles produced in Production Example 3 against various strains was examined. The results are shown in Table 10.
  • Example 4 Confirmation of Adhesiveness and Lysis Phenomenon of Polymer Particles Morphological changes of Gram-positive bacteria treated with 0.01N HCl-Dex70 + Glucose particles prepared in Production Example 1 were observed with an electron microscope. The treatment with polymer particles was performed as follows.
  • the particles were suspended in physiological saline to prepare a particle suspension (6 ⁇ g / ml).
  • a particle suspension (6 ⁇ g / ml).
  • Using a commercially available 24-well cell culture plate add 1 ml of particle suspension per well to the number of gram-positive bacteria or mammalian cells of about 10 5 to 10 6 / ml per well.
  • the particles and bacteria were mixed and suspended at room temperature for 1 hour. Thereafter, 1 ml / well of physiological saline was added, the plate was shaken 2 to 3 times, and the washing solution was removed by suction. This washing operation was repeated twice for a total of 3 washing operations, and the washed bacteria were observed with a scanning electron microscope (SEM).
  • SEM scanning electron microscope

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Abstract

　細菌の薬剤耐性機構を超越した新規なグラム陽性細菌用抗菌剤が開示されている。該抗菌剤は、グラム陽性細菌の細胞壁に接着し、哺乳動物の細胞膜には接着しない、粒径が5μm以下の粒子であって、グラム陽性細菌に対する抗菌活性成分を実質的に含まない粒子を有効成分として含有する。本発明の抗菌剤によれば、MRSAやVREに代表される多剤耐性を示すグラム陽性細菌をも抗菌することができ、また、抗生物質の使用において大きな問題となる新たな多剤耐性菌の出現を回避することもできる。

Description

グラム陽性細菌用抗菌剤
　本発明は、グラム陽性細菌に対する抗菌活性成分を実質的に含まない粒子を有効成分として含有する、グラム陽性細菌用抗菌剤に関する。
　近年、多くの抗生剤が続々と開発されて細菌感染症は克服されたかと錯覚を抱く今日であるが、細菌は多様な抗生物質に対する防御機構を一つ一つ身につけて生き延び、院内感染の原因菌として重大な事態を引き起こしている。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)をはじめ、バンコマイシン耐性腸球菌(VRE)やバンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌(VRSA)、さらに多剤耐性緑濃菌(MDRP)など、耐性菌の多くは現存するほとんどすべての抗生剤に耐性であり、早急なる対策が世界的に望まれている。
　抗生物質の耐性機構はそれぞれの抗生物質に対して特異的なメカニズムであり、多剤耐性菌はその多様な仕組みを駆使して、抗生物質の多剤併用療法から生き延びている。この問題に答えるべく、新しい抗生物質の探索や構造改変、薬物送達方法の改善や、耐性菌の全ゲノム解析からプロテオミクス手法、Multi-locus sequence typing手法や、常在菌干渉作用など様々な方策を用いた多様な研究が始まっている。それらの成績は未だ充分なものでなく、複数の耐性機構を同時に封じ込める対策が必要である。
　薬物のデリバリーシステム（ＤＤＳ）や徐放化による薬物の効果向上を目的に、薬剤の微粒子化の研究が進んでおり、例えばシアノアクリレートポリマー粒子に薬剤を抱合させたＤＤＳが公知である（特許文献１、２及び非特許文献１）。しかしながら、現在までのいずれの研究においても、薬物のDDSと徐放化が目的であって、微粒子単体の抗菌作用については全く知られていなかった。
特表平１１－５０３１４８号公報 特表２００２－５０４５２６号公報 Christine Vauthier et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 55, 519-548 (2003)
　従って、本発明の目的は、耐性菌が身につけた多様な抗生物質耐性機構を超えて、種々の多剤耐性菌に対して抗菌作用を発揮することができる新規な手段を提供することにある。
　本願発明者らは、抗菌薬のアクリル系ナノカプセル抱合による薬物送達方法の研究を行なってきたが、今回その研究から得られたノウハウを基に、抗菌薬を抱合しない粒子単体を細菌に初めて適用したところ、粒子と細菌の細胞壁との特異的な接着に次ぐ溶菌現象を見出し、本願発明を完成した。
　すなわち、本発明は、グラム陽性細菌の細胞壁に接着し、哺乳動物の細胞膜には接着しない、粒径が5μm以下の粒子であって、グラム陽性細菌に対する抗菌活性成分を実質的に含まない粒子を有効成分として含有する、グラム陽性細菌用抗菌剤を提供する。また、本発明は、グラム陽性細菌の細胞壁に接着し、哺乳動物の細胞膜には接着しない、粒径が5μm以下の粒子であって、グラム陽性細菌に対する抗菌活性成分を実質的に含まない粒子の有効量を、抗菌すべきグラム陽性細菌と接触させることを含む、グラム陽性細菌の抗菌方法を提供する。さらに、本発明は、グラム陽性細菌の細胞壁に接着し、哺乳動物の細胞膜には接着しない、粒径が5μm以下の粒子であって、グラム陽性細菌に対する抗菌活性成分を実質的に含まない粒子の、グラム陽性細菌用抗菌剤の製造のための使用を提供する。
