JPH05506997A - オリゴヌクレオチドによるインフルエンザウィルス複製の阻止 - Google Patents

オリゴヌクレオチドによるインフルエンザウィルス複製の阻止

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 オリゴヌクレオチドによる インフルエンザウィルス複製の阻止 発明の背景 インフルエンザウィルスは膜包封されたウィルスであって、そのゲノムはセグメ ント化されたＲＮＡのマイナスストランドである。種類ＡおよびＢの一本鎖ＲＮ Ａにおける８個のセグメントおよび種類Ｃの７個のセグメントには、１０個のイ ンフルエンザウィルス遺伝子が存在する。これらセグメントは種々異なる寸法（ 長さ８９０〜２３４１個のヌクレオチドの範囲）を有し、それぞれが種々異なる ｍＲＮＡの合成用雛型である。インフルエンザウィルスピリオンはこれら雛型か らのｍＲＮＡ合成に必要なウィルス特異性ＲＮＡポリメラーゼを含有し、この特 異性ポリメラーゼの不存在下ではインフルエンザウィルスＲＮＡのマイナススト ランドは感染性でない。
ｍＲＮＡの転写の開始は、インフルエンザウィルスＲＮＡポリメラーゼが細胞ｍ ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ先駆体の５′末端から１２〜１５個のヌクレオチドを取 上げて、その取上げたオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する際に生ず る。一般に、この過程で作成されるｍＲＮＡは１種のみの蛋白をコードする。ｍ ＲＮＡおよびＮＳ　ＲＮＡも接合ｍＲＮＡをコードして、これら２種のセグメン トのそれぞれにつき２種の異なる蛋白を産生ずる。
インフルエンザウィルスはヒトおよび動物（たとえば豚、鳥、馬）に感染して急 性呼吸病をもたらしうる。インフルエンザウィルスに対し有効なワクチンを生産 すべく多くの試みがなされている。しかしながら、特に長期間にわたり完全に成 功を治めたものはない。これは少なくとも部分的にインフルエンザウィルスゲノ ムのセグメント化された特徴に起因し、セグメントの再分類により多くの形態が 存在しうる。たとえば動物とヒトとのインフルエンザウィルスの間にはＲＮＡセ グメントの互換性が存在し、新たな抗原サブタイプを両種類のウィルスに導入し うることが示唆されている。したがって新たなサブタイプの出現（抗原性「シフ ト」）により、長期間のワクチン対策は失敗している。さらにウィルスの表面蛋 白、すなわちヘマグルチニンおよびニウラミニダーゼは常に僅かな抗原変化（抗 原「ドリフト」）を受ける。この高度の変化は、特定のインフルエンザウィルス に対し発生した特定の免疫が何故新たな種類に対し保護を確立しないかの説明と なる。したがって、他の抗ウイルス対策が必要とされる。インフルエンザＢおよ びＣウィルスは種類Ａよりも低い臨床的症状をもたらすが、抗ウイルス薬品もこ れら種類によってもたらされる感染を抑制するのに有益となる。
発明の要点 本発明は、インフルエンザウィルスＲＮＡの選択領域にハイブリダイズしてコー ド生産物（たとえばＲＮＡ。
ＤＮＡ、蛋白）の合成の雛型として作用する能力を阻害（減少もしくは除去）す る天然（未改変）もしくは改変オリゴヌクレオチド（すなわちオリゴデオキシヌ クレオチドもしくはオリゴリボヌクレオチド）の活性を介しインフルエンザウィ ルス複製を阻止（減少もしくは防止）する方法に関する。本発明の方法において 、インフルエンザウィルスＲＮＡ　［（−）ｖＲＮＡ　；　（＋）ｍＲＮＡおよ び／または（＋）ｃＲＮＡ］の選択領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオチ ド（改変もしくは未改変）は、ウィルスＨＭＡ選択領域に対するオリゴヌクレオ チドのハイブリッド化に適する条件下で細胞中に導入される。オリゴヌクレオチ ドはインフルエンザウィルスＲＮＡとハイブリダイズして、コード生産物を合成 するための雛型として作用する能力を阻害し、その結果としてインフルエンザウ ィルス複製および／または遺伝子発現の阻止をもたらす。
さらに本発明は、インフルエンザウィルスＲＮＡの選めの雛型として作用する能 力を阻止する能力を有する結果、インフルエンザウィルスに対し抗ウィルス活性 を有するオリゴヌクレオチドに関するものである。本発明の改変オリゴヌクレオ チドは核酸塩基、糖部分、ヌクレオシト間の燐酸結合、またはこれら部位におけ る改変の組合せのような１つもしくはそれ以上の改変を含むことができる。ヌク レオシド間の燐酸結合はホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホス ホネート、ホスホロジチオエートおよび同様な結合の組合せとすることがテキる （混成骨格の改変オリゴヌクレオチドを産生ずる）。これら改変はオリゴヌクレ オチド分子の内部または末端とすることができ、ヌクレオシド間の燐酸結合の分 子に対する付加、たとえばコレステリル、アミノ基と末端リボースとの間の炭素 数が変化したジアミン化合物１、デオキシリボースおよび燐酸改変を包含し、反 対連鎖またはウィルスゲノムに結合する関連酵素もしくは他の蛋白を切断し或い はこれに架橋する。たとえばレプリカーゼは成る種の合成されたアンチセンスオ リゴマーに隣接する。たとえばリポース−ジアルデヒドのような電性基は、この 種の蛋白におけるリシル残基のε−アミノ基と共有結合しうる。たとえばオリゴ マーに拘束されるｎ　−エチロナレイミドのような核性基はｍＲＮＡの三燐酸キ ャップまたは他の電性部位に共有結合しうる。さらに本発明は、インフルエンザ ウィルスに対し抗ウィルス活性を有し本発明のオリゴヌクレオチドを含む組成物 、並びにインフルエンザウィルス複製を阻止する目的で個人に対しオリゴヌクレ オチドまたは改変オリゴデオキシヌクレオチドを含有する組成物を投与する方法 にも関するものである。
