JP2001518065A

JP2001518065A - ウイルス複製の阻害

Info

Publication number: JP2001518065A
Application number: JP52871297A
Authority: JP
Inventors: カラチノ，ジョゼフ・マシュー; ハッチ，スティーブン・ディ; ホーンバック，ウィリアム・ジェイ; ムーシング，マーク・エイ; マンロー，ジョン・イー; スタシュク，カーク・エイ; タン，ジョゼフ・チョウ―チュン
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1996-02-09
Filing date: 1997-02-07
Publication date: 2001-10-09
Also published as: US6037348A; CA2244848A1; WO1997028802A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、標的タンパク質の翻訳中および／またはその小胞輸送中に、ＨＡもしくはＥタンパク質と結合、複合または会合する融合疎外剤によって、ＨＡ媒介性融合またはＥタンパク質媒介性融合が阻害されるという作用のメカニズムに基づく、インフルエンザおよびフラビウイルスの複製を阻害する方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】ウイルス複製の阻害インフルエンザおよびフラビウイルスは、それに対する適切な治療剤のない種々の感染性疾患を引き起こす。存在する治療の欠点として、３６時間以内の臨床的耐性の開始およびＢ型インフルエンザに対しては無効であることが挙げられる。不活性化インフルエンザウイルスワクチンは、６０年間にわたって有効である。しかし、これらのワクチンによって罹患率、死亡率あるいはこのような疾患によって生じる財政的困難が軽減されるわけではない。したがって、当然、インフルエンザまたはフラビウイルス感染を治療または予防する作用剤または臨床的症状を予防するのに有効である作用剤が、社会的に重要な利益をもたらすことになるであろう。現在、インフルエンザ感染の治療的または予防的治療に適切である唯一の化合物は、アダマンタン類：アマンタジンおよびリマンタジンである。これらの化合物は、ウイルスのＭ２イオンチャネル活性を阻害することによってＡ型インフルエンザを阻害する。アマンタジンは、プラーク減少アッセイなどの標準抗ウイルスアッセイによって示されるように、Ａ型インフルエンザウイルスの強力なインビトロインヒビターである。アマンタジンは、Ａ型インフルエンザに感染した個体に臨床的症状の発症の４８時間以内に投与した場合、熱および筋肉痛ならびに疲労といったような（これらに限定されるものではないが）他の全身性病訴の持続期間を減少することにおいて有効である。アマンタジンは、野生型インフルエンザウイルスに感染したボランティアのヒトの鼻洗浄に用いた場合、熱得点評価のスコアにおける劇的な軽減化をともなって、ウイルス力価を１００分の１に減少することも観察されている。このように、インビトロでのインフルエンザ阻害効果から、インビボにおける有用な阻害効果、すなわち、インフルエンザ感染に伴う臨床的症状の低減化を予期してよいものと考えてよい。本発明は、インフルエンザウイルスといったようなオルソミクソウイルスおよびウシ下痢ウィルスならびにＣ型肝炎ウイルスといったようなフラビウイルスがエンベロープをもつウイルスであり、ウイルスの遺伝情報を細胞に導入するプロセスを開始するためには、該ウイルスエンベロープが宿主細胞のエンドソーマル膜と融合しなければならないという事実から誘導される。このプロセスは、すべてのエンベロープウイルスに共通しているので、抗ウイルス化学療法にとって魅力的なターゲットである。インフルエンザウイルスのエンベロープ糖タンパク質の融合ドメイン、赤血球凝集素（ＨＡ）およびフラビウイルスのエンベロープタンパク質（Ｅタンパク質）の特徴に関しては、従来からよく研究がなされている。たとえば、ホワイト,J.M.のAnnu.Rev.Physiol.Vol.52,675-697頁(1990);レイ, F.A.らのNature.375,291-298(1995)を参照せよ(本発明の引用文献である)。インフルエンザウイルスＨＡおよびフラビウイルスＥタンパク質は、少なくとも２つの別個の機能をもつ：１）宿主細胞受容体、すなわち、複合糖質上のシアル酸残基の認識、および２）ウイルスエンベロープとエンドソーマル膜の融合。両方の機能が、たとえばインフルエンザウイルスのインビトロならびにインビボでの増殖において不可欠である。