JP6533213B2 - 抗ウイルス剤 - Google Patents

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Description

本発明は、シアノアクリレートポリマー等のポリマーで構成された粒子を有効成分とする抗ウイルス剤に関する。
主としてヒトの医薬に応用すべく、薬物のデリバリーシステム（ＤＤＳ）や徐放化による薬物の効果向上を目的に、薬剤の微粒子化の研究が進んでおり、例えばシアノアクリレートポリマー粒子に薬剤を抱合させたＤＤＳが公知である（特許文献１、２及び非特許文献１）。本願発明者らも、現在までに、粒径のばらつきが少ないシアノアクリレートポリマー粒子の製造方法、抗菌剤抱合粒子、及びプラスミド抱合粒子を開示している（特許文献３〜５）。従来のポリマー粒子合成法では、シアノアクリレートのアニオン重合反応の開始及び安定化の目的で、重合反応系内に糖類やポリソルベートを共存させる。これらの過去の研究は、薬物のDDSと徐放化が目的であった。
その後、本願発明者は、シアノアクリレートポリマー粒子そのものにグラム陽性細菌に対する抗菌活性があることを見出した（特許文献６）。さらに、アミノ酸を抱合したシアノアクリレートポリマー粒子が抗がん活性を有するほか、グラム染色性を問わず各種の細菌に対し抗菌力を発揮できることを見出した（特許文献７〜９）。ナノサイズのポリマー粒子は、細菌表面に特異的に接着し、細菌を溶菌に導く。シアノアクリレートナノ粒子は、抗生物質とは全く異なる作用機序で抗菌活性を発揮し、MRSAやVRE等の多剤耐性菌に対しても有効である。
一方、ナノサイズのポリマー粒子のウイルスに対する効果は知られていない。
特表平１１−５０３１４８号公報 特表２００２−５０４５２６号公報 特開２００８−１２７５３８号公報 国際公開第２００８／１２６８４６号公報 特開２００８−２０８０７０号公報 国際公開第２００９／０８４４９４号公報 国際公開第２０１０／１０１１７８号公報 国際公開第２０１２／１３３６４８号公報 国際公開第２０１３／１０８８７１号公報
Christine Vauthier et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 55, 519-548 (2003)
本発明の目的は、新規な抗ウイルス手段を提供することにある。
本願発明者は、鋭意研究の結果、一定の化学構造を有するポリマー粒子がウイルス粒子表面に接着して正常なウイルス粒子構造を破壊することにより抗ウイルス作用を発揮できることを見出し、本願発明を完成した。
すなわち、本発明は、グリシン、アラニン、アスパラギン酸及びデキストランからなる群より選択される少なくとも１種を含み、かつ、抗ウイルス活性成分を含まない、平均粒径1000nm未満のn-ブチル-2-シアノアクリレートポリマーの粒子を有効成分として含有する、抗ウイルス剤を提供する。また、本発明は、上記粒子の有効量を、植物体、植物の種子、土壌、鉢土、苗箱、農業機具、又は園芸器具と接触させることを含む、植物ウイルス病害の防除方法を提供する。さらに、本発明は、繊維、不織布又は樹脂にポリマー粒子を付着又は練り込ませてなる、抗ウイルス用衛生用品材料であって、前記ポリマー粒子が、グリシン、アラニン、アスパラギン酸及びデキストランからなる群より選択される少なくとも１種を含み、かつ、抗ウイルス活性成分を含まない、平均粒径1000nm未満のn-ブチル-2-シアノアクリレートポリマーの粒子である、抗ウイルス用衛生用品材料を提供する。さらに、本発明は、上記本発明の抗ウイルス用衛生用品材料を用いて製造された、抗ウイルス用の衛生用品であって、前記衛生用品は、マスク、白衣、防護服、手袋、ゴーグル、避妊用の器具、おむつ、シーツ、又は空気清浄器若しくはエアコンのフィルターである、抗ウイルス用の衛生用品を提供する。さらに、本発明は、グリシン、アラニン、アスパラギン酸及びデキストランからなる群より選択される少なくとも１種を含み、かつ、抗ウイルス活性成分を含まない、平均粒径1000nm未満のn-ブチル-2-シアノアクリレートポリマーの粒子を含む、抗ウイルス用の衛生用品であって、前記衛生用品は、ルームミスト、ハンドソープ、うがい薬、スプレー、又は洗剤である、抗ウイルス用の衛生用品を提供する。

本発明により、シアノアクリレートポリマー等のポリマー粒子を用いてウイルスを防除できる新規な抗ウイルス剤が提供された。既存の抗ウイルス薬では、各ウイルスに固有の転写因子や生活環をターゲットとした治療薬がそれぞれのウイルスに対して必要となる場合が多いが、本発明の抗ウイルス剤は、ウイルス粒子表面（特にエンベロープ）への接着性により正常なウイルス粒子構造を破壊し、ウイルス粒子の感染性を喪失させる。そのため、哺乳類、鳥類、魚類等の動物に感染する動物ウイルスのみならず、植物ウイルスを包含する様々なウイルスに対して広く抗ウイルス活性を発揮できる。本発明の抗ウイルス剤を含むマスク等の衛生用品は、インフルエンザウイルス等の飛沫感染ないしは空気感染するウイルスの感染防止に優れた効果を発揮し得る。