本発明による方法の特定具体例において、インフルエンザウィルスに対し抗ウィ ルス活性を有する改変オリゴデオキシヌクレオチドは、それらがインフルエンザ ウィルスＲＮＡ　［（−）もしくは（＋）のインフルエンザウィルスゲノムのス トランド］の選択領域に／％イブリダイズする細胞に導入されてコード生産物の 複製もしくは発現を阻止する。その結果、インフルエンザウィルス複製が阻止さ れる。本発明の方法に使用される改変オリゴデオキシヌクレオチドは、インフル エンザウィルス複製および／または遺伝子発現に必須であるインフルエンザウィ ルスＲＮＡの領域に対し相補的である。改変オリゴデオキシヌクレオチドは核酸 塩基、ヌクレオシド間の燐酸、糖成分の改変、またはこれら部位における改変の 組合せを包含する。これら改変はオリゴヌクレオチド分子の内部または末端とす ることができる。
本発明の改変オリゴヌクレオチドは、これらが前記領域にハイブリダイズしてこ れらを他のゲノムストランドを産生ずるための雛型として作用しえなくするイン フルエンザウィルスゲノムの領域に対し充分に相補的である。
その結果、ンンフルエンザウイルス複製が阻止される。
改変オリゴデオキシヌクレオチドは保持された標的、たとえばインフルエンザウ ィルスゲノムストランドの３′末端に共通の１３ヌクレオチド；インフルエンザ ウィルスＲＮＡの５′末端における保守されたヌクレオチド領域、ＦＢＩポリメ ラーゼをコードする幾つか或いは全部の配列（特にその触媒部位のＡｓｐ−Ａｓ ｐモチーフ）：ポリメラーゼ関連蛋白ＰＢ２およびＰＡの触媒部位；ネウラミニ ダーゼ蛋白の触媒部位；並びにＨＥ、ＮＰ、ＭおよびＮＳ蛋白の不変セグメント のような保守された標的を含むインフルエンザウィルスＲＮＡの領域にハイブリ ダイズする。本発明の方法によれば、改変オリゴヌクレオチドはそれらがウィル スＲＮＡの選択領域にハイブリダイズする細胞に侵入し、これはウィルスゲノム の（−）もしくは（＋）ストランドのいずれかとすることができる。
本発明の改変オリゴヌクレオチドは、インフルエンザウィルスに対する保護を与 えるべく個人に投与することができる。改変オリゴヌクレオチドは一般に、生理 学上許容しうるキャリヤをも含む組成物の一成分として個人に投与される。投与 した後、オリゴヌクレオチドは細胞中に侵入し、ウィルスＲＮＡにハイブリダイ ズし、コード生産物を合成するための雛型として作用する能力を阻止する。その 結果、インフルエンザウィルスの複製が阻止され、個人に対するインフルエンザ ウィルスの作用は改変オリゴヌクレオチドが投与されなかった場合に見られるよ りも低くなる。その結果として得られる保護はインフルエンザウィルスによる感 染に対し耐性をもたらしくその結果、ウィルスによる感染が生じない）、或いは 個人に対し減少した感染レベルをもたらす（その結果、感染は生ずるが改変オリ ゴヌクレオチドが投与されない場合に生ずるよりも低い程度で感染する）。
この種の改変オリゴヌクレオチドの使用は少なくとも２つの重要な利点を有する 。第１に、観察される抗ウィルス作用は次の意味で極めて特異的である。２０個 のヌクレオチドの特定配列は１０　で１回よりも多くランダムに生ずると予想さ れない。ヒトゲノムでは約４×１０９個のヌクレオチドが存在し、したがってた とえばインフルエンザウィルスゲノムから選択される２０−ヌクレオチドの特異 性は配列の特異性は大であると予想される。
第２に、オリゴヌクレオチドの細胞毒性は低い。
図面の簡単な説明 第１図はインフルエンザウィルスにより感染された細胞に存在する３種の異なる ＲＮＡおよび２種のインフルエンザウィルスの部分ＲＮＡ配列を示す略図である 。第１図の上部における３本の棒はそれぞれ相補ＲＮＡ　（ｃッチング）および ポリアデニル化３′部分が示されている。図面の下半分に示された２つの配列は それぞれインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウィルスのＰＢ１遺伝子におけるＲＮ Ａ配列の部分およびインフルエンザＣ／ＪＪ１５０ウィルスのＲＮＡ配列の部分 であり、これら両者は（＋）方向の配向である。試験したオリゴヌクレオチドに 対応する領域を大活字で示し、開始コドンに下線を施す。
第２図はインフルエンザウィルスＡ複製に対するオリゴデオキシヌクレオチド（ ＯＤＮ）、たとえば未改変ＯＤＮ　（０−ＯＤＮ）もしくはＯＤＮのホスホロチ オニー誘導体（Ｓ−ＯＤＮ）の作用を示すグラフである。第２Ａ図はインフルエ ンザウィルスＡ複製に対する０−ＯＤＮの作用を示し、第２Ｂ図はインフルエン ザウィルスＡ複製に対する５−ＯＤＮの作用を示す。
第３図は５−ＯＤＮによるインフルエンザウィルスＡ複製の阻止を示すグラフで ある。第３Ａ図は感染の３０分前に添加された５−ＯＤＮの作用を示し、作用の 全体的評価を連続的に示している。第３Ｂ図は感染の２４時間前に添加した５− ＯＤＮの作用を示すと共に、この作用の全体的評価を連続的に示し、ウィルス収 率はへマグルチニン（ＨＡ）タイターを試験して決定される。第３Ｃ図は、第３ Ｂ図につき説明したように添加したＳ−ＯＤＮの作用を示す。ウィルス収率は、 ＭＤＣＫ細胞に対する感染性ウィルスの滴定によって決定される。
第４図は５−ＯＤＮによるインフルエンザＣウィルスの投与量依存性阻止を示す グラフである。
第５図は５−ＯＤＮ４によるインフルエンザＣウィルス複製の配列特異性阻止を 示すグラフである。
第６図は０ＤＮ１〜９のコンピュータ配列分析の結果本発明は、インフルエンザ ウィルスＲＮＡの選択領域にハイブリダイズすると共にコード産生物を合成する ための雛型として作用する能力を阻止（減少もしくは除去）してインフルエンザ ウィルス複製および／または遺伝子発現の全体的もしくは部分的阻止をもたらす オリゴヌクレオチドの使用により、細胞におけるインフルエンザウィルス複製を 阻止（減少もしくは防止）する方法に関するものである。さらに本発明は、ウィ ルス複製に必要なウィルスゲノムの選択領域にハイブリダイズすると共にコード 産生物（ＲＮＡ、ＤＮＡ、蛋白）を合成するための雛型として作用する能力を阻 止する能力の結果として、インフルエンザウィルスに対し抗ウィルス活性を有す る（すなわち複製を減少もしくは防止する）オリゴヌクレオチドに関するもので ある。本発明のオリゴヌクレオチドは改変型または未改変型とすることができ、 オリゴデオキシヌクレオチドもしくはオリゴリボヌクレオチドとすることができ る。
