KR102083481B1 - 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물은 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)를 유효 성분으로 포함한다.
상기한 구성에 의해 본 발명은 아연-키토산 나노 입자를 포함하는 조성물을 이용하여 종양 괴사 인자 수용체 CD95 및 세포 사멸 관련 유전자의 활성화를 통해 사람의 급성 T- 림프구 백혈병에서 세포 사멸을 유도할 수 있다.

Description

아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR ACUTE LYMPHOBLASTIC LEUKEMIA COMPRISING ZINC-CHITOSAN NANOPARTICLES}
본 발명은 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 아연-키토산 나노 입자를 포함하는 조성물을 이용하여 종양 괴사 인자 수용체 CD95 및 세포 사멸 관련 유전자의 활성화를 통해 사람의 급성 T- 림프구 백혈병에서 세포 사멸을 유도할 수 있는 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
급성 림프구성 백혈병(ALL, Acute lymphoblastic leukemia)은 소아암의 30%를 차지하는 가장 흔한 암종이다.
이러한 급성 림프구성 백혈병은 방사선이나 유아기 감염, 부모의 알코올 및 흡연 등이 영향을 미치는 것으로 알려져 있으나, 그 원인은 대체로 잘 알려져 있지 않다.
급성 림프성 백혈병은 종양 억제 유전자(tumor suppressor gene), 암유전자(oncogene) 및 몇몇 염색체에 영향을 미치는 유전적 돌연변이의 축적에서 기인하는 것으로 알려져 있다. 소아에서의 백혈병의 발명에 대한 개개인의 차이를 결정하는 데에는 일반적인 유전적 변이가 작용할 수 있다.
한편, 백혈병을 치료하기 위한 방법에 있어서, 소수성 약물 중재 화학 요법은 암세포의 임상 치료를 위한 전형적인 선택으로 간주되는데, 이들 화학 요법제가 암세포에 대하여 효과적이지만, 암세포 및 정상 세포의 선택성에는 큰 단점이 있다(Li, Xiang, Li, & Xu, 2018).
이러한 소수성 약물 화학 요법 시스템은 정상 세포에 대한 독성으로 인해 암을 치료할 임상적 수용성으로 만족스럽지 못하며 몇 가지 부작용을 유발한다(Li, Xiang, Li, & Xu, 2018).
따라서 나노 캐리어를 이용한 암세포에 대한 소수성 화학 요법제의 표적 기반 활성화는 정상 세포에 해를 입히지 않고 투자율 및 보유력의 효능을 증가시킬 수 있다(Peer et al., 2007).
나노 캐리어, 리포솜, 무기 나노 물질 및 고분자 미셀과 같은 고분자 화학 기반의 약물 전달 시스템은 유방암(Mayeridharan, Munshi), 폐암(Amreddy, Babu, 2013), 인간 자궁 경부암(Altmeyer, Karam, Khalil, & Mainardes, 2016), 인간 두경부(Termsalasab 등, 2014), 골육종(Ai, Liao, & Ren, 2017), 대장암(Dong et al., 2010), 피부암(Das, Das, Samadder, Paul, & Khuda-Bukhsh, 2013), 전립선암(Siddiqui et al., 2009), 간암(Z.-H. Zhang 외. 2013), 췌장암(Kesharwani et al., 2015), 구강암(Lu, Chen, Wen, Li, & Chen, 2013), 백혈병(Misra & Sahoo, 2011) 및 난소암(Zheng et al., 2010)) 등에서 비 유해성, 정상 세포에 대한 부작용 감소 및 높은 치료 효율로 인해 현재 주목받고 있다.
이중, 백혈병은 미성숙 및 비정상 백혈구의 비정상적인 증가로 감염 초기 단계에서 치료하지 않으면 사망을 유발할 수 있는데(Eby, 2005), 이것은 흔히 어린이(15세 미만)(Bhojwani, Yang, & Pui, 2015)에게 흔히 발생하는 암의 일반적인 유형으로 급성 림프 구성 백혈병, 만성 림프 구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 적어도 일부 현저한 백혈병(Siegel, Miller, & Jemal, 2016)과는 다른 유형으로 구별된다.
백혈병은 원 발암 유전자와 마이크로 RNA 유전자가 번갈아 발생하는 일종의 혈액 암인데, 초기에는 천천히 증식하고 미성숙 백혈구, 골수 및 림프계로 발생하여 림프절, 비장, 간 및 중추 신경계(뇌 및 척수)로 퍼질 수 있다.
줄기 세포 이식, A-CD22 유도 요법, epratumab, obinutuzumab, REGN 1979, C-CD19, Coltuximab ravtansine, SGN-CD 19A, ADCT-combotox, B-CD20, Ofatumumab, Bortezomib, Ruxolitinib, Decitabine, P13K/mTOR 억제제, 6-키메라 항원 수용체 T 세포 및 리툭시 맵(Terwilliger & Abdul- 헤이, 2017)을 포함하여 백혈병을 치료하기 위한 몇몇 치료 방법이 있는데, 그러나 급성 림프구 백혈병을 치료하기 위한 새로운 표적 기반 전략은 약물 내성을 증가시켰다(Pui & Jeha, 2007).