　本発明により、公知の抗生物質とは全く異なる機構による新規な抗菌手段が提供された。抗生物質を使わない殺菌剤としては消毒薬があるが、これらは外用薬であり、その毒性ゆえに体内投与することはできず、感染症治療に用いることはできない。本発明で用いられる粒子は、既に人体への安全性が確認され実用されている素材を用いて調製することができるので、感染症治療にも使用可能である。本発明の抗菌剤は、細菌の薬剤耐性機構を超越した抗菌剤であるため、MRSAやVREに代表される多剤耐性を示すグラム陽性細菌にも適用可能であり、また、抗生物質の使用において大きな問題となる新たな多剤耐性菌の出現を回避することもできる。本発明によって、多剤耐性菌感染症に対する治療の途が拓かれるばかりか、抗菌薬の研究開発に全く新しい分野が創造され、抗菌薬研究に革新的な展開が生じるものと期待される。
VSE及びVREの菌体のSEM像である。 バンコマイシン処理したVRE NCTC12201株のSEM像である。 製造例１で調製した0.01NHCl-Dex70+Glucose粒子で処理した、VRE NCTC12201株のSEM像である（粒子処理から１時間後、３時間後及び６時間後）。 製造例１で調製した0.01NHCl-Dex70+Glucose粒子で処理した、VRE NCTC12201株及びGTC02000株のSEM像である（粒子処理から１時間後）。 製造例１で調製した0.01NHCl-Dex70+Glucose粒子で処理した、MRSA JCM8703菌株のSEM像である（粒子処理から１時間後、３時間後及び６時間後）。 製造例３で製造した各粒子の粒径分布のグラフである。 製造例３で製造した各粒子のゼータ電位分布のグラフである。
　本発明のグラム陽性細菌用抗菌剤は、グラム陽性細菌の細胞壁に接着し、哺乳動物の細胞膜には接着しない粒子であって、グラム陽性細菌に対する抗菌活性成分を実質的に含まない粒子を有効成分として含有するものである。
　本発明で用いられる粒子は、グラム陽性細菌の細胞壁に接着し、哺乳動物の細胞膜には接着しないという特徴を有する。粒子が細胞壁や細胞膜等の細胞表面に接着するか否かの判断は、以下のようにして行なわれる。粒子を生理食塩水又はMueller Hinton Broth等の培養液に懸濁し（6μg/ml）、市販の24ウェル細胞培養プレート(通常は１ウェル当たりの容量3.29ml、底面培養表面積1.91cm2)を用いて、１ウェル当たり105個～106個/1ml程度のグラム陽性細菌又は哺乳動物細胞数に該懸濁液を1ml添加する。少なくとも1時間放置後、生理食塩液をマイクロピペットで１ウェル当たり１ｍｌを加えて２～３回プレートをゆっくり振盪後、上澄洗浄液を吸引除去する。さらに、同様の洗浄操作を２回繰り返す。こうして得られる細胞試料を電子顕微鏡を用いて観察し、細胞表面に粒子を認める場合を接着する、認めない場合を接着しないと判断する。なお、かかる処理により細胞内に粒子が侵入する場合があるが、細胞内への侵入の有無は接着性の評価において考慮しないものとする。哺乳動物細胞は、周知の通り表面に細胞壁を有さず細胞膜で覆われており、該細胞膜の構造は脂質二分子層から成るが、このような哺乳動物細胞の表面構造はいずれの動物種ないしは組織由来であっても基本的に同一である。従って、哺乳動物の細胞膜に接着するか否かの判断に用いられる哺乳動物細胞の種類は特に限定されない。また、生体から採取した組織細胞塊又はそれを分離して調製した細胞であってもよいし、株化された培養細胞であってもよい。例えば、下記実施例に記載されるように、ヒト培養細胞株であるHeLa細胞あるいはハムスターCHO細胞等の細胞を用いて、哺乳動物細胞膜への接着性を評価することができる。以下、本明細書において、哺乳動物細胞膜には接着せずにグラム陽性細菌細胞壁に接着する該粒子の接着性を「特異的接着」ということがある。
　また、該粒子は、グラム陽性細菌に対する抗菌活性成分を実質的に含まない粒子である。「抗菌活性成分」とは、グラム陽性細菌の代謝経路ないしは生理機能に生化学的に作用して該細菌の発育を阻止することができる化学物質成分をいい、具体的には、グラム陽性細菌の抗菌に利用可能な抗生物質その他の化学物質成分を言う。「実質的に含まない」とは、抗菌活性成分を全く含まないか、含んでいるとしても、その抗菌活性成分に対し感受性であるグラム陽性細菌を抗菌することができない程度の微量にしか該抗菌活性成分を含んでいないことを意味する。「抗菌することができない程度の微量」とは、粒子単位体積当たりに含まれる粒子中の抗菌活性成分量を粒子中の含有濃度と定義し、この含有濃度と同濃度の抗菌活性成分を粒子に抱合させず単独で感受性グラム陽性細菌に作用させた場合に、該感受性グラム陽性細菌の発育を阻止できない量のことを意味する。本発明で用いられる粒子としては、抗生物質等の抗菌活性成分を全く含まないものが好ましい。
　本発明の抗菌剤は、抗生物質の抗菌活性を利用するものではなく、粒子の細胞壁への接着作用により溶菌を生じさせ、細菌の発育を阻止するものである。粒子の上記した特異的接着性が溶菌を生じる原理の詳細は不明であり、本発明の範囲は理論に拘束されるものではないが、以下のことが考えられる。すなわち、細胞壁合成の基本はUDP－MurNAc－ペンタペプチドと、次に、細胞膜の脂肪酸と結合し後にGluNAcと結合した脂質－MurNAc（GluNAc）－ペンタペプチドを形成し、そのMurNAcが合成中のペプチドグリカンのGluNAcと結合して多枝構造の細胞壁が構築される。その細胞壁合成は細胞壁の外側で施工されているので、粒子が細菌表面に接着することで細胞壁合成を妨害し、溶菌に導いているものと考えられる。
　本発明の抗菌剤の抗菌作用は、上記粒子の粒径とゼータ電位に影響される（下記実施例参照）。本発明に用いられる粒子の粒径は5μm以下であり、好ましくは2μm以下、より好ましくは1μm以下である。なお、粒径の下限は特に限定されないが、例えば下記実施例に記載されるような方法でアクリレート系モノマーの重合によりアクリレート系ポリマー粒子を製造する場合には、粒子の粒径は通常7nm程度以上となる（図６）。抗菌剤に含有される粒子全体の平均粒径は、好ましくは20nm～500nm、特に好ましくは20nm～300nmである。また、ゼータ電位とは、粒子表面の電荷を示すもので、粒子の分散性の指標となる。本発明で用いられる粒子は、数百nm～数μm程度のサイズの細菌表面に接着して作用するため、凝集が生じない程度の分散性を有することが好ましく、特に限定されないが、ゼータ電位が好ましくは-3mV～-80mVである。粒子サイズ及びゼータ電位は、下記実施例に記載するとおり、He・Neレーザーを用いた市販の装置（実施機種：Zetasizer Nano, Malvern Inst.UK社製）により容易に測定することができる。該装置によれば、図６及び図７に示されるような粒径分布及びゼータ電位分布のグラフが得られ、平均粒径とゼータ電位が算出される。なお、この装置による平均粒径の測定原理は、粒子のブラウン運動により散乱されたレーザー光の強度の変動から粒子径を求める光子相関法（動的散乱法）により算出するものであり、また、ゼータ電位の測定原理は、粒子の電気泳動である。
