WO2018231093A1 - Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами - Google Patents

Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами Download PDF

Info

Publication number
WO2018231093A1
WO2018231093A1 PCT/RU2017/000426 RU2017000426W WO2018231093A1 WO 2018231093 A1 WO2018231093 A1 WO 2018231093A1 RU 2017000426 W RU2017000426 W RU 2017000426W WO 2018231093 A1 WO2018231093 A1 WO 2018231093A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
combinatorial
derivatives
oligopeptides
antiviral properties
oligopeptide
Prior art date
Application number
PCT/RU2017/000426
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Борис Славинович ФАРБЕР
Софья Борисовна ФАРБЕР
Артур Викторович МАРТЫНОВ
Original Assignee
Борис Славинович ФАРБЕР
Софья Борисовна ФАРБЕР
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Борис Славинович ФАРБЕР, Софья Борисовна ФАРБЕР filed Critical Борис Славинович ФАРБЕР
Priority to US16/771,467 priority Critical patent/US11339502B2/en
Priority to EA202090756A priority patent/EA202090756A1/ru
Priority to PCT/RU2017/000426 priority patent/WO2018231093A1/ru
Publication of WO2018231093A1 publication Critical patent/WO2018231093A1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/03—Peptides having up to 20 amino acids in an undefined or only partially defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals

Definitions

  • the invention relates to organic and bioorganic combinatorial chemistry, namely, to new combinatorial libraries of derivatives of oligopeptides and supramolecular structures based on them, which, when used without separation into individual components, possess powerful antiviral properties.
  • organic and bioorganic combinatorial chemistry namely, to new combinatorial libraries of derivatives of oligopeptides and supramolecular structures based on them, which, when used without separation into individual components, possess powerful antiviral properties.
  • Viral diseases account for more than 90% of all registered infectious diseases. But there are very few antiviral agents introduced into production. Such substances often have toxic properties, a small spectrum of action, an addictive effect quickly appears to them. Thus, the development of antiviral agents that would not have toxic properties, were effective in the treatment of a wide range of viral infections, is an urgent task of modern medicine. At the moment, very few substances are known that would be effective at all stages of a viral infection. In addition to interferons and their inducers, there are no known substances that would simultaneously combine the therapeutic and antiviral properties of relatively widespread viral diseases - HIV / AIDS, herpes, influenza, but others. Remantadine is the most famous treatment for influenza.
  • This substance which blocks only the stage of penetration of the virus into the cell and the early stage of specific reproduction, does not affect the pathogenesis of the disease. Long-term use of this drug is impossible, because it has neurotropic effects and can cause hallucinations, impair brain function due to inhibition of impulse conduction along the nerve fiber.
  • leukocyte a-interferon is known. This protein is synthesized in activated human white blood cells. It has the ability to cause resistance to influenza in epithelial cells of the nasopharynx. But its healing properties are very insignificant. It is ineffective on the 2nd-6th day of the flu and is a preventive measure. Recombinant interferons are expensive and often lead to allergic reactions. In addition, with the development of the disease, the effectiveness of interferon therapy decreases, and the resistance of the virus to interferon increases.
  • the closest prototype of the substance to be patented is modified proteins and their use for the control of viral infections [']. These are proteins treated with various anhydrides and acylating agents: albumin, lactoferrin, transferrin, lactalbumin. The authors also patented the mechanism of action of these proteins - inhibition of viral adhesion. These proteins should have a molecular weight of more than 60,000 with little variation. A significant prophylactic antiviral effect of these proteins was shown in experiments on cell cultures. Substances showed activity against HIV viruses (human and monkey), influenza, cytomegalovirus, poliovirus, Selmiki forest virus, Sendai virus, parainfluenza, Coxsackie virus. The authors showed that acylated proteins are non-toxic and can protect animals against infection with viruses.
  • the prototype has several drawbacks: it is a purely prophylactic agent (such proteins did not have a therapeutic effect on cells that are already infected with the virus) and does not have therapeutic properties in infected animals. Due to the fact that the prototype is a high molecular weight protein, it can be used only for parenteral use, the drug is an individual high molecular weight compound, not oligopeptides and is not a dynamic self-organizing supramolecular system and, accordingly, viruses will quickly adapt to the drug.
  • Also known patent application [2] which describes modified peptides with antiviral properties and their method of preparation, characterized in that as the main active substance acts mixture (ensemble) oligopeptides - protein hydrolysis products with modified on the opposite charges of the molecules, and to obtain them first partial hydrolysis of protein-containing raw materials is carried out, and then the process of chemical modification of the amount of oligopeptides obtained is carried out with the charge of their molecules being replaced with the opposite and used as antivirus Wow funds composition from the obtained oligopeptides.
  • This sum of modified oligopeptides can inhibit the activity of the ⁇ -importin heterodymr of the cell and inhibit the replication of viruses whose replication cycle depends on the functions of the nucleus.
  • An ensemble of modified oligopeptides based on a dynamic self-organizing system is more effective in the treatment of viral infections such as influenza, herpes, viruses of animal diseases at all stages of development infectious process when other drugs are ineffective.
  • the tool has a wide spectrum of action, is slightly toxic and available for industrial production, it is effective at all stages of the replication cycle of viruses dependent on the cell nucleus.
  • the disadvantages of the analogue include the impossibility of standardizing the series of the drug, validation of analysis methods, the inconsistency of the composition and pharmacological effects and the instability of the pharmacological effect due to the short half-life in the animal body.
  • the basis of the invention is the task of synthesizing combinatorial derivatives of oligopeptides with antiviral properties and with a new mechanism of action, the use of which will significantly increase the effectiveness of treatment and reduce the treatment time for viral diseases such as influenza, herpes virus infections.
  • the problem is solved by synthesizing combinatorial derivatives of oligopeptides with antiviral properties, characterized in that the combinatorial derivatives of oligopeptides, in the structure of which the amino group residues of lysines, histidines, arginines are accessible for modification, as well as the alcohol residues of threonine and serine available for modification, are simultaneously combinatorially modified by at least two different covalent modifiers and subsequently obtained combinatorial mixture as a whole without purification and without highlighting each a flax derivative is used as an antiviral agent in various pharmaceutical compositions.
  • the molar ratio of the components of the combinatorial reaction can be calculated according to the formulas:
  • n the number of substitutional groups in the oligopeptide
  • t number of moles of the original oligopeptide and the number of different molecules of its combinatorial derivatives after synthesis;
  • k the number of moles of each of the two modifiers in the combinatorial synthesis reaction to obtain the maximum number of different derivatives.
  • the following combinations can be used as covalent modifiers of the oligopeptide structure in combinatorial synthesis: at least two dicarboxylic acid anhydrides, at least two tricarboxylic acid anhydrides, at least one tricarboxylic acid anhydride and one dicarboxylic acid anhydride, at least two halogen derivatives can be used for alkylation ; combinatorial modification is carried out by simultaneous alkylation with at least one halogen derivative and acylation with one dicarboxylic or tricarboxylic acid anhydride; combinatorial modification is carried out by simultaneous alkylation with a halogen derivative and acylation with dicarboxylic or tricarboxylic acid anhydride.
  • oligopeptides can be used classical nuclear localization signal (cNLS), consisting of one or two clusters of positively charged amino acid residues: KK / RXK / R or K / RK / R-Xio- i2 (K / R) 3/5, where X is any amino acid.
  • cNLS classical nuclear localization signal
  • a peptide consisting of two clusters of positively charged amino acid residues: KKRKRKRKR can also be used as an oligopeptide.
  • the oligopeptides of the present invention can be produced synthetically or, if necessary, recombinantly by standard methods. Specific embodiments of the oligopeptides are described in detail in the experimental part below.
  • the oligopeptides of the invention are prepared by standard chemical synthesis methods, such as, for example, described by Merrifield (J. Am. Chem. Soc. (1963) 85: 21492154).
  • the oligopeptides of the present invention can be produced using methods for cloning and expressing recombinant DNA into a microorganism / host or cell carrying a DNA fragment, sequence nucleic acids encoding one of the above peptides.
  • the nucleic acid encoding the sequences can be prepared synthetically, or can be obtained from existing nucleic acid sequences by site-specific mutagenesis.
  • a suitable expression vector such as E. coli, Bacillus, Lactobacillus, Streptomyces, mammalian cells (such as CHO, HEK or COS1 cells), yeast (e.g., Saccharomyces, Schizophyllum ), insect cells or viral expression systems, such as baculovirus systems. Specialist,
  • nucleic acid sequences and providing means to enable their expression. It is also possible to incorporate non-naturally occurring amino acids (such as D-amino acids) into peptides through genetic engineering methods. Then, the peptide can be separated from the host cell culture. It can be achieved overall
  • Such methods may, for example, include immunoadsorption or chromatography. It is also possible to provide peptides with a label (such as a histidine tag) during synthesis, which allows for fast binding and purification, after which the label is enzymatically removed to obtain the active peptide. If the peptide cannot be encoded or
  • O is expressed, but is very similar to a peptide that can be encoded or expressed, a method can be used to prepare a peptide that is similar to a peptide, followed by one or more steps in which the aforementioned peptide is modified by chemical or enzymatic methods to preparation of the final peptide. Oligopeptides can also be obtained.
  • Oligopeptides can also be obtained by cleaving the oligopeptide from a larger peptide using proteolytic enzymes like pepsin, papain, etc.
  • Alkylation the introduction of an alkyl substituent in an organic compound
  • Typical alkylating agents are alkyl halides, alkenes, epoxy compounds, alcohols, less often aldehydes, ketones, esters, sulfides, diazoalkanes.
  • the alkylation catalysts are mineral acids, Lewis acids, and also zeolites. Alkylation is widely used in the chemical and petrochemical industries.
  • An ensemble or supramolecular ensemble is a term from supramolecular chemistry.
  • the objects of supramolecular chemistry are supramolecular ensembles built spontaneously from complementary, that is, having geometrical and chemical matching fragments, similar to spontaneous assembly of complex spatial structures in a living cell [ 3 , 4 ]. Due to the fact that in the synthesis of one oligopeptide in the presence of two modifiers, more than 1,500 different derivatives are synthesized, intermolecular ionic and hydrogen bonds are necessarily formed between their molecules. Such supramolecular structures have significantly higher biological activity than the original peptide. The experiment confirmed the efficacy of the drug in influenza, herpes, in vivo and in ovo models, as described below. We used a combinatorial mixture of oligopeptides in the form of a supramolecular ensemble without separation into individual components.
  • Atsilirovanie- administering acyl residue RCO- (acyl) of the organic compound usually by substitution of a hydrogen atom, introduction of the acetic acid residue SNzSO- called acetylation, benzoic C 6 H 5 CO benzoylation, formic NSO- - formylation.
  • acyl residue RCO- acyl
  • acetylation introduction of the acetic acid residue SNzSO- called acetylation
  • benzoic C 6 H 5 CO benzoylation formic NSO- - formylation.
  • C-acylation, ⁇ -acylation, O-acylation are isolated.
  • Acid halides and acid anhydrides are used as acylating agents.
  • Combinatorial library [lat. combinare - connect, combine; Greek biblion - book and theke - repository] - a set of a large number of all kinds of chemical compounds, proteins, genes or oligonucleotides, allowing you to quickly search for target genes or target proteins.
  • a kit consisting of millions of different chemicals, or a set of recombinant DNA molecules, obtained by incorporating various antibodies into the light and heavy chains of cDNAs, etc.
  • Combinatorial synthesis - synthesis by methods of combinatorial chemistry includes the simultaneous reaction between three or more reagents with the formation of a combinatorial synthesis product, consisting of dozens of derivatives. These derivatives are then separated chromatographically, confirm their structure and study the biological activity. Simultaneous combinatorial modification with two modifiers - if a multifunctional molecule with more than two groups available for modification is used in the combinatorial synthesis reaction and two modifying agents are introduced immediately, for example, acetic anhydride and succinic anhydride. As a result of the reaction, a mixture of acylated derivatives in different positions — acetyl-succinyl derivatives — is formed.
  • Therapeutically effective amount - for the purposes of the present description refers to the amount of the drug, that is, the combinatorial derivative of the oligopeptide according to the present invention, sufficient for the manifestation of antiviral activity, for different viruses, animal models, this amount may differ.
  • FIG. 1 HPLC of the original peptide with the amino acid sequence KKRKRKRKR (chromatographic conditions: gradient separation under buffer A conditions: 0.1 M perchloric acid / 1 M lithium perchlorate; buffer B: acetonitrile from 5% to 100%; Milichrom A-02 chromatograph, column prontosil-18)
  • FIG. 2. HPLC of a combinatorial derivative peptide with the amino acid sequence KKRKRKRKR (chromatographic conditions: gradient separation under buffer A conditions: 0.1 M perchloric acid / 1 M lithium perchlorate; buffer B: acetonitrile from 5% to 100%; Milichrom A-02 chromatograph , column prontosil-18).
  • FIG. 3. HPLC of the original peptide with the amino acid sequence KKRKSTRKR (chromatographic conditions: gradient separation under buffer A conditions: 0.1 M perchloric acid / 1 M lithium perchlorate; buffer B: acetonitrile from 5% to 100%; Milichrom A-02 chromatograph, column prontosil-18)
  • FIG. 4 HPLC of a supramolecular combinatorial derivative peptide (SKP) with the amino acid sequence KKRKSTRKR (chromatographic conditions: gradient separation under buffer A conditions: 0.1 M perchloric acid / 1 M lithium perchlorate; buffer B: acetonitrile from 5% to 100%; chromatograph Milichrom A-02, column prontosil-18).
  • SBP supramolecular combinatorial derivative peptide
  • chromatographic conditions gradient separation under buffer A conditions: 0.1 M perchloric acid / 1 M lithium perchlorate
  • buffer B acetonitrile from 5% to 100%
  • chromatograph Milichrom A-02, column prontosil-18 chromatograph
  • KR KKRKRKRKR Oligopeptide Combinatorial Mixture
  • KKRKRKRKR oligopeptide 1 Mmol of KKRKRKRKR oligopeptide is dissolved in 50 ml of phosphate buffered saline, 3 Mmol of succinic anhydride and 3 Mmol of phthalic anhydride are added, and the solution is stirred until both anhydrides are completely dissolved. The solution is poured into vials, lyophilized and used for analysis and research. The calculation of the molar ratios of two modifiers to the oligopeptide is carried out according to the formulas:
  • hl number of moles of the original oligopeptide and the number of different molecules of its combinatorial derivatives after synthesis (from the same source peptide, 1532 different derivatives are formed both in substitution and in permutation);
  • the molar ratio to obtain the maximum number of different derivatives (1532 different molecules) is 3: 3: 1 (succinic anhydride: phthalic anhydride: KKRKRKRKR oligopeptide).
  • FIG. 1 shows the result of HPLC analysis of the starting peptide KKRKRXRKR.
  • FIG. 2. shows the result of HPLC analysis of the combinatorial derivative peptide KXRKRKRKR.
  • the peptide peak is not only located in another place - in the region of a more hydrophilic region, it is still broadened, divided into 3 additional bands. This suggests that between 1532 different derivatives of the peptide there are intramolecular / supramolecular bonds of ionic and hydrogen nature, which are not able to be broken during the HPLC separation under classical gradient HPLC conditions.
  • Using thin-layer chromatography and capillary gel electrophoresis it was also not possible to separate the supramolecular derivative into separate fragments.
  • oligopeptide can be used as well as oligopeptide mixtures obtained both by the standard method using peptide synthesizers and by genetic engineering methods and using recombinant technology.
  • the antiviral activity of the derivatives was studied by the screening method on models of the H1N1 influenza virus (Inf), the reference strain of vesicular stomatitis virus (Vesic-VVS) and herpes type 1 virus (Negro. - strain L-2) in tablets on chicken fibroblast culture according to the degree of degradation (cytopathic effect, detachment from the bottom of the hole).
  • the degree of “desquamation” of the cells was determined by staining the culture with a vital dye, the concentration of which was determined spectrophotometrically with respect to a healthy monolayer and an empty well.
  • Table 1. Antiviral activity of supramolecular combinatorial derivatives of the oligopeptide KKRKRKRKR obtained in the reaction with different molar ratio of modifiers
  • the KKRKSTRKR oligopeptide is prepared using a standard peptide synthesizer technique or by genetic engineering.
  • m the number of moles of the initial oligopeptide and the number of different molecules of its combinatorial derivatives after synthesis (from the same source peptide, 1532 different derivatives are formed both in the places of substitutions and in permutations);
  • the molar ratio to obtain the maximum number of different derivatives (1532 different molecules) is 3: 3: 1 (succinic anhydride: phthalic anhydride: KKRKSTRKR oligopeptide).
  • FIG. 3 shows the result of HPLC analysis of the original peptide KKRKSTRKR.
  • FIG. 4. shows the result of HPLC analysis of the combinatorial derivative peptide KKRKSTRKR.
  • the peak of the peptide is not only located in another place - in a more hydrophilic region, it is still broadened, divided into 4 additional bands. This suggests that between 1532 different derivatives of the peptide there are intramolecular / supramolecular bonds of ionic and hydrogen nature, which are not able to be broken during the HPLC separation under classical gradient HPLC conditions.
  • oligopeptide can be used as well as oligopeptide mixtures obtained both by the standard method using peptide synthesizers and by genetic engineering methods and using recombinant technology.
  • transplantable cells of human and animal origin were used to determine the maximum tolerated concentration (MIC) in toxicological experiments and study the antiviral activity of the drug KR:
  • Influenza viruses used as test viruses H3N2
  • vesicular stomatitis Indiana strain
  • coronavirus X 343/44
  • herpes simplex virus type 1 strain L-2
  • Example 2 The study of toxicity and determination of the MIC of the drug KR on cell cultures and chicken embryos
  • Two-day cell cultures with a well-formed cell monolayer were used to determine BMD.
  • the drug KR tested on four types of the above cells in 5 repetitions.
  • at least 10 test tubes of each culture were used for the study. After removal of the growth medium from the tubes, 0.2 ml of the test solution and 0.8 ml of the supporting nutrient medium were added. Tubes with cells were incubated at 37 ° C for 7-8 days.
  • Controls were tubes with cell cultures into which the drug was not added.
  • the results were taken into account by the presence or absence of a cytopathic effect on cells when viewed under a microscope at low magnification x10.
  • the degree of cytotoxic action was determined by changing the morphology of cells (rounding and wrinkling of cells, rejection of degenerated cells from the glass) using the four-plus system from + to ++++.
  • the maximum tolerated concentration was determined by the maximum amount of a substance that did not cause a cytopathic effect on the cells. For this, in various dilutions of the drug in a dose of 0.2 ml was introduced into the cell culture.
  • the marked place was disinfected with an alcoholic solution of iodine, then the shell was punctured here and 0.1 ml of material was injected into the hole with a tuberculin syringe. To get into the allantoic cavity, the syringe needle was injected to a depth of 10-15 mm parallel to the longitudinal axis of the egg. After infection, the hole again disinfected with an iodine alcohol solution, sealed with paraffin and placed for incubation in a thermostat at a temperature of 35-37 0 C for 72 hours.
  • the embryos were placed for 18-20 hours in a refrigerator at a temperature of 4 ° C for maximum narrowing of blood vessels. After this, the eggs were placed on the tray with the blunt end up, the shell above the air bag was disinfected with an alcoholic solution of iodine and 96% ethanol, then they were broken and removed with sterile tweezers. The membrane lining the bottom of the air sac was also removed, having previously separated it from the underlying chorion-allantoic membrane. After 24 and 48 hours of incubation in a thermostat at 37 ° C, the number of living and normally developing embryos was taken into account. Calculation of LD50 and MTD was carried out according to the Kerber method.
  • KR is not toxic to cell cultures at a dose of more than 50 mg / ml. (to increase the concentration, the drug was lyophilized and then diluted to 5% concentration).
  • Table 2 The results of the study of toxicity in different cultures are presented in table 2.