デキストラン含有ナノ粒子で処理したコイヘルペスウイルスCyHV-3をコイヒレ培養細胞に添加して一定時間インキュベート後、細胞内のウイルス遺伝子（ORF89遺伝子）のコピー数を調べた結果である。 グリシン含有ナノ粒子で処理したCyHV-3をコイヒレ培養細胞に添加して一定時間インキュベート後、細胞内のORF89遺伝子のコピー数を調べた結果である。 アラニン含有ナノ粒子で処理したCyHV-3をコイヒレ培養細胞に添加して一定時間インキュベート後、細胞内のORF89遺伝子のコピー数を調べた結果である。 アスパラギン酸含有ナノ粒子で処理したCyHV-3をコイヒレ培養細胞に添加して一定時間インキュベート後、細胞内のORF89遺伝子のコピー数を調べた結果である。 ナノ粒子で処理したCyHV-3を透過型電子顕微鏡で観察した画像である。スケールバーは500 nm。
本発明の抗ウイルス剤は、下記一般式(I)
[式中、Zは電子吸引基である。]
で表される構造を繰り返し単位中に有する、粒径5μm以下のポリマー粒子を有効成分として含有する。式中の波線は、一般式(I)で示される構造が結合している、ポリマー構造中の他の構造部分を示す。電子吸引基とα位に存在するカルボキシル基とを有する一般式(I)の構造は、糖タンパク質と高い親和性を示す。一方、ウイルス粒子の表面、特にエンベロープ上には、ウイルス糖タンパク質が存在する。そのため、一般式(I)の構造を有するポリマー粒子は、ウイルス粒子の表面と高い親和性を示し、ウイルス粒子表面に特異的に接着してエンベロープを破壊し、ウイルス粒子の感染性を低下ないしは喪失させるものと考えられる。
Z基の具体例としては、シアノ基、ニトロ基、カルボニル基、カルボキシ基、又はトリフルオロメチル基等を挙げることができ、中でもシアノ基が好ましい。
一般式(I)で示される構造としては、特に限定されないが、例えば下記一般式(II)で示される構造を挙げることができる。
[式中、Zは上記一般式(I)における定義に同じであり、Rは水素、ヒドロキシ基、炭素数１から１０のアルキル基、炭素数１から１０のアルコキシ基、炭素数６から１５のアリール基、炭素数６から１５のアリールオキシ基、炭素数７から１６のアラルキル基又は炭素数７から１６のアラルキルオキシ基である。R中の炭素鎖を構成する１以上の炭素原子は窒素、硫黄又は酸素で置き換わっていてもよい。]
一般式(II)の中でも、Rがヒドロキシ基又は炭素数１から１０のアルコキシ基である構造が好ましく、特に、Rがn-ブトキシ基である構造が好ましい。Zの好ましい例は上記の通りである。従って、一般式(II)の構造としては、Zがシアノ基でRがn-ブトキシ基であるものが特に好ましい。
繰り返し単位中に上記一般式(II)で表される構造を有するポリマー粒子は、例えば、下記一般式(III)
[Z及びRは上記一般式(II)における定義に同じであり、X及びYはそれぞれ独立して末端に炭素−炭素二重結合を有する原子団を表すか、又はX及びYが一緒になってメチリデン基を表す。]
で表される少なくとも１種のモノマーを、アミノ酸、アミノ酸誘導体、それらのオリゴマー及びポリマー、糖並びにポリソルベートからなる群より選択される少なくとも１種の共存下で重合させることにより製造することができる。このような構造を有するモノマーとしては、例えばアクリレート系モノマーが挙げられるが、アクリレート系モノマーは種々のものが市販されており、そのような市販品を好ましく用いることができる。また、その他のモノマーは、例えば市販のアクリレート系モノマーから化学合成分野における周知の常法を用いて容易に調製することができる。
一般式(III)で表されるモノマーとしては、Rがヒドロキシ基又は炭素数１から１０のアルコキシ基であるモノマー、すなわち、電子吸引基Zで置換されたアクリレート系モノマーが好ましい。また、Z基としては、特にシアノ基が好ましい。すなわち、上記モノマーとしては、シアノアクリレート系モノマーが特に好ましい。シアノアクリレート系モノマーの好ましい例としては、メチル−２−シアノアクリレート、エチル−２−シアノアクリレート、ｎ−プロピル−２−シアノアクリレート、ｉ−プロピル−２−シアノアクリレート、ｎ−ブチル−２−シアノアクリレート、i-ブチル-2-シアノアクリレート、n-ペンチル-2-シアノアクリレート、ｎ−ヘキシル-2-シアノアクリレート、ｎ−ヘプチル-2-シアノアクリレート、n-オクチル-2-シアノアクリレート等を挙げることができる。これらの中でも特に、外科領域において傷口の縫合のための接着剤として用いられている、下記式で表されるn-ブチル-2-シアノアクリレート(nBCA)を好ましく用いることができる。
