JP2022501423A - 医薬ベシクル製剤を調製するための方法、ならびに関連する製品および使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、医薬ベシクル製剤を調製するための方法であって、ベシクル成分および医薬剤を調製および加工して、医薬剤をベシクル内に封入し、医薬ベシクル製剤を形成するステップを含み、医薬ベシクル製剤が薬学的に許容可能な担体中に溶解した、既知数量の医薬剤に復元されて、二相性医薬ベシクル製剤をもたらす方法に関する。本発明はまた、特に、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）および野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）などの細菌、ならびにベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）などのウイルスによる感染の防止または処置のための、関連する医薬ベシクル製剤、医薬キット、および医薬としての使用にも関する。

Description

本発明は、医薬ベシクル製剤を調製するための方法と、特に、鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）および野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）などの細菌、ならびにベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）などのウイルスによる感染の防止または処置のための、関連する医薬ベシクル製剤、医薬キット、および医薬としての使用とに関する。本発明は、特に、レボフロキサシン、ドキシサイクリン、またはシプロフロキサシンなどの抗生剤と、ヒト化抗ＶＥＥＶモノクローナルＩｇＧである、Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７などの抗ウイルス剤とを含む、医薬剤を封入する、非イオン性界面活性剤ベシクル（ＮＩＳＶ）、またはこの修飾ベシクルを含む、医薬ベシクル製剤を調製する方法に関する。

細菌およびウイルスのそれぞれに対して効果的な、抗生剤および抗ウイルス剤を包摂する、抗微生物薬剤は、動物宿主における感染を解消させるための、最も一般に展開される戦略のうちの１つであり続けている。しかし、抗微生物性耐性の発生は、微生物が、処置を回避する能力と並んで、不断の憂慮点である。さらに、新たな抗微生物療法における投資がなされていないことも、十分に記録されている。
類鼻疽菌とは、環境中のグラム陰性細菌であり、ヒト疾患である、類鼻疽の原因物質である。鼻疽菌（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）とは、タイおよびオーストラリア北部などの熱帯地域に特有であり、水田などの湿潤条件と、特に関連する。ヒトの曝露は、皮膚を介する経路を含む経路を介して生じる、例えば、ひっかき傷または他の病変の結果として生じる可能性があり、接種物のサイズに応じて、急性熱病をもたらしうる。細菌はまた、吸気を介して、ヒトに感染する結果として、より急性の肺感染ももたらしうる。

野兎病菌（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）とは、細胞内の病原体であり、疾患である、野兎病の原因物質であると考えられる。野兎病菌の、典型的な人畜共通宿主は、齧歯動物およびウサギ目動物を含むが、ヒトにおける野兎病の発生も記録されている。野兎病菌の、４つの公知の亜種（Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｈｏｌａｒｃｔｉｃａ、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｍｄｅｉａｓｉａｔｉｃａ、およびＦ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｎｏｖｉｃｉｄａ）のうち、野兎病菌亜種である、Ｆ．ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓは、特に、呼吸器経路を介して、低感染用量（＜５０コロニー形成単位）で、ヒトに感染することが可能な、最も臨床的に関与性の亜種であると考えられる。
アルファ−ウイルスである、ＶＥＥＶは、ウマおよびヒトを含む動物において、疾患を引き起こすことが可能であり、蚊およびダニなどの媒介節足動物を介して伝染する。ＶＥＥＶは、生物兵器物質としての歴史的使用と関連している。

鼻疽菌、野兎病菌、およびＶＥＥＶなどの微生物学的作用物質は、全て、効果的な医学的対抗策の開発に対する難題を提示する。鼻疽菌および野兎病菌のいずれも、自然免疫による防御を回避する機構を発生させ、宿主環境内に遷延する。特に、鼻疽菌は、複数の分泌機構および他の免疫調節機構を発達させて、細胞内の肉芽腫性病変内の、長期にわたる生存を可能とし、これにより、この病原体に接近し、効果的に処置することを、極めて困難としている。実際、１つの記録された症例は、元の曝露の６０年後に再出現する、鼻疽菌のヒト感染について記載している。同様に、ＶＥＥＶなどのウイルスも、宿主細胞内で複製する、それらの必要のために、処置するのが困難なことで有名である。脳炎ウイルスを処置する能力は、ウイルスが、血液脳関門（ＢＢＢ）により保護されるｉｎ ｖｉｖｏ部位である、脳にアクセスし、複製する場合、さらに複雑化される。

現在のところ、類鼻疽、野兎病、またはＶＥＥＶに対するワクチンは、完全には認可されていない。結果として、感染を処置するのに、既存の抗微生物剤に対する、過重な依存がなされている。しかし、以下の例は、このような感染を除去するための、既存の抗微生物剤の使用に影響しうる、律速因子を強調する。
鼻疽菌は、排出ポンプにより、抗生剤を、能動的に排出し、これにより、この細菌を、複数の抗生剤に対して耐性とし、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、効果的に処置することを、極めて困難とすることが公知である。実際、データは、単一の抗生剤投与レジメンが、鼻疽菌に対して、部分的に効果的であるに過ぎないことを示唆する。類鼻疽に対する有効性を改善するための、１つの選択肢は、組合せ療法の適用、すなわち、急性期のために、β−ラクタムおよびセファロスポリンなど、複数の抗生剤を投与して、重篤な敗血症および死亡を防止し、口腔内根絶期のために、コトリモキサゾールなどの抗生剤と、静菌性の広域スペクトル抗生剤である、クロラムフェニコールおよびドキシサイクリンとの混合物を投与して、残存する細菌を死滅させることである。しかし、このような手法は、このような抗生剤の組合せから生じうる副作用の危険性がある。