  • MIC for KR-treated cell cultures is greater than 50 mg / ml
  • Aqueous solutions of KR in various doses were administered to 15 chicken embryos in the allantoic cavity in a volume of 0.2 ml 12 hours after the virus was introduced in a working dose (100 TCD 50 / 0.2 ml).
  • the minimum effective concentration of KR2 against influenza virus is 0.05 mg / ml.
  • the effectiveness of KR2 decreases and has a dose-dependent nature. This fact indicates the presence of a direct antiviral effect of the drug KR2 in relation to the H3N2 influenza virus.
  • Example 4 The study of the antiviral effect of the drug KR on cytopathic viruses (vesicular stomatitis virus, coronavirus, herpes simplex virus type 1)
  • Antiviral activity against this group of viruses was determined in a culture of the above cells.
  • the reaction was carried out in the following way: 0.2 ml of the corresponding virus in a working dose (100 TCD 50 / 0.2 ml) was added in a volume of 0.2 ml in a 2-day washed cell culture. 0.8 ml was added supporting environment.
  • the drug KR was introduced in various doses.
  • As a control the same thing was done with test viruses without the drug. Cells were incubated at 37 ° C in an incubator. The experience was taken into account on 3.5.7 days.
  • the decrease in virus titer under the influence of the test drug by 2 lg or more in comparison with the control was evaluated as a manifestation of antiviral activity.
  • the CTI of the drug is 1000.
  • KR was active against all the viruses studied, while no comparison drug showed such activity.
  • the drug is not associated with specific features of the virus or cell culture, but affects the mechanisms common to all cells.
  • Example 5 The study of the antiviral effect of KR2 in vitro on models of viruses of farm animals
  • the tests were carried out in 96-well plastic panels with transmissible pig gastroenteritis virus (TGS) strain D-52 with an initial titer of 10 4.0 TCD 50 / ml (tissue cytopathic doses) in a transplanted cell culture of pig testicles (PTP) and virus cattle diarrhea strain "Oregon" with an initial titer of 10 70 TCC50 / ML in an inoculated culture of saiga kidney cells (PS).
  • TCS transmissible pig gastroenteritis virus
  • PTP pig testicles
  • PS virus cattle diarrhea strain
  • KR2 was introduced into the cell cultures (CC) at various doses 1-1.5 hours after infection (after adsorption period). For each dilution took 8 holes. After making the compound, the cell cultures were incubated at 37 ° C for 72-144 hours until a clear manifestation of CPD (cytopathogenic effect) in the control of viruses.
  • Controls were viral infected cell cultures, inactive KK and KK, where only different concentrations of KR2 were added. Virusstatic effect was determined by the difference in titer of viruses in the experiment and control.
  • virucidal (inactivating) effect When determining the virucidal (inactivating) effect, different doses of the compound solution were mixed in equal volumes with virus-containing material and incubated in an incubator at 37 ° C for 24 hours. A virus-containing material was used as a control, to which a placebo (saline) and inactive cell cultures were added instead of a compound solution. The mixtures after contact were titrated in parallel with the control. The results were taken into account 72-144 hours after incubation at 37 ° C, after a clear manifestation of CPD in virus controls. The virucidal effect was determined by the difference in virus titers in the experiment and control and expressed in lg TCD50.
  • compound KR2 has a viral-static (inhibitory) and virucidal (inactivating) effect on TGS viruses and cattle diarrhea, and chemotherapy drugs can be created on its basis for the treatment and prevention of infectious diseases of viral etiology.
  • Example 6 The study of the antiviral activity of KR in an animal experiment (Herpes virus kerato-conjunctivitis / encephalitis in rabbits)
  • Herpetic experimental infection is of interest due to the fact that herpetic diseases are widespread and extremely variable in clinical manifestations. Models of experimental herpes in animals are finding wider application in the study of new antiviral substances.
  • herpetic encephalitis which is reproduced in guinea pigs, hamsters, rats, mice, rabbits, dogs, monkeys.
  • Herpetic keratoconjunctivitis in rabbits with an average weight of 3.5 kg was obtained by applying infectious material (herpes simplex virus type 1 strain L-2) on a scarified cornea. The animal was fixed, anesthesia of the eye was performed with dikain (instilled into the eye). Eyelids were opened, several scratches were applied to the cornea using a syringe needle. Then, virus-containing material was introduced and, closing the eyelids, rubbed it into the cornea in circular motions. Dose of the virus: 0.05 ml. 16 rabbits were used in the experiment, ten of them were injected with KR (daily from the second day of infection -14 days at a dose of 20 mg / kg, and six - placebo (0.9% sodium chloride).
  • the experimental group of rabbits was injected into the ear vein KR at a dose of 20 mg / kg body weight, and a 0.9% sodium chloride solution was administered to the control group. Every day for two weeks, this procedure was repeated once a day. In the experimental group, all animals survived, and the HSV1 antigen in the blood was not determined on days 13-14. In addition, in the experimental group, encephal manifestations disappeared by the 7th day of drug administration, while in the control 2 animals died. By the 14th day of treatment, one animal died in the experimental group, while in the control - 6.
  • the efficacy index was 83.3%, indicating a high therapeutic efficacy of KR in the model of herpetic keratoconjunctivitis / encephalitis in rabbits.
  • the rabbits in the experimental group scored in weight and in all animals there were no signs of keratoconjunctivitis.
  • the chemotherapeutic index for rabbits for KR was 1000, which indicates the promise of KR as a highly effective antiviral drug with a wide spectrum of action and low toxicity.
  • the purpose of the tests was to study the effect of the drug KR on the reproduction of vaccine virus strains by reducing the titer of the corresponding specific antibodies. It is known that many antiviral drugs, inhibiting the reproduction of live vaccine strains of viruses, inhibit the synthesis of specific antiviral antibodies. This effect is associated with the insufficient intensity of the infectious process caused by the vaccine in the bird's body and a weak immune response. It is also known that in many cases, for example, with an infectious bursal disease, the use of a live vaccine leads to the synthesis of such an excess titer of antibodies that the bursa is depleted, the bird becomes sensitive to other viruses, a decrease in weight gain and an increase in mortality are observed.
  • the use of the drug KR was supposed to show the presence of antiviral properties in several ways: reduction of the excess level (titers) of antibodies, a decrease in the case (safety), and an increase in weight gain.
  • Table 6 summarizes the changes in titers of specific antiviral antibodies in the KR-treated vaccination group, the untreated group and the unvaccinated group.
  • KR has a direct (non-immunostimulating) effect against all three viruses.
  • the greatest inhibitory effect was observed in the group with infectious bronchitis - reduction of antibody titer by 1200 units.
  • antibody titers increased from 2800 units to 3400 units, indicating an effective process of reproduction of a live vaccine in the bird.
  • the use of KR will make it possible to increase the gain of broilers by 5% and to reduce the death rate by 1%.
  • KR has a direct antiviral effect, inhibiting the reproduction of viruses of infectious bursal disease, Gumboro disease and infectious bronchitis.
  • KR allows moderate suppression of the replication of vaccine viruses, providing an adequate level of protective antibodies and preventing the depletion of immunity of birds and a corresponding decrease in weight gain and increase in mortality.
  • Example 8 The study of the effect of KR on the effectiveness of vaccination of broilers with live vaccines
  • Immunity was determined at the age of 42 days in RHCA. At the same time, the clinical condition of the bird, the percentage of conservation, growth and feed costs were taken into account.
  • the average titers of specific antibodies to the BNV virus both in the control and in the experimental groups were at the protective level.
  • a significant increase in the average titer in the experimental group 3 was established in comparison with the control by 6 times ( ⁇ 0.01).
  • the experimental groups (1,2) no significant difference in antibody titers was found in comparison with the control, however, they were at the protective level and a tendency to increase this indicator by 1.8 and 4.3 times was found.
  • Group immunity in the control was 75%, while in the experimental groups (3.4) 100%, in the 1st experimental group 87.5%.
  • the death of broilers was in the control - 9.8%, while the percentage of death decreased in the experimental groups: 2.8; 3.3 and 4 times respectively, in comparison with the control.
  • the average daily gains in the experimental groups ranged from 52-54 g, while in the control - 48 g.
  • UPCs supramolecular combinatorial derivative peptides
  • the UPC composition can be given orally or can be administered by intravascular, subcutaneous, intraperitoneal injection, in the form of an aerosol, an ophthalmic route of administration, into the bladder, topically, and so on.
  • inhalation methods are well known in the art.
  • the dose of the therapeutic composition will vary widely depending on the particular antiviral UPC administered, the nature of the disease, frequency of administration, route of administration, clearance of the agent used from the host, and the like. The initial dose may be higher with subsequent lower maintenance doses.
  • the dose can be administered once a week or once every two weeks, or divided into smaller doses and administered once or several times a day, twice a week, and so on to maintain an effective dose level. In many cases, a higher dose will be needed for oral administration than for intravenous administration.
  • the compounds of this invention may be included in a variety of compositions for therapeutic administration.
  • the compounds of the present invention can be incorporated into pharmaceutical compositions in combination with suitable pharmaceutically acceptable carriers or diluents, and can be incorporated into preparations in solid, semi-solid, liquid or gaseous forms, such as capsules, powders, granules, ointments, creams, foams, solutions, suppositories, injections, forms for inhalation use, gels, microspheres, lotions and aerosols.
  • the administration of the compounds can be carried out in various ways, including oral, buccal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradermal, transdermal, intratracheal administration and so on.
  • Antivirus UPC according to the invention can be distributed systemically after administration or can be localized using an implant or other composition that holds the active dose at the site of implantation.
  • the compounds of the present invention can be administered alone, in combination with each other, or they can be used in combination with other known compounds (eg, perforin, anti-inflammatory agents, and so on).
  • the compounds may be administered in the form of their pharmaceutically acceptable salts.
  • the following methods and excipients are given as examples only and are in no way limiting.
  • the compounds can be used alone or in combination with suitable additives for the manufacture of tablets, powders, granules or capsules, for example, with conventional additives such as lactose, mannitol, corn starch or potato starch; with binding agents such as crystalline cellulose, cellulose derivatives, gum arabic, corn starch or gelatins; with disintegrants such as corn starch, potato starch or sodium carboxymethyl cellulose; with lubricants such as talc or magnesium stearate; and, if desired, with diluents, buffering agents, moisturizing agents, preservatives and flavoring agents.
  • suitable additives for the manufacture of tablets, powders, granules or capsules, for example, with conventional additives such as lactose, mannitol, corn starch or potato starch; with binding agents such as crystalline cellulose, cellulose derivatives, gum arabic, corn starch or gelatins; with disintegrants such as corn starch, potato starch or sodium carboxymethyl cellulose
  • the compounds may be included in compositions for injection by dissolving, suspending or emulsifying them in an aqueous or non-aqueous solvent, such as vegetable or other similar oils, synthetic aliphatic acid glycerides, esters of higher aliphatic acids or propylene glycol; and, if desired, with conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers and preservatives.
  • the compounds may be used in an aerosol composition for inhalation administration.
  • the compounds of the present invention can be incorporated into suitable pressure propellants such as dichlorodifluoromethane, propane, nitrogen and the like.
  • the compounds can be incorporated into suppositories by mixing with a variety of bases, such as emulsifying bases or water-soluble bases.
  • bases such as emulsifying bases or water-soluble bases.
  • the compounds of the present invention can be administered rectally using a suppository.
  • a suppository may contain excipients, such as cocoa butter, carboax, and polyethylene glycols, which melt at body temperature but are solid at room temperature.
  • Standard dosage forms for oral or rectal administration such as syrups, elixirs and suspensions, where each unit dose, for example, a teaspoon, tablespoon, tablet or suppository, contains a predetermined amount of a composition containing one or more compounds of the present invention.
  • unit dosage forms for injection or intravenous administration may contain the compound of the present invention in the composition in the form of a solution in sterile water, normal saline, or another pharmaceutically acceptable carrier.
  • Implants for the sustained release of compositions are well known in the art. Implants are made in the form of microspheres, plates, and so on with biodegradable or non-biodegradable polymers. For example, lactic and / or glycolic acid polymers form a degradable polymer that is well tolerated by the host.
  • An implant containing the antiviral combinatorial peptides of the invention is positioned close to the site of infection so that the local concentration of the active agent is increased compared to other areas of the body.
  • standard dosage form refers to physically discrete units suitable for use as single doses for subjects of humans and animals, with each unit containing a predetermined number of compounds of the present invention, which, according to calculations, is sufficient to provide the desired effect together with a pharmaceutically acceptable diluent, carrier or excipient.
  • Descriptions of unit dosage forms of the present invention depend on the particular compound used, and the effect to be achieved, and the pharmacodynamics of the compound used in the host.
  • Pharmaceutically acceptable excipients such as excipients, adjuvants, carriers or diluents, are generally available.
  • Typical doses for systemic administration range from 0.1 pg to 1000 milligrams per kg of subject body weight per administration.
  • a typical dose may be one tablet for administration from two to six times a day, or one capsule or sustained-release tablet for administration once a day with a proportionally higher content of the active ingredient.
  • the effect of prolonged release may be due to the materials of which the capsule is made, which dissolve at different pH values, and capsules that provide slow release under the influence of osmotic pressure or any other known controlled release method.
  • dose levels may vary depending on the particular compound, the severity of the symptoms, and the subject's predisposition to side effects. Some of the specific compounds are more potent than others. Preferred doses of this compound can be readily determined by those skilled in the art in a variety of ways. A preferred method is to measure the physiological activity of the compound.
  • One of the methods of interest is the use of liposomes as a vehicle for delivery. Liposomes fuse with the cells of the target region and ensure the delivery of liposome contents into the cells. The contact of the liposomes with the cells is maintained for a time sufficient for fusion using various methods of maintaining contact, such as isolation, binding agents and the like.
  • liposomes are designed to produce an aerosol for pulmonary administration.
  • Liposomes can be made with purified proteins or peptides that mediate membrane fusion, such as Sendai virus or influenza virus and so on.
  • Lipids can be any useful combination of known liposome forming lipids, including cationic or zwitterionic lipids, such as phosphatidylcholine. The remaining lipids will usually be neutral or acidic lipids, such as cholesterol, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol and the like.
  • To obtain liposomes the method described by Kato et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 3361.
  • lipids and a composition for incorporation into liposomes containing combinatorial supramolecular antibiotics are mixed in a suitable aqueous medium, suitably in a salt medium, where the total solids content will be in the range of about PO wt.%.
  • a suitable aqueous medium suitably in a salt medium, where the total solids content will be in the range of about PO wt.%.
  • the tube is placed in a warm water bath at approximately 25-40 ° C and this cycle is repeated approximately 5-10 times.
  • the composition is then sonicated for a suitable period of time, typically approximately 1-10 seconds, and optionally further mixed with a vortex mixer.
  • the volume is increased by adding an aqueous medium, usually increasing the volume by about 1-2 times, followed by agitation and cooling.
  • the method allows to include supramolecular structures with high total molecular weight in liposomes.
  • Compositions with other active agents are mixed in a suitable aqueous medium, suitably in a salt
  • the antiviral UPCs of the invention may be included in compositions with other pharmaceutically active agents, in particular other antiviral, antimicrobial or anti-cancer agents.
  • Other agents of interest include a wide range of antiviral derivatives of mononucleotides and other RNA polymerase inhibitors known in the art.
  • Classes of antiviral agents include interferons, lamivudine, ribavirin, and so on; amantadine; remantadine, for example, zinamivir, oseltavimir, and so on; acyclovir, valaciclovir, valganciclovir; and so on.
  • antiviral agents include adefovir, vbacavir, didanosine, emtricitabine, lamivudine, stavudine, tenofovir, efavirenz, nevirapine, indinavir, lopinavir and ritonavir, nelfinavir, ritonavir, sakinavir, daclatasvir, Sovof.
  • Cytokines for example, interferon gamma, tumor necrosis factor alpha, interleukin 12, and so on, may also be included in the composition of the UPC according to the invention.
  • the present invention is further described by the following examples, which should not be construed as limiting the scope of the invention.
  • the invention relates to organic and bioorganic combinatorial chemistry, namely, to new combinatorial libraries of derivatives of oligopeptides and supramolecular structures based on them, which, when used without separation into individual components, possess powerful antiviral properties.
  • the preparations obtained in this way are completely environmentally friendly, biodegradable and fully metabolizable both in the patient’s body and in the environment, and the technologies for their preparation are completely waste-free.
  • the production of a patentable product is feasible on existing equipment of pharmaceutical enterprises and does not require the development of new unique equipment, does not require energy and is waste-free and environmentally friendly.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Изобретение относится к органической и биоорганической комбинаторной химии, а именно, к новым комбинаторным библиотекам производных олигопептидов и супрамолекулярным структурам на их основе, которые при использовании без разделения на отдельные компоненты обладают мощными противовирусными свойствами. В основу изобретения поставленная задача синтезировать комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами и с новым механизмом действия, использование которых позволит значительно увеличить эффективность лечения и сократить сроки лечения вирусных заболеваний, таких как грипп, герпесвирусные инфекции. Поставленная задача решается путем синтеза комбинаторных производных олигопептидов с противовирусными свойствами, отличающихся тем, что комбинаторные производные олигопептидов, в структуре которых доступные для модификации остатки аминогрупп лизинов, гистидинов, аргининов, а также доступные для модификации спиртовые остатки треонина и серина одновременно комбинаторно модифицированы как минимум двумя разными ковалентными модификаторами и в дальнейшем полученная комбинаторная смесь целиком без очистки и без выделения каждого отдельного производного используется как противовирусное средство в различных фармацевтических композициях. Модифицированные комплементарные защищенные олигопептиды с мощными противовирусными свойствами, на основе которых может быть получен лекарственный, ветеринарный, или косметический препарат с широким спектром активности. Средство имеет широкий спектр действия, мало токсично и доступно для промышленного производства.