インフルエンザウイルスの成熟中に、モノマーＨＡが脂質二重層に挿入され、翻訳後修飾が行われ、次いで同一のサブユニットのトリマーへとオリゴマー形成が行われる（トリマーＨＡ）。後代インフルエンザウイルスの感染性は、宿主だいぼうプロテアーゼによるＨＡの部位特異的切断と条件としている。この切断によって、非共有的相互作用ならびに分子間および分子内ジスルフィド結合によって会合している２つのポリペプチド鎖、ＨＡ１およびＨＡ２が形成される。インフルエンザＨＡおよびＥタンパク質が２つの機能的に関連性のあるコンホーメーションをもつことが確立されている。ひとつのコンホーメーションは、中性ｐＨで準安定な構造として存在し、受容体認識を媒介する。受容体を介して宿主細胞に結合した後、ウイルスは、酸性環境に遭遇するエンドソーマルコンパートメントへ輸送される。低いｐＨが引金となって、劇的な構造転位が起こり、別の、より安定なコンホーメーションが形成される。インフルエンザウイルスの場合、たとえば、ＨＡのＡ体からＢ体への変化がこの構造転位であり、ＨＡの融合ドメインを、エンドソーマル膜と直接相互作用させて、ウイルスの遺伝情報が宿主細胞の細胞質へ放出されうるようになる。これらの考察は、ウイルス−宿主膜のＨＡ媒介性またはＥタンパク質媒介性融合を阻害することに基づく抗ウイルス的干渉のための方策の発達の役に立つものである。後代ウイルスは複製不能であるが、親ウイルスは複製可能であるように、産生宿主細胞に、有効量の融合阻害剤を投与することを特徴とするフラビウイルス複製を阻害する方法。後代ウイルスは複製不能であるが、親ウイルスは複製可能であるように、産生宿主細胞に、有効量の融合阻害剤を投与することを特徴とするインフルエンザウイルス複製を阻害する方法。後代ウイルスにおけるＨＡまたはＥタンパク質の不活性コンホーマーがエンドソーマルｐＨにおいて安定であるように、産生宿主細胞において融合阻害剤に対して、該タンパク質の融合ドメインを不活性化する方法。成熟に際し、後代ウイルスのＨＡはノンフソジェニック（non-fusogenic）であるが、親ウイルスのＨＡはフソジェニックであるように、産生宿主細胞において後代ウイルスのＨＡのＡ体トリマーを安定化することを特徴とするインフルエンザウイルス複製を阻害する方法。後代ウイルスにおけるＥタンパク質のノンフソジェニック体を安定化することを特徴とするフラビウイルス複製を阻害する方法。産生宿主細胞に有効量の融合阻害剤を投与することを特徴とする後代インフルエンザまたはフラビウイルスと宿主細胞の融合を阻害する方法。成熟中、後代ウイルスにおけるＨＡまたはＥタンパク質はノンフソジェニックであるが、親ウイルスのＨＡまたはＥタンパク質はフソジェニックであるように、後代ウイルスのＨＡまたはＥタンパク質の融合ドメインを安定化することを特徴とする後代インフルエンザまたはフラビウイルスと宿主細胞の融合を阻害する方法。図１は、アマンタジン耐性インフルエンザウイルスに対する化合物Ｃ，Ｅ，Ｇおよびアマンタジンの“阻害パーセント”対“濃度（μｇ／ｍｌ）”のグラフである。図２は、野生型インフルエンザウイルスに対する化合物Ｃ，Ｅ，Ｇおよびアマンタジンの“阻害パーセント”対“濃度（μｇ／ｍｌ）”のグラフである。図３Ａは、化合物Ｃ耐性インフルエンザウイルスに対する化合物Ｃ，Ｅ，Ｇおよびアマンタジンの“阻害パーセント”対“濃度（μｇ／ｍｌ）”のグラフである。図３Ｂは、化合物Ｄ耐性インフルエンザウイルスに対する化合物Ｃ，Ｅ，Ｇおよびアマンタジンの“阻害パーセント”対“濃度（μｇ／ｍｌ）”のグラフである。図４は、ＷＳＮＨＡセグメントによって付与された化合物Ａに対する耐性である。ａ，インフルエンザウイルス間の遺伝再組み合わせ物の図式的ダイアグラムである。ＭＤＣＫ細胞は、化合物Ａの不在下で化合物Ａ感受性株Ａ／Ｋａｗ／８６（Ｈ１Ｎ１）および化合物Ａ耐性株Ａ／ＷＳＮ／３３に共感染させた。感染細胞から得た上清を用い、化合物Ａ５μｇ／ｍｌの存在下でＭＤＣＫ細胞を感染させた。ウイルスプラークを採取し、次の分析に用いた。ｂ，６個の化合物Ａ耐性組み合わせ物から単離したウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）からプラス鎖ｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲで増幅した後、制限分析法を用いて各セグメントの起源を決定した。図５は、ＢＨＡモノマーのα炭素トレースである。ＨＡ₁（ブルー）およびＨＡ₂（グリーン）鎖、ならびに融合ペプチド（マゼンタ）を示す。ローカル・アラインメント・ツールＭＡＣＡＷを用い、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８（Ｈ３Ｎ２）およびＡ／Ｋａｗ／８６（Ｈ１Ｎ１）のアミノ酸配列を整列させた。化合物Ａ，Ｂ，ＣまたはＤ耐性Ａ／Ｋａｗ／８６（それぞれ、変異体３−１，ＪＴ.