WO2012070975A1 - Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения - Google Patents

Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения Download PDF

Info

Publication number
WO2012070975A1
WO2012070975A1 PCT/RU2010/000701 RU2010000701W WO2012070975A1 WO 2012070975 A1 WO2012070975 A1 WO 2012070975A1 RU 2010000701 W RU2010000701 W RU 2010000701W WO 2012070975 A1 WO2012070975 A1 WO 2012070975A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
modified peptides
oligopeptides
antiviral properties
properties according
Prior art date
Application number
PCT/RU2010/000701
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Борис Славинович ФАРБЕР
Софья Борисовна ФАРБЕР
Артур Викторович МАРТЫНОВ
Original Assignee
Farber Boris Slavinovich
Farber Sof Ya Borisovna
Martynov Artur Viktorovich
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Farber Boris Slavinovich, Farber Sof Ya Borisovna, Martynov Artur Viktorovich filed Critical Farber Boris Slavinovich
Priority to IN1230MUN2013 priority Critical patent/IN2013MN01230A/en
Priority to PCT/RU2010/000701 priority patent/WO2012070975A1/ru
Priority to EA201300487A priority patent/EA025624B1/ru
Priority to US12/931,467 priority patent/US20120129760A1/en
Publication of WO2012070975A1 publication Critical patent/WO2012070975A1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to veterinary medicine and, in particular, to virology, and is intended for the treatment of viral diseases of humans and animals.
  • Viral diseases account for more than 90% of all registered infectious diseases. But there are very few antiviral agents introduced into production. Such substances often have toxic properties, a small spectrum of action, an addictive effect quickly appears to them. Thus, the development of antiviral agents that would not have toxic properties, were effective in the treatment of a wide range of viral infections, is an urgent task of modern medicine. At the moment, very few substances are known that would be effective at all stages of viral infection. In addition to interferons and their inducers, there are no known substances that simultaneously combine the therapeutic and antiviral properties of relatively widespread viral diseases - HIV / AIDS, herpes, influenza, etc. The most famous treatment for influenza is remantadine.
  • This substance which blocks only the stage of virus penetration into the cell and the early stage of specific reproduction, does not affect the pathogenesis of the disease. Long-term use of this drug is impossible, because it has neurotropic effects and can cause hallucinations, impair brain function due to inhibition of the conduction of an impulse along the nerve fiber.
  • leukocyte a-interferon is known. This protein is synthesized in activated human white blood cells. It has the ability to cause influenza resistance in epithelial cells of the nasopharynx. But its healing properties are very insignificant. It is ineffective on the 2nd – 6th day of the flu disease and is a prophylactic. Recombinant interferons are expensive and often lead to allergic reactions. In addition, with the development of the disease, the effectiveness of interferon therapy decreases, and the resistance of the virus to interferon increases.
  • the closest prototype of the substance to be patented is modified proteins and their use for the control of viral infections [1]. It is processed- proteins: albumin, lactoferrin, transferrin, lactalbumin, different anhydrides and acylating agents. The authors also patented the mechanism of action of these proteins - inhibition of viral adhesion. These proteins should have a molecular weight of more than 60,000 with little variation. A significant prophylactic antiviral effect of these proteins was shown in experiments on cell cultures. Substances showed activity against HIV viruses (human and monkey), influenza, cytomegalovirus, poliovirus, Selmiki forest virus, Sendai virus, parainfluenza, Coxsackie virus. The authors showed that acylated proteins are non-toxic and can protect animals against infection with viruses.
  • the prototype has several drawbacks: it is a purely prophylactic agent (such proteins did not have a therapeutic effect on cells that are already infected with the virus) and does not have therapeutic properties in infected animals. Due to the fact that the prototype is a high molecular weight protein, it can be used only for parenteral use, the drug is an individual compound and does not constitute a dynamic self-organizing system and, accordingly, viruses will quickly adapt to the drug.
  • the basis of the invention is the task to synthesize modified peptides with antiviral properties and with a new mechanism of action, the use of which will significantly increase the effectiveness of treatment and reduce the treatment time for viral diseases such as influenza, herpes virus infections.
  • modified peptides with antiviral properties characterized in that they first partially hydrolyze the protein-containing raw material, and then carry out the process of chemical modification of the sum (ensemble) of the obtained oligopeptides with replacing the charge of their molecules with false.
  • the following proteins can be used for synthesis: ovalbumin (OA), human serum albumin (LSA), bovine serum albumin (BSA), a mixture of milk proteins (SMB), rabbit serum albumin (CSA), lysozyme (LC), lactoalbumin (LA), casein (KZ), soy protein (SB), their mixture, milk (M), whole egg white (CNF).
  • pepsin For enzymatic hydrolysis, pepsin, trypsin, chymotrypsin, papain, proteinase K, clostripain, thrombin, thermolysin, elastase can be used.
  • the synthesized oligopeptides are able to inhibit the activity of heterodimer ab - import cells, which transport viral polynucleotides from the cytoplasm to the nucleus. Accordingly, the inhibition of these transport proteins will lead to the blockade of viruses, rep which depends on the functions of the cell nucleus.
  • the drug is effective when administered orally.
  • the experiment confirmed the efficacy of the drug in influenza, herpes, in vivo and in ovo models, as described below.
  • An ensemble is a term from supramolecular chemistry.
  • the objects of supramolecular chemistry are supramolecular ensembles built spontaneously from complementary, that is, having geometrical and chemical correspondence of fragments, similar to spontaneous assembly of complex spatial structures in a living cell [ 2 , 3 ]
  • FIG. 1. Structures of chemical modifiers applicable for changing the charges of MP oligopeptide molecules
  • FIG. 2. Micrographs of infected and uninfected cells obtained using a luminescent microscope
  • FIG. 3. Photographs of rabbit eyes infected with and after herpes simplex virus type 1
  • FIG. 4. Electron micrographs of cell type herpesvirus infected cells - processed (2) and not processed (1) MP
  • Example 1 Obtaining a mixture (composition) of modified peptides (MP) with antiviral properties that are capable of self-organization in imported
  • ovalbumin is dissolved in 50 ml of distilled water, the pH is adjusted to 8.0 with 1 M sodium hydroxide solution, 5 mg of trypsin is added, the solution is left for 3-45 hours, ovalbumin is hydrolyzed to form a mixture of peptides. 501-2000 mg of succinic anhydride is added to this mixture, stirred at a temperature of 16-65 ° C for 20 minutes. The mixture is passed through membrane filters for sterilization and poured into glass vials.
  • transplantable cells of human and animal origin were used to determine the maximum tolerated concentration (MIC) in toxicological experiments and study the antiviral activity of the MP preparation:
  • Influenza viruses H3N2
  • vesicular stomatitis Indiana strain
  • coronavirus X 343/44
  • herpes simplex virus type 1 strain L-2
  • Example 2 The study of toxicity and the determination of the MPC of the MP preparation on cell cultures and chicken embryos
  • Two-day cell cultures with a well-formed cell monolayer were used to determine BMD.
  • the MP preparation was tested on four types of enumerated cells in 5 repetitions. In each experiment, at least 10 test tubes of each culture were used for the study. After removal of the growth medium from the tubes, 0.2 ml of the test solution and 0.8 ml of the supporting nutrient medium were added. Cell tubes were incubated at 37 ° C for 7-8 days. Controls were tubes with cell cultures to which the drug was not added.
  • the results were taken into account by the presence or absence of a cytopathic effect on the cells when viewed under a microscope at low magnification x10.
  • the degree of cytotoxic action was determined by changing the morphology of cells (rounding and wrinkling of cells, rejection of degenerated cells from glass) using the four-plus system from + to ++++.
  • the maximum tolerated concentration was determined by the maximum amount of a substance that did not cause a cytopathic effect on the cells. For this purpose, in various dilutions of the drug, 0.2 ml was added to the cell culture.
  • the marked place was disinfected with an alcoholic solution of iodine, then the shell was pierced here and 0.1 ml of material was injected into the hole with a tuberculin syringe. To get into the allantoic cavity, the syringe needle was injected to a depth of 10-15 mm parallel to the longitudinal axis of the egg. After infection, the hole was again disinfected with an iodine alcohol solution, sealed with paraffin and placed for incubation in a thermostat at a temperature of 35-37 ° C for 72 hours.
  • the embryos were placed for 18-20 hours in a refrigerator at a temperature of 4 ° C for maximum narrowing of blood vessels. After this, the eggs were placed on the tray with the blunt end up, the shell above the air bag was disinfected with an alcoholic solution of iodine and 96% ethanol, then they were broken and removed with sterile tweezers. The membrane covering the bottom of the air sac was also removed by first separating it from the underlying chorion-allantoic membrane. After 24 and 48 hours of incubation in a thermostat at 37 ° C, the number of living and normally developing embryos was taken into account. Calculation of LD 50 and MTD was carried out according to the Kerber method.
  • MPC for cell cultures treated with MP is more than 50 mg / ml
  • Aqueous MP solutions in various doses were administered to 15 chicken embryos in the allantoic cavity in a volume of 0.2 ml 12 hours after the virus was introduced in a working dose (100 TCD5o / 0.2 ml).
  • the minimum effective concentration of MP in relation to the influenza virus, which completely inhibits the synthesis of the virus is 0.05 mg / ml.
  • the effectiveness of MP decreases and has a dose-dependent nature. This fact indicates the presence of a direct antiviral effect in the MP preparation with respect to the H3N2 influenza virus.