上記構造を有するモノマーは、アニオン重合により重合することができる。アニオン重合では、重合開始及び重合安定化のために、糖及びポリソルベートの他、アミノ酸、アミノ酸誘導体、それらのオリゴマー及びポリマー（以下、これらを総称して「アミノ酸系分子」ということがある）を用いることができる。これらの重合開始・安定剤は、いずれか１種のみを使用してもよいし、２種以上を組み合わせて使用してもよい。すなわち、本発明で用いるポリマー粒子は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、それらのオリゴマー及びポリマー、糖並びにポリソルベートからなる群より選択される少なくとも１種を含有する粒子であり得る。特に限定されないが、好ましく用いられる重合開始・安定剤は、アミノ酸、アミノ酸誘導体、それらのオリゴマー及び糖からなる群より選択される少なくとも１種、あるいはアミノ酸及び糖からなる群より選択される少なくとも１種であり得る。
糖及び／又はポリソルベートを重合開始・安定剤として用いるポリマー粒子製造法は、特許文献３、特許文献４（抗菌剤抱合粒子）、特許文献５（プラスミド抱合粒子）等に記載され公知である。アミノ酸系分子を重合開始・安定剤として用いるポリマー粒子製造法は、特許文献８、９（アミノ酸系分子の単独使用）等に記載され公知である。また、特許文献７には、アミノ酸と糖類・ポリソルベートを併用する製造法が記載されている。
本発明において、「アミノ酸」とは、分子内にアミノ基とカルボキシ基とを持つ化合物をいい、一般的なアミノ酸の定義の通り、アミノ基の水素が分子内の他の部分と置換して二級アミンとなった環状化合物であるイミノ酸も包含する。本発明で使用できるアミノ酸の代表的な例としては、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されず、β−、γ−及びδ−アミノ酸系分子も包含される。具体例を挙げると、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、シスチン又はシステイン、グルタミン、アスパラギン、プロリン、メチオニン、β−アラニン、γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ；神経伝達物質）、カルニチン、γ−アミノレブリン酸、γ−アミノ吉草酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
「アミノ酸誘導体」とは、上記定義によるアミノ酸においていずれかの基が修飾又は置換された構造を有する化合物をいう。生物体成分として天然に存在するアミノ酸誘導体は、通常、本発明で好ましく使用することができる。使用可能なアミノ酸誘導体の具体例を挙げると、クレアチン（アルギニン誘導体で1-メチルグアニジノ酢酸）、オルニチン（アルギニン誘導体で尿素サイクル産物）、サイロキシン（芳香族アミノ酸類であるトリヨウドサイロニン；Ｔ４）、デスモシン（角質エラスチンやコラーゲンの構成成分；3分子のアリシンの側鎖と1分子のリシンの側鎖が結合した構造）、ヒドロキシプロリン及びヒドロキシリジン（ゼラチンやコラーゲン構成成分）、ホスホセリン（セリンとリン酸のエステル；カゼイン構成成分）、テアニン（茶成分、グルタミン酸誘導体）、カイニン酸（海人草の虫下し成分）、トリコロミン酸（シメジの成分）やサルコシン（卵黄・ハム・豆類成分；Nメチルグリシン）等が挙げられるが、これらに限定されない。
アミノ酸の「オリゴマー」とは、１０個以下のアミノ酸残基がペプチド結合により結合したオリゴペプチドをいい、アミノ酸の「ポリマー」とは、１１個以上のアミノ酸残基がペプチド結合により結合したポリペプチドをいう。いずれも、アミノ酸だけではなくアミノ酸誘導体を残基として含んでいてよい。ポリペプチドの残基数の上限は特に限定されないが、例えば５００残基以下であり得る。ポリペプチドとしては、１１〜１００残基、１１〜５０残基、１１〜３０残基、１１〜２０残基、あるいは１１〜１５残基のものが好ましく用いられ得る。
オリゴペプチドはポリペプチドよりも好ましく用いられ得る。中でも、２〜７残基、２〜５残基、あるいは２又は３残基のオリゴペプチドがより好ましく用いられ得る。
上記した特許文献８〜９に記載されている通り、天然のタンパク質を構成する２０種のα−アミノ酸（すなわち、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、イソロイシン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、シスチン又はシステイン、グルタミン、アスパラギン、プロリン、メチオニン）のいずれでも、糖類やポリソルベートを使用しない条件でナノサイズ（1000nm未満）のシアノアクリレートポリマー粒子を合成できる。中性・酸性・塩基性アミノ酸のいずれでも、そして直鎖・芳香族・イミノ・含硫黄構造のいずれでも、糖類もポリソルベートも使用せずに粒径が揃ったナノサイズのポリマー粒子を製造できることが示されている。従って、２０種のα−アミノ酸のみならず、上記したその他のアミノ酸及びアミノ酸誘導体もナノ粒子合成に使用することができるし、また、オリゴペプチドやポリペプチドも分子内にアミノ酸構造を有するので、やはりポリマー粒子合成に使用することができる。