Ｃ，ＪＴ.ＡおよびＪＴ.Ｂ）あるいは化合物Ａ耐性Ａ／Ｋａｗ／８６（変異体Ａ１− Ａ１０）のＨＡにおいて置換されていることが発見されたアミノ酸に対応するアミノ酸をそれぞれレッドおよびイエローで示す。太字で記載されているアミノ酸は、Ａ／ＡｉｃｈｉおよびＡ／Ｋａｗの間で保存されている。図６は、低ｐＨ誘発ＴＢＨＡ₂およびＢＨＡの対応領域（ｐＨ７コンホーメーション）のα炭素トレースである。ＨＡ₁（アミノ酸１２〜１６）およびＨＡ₂（アミノ酸４０〜１５３）鎖をそれぞれブルーおよびグリーンで示す。変異体３−１，ＪＴ.Ａ，ＪＴ.ＢおよびＪＴ.Ｃにおいて発見された置換に対応するアミノ酸をレッドで示し、変異体Ａ１−Ａ１０において発見された置換に対応するアミノ酸をイエローで示す。図７では、アミノ酸置換は、ＨＡ構造の内部に隠されている。ａ，ＢＨＡトリマーのα炭素トレースである。変異体３−１，ＪＴ.Ａ，ＪＴ.ＢおよびＪＴ.Ｃに対応するアミノ酸をレッドで示し、変異体Ａ１−Ａ１０に対応するアミノ酸をグリーンで示す。ｂ，ほとんどのアミノ酸構造が隠されていることを示すａにおける構造の空間充填モデルである。ｃ，観点が膜末梢領域からであるａの様子である。図８は、感染ＭＤＣＫ細胞とヒト赤血球の融合を示す。Ａ／Ｋａｗ／８６に感染したＭＤＣＫ細胞を、ｃおよびｄでは化合物Ａで、ｅおよびｆではアマンタジンで、それぞれ濃度１０μｇ／ｍｌにて処理した。３７℃で８時間のインキュベーション後、ヒト赤血球を感染細胞モノレイヤーに結合させた。ｐＨ７において（ａ，ｃ，およびｅ）または（ｂ，ｄ，およびｆ）をインキュベーションした後、位相差光学顕微鏡（２００倍）で観察した。 “複製（replication）”とは、宿主細胞によるウイルスＲＮＡおよび関連ウイルスタンパク質の再生産または複写(duplication)の挙動または過程を意味し、その定義には、感染性の後代ウイルス粒子の組み立てが包含される。 “安定化”とは、ＨＡまたはＥタンパク質の構造転位、たとえば、ＨＡのＡ体からＢ体へ転位の阻止または妨害を意味し、すなわち、ＨＡの融合ドメインがフソジェニックになることを阻止することを意味する。 “投与する”とは、産生宿主細胞を融合阻害剤に暴露することを意味する。“ 暴露する”には、細胞および作用を剤互いに接近させることが包含される。 “フソジェニック”とは、宿主細胞のエンドソーマル膜と相互作用することができ、宿主細胞の細胞質にウイルス遺伝情報を放出を引き起こしうる融合ドメインを含むＨＡまたはＥタンパク質の構造形体を意味する。 “ノンフソジェニック”とは、宿主細胞のエンドソーマル膜と相互作用することができず、宿主細胞の細胞質にウイルス遺伝情報を放出を引き起こせない融合ドメインを含むＨＡまたはＥタンパク質の構造形体を意味する。 “後代ウイルス”とは、親ウイルスと宿主細胞の融合後に産生宿主細胞によって産生されるウイルスを意味する。 “Ｅタンパク質”または“エンベロープタンパク質”とは、標的細胞受容体の結合およびウイルス膜融合を媒介するフラビウイルス上の主要表面タンパク質を意味する。Ｅタンパク質は、生理的ｐＨにおいて成熟ウイルスの表面上でダイマーを形成する。しかし、約６．５より低いｐＨ環境においては、Ｅタンパク質に、フラビウイルス膜とエンドソーマル膜の融合において臨界条件であると考えられているコンホーメーションの変化が起こる。 “融合阻害剤”とは、標的タンパク質の翻訳中および／または小胞輸送中に、ＨＡまたはＥタンパク質に結合、複合あるいは会合し、最終的にタンパク質のオリゴマー形成が起こり、そのためにＥタンパク質のコンホーメーションの転換またはＨＡのＡ体からＢ体へのコンホーメーションの転換を阻害する、化学分子などの作用剤を意味する。 “フラビウイルス”とは、動物ウイルスのひとつの属を意味し、ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）、ダニ媒介脳炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、黄熱ウイルスおよびウシ下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）などが挙げられるがこれらに限定されるものではない。フラビウイルスは、エンベロープをもち、ＲＮＡゲノムを含み、Ｅ１およびＥ２といったようなＥタンパク質が関与するメカニズムによって標的宿主細胞と融合する。ウイルスとエンドソーマル膜の融合は低ｐＨにおいて最適条件である。本明細書で用いる“有効量”とは、ウイルスと宿主細胞の融合を阻害する融合阻害剤の量を意味する。本発明方法によって企図されるインフルエンザウイルスおよびフラビウイルスの阻害には、治療的および予防的処置の両方が包含される。