  • Example 4 The study of the antiviral effect of the drug MP on cytopathic viruses (vesicular stomatitis virus, coronavirus, herpes simplex virus type 1)
  • Antiviral activity against this group of viruses was determined in a culture of the above cells.
  • the reaction was carried out in the following way: 0.2 ml of the corresponding virus in a working dose (100 TSTs5o / 0.2 ml) was introduced in a volume of 0.2 ml into a 2-day washed cell culture. 0.8 ml of support medium was added. When the CPP appeared in the culture, the MP preparation was introduced in various doses. As a control, the same thing was done with test viruses without the drug. Cells were incubated at 37 ° C in an incubator. The experience was taken into account on 3.5.7 days.
  • the decrease in virus titer under the influence of the test drug by 2 lg or more in comparison with the control was evaluated as a manifestation of antiviral activity.
  • the CTI of the drug is 1000.
  • MP was active against all the viruses studied, while not one comparison drug showed such activity.
  • the drug is not associated with specific features of the virus or cell culture, but affects the mechanisms common to all cells.
  • Example 5 The study of the antiviral effect of MP in vitro on models of viruses of agricultural animals
  • the tests were carried out in 96-well plastic panels with pig transmissible gastroenteritis virus (TGS) strain D-52 with an initial titer of 10 4 ' 0 TCD50 / ML (tissue cytopathic doses) in a transplanted culture of testicle cells (PTP) ) and bovine diarrhea virus Oregon strain with an initial titer of 10 70 MTC 5 o / ml in a transplanted culture of saiga kidney cells (PS).
  • TCS gastroenteritis virus
  • cell cultures were infected with viruses at doses of 100 and 10 TTsedl ml and incubated in an incubator at 37 ° C. MPs at various doses were introduced into cell cultures (CC) 1-1.5 hours after infection ( after the adsorption period). For each dilution took 8 holes. After the compound was added, the cell cultures were incubated at 37 ° C for 72-144 hours until the CPD (cytopathogenic effect) was clearly manifested in the virus control.
  • CPD cytopathogenic effect
  • Controls were cell cultures infected with the virus, inactive KK and KK, where only different concentrations of MP were added. Virusstatic effect was determined by the difference in virus titers in the experiment and control.
  • virucidal (inactivating) action When determining the virucidal (inactivating) action, different doses of the compound solution were mixed in equal volumes with virus-containing material and incubated in an incubator at 37 ° C for 24 hours. A virus-containing material was used as a control, to which a placebo (saline solution) and inactive cell cultures were added instead of a compound solution. The mixtures after contact were titrated in parallel with the control. The results were studied 72-144 hours after incubation at 37 ° C, after a clear manifestations of the CPP in virus controls. The virucidal effect was determined by the difference in virus titers in the experiment and control and expressed in lg TCD50.
  • the MP compound at a concentration of 4000 ⁇ g / ml suppressed the reproduction of the TGS virus at 2, 75 lg TTC50 / ml, at an infectious dose of 100 TCD50 / ml and at the same dose at 3.75 lg TTCDed / ml at an infectious dose of 10 TCD50 / ml.
  • the MP compound has a viral-static (inhibitory) and virulicidal (inactivating) effect on TGS viruses and cattle diarrhea; on its basis, it is possible to create chemotherapeutic agents for the treatment and prevention of infectious diseases of viral etiology.
  • Example 6 The study of the antiviral activity of MP in an experiment on animals (Herpesviral kerato-conjunctivitis / encephalitis in rabbits)
  • Herpetic experimental infection is of interest due to the fact that herpetic diseases are widespread and extremely variable in clinical manifestations. Models of experimental herpes in animals are finding wider application in the study of new antiviral substances.
  • herpetic encephalitis As is known, one of the clinical forms of systemic herpes is herpetic encephalitis, which is reproduced in guinea pigs, hamsters, rats, mice, rabbits, dogs, and monkeys.
  • Herpetic keratoconjunctivitis in rabbits with an average weight of 3.5 kg was obtained by applying infectious material (herpes virus type 1, strain L-2) to the scarified cornea (Fig. Z (1.2)). The animal was fixed, anesthesia of the eye was performed with dikain (instilled into the eye). Eyelids were opened, several scratches were applied to the cornea using a syringe needle. Then, virus-containing material was introduced and, closing the eyelids, rubbed it into the cornea in circular motions. Dose of the virus: 0.05 ml. 16 rabbits were used in the experiment; ten of them were administered MP (daily from the second day of infection). -14 days at a dose of 21 mg / kg (which is 7.5 ml of a 1% solution per animal per day), and six placebo (0.9% sodium chloride).
  • the experimental group of rabbits was injected into the ear vein MP at a dose of 21 mg / kg body weight, and a 0.9% sodium chloride solution was administered to the control group. Every day for two weeks, this procedure was repeated once a day. In the experimental group, all animals survived, and the HSV1 antigen in the blood was not determined on days 13-14. In addition, in the experimental group, encephal manifestations disappeared by the 7th day of drug administration, while in the control 2 animals died. By the 14th day of treatment, one animal died in the experimental group, while in the control group 6.
  • the efficacy index was 83.3%, which indicates the high therapeutic efficacy of MP in the model of herpetic keratoconjunctivitis / encephalitis in rabbits.
  • the rabbits in the experimental group gained weight and all animals showed no signs of keratoconjunctivitis.
  • the chemotherapeutic index for rabbits for MP was 1000, which indicates the promise of MP as a highly effective antiviral drug with a wide spectrum of action and low toxicity.
  • Example 7. Confirmation of the mechanism of action of the drug
  • the herpes virus DNA type 1 strain L-2 was used. They were isolated as shown in [5]. DNA conjugation with gold particles was performed using the method from [6]. The resulting complex was introduced into liposomes by the method [7]. The experiment was described in detail for the SV40 virus in [8]
  • the ⁇ - ⁇ -importin complex transferred colloidal particles with a polynucleotide to the nuclear pores. If cells were incubated in the presence of MP, then the accumulation of particles no lloid gold was observed on nuclear pores (Figure 4 (2)). All particles were evenly distributed over the cell cytoplasm. In this case, the cytopathic effect of the herpes virus was not observed.
  • MP inhibits the entry of viral DNA into the cell nucleus, which was necessary to confirm.
  • Example 8 The effect of the drug MP on broilers cross Cobb-500
  • the purpose of the tests was to study the effect of the MP preparation on the reproduction of vaccine virus strains by reducing the titer of the corresponding specific antibodies. It is known that many antiviral drugs, inhibiting the reproduction of live vaccine strains of viruses, inhibit the synthesis of specific antiviral antibodies. This effect is associated with the insufficient intensity of the infectious process caused by the vaccine in the body of the bird and a weak immune response. It is also known that in many cases, for example, with infectious bursal disease, the use of a live vaccine leads to the synthesis of such an excess titer of antibodies that the bursa is depleted, the bird becomes sensitive to other viruses, a decrease in weight gain and an increase in mortality are observed.
  • the use of the MP preparation was supposed to show the presence of antiviral properties in several ways: reduction of the excess level (titers) of antibodies, reduction of the case (safety), increase in weight gain.
  • Table ⁇ ° 5 shows the changes in the titers of specific antiviral antibodies in the vaccine group treated with MPa, the vaccinated group, and the unvaccinated group.
  • MP has a direct (non-immunostimulating) effect against all three viruses.
  • the greatest inhibitory effect was observed in the group with infectious bronchitis - reduction of antibody titer by 1200 units.
  • antibody titers increased from 2600 units to 3200 units, indicating an effective process of reproduction of live vaccine in the bird.
  • MP has a direct antiviral effect, inhibiting the reproduction of viruses of infectious bursal disease, Gumboro disease and infectious bronchitis.
  • MP allows moderate suppression of the replication of vaccine viruses, providing a sufficient level of protective antibodies and preventing the exhaustion of bird immunity and a corresponding decrease in weight gain and an increase in mortality.
  • Example 9. The study of the influence of MP on the effectiveness of vaccination of broilers with live vaccines
  • Immunity was determined at the age of 42 days in RHCA. At the same time, the clinical condition of the bird, the percentage of conservation, growth and feed costs were taken into account.
  • the average titers of specific antibodies to the BNV virus both in the control and in the experimental groups were at the protective level.
  • a significant increase in the average titer in the experimental group 3 was established in comparison with the control 6 times ( ⁇ 0.01).
  • the experimental groups (1,2) no significant difference in antibody titers was found in comparison with the control, however, they were at the protective level and a tendency to increase this indicator by 1.8 and 4.3 times was found.
  • Group immunity in the control was 75%, while in the experimental groups (3.4) 100%, in 1 experimental group 87.5%.
  • the death of broilers was in control - 9.8%, while the percentage of death decreased in the experimental groups: 2.8; 3.3 and 4 times, respectively, in comparison with the control.
  • the average daily gains in the experimental groups ranged from 52-54 g, while in the control - 48 g.
  • the invention relates to veterinary medicine and medicine, and specifically to virology, and can be used to create new drugs based on dynamic self-adaptive and self-organizing systems for treatment viral infections of animals and humans.
  • the preparations obtained in this way are completely environmentally friendly, biodegradable and fully metabolizable both in the patient’s body and in the environment, and the technologies for their preparation are completely waste-free.
  • the production of a patentable product is feasible on existing equipment of pharmaceutical enterprises and does not require the development of new unique equipment, does not require energy and is waste-free and environmentally friendly.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