さらに本発明は、インフルエンザウィルスに対し抗ウィルス活性を有するオリゴ ヌクレオチドを含む組成物にも関する。この種の組成物は、本発明の方法によれ ば、インフルエンザウィルスの作用を減少させる目的で個人に投与される。オリ ゴヌクレオチドは、インフルエンザウィルスによる感染の前または感染が生じた 後に個人に投与することができる。
ここに説明したように、インフルエンザウィルスＲＮＡの選択領域に対し相補的 な改変ＯＤＮ　（たとえば、ここに５−ＯＤＮとして示したホスホロチオエート 誘導体）はインフルエンザＡウィルスおよびインフルエンザＣウィルスの複製を 阻止することが示された。用いる濃度において、インフルエンザウィルスＲＮＡ の選択領域に対し相補的な未改変ＯＤＮ　（ここでは０−ＯＤＮとして示す）は インフルエンザウィルス複製を阻止しなかった。
しかしながら、より高濃度にて未改変オリゴデオキシヌクレオチドはインフルエ ンザウィルス複製を阻止するのに有効であり、その効果はここに記載した方法を 用いて評価することができる。
以下、本発明の方法によるインフルエンザＡウィルスおよびインフルエンザＣウ ィルスの阻止につき説明する。
以下の説明は本発明による方法およびこれら特定インフルエンザウィルスの選択 領域に対しハイブリダイズするオリゴデオキシヌクレオチドの使用に関するもの であるが、本発明の方法は他の種類のインフルエンザウィルス（たとえばインフ ルエンザＣウィルス）の阻止にも有用である。さらに本発明の方法は、ここに特 定的に記載した以外のインフルエンザウィルスＲＮＡの領域にハイブリダイズす る改変オリゴヌクレオチドを用いても行なうことができる。ウィルス複製に必要 なインフルエンザウィルスＲＮＡの領域（特に種々異なるウィルスで保持される 領域）が本発明の改変オリゴヌクレオチドに適する標的である。インフルエンザ ウィルスＲＮＡのこれら領域は、インフルエンザウィルスゲノムストランドの３ ′末端に共通の１３ヌクレオチド：インフルエンザウィルスＲＮＡの５′末端に おける保持ヌクレオチド領域：ＰＢ１ポリメラーゼをコードする配列の部分また は全体（特に、その触媒部位のＡｓｐ−Ａｓｐモチーフ）；ポリメラーゼ関連蛋 白ＰＢ２およびＰＡの触媒部位；ニウラミニダーゼ蛋白の触媒部位；並びにＨＥ 、ＮＰＳＭおよびＮＳ蛋白の不変セグメントを包含する。
これら３種のインフルエンザウィルスＲＮＡ　（ウィルスＲＮＡ、ｍＲＮＡおよ び相補ＲＮＡ）のいずれか１種または全部が、本発明のオリゴヌクレオチドに対 する有力な標的である。これら３種類を第１図に示す。（＝）−ストランドのウ ィルスゲノム、たとえばインフルエンザウィルスに存在するような（−）ｖＲＮ Ａと称するウィルスＲＮＡは、ｍＲＮＡに変換しうる（＋）−ストランドＲＮＡ のウィルスレブリカーゼによる合成の雛型として作用する。ｍＲＮＡに対し相補 的なオリゴマーをアンチセンスＲＮＡと称することができる。ウィルス（（−） ｖＲＮＡ）に相補的であるオリゴマーはウィルスＲＮＡに対しアンチセンスと見 なすことができ、第１図に示したように（＋）ｃＲＮＡと称する。本発明の方法 にお゛いては、これら３種のいずれかのインフルエンザウィルスＲＮＡにハイブ リダイズしうるオリゴヌクレオチドを個々に或いは他の種類のオリゴヌクレオチ ドのいずれかまたは両者と組合せて使用することができる。たとえば、インフル エンザウィルスｍ　ＲＮ　Ａにハイブリダイズしつる改変オリゴヌクレオチドを 、細胞中に単独で或いはインフルエンザウィルスｖＲＮＡにハイブリダイズしつ る改変オリゴヌクレオチドおよび／またはインフルエンザウィルスｃＲＮＡにハ イブリダイズしうる改変オリゴヌクレオチドと組合せて導入することができる。
本発明の方法に使用するオリゴヌクレオチドの長さは、たとえばこれらがハイブ リダイズするインフルエンザウィルスＲＮＡの選択領域に応じて変化する。典型 的には、これらは少なくとも６個のヌクレオチドの長さであり、好適具体例にお いては１７〜２５個のヌクレオチド、の長さである。
選択されたインフルエンザウィルスＲＮＡ配列においては、ウィルス複製に必須 の領域が選択される。この領域にハイブリダイズしうる改変オリゴヌクレオチド は、相補ヌクレオチド配列のハイブリッド化に適する条件下で細胞にて産生され ると共に導入される。この種の条件下で、インフルエンザウィルスＲＮＡと導入 された相補改変オリゴヌクレオチドとのハイブリッド化が生ずる。
このハイブリッド化はウィルスＲＮＡに存在する配列の選択のため極めて特異性 であるが、ヒト細胞ＤＮＡには存在しないと思われる。インフルエンザウィルス に対し抗ウィルス活性を有する改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、 本発明の方法に有用であるインフルエンザウィルスＲＮＡの領域に対し全体的（ １００％）に相補的である必要はない。改変オリゴヌクレオチドのヌクレオチド 配列を、これが使用条件下で領域にハイブリダイズすると共にハイブリッド状態 に維持されるよう充分にインフルエンザウィルスＲＮＡの選択領域に対し相補的 とすることのみが必要である。　、ここに記載しかつ例示したように、インフル エンザウィルスＲＮＡの領域にハイブリダイズするオリゴデオキシヌクレオチド のホスホロチオエート誘導体（ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド もしくはＳ−ＯＤＮ）は、ウィルス複製を阻止するのに効果的であることが示さ れた。インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３のＰＢＩ　ＲＮＡを、アンチセンスオリ ゴヌクレオチドによる阻止のための標的として最初に選択した。インフルエンザ Ａ／ＷＳＮ／３３のＰＢＩ　ＲＮＡは、次の理由により標的として選択した＝　 （ｉ）インフルエンザウィルス蛋白ＦＢＩは、ウィルスＲＮＡの転写および複製 に必要とされるポリメラーゼ複合体の部分である。ＦＢＩ蛋白はこの複合体の最 も高度に保持された蛋白であり、多くのＲＮＡポリメラーゼに見られるＡｓｐ− ＡｓｐモチーフがインフルエンザＡ、ＢおよびＣウィルスに保持される唯一もの である。これらを総合して、ウィルス増殖に関するＦＢＩ遺伝子の重要な機能が 示唆され、その発現の阻止はウィルスタイターの減少をもたらすと思われる。