本発明にしたがって治療的および／または予防的効果を得るために投与される化合物の特定の用量は、もちろん、たとえば、投与される化合物、投与経路、処置される身体状態および処置される個体といったような各ケースを取り巻く個々の環境によって決定される。代表的な一日の用量（一回投与または分割投与）は、体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ〜約５０ｍｇの投与量の本発明活性化合物である。好ましい一日用量は、一般に体重１ｋｇ当たり約０．０５ｍｇ〜約２０ｍｇであり、理想的には、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。化合物は、経口、直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内および鼻孔内などの種々の経路によって投与することができる。本発明化合物は、投与前に製剤されるのが好ましい。したがって、本発明の他の具体例は、有効量の化合物Ｉまたはその医薬的に許容しうる塩、および医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬製剤である。このような製剤において有効成分は、製剤の０．１〜９９．９重量％である。 “医薬的に許容しうる”とは、担体、希釈剤または賦形剤が、製剤の他の成分と共存可能であって、そのレシピエントにとって有害でないことを意味する。化合物ＡからＫは、未成熟の後代ウイルスの赤血球凝集素（ＨＡ）またＥタンパク質の融合ドメインを安定化することによって、成熟中である未成熟の後代ウイルスがノンフソジェニックなＨＡまたはＥタンパク質を含み、複製不可能となるゆえに、ウイルスの複製を阻害することがわかった。化合物Ｃは、フランス特許ＦＲ７０３１（６９０７２１）；化合物Ｈは、Can ．Ｊ．Chem．65(1)124-30(1987)に記載されている。製造例１当業界で公知の方法および本明細書に開示した方法により化合物Ｃから化合物Ｅを製造することができる。たとえば、氷酢酸(約１５ml)に化合物Ｃ(７７５mg) を溶解し、耐圧ガラスボトルに入れ、５％ロジウム／炭素(１００mg)を加える。ボトルを水素ガスでフラッシュし、シールし、次いで約６０ｐｓｉの圧力をかける。反応物を６０℃に加熱し、一夜かきまぜる。反応物を冷却し、開封し、濾過し、次いで回転蒸発により溶媒を除去する。１Ｎ水酸化ナトリウム(１０ml)に溶解し、ジエチルエーテルで洗浄し、次いで水層を５Ｎ塩酸で酸性化することにより粗生成物を精製する。水層を３部の塩化メチレンで抽出し、抽出物を合わせ、食塩水で洗浄する。回転蒸発により溶媒を除去して褐色油状生成物を得る。ＮＭＲ、マススペクトルおよび元素分析により、生成物を確認する。抗ウイルスプラークアッセイ化合物Ａ、化合物Ｂ、化合物Ｃおよびアマンタジンのインビトロにおける抗インフルエンザ活性を、HaydenらのAntimicrob．Agents Chemother.，vol.17，pp8 65-870(1980)(本発明の引用文献である)に記載されているような標準プラークアマンタジンを用いて評価した。このアッセイでは、インフルエンザウイルス感染マジンダービイイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を各化合物の連続希釈液で非処理または処理した。化合物濃度対プラーク形成阻害パーセントのプロットの直線回帰直線から、ウイルスプラーク形成を５０％阻害するのに必要な化合物の濃度（ＩＣ₅₀ ）を決定した。これ以外にも、ReedおよびMuenchのAm．J．Hyg，vol.27,493-4 97(1938)(本発明の引用文献である）の方法によってもＩＣ₅₀を決定することができる。これらの化合物は、インフルエンザＡ／Kawasakiに対して有効な活性を示す。これらの化合物はまた、インフルエンザＡおよびＢウイルスに対する抗ウイルス活性も示す。下記表１は、これらのデータの一覧である。表１化合物Ａ、化合物Ｂおよび化合物Ｃの抗ウイルス活性耐性実験これらの化合物の生物学的活性がウイルス標的または宿主細胞に対して示されるかどうかを確認するために、インフルエンザＡ／Kawasakiウイルスを選択し、これらの化合物の各クラスのメンバーに対する耐性を調べた。耐性実験から２つの結論が導かれた。ひとつ目は、試験化合物の抗ウイルス活性が、細胞の機能に対するものとしてのウイルスの機能を介して媒介されることである。２番目は、試験化合物の抗ウイルス活性が、共通の作用メカニズムを介して作動することである。野生型ウイルスにおいて、化合物濃度を段階的上昇させ、次いでプラークの精製を行い、その結果として高度に薬物耐性のあるウイルスの選択がなされたことから、抗ウイルス活性がウイルスの機能の阻害に由来することがわかる。