　上記した特異的接着性を有する粒子は、好ましくは、下記一般式(I)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、Zは電子供与基を示す）
で表される構造を繰り返し単位中に有するポリマー粒子である。式中の波線は、一般式(I)で示される構造が結合している、ポリマー構造中の他の構造部分を示す。電子供与基とα位に存在するカルボキシル基とを有する一般式(I)の構造は、糖タンパク質と高い親和性を示す。そのため、細菌細胞表層に存在するペプチドグリカンからなる細胞壁多枝構造と親和性を示し、上記した特異的接着性を好ましく発揮し得る。
　電子供与基Zとしては、シアノ基、アミノ基又はイミノ基が好ましく、中でもシアノ基が好ましい。
　一般式(I)で示される構造としては、特に限定されないが、例えば下記一般式(II)で示される構造を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、Zは上記一般式(I)における定義に同じであり、Rは水素、ヒドロキシ基、炭素数１から１０のアルキル基、炭素数１から１０のアルコキシ基、炭素数６から１５のアリール基、炭素数６から１５のアリールオキシ基、炭素数７から１６のアラルキル基又は炭素数７から１６のアラルキルオキシ基である。R中の炭素鎖を構成する１以上の炭素原子は窒素、硫黄又は酸素で置き換わっていてもよい。）
　一般式(II)の中でも、Rがヒドロキシ基又は炭素数１から１０のアルコキシ基である構造が好ましく、特に、Rがn-ブトキシ基である構造が好ましい。Zの好ましい例は上記の通りである。従って、一般式(II)の構造としては、Zがシアノ基でRがn-ブトキシ基であるものが特に好ましい。
　本発明で用いられる粒子のうち、繰り返し単位中に上記一般式(II)で表される構造を有するポリマー粒子は、例えば、下記一般式(III)
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
[Z及びRは上記一般式(II)における定義に同じであり、X及びYはそれぞれ独立して末端に炭素－炭素二重結合を有する原子団を表すか、又はX及びYが一緒になってメチリデン基を表す。]
で表されるモノマーを、水酸基を有する糖類及び／又はポリソルベートの共存下において重合させることにより製造することができる。このような構造を有するモノマーとしては、例えばアクリレート系モノマーが挙げられるが、アクリレート系モノマーは種々のものが市販されており、そのような市販品を好ましく用いることができる。また、その他のモノマーは、例えば市販のアクリレート系モノマーから化学合成分野における周知の常法を用いて容易に調製することができる。
　一般式(III)に示すモノマーの中でも、Rがヒドロキシ基又は炭素数１から１０のアルコキシ基であるモノマー、すなわち、電子供与基Zで置換されたアクリレート系モノマーが好ましい。また、電子供与基Zとしては、上記した通りシアノ基、アミノ基又はイミノ基が好ましく、中でもシアノ基が好ましい。すなわち、上記モノマーとしては、シアノアクリレート系モノマーが特に好ましい。シアノアクリレート系モノマーの好ましい例としては、例えば、下記式で表されるn-ブチル-2-シアノアクリレート(nBCA)を挙げることができる。nBCAは外科領域において傷口の縫合のための接着剤として従来から用いられているものであり、人体への安全性は保証されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　上記モノマーはアニオン重合により重合することができる。アニオン重合では、特に限定されないが、重合開始及び重合安定化のために糖類及び／又はポリソルベートを用いることができる。従って、本発明で用いることができる「ポリマー粒子」には、糖類やポリソルベートのような重合開始及び安定剤を含むものも包含される。糖類及び／又はポリソルベートを用いることで、粒径のばらつきの少ない均一な粒子を好ましく調製することができる。
　糖類は特に限定されず、水酸基を有する単糖類、水酸基を有する二糖類及び水酸基を有する多糖類のいずれであってもよい。単糖類としては、例えばグルコース、マンノース、リボース及びフルクトース等が挙げられる。二糖類としては、例えばマルトース、トレハロース、ラクトース及びスクロース等が挙げられる。多糖類としては、従来公知のシアノアクリレートポリマー粒子の重合に用いられているデキストランや、マンナン等を用いることができる。これらの糖は、環状、鎖状のいずれの形態であってもよく、また、環状の場合、ピラノース型やフラノース型等のいずれであってもよい。また、糖には種々の異性体が存在するがそれらのいずれでもよい。通常、単糖は、ピラノース型又はフラノース型の形態で存在し、二糖は、それらがα結合又はβ結合したものであり、このような通常の形態にある糖をそのまま用いることができる。また、ポリソルベートとしては、特に限定されず、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名 Tween 20）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（商品名 Tween 80）等の公知のTween系界面活性剤のいずれであってもよい。単糖類、二糖類及び多糖類並びにポリソルベートは、単独で用いることもできるし、２種以上を組み合わせて用いることもできる。上記した糖類及びポリソルベートのうち、グルコース、リボース、ラクトース、トレハロース、デキストラン、Tween 20（商品名）が好ましく、デキストランとしては、平均分子量７万以上の重合度であるデキストランが好ましい。デキストランの分子量の上限は特にないが、通常、分子量50万程度以下である。
　重合反応の溶媒は、通常、水が用いられる。アニオン重合は、水酸イオンにより開始されるので、反応液のpHは、重合速度に影響する。反応液のpHが高い場合には、水酸イオンの濃度が高くなるので重合が速く、pHが低い場合には重合が遅くなる。通常、pHが２～４程度の酸性下で適度な重合速度が得られる。反応液を酸性にするために添加する酸としては、特に限定されないが、反応に悪影響を与えず、反応後に揮散する塩酸を好ましく用いることができる。