Description

Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами Область техники
Изобретение относится к органической и биоорганической комбинаторной химии, а именно, к новым комбинаторным библиотекам производных олигопептидов и супрамолекулярным структурам на их основе, которые при использовании без разделения на отдельные компоненты обладают мощными противовирусными свойствами. Предшествующий уровень техники
Вирусные болезни составляют более 90% всей зарегистрированной инфекционной патологии. Но внедренных в производство противовирусных средств, очень мало. Такие вещества часто имеют токсичные свойства, небольшой спектр действия, к ним быстро появляется эффект привыкания. Таким образом, разработка противовирусных средств, которые бы не имели токсичных свойств, были эффективными в лечении широкого спектра вирусных инфекций, является актуальной задачей современной медицины. В настоящий момент известно очень мало веществ, которые были бы эффективны на всех этапах вирусной инфекции. Кроме интерферонов и их индукторов еще не известно таких веществ, которые бы одновременно объединяли лечебные и противовирусные свойства относительно широко распространенных вирусных заболеваний - ВИЧ/СПИД, герпеса, гриппа, но др. Наиболее известным средством для лечения гриппа является ремантадин. Это вещество, которое блокирует только этап проникновения вируса в клетку и раннюю стадию специфической репродукции, не действует на патогенез заболевания. Долговременное использование этого препарата невозможно, потому что он имеет нейротропные эффекты и может вызывать галлюцинации, нарушать функции мозга благодаря торможению проведению импульса по нервному волокну.
Среди других веществ, эффективных в лечении гриппа, известен лейкоцитарный а- интерферон. Этот белок синтезируется в активированных лейкоцитах человека. Он обладает способностью вызывать резистентность к гриппу у клеток эпителия носоглотки. Но его лечебные свойства очень незначительны. Он малоэффективен на 2-6-й день заболевания гриппом и является профилактическим средством. Рекомбинантные интерфероны имеют большую стоимость и часто приводят к аллергическим реакциям. Кроме того, с развитием заболевания эффективность терапии интерефероном уменьшается, а резистентность вируса к интерферону увеличивается.
Ближайшим прототипом вещества, которое патентуется, являются модифицированные белки и их использование для контроля вирусных инфекций [']. Это обработанные разными ангидридами и ацилирующими средствами белки: альбумины, лактоферрин, трансферин, лактальбумин. Авторы запатентовали также механизм действия этих белков - торможение вирусной адгезии. Эти белки должны иметь молекулярную массу больше 60000 с небольшим колебанием. Показано значительное профилактическое антивирусное действие этих белков в опытах на культурах клеток. Вещества проявили активность относительно вирусов ВИЧ (человека и мартышки), гриппа, цитомегаловируса, полиовирусу, вируса леса Селмики, вируса Сендай, парагриппа, Коксаки вируса. Авторы показали, что ацилированные белки нетоксичны и могут защищать животных против инфицирования вирусами.
Прототип имеет ряд недостатков: он является сугубо профилактическим средством (на клетки, которые уже инфицированы вирусом такие белки лечебного эффекта не оказывали) и не имеет лечебных свойств у инфицированных животных. В связи с тем, что прототип является высокомолекулярным белком, он может быть использован только для парентерального применения, препарат представляет собой индивидуальное высокомолекулярное соединение, а не олигопептиды и не представляет из себя динамической самоорганизующейся супрамолекулярной системы и, соответственно, вирусы будут быстро адаптироваться к препарату. Также известен патент [2], где описаны модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения, отличающиеся тем, что в качестве основного действующего вещества выступает смесь (ансамбль) олигопептидов - продуктов гидролиза белков с измененными на противоположный зарядами молекул, и для их получения сперва проводят частичный гидролиз белоксодержащего сырья, а затем проводят процесс химической модификации суммы полученных олигопептидов с заменой заряда их молекул на противоположный и используют в качестве антивирусного средства композицию из полученных олигопептидов. Эта сумма модифицированных олигопептидов способна тормозить активность гетеродимра β-импортина клетки и тормозить репликацию вирусов, репликационный цикл которых зависит от функций ядра. Ансамбль модифицированных олигопептидов на основе динамической самоорганизующейся системы эффективней в лечении вирусных инфекций, таких как грипп, герпес, вирусы болезней животных на всех стадиях развития инфекционного процесса, когда другие препараты неэффективны. Средство имеет широкий спектр действия, мало токсично и доступно для промышленного производства, эффективно на всех стадиях репликационного цикла зависимых от клеточного ядра вирусов. К недостаткам аналога можно отнести невозможность стандартизации серий препарата, валидации методов анализа, непостоянство состава и фармакологических эффектов и нестабильность фармакологического эффекта из-за короткого времени полужизни в организме животных. Данные недостатки устраняются путем увеличения степеней свободы самоорганизующейся системы пептидов (увеличение количества производных в смеси) путем одновременной модификации структуры пептидов сразу двумя модификаторами. Это приводит к увеличению количества производных как минимум на два порядка. Кроме того, вместо природных пептидов и ферментативного гидролиза в предлагаемом нами изобретении предлагается изначально использовать в качестве мишени сигнальные пептиды ядерной локализации, участвующие в переносе вирусного генома в ядро. Такой препарат с известной аминокислоной последовательностью, известным механизмом действия, легко стандартизуется по составу и фармакологической активности, а также методам анализа. Метод бинарной модификации олигопептидов ранее не был известен и никогда не применялся для получения самоорганизующихся комбинаторных структур.
Раскрытие изобретения
В основу изобретения поставленная задача синтезировать комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами и с новым механизмом действия, использование которых позволит значительно увеличить эффективность лечения и сократить сроки лечения вирусных заболеваний, таких как грипп, герпесвирусные инфекции.
Поставленная задача решается путем синтеза комбинаторных производных олигопептидов с противовирусными свойствами, отличающиеся тем, что комбинаторные производные олигопептидов, в структуре которых доступные для модификации остатки аминогрупп лизинов, гистидинов, аргининов, а также доступные для модификации спиртовые остатки треонина и серина одновременно комбинаторно модифицированы как минимум двумя разными ковалентными модификаторами и в дальнейшем полученная комбинаторная смесь целиком без очистки и без выделения каждого отдельного производного используется как противовирусное средство в различных фармацевтических композициях. Мольное соотношение компонентов комбинаторной реакции может быть рассчитано согласно формул:
(1) k= n x (2n - l)
(2) m= 4 x (3x2"-2 - 1)
где
п=количество доступных для замещения групп в олигопептиде;
т=количество молей исходного олигопептида и количество разных молекул его комбинаторных производных после синтеза;
к=количество молей каждого из двух модификаторов в реакции комбинаторного синтеза для получения максимального количества разных производных. В качестве ковалентных модификторов структуры олигопептидов в комбинаторном синтезе могут быть использованы такие комбинации: как минимум ангидриды двух дикарбоновых кислот, как минимум ангидриды двух трикарбоновых кислот, как минимум однин ангидрид трикарбоновой кислоты и один ангидрид дикарбоновой кислоты, для алкилирования могут быть использованы как минимум два галогенпроизводные; комбинаторную модификацию проводят путем одновременного алкилирования как минимум одним галогенпроизводным и ацилированием одним ангидридом дикарбоновой или трикарбоновой кислоты; комбинаторную модификацию проводят путем одновременного алкилирования галогенпроизводным и ацилированием ангидридом дикарбоновой или трикарбоновой кислоты. В качестве олигопептидов может быть использован классический сигнал ядерной локализации (cNLS), состоящий из одного или двух кластеров положительно заряженных аминокислотных остатков: K-K/R-X-K/R или K/R-K/R-Xio— i2(K/R)3/5, где X— любая аминокислота. Также в качестве олигопептида может быть использован пептид, состоящий из двух кластеров положительно заряженных аминокислотных остатков: KKRKRKRKR.
Олигопептиды настоящего изобретения могут быть произведены синтетически или, при необходимости, рекомбинантно стандартными способами. Конкретные варианты осуществления олигопептидов подробно описаны в экспериментальной части дальше. Предпочтительно, олигопептиды изобретения готовят стандартно известными химическими способами синтеза, такими как, например, описывает Merrifield (J. Am. Chem. Soc. (1963) 85:21492154). С другой стороны, олигопептиды настоящего изобретения могут быть произведены с помощью способов клонирования и экспрессии рекомбинантной ДНК в микроорганизм/хозяин или клетку, несущей фрагмент ДНК, последовательность нуклеиновых кислот, кодирующую один из вышеописанных пептидов. Нуклеиновая кислота, кодирующая последовательности, может быть приготовлена синтетически, или может быть получена из существующих последовательностей нуклеиновых кислот сайтспецифическим мутагенезом. Эти последовательности нуклеиновой кислоты могут
5 после этого быть клонированы в подходящем экспрессирующем векторе и преобразованы или трансфицированы в подходящую клетку хозяина, такую как Е. coli, Bacillus, Lactobacillus, Streptomyces, клетки млекопитающих (такие как СНО, НЕК или COS1 клетки), дрожжи (например, Saccharomyces, Schizophyllum), клетки насекомых или вирусные системы экспрессии, такие как системы бакуловируса. Специалист,
О квалифицированный в этой области техники, узнает способы создания последовательностей нуклеиновых кислот и обеспечения средств для обеспечения возможности их экспрессии. Также возможно включить аминокислоты неприродного происхождения (как D-аминокислоты) в пептиды через способы генной инженерии. Затем, пептид может быть отделен от культуры клеток хозяина. Это может быть достигнуто общей
5 очисткой белка и способами выделения, которые являются доступными в уровне техники.
Такие способы могут, например, включать иммуноадсорбцию или хроматографию. Также возможно обеспечить пептиды меткой (такой как гистидиновая метка) во время синтеза, который обеспечивает быстрое связывание и очистку, после которой метку ферментативно удаляют для получения активного пептида. Если пептид не может быть закодирован или
О экспрессирован, но при этом является очень похожим на пептид, который может быть закодирован или экспрессирован, то может быть применен способ для приготовления пептида, на который похож пептид, с последующей одной или более стадиями, в которых вышеупомянутый пептид модифицируют химическими или ферментативными способами для приготовления конечного пептида. Олигопептиды также могут быть получены
5 расщеплением олигопептида от большего пептида, используя протеолитические ферменты, как пепсин, папаин и т.д. Олигопептиды также могут быть получены расщеплением олигопептида от большего пептида, используя протеолитические ферменты, как пепсин, папаин и т.д. Некоторые более полные сущности способов, которые могут быть применены в получении пептидов, описаны в: W. F. Anderson, Nature 392 Supp., 30 April 1998, p. 2530;
0 Pharmaceutical Biotechnology, Ed. D. J. A. Crommelin and R. D. Sindelar, Harwood Academic Publishers, 1997, p. 5370, 167180, 123152, 820; Protein Synthesis: Methods and Protocols, Ed. R. Martin, Humana Press, 1998, p. 1442; SolidPhase Peptide Synthesis, Ed. G. B. Fields, Academic Press, 1997, p. 1780; Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford University Press, 1997, p. 189. Новые пептиды по любому из пунктов формулы изобретения могут быть быстро сделаны специалистом, квалифицированным в этом уровне техники.
Терминология
Алкилирование- введение алкильного заместителя в молекулу органического соединения. Типичными алкилирующими агентами являются алкилгалогениды, алкены, эпоксисоединения, спирты, реже альдегиды, кетоны, эфиры, сульфиды, диазоалканы. Катализаторами алкилирования являются минеральные кислоты, кислоты Льюиса, а также цеолиты. Алкилирование широко применяется в химической и нефтехимической промышленности.
Ансамбль или супрамоле улярный ансамбль - термин из супрамолекулярной химии. Объекты супрамолекулярной химии — супрамолекулярные ансамбли, строящиеся самопроизвольно из комплементарных, т. е. имеющих геометрическое и химическое соответствие фрагментов, подобно самопроизвольной сборке сложнейших пространственных структур в живой клетке [3,4]. В связи с тем, что при синтезе из одного олигопептида при наличии двух модификаторов синтезируется более 1500 разных производных, между их молекулами обязательно образуются межмолекулярные ионные и водородные связи. Таких супрамолекулярные структуры обладают значительно более высокой биологической активностью, чем исходный пептид. В эксперименте была подтвержденная эффективность препарата при гриппе, герпесе, на моделях in vivo и in ovo, что описано ниже. Нами использована комбинаторная смесь олигопептидов в виде супрамолекулярного ансамбля без разделения на отдельные компоненты.
Ацилирование- введение ацильного остатка RCO- (ацила) в состав органического соединения, как правило, путём замещения атома водорода, введение остатка уксусной кислоты СНзСО- называют ацетилированием, бензойной С6Н5СО бензоилированием, муравьиной НСО- — формилированием. В зависимости от атома, к которому присоединяется ацильный остаток, выделяют С-ацилирование, Ν-ацилирование, О- ацилирование. В качестве ацилирующих агентов используют галогенангидриды и ангидриды кислот.