さらに、耐性ウイルスが交差耐性であることがわかったことから、化合物の抗ウイルス活性が共通の作用メカニズムに由来することが示唆される。図１、２、３Ａおよび３Ｂは、阻害パーセント対試験化合物の濃度（μg／ml）のグラフである。さらなる実験から、感染後８時間に至って加える場合でさえも、これらの化合物がフルの抗ウイルス活性を保有していることがわかり、このことから、抗ウイルス活性の作用のメカニズムが、ウイスル複製サイクルにおいて後期に媒介されることが示された。図４は、阻害パーセント対添加時間（感染後の時間）のグラフである。薬物耐性ウイルス変異体の分子的特徴１．Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子セグメントに対する薬物耐性マップ図５は、インフルエンザＡ／KawasakiのＨＡの完全ヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。薬物耐性表現型に関与するウイルスゲノム変異のマッピングのために配列試験を行った。逆転写酵素によるｃＤＮＡの合成のためのテンプレートとして、野生型、化合物Ｃ耐性インフルエンザ、化合物Ｄ耐性，化合物Ｂ耐性または化合物Ａ耐性Ａ／Kawasakiウイルス由来のウイルスＲＮＡを用いた。セグメント特異的ＰＣＲプライマーを用い、ｃＤＮＡとなっている個々のウイルスの遺伝子セグメントを増幅し、次いで循環的シーケンシングプロトコルを用いてＰＣＲ産物の配列法定を行った。下記表２に示すように、各薬物耐性ウイルスにおいて、ＨＡのＨＡ２セグメントにヌクレオチドの変化が発見された。化合物Ａ耐性変異由来のＨＡセグメントの配列分析によって、高レベルの薬物耐性およびウイルス交差耐性によるＨＡ配列の変更の相関関係をさらに具体化した。Ａ／Kawasakiの独立した単離物（ｎ＝１０）を選択し、単一経路のプロトコルを用いて高濃度の化合物Ａ（５μg／ml ）中での成長を試験した。これらのウイルスのそれぞれのＨＡ遺伝子セグメントの配列決定をし、再度各ケースにおいて、少なくともひとつの配列変更を含む変異ＲＮＡセグメントの配列決定を行った。これによって、ＨＡ配列の変更と高レベルの薬物耐性の間に直接的な相関関係が確立される。表２薬物耐性変異体のＨＡにおけるアミノ酸置換 ^a）化合物Ｃ、化合物Ｄ、化合物Ｂまたは化合物Ａに対する耐性試験用としてインフルエンザウイルス株Ａ／Kawasaki／８６を選択し、マディーダービイイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞を用い、化合物濃度を段階的に上昇させ、プラーク精製を３回行った。変異体また親Ａ／Kawasaki／８６ウイルスからビリオンＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を精製し、プラス鎖ＤＮＡ合成のためのテンプレートとして用いた。次いで、該プラス鎖ＤＮＡをＰＣＲにより増幅し、二本鎖サイクル配列決定法により配列決定を行った。ＪＴ.ＡウイルスのｖＲＮＡセグメント、ＮＳ，Ｍ，ＮＰ，ＮＡおよびＨＡの配列分析から、ＨＡにおけるアミノ酸置換を導く変異が示された。 ^b）化合物Ｃに耐性のあるＪＴ.Ａウイルスもまた化合物Ｄに対して交差耐性である。 ^c）ローカルアラ・インメントツール（ＭＡＣＡＷ）を用いてＡ／Kaw／８６（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／Aichi／２／６８（Ｈ３Ｎ２）のアミノ酸配列を整列した。括弧内のアミノ酸は、Ａ／Aichi／２／６８のＨＡにおける対応するアミノ酸を示す。表３化合物Ａ耐性変異体におけるアミノ酸置換 ^a）ＭＤＣＫ細胞を、化合物Ａ（５μg／ml）の存在下インフルエンザウイルス株Ａ／Kaw／８６のひとつのプラーク形成ユニット（ｐｆｕ）で感染させ、プラークを１回精製した。表１に示したように薬物耐性または親ウイルスからビリオンＲＮＡを精製した。 ^b）括弧内のアミノ酸は、Ａ／Aichi／２／６８のＨＡにおける対応するアミノ酸を示す。 ^c）ＭＤＣＫ細胞±化合物Ａにおいて、変異体ウイルスストックの力価決定を行った。 ^d）変異体Ａ２は、同数のプラーク±化合物Ａを示したが、化合物Ａの不在下では別のプラーク形態を示した。再組み合わせ実験再組み合わせ実験により、化合物Ａの抗ウイルス活性に対するＡ型インフルエンザウイルスの耐性におけるＨＡの役割をさらに具体化した。これらの実験では、紫外線照射により、化合物Ａに対して天然耐性をもつインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３を不活化し、図６に示す、化合物Ａに対して感受性のあるインフルエンザＡ／Kawasaki／８６とともにＭＤＣＫ細胞上に植えた。