　反応開始時の重合反応液中のモノマーの濃度は、特に限定されないが、通常、0.5v/v％～2.0v/v％程度、好ましくは0.8v/v％～1.5v/v％程度である。重合反応に糖類及び／又はポリソルベートを用いる場合、反応開始時の重合反応液中の糖類及び／又はポリソルベートの濃度（複数種類用いる場合はその合計濃度）は、特に限定されないが、通常、0.5％～10％程度、好ましくは0.75％～7.5％程度である。なお、糖類の濃度はw/v％、ポリソルベートの濃度はv/v％を意味し、例えば糖類を単独で用いる場合には、上記した濃度範囲はそれぞれ「0.5w/v％～10w/v％」、「0.75w/v％～7.5w/v％」を意味する。また、糖類を5w/v％、ポリソルベートを1v/v％で併せて用いる場合には、これらの合計濃度を6％というものとする。ただし、単糖類（例えばグルコース）のみを用いる場合には、2.5w/v％～10w/v％程度で用いることが好ましい。また、反応温度は、特に限定されないが、室温で行なうことが簡便で好ましい。反応時間は、特に限定されないが、通常、１５分～４時間程度、好ましくは、３０分～３時間程度である。重合反応は、撹拌下に行なうことが好ましい。なお、粒子は、通常、中性の粒子として用いられるので、反応終了後、水酸化ナトリウム水溶液等の塩基を反応液に添加して中和することが好ましい。
　上記の重合反応により、モノマーがアニオン重合してポリマー粒子が生成する。生成した粒子は、遠心式限外ろ過等の常法により回収することができる。上記方法によれば、平均粒径が20nm～500nm程度、好ましくは20nm～300nm程度であって、ゼータ電位が-3mV～-80mV程度であるポリマー粒子を得ることができ、該粒子を上記した粒子として本発明に好ましく用いることができる。なお、粒子のサイズは、反応液中のモノマーの濃度や反応時間を調節することにより調節することが可能である。また、重合開始・安定剤として糖類及び／又はポリソルベートを用いる場合には、該重合開始・安定剤の濃度や種類を変えることによっても、粒子サイズを調節することができる（下記実施例参照）。
　本発明の抗菌剤が抗菌作用を示す菌は、グラム陽性細菌である。グラム陽性細菌であれば特に限定されず、MSSA（メチシリン感受性黄色ブドウ球菌）やVSE（バンコマイシン感受性腸球菌）等のように抗生物質に感受性の細菌であっても、また、MRSA（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌）やVRE（バンコマイシン耐性腸球菌）等の多剤耐性菌であっても、本発明の抗菌剤により抗菌することができる。本発明の抗菌剤は、グラム陽性細菌の抗生物質耐性とは無関係に、上記粒子の特異的接着によってグラム陽性細菌を溶菌させ増殖を抑制するものである。従って、本発明の抗菌剤によれば、現存する多剤耐性菌をも抗菌することができるほか、新たな多剤耐性菌を出現させるおそれがないため、臨床応用上も極めて有利である。
　本発明の抗菌剤は、上記粒子のみから成るものであってもよく、また、グラム陽性細菌感染症の治療に用いる場合には、公知の賦形剤、担体等と混合し、投与方法に適した形態に調製したものであってもよい。該粒子は、単一種類の粒子のみからなるものであってもよく、また、２種類以上の粒子を混合して用いてもよい。本発明の抗菌剤の投与方法としては、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、静脈内、直腸内等への非経口投与の他、経口投与が挙げられる。具体的には、例えば、生理緩衝食塩水に粒子を懸濁し、注射等により非経口投与することができ、また、カプセル剤やシロップ剤などとして経口投与することができるが、これらに限定されない。また、本発明の抗菌剤を医療器具等の殺菌に用いる場合には、例えば、水やアルコール溶媒等に上記粒子を分散させ、これに医療器具等を浸漬すればよい。上記粒子を生体に投与又は器具類等と接触させることにより、抗菌すべきグラム陽性細菌と上記粒子とを接触させることで、グラム陽性細菌を抗菌することができる。
　上記粒子の抗菌活性の強さ（MIC値及びMBC値）は、粒子の粒径やゼータ電位等に影響され、また、耐性菌の種類に応じても異なるが、通常、該粒子はインビトロで0.01mg/ml～25mg/ml程度の濃度で抗菌作用を示す。例えば、下記実施例に記載されるシアノアクリレートポリマーから成る粒子は、下記実施例で用いられている各種黄色ブドウ球菌株及び腸球菌株に対し、インビトロで0.025mg/ml～6.4mg/ml程度の濃度で抗菌作用を示す。本発明の抗菌剤を感染症治療に用いる場合には、特に限定されないが、上記粒子を成人に対し１回当たり通常0.1g～100g程度、特に0.1g～25g程度投与すればよい。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
製造例１
シアノアクリレート系ポリマー粒子の製造
（デキストラン、デキストラン＋グルコース反応系）
　モノマーとしてnBCA（Histoacryl(登録商標)、Braun社、独国Melsungen）を用いてシアノアクリレート系ポリマー粒子を製造した。重合開始・安定剤として、デキストラン単独、又はデキストラン＋グルコースを用いた。デキストランは平均分子量70Kのものを用いた（Dex70）。
　100mlの塩酸に(1) 1gのDex70、又は(2) 1gのDex70と5gのグルコースを溶解した。塩酸濃度は、0.05N、0.01N、0.001Nの3通りとした。それぞれの溶液を撹拌下、1.2mLのnBCAを加え（反応液中濃度1.2v/v%）、室温で2時間撹拌を続けて（600rpm）重合反応を行なった。重合後の反応液に0.1N NaOHを加えて中和し、その後15分間撹拌した。該反応液を５μmサイズのMilexフィルター（商品名、MILLIPORE社）で濾過後、濾液をCentriprepフィルター（商品名、MILLIPORE社）を用いて3000rpm/15分間にて遠心濾過した。Centriprepフィルターを通過しなかった液について、更にDWを加え懸濁後3000rpm/15分間遠心し、同様の操作を3回行い、ポリシアノアクリレート粒子（0.05NHCl-Dex70, 0.05NHCl-Dex70+Glucose, 0.01NHCl-Dex70, 0.01NHCl+Glucose, 0.001NHCl-Dex70, 0.001NHCl-Dex70+Glucose)を得た。
　得られた粒子について、He・Neレーザー散乱光方式を利用した市販の測定装置（実施機種：Zetasizer Nano, Malvern Inst.UK社製）を用いて、平均粒径とゼータ電位を測定した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実施例１
シアノアクリレート系ポリマー粒子の抗菌活性
（デキストラン、デキストラン＋グルコース反応系）