Изобретение может быть использовано в медицине и ветеринарии для создания препарата, эффективного при пероральном использовании в лечении многих вирусных инфекций, таких как грипп, герпес, цитомегаловирус. Суть изобретения: Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения, отличающиеся тем, что в качестве основного действующего вещества вы- ступает смесь (ансамбль) олигопептидов - продуктов гидролиза белков с измененными на противоположный зарядами молекул и для их получения сперва проводят частичный гидролиз белок-содержащего сырья, а затем проводят процесс химической модификации суммы полученных олигопептидов с заменой заряда их молекул на противоположный и используют в качестве антивирусного средства композицию из полученных олигопепти- дов. Эта сумма модифицированных олигопептидов способна тормозить активность гете- родимра б- импортина клетки и тормозить репликацию вирусов, репликационный цикл которых зависит от функций ядра. Ансамбль модифицированных олигопептидов на основе динамической самоорганизую- щейся системы эффективней в лечении вирусных инфекций, таких как грипп, герпес, ви- русы болезней животных на всех стадиях развития инфекционного процесса, когда дру- гие препараты неэффективны. Средство имеет широкий спектр действия, малотоксично и доступно для промышленного производства, эффективно на всех стадиях репликационно- го цикла зависимых от клеточного ядра вирусов.

Description

Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения
Область техники
Изобретение относится к ветеринарии и медицине, а именно, к вирусологии и предназначено для лечения вирусных заболеваний человека и животных.
Предшествующий уровень техники Вирусные болезни составляют более 90% всей зарегистрированной инфекционной патологии. Но внедренных в производство противовирусных средств, очень мало. Такие вещества часто имеют токсичные свойства, небольшой спектр действия, к ним быстро по- является эффект привыкания. Таким образом, разработка противовирусных средств, кото- рые бы не имели токсичных свойств, были эффективными в лечении пшрокого спектра вирусных инфекций, является актуальной задачей современной медицины. В настоящий момент известно очень мало веществ, которые были бы эффективны на всех этапах ви- русной инфекции. Кроме интерферонов и их индукторов еще не известно таких веществ, которые бы одновременно объединяли лечебные и противовирусные свойства относи- тельно широко распространенных вирусных заболеваний - ВИЧ/СПИД, герпеса, гриппа но др. Наиболее известным средством для лечения гриппа является ремантадин. Это ве- щество, которое блокирует только этап проникновения вируса в клетку и раннюю стадию специфической репродукции, не действует на патогенез заболевания. Долговременное ис- пользование этого препарата невозможно, потому что он имеет нейротропные эффекты и может вызывать галлюцинации, нарушать функции мозга благодаря торможению прове- дению импульса по нервному волокну.
Среди других веществ, эффективных в лечении гриппа, известен лейкоцитарный а- интерферон. Этот белок синтезируется в активированных лейкоцитах человека. Он обла- дает способностью вызывать резистентность к гриппу у клеток эпителия носоглотки. Но его лечебные свойства очень незначительны. Он малоэффективен на 2-6-й день заболева- ния гриппом и является профилактическим средством. Рекомбинантные интерфероны имеют большую стоимость и часто приводят к аллергическим реакциям. Кроме того, с развитием заболевания эффективность терапии интерефероном уменьшается, а резистент- ность вируса к интерферону увеличивается.
Ближайшим прототипом вещества, которое патентуется, являются модифициро- ванные белки и их использование для контроля вирусных инфекций [1]. Это обработан- ные разными ангидридами и ацилирующими средствами белки: альбумины, лактоферрин, трансферин, лактальбумин. Авторы запатентовали также механизм действия этих белков - торможение вирусной адгезии. Эти белки должны иметь молекулярную массу больше 60000 с небольшим колебанием. Показано значительное профилактическое антивирусное действие этих белков в опытах на культурах клеток. Вещества проявили активность отно- сительно вирусов ВИЧ (человека и мартышки), гриппа, цитомегаловируса, полиовирусу, вируса леса Селмики, вируса Сендай, парагриппа, Коксаки вируса. Авторы показали, что ацилированные белки нетоксичны и могут защищать животных против инфицирования вирусами.
Прототип имеет ряд недостатков: он является сугубо профилактическим средством (на клетки, которые уже инфицированы вирусом такие белки лечебного эффекта не ока- зывали) и не имеет лечебных свойств у инфицированных животных. В связи с тем, что прототип является высокомолекулярным белком, он может быть использован только для парентерального применения, препарат представляет собой индивидуальное соединение и не представляет из себя динамической самоорганизующейся системы и соответственно вирусы будут быстро адаптироваться к препарату.
Раскрытие изобретения
В основу изобретения поставленная задача синтезировать модифицированные пептиды с противовирусными свойствами и с новым механизмом действия, использова- ние которых позволит значительно увеличить эффективность лечения и сократить сроки лечения вирусных заболеваний, таких как грипп, герпесвирусные инфекции.
Поставленная задача решается путем синтеза модифицированных пептидов с ан- тивирусными свойствами, отличающегося тем, что сначала проводят частичный гидро- лиз белок-содержащего сырья, а затем проводят процесс химической модификации сум- мы (ансамбля) полученных олигопептидов с заменой заряда их молекул на противопо- ложный. Для синтеза могут быть использованы такие белки: овальбумин (OA), человече- ский сывороточный альбумин (ЛСА), бычий сывороточный альбумин (БСА), смесь мо- лочных белков (СМБ), кроличий сывороточный альбумин (КСА), лизоцим (ЛЦ), лактоа- льбумин (ЛА), казеин (КЗ), соевый белок (СБ), их смесь, молоко (М), цельный яичный бе- лок (ЦЯБ). Для ферментативного гидролиза могут быть использованы пепсин, трипсин, химотрипсин, папаин, протеиназа К, клострипаин, тромбин, термолизин, эластаза. Синте- зированные олигопептиды способны тормозить активность гетеродимера а- б - импорти- нов клетки, которые транспортируют вирусные полинуклеотиды из цитоплазмы в ядро. Соответственно торможение этих транспортных белков приведет к блокаде вирусов, реп- ликация которых зависит от функций ядра клетки. Кроме того, препарат эффективен при пероральном приложении.
В качестве ацилирующих агентов могут быть использованы модификаторы, пред- ставленные на Фиг. 1.
В эксперименте была подтвержденная эффективность препарата при гриппе, гер- песе, на моделях in vivo и in ovo, что описано ниже. Нами использован ансамбль из олиго- пептидов - продуктов гидролиза белков и их смесей (яичного, молочного и др.), но с из- мененными на противоположные зарядами молекул. Ансамбль - термин из супрамолеку- лярной химии. Объекты супрамолекулярной химии— супрамолекулярные ансамбли, строящиеся самопроизвольно из комплементарных, т. е. имеющих геометрическое и хи- мическое соответствие фрагментов, подобно самопроизвольной сборке сложнейших про- странственных структур в живой клетке [2,3]
Краткое описание чертежей:
Фиг. 1.- Структуры химических модификаторов, применимых для изменения зарядов мо- лекул олигопептидов МП
Фиг. 2.- Микрофотографии инфицированных и неинфицированных клеток , полученные при использовании люминисцентного микроскопа
Фиг. 3.- Фотографии глаз кролей при инфицировании вирусом герпеса 1 типа и после