Комбинаторная библиотека (combinatorial library) [лат. combinare — соединять, сочетать; греч. biblion — книга и theke — хранилище] — набор большого числа всевозможных химических соединений, белков, генов или олигонуклеотидов, позволяющий осуществлять в нем быстрый поиск целевых генов или белков-мишеней. Например, набор, состоящий из миллионов различных химических веществ, или совокупность рекомбинантных молекул ДНК, полученная встраиванием в вектор кДНК легкой и тяжелой цепей различных антител, и др.
Комбинаторный синтез- синтез методами комбинаторной химии, включает одновременную реакцию между тремя и более реагентами с образованием комбинаторного продукта синтеза, состоящего из десятков производных. Эти производные затем разделяют хроматографически, подтверждают их структуру и изучают биологическую активность. Одновременная комбинаторная модификация двумя модификаторами - если в реакции комбинаторного синтеза используют полифункциональную молекулу, имеющую более двух доступных для модификации групп и в реакцию, сразу вводят два модифицирующих агента, например, уксусный ангидрид и янтарный ангидрид. В результате реакции образуется смесь ацилированных производных в разных положениях - ацетил-сукцинил производных.
Терапевтически эффективное количество - для целей настоящего описания относится к количеству лекарства, то есть комбинаторного производного олигопептида согласно настоящему изобретению, достаточного для проявления антивирусной активности, для разных вирусов, моделей животных данное количество может отличаться. Краткое описание чертежей:
Фиг. 1.- ВЭЖХ исходного пептида с аминокислотной последовательностью KKRKRKRKR (условия хроматографирования: градиентное разделение в условиях буфер А: 0,1 М хлорная кислота/ 1 М перхлорат лития; буфер В: ацетонитрил от 5% до 100%; хроматограф Милихром А-02, колонка пронтосил-18)
Фиг. 2. - ВЭЖХ комбинаторного производного пептида с аминокислотной последовательностью KKRKRKRKR (условия хроматографирования: градиентное разделение в условиях буфер А: 0,1 М хлорная кислота/ 1 М перхлорат лития; буфер В: ацетонитрил от 5% до 100%; хроматограф Милихром А-02, колонка пронтосил-18). Фиг. 3.- ВЭЖХ исходного пептида с аминокислотной последовательностью KKRKSTRKR (условия хроматографирования: градиентное разделение в условиях буфер А: 0,1 М хлорная кислота/ 1 М перхлорат лития; буфер В: ацетонитрил от 5% до 100%; хроматограф Милихром А-02, колонка пронтосил-18)
Фиг. 4.- ВЭЖХ супрамолекулярного комбинаторного производного пептида (СКП) с аминокислотной последовательностью KKRKSTRKR (условия хроматографирования: градиентное разделение в условиях буфер А: 0,1 М хлорная кислота/ 1 М перхлорат лития; буфер В: ацетонитрил от 5% до 100%; хроматограф Милихром А-02, колонка пронтосил-18).
Лучший вариант осуществления изобретения Пример 1. Получение комбинаторной смеси олигопептида KKRKRKRKR (далее KR) Предварительно олигопептид KKRKRKRKR получают с использованием
стандартной методики на пептидном синтезаторе либо генно-инженерным путем.
В 50 мл фосфатного буферного раствора растворяют 1 Ммоль олигопептида KKRKRKRKR, добавляют 3 Ммоль янтарного ангидрида и 3 Ммоль фталевого ангидрида, перемешивают раствор до полного растворения обоих ангидридов. Раствор разливают по флаконам, лиофилизируют и используют для анализа и исследований. Расчет мольных соотношений двух модификаторов к олигопептиду проводят по формулам:
(1) k= n x (2n- l)
(2) m= 4 x (3x2"-2 - l)
где
п=количество доступных для замещения групп в олигопептиде (п=9);
гл=количество молей исходного олигопептида и количество разных молекул его комбинаторных производных после синтеза (из одного исходного пептида образуется 1532 разных производных как по местам замещений, так и по перестановкам);
к=количество молей каждого из двух модификаторов в реакции комбинаторного синтеза для получения максимального количества разных производных (к=4599) При этом, мольное соотношение для получения максимального количества разных производных (1532 разных молекул) составляет 3:3:1 (янтарный ангидрид: фталевый ангидрид: олигопептид KKRKRKRKR).
На Фиг. 1. показан результат ВЭЖХ анализа исходного пепетида KKRKRXRKR. Исходный пептид при использовании детектора в области 280 нм дает одну полосу поглощения.
На Фиг. 2. показан результат ВЭЖХ анализа комбинаторного производного пептида KXRKRKRKR. Как видно из хроматограммы, пик пептида не только располагается в другом месте - в области более гидрофильной области, он еще уширен, разделен на 3 дополнительные полосы. Это свидетельствует о том, что между 1532 разными производными пептида существуют внутримолекулярные /супрамолекулярные связи ионного и водородного характера, которые не способны быть разорванными в процессе ВЭЖХ разделения в классических условиях градиентной ВЭЖХ. При использовании тонкослойной хроматографии и капиллярного гель-электрофореза также не удалось разделить супрамолекулярное производное на отдельные фрагменты. Для модификации пептида могут быть использованы другие комбинации как минимум двух разных модификаторов: ангидридов карбоновых и поликарбоновых кислот, галогенангидридов карбоновых кислот, галогенуглеводородов. В качестве пептидов могут быть использованы как один индивидуальный олигопептид так и смеси олигопептидов, полученные как стандартным методом с применением пептидных синтезаторов, так и методами генной инжинерии и с использованием рекомбинантной технологии.
Для проверки биологической (антивирусной) активности синтезированных производных с другими соотношениями компонентов в реакции комбинаторного синтеза изучали противовирусную активность производных скрининговым методом на моделях вируса гриппа H1N1 (Inf), референтного штамма вируса везикулярного стоматита (Vesic- VVS) и вируса герпеса 1 типа (Негр. - штам Л-2) в планшетах на культуре куриных фибробластов по степени деградации (цитопатический эффект, открепление от дна лунки). Степень «слущивания» клеток определяли по окраске культуры витальным красителем, концентрацию которого определяли спектрофотометрически относительно здорового монослоя и пустой лунки. Результаты исследований in vitro приведены в таблице 1. Таблица 1. - Антивирусная активность супрамолекулярных комбинаторных производных оплигопептида KKRKRKRKR, полученных в реакции с разным мольным соотношением модификаторов
N° п/п Мольные соотношения реагентов* % цитопротекторного
антивирусного действия** m kl k2 Inf Неф Vesic
1 1532 18396*** 1 0 0 0
2 1532 9198 4 0 0 0
3 -II- 4599 9 0 0 0
4 -II- 2299 18 0 0 0
5 -II- 1149 36 0 0 0
6 -II- 575 72 0 0 0
7 -II- 287 143 0 0 0
8 -II- 143 287 0 0 0
9 -II- 72 575 0 0 0
10 -II- 36 1149 0 0 0
11 -II- 18 2299 0 0 0
12 -II- 9 4599 0 0 0
13 -II- 1 9198 0 0 0
14 -II- 0 18396*** 0 0 0
16 -II- 9198*** 9198*** 0 0 0
17 -II- 4599 4599 100 100 100
18 -II- 2299 2299 50 50 50
19 -II- 1149 1149 25 25 25
20 -II- 575 575 0 0 0
21 -II- 287 287 0 0 0
22 -II- 143 143 0 0 0
23 -II- 72 72 0 0 0
24 -II- 36 36 0 0 0
25 -II- 18 18 0 0 0
26 -II- 9 9 0 0 0 27 -II- 1 1 0 0 0
28 -II- 18396*** 0 0 0 0
29 -II- 9198 0 0 0 0
30 -II- 4599 0 0 0 0
31 -II- 2299 0 0 0 0
32 -II- 1149 0 0 0 0
33 -II- 575 0 0 0 0
34 -II- 287 0 0 0 0
35 -II- 143 0 0 0 0
36 -II- 72 0 0 0 0
37 -II- 36 0 0 0 0
38 -II- 18 0 0 0 0
39 -II- 9 0 0 0 0
40 -II- 1 0 0 0 0
41 -II- 0 18396*** 0 0 0
42 -II- 0 9198 0 0 0
43 -II- 0 4599 0 0 0
44 -II- 0 2299 0 0 0
45 -II- 0 1149 0 0 0
46 -II- 0 575 0 0 0
47 -II- 0 287 0 0 0
48 -II- 0 143 0 0 0
49 -II- 0 72 0 0 0
50 -II- 0 36 0 0 0
51 -II- 0 18 0 0 0
52 -II- 0 9 0 0 0
53 -II- 0 1 0 0 0
54 -II- 0 0 0 0 0
* m- количество молей олигопептида KKRKRKRKR в реакции комбинаторного синтеза; к1- количество молей янтарного ангидрида в реакции; к2 - количество молей фталевого ангидрида в реакции; ** % оставшегося монослоя клеток после инфицирования вирусами и замены культуры на исследуемый препарата в культуре после 48 часов инкубации в присутствии исследуемого вещества, добавленного в предварительно подобранной концентрации (ED90=0,05 мкг/мл); *** максимальное мольное соотношение, при котором замещаются все группы в 5 олигопептиде, превышение этого соотношения приводит к тому, что в реакционной среде остаются непрореагировавшие модификаторы - янтарный ангидрид и фталевый ангидрид.
Как видно из таблицы, только при рассчитанном соотношении компонентов, когда образуется максимальное количество разных производных олигопептида, образуется О биологическая активная и эффективная супрамолекулярная структура (производное 17 или KR), способная в дозе 0,05 мкг/мл полностью защищать монослой клеток (ED100) от деградирующего цитопатического действия вирусов.
5 Пример 2. Получение комбинаторной смеси олигопептида KKRKSTRKR (далее KR2)
Предварительно олигопептид KKRKSTRKR получают с использованием стандартной методики на пептидном синтезаторе либо генно-инженерным путем.
В 50 мл фосфатного буферного раствора растворяют 1 Ммоль олигопептида KKRKSTRKR, добавляют 3 Ммоль янтарного ангидрида и 3 Ммоль малеинового Э ангидрида, перемешивают раствор до полного растворения обоих ангидридов. Раствор разливают по флаконам, лиофилизируют и используют для анализа и исследований. Расчет мольных соотношений двух модификаторов к олигопептиду проводят по формулам:
(1) k= n x (2n- l)
(2) m= 4 χ (3χ2"-2 - 1)
5 где
п=количество доступных для замещения групп в олигопептиде (п=9);
т=количество молей исходного олигопептида и количество разных молекул его комбинаторных производных после синтеза (из одного исходного пептида образуется 1532 разных производных как по местам замещений, так и по перестановкам);
О к=количество молей каждого из двух модификаторов в реакции комбинаторного синтеза для получения максимального количества разных производных (к=4599) При этом, мольное соотношение для получения максимального количества разных производных (1532 разных молекул) составляет 3:3:1 (янтарный ангидрид: фталевый ангидрид: олигопептид KKRKSTRKR).
На Фиг. 3. показан результат ВЭЖХ анализа исходного пептида KKRKSTRKR. Исходный пептид при использовании детектора в области 280 нм дает одну полосу поглощения.
На Фиг. 4. показан результат ВЭЖХ анализа комбинаторного производного пептида KKRKSTRKR. Как видно из хроматограммы, пик пептида не только располагается в другом месте - в более гидрофильной области, он еще уширен, разделен на 4 дополнительные полосы. Это свидетельствует о том, что между 1532 разными производными пептида существуют внутримолекулярные /супрамолекулярные связи ионного и водородного характера, которые не способны быть разорванными в процессе ВЭЖХ разделения в классических условиях градиентной ВЭЖХ. При использовании тонкослойной хроматографии и капиллярного гель-электрофореза также не удалось разделить супрамолекулярное производное на отдельные фрагменты. Для модификации пептида могут быть использованы другие комбинации как минимум двух разных модификаторов: ангидридов карбоновых и поликарбоновых кислот, галогенангидридов карбоновых кислот, галогенуглеводородов. В качестве пептидов могут быть использованы как один индивидуальный олигопептид так и смеси олигопептидов, полученные как стандартным методом с применением пептидных синтезаторов, так и методами генной инженерии и с использованием рекомбинантной технологии.
Для определения максимально переносимой концентрации (МПК) в токсикологических опытах и изучения антивирусной активности препарата KR использованы следующие виды перевиваемых клеток человеческого и животного происхождения:
- ПТ - перевиваемые клетки почки эмбриона крупного рогатого скота;
- Тг - перевиваемые клетки трахеи эмбриона крупного рогатого скота;
- Hep -2- перевиваемые клетки рака гортани человека;
- Hela - перевиваемые клетки рака тела матки;
- Эмбрионы куриные
Клетки выращивали в среде 199 с добавлением 10% бычьей сыворотки и антибиотиков (пенициллина и стрептомицина). В качестве тест-вирусов использованы вирусы гриппа (H3N2), везикулярного стоматита (Штамм Индиана), коронавирус (X 343/44) и вирус простого герпеса 1 типа (штамм Л-2).
Исследования проводили по методикам, рекомендованным Государственным фармакологическим центром МЗ Украины.
Пример 2. Изучение токсичности и определение МПК препарата KR на культурах клеток и на куриных эмбрионах
Для определения МПК использовали двухсуточные культуры клеток с хорошо сформированным монослоем клеток. Препарат KR испытан на четырех видах перечисленных выше клеток в 5 повторениях. В каждом опыте для исследования использовали не менее 10 пробирок каждой из культур. После удаления из пробирок ростовой среды вносили 0,2 мл испытуемого раствора и по 0,8 мл поддерживающей питательной среды. Пробирки с клетками инкубировали при 37 °С в течение 7-8 дней.
Контролем служили пробирки с культурами клеток, в которые не добавляли препарат.
Учет результатов проводили по наличию или отсутствию цитопатического действия на клетки при просмотре в микроскопе при малом увеличении х10. Степень цитотоксического действия определяли по изменению морфологии клеток (округление и сморщивание клеток, отторжение от стекла дегенерированных клеток) по четырехплюсовой системе от + до ++++.
Максимально переносимую концентрацию определяли по максимальному количеству вещества, не вызывающего цитопатического действия на клетки. Для этого в различных разведениях препарата в дозе 0,2 мл вносили в культуру клеток.
Для изучения токсичности in vivo в различных дозах препарата в объеме 0,2 мл вносили в аллантоисную полость 9-10 дневных куриных эмбрионов (по 5 эмбрионов на разведение МП) по следующей методике:
брали 10-11- дневные эмбрионы, овоскопировали, наносили карандашом метку над воздушным мешком на стороне, противоположной расположению эмбриона, где меньше кровеносных сосудов. Отмеченное место обеззараживали спиртовым раствором йода, затем здесь же прокалывали скорлупу и в отверстие вводили туберкулиновым шприцем материал в объеме 0,1 мл. Для попадания в аллантоисную полость иглу шприца вводили на глубину 10-15 мм параллельно продольной оси яйца. После заражения отверстие вновь дезинфицировали спиртовым раствором йода, запечатывали парафином и помещали для инкубации в термостат при температуре 35-37 0 С на 72 часа. Перед вскрытием эмбрионы помещали на 18-20 ч в холодильник при температуре 4° С для максимального сужения кровеносных сосудов. После этого яйца помещали на лоток тупым концом вверх, скорлупу над воздушным мешком обеззараживали спиртовым раствором йода и 96% этиловым спиртом, затем разбивали и удаляли стерильным пинцетом. Также удаляли оболочку, выстилающую дно воздушного мешка, предварительно отсепарировав её от подлежащей хорион-аллантоисной оболочки. Через 24 и 48 часов инкубирования в термостате при 37 °С учитывали количество живых и нормально развивающихся эмбрионов. Расчет LD50 и МПД проводили по методу Кербера .