　製造例１で製造した粒子の各種菌株に対する抗菌活性（最小発育阻止濃度（MIC）及び最小殺菌濃度（MBC））を調べた。ポジティブコントロールとしてアンピシリン（ABPC）を使用した。測定方法は微量液体希釈法（NCCLS）に準拠した。すなわち、APBCについては256μg/mlを原液（１倍希釈）とし、粒子については6.4mg/mlを原液（１倍希釈）として、それぞれ２倍希釈～２０４８倍希釈までの１２段階の希釈系列を調製して抗菌活性を評価した。９６ウェルプレートにこれらの希釈系列を添加して、各ウェルに菌株を105 CFU/mlとなるように加えて35℃で18時間インキュベートし、目視にて濁りが観察された場合を菌株の発育ありとして、発育が認められなかった最低濃度をMICとした。発育が認められなかったウェルから溶液を採取して、抗生物質を含まない培地に添加し、35℃にて18時間インキュベートした後、目視にて濁りの有無を観察した。濁りが観察されなかった最低濃度をMBCとした。結果を表２～表４に示す。表中の数値は、ABPC:μg/ml、ポリマー粒子:mg/ml、カッコ内は希釈倍率を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　デキストラン反応系とデキストラン＋グルコース反応系では、得られた粒子の抗菌活性は同程度であった。塩酸濃度は、0.01Nの方が0.05Nよりも抗菌活性が高くなる傾向があった。
　黄色ブドウ球菌に対するMICは0.025～0.4mg/mlであり、MSSAとMRSAに同程度の抗菌活性を示した。MBCは株間にて異なっていた。
　また、腸球菌に対するMICは0.1～0.2mg/mlであり、VSEとVREに対する抗菌活性に差はなかった。MBCは株間で有意差が認められる場合があった（1.6mg/mlと0.1mg/ml）。
製造例２
シアノアクリレート系ポリマー粒子の製造
（グルコース、リボース、ラクトース、トレハロース反応系）
　モノマーとしてnBCA（Histoacryl(登録商標)、Braun社、独国Melsungen）を用いてシアノアクリレート系ポリマー粒子を製造した。重合開始・安定剤として、グルコース、リボース、ラクトース、トレハロースを用いた。
　糖類として上記した単糖類及び二糖類のいずれかを5g用いた他は製造例１と同様にして、ポリシアノアクリレート粒子（0.05NHCl-Glucose, 0.05NHCl-Ribose, 0.05NHCl-Lactose, 0.05NHCl-Trehalose, 0.01NHCl-Glucose, 0.01NHCl-Ribose, 0.01NHCl-Lactose, 0.01NHCl-Trehalose, 0.001NHCl-Glucose)を製造した。
　得られた粒子について、市販の測定装置（上述）を用いてHe・Neレーザー散乱光解析を行ない、平均粒径とゼータ電位を測定した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
実施例２
シアノアクリレート系ポリマー粒子の抗菌活性
（グルコース、リボース、ラクトース、トレハロース反応系）
　実施例１と同様にして、製造例２で製造した粒子の各種菌株に対する抗菌活性（最小発育阻止濃度（MIC）及び最小殺菌濃度（MBC））を調べた。結果を表６～表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　単糖系と二糖系とを比較すると、ポリマー粒子の抗菌活性は単糖系の方が高かった。塩酸濃度の影響についてみると、抗菌活性は単糖系においては0.01NHCl系＞0.05NHCl系、二糖系においては0.01NHCl系≦0.05NHCl系であった。
　黄色ブドウ球菌に対するMICは0.4～3.2mg/mlであり、MSSAとMRSAに同程度の抗菌活性を示した。MBCは株間にて異なっていた。
　腸球菌に対するMICは1.6～3.2mg/mlであり、VSEとVREに対する抗菌活性に差はなかった（データ示さず）。MBCは株間で有意差が認められる場合があった（1.6mg/mlと＞6.4mg/ml）。
製造例３
シアノアクリレート系ポリマー粒子の製造
（Tween20、Tween20＋グルコース反応系）
　モノマーとしてnBCA（Histoacryl(登録商標)、Braun社、独国Melsungen）を用いてシアノアクリレート系ポリマー粒子を製造した。重合開始・安定剤として、Tween20、Tween20＋グルコースを用いた。重合反応時間は１時間とし、製造例１で検討したDex70及びDex70＋グルコースについても再度検討した。
　0.01Nの塩酸100mlに(1) Tween20を1ml、(2) Tween20を1mlとグルコース5g、(3) Dex70を1g、(4) Dex70を1gとグルコース5gを溶解した。それぞれの溶液を撹拌下、1.2mLのnBCAを加え（反応液中濃度1.2v/v%）、室温で1時間撹拌を続けて（600rpm）重合反応を行なった。重合後の反応液に0.1N NaOHを加えて中和し、その後15分間撹拌した。該反応液を５μmサイズのMilexフィルター（商品名、MILLIPORE社）で濾過後、濾液をCentriprepフィルター（商品名、MILLIPORE社）を用いて3000rpm/15分間にて遠心濾過した。Centriprepフィルターを通過しなかった液について、更にDWを加え懸濁後3000rpm/15分間遠心し、同様の操作を4回行い、ポリシアノアクリレート粒子（0.01NHCl-Tw20、0.01NHCl-Tw20+Glucose、0.01NHCl-Dex70(1hr)、0.01NHCl-Dex70+Glu(1hr)）を得た。
　得られた粒子について、市販の測定装置（上述）を用いてHe・Neレーザー散乱光解析を行ない、平均粒径とゼータ電位を測定した。結果を表９に示す。該装置を用いた解析で得られた粒径分布のグラフを図６に、ゼータ電位分布のグラフを図７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
実施例３
シアノアクリレート系ポリマー粒子の抗菌活性
（Tween20、Tween20＋グルコース反応系）
　実施例１と同様にして、製造例３で製造した粒子の各種菌株に対する抗菌活性（最小発育阻止濃度（MIC））を調べた。結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　Tween20を用いた反応系では、グルコース使用の有無で得られるポリマー粒子の抗菌活性に差異はなく同程度であった。また、デキストランを用いた反応系と対比しても、ポリマー粒子の抗菌活性は同程度であった。黄色ブドウ球菌と腸球菌に対するMICは0.05～0.1mg/mlであり、感受性と耐性菌共に同等の抗菌活性を示した。
実施例４
ポリマー粒子の接着性及び溶菌現象の確認
　製造例１で調製した0.01NHCl-Dex70+Glucose粒子を処理したグラム陽性細菌の形態変化を電子顕微鏡により観察した。ポリマー粒子による処理は、以下のとおりに行なった。