（ｉｉ）インフルエンザウィルスポリメラーゼｍＲＮＡは、他のウィルスｍＲＮ Ａと対比して、感染細胞では比重するには、より低細胞内濃度の５−ＯＤＮが必 要とされる。（ｉ　ｉ　１）ＦＢＩ遺伝子の末端が標的として選択された。何故 なら、インフルエンザウィルスのゲノムセグメントにおいては３′および５′末 端で高度の保持が観察されたからである。したがってＯＤＮ配列の１部が種々異 なるＲＮＡセグメントで保持されれば、これはＰＢ１遺伝子だけでなく他の数種 の遺伝子をも阻止する［インフルエンザＣウィルスゲノムにおけるＯＤＮ標的部 位のコンピュータ分析の結果を実施例１で検討する］。
特に、インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウイルスもしくはインフルエンザＣ／Ｊ 　Ｊ１５０ウイルスのポリメラーゼＦＢＩ遺伝子に対し相補的である５−ＯＤＮ は、それぞれインフルエンザＡウィルスおよびインフルエンザＣウィルスの複製 を阻止した。試験した濃度にて、同じ配列の未改変オリゴデオキシヌクレオチド （すなわちインフルエンザウィルス型のポリメラーゼＦＢＩ遺伝子に対応）はい ずれのウィルスの複製をも阻止しえなかった。
より高い濃度については試験しなかったが、より高濃度にてこれらはＨＩＶに対 する未改変および改変オリゴマーの試験の結果により示唆されるように阻止性で あると思われる。
例示のため５−ＯＤＮの作用を実施例２および３で説明する。要するに、これら の作用は次のように示された。
３種全てのインフルエンザウィルスもしくはウィルス特異性ＲＮＡはアンチセン スＯＤＮに対する可能な標的であるため、＋および−の配向におけるウィルス配 列に相補的または同一の未改変型（０−ＯＤＮ）および改変型（Ｓ−ＯＤＮ）を 公知技術（実施例１参照）を用いて合成すると共に試験した。合成されかつ試験 されたＯＤＮの配列を表に示す（これらＯＤＮの説明についてはさらに実施例１ を参照）。使用した各配列は長さ２０個のヌクレオチドであった。ＯＤＮに対し 相補的またはこれと同一であるインフルエンザウィルスゲノムの領域を図１に大 活字で示し、開始コドンに下線を施す。インフルエンザＡおよびＣのポリメラー ゼＰＢＩ　ＲＮＡを標的とするＯＤＮの他、特定インフルエンザウィルス配列に 対しミスマツチを含むＯＤＮを生産させかつ試験した（生産されるミスマツチの 説明については実施例１参照）。
０−ＯＤＮおよび５−ＯＤＮのインフルエンザＡウィルスに対する抗ウィルス作 用の試験を実施例２に記載したように行なった。マシン・ダービ一種の犬の腎臓 （ＭＤＣＫ）細胞を、実施例２に記載したように感染前および再び感染後にオリ ゴヌクレオチドで処理した。インフルエンザＣウィルスに対する０−ＯＤＮおよ び５−ＯＤＮの抗ウィルス作用の試験を実施例３に記載したように同様に行なっ た。
使用した濃度において、未改変ＯＤＮはインフルエンザＡウィルス（第２Ａ図） またはインフルエンザＣウィルス（第５図）のいずれに対しても活性でないと判 明した。ＨＩＶに対しＯＤＮの作用を評価して得られたデ−夕に基づき、未改変 ０−ＯＤＮは細胞外および／または細胞内で急速に分解するため有効でないと思 われる。インフルエンザウィルスＲＮＡに対し相補的な未改変ＯＤＮは、インフ ルエンザウィルスを阻止する能力につきここに使用しかつ試験したよりも高濃度 にて細胞中に導入することができる。より高い濃度はウィルスを阻止すると予想 するのが合理的である。
ホスホロチオエート誘導体は、インフルエンザＡウィルスを用いる複数サイクル および単一サイクルの複製実験で一致した阻止的抗ウィルス活性を示した（第２ Ｂおれ、恐らく化合物の細胞毒性作用の結果でない。この観察は幾つかの証拠に よって裏付けられる。第１に、ＭＤＣＫ細胞の単層が、８０μモルの５−ＯＤＮ 化合物で処理された未感染比較細胞にて実験全体にわたり無傷であると判明した 。第２に、完全に除去せずに５−ＯＤＮ遅延されたインフルエンザＡウィルス複 製（第３図）は、５−ＯＤＮで処理してから４日間後に遅く細胞がウィルス複製 を支持しうろことを示す。第３に、これら化合物は、抗ウィルス活性を示さない ０−ＯＤＮにつき使用したと同じ方法により精製された。したがって、観察され た作用は調製物における不純物に起因しないと思われる。
しかしながら、この作用は第６図に示したように特定配列と相関せず、２０個の 隣接ヌクレオチドのうち少なくとも８個がコンピュータ分析により決定されたよ うに試験された全配列につきハイブリダイズする。さらに、ウィルス複製に対す るミスマツチ５−ＯＤＮの作用はＨＩＶの場合にも認められた。さらに５−ＯＤ Ｎは逆転写酵素、並びに恐らく他の酵素および蛋白に対し相互作用することも知 られている。
インフルエンザＣウィルス複製は、５−ＯＤＮ４を用いて配列特異的に阻止する ことができた。媒体中に２０μモルの濃度で存在する場合、この化合物は試験し た他のいずれの配列よりも少なくとも１０倍活性が大であつた（第５図）。同じ 配列は同じ分析システムを用い、てインフルエンザＡウィルス複製に対し作用を 示さなかった（データ示さず）。より高濃度にて、インフルエンザウィルス増殖 の一層劇的な減少が観察された（第４図）。