아연이온(Zn)은 단백질 및 DNA 합성 경로와 면역, 적혈구, 뼈, 기관, 근육 기능, 호중구, T- 헬퍼 1 및 2 사이토 카인, IL 2, IL6, 인터페론 γ, 유전적 세포 분열, DNA 복제 및 RNA 전사, 세포 활성화 및 자연 살해 세포(Dhawan & Chadha, 2010)의 적절한 세포 조절에 필수적인 영양소/항산화제인데, 이러한 아연이온의 결핍은 여러 질병에 대한 면역 반응의 조절을 약화시키고 세포 면역을 약화시키고 (Kanter et al., 1982), 또한, 아연은 백혈병, 심혈관 질환 및 다양한 암을 포함한 만성 질환에 대한 면역 보조제를 보조한다(Shankar & Prasad, 1998 ).
여기에 백혈병 환자 혈청의 Zn 농도가 정상적인 환자보다 매우 낮으며 아연 대사의 체계적인 오류가 증가한다는 것을 언급할 가치가 있다(Eby, 2005)
백혈병 세포의 성장과 발달의 분자 기전은 정상 세포가 아스파라긴을 완전히 분해할 수는 없지만, 아스파라긴(2-aminosuccinic acid의 아미드)이 백혈병 세포의 증식 및 증식에 필수적이라는 사실을 밝혀냈다.}
박테리아와 식물 세포에서 아연(Zn)이 결핍되면 단백질 합성에서보다 많은 질소가 저장되기 때문에 유리 아미노산 아스파라긴의 생성을 증가시킬 수 있다("인간 건강과 질병의 미량 원소. Vol. 2. Essential and Toxic Elements", 1977).}
아연 보충제는 예상치 못한 경우에 과도하게 섭취하는 임상 연구 과정(Consolo, Melnikov, C
Figure 112018028846270-pat00001
nsolo, Nascimento, & Pontes, 2013, Eby, 2005, Kanter 등, 1982)에 의한 백혈병 위험을 감소시킬 수 있다고 보고되었지만, (과량의) 아연(Zn)은 다른 세포의 변화에 영향을 미칠 수 있고(Leitzmann et al., 2003), 최적 섭취량에서 암 위험을 현저하게 감소시킬 수 있다(Grattan & Freake, 2012).
이에 본 발명자는 아연을 제어하는 아연 함유 키토산 나노 입자를 생성하고 인간 급성 T 림프구 백혈병에서 유도된 세포 사멸에 미치는 영향을 조사하고 임상 박테리아 병원균에 대한 효과를 평가함으로써, 아연-키토산 나노 입자를 포함하는 약학조성물이 사람의 급성 T- 림프구 백혈병에서 세포 사멸을 유도할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
국내등록특허 제10-1695329호(2017년 01월 05일 등록) 국내등록특허 제10-1695327호(2017년 01월 05일 등록)
Ai, J.-w., Liao, W., & Ren, Z.-L. (2017). Enhanced anticancer effect of copper-loaded chitosan nanoparticles against osteosarcoma. RSC Advances, 7(26), 15971-15977. Altmeyer, C., Karam, T. K., Khalil, N. M., & Mainardes, R. M. (2016). Tamoxifen-loaded poly(L-lactide) nanoparticles: Development, characterization and in vitro evaluation of cytotoxicity. Materials Science and Engineering: C, 60, 135-142. Amreddy, N., Babu, A., Muralidharan, R., Munshi, A., & Ramesh, R. (2017). Polymeric Nanoparticle-Mediated Gene Delivery for Lung Cancer Treatment. Topics in Current Chemistry, 375(2), 35.
본 발명은 아연-키토산 나노 입자를 포함하는 조성물을 이용하여 종양 괴사 인자 수용체 CD95 및 세포 사멸 관련 유전자의 활성화를 통해 사람의 급성 T- 림프구 백혈병에서 세포 사멸을 유도할 수 있는 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물을 제공하는데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 다양한 과제들은 이상에서 언급한 과제들에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물은 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)를 유효 성분으로 포함한다.
상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 직경이 10 내지 200nm일 수 있다.
상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 구형으로 형성될 수 있다.
상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 손상된 세포벽 유도를 통해 박테리아 병원체(bacterial pathogens)를 억제할 수 있다.
상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 인간 급성 T 림프구 백혈병(6T-CEM) 세포에서 세포 사멸을 유도할 수 있다.
상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 키토산 나노 입자(CSNPs)를 이온성 젤라틴 방법을 사용하여 합성하여 제조될 수 있다.
상기 키토산 나노 입자(CSNPs)는 키토산(CS) 50mg을 아세트산 0.5%에 용해시키고, 실온(25±2℃)에서 자기 교반기로 4시간 동안 교반한 다음, 나트륨 트리폴리인산염(sodium tripolyphosphate)(5mg/5ml 증류수)을 25ml의 키토산(CS) 용액에 떨어 뜨려 키토산 나노 입자(CSNPs)를 형성하고 2시간 동안 계속 교반하는 과정을 거쳐 제조될 수 있다.
상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 상기 교반된 키토산 나노 입자(CSNPs)에 트리폴리 인산나트륨(sodium tripolyphosphate(TPP))를 첨가하고, 500rpm·min-1에서 15분 동안 교반한 키토산 아세트산 용액(CS-acetic acid 용액)에 ZnSO4·7H2O(1:5 비율)를 용해시키며, 14000rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 동결 건조시켜 제조될 수 있다.
상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 FT-IR 분광 광도계(FTIR) 분석을 통해 분석하는 경우 2880(C-H, 스트레칭, 알켄), 1534(-N-O, 스트레칭, 니트로 화합물), 1379(-OH, 벤딩, 알콜), 1034(SO, 스트레칭, 술폭시드) 및 605(C-I, 스트레칭, 할로 화합물)에서 피크(peaks)를 보일 수 있다.
상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 S. aureus (ATCC13150) 및 E. coli 60을 완전히 사멸시키고, S. enterica typhimurium (ei-eiii)에서 세포 사멸의 60~65%를 보일 수 있다.