「糖」には、水酸基を有する単糖類（例えばグルコース、マンノース、リボース及びフルクトース等）、水酸基を有する二糖類（例えばマルトース、トレハロース、ラクトース及びスクロース等）及び水酸基を有する多糖類（例えばデキストランやマンナン等）が包含される。これらの糖は、環状、鎖状のいずれの形態であってもよく、また、環状の場合、ピラノース型やフラノース型等のいずれであってもよい。また、糖には種々の異性体が存在するがそれらのいずれでもよい。上記した糖のうち、グルコース及びデキストランが安価に入手できコスト面で有利である。デキストランとしては、平均分子量５万程度以上の重合度であるデキストランが好ましい。デキストランの分子量の上限は特にないが、通常、分子量50万程度以下である。
「ポリソルベート」には、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（商品名 Tween 20）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（商品名 Tween 80）等の各種のTween系界面活性剤が包含される。これらのうち、Tween 20（商品名）が安価に入手できコスト面で有利である。
アニオン重合工程では、適当な溶媒中に少なくとも１種の上記した重合開始・安定剤を溶解させた後、撹拌下にて少なくとも１種のモノマーを加え、適宜撹拌を続けて重合反応を進行させればよい。モノマーは、１種類のみ用いてもよいし、２種類以上を用いてもよい。
重合開始・安定剤として糖及び／又はポリソルベートを使用する場合、反応開始時の重合反応液中の糖及び／又はポリソルベートの濃度（複数種類用いる場合はその合計濃度）は、特に限定されないが、通常、0.5％〜10％程度、好ましくは0.75％〜7.5％程度である。なお、糖の濃度はw/v％、ポリソルベートの濃度はv/v％を意味し、例えば糖を単独で用いる場合には、上記した濃度範囲はそれぞれ「0.5w/v％〜10w/v％」、「0.75w/v％〜7.5w/v％」を意味する。また、糖を5w/v％、ポリソルベートを1v/v％で併せて用いる場合には、これらの合計濃度を6％というものとする。ただし、単糖類（例えばグルコース）のみを用いる場合には、2.5w/v％〜10w/v％程度で用いることが好ましい。
重合開始・安定剤としてアミノ酸系分子を使用する場合、反応開始時の重合反応液中のアミノ酸系分子の濃度（複数種類用いる場合はその合計濃度）は、特に限定されないが、通常0.1w/v％〜3w/v％程度である。糖及び／又はポリソルベートと併用する場合、アミノ酸系分子の使用濃度はこれより低い濃度であっても差し支えない。
重合反応の溶媒としては、水を主体とする水性溶媒（例えば水、低級アルコール水溶液など）を使用することができ、通常は水が好ましく用いられる。アニオン重合は水酸イオンにより開始されるので、反応液のpHは重合速度に影響する。反応液のpHが高い場合には、水酸イオンの濃度が高くなるので重合が速く、pHが低い場合には重合が遅くなる。通常、pH２〜４程度の酸性下で、特にアミノ酸系分子を重合開始・安定剤として用いる場合にはpH1.5〜3.0程度の酸性下で適度な重合速度が得られる。反応液を酸性にするために添加する酸は特に限定されず、無機酸及び有機酸のいずれでも使用することができる。例えば、塩酸は、反応に悪影響を与えず、反応後に揮散することから、ポリマー粒子の製造において好ましく用いることができるが、使用可能な酸はこれに限定されない。塩酸の濃度は、特に限定されないが、0.0005N〜0.5N程度の範囲で適宜選択可能である。
反応開始時の重合反応液中のモノマーの濃度（２種以上のモノマーを用いる場合はその合計濃度）は、特に限定されないが、通常、0.5v/v％〜2.0v/v％程度、好ましくは0.8v/v％〜1.2v/v％程度である。
反応温度は、特に限定されないが、室温で行なうことが簡便で好ましい。反応時間は、反応液のpH、溶媒の種類等に応じて反応速度が異なるため、これらの要素に応じて適宜選択される。特に限定されないが、通常、反応時間は１０分〜５時間程度、好ましくは３０分〜４時間程度である。得られたポリマー粒子は、通常、中性の粒子として用いられるので、反応終了後、水酸化ナトリウム水溶液等の塩基を反応液に添加して中和することが好ましい。反応終了後の反応液をフィルター濾過し、適宜滅菌水で洗浄して粒子を回収すればよい。