二重に感染させた細胞を、化合物Ａの不在下にて、ウイルスの細胞変性効果が観察されるまでインキュベートした。細胞培養液中のウイルスを連続的に希釈し、化合物Ａ（５μg／ml）の存在下、ＭＤＣＫ細胞を感染させるのに用いた。得られるウイルスプラークを採集し、拡張（expand）した。拡張したプラークからウイルスＲＮＡを得、逆転写酵素を用いてｃＤＮＡにコピーした。セグメント特異的ＰＣＲプライマーを用いて、得られるｃＤＮＡを増殖し、増殖した遺伝子セグメントのそれぞれを制限酵素分析に付し、遺伝子セグメントを最初のウイルスのものと比較することにより、特徴を決定した。これらの実験から、化合物Ａに耐性のあるすべての再類別ウイルスが、インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３由来のＨＡセグメントを含み、幾つかの耐性単離体が、ＨＡセグメントのみを含むことがわかった。これらの結果を図７にまとめた。薬物耐性表現型を得るためには、耐性ウイルスＡ／ＷＳＮ／３３由来のＨＡ遺伝子が、必要不可欠であったという結果になる。２．薬物耐性ウイルスにおける変異の位置：作用のメカニズムとの関連薬物耐性ウイルスにおけるすべての変異がＨＡ遺伝子セグメントにマッピングされたことから、ＨＡの阻害が抗ウイルス活性にとって必須であることは明らかである。ＨＡのシアル酸受容体結合ドメインにマッピングされた変異がないことは、これらの化合物が受容体認識を妨害しないことを示している。さらに、実験から、インフルエンザウイルスによるニワトリ赤血球細胞の赤血球凝集が、融合阻害剤によって影響されないことが示されている。化合物Ｃ耐性ウイルスおよび化合物Ａ耐性ウイルスの両方のＨＡセグメントにおいて発見された変異は、ＨＡの一次アミノ酸配列にわたって分散しており、ＨＡのＡ体の三次構造の２つの領域のうちのひとつに群存している。これらの２つの領域とは：１）中性ｐＨでＡ体の完全さを維持するために臨界的である、ＨＡ１とＨＡ２との間の界面、および２）ＨＡ２の融合ドメインの近傍である。これらの変異を図８に示す。図９は、Ａ体およびＢ体における、これらの変異の位置を示す。図１０は、これらの変異が、トリマーＨＡ構造の内部に隠されていることを示す。ウイルスが遺伝物質を宿主細胞の細胞質に導入できなくするという、ＨＡ媒介性融合の阻害は、少なくとも５つの作用のメカニズムによって達成される。これらの作用のメカニズムは次のとおりである。Ｂ体の作用のメカニズムは、ＨＡのＢ体を不活性化することによって融合プロセスを阻害することからなる。このメカニズムには、Ｂ体と小さい分子などのインヒビターとの直接の相互作用が含まれる。このようなインヒビターはコンホーメーションのスイッチとして迅速に作動すると予測される。トリペリデン(Norikan(登録商標))およびBodianらの作用のメカニズムは、薬物で細胞質内におけるＡ体のコンホーメーション構造をＢ体よりも安定化することにより、Ａ体からＢ体へのコンホーメーションの変化を阻害することからなる。Ａ体を安定化しうる少なくとも２つの方法がある。たとえばトリペリデンのメカニズムは、エンドソーマルｐＨを上昇させてＢ体へのコンホーメーションの変化を阻止することからなる。Bodianのメカニズムは、薬物がＡ体トリマーと相互作用することによりＡ体を安定化し、それによってＢ体へのコンホーメーションの変化を阻止することからなる。この仮説はBodianらのBiochemistry,vol.32,29 67-2978(1993)に記載されている。本発明においては、モノマーＨＡは、翻訳中に融合阻害剤に曝露され、その結果として、ひとつ以上の融合阻害剤と結合、複合または会合しているＡ体トリマーが形成される。化合物Ａおよび化合物Ｃ耐性ウイルスにおける変異の位置は、エンドソーマルコンパートメントにおけるＡ体からＢ体へのコンホーメーションスイッチの阻害と一致する。薬物添加時間の実験から、これらの化合物の標的は、感染宿主細胞内にあるが、抗ウイルス活性は、新たに感染した細胞における次の感染ラウンド中のみに現れることが示された。本発明は、産生宿主細胞のＨＡのＡ体トリマーとの偵接の相互作用を含まないことになる。むしろ、本発明を例証する化合物は、産生宿主細胞によって産生され、後代ウイルスによって用いられるＡ体トリマーに影響を及ぼす。これらの融合阻害剤が直接ＨＡと相互作用する、上記メカニズムのサポートとして、薬物耐性ウイルスのサブセットは薬物依存的表現型を表した（すなわち薬物の存在下、それらは薬物なしの１００倍の力価で複製した）。さらに、上記メカニズムを確認するために次のアッセイを行った。赤血球融合アッセイヒト赤血球と感染したＭＤＣＫ細胞の融合を、次のようにモニターした：ＭＤＣＫ細胞の集密的単層細胞を、およそ２５の感染多重度で３７℃にて１時間Ａ／ Kawasaki／８６に感染させた。