　上記粒子を生理食塩水に懸濁して粒子懸濁液（6μg/ml）を調製した。市販の24ウェル細胞培養プレートを用いて、１ウェル当たり105個～106個/1ml程度のグラム陽性細菌又は哺乳動物細胞数に１ウェル当たり1mlの粒子懸濁液を添加し、ウェル中にて室温で１時間粒子と細菌を混合浮遊させた。その後、生理食塩水を1ml/ウェル添加してプレートを２～３回振とうし、洗浄液を吸引除去した。この洗浄操作を２回繰り返して合計３回の洗浄操作を行ない、洗浄後の細菌を走査型電子顕微鏡（SEM）により観察した。
　バンコマイシン耐性の多剤耐性菌であるVREのNCTC12201株にバンコマイシンを作用させても、全く変化は認められないが（図２）、上記ポリマー粒子で処理すると、粒子が細菌表面に接着し、菌体が膨潤して溶菌する様子が観察された（図３）。VREの他の菌株においても同様に粒子の接着と溶菌現象が観察され、菌株間で形態変化に差異は認められなかった（図４）。メチシリン耐性の多剤耐性菌であるMRSAのJCM8703菌株においても、VREと同様に、ポリマー粒子の細菌表面への接着と溶菌現象が観察された(図５)。
　一方、哺乳動物細胞への接着性について検討するため、24ウェル細胞培養プレート中で培養したHeLa細胞あるいはＣＨＯ細胞に対して、上記と同様の粒子処理及び洗浄操作を行ない、SEMにて細胞を観察したところ、細胞表面への粒子の接着は認められなかった。このことから、該粒子は哺乳動物細胞膜への接着性を有しないことが確認された。なお、該粒子の生体への毒性について、マウスを用いて日局の亜急性毒性試験を行なったところ、毒性症状は認められなかった。
参考例　ポリマー粒子洗浄外液の抗菌活性について
　製造例１ないし３において、Centriprepフィルターを用いて遠心濾過によりポリマー粒子を洗浄した際の洗浄外液を用いて、ポリマー粒子からの溶出成分が抗菌活性を示している可能性を検討した。４回目の洗浄外液を用いて、実施例１に記載される方法と同様の方法により抗菌活性を調べた。その結果、製造例１ないし３で製造したいずれの粒子の洗浄外液を用いても、MSSA及びMRSAの増殖を抑制することはできなかった。

Claims (18)

  1. 　グラム陽性細菌の細胞壁に接着し、哺乳動物の細胞膜には接着しない、粒径が5μm以下の粒子であって、グラム陽性細菌に対する抗菌活性成分を実質的に含まない粒子を有効成分として含有する、グラム陽性細菌用抗菌剤。
  2. 　前記粒子の粒径が1μm以下である請求項１記載の抗菌剤。
  3. 　前記粒子の平均粒径が20nm～500nmである請求項２記載の抗菌剤。
  4. 　前記粒子の平均粒径が20nm～300nmである請求項３記載の抗菌剤。
  5. 　前記粒子のゼータ電位が-3mV～-80mVである請求項１ないし４のいずれか１項に記載の抗菌剤。
  6. 　前記粒子が、繰り返し単位中に下記一般式(I)
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     [式中、Zは電子供与基を示す]
    で表される構造を有するポリマー粒子である、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の抗菌剤。
  7. 　前記一般式(I)において、Zはシアノ基、アミノ基又はイミノ基である請求項６記載の抗菌剤。
  8. 　前記一般式(I)で表される構造が、下記一般式(II)で表わされる構造である請求項６又は７記載の抗菌剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     [式中、Zは上記一般式(I)における定義に同じであり、Rは水素、ヒドロキシ基、炭素数１から１０のアルキル基、炭素数１から１０のアルコキシ基、炭素数６から１５のアリール基、炭素数６から１５のアリールオキシ基、炭素数７から１６のアラルキル基又は炭素数７から１６のアラルキルオキシ基である。R中の炭素鎖を構成する１以上の炭素原子は窒素、硫黄又は酸素で置き換わっていてもよい。]
  9. 　前記一般式(II)において、Rはヒドロキシ基又は炭素数１から１０のアルコキシ基である請求項８記載の抗菌剤。
  10. 　前記一般式(II)において、Zはシアノ基であり、Rはn-ブトキシ基である請求項９記載の抗菌剤。
  11. 　前記ポリマー粒子は、下記一般式(III)
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     [Z及びRは上記一般式(II)における定義に同じであり、X及びYはそれぞれ独立して末端に炭素－炭素二重結合を有する原子団を表すか、又はX及びYが一緒になってメチリデン基を表す。]
    で表されるモノマー並びに水酸基を有する糖類及び／又はポリソルベートの共存下において、前記モノマーを重合させることにより製造される請求項６ないし１０のいずれか１項に記載の抗菌剤。
  12. 　前記一般式(III)において、Zはシアノ基、アミノ基又はイミノ基であり、Rはヒドロキシ基又は炭素数１から１０のアルコキシ基であり、X及びYは一緒になってメチリデン基を表す請求項１１記載の抗菌剤。
  13. 　前記一般式(III)で表されるモノマーがn-ブチル-2-シアノアクリレートである請求項１２記載の抗菌剤。
  14. 　前記糖類が、グルコース、リボース、フルクトース、マンノース、ラクトース、トレハロース、マルトース、スクロース、マンナン及び平均分子量70,000以上のデキストランからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１１ないし１３のいずれか１項に記載の抗菌剤。
  15. 　前記糖類が、グルコース、リボース、ラクトース、トレハロース及び平均分子量70,000以上のデキストランからなる群より選択される少なくとも１種である請求項１４記載の抗菌剤。
  16. 　前記ポリソルベートがポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートである請求項１１ないし１５のいずれか１項に記載の抗菌剤。
  17. 　グラム陽性細菌の細胞壁に接着し、哺乳動物の細胞膜には接着しない、粒径が5μm以下の粒子であって、グラム陽性細菌に対する抗菌活性成分を実質的に含まない粒子の有効量を、抗菌すべきグラム陽性細菌と接触させることを含む、グラム陽性細菌の抗菌方法。
  18. 　グラム陽性細菌の細胞壁に接着し、哺乳動物の細胞膜には接着しない、粒径が5μm以下の粒子であって、グラム陽性細菌に対する抗菌活性成分を実質的に含まない粒子の、グラム陽性細菌用抗菌剤の製造のための使用。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012133648A1 (ja) 2011-03-31 2012-10-04 Shirotake Shoichi 高次構造体が示す抗細胞効果の新規調整技法
WO2013108871A1 (ja) 2012-01-19 2013-07-25 Shirotake Shoichi 植物病原細菌用抗菌剤