本発明で用いるポリマー粒子のサイズは、平均粒径が1000nm未満であることが好ましいが、上記の方法によれば、平均粒径が1000nm未満であるナノサイズのポリマー粒子を容易に製造することができる。生成した粒子は、遠心式限外ろ過等の常法により回収することができる。粒子サイズの下限は特に限定されないが、上記の重合反応で製造される粒子の粒径は通常7nm程度以上となる。好ましくは、粒子の平均粒径は20nm〜600nm、より好ましくは50nm〜550nmである。粒子のサイズは、反応液中のアクリレートモノマーの濃度やpH、反応時間を調節することによって調節することができる。また、重合開始・安定剤として糖及びポリソルベートから選択される少なくとも１種を用いる場合には、該重合開始・安定剤の濃度や種類を変えることによっても、粒子サイズを調節することができる（特許文献３、４等参照）。一般に、反応液のpHを高めた場合、反応時間を長くした場合、及び反応液の糖濃度を低くした場合には粒子サイズが大きくなり、重合開始・安定剤としてポリソルベートを用いた場合には粒子サイズが小さくなる。これらの反応条件を適宜組み合わせることで、所望のサイズの粒子を製造することができる。
ポリマー粒子の電荷（ゼータ電位）は、特に限定されないが、通常-50mV〜0mV程度である。ゼータ電位とは、粒子表面の電荷を示すもので、粒子の分散性の指標となる。粒子サイズとゼータ電位は、例えばHe・Neレーザーを用いた市販の装置（例えばMalvern Inst.UK社製のゼータサイザー等）を用いて容易に測定することができる。
アミノ酸系分子を重合開始・安定剤として用いて製造されたポリマー粒子では、アミノ酸系分子が単に粒子に付着して含有されるのみならず、アミノ酸構造中の-COO基がアクリレートのエチレン末端の炭素に結合し、共有結合により粒子に含有されていると考えられる。共有結合によりポリマー部分に結合しているアミノ酸系分子の官能基を利用すれば、ポリマー粒子を所望の材料に共有結合により固定化することができる。
なお、上記方法で得られる粒子のアミノ酸系分子の含有率は、通常約２０％〜約６５％程度である。アミノ酸系分子の含有率は、重合後にフィルター洗浄したときのフィルター通過液の吸光度を適当な波長で測定し、フィルター通過液中のアミノ酸系分子の量（すなわち粒子に結合しなかったアミノ酸系分子の量）を吸光度法により求めた後、下記の式によって算出することができる。
アミノ酸系分子含有量＝(アミノ酸系分子添加量)−(フィルター通過液中のアミノ酸系分子の量)
アミノ酸系分子含有率（％）＝アミノ酸系分子含有量÷アミノ酸系分子添加量×100
本発明の抗ウイルス剤は、エンベロープを有するウイルスに対して好ましく用いられる。エンベロープを有するウイルスの具体例としては、インフルエンザウイルス、各種ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス、コイヘルペスウイルス等）、ヒト免疫不全ウイルス、センダイウイルス等を挙げることができるが、これらに限定されない。植物ウイルスのうちでエンベロープを有するウイルスとしては、例えば、昆虫等の動物を中間宿主とするウイルスを挙げることができる。エンベロープを有する植物ウイルスの具体例としては、レタス壊死性黄変病ウイルス（Lettuce necrotic yellows virus）、ジャガイモ黄萎病ウイルス（Potato yellow dwarf virus）等のラブドウイルス科のウイルス；トマト黄化えそウイルス (Tomato spotted wilt virus)等のトスポウイルス属ウイルス等を挙げることができるが、これらに限定されない。
なお、本発明において、動物ウイルスという語には、哺乳類、鳥類、魚類、甲殻類、貝類・軟体動物、爬虫類、両生類、昆虫類等の各種の動物を宿主として感染するウイルスをいう。また、植物ウイルスという語には、植物のみを宿主として感染するウイルスのみならず、昆虫等の植物以外の動物を中間宿主とし、植物に感染するウイルスも包含される。
また、本発明において、「抗ウイルス」との語には、ウイルスの感染防止、ウイルスの増殖抑制、並びにウイルス感染症の治療及び予防が包含され、植物に対して当該用語を用いる場合には植物ウイルス病害の防除も包含される。