次いで、０．２％ウシアルブミン（ＢＡ）を含む最少必須培地（ＭＥＭ）で２回濯ぎ、０．２％ＢＡ，２μｇ／ｍｌのトリプシンおよび化合物Ａを１０μｇ／ｍｌの濃度で含むＭＥＭを満たす。３７℃で８時間インキュベートした後、単層を上記培地で１回濯ぎ、ヒト赤血球の１％リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）の溶液を加える。室温で１５分インキュベートした後、すべての未結合の赤血球が未感染のコントロール単層から洗浄されるまで単層をＰＢＳ（３〜５回）で広範囲にわたって洗浄する。次いで、結合洗浄の存在について感染細胞を調べた。細胞単層を予熱したＭＥＭとともにｐＨ７または４．８にて３７℃でインキュベートした。５分間インキュベートした後、培地を中性ｐＨのＭＥＭで置き換え、単層を３７℃でインキュベートした。感染ＭＥＭ細胞と結合ヒト赤血球の融合について細胞単層をモニターし、位相差光学顕微鏡（２００倍）で、２時間後に観察した。結果化合物Ａで処理した細胞への赤血球の結合によって明らかなように（図１１のパネルｃ対ａを参照せよ）、化合物Ａは、感染細胞表面のＨＡの発現に効果はなかった。しかし、感染ＭＤＣＫ細胞を化合物Ａで処理すると、ＭＤＣＫの低ｐＨ誘発融合の阻害が得られた（パネルｂ対ｄを参照）。これらの結果は、化合物Ａが、ＨＡの折り畳み中および／またはオリゴマー形成中にＨＡと結合し、それによって膜融合を阻止するという仮説と一致する。さらに、化合物Ａの抗ウイルス活性に耐性を獲得しているＡ／ＷＳＮ／３３を用いて赤血球融合アッセイを行った（表１参照）。化合物Ａがヒト赤血球とＡ／ＷＳＮ／３３感染ＭＤＣＫ細胞との融合において無効であることを示すことが観察された。これらの結果は、化合物Ａの抗ウイルス活性は、インフルエンザウイルスのＨＡのフソジェニック機能の阻害を介して媒介されるという仮説をさらにサポートしている。別のメカニズムば、Ａ体トリマーの形成からモノマーＨＡを阻害することである。トリマーＨＡが融合プロセスに必須であるために、Ａ体のＨＡの形成を阻害することによって、ウイルスと産生宿主細胞の融合が必然的に阻害される。上記詳述した実験から、本発明は、タンパク質のオリゴマー形成がなされる、標的タンパク質の翻訳中および／またはその小胞輸送中に、ＨＡもしくはＥタンパク質と結合、複合または会合する融合疎外剤によって、ＨＡ媒介性融合が阻害され、最終的にＡ体トリマーからＢ体トリマーへのコンホーメションスイッチが阻害されるという新規な作用メカニズムを含むことが立証された。融合阻害剤は、完全に形成されたオリゴマー状態においては達せられない、タンパク質のドメインへ結合、複合または会合すると考えられる。したがって、これらの化合物は、完全に組み立てられたＨＡトリマーが成熟ビリオンのエンベロープへ挿入された後では、活性はない。記載した作用のメカニズムに一致して、細胞のない培地において感染性ビリオンと予備インキュベートした場合、化合物Ａは試験の結果不活性であった。フラビウイルスの阻害ＢＶＤＶは、全ゲノム構成および遺伝子発現がＣ型肝炎ウイスルに類似しているウイルスのうちのフラビウイルスグループに属する。ＢＶＤＶは、組織培養ウィルス複製アッセイにおいて、ＨＣＶ用のサロゲートウイルスとして用いられている。インフルエンザと同様に、フラビウイルスが宿主細胞に感染するには、特定のウイルス膜糖タンパク質（すなわちＥタンパク質）がフラビウイルスとエンドソーマル膜の融合を媒介することが必要である。フラビウイルス感染が低ｐＨによって刺激され、Ｅタンパク質のコンホーメーション変化に関連性があるという点で、フラビウイルスの融合はインフルエンザ感染を暗示する。組織培養においてＢＶＤＶの複製を阻害する能力について、化合物Ａおよび関連化合物を試験した。化合物ＡはＭＤＢＫの複製を濃度３．５μｇ／ｍｌで５０％および濃度１３．４μｇ／ｍｌで９０％阻害した（表４を参照）。すべての化合物は、ＤＭＳＯに溶解してストック溶液とした。薬物の希釈はＤＭＳＯで行った；“薬物なし”のコントロールは、ＤＭＳＯのみからなる。すべてのケースにおいて、ＤＭＳＯの最終濃度は０．１％である。表４化合物Ａおよび関連化合物の抗ＢＶＤＶ活性 ^a）ＣＰＥ／ＸＴＴアッセイにより決定したウイルスの複製を５０％阻害するのに必要な化合物の濃度。 ^b）ＣＰＥ／ＸＴＴアッセイにより決定したウイルスの複製を５０％阻害するのに必要な化合物の濃度。 ^c）ＸＴＴアッセイにより決定したＭＤＢＫ宿主細胞に対して５０％の毒性をもつ化合物の濃度。ＣＰＥ／ＸＴＴ保護アッセイまたはプラーク減少アッセイのいずれかにより抗ウイルス活性を評価した。ＣＰＥ／ＸＴＴ保護アッセイでは、試験化合物について、ウイルス誘発性細胞毒性効果から宿主細胞を保護する能力を評価した。