기타 실시 예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명에 포함되어 있다.
본 발명에 따른 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물은 아연-키토산 나노 입자를 포함하는 조성물을 이용하여 종양 괴사 인자 수용체 CD95 및 세포 사멸 관련 유전자의 활성화를 통해 사람의 급성 T- 림프구 백혈병에서 세포 사멸을 유도할 수 있다.
본 발명의 기술적 사상의 실시예는, 구체적으로 언급되지 않은 다양한 효과를 제공할 수 있다는 것이 충분히 이해될 수 있을 것이다.
도 1a는 입자 크기 분석기를 사용하여 측정된 키토산 나노 입자의 입자 크기 분석 그래프이고, 도 1b는 입자 크기 분석기를 사용하여 측정된 아연-키토산 나노 입자의 입자 크기 분석 그래프이다.
도 2a(i), 2b(i), 2c(i)는 키토산 나노 입자(CSNPs)의 형태적 특성을 보여주고, 도 2a(ii), 2b(ii), 2c(ii)는 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)의 형태적 특성을 보여주는 사진으로, 도 2a(i), (ii)는 주사 전자 현미경 사진(Scanning Electron Microscopic image)이고, 도 2b(i), (ii)는 투과전자 현미경 사진(Transmission electron microscopic image)이며, 도 2c(i), (ii)는 키토산과 아연의 존재하의 에너지분산형 분광분석법(Energy dispersive X-ray spectroscopy)을 보여주는 그래프이다.
도 3a는 화학 시료의 패턴에 대한 FTIR을 보여주는 그래프이고, 도 3b는 화학 시료의 패턴에 대한 XRD를 보여주는 그래프이다.
도 4a(i)은 처리되지 않은 Staphylococcus aureus (ATCC13150)의 박테리아 세포의 SR-CLSM 이미지를 보여주는 사진이고, 도 4a(ii)는 처리되지 않은 Escherichia coli (ATCC35150)의 박테리아 세포의 SR-CLSM 이미지를 보여주는 사진이며, 도 4a(iii)은 처리되지 않은 Salmonella enterica typhimurium (ATCC14028)의 박테리아 세포의 SR-CLSM 이미지를 보여주는 사진이다.
도 4b(i), (ii), (iii)은 ZnSO4·7H2O로 처리한 박테리아 세포의 SR-CLSM 이미지를 보여주는 사진이고, 도 4c(i), (ii), (iii)은 Chitosan으로 처리한 박테리아 세포의 SR-CLSM 이미지를 보여주는 사진이며, 도 4d(i), (ii), (iii)은 CSNPs-chitosan 나노 입자로 처리한 박테리아 세포의 SR-CLSM 이미지를 보여주는 사진이고, 도 4e(i), (ii), (iii)은 아연-키토산 나노 입자로 처리한 박테리아 세포의 SR-CLSM 이미지를 보여주는 사진이다.
도 5a는 여러 pH 범위에서 CSNPs로부터 Zn의 시험 관내 방출 실험 결과를 보여주는 그래프이고, 도 5b는 인간 급성 T-림프구 백혈병에 대응한 Zn, CS, CSNPs and Zn-CSNPs의 시험 관내 세포 독성 방출 실험 결과를 보여주는 그래프이며, 도 5c는 6T-CEM이 투여량에 따른 세포 부착 분석을 보여주는 그래프이다.
도 6a, b, c, d, e는 세포 사멸 분석을 보여주는 그래프이다.
도 7a는 FITC의 형광현미경(Fluorescence microscopic images) 사진이고, 도 7b는 DAPI의 형광현미경 사진이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예를 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 실시예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
본 출원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미가 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미가 있는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물에 대한 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다.
1. 재료 및 실험
(1) 재료(Materials)
RPMI1640 배지(medium)(Gibco), 소태아혈청(Fetal bovine serum)(Gibco), 트립판, 디메틸 술폭시드(dimethyl sulfoxide)(DMSO), 메틸티아졸릴디페닐테트라졸륨 브로마이드(methyl thiazolyl diphenyl-tetrazolium bromide)(MTT), 플루오로세린 이소티오시아네이트(fluorescerin isothiocyanate)(FITC), 4',6- 디아미디노-2-페닐인돌(4',6-diamidino-2-phenylindole)(DAPI), 디메틸술폭시드(dimethyl sulfoxide)(DMSO)는 Gibco 및 Sigma-Aldrich, Shanghai, China로부터 구입하였다.
저 분자량 키토산(폴리[β-2-아미노-2-데옥시-(1-4)-D 글루코피라노오스] (50000 Da)(poly[β-2-amino-2-deoxy-(-1-4)-D glucopyranose])(50000 Da)), 아세트산, 황산아연(ZnSO4·7H2O), 트리폴리 인산나트륨(sodium tripolyphosphate (TPP))은 한국의 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.
또한, 다른 모든 화학 물질 및 시약은 상업용 공급 업체에서 구입하였다.
(2) 키토산 나노 입자를 포함하는 아연의 준비(Preparation of zinc containing chitosan nanoparticles)
키토산 나노 입자(CSNPs)는 약간의 수정을 가하여 다른 곳(Calvo, Remunan-Lopez, Vila-Jato, & Alonso, 1997)에 기술된 이온성 젤라틴 방법을 사용하여 합성하였다.