лечения (Фиг. 3). Скарифицированная роговица после внесения вируса - гиперемирована с «бельмом» инфицирования (1,2) (на втором снимке место скарификации контрастировало флюоресцеином). Здоровая роговица после лечения (3) : гиперемии нет.
Фиг. 4. - Электронные микрофотографии инфицированных вирусом герпеса типа клетки - обработанные (2) и не обработанные (1) МП
Лучший вариант осуществления изобретения Пример 1. Получение смеси (композиции) модифицированных пептидов (МП) с ан- тивирусными свойствами, которые способны к самоорганизации на импорти- нах
В асептических условиях 500 мг овальбумина растворяют в 50 мл дистиллирован- ной воды, доводят рН до 8,0 1 М раствором гидроксида натрия, добавляют 5 мг трипсина, оставляют раствор на 3-45 часов, наблюдается гидролиз овальбумина с образованием сме- си пептидов. К этой смеси добавляют 501-2000 мг янтарного ангидрида, перемешивают при температуре 16-65 ° С 20 минут. Смесь пропускают через мембранные фильтры с це- лью стерилизации и разливают в стеклянные флаконы.
Для определения максимально переносимой концентрации (МПК) в токсикологи- ческих опытах и изучения антивирусной активности препарата МП использованы сле- дующие виды перевиваемых клеток человеческого и животного происхождения:
ПТ - перевиваемые клетки почки эмбриона крупного рогатого скота; - Тг - перевиваемые клетки трахеи эмбриона крупного рогатого скота;
Hep -2- перевиваемые клетки рака гортани человека;
Hela - перевиваемые клетки рака тела матки;
Эмбрионы куриные
Клетки выращивали в среде 199 с добавлением 10% бычьей сыворотки и антибиотиков (пенициллина и стрептомицина). В качестве тест-вирусов использованы вирусы гриппа (H3N2), везикулярного стоматита (Штамм Индиана), коронавирус (X 343/44) и вирус простого герпеса 1 типа (штамм Л-2).
Исследования проводили по методикам, рекомендованным Государственным фарма- кологическим центром МЗ Украины.
Пример 2. Изучение токсичности и определение МПК препарата МП на культурах клеток и на куриных эмбрионах
Для определения МПК использовали двухсуточные культуры клеток с хорошо сформированным монослоем клеток. Препарат МП испытан на четырех видах перечис- ленных вьппе клеток в 5 повторениях. В каждом опыте для исследования использовали не менее 10 пробирок каждой из культур. После удаления из пробирок ростовой среды вно- сили 0,2 мл испытуемого раствора и по 0,8 мл поддерживающей питательной среды. Про- бирки с клетками инкубировали при 37 °С в течение 7-8 дней. Контролем служили пробирки с культурами клеток, в которые не добавляли препа- рат.
Учет результатов проводили по наличию или отсутствию цитопатического дейст- вия на клетки при просмотре в микроскопе при малом увеличении х10. Степень цитоток- сического действия определяли по изменению морфологии клеток (округление и сморщи- вание клеток, отторжение от стекла дегенерированных клеток) по четырехплюсовой сис- теме от + до ++++.
Максимально переносимую концентрацию определяли по максимальному количе- ству вещества, не вызывающего цитопатического действия на клетки. Для этого в различ- ных разведениях препарата в дозе 0,2 мл вносили в культуру клеток.
Для изучения токсичности in vivo в различных дозах препарата в объеме 0,2 мл вносили в аллантоисную полость 9-10 дневных куриных эмбрионов (по 5 эмбрионов на разведение МП) по следующей методике:
брали 10-11- дневные эмбрионы, овоскопировали, наносили карандашом метку над воздушным мешком на стороне, противоположной расположению эмбриона, где меньше кровеносных сосудов. Отмеченное место обеззараживали спиртовым раствором йода, за- тем здесь же прокалывали скорлупу и в отверстие вводили туберкулиновым шприцем ма- териал в объеме 0,1 мл. Для попадания в аллантоисную полость иглу шприца вводили на глубину 10-15 мм параллельно продольной оси яйца. После заражения отверстие вновь дезинфицировали спиртовым раствором йода, запечатывали парафином и помещали для инкубации в термостат при температуре 35-37 0 С на 72 часа. Перед вскрытием эмбрионы помещали на 18-20 ч в холодильник при температуре 4° С для максимального сужения кровеносных сосудов. После этого яйца помещали на лоток тупым концом вверх, скорлу- пу над воздушным мешком обеззараживали спиртовым раствором йода и 96% этиловым спиртом, затем разбивали и удаляли стерильным пинцетом. Также удаляли оболочку, вы- стилающую дно воздушного мешка, предварительно отсепарировав её от подлежащей хо- рион-аллантоисной оболочки. Через 24 и 48 часов инкубирования в термостате при 37 °С учитывали количество живых и нормально развивающихся эмбрионов. Расчет LD50 и МПД проводили по методу Кербера .
В результате исследований на различных культурах было установлено, что МП не- токсичен для культур клеток в дозе более 50 мг/мл. (для повышения концентрации препа- рат лиофилизировали и затем разводили до 5% концентрации). Результаты изучения ток- сичности на различных культурах представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Токсичность МП на культурах клеток МПК (мг/ л)
Культура клеток
п/п
1 ПТ более 50
2 Тг -II-
3 Hep -2 -II-
4 Hela -II-
МПК для культур клеток, обработанных МП составляет более 50 мг/мл
Пример 3. Изучение антивирусного действия препарата МП на вирус гриппа А (НЗ
N2)
Водные растворы МП в различных дозах (десятикратные разведения) вводили 15 куриным эмбрионам в аллантоисную полость в объеме 0,2 мл через 12 часов после внесе- ния вируса в рабочей дозе (100 ТЦД5о/0,2 мл).
Каждый опыт сопровождался контролем тест-вируса в рабочей дозе. Зараженные и незараженные (контроль) эмбрионы инкубировали при 36°С в течение 48 часов. Затем производили вскрытие эмбрионов, из которых отсасывали аллантоисную жидкость. Тит- рование вируса в аллантоисной жидкости проводили по общепринятой методике с 1% эритроцитами 0(1) группы крови человека.
Определили коэффициент защиты (КЗ) согласно [1,2].
Титр вируса в опытной и контрольной группах куриных эмбрионов
представлен в таблице 2
Таблица 2- Эффективная концентрация МП на модели гриппозной инфекции in ovo
Группа Концентрация Титр вируса Минимальная
препарата (мг/мл) (^ ТЦЦ до/мл) эффективная кон- центрация (МЭК опыт кон- мг/мл) троль
Контрольная (вво- 12 12
дили 0,9 % раствор
натрия хлорида)
Опытная 50±5 0 12
5±1 0 12 0,05
0,5 + 0,05 2 12
0,05+0,005 4 12 Группа Концентрация Титр вируса Минимальная препарата (мг/мл) (18 ТЦЦ 50/мл) эффективная кон- центрация (МЭК опыт кон- мг/мл) троль
0,005±0,0005 10 12 5
Как видно из таблицы 2, минимальная эффективная концентрация МП в отноше- нии вируса гриппа, которая полностью тормозит синтез вируса, равна 0,05 мг/мл. При увеличении разведения препарата, эффективность МП падает и имеет дозозависимый ха- рактер. Данный факт свидетельствует о наличии прямого противовирусного эффекта у препарата МП в отношении вируса гриппа H3N2.
Пример 4,- Исследование антивирусного действия препарата МП на цитопатиче- ские вирусы (вирус везикулярного стоматита, коронавирус, вирус про стого герпеса 1 типа)
Противовирусную активность в отношении этой группы вирусов определяли в культуре вышеуказанных клеток. Постановку реакции осуществляли следующим спосо- бом: 0,2 мл соответствующего вируса в рабочей дозе (100 ТЦЦ5о/0,2 мл) вносили в объеме 0,2 мл в 2-х суточную отмытую культуру клеток. Добавляли 0,8 мл поддерживающей сре- ды. При появлении в культуре ЦПД вносили препарат МП в различных дозах. В качестве контроля выполняли то же самое с тест-вирусами без препарата. Клетки инкубировали при 37 0 С в термостате. Учет опыта производили на 3,5,7 день.
Снижение титра вируса под влиянием испытуемого препарата на 2 lg и более в сравнении с контролем оценивали как проявление антивирусной активности.