ＭＤＢＫ細胞を、９６ウエル平底マイクロタイター組織培養プレート上のペニシリン／ストレプトマイシン、重炭酸ナトリウムおよび１０％ウマ血清を含む最少必須培地（ＭＥＭ）に、約１００００細胞／ウエルの密度で植えた。細胞をＢＶＤＶ（ＡＴＣＣＶＲ−５３４）に感染多重度０．１プラーク形成ユニット／細胞で感染させた。化合物のシリーズ希釈物を含む培地を加え、培養物を３７℃で３〜４日間、薬物なしコントロールにおいてウイルス誘発性細胞毒性効果が著しくあらわれるまでインキュベートした。５０μｌの新たに調製したＸＴＴ−ＰＭＳ培地［（１ｍｇの２，３−ビス（メトキシ−４−ニトロ−５−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム−５（ＸＴＴ）／ｍｌおよび２５ｎＭのメトスルホン酸フェナジン（ＰＭＳ）を含む血清フリーＭＥＭ）］を各ウエルに加えるＴＸＴアッセイにより抗ウイルス活性を定量した。プラークを３７℃で２〜３時間インキュベートした。代謝的活性細胞と相互関係がある呈色を、４５０ｎｍにおける光学密度を記録することによって分光光学的に評価した。細胞毒性効果を５０％妨害するのに必要な薬物濃度（ＩＣ₅₀）または９０％妨害するのに必要な薬物濃度（ＩＣ₉₀）を、各用量応答曲線の直線部分から算出した。抗ウイルスプラーク減少アッセイでは、ＭＤＢＫ細胞を、６ウエルの組織培養プレートに植え、ＭＥＭ培養培地でインキュベートした。細胞が集密になったとき、培地を除去し、約１００プラーク形成ユニットのＢＶＤＶを含む植え込み物を各ウイルスに加えた。室温にてウイルスを１〜２時間吸着させた後、等量部の１．５％アガロースおよび５％ウマ血清（ｖ／ｖ）を含む２倍のＭＥＭ中にＤＭＳＯ担体単独または指示された濃度の薬物を含む表層を、細胞に加えた。表層を凝固させる場合、３７℃で２〜４日間、薬物なしコントロールにプラーク形成が現れるまで、プレートをインキュベートした。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＹＵ (72)発明者ホーンバック，ウィリアム・ジェイアメリカ合衆国46038インディアナ州フィッシャーズ、ベント・トゥリー・レイン 10063番 (72)発明者ムーシング，マーク・エイアメリカ合衆国46143インディアナ州グリーンウッド、シエロ・ビスタ・ドライブ 664番 (72)発明者マンロー，ジョン・イーアメリカ合衆国46220インディアナ州インディアナポリス、ローリング・パインズ・コート5783番 (72)発明者スタシュク，カーク・エイアメリカ合衆国46220インディアナ州インディアナポリス，グリーンリーブズ・ロード6423番 (72)発明者タン，ジョゼフ・チョウ―チュンアメリカ合衆国46033インディアナ州カーメル、ドーチェスター・プレイス1512番

Claims

【特許請求の範囲】１．後代ウイルスは複製不能であるが、親ウイルスは複製可能であるように、産生宿主細胞に、有効量の融合阻害剤を投与することを特徴とするフラビウイルス複製を阻害する方法。２．後代ウイルスは複製不能であるが、親ウイルスは複製可能であるように、産生宿主細胞に、有効量の融合阻害剤を投与することを特徴とするインフルエンザウイルス複製を阻害する方法。３．モノマー赤血球凝集素が、ノンフソジェニックな融合ドメインを含むトリマーを形成する請求項２記載の方法。４．Ａ体トリマーがエンドソーマルｐＨにおいて安定であるために、後代ウイルスが複製不能である請求項２記載の方法。５．トリマー赤血球凝集素が、Ａ体トリマーからＢ体トリマーへのコンホーメーション変化が不能である請求項２記載の方法。６．後代ウイルスにおけるトリマー赤血球凝集素がエンドソーマルｐＨにおいて安定であるように、産生宿主細胞においてモノマー赤血球凝集素を融合阻害剤に暴露することにより、トリマー赤血球凝集素の融合ドメインを不活性化する方法。７．成熟に際し、後代ウイルスの赤血球凝集素はノンフソジェニック（non-fu sogenic）であるが、親ウイルスの赤血球凝集素はフソジェニックであるように、産生宿主細胞において後代ウイルスのＡ体トリマーを安定化することを特徴とするインフルエンザウイルス複製を阻害する方法。８．Ａ体からＢ体へのコンホーメーション変化が不能であるために、赤血球凝集素がノンフソジェニックである請求項７記載の方法。９．産生宿主細胞に有効量の融合阻害剤を投与することを特徴とする後代インフルエンザウイルスと宿主細胞の融合を阻害する方法。１０．成熟中、後代ウイルスにおける赤血球凝集素はノンフソジェニックであるが、親ウイルスの赤血球凝集素はフソジェニックであるように、後代ウイルスの赤血球凝集素の融合ドメインを安定化することを特徴とする後代インフルエンザと宿主細胞の融合を阻害する方法。