抗生剤による野兎病感染の処置はまた、抗生剤の適正な選択にも依存する。例えば、β−ラクタムおよびマクロリドは、不適切である。アミノグリコシドは、効果的でありうるが、このような抗生剤の投与は、非経口投与および毒性についての、血清レベルのモニタリングに対する要件のために、実際的でない場合がある。シプロフロキサシンは、野兎病の処置に好ましい抗生剤でありうるが、マウスモデルおよびヒト感染の発生率に由来するデータは、このレジメンが、抗生剤の投与が、中止された場合における、感染の再発のために、最適ではないことを示唆している。
現在のところ、ＶＥＥＶに対する抗ウイルス剤は、認可されていない。ウイルスは、宿主細胞内で複製する、それらの必要のために、細菌の病原体と比較して、処置するのがより困難なことで有名である。一般的なウイルス標的はまた、多種多様なウイルス（例えば、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、エンベロープウイルス）のために、同定することも困難であるため、抗ウイルス剤は、特異的なウイルス科またはウイルス属だけに対して有用である傾向がある。宿主特異的応答を、ウイルス感染へとターゲティングすることにより、より広範な手法が達成されうる。しかし、ＶＥＥＶのための療法を含む、このような療法は、いまだ最適化されていない。

したがって、細菌などの微生物の中の、抗生剤耐性に関する憂慮点一般、および選択された処置レジメンが、所望されない副作用を付与する潜在的可能性を踏まえると、疾患の、効果的で、安全で、かつ十分に忍容された処置が必要とされている。また、抗微生物剤の、病原体の処置に有益な、特定の細胞内ニッチへの送達を最適化することも所望される。このような必要は、鼻疽菌、野兎病菌、およびＶＥＥＶのそれぞれによる感染について、明らかである。

本発明は、医薬ベシクル製剤を調製するための方法であって、ａ）界面活性剤、疎水性物質、および両親媒性物質を含むベシクル成分を有機溶媒の存在下または非存在下で加熱するステップ；ｂ）医薬剤を薬学的に許容可能な担体中に溶解させ、得られた医薬剤−担体混合物を加熱するステップ；ｃ）加熱された医薬剤−担体混合物を加熱されたベシクル成分に添加して、製剤混合物をもたらすステップ；ならびにｄ）製剤混合物を加工して、医薬剤と担体とを、ベシクル成分を含むベシクル内に封入して、医薬ベシクル製剤を形成するステップを含み、医薬ベシクル製剤が、使用の前に、薬学的に許容可能な担体で復元される方法を提供する。ベシクル内に封入された医薬剤の濃度は、復元の前に測定されうる。さらに、医薬ベシクル製剤は、使用の前に、薬学的に許容可能な担体中に溶解した、既知数量の医薬剤に復元されて、二相性医薬ベシクル製剤をもたらしうる。

第１の態様に従い、本発明は、医薬ベシクル製剤を調製するための方法であって、ａ）モノパルミトイルグリセロール、コレステロールおよびリン酸ジセチルを含むベシクル成分を５０℃〜１５０℃の範囲の温度で加熱するステップ；ｂ）医薬剤を薬学的に許容可能な担体中に溶解させ、得られた医薬剤−担体混合物を３０〜９９℃の範囲で加熱するステップ；ｃ）医薬剤−担体混合物をベシクル成分に添加して、製剤混合物をもたらすステップ；ならびにｄ）製剤混合物を加工して、医薬剤と担体とが複数のベシクル内に封入された医薬ベシクル製剤を形成するステップを含み、医薬ベシクル製剤が薬学的に許容可能な担体中に溶解した、既知数量の医薬剤に復元されて、二相性医薬ベシクル製剤をもたらす方法を提供する。
当業者により理解される、「ベシクル」という用語は、医薬剤などの化合物または物質を封入するか、またはこれと会合することが可能な、ナノ粒子状構造またはマイクロ粒子状構造を指す場合がある。医薬剤と、ベシクルとの会合について記載するのに、「封入された」という用語が使用される一方で、医薬剤は、ベシクル表面に結合させられることの結果としてもまた、ベシクルと会合することが想定される。

「医薬剤」という用語は、動物に対する、生物学的効果、特に、動物内部の組織または細胞に対する生物学的効果を誘導することが可能な、１つまたは少なくとも１つの成分（すなわち、１つを超える成分を包摂する）を指す。「医薬剤」という用語は、動物における疾患の防止または処置における使用に適する、治療用成分、例えば、抗生剤、抗ウイルス剤、および／または病原体を認識するか、もしくはこれらに結合することが可能な抗体などの生物学的分子、ならびに／あるいは細菌、酵母、またはウイルスなど、特定の生物学的作用物質、および、特に、疾患を引き起こすことが可能な病原体であると考えられる、生物学的実体により発現させられる要素（例えば、タンパク質、糖タンパク質）など、ワクチンとして作用することが可能な、他の生物学的分子などの薬物を含む。疾患の例は、感染（例えば、細菌性病原体またはウイルス性病原体により引き起こされる感染）、がん、炎症性機能不全（例えば、関節炎）、糖尿病、および／またはアレルギーを含むがこれらに限定されない。「医薬剤」という用語は、疾患に対抗するために、動物の免疫応答を修飾することにより、動物の状態を改善するように作用しうる薬剤を含みうる。

「医薬剤」という用語は、ヒトなどの動物における免疫応答を刺激する能力を伴う、免疫原性成分を指す場合がある。このような免疫応答は、全身性免疫応答の場合もあり、かつ／または例えば、腸粘膜および／もしくは肺粘膜における、粘膜性免疫応答の場合もあり、これらは、体液性免疫応答を刺激する場合もあり、かつ／または細胞媒介性免疫応答を刺激する場合もある。免疫原性成分は、特異的作用物質と会合する、エピトープまたは標的（「抗原」）、例えば、動物において疾患を引き起こすことが可能な、細菌またはウイルスなどの作用物質と会合する、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、核酸、またはこれらの任意の変異体もしくは断片を表しうる。免疫原性成分は、動物における、作用物質特異的免疫応答を刺激するか、またはこれを刺激する一助となることが可能な、組換え抗原を含む抗原でありうる。