JP2015157778A (ja) * 2014-02-24 2015-09-03 昇一 城武 優れた植物病害防除効果を有する菌類用抗菌剤
WO2015129793A1 (ja) * 2014-02-27 2015-09-03 昇一 城武 抗ウイルス剤
JP2016056481A (ja) * 2014-09-11 2016-04-21 チカミミルテック株式会社 抗菌性シートおよび抗菌性シートの製造方法
JP2017081852A (ja) * 2015-10-28 2017-05-18 チカミミルテック株式会社 抗菌剤および抗菌剤の製造方法
WO2020071427A1 (ja) * 2018-10-03 2020-04-09 三菱鉛筆株式会社 筆記具用水性インク組成物

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11019817B2 (en) 2015-08-25 2021-06-01 Shoichi Shirotake Antimicrobial agent against germs which has excellent plant disease control effect
CN111117116B (zh) * 2019-12-31 2022-02-01 安徽科居新材料科技有限公司 抗菌剂及木塑复合材料

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11503148A (ja) 1995-04-04 1999-03-23 エラン コーポレーション ピーエルシー インスリンを含有する生分解性ナノ粒子の制御放出
JP2002504526A (ja) 1998-02-27 2002-02-12 バイオオーリアンス ファーマ（エス．エー．） 少なくとも一つの重合体および一つ又は複数の有効成分と複合化できる少なくとも一つの化合物から成るナノ粒子
JP2008127538A (ja) * 2006-11-24 2008-06-05 Yokohama City Univ シアノアクリレート系ポリマー粒子及びその製造方法
JP2008207137A (ja) * 2007-02-28 2008-09-11 Shoichi Shirotake 異なる平均粒径サイズの粒子からなる混合微粒子カプセルの製造方法
WO2008126846A1 (ja) * 2007-04-09 2008-10-23 Yokohama City University バンコマイシン耐性グラム陽性細菌用抗菌剤

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2504408B1 (fr) * 1981-04-24 1986-02-14 Couvreur Patrick Procede de preparation de particules submicroscopiques, particules ainsi obtenues et compositions pharmaceutiques les contenant
US4843130A (en) * 1987-04-17 1989-06-27 Otsuka Kagaku Kabushiki Kaisha Antibacterial polymer
JP2002510049A (ja) * 1998-03-31 2002-04-02 ゼタトロニクス・リミテッド 微生物の検出および抗菌活性の評価を行うための迅速な方法
JP2001123278A (ja) * 1998-12-26 2001-05-08 Toto Ltd 施釉製品
FR2816949B1 (fr) * 2000-11-17 2003-11-28 Centre Nat Rech Scient Copolymere a structure sequencee compose d'un segment saccharidique lie a au moins un segment hydrophobe bioerodable, et particules correspondantes
US9149440B2 (en) * 2003-09-02 2015-10-06 University Of South Florida Nanoparticles for drug-delivery

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH11503148A (ja) 1995-04-04 1999-03-23 エラン コーポレーション ピーエルシー インスリンを含有する生分解性ナノ粒子の制御放出
JP2002504526A (ja) 1998-02-27 2002-02-12 バイオオーリアンス ファーマ（エス．エー．） 少なくとも一つの重合体および一つ又は複数の有効成分と複合化できる少なくとも一つの化合物から成るナノ粒子
JP2008127538A (ja) * 2006-11-24 2008-06-05 Yokohama City Univ シアノアクリレート系ポリマー粒子及びその製造方法
JP2008207137A (ja) * 2007-02-28 2008-09-11 Shoichi Shirotake 異なる平均粒径サイズの粒子からなる混合微粒子カプセルの製造方法
WO2008126846A1 (ja) * 2007-04-09 2008-10-23 Yokohama City University バンコマイシン耐性グラム陽性細菌用抗菌剤

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Dai 127 Proceedings of the Annual Meeting of the Pharmaceutical Society of Japan", 5 March 2007, article TONEGAWA J. ET AL.: "Nano Technology o Mochiita Yakuzaigakuteki Kiban Kenkyu -VIII. Kokin'yaku Hogo Nano Capsule no Gosei to Kokin Kassei no Tansaku", pages: 132 *
"Program of Joint Meeting, 55th Higashinihon Branch of Japanese Association of Infectious Diseases / 53th Higashinihon Branch of Japan Society of Chemotherapy", 2006, article TONEGAWA J. ET AL.: "Nano Technology o Mochiita Yakuzaigakuteki Kiban Kenkyu VI -Kokin Kassei no Fine Tuning", pages: 121 *