상세하게는, 키토산(CS) 50mg을 아세트산 0.5%에 용해시키고, 실온(25±2℃)에서 자기 교반기로 4시간 동안 교반한 다음, 나트륨 트리폴리인산염(sodium tripolyphosphate)(5mg/5ml 증류수)을 25ml의 키토산(CS) 용액에 떨어 뜨려 키토산 나노 입자(CSNPs)를 형성하고 2시간 동안 계속 교반하였다.
한편, 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 위에서 언급한 TPP를 첨가하고 이 혼합물을 500rpm·min-1에서 15분 동안 교반한 키토산 아세트산 용액(CS-acetic acid 용액)에 ZnSO4·7H2O(1:5 비율)를 용해시켜 제조하였다.
최종적으로 14000rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 동결 건조시켜 키토산 나노 입자(CS NPs)와 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)를 제조하였고, 항 박테리아 및 세포 자살과 같은 생물학적 분석을 위해 4℃에서 보관하였다.
아연 함량의 수준은 유도 결합 플라즈마 시스템 ICP-광 방출 분광 광도계 (Optima 7300DV)에 의해 결정되었다.
(3) 물질 특성화(Material characterization)
입자 크기 분석기(the particle size Analyzer)(Malvern Mastersizer 2000)를 사용하여 키토산 나노 입자(CS NPs) 및 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)의 입자 크기를 분석하였다.
나노입자(NPs)의 형태는 에너지분산형 분광분석법(Energy dispersive X-ray spectroscopy)과 연결된 전계 방출 투과 전자 현미경(Field emission transmission electron microscope)(JEM-2100F)과 주사 전자 현미경(Scanning Electron Microscope)(UHR-SEM : S-4800, Hitachi, Japan)을 이용하여 관찰하였으며, 나노입자(NPs)에 존재하는 작용 분자를 푸리에 변환 적외선 분광계(Fourier-transform infrared spectrophometer)(Perkin Elmer, UK)로 분석 하였다.
분석된 FTIR에 대해, 나노 입자(NPs)를 브롬화칼륨(KBr)과 혼합하여 샘플을 준비하고 펠렛으로 제조한 후, 스펙트럼을 4cm-1의 분해능, 500 내지 4000cm-1의 범위에서 관찰하였다.
나노 입자(NPs)의 순도와 미세 결정은 Cu κα선을 40keV에서 θ-2θ 구성으로 작동하는 X-선 회절계(X-ray diffractometer)(X'pert-pro MPD-PANalytical, Netherland)를 사용하여 측정하였으며, 시료는 나노 입자(NPs) 0-10ml를 유리 그리드(glass grid) 위에 로딩하고, 공기로 건조하였다.
나노 입자(NPs)의 크기는 입자 크기 분석기(Particle size analyzer)(PSA, Malvern ins. Ltd, 영국)를 사용하여 분석하였고, 이 모든 분석은 한국 춘천 중앙 연구소 강원 대학교에서 수행되었다.
(4) 항균 활동(Antimicrobial activity)
Zn-CSNPs, CSNPs 및 ZnSO4.7H2O의 저해 효과를 미생물 희석법(microdilution method)(Clinical and laboratory standard institute, CLSI) 및 디스크 확산법(disc diffusion method)(Brumfitt, Hamilton-Miller, & Franklin, 1990)을 이용하여 Escherichia coli(ATCC35150), Staphylococcus aureus(ATCC13150), and Salmonella enterica Typhimurium(ATCC14028)를 분석하였다.
본 발명에서 사용된 균주는 미국의 ATCC(American Type Culture Collection) 또는 한국의 KCTC(Korean Collection for Type Culture)에서 입수하였다.
Muller-Hinton 한천(Muller-Hinton agar)(MH)과 De Man, Rogosa 및 Sharpe 한천(MRS)을 사용하여 최소 억제 농도(The minimal inhibitory concentration)(MIC) 분석을 수행하였다.
MIC의 경우, 미생물 균주는 전형적으로 37℃에서 180rpm의 회전 진탕기(rotary shaker)에서 18~24시간 동안 MH 배지로 성장시켰다. 미생물 현탁액(microbial suspension)은 600nm에서 측정된 OD와 같이 약 109 CFU·ml-1의 세포 밀도로 조절하였다. 박테리아 현탁액(bacterial suspensions)을 상이한 농도의 나노 입자(NPs) 및 다른 분석 현탁액(other analytical suspensions)을 함유하는 웰 플레이트(well plates )(96-웰, Costar)에 분배하였다.
여기서, MHB는 음성 대조군(negative control)으로 사용되었고 처리되지 않은 세균 현탁액(bacterial suspensions)은 양성 대조군(positive control)으로 사용되었다. MIC50 및 MBC99는 다른 곳(Gopinath et al., 2016)에서 기술된 바와 같이 측정되었다.
Zn-CSNPs, CSNPs, CS 및 ZnSO4·7H2O 박테리아의 세포 사멸 또는 생존의 영향은 LIVE/DEAD ™ BacLight ™ Bacterial Viability Kit와, 현미경 L7007 용 초 민감 고해상도 공 촛점 레이저 스캐닝 현미경(SR-CLSM, LSM880 with Airyscan, ZEISS, Oberkochen, Germany)을 사용하여 구별하였다.
하룻밤 동안 세포 현탁액(105 CFU ml- 1)을 성장시키기 위해 Zn-CSNPs, CSNPs, CS 및 ZnSO4·7H2O를 30분에서 60분 동안 MIC에서 처리하였고, 이후 다음 세포를 원심 분리하고 펠렛을 PBS로 세척한 후 SYTO9 및 요오드화 프로피딘(propidium iodide)으로 어두운 환경에서 15분간 두 배로 염색하였다.