「薬学的に許容可能な担体」という用語は、その中で、医薬剤が混合されうる物質、例えば、医薬剤と混合して、溶液またはエマルジョンをもたらすことが可能な液体、および、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、医薬剤を投与するのに適する物質を指す。「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）など、当業者に公知の物質を包摂する。好ましくは、二相性製剤中の医薬担体（すなわち、それぞれ、ベシクル内に封入される医薬担体、および製剤を再構成するのに使用される医薬担体）は、同じ医薬担体である。

「医薬ベシクル製剤」という用語は、ベシクル成分から形成された複数のベシクルであって、それらの中に薬学的に許容可能な担体中の医薬剤が封入された（すなわち、それらの中に封入され、かつ／またはそれらに結合した）、複数のベシクルを指す。
方法ステップａ）およびｂ）に関して、加熱される成分に有害でない加熱温度が使用されるべきことが理解されるものとする。ステップａ）について、ベシクル成分は、約１３０℃の温度で加熱されうる。しかし、市販の自動式実験室装置（例えば、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍ製のＮａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）などのマイクロフルイディクスデバイス）の使用を包摂する方法は、低温、例えば、６５℃を利用しうる。低温で行われるステップａ）について、ベシクル成分は、有機溶媒、例えば、濃度を１００％とするメタノールの存在下で加熱されうる。
好ましくは、ステップｂ）の方法に関して、加熱温度は５０℃〜６０℃、特に６０℃である。

ステップｄ）に関して、「〜を加工すること」という用語は、非限定例に従えば、ベシクル成分／医薬剤−担体混合物から、医薬剤を封入するベシクルをもたらすことを可能とする実験室工程などの実験室工程を含む。
製剤混合物は、振とうおよび後続のペレット化により加工されうる。例えば、２５００ｒｐｍで、２分間にわたる、ボルテクシングによる振とう工程が適用されうる。代替的に、プローブ型のホモジナイザーも使用されうる。その後における、製剤混合物の濃縮は、遠心分離により達成されうる。好ましくは、製剤混合物は、例えば、１００，０００×ｇで、１時間にわたる、超遠心分離によりペレット化されうる。代替的に、ペレット化は、スピンカラムを使用するサイズ除外濾過などのサイズ除外濾過を介しても達成されうる。スピンカラム法は、自動式実験室装置上で調製されるベシクルに、特に適する。例えば、Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）上で調製されたベシクルは、ＶｉｖａＳｐｉｎカラムにより、封入されていない薬物から分離されうる。

好ましくは、加工の後、ベシクル内に封入された医薬剤の濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ブラッドフォードアッセイ、またはニンヒドリンアッセイにより測定される。
「二相性医薬ベシクル製剤」という用語は、ある量の医薬剤は、ベシクル内に封入される（すなわち、それらに結合させられ、かつ／またはそれらの中に封入される）が、残りの医薬剤は、ベシクルが懸濁させられる水溶液中に遊離する（すなわち、ベシクルに結合させられず、かつ／またはこれらの中に封入されていない）形でデザインされた製剤を指す。二相性医薬ベシクル製剤は、典型的に、医薬剤が、溶液中に所定の濃度の、同じ医薬剤に結合させられた／この中に封入されたベシクルを再懸濁させることにより調製される。好ましい組合せは、結合／封入抗生剤の、遊離抗生剤に対する５０／５０比、または平衡製剤もしくは安定製剤を達成するのに必要な比である。

本発明者らは、医薬ベシクル製剤を作製するための方法であって、医薬剤を、ベシクル担体に結合させ、かつ／またはこの中に封入する手法を最適化し、反復的な試験により、このような製剤が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける医薬の送達および有効性の、ベシクル担体の非存在下で送達される、同じ医薬剤と比べた改善をもたらすことを裏付けることを要求する方法を作出することに成功した。
本発明の方法は、それに、えり抜きの医薬剤が結合させられ、かつ／またはこの中に封入される、生体適合性で生体分解性のベシクルの作製を提供し、前記医薬剤を、動物へと送達するためのプラットフォーム技術を提供する。ベシクルの物理的特性は、本発明者らにより、医薬剤の、細胞への取込みを増強する特性；組織ターゲティング薬物送達を達成するための修飾に適する特性、例えば、病原体が常在しうるので、全病原体の除去の一助となるニッチ；バイオアベイラビリティーの増大；合成するのに廉価である特性；および凍結乾燥に適する特性を含む、一連の利点を付与することが示されている。

驚くべきことに、本発明の方法は、送達系、特に、経口投与可能な抗生剤を含む、経口投与可能な医薬剤の送達および有効性を改善する、経口送達系を提供する。さらに、方法は、医薬の副作用、特に、抗生剤誘導性の体重減少に対する保護において、送達系に予測外で高度に有意義な利益をもたらす。したがって、ベシクルプラットフォームは、抗微生物剤の経口送達のための利用に対する潜在的可能性を有するだけでなく、また、有害な副作用を引き起こしうる場合もあり、送達の増強を要求する場合もある、ある範囲の他の治療剤に対する潜在的可能性も有する。
本発明者らはまた、本発明の方法が、様々な異なる抗微生物剤を、ベシクル内に封入する（すなわち、ベシクルに結合し、かつ／またはこの中に封入する）能力を有することも示した。二相性製剤は、複数の温度および時点の、液体形態および凍結乾燥形態における安定性のために開発され、評価された。例えば、方法を使用する、抗生剤の製剤の最適化は、−２０℃で保持された場合の安定性と、最小阻害濃度（ＭＩＣ）および最小殺菌濃度（ＭＢＣ）について、非製剤化抗生剤と異ならない値を伴う、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、完全な抗微生物性活性とを保持することが裏付けられている。全ての被験温度および３カ月間にわたり、凍結乾燥状態で保管された、凍結乾燥二相性製剤の安定性は、使用についての現実的な概念を強調する。適合的であり、かつ／または新規である治療用製剤の安定性は、とりわけ、低温保管が、たやすく利用可能ではない、低中所得国（ＬＭＩＣ）へと販売される場合、ますます大きな関心の対象である。