В результате исследований на различных культурах было установлено, что KR нетоксичен для культур клеток в дозе более 50 мг/мл. (для повышения концентрации препарат лиофилизировали и затем разводили до 5% концентрации). Результаты изучения токсичности на различных культурах представлены в таблице 2.
Таблица 2. Токсичность KR на культурах клеток
Figure imgf000017_0001
МПК для культур клеток, обработанных KR составляет более 50 мг/мл
Пример 3· Изучение антивирусного действия препарата KR2 на вирус гриппа А (НЗ
N2)
Водные растворы KR в различных дозах (десятикратные разведения) вводили 15 куриным эмбрионам в аллантоисную полость в объеме 0,2 мл через 12 часов после внесения вируса в рабочей дозе (100 ТЦД50/0,2 мл).
Каждый опыт сопровождался контролем тест-вируса в рабочей дозе. Зараженные и незараженные (контроль) эмбрионы инкубировали при 36°С в течение 48 часов. Затем производили вскрытие эмбрионов, из которых отсасывали аллантоисную жидкость. Титрование вируса в аллантоисной жидкости проводили по общепринятой методике с 1% эритроцитами 0(1) группы крови человека. Определили коэффициент защиты (КЗ). Титр вируса в опытной и контрольной группах куриных эмбрионов представлен в таблице 3.
Таблица 3. Эффективная концентрация KR2 на модели гриппозной инфекции in ovo
Figure imgf000018_0001
Как видно из таблицы 3, минимальная эффективная концентрация KR2 в отношении вируса гриппа, которая полностью тормозит синтез вируса, равна 0,05 мг/мл. При увеличении разведения препарата, эффективность KR2 падает и имеет дозозависимый характер. Данный факт свидетельствует о наличии прямого противовирусного эффекта у препарата KR2 в отношении вируса гриппа H3N2.
Пример 4. Исследование антивирусного действия препарата KR на цитопатические вирусы (вирус везикулярного стоматита, коронавирус, вирус простого герпеса 1 типа)
Противовирусную активность в отношении этой группы вирусов определяли в культуре вышеуказанных клеток. Постановку реакции осуществляли следующим способом: 0,2 мл соответствующего вируса в рабочей дозе (100 ТЦД50/0,2 мл) вносили в объеме 0,2 мл в 2-х суточную отмытую культуру клеток. Добавляли 0,8 мл поддерживающей среды. При появлении в культуре ЦПД вносили препарат KR в различных дозах. В качестве контроля выполняли то же самое с тест-вирусами без препарата. Клетки инкубировали при 37 0 С в термостате. Учет опыта производили на 3,5,7 день.
Снижение титра вируса под влиянием испытуемого препарата на 2 lg и более в сравнении с контролем оценивали, как проявление антивирусной активности.
Результаты изучения противовирусной активности препарата KR представлены в таблице 4 Таблица 4. Изучение противовирусного действия препарата KR в отношении вирусов: везикулярного стоматита, коронавируса, вируса простого герпеса 1 типа)
Figure imgf000019_0001
Как видно из таблицы 4, KR обладает антивирусной активностью и способностью подавлять репродукцию всех изученных нами вирусов в концентрации 0,05 мг/мл при МПК = 50 мкг/мл. ХТИ препарата составляет 1000. Кроме того, KR был активен в отношении всех изученных вирусов, тогда как не один препарат сравнения не проявлял подобной активности. Таким образом, препарат не связан с конкретными особенностями вируса или клеточной культуры, а влияет на общие для всех клеток механизмы.
Пример 5. Изучение антивирусного действия KR2 in vitro на моделях вирусов сельскохозяйственных животных
Испытания проводили в 96-ти луночных пластиковых панелях с вирусом трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) штамм «Д-52» с исходным титром 104,0 ТЦД50/мл (тканевых цитопатических доз) в перевиваемой культуре клеток тестикул поросенка (ПТП) и вирусом диареи крупного рогатого скота штамм «Орегон» с исходным титром 1070 ТЦЦ50/МЛ в перевиваемой культуре клеток почки сайги (ПС). При испытании вирусстатического (ингибирующего) действия культуры клеток инфицировали вирусами в дозах 100 и 10 ТЦДед/мл и инкубировали в термостате при 37° С. KR2 в различных дозах вносили в культуры клеток (КК) через 1-1,5 часов после заражения (после периода адсорбции). На каждое разведение брали по 8 лунок. После внесения соединения культуры клеток инкубировали при 37 °С в течение 72-144 часов до четкого проявления ЦПД (цитопатогенного действия) в контроле вирусов.
Контролями служили культуры клеток, инфицированные вирусом, инактные КК и КК, куда вносили только различные концентрации KR2. Вирусстатическое действие определяли по разнице титров вирусов в опыте и контроле.
При определении вирулицидного (инактивирующего) действия разные дозы раствора соединения смешивали в равных объемах с вируссодержащим материалом и инкубировали в термостате при 37 °С в течение 24 часов. Контролем служили вируссодержащий материал, к которому вместо раствора соединения добавляли плацебо (физраствор) и инактные культуры клеток. Смеси после контакта титровали параллельно с контролем. Результаты учитывали через 72-144 часа после инкубирования при 37° С, после четкого проявления ЦПД в контролях вирусов. Вирулицидное действие определяли по разнице титров вирусов в опыте и контроле и выражали в lg ТЦД50.
В результате проведенных исследований установлено, что соединение KR2 в концентрации 40 мкг\мл подавляло репродукцию вируса ТГС на 2,75 lg ТЦД50.МЛ, при заражающей дозе 100 ТЦД50/мл и в той же дозе на 3,75 lg ТЦДед/мл, при заражающей дозе 10 ТЦД50/мл. В дозе 40 мкг/мл KR2 инактивировал вирус ТГС на 2,0 lg ТЦД50/мл. Соединение KR в дозе 40 мкг\мл инактивировал вирус диареи КРСна 3,5 Ь ТЦД50/МЛ.
Таким образом, соединение KR2 обладает вирусстатическим (ингибирующем) и вирулицидным (инактивирующим) действием на вирусы ТГС и диареи КРС, на его основе возможно создание химиопрепаратов для лечения и профилактики инфекционных болезней вирусной этиологии.
Пример 6. Изучение противовирусной активности KR в эксперименте на животных (Герпесвирусный керато-конъюнктивит/энцефалит у кролей)
Особенности экспериментальной системы и уровень ее адекватности естественному заболеванию человека несомненно играют решающую роль в оценке влияния антивирусного вещества на течение инфекции. Герпетическая экспериментальная инфекция представляет собой интерес в связи с тем, что заболевания герпетической природы широко распространены и чрезвычайно вариабельны по клиническим проявлениям. Модели экспериментального герпеса на животных находят все более широкое применение в изучении новых противовирусных веществ.
Как известно, одной из клинических форм системного герпеса является герпетический энцефалит, который воспроизводится у морских свинок, хомяков, крыс, мышей, кроликов, собак, обезьян.
Герпетический кератоконъюнктивит у кроликов среднего веса 3,5 кг был получен путем нанесения инфекционного материала (вирус герпеса 1 типа, штамм Л-2) на скарифицированую роговицу. Животного фиксировали, анестезию глаза проводили дикаином (закапывали в глаз). Раздвигали веки глаза, наносили несколько царапин на роговицу при помощи иглы шприца. Затем вводили вируссодержащий материал и, смыкая веки, круговыми движениями втирали его в роговицу. Доза вируса: 0,05 мл. В опыте использовали 16 кролей, из них десятерым вводили KR (ежедневно со второго дня инфицирования -14 дней в дозе 20 мг/кг, а шестерым - плацебо (0,9 % натрия хлорида).
После заражения кролей ВПГ1 ежедневно контролировали состояние роговицы, наличие кератоконъюнктивита, энцефальных нарушений и наличие в лимфоцитах периферической крови антигенов ВПГ1 методом РИФ до и после инфицирования. До инфицирования у всех животных в лимфоцитах отсутствовало специфическое свечение, что свидетельствовало об отсутствии в периферической крови антигенов вируса герпеса 1 типа. На 3 день после инфицирования у всех животных в крови определялся антиген ВПГ1, ИФ=70%. Кроме того, у трех кролей (двух - из опытной группы до начала лечения и у одного из контрольной группы) появились энцефальные проявления - судорожный синдром, отсутствие аппетита. У всех животных развился кератоконъюнктивит. На 4 день после инфицирования опытной группе кролей ввели в ушную вену KR в дозе 20 мг/кг веса тела, а контрольной группе ввели 0,9% раствор натрия хлорида. Каждый день в течение двух недель повторяли эту процедуру один раз в день. В опытной группе все животные выжили, а антиген ВПГ1 в крови не определялся на 13-14 день. Кроме того, в опытной группе энцефальные проявления исчезли к 7 дню применения препарата, тогда как в контроле погибло 2 животных. К 14 дню лечения в опытной группе погибло одно животное, тогда как в контроле - 6. Соответственно индекс эффективности был равен 83,3 %, что свидетельствует о высокой лечебной эффективности KR на модели герпетического кератоконъюнктивита/энцефалита у кролей. Кроме того, кроли в опытной группе набрали в весе и у всех животных отсутствовали признаки кератоконъюнктивита. Химиотерапевтический индекс для кролей по препарату KR составил 1000, что свидетельствует о перспективности KR как высокоэффективного противовирусного препарата с широким спектром действия и низкой токсичностью.
Пример 7. Влияние препарата KR на бройлеров кросса Кобб-500
Целью испытаний являлось изучение влияния препарата KR на репродукцию вакцинных штаммов вирусов по редукции титра соответствующих специфических антител. Известно, что многие антивирусные препараты, подавляя репродукцию живых вакцинных штаммов вирусов приводят к угнетению синтеза специфических антивирусных антител. Этот эффект связан с недостаточной интенсивностью вызванного вакциной инфекционного процесса в организме птицы и слабым иммунным ответом. При этом известно, что во многих случаях, например, при инфекционной бурсальной болезни, применение живой вакцины приводит к индукции синтеза настолько избыточного титра антител, что истощается бурса, птица становится чувствительной к другим вирусам, наблюдается уменьшение привеса и увеличение падежа. Применение препарата KR должно было показать наличие у него антивирусных свойств по нескольким параметрам: редукции избыточного уровня (титров) антител, уменьшению падежа (сохранность), увеличение привеса.
В эксперимент брали бройлеров на 36 и 41 день по 15 животных в группу. KR выпаивали за сутки до вакцинации живыми вакцинами против ИББ, болезни Гамборо (БГ) и инфекционного бронхита (ИБ). В контроле были птицы, которым не выпаивали KR , но вакцинировали. В таблицах 5-6 приведены результаты исследований.
: Таблица 5. Привес бройлеров (на момент забоя) в опытной и контрольной группах
Figure imgf000022_0001
* - против невакцинированного контроля, который принимался за основу.
** - (Р=0,01) Как видно из таблицы 5, в опытной группе привес животных увеличился на (5,0±0,5)% против уменьшения веса в контрольной вакцинированной, но не леченной группе (-1,2±0,2)%. Также в опытной группе наблюдалось увеличение сохранности на (1,0±0,2)%.
В таблице 6 приведены изменения в титрах специфических антивирусных антител в леченной KR вакцинировной группе, вакцинированной не леченной группе и невакцинированной группе.
Таблица 6 Изменение титра антител против ИББ, БГ и ИБ в вакцинированных группах и невакцинированном контроле
Figure imgf000023_0001
Как видно из таблицы 6, KR обладает прямым (не иммуностимулирующим) действием в отношении всех трех вирусов. Наибольший ингибирующий эффект наблюдался в группе с инфекционным бронхитом - редукция титра антител на 1200 единиц. В вакцинированном, но не леченном контроле, титры антител возрастали от 2800 единиц до 3400 единиц, что свидетельствовало об эффективном процессе размножения живой вакцины в организме птицы. Таким образом, применение KR позволят в среднем на 5% увеличить привес бройлеров и на 1% уменьшить падеж.
KR обладает прямым антивирусным действием, подавляя репродукцию вирусов инфекционной бурсальной болезни, болезни Гамборо и инфекционного бронхита.
KR позволяет умеренно подавлять репликацию вакцинных вирусов, обеспечивая достаточный уровень защитных антител и предотвращая истощение иммунитета птицы и соответствующее уменьшение привеса и увеличение падежа.
Пример 8. Изучение влияния KR на эффективность вакцинации бройлеров живыми вакцинами
Влияние KR на эффективность вакцинации проводили непосредственно в птицеводческом хозяйстве при выращивании бройлеров. При патологоанатомическом изучении бройлеров наблюдали характерные изменения для колибактериоза, кокцидиоза, а также многочисленные кровоизлияния на слизистых оболочках прямого отдела кишечнику, в участке перехода железистого желудка в мышечный, цокалевих железах. Содержимое железистого желудка было окрашено в зеленый цвет. Гибель бройлеров достигала около 15 - 20%. При исследовании сывороток крови бройлеров в 38-42 суточном возрасте в реакции задержки гемаглютинацп (РЗГА) обнаруживали специфические титры антител к вирусу болезни Нью-Касла (БНК) выше протэктивных (1 :1024, 1: 2048).
Изучение влияния KR в дозе 0,03 мл/кг живого веса на эффективность вакцинации против БНК. Для этого один из птичников был принят за контроль, другие были опытными (таблица 7).
Таблица 7. Результаты изучения влияния KR на эффективность вакцинации в птицеводстве
No птичника Количество Схема применения МП jV° группы голов
(тыс.)
Контроль 4 40,0 KR не давали
Опыт 1 Из 7-суточного возраста в течение 3 суток до
8 40,0 вакцинации живыми вирусными вакцинами Опыт 2 7 40,0 За 1 сутки до вакцинации против БНК
Опыт 3 5 40,0 В течение 3 суток до вакцинации и через 7-10 суток после вакцинации против БНК
Условия досмотра, параметры микроклимата, режим освещенности, плотность посадки, режим кормления был одинаковым во всех группах согласно методических рекомендаций по выращиванию кросса РОС 308.
Напряженность иммунитета определяли в возрасте 42 суток в РЗГА. Одновременно учитывали клиническое состояние птицы, процент сохранения, приросты и затраты корма.