488nm에서 488nm의 레이저 라인에 488nm의 여기 광을 방출하고, Syto-9는 레이저 라인을 488nm에서 617번, 503에서의 발광을 63x 렌즈를 사용하여 관찰하였다.
(5) 세포 배양 연구 - 세포 사멸 분석(Cell culture studies- apoptosis assay)
인간 급성 T-림프구 백혈병(Human acute T-lymphocyte leukemia)(6T-CEM)은 중국 과학원(Shanghai, China)의 상해 생물 과학 연구소의 세포 자원 센터(Cell Resource Centre)에서 얻었다.
MTT 기반 세포 생존능 분석법에 의한 세포 독성(Immunol & J, 1983), 간단히 말하면, 10-well FBS와 항생제 혼합물이 보충된 RPMI 1640 (Gibco)이 들어있는 96-well microtiter plates에 6T-CEM 세포(1x106 cells.mL-1) 100μl를 뿌렸다.
세포를 5% CO2 배양기에서 37℃에서 가습 분위기로 성장시켰다. 24시간 후, 배지를 제거하고 각각의 샘플의 농도가 다른 혼합 배지 100㎕로 대체 하였다. blank, Zn-CSNPs, CSNPs, CS 및 ZnSO4·7H2O(100-1000μg.mL-1)를 각 웰에 3중으로 채취하고 24시간 동안 배양하였다.
배양 후, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 세척하였고, 이후 세포는 4~5시간 동안 100μl의 MTT(FBS 5mg.mL-1) 용액으로 처리하였으며, 그런 다음 MTT 용액을 분쇄하고 세포 결정의 바닥층을 100㎕의 DMSO에 용해시키고, 15분 후 플레이트 판독기(plate reader )(Bio-Tek, VT, USA)를 사용하여 570nm(Jeevithan et al., 2016)에서 포르 마잔 생성물의 광학 밀도(plate reader )(OD)를 측정하였다.
세포 생존률(Cell viability)(%) IC50은 다른 곳(Saravanakumar et al., 2015)에서 기술된 공식을 사용하여 계산하였다.
(6) 총 RNA 분리, cDNA 합성 및 qRT - PCR (Isolation of Total RNA, cDNA synthesis and qRT-PCR)
6T-CEM 세포 현탁액(6T-CEM cells suspension)(1x106 cells.mL- 1)이 대조군으로 사용된 샘플 IC50 농도를 함유하는 RPMI 1640(Gibco)를 포함하는 96-웰 마이크로타이터 플레이트(96-well microtiter plates)에 시딩되었다.
세포를 5% CO2 배양기에서 37℃에서 가습 분위기로 성장시켰고, 24시간 후, 배지를 제거하였다.
RNA 추출 키트(RNA Extraction Kit)(Takara, Shanghai)를 사용하여 총 RNA를 분리하기 위해 세포를 수확한 후 역전사 반응을 수행하여 상호 작용을 일으키는 cDNA를 합성하였다(PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA 합성 키트, Takara, Clontech, Japan).
FAS, Casp3, IL-2, IL-6와 같은 세포 사멸 조절 유전자의 발현은 FTC-3000 실시간 정량적 PCR 시스템(FTC-3000 Real-Time quantitative PCR System)(Funglyn Biotech, Inc.)에 의한 SuperReal PreMix Plus(SYBR Green, Tiangen Biotech, China)를 사용하여 측정되었다.
이 분석에서 β-actin은 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)로 사용되고, 사멸 조절 유전자(apoptosis regulatory genes)의 qRT-PCR 프라이머는 다른 곳(Jeevithan et al., 2016)에서 검색된다.
더욱이, 세포 사멸 및 형태학적인 변화가 유도된 나노 입자(NPs)는 FITC(fluorescein isothiocyanate)와 같은 균주 및 6-디아미디노-2-페닐인돌(6-diamidino-2-phenylindole)(DAIP)로 핵 염색을 사용하여 6T-CEM 세포에서 미토콘드리아 손상 및 핵 손상의 형광현미경 이미지(florescence microscopic (Olympus Culture microscope CKX53) imaging)로 측정하였다.
2. 결론(Results)
(1) 키토산 나노 입자를 포함하는 아연(Zinc containing chitosan nanoparticles)
아연(Zn)의 결핍은 다양한 인간 질병의 원인으로 주요한 문제를 유발할 수 있다(Kanter et al., 1982).
따라서, 아연(Zn) 또는 그 보충제의 적절한 섭취는 아연 결핍에 의해 조절되는 질병의 위험을 감소시킬 수 있고, 또한, 아연(Zn)의 제어 전달 시스템의 개발은 과다 복용으로 인한 부작용을 줄일 수 있다.
키토산 나노 입자(CSNPs)의 생성을 위해, 키토산과 음으로 하전된 TPP의 양전하를 띄는 아미노기 사이의 상호 작용을 시작하였고(Calvo 등, 1997), 아연(Zn)을 포함하는 키토산 나노 입자(CSNPs)의 생성을 위해 ZnSO4·7H2O(Deshpande, Dapkekar, Oak, Paknikar, & Rajwade, 2017; H. Zhang & Zhao, 2015)에 기술된 대로 TPP를 첨가하기 전에 키토산에 넣었다.
키토산 나노 입자(CSNPs)의 유체 역학 평균 입자 크기는 표면적 51.30m2/kg과 직경 113.09nm를 보였고, 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 표면적 8.039m2/kg과 직경 113.09nm를 보였다.
입자 크기 분석기 결과(particle size analyzer results)에 나타난 키토산 나노 입자(CS NPs)(PDI-0.0945) 및 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)(PDI-0.2111)에서 관찰되는 다분산 지수(polydispersity index)가 도 1a 및 도 1b에 도시되었다.