全体として、本発明者らにより考案された方法は、送達の一助となり、ｉｎ ｖｉｖｏにおける医薬剤の有効性の点で、遊離（すなわち、ベシクル担体に結合させられず、かつ／またはこの中に封入されていない）医薬剤と比較して、明らかな生存上の利点をもたらしうる修飾に対して、極めて適合性である、ベシクルプラットフォーム技術の産出を可能とすることが示されている。さらに、本発明は、反復投与から生じる副作用（主に、体重の減少）に対して、著明に保護する。
本発明のベシクルは、例えば、使用サイトカインが上昇した状態に対する治療剤としての、空のＮＩＳＶ、または修飾ＮＩＳＶを開示する、ＰＣＴ／ＧＢ９６／０１８６１において記載されているＮＩＳＶである。当業者により理解される通り、このようなベシクルは、界面活性剤すなわち、ミセルなどの凝集物を形成する、水不溶性（または油可溶性）成分および水溶性成分の結果として、溶液中にＮＩＳＶを形成することが可能な化合物；界面活性剤と混合して、ベシクルの物理的特性が依存する二重層を形成することが可能な疎水性物質；ならびにベシクルに、負の電荷を帯びさせることから、ベシクルを安定化させ、効果的な分散をもたらす、電荷産生性の両親媒性物質を含む。

本発明に関して、選択されたベシクル成分は、界面活性剤である、モノパルミトイルグリセロールと、両親媒性物質である、コレステロールおよびリン酸ジセチルの形態にある疎水性物質とを含む。これらの特異的化合物は、本発明者らにより、特に、本発明の方法に適することが示されている。
好ましくは、界面活性剤、疎水性物質および両親媒性物質が、それぞれ５：４：１のモル比で提供される。この比は、本発明の方法において特に良好に作用することが示されている。

また、ＰＣＴ／ＧＢ９６／０１８６１においても記載されている通り、ＮＩＳＶは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、脂肪、脂肪酸、および脂質の、膜を越える輸送を容易とする物質（本明細書の後出では、このようなベシクルは、「ビロソーム」と称される）を組み込みうる。したがって、好ましくは、胆汁酸塩が、ベシクル成分中に、かつ／または医薬剤を、薬学的に許容可能な担体中に溶解させる場合に供給される。本発明者らは、ビロソームの送達が、腸組織内で、検出可能な毒性を及ぼさず、さらに、抗生剤の、ビロソーム内の経口送達が、それぞれ、鼻疽菌および野兎病菌により引き起こされる細菌性疾患についての、２つのマウスモデルにおいて、有意な生存上の利点をもたらしているので、有利であることを示した。

好ましくは、胆汁酸塩は、デオキシコール酸ナトリウム、例えば、ＰＢＳ中のデオキシコール酸ナトリウムである。
ターゲティングされる細胞または組織が必要とされる適用では、ベシクル成分が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける受容体媒介性輸送機構により認識されるリガンドをさらに含むことが好ましい。
「リガンド」という用語は、タンパク質受容体、例えば、宿主細胞受容体などの生体物質に結合することが可能であり、かつ／またはこれらと複合体を形成しうる物質を指す。リガンドの、本発明の方法により、すなわち、医薬ベシクルの形成時における、ベシクル内の封入、および／またはこれへの結合による組込みを介して作製されたベシクルとの会合は、医薬ベシクルの、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、特異的障壁を越える輸送、または例えば、宿主受容体媒介性輸送機構の結果としての、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、特異的なニッチ（例えば、細胞型、組織型、または細胞内の環境）への侵入を容易としうる。

脳へのターゲティング送達の場合、好ましくは、リガンドは、グルコサミンおよび／もしくはトランスフェリン、またはこれらの任意の変異体もしくは断片である。
タンパク質に関する記載を通して使用される、「変異体」という用語は、野生型配列、またはそれらが由来する塩基配列と異なる、アミノ酸の配列を指す場合があるが、この場合、変異体は、野生型配列または塩基配列の、所望の特性を保持する。例えば、トランスフェリンに由来する変異体は、元のトランスフェリンタンパク質と比べて、所望されるレベルの、リガンド構造／機能を保持するので、構造的／機能的変異体であると考えられるであろう。当業者により理解される通り、アミノ酸置換は、「保存的」置換、すなわち、アミノ酸を、同様の特性を伴う、別のアミノ酸で置きかえる置換の場合もあり、「非保存的」置換、すなわち、異なる特性を伴う、別のアミノ酸で置きかえる置換の場合もある。当業者によりさらに理解される通り、適切な変異体は、野生型配列または塩基配列と比較して、好ましくは、少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一であり、好ましくは、少なくとも９５％同一である。

タンパク質に関する記載を通して使用される、「断片」という用語は、典型的に、野生型配列または塩基配列の、任意のアミノ酸部分を指す場合があるが、この場合、断片は、野生型配列または塩基配列の、所望の特性（例えば、構造的特性、機能的特性）を保持する。例えば、タンパク質断片は、タンパク質の野生型配列または塩基配列のうちの、５〜１０アミノ酸の配列であって、特定のエピトープをコードし、したがって、エピトープ断片であると考えられる配列でありうる。

本発明者らは、グルコサミン（ｇＮＩＳＶを形成する）および／またはトランスフェリン（ｔＮＩＳＶを形成する）で修飾されたＮＩＳＶ（本明細書の後出において、このようなベシクルは、「ブレインソーム」と称される）が、ＢＢＢを隔てた、それらの送達を増強するように適合しているので有利であることを示した。例えば、これらのグルコサミン修飾ＮＩＳＶおよびトランスフェリン修飾ＮＩＳＶは、抗ＶＥＥＶモノクローナル抗体である、１Ａ３Ｂ−７、特に、ヒト化形である、Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７をロードされて成功している。さらに、抗体をロードされたｇＮＩＳＶも、静脈内注射により、Ｂａｌｂ／ｃマウスに送達され、抗体カーゴが、脳組織内の免疫組織化学により検出され、注射の９０分後にピークに達している。このような修飾の利益は、ＶＥＥＶ Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７モノクローナル抗体の、ＮＩＳＶ内およびｇＮＩＳＶ内のカプセル化が、ＶＥＥＶのエアロゾルモデルにおける生存を、遊離（非カプセル化）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）と比較して、著明に延長することにより裏付けられている。カプセル化による生存の利点は、肺内および脳内のウイルス負荷の減少と関連する。