相補配列５−ＯＤＮ３は不活性であると判明した（第５図）。コンピュータ分析 を行なって、試験したＯＤＮ配列とインフルエンザＣウィルスゲノムとの間の配 列同一性の程度を検査した。７個のウィルスＲＮＡセグメントのうち６個が、０ ＤＮ４における少なくとも１３個のヌクレオチドに対し相補的であると判明した （第６図）。
５−ＯＤＮ５における単一ミスマツチの導入は１０個のヌクレオチドに対し相補 的な配列の程度を減少させるが、６個のＲＮＡセグメントが有力な標的に留まっ た。これは、この化合物が２０μモル濃度にて抗ウィルス活性を維持することを 説明しうる（第５図）。５−ＯＤＮ６の三重ミスマツチ配列を含む他の比較はい ずれも抗ウィルス活性を示さず（第５図）、さらにいずれもインフルエンザＣウ ィルスゲノムの８個より多い隣接ヌクレオチドに対し相補的でなかった（第６図 ）。０−ＯＤＮの場合、オリゴマーとＲＮＡとの間の１個もしくは２個のミスマ ツチは複合体のＲＮアーゼＨ感度を喪失しうることが最近判明した。これらを総 合して、５−ＯＤＮが抗インフルエンザＣウィルス作用を示すには、この標的部 位変動において（−）−ストランドウィルスＲＮＡに対し相補的な１０個以上の 隣接ヌクレオチドを有することが重要である。ウィルス阻止に対するハイブリッ ド化ミスマツチの作用は可変であって、ウィルスゲノムの第２構造および他の特 徴に依存する。
５−ＯＤＮ４は位置２〜２１にてインフルエンザＣウィルス（−）−ストランド ウィルスＲＮＡに対し相補的であるのに対し、５−ＯＤＮ２は位置８〜２７にて インフルエンザＡウィルス（−）−ストランドウィルスＲＮＡに対し相補的であ る（第１図）。したがって、位置２〜２１にてインフルエンザウィルス ウィルスＲＮＡに対し相補的な５−ＯＤＮ　（５’　−ＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＧ ＣＡＡＡＣＣＡＴＴ−３’　）を合成すると共に、抗ウイルスインフルエンザ活 性につき試験した。この場合も、この化合物はミスマツチの比較５−ＯＤＮより も活性が大でないと判明した。インフルエンザＡウィルスとＣウィルスとの間の この差は謎であるが、これらウィルスの極めて異なる複製速度を考慮すべきであ る。たとえばインフルエンザＣウィルスのようなゆっくり複製するウィルスは、 たとえばインフルエンザＡのような急速増殖するウィルスよりもずっと良好なア ンチセンスＯＤＮ阻止の標的となりつる。
各インフルエンザウィルスの３′−および５′−末端はハイブリダイズする相補 的範囲を形成することが知られている。この範囲において領域はポリメラーゼ複 合体および宿主ｍ　ＲＮ　Ａのセグメントであって、ポリメラーゼに対するプラ イマーとし作用する。ＯＤＮによるハイブリッド化阻止につきここに説明したよ うに選択した領域はしたがって上記理由から種々の程度で妨げられ、インフルエ ンザＡウィルスとＣウィルスとの間の阻止の相違を説明することができる。
かくして、インフルエンザウィルス複製は、ウィルスＲ，Ｍ　Ａの選択領域に対 し相補的な改変オリゴデオキシヌクレオチドの活性により細胞内で阻止しうるこ とが示された。上記改変オリゴデオキシヌクレオチドはホスホロチオエート誘導 体である。しかしなから、たとえばインターヌクレオシドホスホロアミデートま たはメチルホスホネートのような他の改変も導入することができる。得られる改 変オリゴヌクレオチドは、たとえばインフルエンザウィルスに対するその抗ウィ ル・ス活性につき実施例２および３に記載した方法で試験することができる。２ 種の分析法につき実施例２および３で説明する：すなわち（１）インフルエンザ ウィルス粒子の全数（すなわち感染性および非感染性粒子の両者）を測定するヘ マグルチニン分析、および（２）感染性インフルエンザウィルス粒子のみを検出 するプラク滴定。
オリゴヌクレオチドの改変はヌクレオシド間結合の部分または全部、或いはオリ ゴヌクレオチドのいずれか一方の末端または両端部とすることができる。さらに 、改変核酸塩基および／または存在する糖分子における改変（たとえばアラビノ ースはリボースを置換することができる）を導入することができる。
ヒトにおけるインフルエンザウィルスの阻止内部標識されたＰ３２−オリゴマー を用いて、ここに説明した改変オリゴデオキシヌクレオチドが各種の細胞（たと えば生存する兎の肝臓、腎臓、牌蔵、筋肉、脳および白血球）に侵入することが 示された。組織培養におけるインフルエンザウィルスの阻止から得られた情報に 基づき、人間における同様なインフルエンザウィルスの阻止につき対策を立てる ことができる。
特定個人を処置する際に使用される対策は、個人の状態および処置の目的に依存 する。本発明の改変オリゴデオキシヌクレオチドを、インフルエンザウィルスに よる感染の徴候を示さないがたとえばインフルエンザ「流行」に露呈された個人 またはウィルスにより既に感染した個人（たとえば臨床的徴候により評価）に投 与することができる。前者の場合は改変オリゴデオキシヌクレオチドを用いてイ ンフルエンザウィルスの作用を予防的に、或いは後者の場合は治療的に防止また は減少させる。
しかしながら、いずれの処理の場合にも、改変オリゴヌクレオチドはこれらオリ ゴヌクレオチドを最初に血流中に次いで細胞中に到達させつるよう個人に投与せ ねばならない。改変オリゴヌクレオチドは静脈注射、静脈点滴により或いは経口 的（たとえばカプセル型）に投与することができる。その結果、オリゴヌクレオ チドは所望の効果を示すことができ、すなわち細胞中に達してウィルス複製を遅 延させ或いは防止し、かつ／またはまだ未感染の細胞に到達して保護を与える。
投与すべき量は、たとえば患者の体格および年齢、病気の段階、並びに投与すべ き改変オリゴヌクレオチドの種類のような因子と共に変化する。
以下、限定はしないが実施例により本発明をさらに説オリゴヌクレオチドを自動 合成装置（ビオサーチ８７００型、ミリゲン社、ベッドフォード、マサチューセ ッツ州）で合成した。０−ＯＤＮと５−ＯＤＮとの両者をＨ−ホスホネート化学 により組立てた。０−ＯＤＮおよび５−ＯＤＮの合成および精製は、従来報告さ れた方法により行なった［Ｓ、アグラワル等、プロシーディング・ナショナル・ アカデミ−ｅサイエンス、ＵＳＡ、第８６巻、第７７９０〜７７９４頁（１９８ ９）］。