本発明で用いるポリマー粒子は、上述した通り、ウイルス粒子表面、特にエンベロープ上に存在するウイルス糖タンパク質と高い親和性を示す構造を有する。ポリマー粒子と接触させたウイルス粒子の電子顕微鏡観察により、ポリマー粒子がエンベロープに接着してエンベロープを破壊することが確認されている。エンベロープを有するウイルスはエンベロープを失うと感染性を失う。従って、本発明の抗ウイルス剤は、ウイルス感染防止剤として好ましく用いることができる。もっとも、本発明の抗ウイルス剤は、生体内においては、エンベロープをまとったウイルス粒子の感染性を低下ないしは喪失させることで新たな細胞への感染を阻害し、これによりウイルスの生体内での増殖を抑制できるものと考えられるため、本発明の抗ウイルス剤は、動物や魚類等の生体に投与して用いるウイルス感染症の治療又は予防剤としても有用である。上記のアニオン重合により製造されたポリマー粒子は、正常な哺乳動物細胞を障害せず、また、マウスに対しポリマー粒子50mg/bodyを経口で、又は10mg/bodyを非経口で投与しても何ら異常がなく、in vivo毒性もないことが知られている（特許文献８、９参照）。
本発明で用いるポリマー粒子は、対象とするウイルスに対する抗ウイルス活性成分を含まない。「抗ウイルス活性成分」とは、ウイルスに特有の遺伝子ないしはその転写物の機能を阻害する化学物質、又は、対象とするウイルスの宿主生物の抗ウイルス免疫機構に働きかけてウイルスの生体内増殖を抑制する物質をいう。前者の例としては、ウイルスのゲノムRNA又はDNAの合成を阻害する薬剤や、ウイルスの宿主細胞への吸着を阻害する薬剤等を挙げることができる。後者の例としては、抗ウイルスワクチン、免疫賦活物質等を挙げることができる。また、「抗ウイルス活性成分を含まない」との語には、抗ウイルス活性成分を全く含まないことのみならず、その抗ウイルス活性成分が対象とするウイルスに対して抗ウイルス作用を発揮できない程度の微量にしか該抗ウイルス活性成分を含んでいないことも包含される。「抗ウイルス作用を発揮できない程度の微量」とは、粒子単位体積当たりに含まれる粒子中の抗ウイルス活性成分量を粒子中の含有濃度と定義し、この含有濃度と同濃度の抗ウイルス活性成分を粒子に含有させず単独で対象のウイルスに作用させた場合に、該ウイルスの増殖を阻止できない量のことを意味する。本発明で用いられるポリマー粒子は、抗ウイルス薬等の抗ウイルス活性成分を全く含まない粒子であり得る。
本発明の抗ウイルス剤は、ポリマー粒子のみからなっていてもよいし、適当な溶媒中にポリマー粒子を分散させた形態であってもよい。例えば、本発明の抗ウイルス剤は、凍結乾燥した粒子の形態で、又は一般に使用される濃度よりも高い濃度で若しくは使用時の濃度でポリマー粒子を含有する粒子分散液の形態で提供され得る。医薬として用いる場合には、賦形剤や希釈剤等の公知の担体をさらに含有させて投与形態に適した剤形に調製することもできる。抗ウイルス剤は、単一種類のポリマー粒子のみを含んでいてもよいし、また２種類以上のポリマー粒子（すなわち、異なる重合開始・安定剤を含有する複数種類のポリマー粒子）を含んでいてもよい。
本発明の抗ウイルス剤を衛生用品に含ませることで、ウイルスが体内に侵入する前にポリマー粒子がウイルス粒子と接着し、ウイルスを物理的に捕捉するかないしはウイルス粒子の感染性を喪失させることができるので、ウイルス感染防止効果に優れた衛生用品を提供することができる。衛生用品の具体例としては、マスク、白衣、防護服、手袋、ゴーグル、避妊用の器具及び薬剤、おむつ、シーツ、空気清浄器やエアコンのフィルター、ルームミスト、ハンドソープ、うがい薬、スプレー、洗剤等を挙げることができるが、これらに限定されない。繊維、不織布、樹脂等の衛生用品材料に上記したポリマー粒子を付着させるか練り込む等したもので衛生用品を製造してもよいし、又は、製造後の衛生用品にポリマー粒子を付着させてもよい。液体状の衛生用品であれば、製造工程のいずれかにおいてポリマー粒子を添加、混合すればよい。例えば、本発明の抗ウイルス剤を含むマスクは、毎年冬季に流行するインフルエンザウイルス等の、飛沫感染又は空気感染するウイルスの感染防止に優れた効果を発揮し得る。
本発明の抗ウイルス剤は、ウイルス感染症の治療や予防目的でそれを必要とする対象に投与することができる。ここでいう「対象」とは、典型的には動物であり、哺乳類、鳥類、魚類、甲殻類、貝類・軟体動物、爬虫類、両生類、昆虫類等の各種の動物が包含される。ヒトに投与する場合、投与量は、特に限定されないが、ポリマー粒子をヒト成人（体重60kg程度）に対し１回当たり通常0.001g〜20g程度、例えば0.1g〜5g程度投与すればよい。他の動物に用いる場合は上記に準じた量を投与すればよい。