Результаты изучения противовирусной активности препарата МП представлены в таблице 3 Таблица 3 - Изучение противовирусного действия препарата МП в отношении виру- сов: везикулярного стоматита, коронавируса, вируса простого герпеса 1 типа) Препарат Вирус мэк, Максимальное падение мг/мл титра вируса, lg ТЦ Д 50/„л
МП ВВС 0,05 3,8
KB 0,05 2,8
ВПГ1 0,05 4,8
Как видно из таблицы 3, МП обладает антивирусной активностью и способностью подавлять репродукцию всех изученных нами вирусов в концентрации 0,05 мг/мл при МПК = 50 мкг/мл. ХТИ препарата составляет 1000. Кроме того, МП был активен в отно- шении всех изученных вирусов, тогда как не один препарат сравнения не проявлял подоб- ной активности. Таким образом, препарат не связан с конкретными особенностями вируса или клеточной культуры, а влияет на общие для всех клеток механизмы.
Пример 5. - Изучение антивирусного действия МП in vitro на моделях вирусов сель- с охозяйственных животных
Испытания проводили в 96-ти луночных пластиковых панелях с вирусом транс- миссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) штамм «Д-52» с исходным титром 104'0 ТЦД50/МЛ (тканевых цитопатических доз) в перевиваемой культуре клеток тестикул по- росенка (ПТП) и вирусом диареи крупного рогатого скота штамм «Орегон» с исходным титром 1070 ТЦЦ5о/мл в перевиваемой культуре клеток почки сайги (ПС).
При испытании вирусстатического (ингибирующего) действия культуры клеток инфицировали вирусами в дозах 100 и 10 ТЦДед мл и инкубировали в термостате при 37° С. МП в различных дозах вносили в культуры клеток (КК) через 1-1,5 часов после зараже- ния (после периода адсорбции). На каждое разведение брали по 8 лунок. После внесения соединения культуры клеток инкубировали при 37 С в течение 72-144 часов до четкого проявления ЦПД (цитопатогенного действия) в контроле вирусов.
Контролями служили культуры клеток, инфицированные вирусом, инактные КК и КК, куда вносили только различные концентрации МП. Вирусстатическое действие опре- деляли по разнице титров вирусов в опыте и контроле.
При определении вирулицидного (инактивирующего) действия разные дозы рас- твора соединения смешивали в равных объемах с вируссодержащим материалом и инку- бировали в термостате при 37 °С в течение 24 часов. Контролем служили вируссодержа- щий материал, к которому вместо раствора соединения добавляли плацебо (физраствор) и инактные культуры клеток. Смеси после контакта титровали параллельно с контролем. Результаты учитьюали через 72-144 часа после инкубирования при 37° С, после четкого проявления ЦПД в контролях вирусов. Вирулицидное действие определяли по разнице титров вирусов в опыте и контроле и выражали в lg ТЦД50.
В результате проведенных исследований установлено, что соединение МП в кон- центрации 4000 мкг\мл подавляло репродукцию вируса ТГС на 2, 75 lg ТЦЦ50.МЛ, при заражающей дозе 100 ТЦД50/мл и в той же дозе на 3,75 lg ТЦДед/мл, при заражающей дозе 10 ТЦД50/мл. В дозе 4000 мкг/мл МП инактивировал вирус ТГС на 2,0 lg ТЦД50/МЛ. Соединение МП в дозе 4000 мкг\мл инактивировал вирус диареи КРСна 3,5 18ТЦД50/МЛ.
При изучении токсичности, установлено, что МП в дозе 4000 мкг\мл не токсичен для обеих культур клеток.
Таким образом, соединение МП обладает вирусстатическим (ингибирующем) и ви- рулицидным (инактивирующим) действием на вирусы ТГС и диареи КРС, на его основе возможно создание химиопрепаратов для лечения и профилактики инфекционных болез- ней вирусной этиологии.
Пример 6.- Изучение противовирусной активности МП в эксперименте на ивот- ных (Герпесвирусный керато-конъюнктивит/энцефалит у кролей)
Особенности экспериментальной системы и уровень ее адекватности естественно- му заболеванию человека несомненно играют решающую роль в оценке влияния антиви- русного вещества на течение инфекции. Герпетическая экспериментальная инфекция представляет собой интерес в связи с тем, что заболевания герпетической природы широ- ко распространены и чрезвычайно вариабельны по клиническим проявлениям. Модели экспериментального герпеса на животных находят все более широкое применение в изу- чении новых противовирусных веществ.
Как известно, одной из клинических форм системного герпеса является герпетиче- ский энцефалит, который воспроизводится у морских свинок, хомяков, крыс, мышей, кро- ликов, собак, обезьян.
Герпетический кератоконъюнктивит у кроликов среднего веса 3,5 кг был получен путем нанесения инфекционного материала (вирус герпеса 1 типа, штамм Л-2) на скари- фицированую роговицу (Фиг.З (1,2)). Животного фиксировали, анестезию глаза проводи- ли дикаином (закапывали в глаз). Раздвигали веки глаза, наносили несколько царапин на роговицу при помощи иглы шприца. Затем вводили вируссодержащий материал и, смыкая веки, круговыми движениями втирали его в роговицу. Доза вируса: 0,05 мл. В опыте ис- пользовали 16 кролей, из них десятерым вводили МП (ежедневно со второго дня инфици- рования -14 дней в дозе 21 мг/кг (что составляет 7,5 мл 1% раствора на одно животное в сутки), а шестерым - плацебо (0,9 % натрия хлорида).
После заражения кролей ВПГ1 ежедневно контролировали состояние роговицы, наличие кератоконъюнктивита, энцефальных нарушений и наличие в лимфоцитах пери- ферической крови антигенов ВПГ1 методом РИФ до и после инфицирования (Фиг.З (3)). До инфицирования у всех животных в лимфоцитах отсутствовало специфическое свече- ние, что свидетельствовало об отсутствии в периферической крови антигенов вируса гер- песа 1 типа. На 3 день после инфицирования у всех животных в крови определялся анти- ген ВПГ1, ИФ=70%. Кроме того, у трех кролей (двух - из опытной группы до начала ле- чения и у одного из контрольной группы) появились энцефальные проявления - судорож- ный синдром, отсутствие аппетита. У всех животных развился кератоконъюнктивит. На 4 день после инфицирования опытной группе кролей ввели в ушную вену МП в дозе 21 мг/кг веса тела, а контрольной группе ввели 0,9% раствор натрия хлорида. Каждый день в течение двух недель повторяли эту процедуру один раз в день. В опытной группе все жи- вотные выжили, а антиген ВПГ1 в крови не определялся на 13-14 день. Кроме того, в опытной группе энцефальные проявления исчезли к 7 дню применения препарата, тогда как в контроле погибло 2 животных. К 14 дню лечения в опытной группе погибло одно животное, тогда как в контроле - 6. Соответственно индекс эффективности был равен 83,3 %, что свидетельствует о высокой лечебной эффективности МП на модели герпетического кератоконъюнктивита/энцефалита у кролей. Кроме того, кроли в опытной группе набрали в весе и у всех животных отсутствовали признаки кератоконъюнктивита. Химиотерапев- тический индекс для кролей по препарату МП составил 1000, что свидетельствует о пер- спективности МП как высокоэффективного противовирусного препарата с широким спек- тром действия и низкой токсичностью. Пример 7. - Подтверждение механизма действия препарата
Для подтверждения механизма действия МП была использована ДНК вируса гер- песа 1 типа штамма Л-2. Выделяли как показано в [5]. Конъюгацию ДНК с частицами зо- лота проводили методом из [6]. Полученный комплекс вводили в липосомы методом [7]. Подробно эксперимент был описан для вируса SV40 в [8]
Такие липосомы сливались с мембранами клеток культуры куриных фиброблас- тов. После объединения липосом с мамбраной клеток, ДНК вируса с частицами золота попадала в цитоплазму (Фиг.4(1)).
Комплекс α-β-импортинов переносил коллоидные частицы с полинуклеотидом к ядерным порам. Если клетки инкубировали в присутствии МП, то накопление частиц ко- ллоидного золота на ядерных порах не наблюдаслось (Фиг.4 (2)). Все частицы равномерно распределялись по цитоплазме клеток. В этом случае цитопатического действия вируса герпеса не наблюдалось.