好ましくは、グルコサミンは、パルミトイル化グルコサミンである。パルミチン酸は、グルコサミンへと、共有結合的に連結され、グルコサミンの疎水性を増強し、したがって、ベシクルの二重層へと挿入されるその能力を増強する。パルミトイル化グルコサミンは、自動式プロトコールにおいて使用される有機相中の溶解により、ベシクル製剤中に組み入れられうるので、グルコサミンのこの形態（すなわち、変異体）は、ｇＮＩＳＶの形成に、特に適する。好ましくは、トランスフェリンは、一級アミン基と反応して、スルフヒドリル基を付加する、トラウト試薬を使用してチオール化される。コレステロール部分は、共有結合が、チオール化リガンドと、修飾コレステロールとの間に形成されるように、コレステロール−ＰＥＧ−マレイミドにより置きかえられる。この配置は、細胞ターゲティングリガンドおよび／または組織ターゲティングリガンドが、ベシクルに接合することを可能とする。コレステロールの、コレステロール−ＰＥＧ−マレイミドに対する任意の比が想定されるが、特に、４：１が好ましい。他の細胞ターゲティングリガンドおよび／または組織ターゲティングリガンドも、同様に、ベシクルへと接合させられうるので、結果として得られるベシクルを、他の解剖学的ニッチへとターゲティングしうる。
好ましくは、医薬剤−担体混合物とベシクル成分とは、それぞれ３：１の比で提供される。本発明者らは、この比が、本発明、特にＢＢＢを越えるように適合したベシクルに特に適することを示した。

好ましくは、本発明の方法ステップは、ｇＮＩＳＶおよびｔＮＩＳＶなどの修飾ベシクルを調製するために、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）上で実施される。
本発明者らは、ＮＩＳＶおよびこれらの変異体（ビロソーム；ブレインソーム）の作製を自動化し、迅速にスケールアップする能力の、市販のＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）装置における裏付けに成功したことを示した。ｇＮＩＳＶおよびｔＮＩＳＶのいずれも、製剤の自動化および迅速なスケールアップを可能とするＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）を使用して作出された。例えば、ある範囲の抗ウイルス剤（例えば、ＩＦＮ−α２βなどのインターフェロン）をロードされたブレインソームを、迅速に作製する、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）の、さらなる有用性は、ナノベシクルを、多目的的で魅力的な薬物送達技術として際立たせる。加えて、Ｎａｎｏａｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）による、ブレインソームおよびビロソームの作製を、作出されるバッチの、サイズおよびローディングの点における特徴付けを伴い、成功裏にスケールアップし、自動化するための作業も企図されている。

医薬ベシクル製剤は、保管および／または販売の前に、凍結および凍結乾燥させられうる。この場合、好ましくは、凍結および凍結乾燥の前に、低温保護剤が添加される、例えば、濃度を１００ｍＭとするスクロースを添加する。後続の、凍結乾燥バッチの保管、および再水和の後における効能の実証も達成されている。
好ましくは、医薬剤は、抗菌剤および／または抗ウイルス剤である。
本発明者らは、二相性のＮＩＳＶ製剤およびビロソーム製剤が、ＭＩＣアッセイおよびＭＢＣアッセイにおいて、抗微生物性活性を維持することが示されることを示すことに成功した。本発明者らにより企図された各アッセイでは、ビロソーム製剤化抗生剤は、非製剤化抗生剤と同等の抗微生物性活性を及ぼしたことから、製剤化の工程が、被験抗生剤に有害な作用を及ぼさなかったことを指し示す。さらに、報告されたデータは、ビロソームによる抗生剤の送達は、有意な生存上の利点をもたらすだけでなく、また、抗生剤の反復投与および感染と関連する、体重の減少という、重篤な副作用も低減することを示す。

凍結乾燥二相性ＮＩＳＶおよびビロソーム抗生剤製剤はまた、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、それらの毒性についても評価された。抗生剤のカプセル化は、特に、抗生剤誘導性の体重減少の緩和、および軽微な臓器病態からの保護により、有益であることが理解された。特に、結果は、ビロソームが、マウスのミクロビオームに対して、有害作用を及ぼさなかったことを裏付けた。さらに、粗病態データは、ＮＩＳＶおよびビロソームが、例えば、ドキシサイクリンにより引き起こされる組織損傷に対して保護することを示唆した。したがって、本発明の方法により作出される、ＮＩＳＶ製剤およびビロソーム製剤は、十分に忍容され、抗生剤の、反復的な、毎日の投与の副作用に対抗するのに有益な特性を有する。

抗菌剤は、β−ラクタム（例えば、アモキシシリンおよびフルクロキサシリンなどのペニシリン；セファレキシンなどのセファロスポリン）、アミノグリコシド（例えば、ストレプトマイシン、カナマイシン）、クロラムフェニコール、糖ペプチド（例えば、バンコマイシン）、キノロン（例えば、シプロフロキサシン、レボフロキサシンなどのフルオロキノロン）、オキサゾリジノン（例えば、リネゾリド、テジゾリド）、スルホンアミド（例えば、スルファジアジン）、テトラサイクリン（例えば、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、オキシテトラサイクリン）、マクロリド（例えば、エリスロマイシン、クラリスロマイシン）、アンサマイシン（例えば、ゲルダナマイシン、リファマイシン）、ストレプトマイシン（例えば、プリスチナマイシンＩＡ）、およびリポペプチド（例えば、ダプトマイシン）を含む抗生剤の群から選択されうる。
好ましくは、抗菌剤は、フルオロキノロンおよびテトラサイクリンを含む群から選択される。