粒子の投与方法としては、吸入、経粘膜、塗布、皮膚散布、点眼、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、静脈内、直腸内等への非経口投与の他、経口投与が挙げられる。具体的には、例えば、生理緩衝食塩水にポリマー粒子を懸濁し、注射等により非経口投与することができ、また、カプセル剤やシロップ剤などとして経口投与することができる。全身投与の他、経皮パッチや軟膏等による局所適用も可能である。家畜、家禽や養殖魚に投与する場合は、飼料に添加して経口投与することができる。医療器具や農業園芸器具類等の消毒に用いる場合には、例えば、水やアルコール溶媒等に粒子を0.00001g〜0.1g程度、又は0.0001w/v%〜0.1w/v%程度の濃度で分散させ、これに器具類等を浸漬すればよい。植物のウイルス病害防除の目的で用いる場合、植物への施用量は、病害の発生の程度に応じて適宜選択でき、特に限定されないが、上記した程度の濃度の粒子分散液を、植物体（根、茎、葉、果実、花などの、植物個体のあらゆる部位を包含する）、土壌、鉢土、又は苗箱等に散布すればよい。粒子分散液に種子を浸漬し、種子消毒を行なうこともできる。ポリマー粒子を生体に投与又は器具類等と接触させることにより、抑制すべきウイルスと該粒子を接触させることで、ウイルス粒子の感染性を低下ないしは喪失させ、ウイルスの生体内での増殖ないしは他個体へのさらなる伝搬を防止することができる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
１．ナノ粒子の製造
特許文献８、９に記載されている方法に準じてアミノ酸又はデキストランを含有するナノサイズのポリマー粒子を製造した。具体的な手順は以下の通りである。
(1) Amino acid合成系
10 mLの0.001N HClに、100mgのアミノ酸を溶解して、その液性pHを要時1N塩酸を用いてpH=3に調整した。アミノ酸としては、グリシン、アラニン、及びアスパラギン酸を使用した。
(2) デキストラン合成系
10 mLの0.01N HClに100mgのデキストラン60Kを溶解し、その液性pHを要時1N塩酸を用いてpH=2に調整した。
(1)及び(2)の各溶液を撹拌下、100μLのnBCAを加え、3時間撹拌し重合反応を実施した。1N NaOHを滴下して反応溶液を中和後(pH7.8)、さらに30分撹拌した。Centriprep(YM-10)フィルター(MILLIPORE社)を用いて反応溶液を3500rpm/15min遠心濾過した。フィルターを通過しなかった液に蒸留水を加えて再度遠心濾過することにより、重合粒子を洗浄した。この遠心洗浄操作を合計４回行ない、アミノ酸又はデキストランを含有するナノサイズのポリマー粒子を得た。
市販のゼータサイザー（Malvern Inst.UK社製）を用いて粒子の平均粒径及びゼータ電位を測定した。測定結果を表１に示す。
２．ナノ粒子の抗ウイルス効果の検証
供試ウイルスとして、魚病ウイルスの一種であるコイヘルペスウイルスCyprinid herpesvirus 3（CyHV-3）を用いた。供試ナノ粒子として、上記で合成した４種類のナノ粒子を用いた。
(1) コイ細胞に対する毒性の確認
抗ウイルス効果の検証に先立ち、ナノ粒子のコイ細胞に対する毒性を確認するため、コイヒレ由来の細胞を3.5cmディッシュで単層になるように培養後、各種濃度（粒子濃度10mg/mLの液体を原液（１倍希釈）とし、１０倍ずつ段階希釈）のナノ粒子を添加し、細胞の変化を顕微鏡下で観察して毒性の有無を判定した。その結果、４種類の粒子いずれも、１０倍希釈（1mg/mL）の高濃度でもコイヒレ細胞に対する毒性は認められなかった。
(2) ナノ粒子の抗ウイルス効果の確認
CyHV-3の0.2％溶液をウイルス原液とし、10倍ずつ段階希釈した希釈系列を調製して抗ウイルス試験に用いた。１０倍段階希釈の各ナノ粒子液とウイルス液を混合し、4℃で1時間インキュベートした後、コイヒレ由来の単層培養細胞（106 cells/well）に添加した。25℃で24時間インキュベート後、細胞内のDNAを抽出し、ウイルス遺伝子（ORF89遺伝子）のコピー数をリアルタイムPCRにより確認した。
＜DNA抽出＞
24穴プレートの各ウエルからマイクロピペットを用いて、チップの先で細胞をこすって剥がした後、回収した細胞懸濁液を2mlのマイクロチューブに移した。Proteinase Kを0.2μl添加し、軽くボルテックス後、55℃で2時間インキュベートした。インキュベート後フェノール・クロロホルムを300μl加えて20℃で15,000rpm、5分間の遠心を行った後、マイクロピペットで上清200μlを回収した。同様の操作を3回繰り返した後、100％エタノールを500μl、3M酢酸ナトリウム20μlを加え−30℃で一晩保存した。一晩保存したサンプルを20℃で15,000rpm、1時間の遠心後、デカントで上清を廃棄した。沈殿に70％エタノール1,000μlを加え、20℃で15,000rpm、10分の遠心後、デカントで上清を廃棄してDNAの沈殿を乾燥させた後、Tris-EDTA buffer溶液30μlを加え、DNAを懸濁しDNAサンプルとした。
＜リアルタイムPCR＞