用いたＯＤＮ 全部で３種のウィルス特異性ＲＮＡ　（ウィルスＲＮＡ。
ｍＲＮＡおよび相補ＲＮＡ）は、アンチセンスＯＤＮの有力な標的である（第１ 図参照）。したがって、＋もしくは一配向におけるウィルス配列に対応した未改 変ＯＤＮ　（０−ＯＤＮ）およびホスホロチオエート誘導体（Ｓ−ＯＤＮ）を合 成すると共に抗ウィルス活性につき試験した。試験したＯＤＮの配列を表Ｉに示 す。
ＯＤＮ／ ５−ＯＤＮ　配列 １　５’−ＣＡＴＴＣＡＡＡＴＧＧＴＴＴＧＣＣＴＧＣ−３’　（−）方向　Ａ ／ＷＳＮ／３３２　５’　−ＧＣＡＧＧＣＡＡＡＣＣＡＴＴＴＧＡＡＴＧ−３’ 　（＋）方向　Ａ／ＷＳＮ／３３３　５’−ＣＣＡＴＡＡＴＣＣＣＣＴＧＣＴＴ ＣＴＧＣ−３’　（−）方向　Ｃ／ＪＪ１５０４　５’−ＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧ ＧＧＧＡＴＴＡＴＧＧ−３’　（＋）方向　Ｃ／ＪＪ１５０１つのミスマツチを 有する５−ＯＤＮ４６　５’−ＧＣＡ工ＡＡＧＣＡＧΔＧＧＡＴＣＡＴＧ３つの ミスマツチを有する５−ＯＤＮ４７　５’−ＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＧＡＧ ＧＣＴＴ−３′　ミスマツチ ａ　５’−ＡＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＡＧＡＧＡＴ−３′　ミスマツチ ９　５’−ＣＧＴＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＡＧＴＣＣＴＡ−３′　ミスマツチ ０ＤＮ１〜２および３〜４は、それぞれインフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３ウィル ス［Ｎ、シバスブラマニアンおよびり、Ｐ、ナヤク、ジャーナル・パイロロジー 、第４４巻、第３２１〜３２９９頁（１９８２）］およびＣ／ＪＪ１５０ウィル ス［Ｍ、ヤマシタ等、パイロロジー、第１７１巻、第４５８〜４６６頁（１９８ ９）コのポリメラーゼＰＢＩ　ＲＮＡに対する標的である。ＯＤＮに対応するウ ィルスゲノムの領域を第１図に大活字で示し、開始コドンに下線を施す。０ＤＮ ５〜９は特定インフルエンザウィルス配列に対し異なる個数のミスマツチを有す る。特に、ＯＤ　Ｎ　５’および０ＤＮ６は示した位置（下線）にポイント突然 変異を導入して０ＤＮ４から誘導される。０ＤＮ７〜９は、インフルエンザウィ ルスゲノムには見られな配列を示す。
各配列につき８種までの異なるバッチのオリゴマーを合成した。各バッチを少な くとも２つの独立した実験にて試験し、匹敵しうる結果を与えた。
０ＤＮ１のホスホロチオエート誘導体（Ｓ−ＯＤＮＩ）および０ＤＮ２のホスホ ロチオエート誘導体（Ｓ−ＯＤＮ２）を合成した。２種の異なる比較配列５−Ｏ ＤＮ８および５−ＯＤＮ９をも同様に作成した。５−ＯＤＮ８および５−ＯＤＮ ９をコンピュータ配列分析によりインフルエンザＣウィルスゲノムにおけるその 発生につき検ＶＭＳ４．６操作システムで作動するＶ　ａ　ｘ　１１　／　７８ ０コンピユータで配列分析を行なった。ゲネチックス・コンピュータ・グループ ［マジソン、ウィスコンシン州］による配列分析ソフトウェア・パッケージのバ ージョン６．１を用いた［Ｊ、デブロー等、ヌレクイック・アシッド・リサーチ 、第１２巻、第３８７〜３９５頁（１９８４）］。ウィルバーおよびリップマン のアルゴリズム［Ｗ、Ｊ、ウィルバーおよびり、Ｊ、リップマン、プロシーディ ング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス、ＵＳＡ、第８０巻、第７２６〜７ ３０頁（１９８３）］に基づくワードサーチ・プログラムを用いて、ＯＤＮ配列 の少なくとも８個の連続ヌクレオチドと同一であるインフルエンザＣウィルスゲ ノムにおける領域を同定した。これは、標識をｒ＋　十十＋　十＋　十＋Ｊに設 定すると共に該当配列０ＤＮ１〜９につきデータベースをサーチして行なった。
データベースは、ジエンバンクレリース６０．０に見られるインフルエンザＣウ ィルス配列およびＣウィルスポリメラーゼ遺伝子の配列で構成した［Ｍ。
ヤマシタ等、パイロロジー、第１７１巻、第４５８〜４６６頁（１９８９）］。
５−ＯＤＮ８および５−ＯＤＮ９はインフルエンザＡウィルスの（−）ストラン ドウィルスＲＮＡと共に１０個以下の連続ヌクレオチドを共有することが判明し た。ＯＤＮの濃度は、各配列に存在するヌクレオチドのモル吸光係数を考慮して 、２６０ｎｍにおける吸光度により測定した［Ｆ、Ｍ、アウスベル等、カレント ・プロトコールスｅイン・モレキュラ嚇バイオロジー（ウィリー社、ニューヨー ク）（１９８７）］。
インフルエンザＡ／ＷＳＮ／２２（ｔｓ　）ウィルスをマシン・ダービイ種の犬 腎臓（ＭＤＣＫ）細胞にて上記したように増殖させた［Ａ、に、シギウラ等、ジ ャーナル・パイロロジー、第１０巻、第６３９〜６４７頁（１９７２）］。イン フルエンザＣ／Ｊ　Ｊ１５　Ｑウィルスを、】、１日齢の胚形成鶏卵の羊膜にて ３５℃で増殖さＭＤＣＫ細胞（穴１個当り２×１０５個の細胞）を２４穴の皿（ タンク）に接種し、１晩にわたり成長させた。
翌日、細胞を燐酸塩緩衝塩水（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で洗浄し、ＯＤＮを含有する０、２ ％牛血清アルブミン（ＭＥＭ−ＢＡ）を含んだ２００μｍの最小必須培地を各穴 に添加した。
化合物を添加してから種々の時間の後、ＭＥＭ−ＢＡ中に２×１０５プラグ形成 単位（ｐ　ｆ　ｕ）を含有する５０μ；のウィルス試料を穴１個当りに添加した 。成る実験においては、穴１個当り僅か２００ｐｆｕのみを用いて複数サイクル の複製を行なった。３７℃にて２５分間にわたり吸着させた後、細胞をＰＢＳで ２回洗浄し、ｏＤＮとトリプシン（３μｇ／ｌ）とを含有する１１のＭＥＭ−Ｂ Ａを添加した。細胞を３７℃または３３℃のいずれかで培養し、培地の試料を感 染後の種々の時間でヘマグルチニン分析用およびＭＤＣＫ細胞における滴定用と して採取した。