Таким образом МП тормозит попадание вирусной ДНК в клеточное ядро, что и не- обходимо было подтвердить.
Пример 8. - Влияние препарата МП на бройлеров кросса Кобб-500
Целью испытаний являлось изучение влияния препарата МП на репродукцию вак- цинных штаммов вирусов по редукции титра соответствующих специфических антител. Известно, что многие антивирусные препараты, подавляя репродукцию живых вакцинных штаммов вирусов приводят к угнетению синтеза специфических антивирусных антител. Этот эффект связан с недостаточной интенсивностью вызванного вакциной инфекционно- го процесса в организме птицы и слабым иммунным ответом. При этом известно, что во многих случаях, например при инфекционной бурсальной болезни, применение живой вакцины приводит к индукции синтеза настолько избыточного титра антител, что истоща- ется бурса, птица становится чувствительной к другим вирусам, наблюдается уменьшение привеса и увеличение падежа. Применение препарата МП должно было показать наличие у него антивирусных свойств по нескольким параметрам: редукции избыточного уровня (титров) антител, уменьшению падежа (сохранность), увеличение привеса.
В эксперимент брали бройлеров на 36 и 41 день по 15 животных в группу. МП вы- паивали за сутки до вакцинации живыми вакцинами против ИББ, болезни Гамборо (БГ) и инфекционного бронхита (ИБ). В контроле были птицы, которых не выпаивали МПом, но вакцинировали. В таблицах 4-5 приведены результаты исследований.
Таблица 4.- Привес бройлеров (на момент забоя) в опытной и контрольной группах
Figure imgf000013_0001
* - против невакцинированного контроля, который принимался за основу.
** - (Р=0,01)
Как видно из таблицы 4, в опытной группе привес животных увеличился на (5,2±0,7)% против уменьшения веса в контрольной вакцинированной, но не леченной группе (-1,2±0,3)%. Также в опытной группе наблюдалось увеличение сохранности на (1,1±0,3)%.
В таблице Ν° 5 приведены изменения в титрах специфических антивирусных анти- тел в леченной МПом вакцинировной группе, вакцинированной не леченной группе и не- вакцинированной группе.
Таблица 5.- Изменение титра антител против ИББ, БГ и ИБ в вакцинированных группах и невакцинированном контроле
Figure imgf000014_0001
Как видно из таблицы 5, МП обладает прямым (не иммуностимулирующим) дейст- вием в отношении всех трех вирусов. Наибольший ингибирующий эффект наблюдался в группе с инфекционным бронхитом - редукция титра антител на 1200 единиц. В вакцини- рованном, но не леченном контроле, титры антител возрастали от 2600 единиц до 3200 единиц, что свидетельствовало об эффективном процессе размножения живой вакцины в организме птицы.
Таким образом, применение МП позволят в среднем на 5% увеличить привес брой- леров и на 1% уменьшить падеж.
МП обладает прямым антивирусным действием, подавляя репродукцию вирусов инфекционной бурсальной болезни, болезни Гамборо и инфекционного бронхита.
МП позволяет умеренно подавлять репликацию вакцинных вирусов, обеспечивая достаточный уровень защитных антител и предотвращая истощение иммунитета пти- цы и соответствующее уменьшение привеса и увеличение падежа. Пример 9.- Изучение влияния МП на эффективность вакцинации бройлеров живы- ми вакцинами
Влияние МП на эффективность вакцинации проводили непосредственно в птицеводче- ском хозяйстве при выращивании бройлеров. При патологоанатомическом изучении бройлеров наблюдали характерные изменения для колибактериоза, кокцидиоза, а также многочисленные кровоизлияния на слизистых оболочках прямого отдела кишечнику, в участке перехода железистого желудка в мышечный, цокалевих железах. Содержимое же- лезистого желудка было окрашено в зеленый цвет. Гибель бройлеров достигала около 15 - 20%. При исследовании сывороток крови бройлеров в 38-42 суточном возрасте в реакции задержки гемаглютинаци (РЗГА) обнаруживали специфические титры антител к вирусу болезни Нью-Касла (БНК) выше протективных (1:1024, 1: 2048).
Изучение влияния МП в дозе 0,03 мл/кг живого веса на эффективность вакцинации против БНК. Для этого один из птичников был принят за контроль, другие были опытны- ми (таблица 6).
Таблица 6.— Результаты изучения влияния МП на эффективность вакцинации в птицеводстве
Figure imgf000015_0001
Условия досмотра, параметры микроклимата, режим освещенности, плотность по- садки, режим кормления был одинаковым во всех группах согласно методических реко- мендаций по выращиванию кросса РОС 308.
Напряженность иммунитета определяли в возрасте 42 суток в РЗГА. Одновременно учитывали клиническое состояние птицы, процент сохранения, приросты и затраты корма.
Результаты проведенных испытаний из определения эффективности МП при про- ведении вакцинации бройлеров против БНК приведены в таблице 7. Таблица 7.- Влияние МП на эффективность вакцинации против болезни Ныо- асла
Figure imgf000016_0001
Примечание: Достоверность в сравнении с контролем
: * Р<0,05, ** Р<0,01 *** ΡΟ,ΟΟΙ
Средние титры специфических антител к вирусу БНК как в контроле, так и опытных группах были на уровне протективных. Однако, при исследовании сывороток бройлеров в 42 суточном возрасте при применении МП установлено достоверное увеличение среднего титра в опытной 3 группе в сравнении с контролем в 6 раз(< 0,01). В опытных группах (1,2) не установлено достоверной разницы титров антител в сравнении с контролем, одна- ко они были на уровне протективних и обнаружена тенденция к увеличению этого показа- теля в 1,8 и 4,3 разы. Групповой иммунитет в контроле составлял 75%, тогда как в опыт- ных группах (3,4) 100%, в 1 опытной группе 87,5%. Гибель бройлеров составляла в кон- троле - 9,8%, тогда как процент гибели уменьшился в опытных группах : в 2,8 ; 3,3 и 4 раза соответственно в сравнении с контролем. Среднесуточные приросты в опытных группах колебались в пределах 52-54 г., тогда как в контроле - 48 г.
Таким образом, можно сделать вывод, что оптимальной схемой использования МП для бройлеров в регионах со сложной эпизоотической ситуацией с БНК является приме- нение препарата в дозе 0,03 мл/кг живого веса на протяжении 3 суток до вакцинации и че- рез 7-10 суток после вакцинации против БНК. Применение препарата по вьппеупомянутой схеме приводит к повышению среднего титра специфических антител к вирусу БНК в 6 раз и уменьшению гибели бройлеров в 4 раза.
Промышленная применимость
Изобретение относится к ветеринарии и медицине, а конкретно к вирусологии, и может быть использовано для созданий новых лекарственных препаратов на основе динамических самоадаптирующихся и самоорганизующихся систем для лечения вирусных инфекций животных и человека. Полученные таким образом препараты являются полностью экологически безопасными, биодеградируемыми и полностью метаболизируемыми как в организме пациентов, так и в окружающей среде, а технологии их получения относятся к группе полностью безотходных. Производство патентуемого средства осуществимо на существующем оборудовании фармацевтических предприятий и не требует разработки нового уникального оборудования, не требует энергозатрат и является безотходным и экологически чистым.
Использованные источники информации
1 Robert Walter Jansen, Dirk Klaas Fokke Meijer, Grietje Molema, Erik Desire Alice De Clercq, Rudi Wilfried Jan Pauwels, Dominique Schols Modified proteins and their use for controlling viral infection // A61K 3804; A61K 3816, US Patent j\° 5869457, Reg. 9.02.1999. Appl. Sep 4, 1997
2 http://dic.acadennc.ru/dic.^f/mwiki/79240
3 Jean-Marie Lehn. Supramolecular Chemistry. Concepts and Perspectives.- Weinheim; New York; Basel; Cambridge; Tokyo: VCH Verlagsgesellschaft mbH, 1995.-P. 103 (Chapter 7)