도 1a 및 도 1b를 참조하면, 표면적, 크기(<200) 및 PDI(<1)는 나노 입자(NPs)의 우수한 다중 분산성(H. Zhang & Zhao, 2015)을 나타내고 약물 운반체로서 제약 응용으로의 보다 높은 잠재력을 가능하게 한다(H. Zhang & Zhao, 2015).
(2) 형태론적 특성(Morphological characterizations)
시토산 나노 입자(CS NPs)와 아연-시토산 나노 입자(Zn-CSNPs)의 형태 학적 특성은 에너지분산형 분광분석법(Energy dispersive X-ray spectroscopy)(EDS)을 구비한 주사전자현미경(scanning electron microscope)(SEM)과 투과 전자 주사 현미경(transmission electron scanning microscope)(TEM)을 사용하여 연구되었다.
도 2a (i), 도 2a (ii)를 참조하면, SEM 이미지는 시토산 나노 입자(CSNPs)와 아연-시토산 나노 입자(Zn-CS NPs) 현미경 사진의 평균 직경(<200nm) 비교에서 구형의 나노 입자(NPs)가 아연(Zn) 및 키토산(Chitosan) 사이에 콜로이드 상호 작용을 나타냄을 보여주었다(도 2a (i), 도 2a (ii)).
도 2b (i), 도 2b (ii)를 참조하면, EM 현미경 사진은 두 나노 입자(NPs)가 다분산, 균질 및 균일한 크기 분포를 보이는 구형이고, 이는 시토산 나노 입자(CSNPs)와 아연-시토산 나노 입자(Zn-CSNPs)(도 1)의 평균 입자 크기의 PSA 결과와 유사함을 보여준다.
EDS 결과에 따르면 시토산(CS) 분자의 존재는 두 나노 입자(NPs)에 모두 존재하지만, 아연(Zn)은 아연-시토산 나노 입자(Zn-CSNPs)에만 존재하며, 이는 키토산 나노 입자를 포함하는 아연(Zn)(아연-키토산 나노 입자)(Zn-CSNPs)의 성공적인 생성을 확인할 수 있다.
(3) 구조 분석(Structural analysis)
시료(CS, ZnSO4, CSNPs, Zn-CSNPs)의 화학 구조 변화를 FT-IR 분광 광도계(FTIR) 분석을 통해 분석하였으며, 그 결과를 도 3a에 나타내었다.
도 3a를 참조하면, 고체 키토산(CS) 분말의 스펙트럼은 2868(-CH, 스트레칭, 알칸), 1649(-C=N, 스트레칭, 이민/옥심), 1584 (-NH, 벤딩, 아민), 1374(-O-H, 벤딩, 페놀), 1311 (C-N, 스트레칭, 방향족 아민), 1058(S=O, 술폭시드), 552(C-I, 스트레칭, 할로 화합물(halo compound))에서 피크(peaks)를 보임을 알 수 있다.
키토산 나노 입자(CS NPs)는 2872(-NH, 연신, 아민염), 1541(-NO, 신장, 니트로 화합물), 1405(OH, 벤딩, 카르복실산), 887 (-C=C, 벤딩, 알켄)에서 피크(peaks)를 보이고, ZnSO4·7H2O는 3232(-OH, 스트레칭, 알콜), 2244(C≡N, 스트레칭, 니트릴), 1625(C-C, 스트레칭, 공액 알켄), 1056(S=O, 스트레칭, 술폭시드), 562(C-I, 스트레칭, 할로 화합물)에서 피크(peaks)를 보임을 알 수 있다.
아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 2880(C-H, 스트레칭, 알켄), 1534(-N-O, 스트레칭, 니트로 화합물), 1379(-OH, 벤딩, 알콜), 1034(SO, 스트레칭, 술폭시드) 및 605(C-I, 스트레칭, 할로 화합물)에서 피크(peaks)를 보임을 알 수 있다.
2868에서 2872로 이동하는 -CH 알칸 결합은 수소 결합의 변형을 나타낸다.
이 변형은 이전 보고서(Rodrigues, Costa, & Grenha, 2012; H. Zhang & Zhao, 2015)와 유사한 시토산 나노 입자(CSNPs)(도 3a)의 합성을 위해 TPP와 교차 연결되어 화학 물질은 황산아연(ZnSO4)을 이동시킨다. 7H2O와 CS/TPP가 아연-시토산 나노 입자(Zn-CSNPs) 복합체(complexation)에 공존하여 시토산(Chitosan)의 아미노기와 TPP 분자와의 이온 가교 결합을 통해 아연(Zn)과 시토산 나노 입자(CSNPs)의 공동 결합이 확인되었다(Deshpande et al., 2017).
이는 철 상호 작용을 통해 음으로 하전된 CS 그룹과 상호 작용하고 금속-CS/TPP 복합체를 형성하는 폴리 인산 그룹을 음으로 전하기 때문으로 보고된다(Deshpande et al., 2017; Jiang et al., 2004; Wang, Du , & Liu, 2004).
X-선 회절 분석기 패턴은 도 3b에 도시된 시토산 나노 입자(CSNP) 및 아연-시토산 나노 입자(Zn-CSNPs)의 비정질 성질의 형성을 확인한다.
2θ 피크 범위는 시토산 나노 입자(CSNPs)와 아연-시토산 나노 입자(Zn-CSNPs) 사이에서 현저히 변화되어 더 낮은 나노 입자(NPs)의 결정화를 유도한다.