プラク形成分析 ＭＤＣＫ細胞を３５ｍｍの皿で成長させた。融合細胞に一連のウィルスの１＝１ ０希釈物を感染させた（皿１枚当り１００μｍ）。感染させてから１時間の後、 接種物を吸引すると共に１ｍｌ当り３μｇのトリプシンと示した濃度のＯＤＮと を含有する寒天オーバーレイ（皿１枚当り２．　４ｍ１）を添加した。細胞を３ ７℃にて２．５日間（インフルエンザＡウィルス）または３３℃にて４〜５日間 （インフルエンザＣウィルス）のいずれかで培養した。
上記の方法を用い、未改変ＯＤＮをインフルエンザＡウィルスを用いて抗ウィル ス活性につき試験した。０−ＯＤＮＩ、０−ＯＤＮ２および０−ＯＤＮ７　（表 および第１図）を合成すると共に抗ウィルス活性につき分析した。細胞を低倍率 の感染（ｍａｔ）（０，００１）で感染させて、ウィルスの複数サイクル複製を 可能にした。
００ＤＮを感染の３０分前に添加し、さらに感染してから２４時間後に添加した 。培地における濃度は８０．２７および９μモルとした。いずれの濃度において も抗ウィルス活性は観察されなかった（第２Ａ図およびデータ示さず）。同様な 結果がインフルエンザＣウィルスについても得られた（下記参照）。
複数サイクル（ｍａｔ　０．００１）および単一サイクル（ｍｏｆ　１）の条件 下でウィルス複製につき試験した。殆どの実験は３７℃にて行なったが、成る種 の感染については３３℃の温度を選択した。作用メカニズムがウィルスＲＮＡに 対する５−ＯＤＮのハイブリッド化を含む場合、この実験条件は抗ウィルス作用 を増大させうると思われた。３３℃およびｍａｉ　ｌで行なった典型的な実験の 結果を第２Ｂ図に示す。試験した全配列は、ホスホロチオエート型で加えた場合 、インフルエンザＡウィルスの増殖を阻止することが判明した。しかしながら、 ミスマツチのオリゴマーによる阻止も観察された。
予想通り、抗ウィルス作用は複数サイクルの複製条件下で極めて強力であり（第 ３Ａ図）　、５−ＯＤＮでの細胞の予備処理によりさらに増大させることができ た（第３Ｂおよび０図）。これら条件下で化合物は１．２５μモル程度に低い濃 度にて活性であった（第３図およびデータ示さず）。
実施例３ Ｓ−ＯＤＮ４を用いるインフルエンザＣウィルスの阻止インフルエンザＣウィル スはインフルエンザＡウィルスよりも遅く増殖し、実験期間がより長くなる。し たがって、より迅速な分析システムをＡウィルスにつき用いてインフルエンザＣ ウィルスの阻止を決定した。要するに、５−ＯＤＮを寒天オーバーレイに添加す ると共に、プラクを培養期間の終了後にカウントした。予備実験においてインフ ルエンザＡウィルスをこのシステムで分析し、ここでもミスマツチのオリゴマー による阻止が得られた（データ示さず）。インフルエンザＣウィルスに対し試験 した配列は５−ＯＤＮ３　（Ｃウィルスの（＋）−ＲＮＡに対し相補的）　、５ −ＯＤＮ４　（Ｃウィルスの（−）−ＲＮＡに対し相補的）および５−ＯＤＮ７ 　（ＨＩＶ−１のポリ（Ａ）信号に対し相補的）を含んだ。８０ｐモルの濃度で 行なった最初の実験において、５−ＯＤＮ４を用いた場合はインフルエンザＣウ ィルスプラグ形成の完全阻止が観察されたが、５−ＯＤＮ３もしくは５−ＯＤＮ ７では観察されなかった。この結果を確認するため、５−ＯＤＮ４を３種の異な るバッチで合成した。
各バッチを２つの独立した実験で試験し、実質的に同じ結果が得られた。次いで 濃度依存性につき検査した。配列特異性の抗ウィルス作用が２０ｐモル程度に低 い濃度で観察された（第４図）。さらに特異性の程度を規定す６）ミスマツチの ５−ＯＤＮ４の誘導体（第１図）を使用した。５−ＯＤＮ５は、２０μモルの濃 度にて５−ＯＤＮ４よりも顕著に活性が低かった（第５図）。Ｓ−ＯＤＮ６、並 びに相補配列５−ＯＤＮ３を含む各種の他の比較配列はその濃度にて不活性であ ることが判明した（第５図）。ホスホロジエステル誘導体０−ＯＤＮ４は、試験 した全ての濃度にて完全に不活性であった（第５図、動物＝　６９匹の雌Ｂ　ａ 　１　ｂ　／　ｃネズミ（６週齢）ウィルス：インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３ ４感染ご　エアロゾルとして（０日目） オリゴス：無菌塩水に溶解し、０日、１日および２日目に投与（感染の１時間前 、並びに感染の２４時間および４８時間後） 投与方式：１ｍｇを鼻孔内（ｉ、ｎ、）（エーテル麻酔下）または０．５ｍｇ（ ｉ、　ｎ、）および０．５ｎｇの腹腔内（ｉ、ｐ、）。比較として塩水をｉ、ｎ 、および’ｒ、ｐ、で投与した。
実験 ３５匹のネズミ（群Ａ）を、肺からの感染性ウィルスを測定すべく３日目に殺し た（測定値をＰ　ｆ　ｕ／肺容積１として示す）。３４匹のネズミ（群Ｂ）を生 存につき観察した。
４（±１．　０）　Ｘ　１０８ｐ　ｆ　ｌ／ｍ１６．６（上２゜７）ＸＩＯ８ｐ 　ｆ　ｌ／ｍ１（ｎ＝４） ｖＲＮＡに対し相補的な１ｍｇのオリゴデオキシヌクレオチド（表１におけるｏ ｐｍ２）を投与した動物のウィルス測定値は、比較動物における場合の約半分で あった。
全ネズミは５日目と７日目との間に死滅した。
明した本発明の特定実施例につき多くの改変をなしうろことを了解し或いは確認 することができるであろう。これら多（の改変も本発明の範囲内に包含すること を意図する。
ＦＩＧ、２Ａ 時間　（ｈｒｓ、　ｐ、１．） ＦＩＧ　３Ａ 時間（ｈｒｓ、　ｐ、１．） プラク数 濃度　（ｕＭ） ２０μＭ ■ベロ区口１ＩＯＩＩＩＩ も セ 要約書 インフルエンザウィルスＲＮＡの選択領域にハイブリダイズすると共にコード産 生物の合成につき雛型として作用する能力を阻害する天然（未改変）もしくは改 変オリゴヌクレオチド（オリゴデオキシヌクレオチドもしくはオリゴリボヌクレ オチド）の活性を介しインフルエンザウィルス複製を阻止する方法につき開示す る。インフると共にコード産生物の合成につき雛型として作用する能力を阻止す る能力を有する結果、インフルエンザウィルスに対し抗ウィルス活性を有するオ リゴヌクレオチド（未改変または改変）、並びにこれらオリゴヌクレオチドを含 む組成物につき開示する。