抽出したDNA量をQ5,000（TOMY）を用いて測定し、DNA濃度が約200ng/μlになるように蒸留水で希釈調整した。スクリーニングではPCRチューブにcDNA溶液1.0μl、TaqMan Gene Expression Master Mix（Applied Biosystems）5μl、Probe（CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG、配列番号１）0.5μl、プライマーKHV-86F（GACGCCGGAGACCTTGTG、配列番号２）及びKHV-163R（CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT、配列番号３）をそれぞれ0.9μl、精製水1.7μlを加え、Step One PlusTM リアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）にてリアルタイムPCR反応を行い、ウイルス濃度を求めた。PCR反応は、まず、熱変性95℃で10分間行った後、１サイクルの条件を、熱変性を95℃で30秒間、アニーリングおよび伸長反応を60℃で1分間とし、40サイクル行った。なお、スクリーニングは2本立てで行った。
１細胞当たりの遺伝子コピー数を調べた結果を図１〜図４に示す。横軸が粒子処理時のウイルス濃度の希釈率であり、０が原液（0.2％ウイルス溶液）である。縦軸が１細胞当たりの遺伝子コピー数を示す。４種類のナノ粒子はいずれも、ウイルス濃度が0.2×10-3％（103-fold dilution）以下であれば細胞内でのウイルス増殖を完全に（検出限界以下に）抑制できることが確認された。
３．ナノ粒子処理したウイルス粒子の電子顕微鏡観察
小フラスコ(25cm2)10本のコイヒレ由来細胞にCyHV-3(moi=1)を接種し、25℃で10日間インキュベートした後、−80℃で凍結、融解を2回繰り返した。つづいて、50mlの遠沈管に懸濁液を移して5,000rpm、4℃で30分の遠心を行った後、上清を回収した。次に、上清を40,000rpm、4℃で1時間30分、超遠心(Beckman)を行って目的の試料を沈殿させた。上清を捨てペレットを無血清のDMEM培地500μlに再懸濁後、30％、40％、50％のスクロース重層の上に注意深く重層し、40,000rpm、4℃で1時間30分の超遠心を行った。その後、50％層より上に検出されたバンドを回収し、500mlのPBSに対して一晩透析を行ったものを供試ウイルス液とした。供試ウイルス液50μlとそれぞれ4種類のナノ粒子溶液5μlを混合し、24h反応させた後、透過型電子顕微鏡H-7100(日立)を用いて観察を行った。
電子顕微鏡像を図５に示す。ナノ粒子がウイルスのエンベロープに接着し、エンベロープが破壊されてキャプシドが露出している様子も観察された。

Claims (8)

  1. グリシン、アラニン、アスパラギン酸及びデキストランからなる群より選択される少なくとも１種を含み、かつ、抗ウイルス活性成分を含まない、平均粒径1000nm未満のn-ブチル-2-シアノアクリレートポリマーの粒子を有効成分として含有する、抗ウイルス剤。
  2. 前記ウイルスがエンベロープを有するウイルスである請求項１記載の抗ウイルス剤。
  3. 前記ウイルスがインフルエンザウイルス及びヘルペスウイルスから選択される少なくとも１種である請求項２記載の抗ウイルス剤。
  4. ウイルス感染防止剤である請求項１ないし３のいずれか１項に記載の抗ウイルス剤。
  5. グリシン、アラニン、アスパラギン酸及びデキストランからなる群より選択される少なくとも１種を含み、かつ、抗ウイルス活性成分を含まない、平均粒径1000nm未満のn-ブチル-2-シアノアクリレートポリマーの粒子の有効量を、植物体、植物の種子、土壌、鉢土、苗箱、農業機具、又は園芸器具と接触させることを含む、植物ウイルス病害の防除方法。
  6. 繊維、不織布又は樹脂にポリマー粒子を付着又は練り込ませてなる、抗ウイルス用衛生用品材料であって、前記ポリマー粒子が、グリシン、アラニン、アスパラギン酸及びデキストランからなる群より選択される少なくとも１種を含み、かつ、抗ウイルス活性成分を含まない、平均粒径1000nm未満のn-ブチル-2-シアノアクリレートポリマーの粒子である、抗ウイルス用衛生用品材料。
  7. 請求項６記載の抗ウイルス用衛生用品材料を用いて製造された、抗ウイルス用の衛生用品であって、前記衛生用品は、マスク、白衣、防護服、手袋、ゴーグル、避妊用の器具、おむつ、シーツ、又は空気清浄器若しくはエアコンのフィルターである、抗ウイルス用の衛生用品。
  8. グリシン、アラニン、アスパラギン酸及びデキストランからなる群より選択される少なくとも１種を含み、かつ、抗ウイルス活性成分を含まない、平均粒径1000nm未満のn-ブチル-2-シアノアクリレートポリマーの粒子を含む、抗ウイルス用の衛生用品であって、前記衛生用品は、ルームミスト、ハンドソープ、うがい薬、スプレー、又は洗剤である、抗ウイルス用の衛生用品。
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