さらに好ましくは、抗菌剤は、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、およびドキシサイクリンを含む群から選択される。
ＮＩＳＶ製剤技術およびビロソーム製剤技術は、少なくとも３つの抗生剤（ドキシサイクリン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン）の、ＮＩＳＶおよびビロソーム内への封入の成功へと適合させられている。成分（モノパルミトイルグリセロール、リン酸ジセチル、およびコレステロール）の混合物が、迅速に加熱され、選び出された抗生剤が添加され、次いで、抗生剤−ベシクル製剤を形成するように加工される。ビロソーム製剤は、加熱段階後において、抗生剤の溶解と同時に、胆汁酸塩を添加することにより調製される。製剤が伴う抗生剤濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍｌでありうる。

作出される製剤は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおいて、安定であり、抗微生物性活性を保持するので、有利である。例えば、特徴付けは、レボフロキサシンの、ＮＩＳＶへのカプセル化が、野兎病菌に感染させたハチノスツヅリガ（ｇａｌｌｅｒｉａ）（適切な無脊椎動物感染モデル）の生存を、著明に延長することを同定した。さらなるｉｎ ｖｉｖｏデータは、ベシクル製剤が、ビロソーム−レボフロキサシン製剤およびビロソーム−ドキシサイクリン製剤のいずれによっても、類鼻疽についてのマウスモデルにおいて、生存率および生存時間を、遊離抗生剤と比較して増大させ、治療有効性を増強することを示唆する。感染についての野兎病菌モデルでも、同様の予備的所見が示されている。本発明者らは、ＮＩＳＶおよびビロソームが、例えば、シプロフロキサシンまたはレボフロキサシンの投与後における、抗生剤誘導性の体重減少に対して保護することを示した。さらに、レボフロキサシンの、経口送達型ビロソーム内のカプセル化は、肝臓内の蓄積を、２倍に増大させ、これにより、この鍵となる臓器内の抗生剤濃度を、より長期にわたり維持することから、肯定的な治療的含意をもたらす。

好ましくは、抗菌剤は、３０ｍｇ／ｍｌの濃度である。工程の持続的な開発の後、３０ｍｇ／ｍｌの抗生剤出発濃度が、特に、効果的に作用することが見出された。このような濃度は、３０ｍｇ／ｍｌの濃度の抗生剤を、薬学的に許容可能な担体へと添加することにより達成され、これが、ベシクル成分へと添加され、製剤混合物が加工される。例えば、ＨＰＬＣによる、任意の、濃度の定量の後、医薬ベシクル製剤は、ベシクル内外でほぼ等しい抗生剤濃度をもたらす、抗生剤の、薬学的に許容可能な担体中の容量および濃度で再懸濁させられた。

抗ウイルス剤は、ウイルスの侵入および脱殻の阻害剤、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤（例えば、アシクロビル）、ｍＲＮＡ阻害剤（例えば、リバビリン、カルボジン）、放出阻害剤（例えば、ノイラミニダーゼ阻害剤）、および免疫調節剤（例えば、インターフェロン）を含む抗ウイルス剤の群から選択されうる。
好ましくは、抗ウイルス剤は、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、カルボジン、ＤＺ−１３（Xie et al. Regulatory roles of c-jun in H5N1 influenza virus replication and host inflammation. Biochimica et Biophysica Acta. 1842(2014), 2479-88）、および抗ウイルス抗体、またはこれらの任意の変異体もしくは断片を含む群から選択される。
本発明者らにより開発されたブレインソームは、大型の抗体（ＶＥＥＶ Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７を含む）および／またはサイトカイン（例えば、ＩＦＮα２β）を封入することが可能であると示されているので有利である。さらに、ｇＮＩＳＶは、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、医薬剤（例えば、ＩｇＧ Ａｂ）の、脳への送達を、遊離抗体と比較して増強することが示されている。

好ましくは、抗ウイルス抗体は、Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂ、またはこの任意の変異体もしくは断片である。
本出願者らは、ＮＩＳＶおよびｇＮＩＳＶによる、Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂの送達が、遊離ｍＡｂと比較して有利であることを示した。いずれのプラットフォームも、肺内のウイルス負荷を低減し、生存を延長し、死亡率を低減する。ｇＮＩＳＶプラットフォームは、脳内のウイルス負荷を、著明に低減する。
本発明はまた、第１の態様に従い調製される、医薬ベシクル製剤も提供する。
第２の態様に従い、本発明は、ａ）モノパルミトイルグリセロール、コレステロールおよびリン酸ジセチルを含むベシクル；ｂ）医薬剤；ならびにｃ）薬学的に許容可能な担体を含む、医薬ベシクル製剤を提供する。

好ましくは、モノパルミトイルグリセロール、コレステロールおよびリン酸ジセチルは、それぞれ、５：４：１のモル比で存在する。
好ましくは、医薬ベシクル製剤は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける受容体媒介性輸送機構により認識されるリガンドをさらに含む。
好ましくは、リガンドは、グルコサミンおよび／もしくはトランスフェリン、またはこれらの任意の変異体もしくは断片である。
好ましくは、医薬ベシクル製剤のベシクル成分は、５０〜４０００ｎｍのサイズである。抗生剤を封入したベシクルについて、ベシクル成分は、好ましくは、２７００〜３４００ｎｍである。ブレインソーム（例えば、抗体を封入したブレインソーム）として修飾されたベシクルについて、サイズは、好ましくは、１００〜６００ｎｍである。