国際調査報告 国際調査報告

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. １．インフルエンザウィルスを有する細胞におけるインフルエンザウィルス複製 を阻止する組成物を製造するための、インフルエンザウィルス複製に必須である インフルエンザウィルスＲＮＡの選択領域にハイブリダイズするオリゴヌクレオ チドまたは改変オリゴヌクレオチドの使用。
  2. ２．オリゴヌクレオチドが、たとえばインフルエンザＡウィルスのポリメラーゼ ＰＢ１　ＲＮＡおよびインフルエンザＣウィルスのポリメラーゼＰＢ１　ＲＮＡ から選択されるインフルエンザポリメラーゼＰＢ１ＲＮＡの領域にハイブリダイ ズする請求の範囲第１項に記載の使用。
  3. ３．オリゴヌクレオチドがホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドであ る請求の範囲第１項または第２項に記載の使用。
  4. ４．ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのヌクレオチド配列が： １【配列があります】 ２【配列があります】 ３【配列があります】 ４【配列があります】 ５【配列があります】 ６【配列があります】 ７【配列があります】 ８【配列があります】 ９【配列があります】 よりなる群から選択される請求の範囲第３項に記載の使用。
  5. ５．インフルエンザウィルスを有する細胞におけるインフルエンザ複製を阻止す る薬物を製造するための、インフルエンザウィルス増殖に必須であるインフルエ ンザウィルスＲＮＡの選択領域にハイブリダイズする改変オリゴデオキシヌクレ オチドの使用。
  6. ６．オリゴヌクレオチドが、インフルエンザウィルスＲＮＡの転写、複製または 転写と複製に必要な蛋白をコードするインフルエンザウィルスＲＮＡの領域にハ イブリダイズする請求の範囲第５項に記載の使用。
  7. ７．オリヌクレオチドが、インフルエンザウィルスＲＮＡの転写、複製または転 写と複製に必要な保持インフルエンザウィルス蛋白をコードするインフルエンザ ウィルスＲＮＡの領域にハイブリダイズする請求の範囲第６項に記載の使用。
  8. ８．オリゴヌクレオチドがインフルエンザポリメラーゼＰＢ１ＲＮＡ遺伝子の領 域にハイブリダイズし、薬物がインフルエンザＡウィルスもしくはインフルエン ザＣウィルスを阻止する請求の範囲第５項に記載の使用。
  9. ９．改変オリゴデオキシヌクレオチドが長さ２０個のヌクレオチドであるホスホ ロチオエートオリゴデ、オキシヌクレオチドであり、次の配列 １【配列があります】 ２【配列があります】 ３【配列があります】 ４【配列があります】 ５【配列があります】 ６【配列があります】 ７【配列があります】 ８【配列があります】 ９【配列があります】 よりなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する請求の範囲第８項に記載の 使用。
  10. １０．インフルエンザウィルスに対し抗ウィルス活性を有してインフルエンザに 対する予防剤を製造するための改変オリゴヌクレオチドの使用。
  11. １１．オリゴヌクレオチドが長さ２０個のヌクレオチドからなるホスホロチオエ ートオリゴデオキシヌクレオチドであり、インフルエンザウィルス増殖に必須の インフルエンザウィルスＲＮＡの領域、たとえばインフルエンザポリメラーゼＰ Ｂ１遺伝子にハイブリダイズする請求の範囲第１０項に記載の使用。
  12. １２．オリゴヌクレオチドが、配列 １【配列があります】 ２【配列があります】 ３【配列があります】 ４【配列があります】 ５【配列があります】 ６【配列があります】 ７【配列があります】 ８【配列があります】 ９【配列があります】 から選択されるヌクレオチド配列を有する請求の範囲第１１項に記載の使用。
  13. １３．インフルエンザウィルスに対し抗ウィルス活性を有する改変オリゴヌクレ オチド。
  14. １４．ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドであり、たとえば長さ２ ０個のヌクレオチドであってインフルエンザウィルス増殖に必須のインフルエン ザウィルスＲＮＡの領域、たとえばポリメラーゼＰＢ１遺伝子にハイブリダイズ する請求の範囲第１３項に記載の改変オリゴヌクレオチド。
  15. １５．ヌクレオチド配列が、配列 １【配列があります】 ２【配列があります】 ３【配列があります】 ４【配列があります】 ５【配列があります】 ６【配列があります】 ７【配列があります】 ８【配列があります】 ９【配列があります】 よりなる群から選択される請求の範囲第１４項に記載の改変オリゴヌクレオチド 。
  16. １６．インフルエンザウィルスに対し抗ウィルス活性を有する改変オリゴヌクレ オチドと生理学上適するキャリヤとからなる組成物。
  17. １７．インフルエンザウィルスに対し抗ウィルス活性を有するホスホロチオエー トオリゴデオキシヌクレオチドと生理学上適するキャリヤとからなり、ホスホロ チオエートオリゴデオキシヌクレオチドのヌクレオチド配列が、配列 １【配列があります】 ２【配列があります】 ３【配列があります】 ４【配列があります】 ５【配列があります】 ６【配列があります】 ７【配列があります】 ８【配列があります】 ９【配列があります】 よりなる群から選択されることを特徴とする細胞におけるインフルエンザウィル ス複製を阻止するため個人に投与する組成物。
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