Claims

Формула изобретения
1. Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами, отличающиеся тем, что в качестве пептидов используют смесь (ансамбль) олигопептидов - продуктов гидролиза белков с измененными на противоположный зарядами молекул.
2. Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами по п.1, отличающиеся тем, что заряд молекул изменяют путем образования амидной группы в результате реакции ацилирования между ангидридами ди- и три-карбоновых кислот с остатками лизинов, гис- титинов в смеси олигопептидов с образованием новых карбоксильных групп.
3. Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами по п.1, отличающиеся тем, что заряд молекул меняют путем образования замещенной аминной группы в ре- зультате реакции алкилирования между монохлоруксусной кислотой и остатками лизи- нов, гиститинов в смеси олигопептидов с образованием новых карбоксильных групп.
4. Способ получения модифицированных пептидов с антивирусными свойствами
отличающийся тем, что для их получения сначала проводят частичный гидролиз белок- содержащего сырья, а затем проводят процесс химической модификации суммы (ансамб- ля) полученных олигопептидов с заменой заряда их молекул на противоположный и ис- пользуют в качестве антивирусного средства композицию из полученных олигопептидов.
5. Способ получения модифицированных пептидов с антивирусными свойствами по п.4, отличающийся тем, что в качестве белок-содержащего сырья используют индивидуаль- ный белок.
6. Способ получения модифицированных пептидов с антивирусными свойствами по п.4, отличающийся тем, что в качестве белок-содержащего сырья используют смесь белков.
7. Способ получения модифицированных пептидов с антивирусными свойствами по п.4, отличающийся тем, что отличающиеся тем, что в качестве белок-содержащего сырья используют молоко.
8. Способ получения модифицированных пептидов с антивирусными свойствами по п.4, отличающийся тем, в качестве белок-содержащего сырья используют первичный яич- ный белок.
9. Способ получения модифицированных пептидов с антивирусными свойствами по п.4, отличающийся тем, что для частичного гидролиза белок-содержащего сырья исполь- зуют ферментативный гидролиз.
10. Способ получения модифицированных пептидов с антивирусными свойствами по п.4, отличающийся тем, что для частичного гидролиза белок-содержащего сырья использу- ют кислотный гидролиз.
11. Способ получения модифицированных пептидов с антивирусными свойствами по п.4, отличающийся тем, что для частичного гидролиза белок-содер ащего сырья использу- ют щелочной гидролиз.
12. Способ получения модифицированных пептидов с антивирусными свойствами по п.4, отличающийся тем, что для частичного гидролиза белок-содержащего сырья исполь- зуют синтетические пептидазы.
13. Способ получения модифицированных пептидов с антивирусными свойствами по п.4, отличающийся тем, что для химической модификации суммы олигопептидов исполь- зуют янтарный ангидрид.
14. Способ получения модифицированных пептидов с антивирусными свойствами по п.4, отличающийся тем, что для химической модификации суммы олигопептидов исполь- зуют монохлоруксусную кислоту.
PCT/RU2010/000701 2010-11-22 2010-11-22 Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения WO2012070975A1 (ru)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IN1230MUN2013 IN2013MN01230A (ru) 2010-11-22 2010-11-22
PCT/RU2010/000701 WO2012070975A1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения
EA201300487A EA025624B1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения
US12/931,467 US20120129760A1 (en) 2010-11-22 2011-02-01 Modified peptides with antiviral properties and methods for obtaining them