"Program of Joint Meeting, 56th Higashinihon Branch of Japanese Association of Infectious Diseases / 54th Higashinihon Branch of Japan Society of Chemotherapy", 10 September 2007, article HODOKI N. ET AL.: "Nano Technology o Mochiita Yakuzaigakuteki Kiban kenkyu XV -Nano Setsugo Kaimen ga Motarasu Vancomycin Taisei Kiko no Choetsu", pages: 136 *
CHRISTINE VAUTHIER ET AL., ADV. DRUG DELIV., vol. 55, 2003, pages 519 - 548
EIFERMAN R.A. ET AL.: "Antibacterial effect of cyanoacrylate glue.", ARCHIVES OF OPHTHALMOLOGY, vol. 101, no. 6, January 1983 (1983-01-01), pages 958 - 960 *
GIRAY C.B. ET AL.: "Antibacterial and cytotoxic effects of N-butyl-2-cyanoacrylate used as a tissue adhesive", MIKROBIYOLOJI BULTENI, vol. 27, no. 2, 1993, pages 154 - 163 *
HODOKI N. ET AL.: "Nano Technology o Mochiita Yakuzaigakuteki Kiban Kenkyu XV -Nano Setsugo Kaimen ga Motarasu Vancomycin Taisei Kiko no Choetsu", JAPANESE JOURNAL OF CHEMOTHERAPY, vol. 56, no. 2, 10 March 2008 (2008-03-10), pages 248 *
QUINN J.V. ET AL.: "N-2-butylcyanoacrylate: Risk of bacterial contamination with an appraisal of its antimicrobial effects", JOURNAL OF EMERGENCY MEDICINE, vol. 13, no. 4, 1995, pages 581 - 585 *
See also references of EP2236143A4 *
SHIROTAKE, S. ET AL.: "Preparation of Cyanoacrylate Nanoparticles Using Monosaccharides or Disaccharides", CHEMICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN, vol. 56, no. 1, January 2008 (2008-01-01), pages 137 - 138 *
UHLIG R. ET AL.: "Experimental studies on the antimicrobial effects of some butylcyanoacrylate adhesives", ZEITSCHRIFT FUER EXPERIMENTELLE CHIRURGIE, vol. 11, no. 1, 1978, pages 27 - 31 *

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2016128571A (ja) * 2011-03-31 2016-07-14 株式会社ナノカム 高次構造体が示す抗細胞効果の新規調整技法
US20140065222A1 (en) * 2011-03-31 2014-03-06 Nanocame Co., Ltd. Novel preparation technique for higher-order structure that exhibits anticellular effect
WO2012133648A1 (ja) 2011-03-31 2012-10-04 Shirotake Shoichi 高次構造体が示す抗細胞効果の新規調整技法
WO2013108871A1 (ja) 2012-01-19 2013-07-25 Shirotake Shoichi 植物病原細菌用抗菌剤
JPWO2013108871A1 (ja) * 2012-01-19 2015-05-11 昇一 城武 植物病原細菌用抗菌剤
JP2015157778A (ja) * 2014-02-24 2015-09-03 昇一 城武 優れた植物病害防除効果を有する菌類用抗菌剤
JPWO2015129793A1 (ja) * 2014-02-27 2017-03-30 昇一 城武 抗ウイルス剤
WO2015129793A1 (ja) * 2014-02-27 2015-09-03 昇一 城武 抗ウイルス剤
JP2016056481A (ja) * 2014-09-11 2016-04-21 チカミミルテック株式会社 抗菌性シートおよび抗菌性シートの製造方法
JP2017081852A (ja) * 2015-10-28 2017-05-18 チカミミルテック株式会社 抗菌剤および抗菌剤の製造方法
WO2020071427A1 (ja) * 2018-10-03 2020-04-09 三菱鉛筆株式会社 筆記具用水性インク組成物
JP2020055971A (ja) * 2018-10-03 2020-04-09 三菱鉛筆株式会社 筆記具用水性インク組成物
CN112867768A (zh) * 2018-10-03 2021-05-28 三菱铅笔株式会社 书写工具用水性墨组合物
JP7169837B2 (ja) 2018-10-03 2022-11-11 三菱鉛筆株式会社 筆記具用水性インク組成物
CN112867768B (zh) * 2018-10-03 2022-12-16 三菱铅笔株式会社 书写工具用水性墨组合物
US11926749B2 (en) 2018-10-03 2024-03-12 Mitsubishi Pencil Company, Limited Aqueous ink composition for writing instruments

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