Результаты проведенных испытаний из определения эффективности KR при проведении вакцинации бройлеров против БНК приведены в таблице 8.
Таблица 8. Влияние KR на эффективность вакцинации против болезни Нью-Касла
Figure imgf000025_0001
Примечание: * Р<0,
Средние титры специфических антител к вирусу БНК как в контроле, так и опытных группах были на уровне протективных. Однако, при исследовании сывороток бройлеров в 42 суточном возрасте при применении KR установлено достоверное увеличение среднего титра в опытной 3 группе в сравнении с контролем в 6 раз (< 0,01). В опытных группах (1,2) не установлено достоверной разницы титров антител в сравнении с контролем, однако они были на уровне протективних и обнаружена тенденция к увеличению этого показателя в 1,8 и 4,3 разы. Групповой иммунитет в контроле составлял 75%, тогда как в опытных группах (3,4) 100%, в 1 опытной группе 87,5%. Гибель бройлеров составляла в контроле - 9,8%, тогда как процент гибели уменьшился в опытных группах : в 2,8 ; 3,3 и 4 раза соответственно в сравнении с контролем. Среднесуточные приросты в опытных группах колебались в пределах 52-54 г., тогда как в контроле - 48 г.
Таким образом, можно сделать вывод, что оптимальной схемой использования KR для бройлеров в регионах со сложной эпизоотической ситуацией с БНК является применение препарата в дозе 0,03 мл/кг живого веса на протяжении 3 суток до вакцинации и через 7-10 суток после вакцинации против БНК. Применение препарата по вьппеупомянутой схеме приводит к повышению среднего титра специфических антител к вирусу БНК в 6 раз и уменьшению гибели бройлеров в 4 раза. Фармацевтические композиции
Могут быть использованы различные способы введения супрамолекулярных комбинаторных производных пептидов (СКП). СКП композицию можно давать перорально или можно вводить внутрисосудистой, подкожной, внутрибрюшинной инъекцией, в форме аэрозоля, глазным способом введения, в мочевой пузырь, местно и так далее. Например, способы ингаляционного введения хорошо известны в данной области техники. Доза терапевтической композиции будет варьировать в широких пределах в зависимости от конкретного вводимого антивирусного СКП, природы заболевания, частоты введения, способа введения, клиренса используемого агента из организма хозяина и тому подобного. Начальная доза может быть более высокой с последующими более низкими поддерживающими дозами. Дозу можно вводить с частотой один раз в неделю или один раз в две недели, или делить на меньшие дозы и вводить их один или несколько раз в сутки, два раза в неделю и так далее для поддержания эффективного уровня дозы. Во многих случаях для перорального введения будет необходима более высокая доза, чем для внутривенного введения. Соединения по данному изобретению могут быть включены во множество композиций для терапевтического введения. Более конкретно, соединения по настоящему изобретению могут быть включены в фармацевтические композиции в сочетании с подходящими фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями и могут быть включены в препараты в твердой, полутвердой, жидкой или газообразной формах, таких как капсулы, порошки, гранулы, мази, кремы, пены, растворы, суппозитории, инъекции, формы для ингаляционного применения, гели, микросферы, лосьоны и аэрозоли. Как таковое, введение соединений может быть осуществлено различными способами, включая пероральное, трансбуккальное, ректальное, парентеральное, внутрибрюшинное, внутрикожное, чрескожное, внутритрахеальное введение и так далее. Антивирусные СКП по изобретению могут распределяться системно после введения или могут быть локализованы с использованием имплантата или другой композиции, удерживающей активную дозу в месте имплантации. Соединения по настоящему изобретению могут быть введены сами по себе, в комбинации друг с другом, или они могут быть использованы в комбинации с другими известными соединениями (например, перфорином, противовоспалительными агентами, и так далее). В фармацевтических лекарственных формах соединения могут быть введены в форме их фармацевтически приемлемых солей. Следующие способы и эксципиенты приведены лишь в качестве примеров и никоим образом не являются ограничивающими. Для препаратов для перорального введения соединения могут быть использованы сами по себе или в комбинации с подходящими добавками для изготовления таблеток, порошков, гранул или капсул, например, с обычными добавками, такими как лактоза, маннит, кукурузный крахмал или картофельный крахмал; со связывающими агентами, такими как кристаллическая целлюлоза, производные целлюлозы, аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатины; с разрыхлителями, такими как кукурузный крахмал, картофельный крахмал или карбоксиметилцеллюлоза натрия; со смазывающими агентами, такими как тальк или стеарат магния; и, если желательно, с разбавителями, буферными агентами, увлажняющими агентами, консервантами и корригентами. Соединения могут быть включены в композиции для инъекций путем их растворения, суспендирования или эмульгирования в водном или неводном растворителе, таком как растительные или другие подобные масла, синтетические глицериды алифатических кислот, эфиры высших алифатических кислот или пропиленгликоля; и, если желательно, с обычными добавками, такими как солюбилизаторы, изотонические агенты, суспендирующие агенты, эмульгаторы, стабилизаторы и консерванты. Соединения могут быть использованы в аэрозольной композиции для ингаляционного введения. Соединения по настоящему изобретению могут быть включены в приемлемые пропелленты под давлением, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и тому подобное. Кроме того, соединения могут быть включены в суппозитории смешиванием с множеством основ, таких как эмульгирующие основы или водорастворимые основы. Соединения по настоящему изобретению могут быть введены ректально с использованием суппозитория. Суппозиторий может содержать наполнители, такие как масло какао, карбоваксы и полиэтиленгликоли, расплавляющиеся при температуре тела, но твердые при комнатной температуре. Могут быть изготовлены стандартные лекарственные формы для перорального или ректального введения, такие как сиропы, эликсиры и суспензии, где каждая единица дозы, например, чайная ложка, столовая ложка, таблетка или суппозиторий, содержит предопределенное количество композиции, содержащей одно или более соединений по настоящему изобретению. Сходным образом, стандартные лекарственные формы для инъекции или внутривенного введения могут содержать соединение по настоящему изобретению в композиции в форме раствора в стерильной воде, нормальном физиологическом растворе или другом фармацевтически приемлемом носителе. Имплантаты для длительного высвобождения композиций хорошо известны в данной области техники. Имплантаты изготавливают в форме микросфер, пластинок и так далее с биодеградируемыми или не являющимися биодеградируемыми полимерами. Например, полимеры молочной и/или гликолевой кислот образуют деградируемый полимер, хорошо переносимый хозяином. Имплантат, содержащий противовирусные комбинаторные пептиды по изобретению, располагают близко к очагу инфекции, так чтобы локальная концентрация активного агента была повышенной по сравнению с остальными областями тела. При использовании здесь термин «стандартная лекарственная форма» относится к физически дискретным единицам, подходящим для использования в качестве однократных доз для субъектов людей и животных, при этом каждая единица содержит предопределенное количество соединений по настоящему изобретению, которого, согласно вычислениям, достаточно для оказания желаемого эффекта, совместно с фармацевтически приемлемым разбавителем, носителем или наполнителем. Описания стандартных лекарственных форм по настоящему изобретению зависят от конкретного используемого соединения, и эффекта, который должен быть достигнут, и фармакодинамики используемого соединения у хозяина. Фармацевтически приемлемые эксципиенты, такие как наполнители, адъюванты, носители или разбавители, общедоступны. Кроме того, общедоступны фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, такие как агенты для регулирования рН и буферные агенты, агенты для регулирования тоничности, стабилизаторы, смачивающие агенты и тому подобное. Типичные дозы для системного введения варьируют от 0,1 пг до 1000 миллиграмм на кг массы тела субъекта на одно введение. Типичная доза может представлять собой одну таблетку для приема от двух до шести раз в сутки или одну капсулу или таблетку с длительным высвобождением для приема один раз в сутки с пропорционально более высоким содержанием активного ингредиента. Эффект длительного высвобождения может быть обусловлен материалами, из которых изготовлена капсула, растворяющимися при различных значениях рН, капсулами, обеспечивающими медленное высвобождение под воздействием осмотического давления или любым другим известным способом контролируемого высвобождения. Специалистам в данной области техники будет ясно, что уровни доз могут варьировать в зависимости от конкретного соединения, тяжести симптомов и предрасположенности субъекта к побочным эффектам. Некоторые из конкретных соединений обладают большей активностью, чем другие. Предпочтительные дозы данного соединения могут быть легко определены специалистами в данной области техники множеством способов. Предпочтительным способом является измерение физиологической активности данного соединения. Один из интересующих способов представляет собой применение липосом в качестве наполнителя для доставки. Липосомы сливаются с клетками целевой области и обеспечивают доставку содержимого липосом внутрь клеток. Контакт липосом с клетками поддерживают в течение времени, достаточного для слияния, с использованием различных способов поддержания контакта, таких как выделение, связывающие агенты и тому подобное. В одном аспекте изобретения липосомы разработаны для получения аэрозоля для легочного введения. Липосомы могут быть изготовлены с очищенными белками или пептидами, опосредующими слияние мембран, такими как вирус Сендай или вирус гриппа и так далее. Липиды могут представлять собой любую полезную комбинацию известных липидов, образующих липосомы, включая катионные или цвиттерионные липиды, такие как фосфатидилхолин. Остальные липиды будут обычно нейтральными или кислыми липидами, такими как холестерин, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин и тому подобное. Для получения липосом может быть использован способ, описанный Kato et al.(1991) J. Biol. Chem. 266:3361. Кратко, липиды и композицию для включения в липосомы, содержащую комбинаторные супрамолекулярные антибиотики, смешивают в подходящей водной среде, подходящим образом в солевой среде, где общее содержание твердых веществ будет находиться в диапазоне приблизительно ПО масс.%. После интенсивного перемешивания в течение коротких периодов времени, приблизительно 5-60 сек, пробирку помещают в теплую водяную баню при приблизительно 25-40° С и этот цикл повторяют приблизительно 5-10 раз. Затем композицию обрабатывают ультразвуком на протяжении подходящего периода времени, обычно приблизительно 1-10 сек, и, возможно, дополнительно перемешивают на вихревой мешалке. Затем объем увеличивают добавлением водной среды, обычно увеличивая объем в приблизительно 1-2 раза, с последующим взбалтыванием и охлаждением. Способ позволяет включать в липосомы супрамолекулярные структуры с высокой суммарной молекулярной массой. Композиции с другими активными агентами
Для применения в рассматриваемых способах антивирусные СКП по изобретению могут быть включены в композиции с другими фармацевтически активными агентами, в частности другими противовирусными, антимикробными или противораковыми агентами. Другие интересующие агенты включают широкий спектр антивирусных производных мононуклеотидов и других средств-ингибиторов РНК-полимераз, известных в данной области техники. Классы антивирусных средств включают интерфероны, ламивудин, рибавирин и так далее; амантадин; ремантадин, например, зинамивир, озельтавимир и так далее; ацикловир, валацикловир, валганцикловир; и так далее. Другие группы антивирусных средств включают адефовир, вбакавир, диданозин, эмтрицитабин, ламивудин, ставудин, тенофовир, эфавиренз, невирапин, индинавир, лопинавир и ритонавир, нельфинавир, ритонавир, сакинавир, даклатасвир, совофбувир. В композицию СКП по изобретению могут также быть включены цитокины, например, интерферон гамма, фактор некроза опухоли альфа, интерлейкин 12 и так далее. Далее настоящее изобретение описано следующими примерами, которые не следует толковать как ограничивающие объем изобретения.
Промышленная применимость
Изобретение относится к органической и биоорганической комбинаторной химии, а именно, к новым комбинаторным библиотекам производных олигопептидов и супрамолекулярным структурам на их основе, которые при использовании без разделения на отдельные компоненты обладают мощными противовирусными свойствами. Полученные таким образом препараты являются полностью экологически безопасными, биодеградируемыми и полностью метаболизируемыми как в организме пациентов, так и в окружающей среде, а технологии их получения относятся к группе полностью безотходных. Производство патентуемого средства осуществимо на существующем оборудовании фармацевтических предприятий и не требует разработки нового уникального оборудования, не требует энергозатрат и является безотходным и экологически чистым. Список литературы
1 Robert Walter Jansen, Dirk Klaas Fokke Meijer, Grietje Molema, Erik Desire Alice De Clercq, Rudi Wilfried Jan Pauwels, Dominique Schols Modified proteins and their use for controlling viral infection // A61 K 3804; A61K 3816, US Patent Ns 5869457, Reg. 9.02.1999. Appl. Sep 4, 1997
2 Евразийский патент EA 025624 «Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения»
3 http://dic.academic.ru/dic.nsf/ruwiki/79240
4 Jean-Marie Lehn. Supramolecular Chemistry. Concepts and Perspectives.- Weinheim; New York; Basel; Cambridge; Tokyo: VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1995.-P. 103 (Chapter 7)
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