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/RU2010/000701 WO2012070975A1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012070975A1 true WO2012070975A1 (ru) 2012-05-31

Family

ID=46064908

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2010/000701 WO2012070975A1 (ru) 2010-11-22 2010-11-22 Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20120129760A1 (ru)
EA (1) EA025624B1 (ru)
IN (1) IN2013MN01230A (ru)
WO (1) WO2012070975A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014104906A2 (en) * 2012-09-19 2014-07-03 Sc Hipocrate 2002 Serv Srl Composition with increased bioavailability of orally administrated embryo-peptides and process for its obtainment
WO2018231093A1 (ru) * 2017-06-16 2018-12-20 Борис Славинович ФАРБЕР Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111138656B (zh) * 2019-12-24 2022-04-15 北京安德普泰医疗科技有限公司 一种肌肽-tpgs化合物及其制备方法和用途
CN111053892B (zh) * 2019-12-24 2023-11-17 山西锦波生物医药股份有限公司 一种广谱抗肠道病毒的蛋白类药物及其应用
CN112316152B (zh) * 2020-11-04 2023-05-02 山西锦波生物医药股份有限公司 经酸酐修饰的蛋白质抑制冠状病毒的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5869457A (en) * 1991-03-11 1999-02-09 Rijksuniversiteit Te Groningen Modified proteins and their use for controlling viral infections

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5985275A (en) * 1995-04-12 1999-11-16 New York Blood Center β-Lactoglobulin modified with aromatic anhydride compound for preventing HIV infection

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5869457A (en) * 1991-03-11 1999-02-09 Rijksuniversiteit Te Groningen Modified proteins and their use for controlling viral infections

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DATABASE PUBMED Database accession no. 127497069 *
LIN LI ET AL.: "Maleic anhydride-modified chicken ovalbumin as an effective and inexpensive anti-HIV microbicide candidate for prevention of HIV sexual transmission", RETRO VIROLOGY, vol. 7, 2010, pages 37 *
OEVERMANN ANNA ET AL.: "The antiviral activity of naturally occurring proteins and their peptide fragments after chemical modification", ANTIVIRAL RESEARCH, vol. 59, 2003, pages 23 - 33 *
TAE-GEE LEE ET AL.: "Isolation of HIV- 1 Protease-Inhibiting Peptides from Thermolysin Hydrolysate of Oyster Proteins", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 253, 1998, pages 604 - 608 *
WOODARD SL ET AL.: "Maize (Zea mays)-derived bovine trypsin: characterization of the first large-scale, commercial protein product from transgenic plants", BIOTECHNOL APPL BIOCHEM, vol. 38, October 2003 (2003-10-01), pages 123 - 30 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014104906A2 (en) * 2012-09-19 2014-07-03 Sc Hipocrate 2002 Serv Srl Composition with increased bioavailability of orally administrated embryo-peptides and process for its obtainment
WO2014104906A3 (en) * 2012-09-19 2014-08-14 Sc Hipocrate 2002 Serv Srl Composition with increased bioavailability of orally administrated embryo-peptides and process for its obtainment
US9999654B2 (en) 2012-09-19 2018-06-19 Sc Hipocrate 2002 Serv Srl Composition with increased bioavailability of orally administered embryo-peptides and process for its obtainment
WO2018231093A1 (ru) * 2017-06-16 2018-12-20 Борис Славинович ФАРБЕР Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами

Also Published As

Publication number Publication date
US20120129760A1 (en) 2012-05-24
EA201300487A1 (ru) 2013-08-30
IN2013MN01230A (ru) 2015-04-17
EA025624B1 (ru) 2017-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2013204906B2 (en) Adjuvant and vaccine compositions
CN111548413B (zh) 一种抗新型冠状病毒的抗体及其制备方法与应用
WO2012070975A1 (ru) Модифицированные пептиды с антивирусными свойствами и способ их получения
JP2012504150A5 (ru)
JP2012504150A (ja) 生体活性材料をカプセル化したナノスフェアおよびナノスフェアの製剤化のための方法
KR20030094211A (ko) 조류 알로부터 수득된 전달인자
CN109568301A (zh) 一种没食子酸、大黄酸复合配方制备方法及其应用
RU2403063C1 (ru) Вакцина инактивированная комбинированная против вирусной диареи, рота-, коронавирусной болезней и эшерихиоза крупного рогатого скота
CN117430672A (zh) 一种新型抗菌肽及其药物组合物
CN106563125A (zh) 鸭甲肝病毒ⅲ型复合物活疫苗及其制备方法
CN114377127B (zh) 一种三联卵黄抗体制剂及其制备方法和应用
CN105807049B (zh) 一种鸭坦布苏病毒病血凝抑制试验抗原及其制备方法
US11339502B2 (en) Combinatorial derivatives of oligopeptides having antiviral properties
JP2007084495A (ja) ウイルス感染細胞処理方法
CN101810638B (zh) 内源性干扰素诱导物的注射液和纳米微囊化溶液的制备方法
CN107823278B (zh) 甘青乌头在制备抑制和杀灭牛病毒性腹泻病毒bvdv药物中的应用
RU2420309C2 (ru) Препарат против бешенства
RU2742160C1 (ru) Способ лечения алеутской болезни норок
RU2651772C2 (ru) Способ химиопрофилактики нодулярного дерматита крупного рогатого скота
RU2346698C1 (ru) Способ профилактики лейкоза крупного рогатого скота
US10351644B2 (en) Antiviral drug
EA041469B1 (ru) Комбинаторные производные олигопептидов с противовирусными свойствами
US20070218036A1 (en) Method For The Prevention Of Infection With Nodavirus And Method For The Treatment Thereof
RU2261111C1 (ru) Инактивированная вакцина против вирусных пневмогастроэнтеритов крупного рогатого скота и телят и способ профилактики вирусных пневмогастроэнтеритов
RU2034565C1 (ru) Биологически активный препарат для кур и способ профилактики и лечения вирусных заболеваний кур

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10859970

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE2 Request for preliminary examination filed before expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201300487

Country of ref document: EA

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 10859970

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1