더욱이, TPP와 CS의 상호 작용은 결정성을 감소시키고 Zn을 포함한 금속의 흡수를 증가시킬 것으로 기대된다(Deshpande et al., 2017; Govindan, Nivethaa, Saravanan, Narayanan, & Stephen, 2012).
(4) 항균 분석(Antibacterial assay)
E. Coli (ATCC35150), S. aureus (ATCC13150) 및 S. enterica Typhimurium (ATCC14028)과 같은 박테리아 병원체에 대하여 미량 희석법에 따라 항균 활성 (ZnSO4.H2O, CS, CSNPs 및 Zn-CSNPs)(임상 및 실험실 표준 연구소, CLSI) 및 디스크 복제 방법을 3회 반복하여 평균 결과를 하기의 [표 1]에 나타내었다.
최소 억제 및 살균 농도(MIC & MBC)는 세균성 병원균의 노출과 표본의 농도에 따라 계산하였고, 그 결과는 하기의 [표 1]에 나타내었다.
Figure 112018028846270-pat00002
상기 [표 1]을 참조하면, E. coli의 MIC는 (2.25-9.25 ㎍.mL-1), S. aureus는 (3.37-9.25 ㎍.mL-1) 및 S. enterica Typhimurium는 (6.75-13.5 ㎍.mL- 1)의 범위였다. 전체 결과는 시험 샘플 중 Zn-CSNPs와 ZnSO4·7H2O가 다른 샘플 (CS 및 CSNPs) 보다 세 가지 병원체 모두에 영향을 미친다는 결과가 나타났다.
ZnSO4·7H2O에 대한 결과는 세균성 병원체에 효과적이고, 이전의 연구들과 일치함을 확인할 수 있다(Nanda & Raghavan, 2011; Surjawidjaja, Hidayat, & Lesmana, 2004). 이전에 보고된 바와 같이 나노 크기의 항균 물질은 박테리아 세포벽에 쉽게 침투하여 박테리아에 치명적일 수 있다(Meghana, Kabra, Chakraborty, & Padmavathy, 2015).
ZnSO4·7H2O는 항균 활성을 지니고 있으며(Surjawidjaja et al., 2004), CS를 첨가한 나노 크기 입자의 추가 개질은 병원균의 세포벽 막을 통한 성공적인 침투를 통해 잠재적인 살균 효과를 나타냈다는 것이 알려져 있다.
샘플의 MIC 농도를 노출시킨 후 CLSM 분석을 사용하여 샘플(ZnSO4·7H2O, CS, CSNPs 및 Zn-CSNPs)의 형태 학적 변화, 생존/사멸 세포에 대한 영향을 관찰하였다.
살아있는 박테리아 세포가 SYTO9와 결합하여 녹색을 나타내고 죽은 세포 나 손상된 세포가 요오드화 프로피디엄과 결합하여 적색 세포를 나타내는 것으로 알려져 있다(Kang, Pinault, Pfefferle, & Elimelech, 2007).
그 결과, 처리되지 않은 박테리아 세포는 녹색의 생존 가능한 세포 (Fig.4ai-aiii)만을 보여 주었지만 ZnSO4는 나타났다. 7H2O에 노출된 세포는 적색 형광으로 80~90%의 완전한 세포사를 나타냈다.
CS, CSNPs가 처리된 세포는 소수의 적혈구(Ci-iii 및 di-diii)가 존재하므로 입증된 세포의 감소가 적었지만 Zn-CSNPs는 S. aureus (ATCC13150) 및 E. coli 60을 완전히 사멸시켰고, S. enterica typhimurium (ei-eiii)에서 세포 사멸의 60~65%를 보였다(Wu, Deokar, Liao, Shih, & Ling, 2013).
(5) Zn- CSNPs로부터 Zn의 시험 관내 방출(In vitro release of Zn from Zn-CSNPs)
아연은 백혈병, 심혈관 질환 및 다양한 암을 포함한 다양한 만성 질환을 치료하는데 중요한 약제로 사용되지만(Shankar & Prasad, 1998), 문헌에 따르면 그 증가된 흡수는 일부 부작용 또는 다른 세포 변화를 일으킬 수 있다고 지적했다 (Leitzmann et al., 2003)
따라서, 제어 방출 시스템은 Zn 방출 수준을 유지할 수 있다. Zn의 pH 또는 시간 간격 방출은 Zn 표준이 공지된 유도 결합 플라즈마 시스템 ICP-광 방출 분광 광도계를 사용하여 정량화되었다.
도 5a를 참조하면, 결과는 아연의 방출이 중성 또는 알칼리성 pH보다 낮은 pH에서 더 높은 것으로 나타났다.
pH에서 단지 방출된 Zn의 약 35~40%는 7~7.5의 범위를 가지며 정상적인 혈액 세포 pH 또는 인간 급성 T-림프구 백혈병에서 제어 방출이 발생할 수 있음을 나타내며 과다 섭취량의 위험을 감소시키고 다른 세포 손상을 깨뜨린다.
(6) 시험관 내 항암제 연구(In vitro anticancer studies)
도 5b를 참조하면, 인간 급성 T- 림프구 백혈병 (6T-CEM)에 대한 샘플(ZnSO4·7H2O, CS, CSNPs 및 Zn-CSNPs)의 시험 관내 세포 독성을 MTT 분석에 의해 결정하였다. 그 결과, 시료의 농도가 증가함에 따라 세포 생존 능력이 현저하게 감소함을 보였다(도 5b; P <0.05).