好ましくは、医薬剤は、抗菌剤および／または抗ウイルス剤である。
好ましくは、抗菌剤は、フルオロキノロンおよびテトラサイクリンを含む群から選択される。
好ましくは、抗菌剤は、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、およびドキシサイクリンを含む群から選択される。
好ましくは、抗菌剤は、３０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
好ましくは、抗ウイルス剤は、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、カルボジン、ＤＺ−１３、および抗ウイルス抗体、またはこれらの任意の変異体もしくは断片を含む群から選択される。
好ましくは、抗ウイルス抗体は、Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂ、またはこの任意の変異体もしくは断片である。

第３の態様に従い、本発明は、第２の態様に従う医薬ベシクル製剤を含む医薬キットを提供する。
第４の態様に従い、本発明は、医薬としての使用のための、第２の態様に従う医薬ベシクル製剤、または第３の態様に従う医薬キットを提供する。
好ましくは、本発明は、動物における感染の防止または処置のための医薬としての使用のための、第２の態様に従う医薬ベシクル製剤、または第３の態様に従う医薬キットを提供する。

本発明の医薬ベシクル製剤は、任意の投与経路、例えば、筋内（筋肉への）投与、皮下（皮膚の下への）投与、皮内（皮膚への）投与、腹膜内（腹膜の体腔への）投与、静脈内（静脈への）投与、鼻腔内（鼻腔を介する）投与、または吸入投与を介する非経口送達を介して、動物へと投与されうることが想定される。しかし、特に、ビロソームについて、医薬ベシクル製剤は、経口経路を介して、動物へと投与されることが好ましい。驚くべきことに、本発明の医薬ベシクル製剤は、既にバイオアベイラビリティーを有する医薬剤の、動物における、抗生剤誘導性の体重減少に対する保護；時間経過にわたる、標的組織への貯留および濃縮の改善；免疫調節効果をもたらすこと；ならびに腸内、特に、に対する腸ミクロビオームにおける毒性を付与しないことを含む利益を増進することが示されている。

好ましくは、動物は、ヒトである。
好ましくは、本発明は、類鼻疽菌、野兎病菌、またはＶＥＥＶによる感染の防止または処置における使用のための、第２の態様に従う医薬ベシクル製剤、または第３の態様に従う医薬キットを提供する。
本発明はまた、第１の態様に従う医薬ベシクル製剤を調製するための、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）の使用も提供する。
本発明の一態様における、任意の特色は、任意の適切な組合せで、本発明の、他の任意の態様へと適用されうる。特に、方法態様は、医薬ベシクル製剤態様、医薬キット態様、および／または使用態様へと適用されることが可能であり、この逆もまた成立しうる。本発明の方法は、実施例を参照することにより、実質的に、本明細書で記載される通りに、医薬ベシクル製剤、医薬キット、および使用へと拡張される。
全ての態様では、本発明は、任意の特色または特色の組合せを含みうるか、これらから本質的になりうるか、またはこれらからなりうる。
ここで、本発明は、以下の、非限定的な実施例および図面を参照しながら記載される。

液体フォーマットまたは凍結乾燥フォーマットの温度範囲で保管された場合における、二相性製剤の安定性を裏付けるグラフである。 ハチノスツヅリガ（Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）モデルにおける、ＮＩＳＶ内で製剤化されたレボフロキサシンの抗微生物機能についての、ｉｎ ｖｉｖｏ評価についてのグラフである。 抗生剤の、二相性ＮＩＳＶ製剤およびビロソーム製剤：体重変化についての、反復投与忍容性研究についてのグラフである。 反復安全性／毒性研究のための、マウス対照群における体重変化を裏付けるグラフである。 反復安全性／毒性研究の、レボフロキサシン製剤の、毎日の投与後における、マウスの体重変化を裏付けるグラフである。 反復安全性／毒性研究の、ドキシサイクリン（ｄｅｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）製剤の、毎日の投与後における、マウスの体重変化を裏付けるグラフである。 反復安全性／毒性研究の、シプロフロキサシン製剤の、毎日の投与後における、マウスの体重変化を裏付けるグラフである。 抗生剤製剤による処置後における、広範なミクロビオーム解析についてのグラフである。 ＮＩＳＶの存在下における、樹状細胞の活性化のモジュレーションについてのグラフである。 鼻疽菌のエアロゾルモデルにおける、ビロソーム−レボフロキサシンの、遊離レボフロキサシンと比較した効果についてのグラフである。 鼻疽菌のエアロゾルモデルにおける、ビロソーム−ドキシサイクリンの、遊離ドキシサイクリンと比較した効果についてのグラフである。 鼻疽菌のエアロゾル抗原投与への曝露、およびビロソーム−レボフロキサシンまたは遊離レボフロキサシンによる処置の後における、動物の体重データについてのグラフである。 野兎病菌のエアロゾルモデルにおける、ビロソーム−レボフロキサシンの、遊離レボフロキサシンと比較した効果についてのグラフである。 マウス組織内の、ウサギＩｇＧ抗体の貯留についてのグラフである。 Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂの異なる製剤による処置後における、マウス臓器内のウイルス負荷についてのグラフである。 異なるＨｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂによる処置後における、ＶＥＥＶのエアロゾルモデルにおける、マウスの生存についてのグラフである。

本発明の方法は、医薬ベシクル製剤を調製するための方法であって、ａ）モノパルミトイルグリセロール、コレステロールおよびリン酸ジセチルを含むベシクル成分を５０℃〜１５０℃の範囲の温度で加熱するステップ；ｂ）医薬剤を薬学的に許容可能な担体中に溶解させ、得られた医薬剤−担体混合物を３０〜９９℃の範囲で加熱するステップ；ｃ）医薬剤−担体混合物をベシクル成分に添加して、製剤混合物をもたらすステップ；ならびにｄ）製剤混合物を加工して、医薬剤と担体とが複数のベシクル内に封入された医薬ベシクル製剤を形成するステップを含み、医薬ベシクル製剤が薬学的に許容可能な担体中に溶解した、既知数量の医薬剤に復元されて、二相性医薬ベシクル製剤をもたらす方法を提供する。