Claims

Формула изобретения
1. Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами, отличающиеся тем, что в структуре комбинаторных производных олигопептидов доступные для модификации остатки аминогрупп лизинов, гистидинов, аргининов, а также доступные для модификации спиртовые остатки треонина и серина при их наличии в структуре исходного олигопептида или смеси олигопептидов одновременно комбинаторно модифицированы как минимум двумя разными ковалентными модификаторами и в дальнейшем полученная комбинаторная смесь целиком без очистки и без выделения каждого отдельного производного используется как противовирусное средство в различных фармацевтических композициях.
2. Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами по п.1., отличающиеся тем, что мольное соотношение компонентов комбинаторной реакции рассчитывают согласно формул:
(1 ) k= n (2" - l)
(2) m= 4 (3χ2η"2 - 1)
где
п=количество доступных для замещения групп в олигопептиде;
т=количество молей исходного олигопептида и количество разных молекул его комбинаторных производных после синтеза;
к=количество молей каждого из двух модификаторов в реакции комбинаторного синтеза для получения максимального количества разных производных;
3. Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами по п.1., отличающиеся тем, что разные ковалентные модификаторы — это ангидриды как минимум двух дикарбоновых кислот.
4. Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами по п.1., отличающиеся тем, что разные ковалентные модификаторы — это ангидриды как минимум двух трикарбоновых кислот.
5. Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами по п.1., отличающиеся тем, что разные ковалентные модификаторы— это как минимум один ангидрид трикарбоновой кислоты и один ангидрид дикарбоновой кислоты.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
6. Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами по п.1., отличающиеся тем, что разные ковалентные модификаторы— это как минимум два галогенпроизводные.
7. Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами по п.1., отличающиеся тем, что разные ковалентные модификаторы— это как минимум одно галогенпроизводное и один ангидрид дикарбоновой или трикарбоновой кислоты.
8. Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами по п.1., отличающиеся тем, что в качестве исходных олигопептидов используют классический сигнал ядерной локализации (cNLS), состоящий из одного или двух кластеров положительно заряженных аминокислотных остатков: K-K/R-X-K/R или K/R-K/R-Xio— i2(K/R)3/5, где X— любая аминокислота.
9. Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами по п.1., отличающиеся тем, что в качестве исходного олигопептида используют пептид, состоящий из двух кластеров положительно заряженных аминокислотных остатков: KKRKRKRKR.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2017/000426 2017-06-16 2017-06-16 Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами WO2018231093A1 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US16/771,467 US11339502B2 (en) 2017-06-16 2017-06-16 Combinatorial derivatives of oligopeptides having antiviral properties
EA202090756A EA202090756A1 (ru) 2017-06-16 2017-06-16 Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами
PCT/RU2017/000426 WO2018231093A1 (ru) 2017-06-16 2017-06-16 Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2017/000426 WO2018231093A1 (ru) 2017-06-16 2017-06-16 Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018231093A1 true WO2018231093A1 (ru) 2018-12-20

Family

ID=64660425

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2017/000426 WO2018231093A1 (ru) 2017-06-16 2017-06-16 Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами

Country Status (3)

Country Link
US (1) US11339502B2 (ru)
EA (1) EA202090756A1 (ru)
WO (1) WO2018231093A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3922347A1 (en) * 2020-06-10 2021-12-15 Boris Slavinovich Farber Supramolecular systems based on dynamic self-organizing nanostructures with antiviral properties

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006056227A1 (en) * 2004-11-27 2006-06-01 Eberhard-Karls- Universität Tübingen Universitätsklinikum Conjugates comprising the active agent and flanking or branched-chain peptides
WO2012070975A1 (ru) * 2010-11-22 2012-05-31 Farber Boris Slavinovich Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006056227A1 (en) * 2004-11-27 2006-06-01 Eberhard-Karls- Universität Tübingen Universitätsklinikum Conjugates comprising the active agent and flanking or branched-chain peptides
WO2012070975A1 (ru) * 2010-11-22 2012-05-31 Farber Boris Slavinovich Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Signal yadernoi lokalizatsii", VIKIPEDIYA, 24 April 2017 (2017-04-24), pages 1 - 3 *
BECKER R.R. ET AL.: "Protein modification by reaction with n-carboxyamino protein modification by acid anhydrides", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 204, 1 October 1953 (1953-10-01), pages 745 - 752, XP055558603 *
OEVERMANN A. ET AL.: "The antiviral activity of naturally occurring proteins and their peptide fragments after chemical modification", ANTIVIRAL RESEARCH, vol. 59, no. 1, 2003, pages 23 - 33, XP002722735 *
SONIAT M. ET AL.: "Nuclear localization signals for four distinct karyopherin-beta nuclear import systems", BIOCHEM J., vol. 468, no. 3, 15 June 2015 (2015-06-15), pages 353 - 362, XP055558609 *
ZHIWU SUN ET AL.: "Intranasal Administration of Maleic Anhydride-Modified Human Serum Albumin for Pre-Exposure Prophylaxis of Respiratory Syncytial Virus Infection", VIRUSES, vol. 7, no. 2, February 2015 (2015-02-01), pages 798 - 816, XP055558614 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3922347A1 (en) * 2020-06-10 2021-12-15 Boris Slavinovich Farber Supramolecular systems based on dynamic self-organizing nanostructures with antiviral properties

Also Published As

Publication number Publication date
US20210071318A1 (en) 2021-03-11
EA202090756A1 (ru) 2020-06-15
US11339502B2 (en) 2022-05-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4536918B2 (ja) 免疫調整機能を有するγ−グルタミルとβ−アスパルチル化合物および免疫調節剤
JP2001518065A (ja) ウイルス複製の阻害
US7115562B2 (en) Peptides and their use to ameliorate cell death
US11859019B2 (en) Bicyclic peptidyl inhibitor of tumor necrosis factor-alpha
JPH07507770A (ja) Ｎ−（ホスホノアセチル）−ｌ−アスパラギン酸組成物，および広域抗ウイルス剤としてのその使用方法
EA025624B1 (ru) Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения
US11339502B2 (en) Combinatorial derivatives of oligopeptides having antiviral properties
JP5583017B2 (ja) インフルエンザウイルス感染症の予防ないし治療剤
JP2023519382A (ja) 腫瘍学及びウイルス学におけるハロゲン化キサンテンの新規の使用
ES2322332T3 (es) Composiciones para estimular la regeneracion del sistema nervioso y reparacion mediante la regulacion de la sintesis de poliamidas y arginasa 1.
RU2620070C2 (ru) Модифицированные пептиды и их применение для лечения аутоиммунных заболеваний
ES2575534T3 (es) Remedio
WO2020112565A1 (en) Antagonists of mitofusion 1 and beta ii pkc association for treating heart failure
EP3922347A1 (en) Supramolecular systems based on dynamic self-organizing nanostructures with antiviral properties
ES2292244T3 (es) Empleo de la lisozima c modificada para preparar composiciones medicinales para tratar ciertas enfermedades graves.
EA041469B1 (ru) Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами
WO2018038168A1 (ja) ヘマグルチニン結合ペプチド、および、これを含むインフルエンザウイルス感染症の予防・治療薬
RU2441906C2 (ru) Применение композиции, состоящей из низкомолекулярных фрагментов пептидогликана грамотрицательных бактерий, для лечения и профилактики заболеваний человека
US20220395555A1 (en) Derivatives of antibiotics
US10064843B2 (en) Bis-amide derivative and use thereof
JP6533213B2 (ja) 抗ウイルス剤
US20140220556A1 (en) Method of Design and Synthesis of a New Drug
WO2023191651A1 (ru) Супрамолекулярные наночастицы с противовирусными свойствами на основе бензимидазолированного гем-порфирина
EA043514B1 (ru) Супрамолекулярные системы на основе динамических самоорганизующихся наноструктур с противовирусными свойствами
WO2019112464A1 (ru) Фармацевтическая композиция для элиминации возбудителей герпесвирусных инфекций из тканей макроорганизма

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 17913787

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 17913787

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1