도 5b를 참조하면, 샘플 중 Zn-CSNPs는 분말 CS, CSNPs 및 ZnSO4·7H2O보다 높은 세포 사멸을 보였다. 또한, Zn-CSNPs의 경우 250 ㎍.mL-1, ZnSO4·7H2O의 경우 562.5 ㎍.mL-1, CSNP의 경우 750 ㎍.mL-1, CS 분말의 경우에는 1000 ㎍.mL-1로 IC50을 계산하였다(도 5b).
CS가 독성이 없는 생체 적합 물질이기 때문에 암세포에서 Zn 방출은 L-아스 페르기나제가 활성화 아스파라긴 또는 pro apoptosis 유전자 발현 FAS, IL-6, IL2 및 caspase 3(Jeevithan et al., 2016)을 통해 세포 사멸을 증가시킨다.
도 5c를 참조하면, 세포 부착 분석은 6T-CEM이 투여량에 따라 샘플과의 결합/결합에 영향을 미쳤다(도 5c).
방어시스템의 기능을 작동시키기 위해, 더 작은 단백질인 사이토 카인은 타고난 방어를 개시하기 위해 한 세포에서 다른 세포로 신호 전달에 관여한다(Jeevithan et al., 2016).
도 6a, 6b 및 6e를 참조하면, 그 결과는 프로-세포 사멸 관련 유전자 인터루킨(IL-6 및 IL-2)의 상대적 mRNA 발현이 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)에서 다른 치료법보다 높게 나타남을 알 수 있다.
따라서, Zn-CSNPs가 만성 질환, 특히 혈액암에 대한 사이토 카인 경로를 통한 타고난 면역 활성화에 관여하는 것을 알 수 있다.
도 6c 내지 도 6e를 참조하면, Fas/CD95와 pro-apoptosis gene caspase 3의 mRNA 발현도 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)에서 더 높음을 알 수 있다.
따라서, 이 결과는 CSNPs로부터 Zn의 제어된 방출이 방사능의 활성화 (Weiner, 1997), fas 및 pro-apoptosis-caspase(Thornberry & Lazebnik, 1998)를 통해 6T-CEM 세포에서 세포 사멸/세포 죽음을 유발할 수 있음을 알 수 있다.
또한, 도 7을 참조하면, 형광 현미경 검사에 의한 6T-CEM 세포의 세포 및 핵 손상에 대한 시료 (ZnSO4·7H2O, CS, CSNPs 및 Zn-CSNPs)의 효과를 연구하여 본 연구 결과를 검증할 수 있다.
이 분석을 위해 처음에는 미토콘드리아와 핵 손상을 연구하기 위하여 fluorescein isothiocyanate(FITC)와 같은 6개의 diadidino-2-phenylindole (DAIP) 염색과 같은 두 가지 형광 염료로 염색한 것보다 다양한 샘플의 IC50 농도로 6T-CEM 세포를 처리했다.
결과는 미처리 세포에서 미토콘드리아 및 핵 손상이 없었지만 CS> CSNPs> ZnSO4·7H2O> Zn-CSNPs에서 손상 수준이 유의하게 증가한다는 것을 보여 주었다. (도 7). 그러나 미토콘드리아와 핵의 비율이 Zn-CSNPs와 ZnSO4·7H2O에서 더 높았다(65-70%).
이상, 본 발명의 바람직한 일 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 일 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (10)

  1. 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)를 유효 성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 직경이 10 내지 200nm인 것을 특징으로 하는 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 구형으로 형성되는 것을 특징으로 하는 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 손상된 세포벽 유도를 통해 박테리아 병원체(bacterial pathogens)를 억제하는 것을 특징으로 하는 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 인간 급성 T 림프구 백혈병(6T-CEM) 세포에서 세포 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물.
  6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 키토산 나노 입자(CSNPs)를 이온성 젤라틴 방법을 사용하여 합성하여 제조된 것을 특징으로 하는 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 키토산 나노 입자(CSNPs)는 키토산(CS) 50mg을 아세트산 0.5%에 용해시키고, 실온(25±2℃)에서 자기 교반기로 4시간 동안 교반한 다음, 나트륨 트리폴리인산염(sodium tripolyphosphate)(5mg/5ml 증류수)을 25ml의 키토산(CS) 용액에 떨어 뜨려 키토산 나노 입자(CSNPs)를 형성하고 2시간 동안 계속 교반하는 과정을 거쳐 제조된 것을 특징으로 하는 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물.
  8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 교반된 키토산 나노 입자(CSNPs)에 트리폴리 인산나트륨(sodium tripolyphosphate(TPP))를 첨가하고, 500rpm·min-1에서 15분 동안 교반한 키토산 아세트산 용액(CS-acetic acid 용액)에 ZnSO4·7H2O(1:5 비율)를 용해시키며, 14000rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 동결 건조시켜 제조된 것을 특징으로 하는 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 FT-IR 분광 광도계(FTIR) 분석을 통해 분석하는 경우 2880(C-H, 스트레칭, 알켄), 1534(-N-O, 스트레칭, 니트로 화합물), 1379(-OH, 벤딩, 알콜), 1034(SO, 스트레칭, 술폭시드) 및 605(C-I, 스트레칭, 할로 화합물)에서 피크(peaks)를 보이는 것을 특징으로 하는 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 아연-키토산 나노 입자(Zn-CSNPs)는 S. aureus (ATCC13150) 및 E. coli 60을 완전히 사멸시키고, S. enterica typhimurium (ei-eiii)에서 세포 사멸의 60~65%를 보이는 것을 특징으로 하는 아연-키토산 나노 입자를 포함한 급성 림프구성 백혈병 치료용 약학조성물.
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