特に、本発明の方法が、送達系、特に、経口投与可能な抗生剤を含む、経口投与可能な医薬剤の送達および有効性を改善する、経口送達系を提供することを裏付ける、多様な研究が実行されている。さらに、方法は、医薬の副作用、例えば、抗生剤誘導性の体重減少に対する保護において、送達系に、予測外かつ高度に有意義な利益をもたらす。特に、本発明者らは、鼻疽菌、野兎病菌、およびＶＥＥＶに対する、本発明の有効性を示した。

材料および方法
抗生剤
抗生剤である、レボフロキサシン≧９８．０％（ＨＰＬＣ）、ドキシサイクリンハイクレート≧９８．０％（ＨＰＬＣ）、およびシプロフロキサシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は、乾燥粉末形態で得、全ての研究で使用した。ビロソーム製剤を作り、非製剤化薬物として投与するために、抗生剤をＰＢＳ中に所定の濃度で懸濁させた。

ＶＥＥＶモノクローナル抗体の合成
ヒト化抗ＶＥＥＶモノクローナル抗体は、既に記載されている通りに作製した（S.A. Goodchild, L.M. O’Brien, J. Steven, M.R. Muller, O.J. Lanning, C.H, Logue, R.V. D’Elia, R.J. Phillpotts, S.D. Perkins. A humanised murine monoclonal antibody with broad serogroup specificity protects mice from challenge with Venezuelan equine encephalitis virus. Antiviral Res., 90(2011), 1-8）。略述すると、Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７を発現させるベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ ＤＧ４４細胞を、１０％（容量／容量）ＦＢＳ、１％抗真菌剤、２５ｍｇのゲンタマイシン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのグルタミン、１％（容量／容量）ペニシリン／ストレプトマイシン、１％（容量／容量）の非必須アミノ酸および１％（容量／容量）の必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、ならびに１０ｍＭのメトトレキサート（Ｓｉｇｍａ）を補充した、ＩＭＤＭ培地中で培養した。Ｐｒｏｓｅｐ−Ａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、ヒト化抗体を精製し、ＰＢＳに透析した。

細菌
類鼻疽菌の臨床分離株である、Ｋ９６４２３を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ研究およびｉｎ ｖｉｖｏ研究のために使用した。細菌をエアロゾル抗原投与のために、回転プラットフォーム上、３７℃のルリア培養液中で増殖させ、Ｌ−寒天プレート上で数え上げた。
野兎病菌株であるＬＶＳは、ＤＳＴＬの培養物コレクション内、−２０℃で保管されたワクチンアンプルから導出した。細菌を、補充ＢＣＧＡ（ｂｌｏｏｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｇａｒ）上、３７℃で一晩にわたり培養し、ＰＢＳに採取し、０．１５〜０．２０の間のＯＤ₆₀₀（１ｍＬ当たり１×１０⁹ＣＦＵ）を得るように希釈した。抗原投与のための細菌数は、試料の系列希釈（１：１０）において寒天上で決定した。

ウイルス調製物
組織培養物：Ｌ９２９細胞系（マウス線維芽細胞）およびＶｅｒｏ（サル腎臓）細胞系（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ＵＫ）を、推奨される培養培地を使用する、標準的方法により繁殖させた。実験の目的で、細胞を、２％（容量／容量）のウシ胎仔血清、２ｍＭのｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、および５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｌ１５ＭＭ）を補充した、ライボビッツＬ−１５培地中で維持した。培地および補充物質は全て、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＫ）により供給された。

原液：強毒力ウイルス株ＶＥＥＶ株である、ＴｒＤを調製するために、哺乳マウスに約１０３ｐｆｕのウイルスを脳内感染させた。感染脳を２４時間後に摘出し、Ｌ１５ＭＭ中に１０％の組織懸濁液として調製し、１０，０００×ｇで１５分間にわたる遠心分離により清明化させた。力価は、Ｖｅｒｏ細胞内のカルボキシメチルセルロースオーバーレイ下におけるプラーク形成により決定した。
ウイルスの滴定：ウイルスの力価は、Ｖｅｒｏ細胞内の、１．５％（質量／容量）のカルボキシメチルセルロースオーバーレイ下におけるプラーク形成により決定した。略述すると、細胞を、２４ウェルプレートに播種し（ウェル１つ当たりの細胞１×１０⁵個）、一晩にわたりインキュベートした。培地を除去し、細胞に、Ｌ１５ＭＭ中で希釈されたウイルス１００μｌをオーバーレイした。室温で３０分間にわたるインキュベーションの後、３％（質量／容量）のカルボキシメチルセルロース中で希釈された、２倍濃度のＬ１５ＭＭ １ｍｌを、各ウェルに、注意深く添加した。細胞を、７２時間にわたりインキュベートし、１０％（容量／容量）のホルマール生理食塩液で、一晩にわたり固定し、次いで、０．１％（質量／容量）のクリスタルバイオレットで染色した。プラークをカウントし、ウイルスの量を計算した。

単相性および二相性の、ＮＩＳＶ製剤およびビロソーム製剤の調製
略述すると、１−モノパルミトイルグリセロール、コレステロール、およびリン酸ジセチルを、５：４：１のモル比で組み合わせ、１３０℃に加熱した。ＮＩＳＶを調製するために、ＰＢＳ中に３０ｍｇ／ｍｌの、関与性の抗生剤を添加した。ビロソームのために、０．０２５Ｍの炭酸緩衝液中に、デオキシコール酸ナトリウムを伴う、３０ｍｇ／ｍｌの関与性の抗生剤を添加した。ベシクル成分への添加の前に、抗生剤を６０℃にあらかじめ加熱した。その後、調製物を２分間にわたり十分にボルテクシングした。抗生剤は、ベシクルの形成に応じて封入されるか、または５サイクルにわたる凍結−融解の後で封入された。封入されなかった抗生剤は、遠心分離を介して除去し、ペレット化させ、ベシクルを単相性調製物に適切な緩衝液中、または二相性調製物をもたらすように、ある量の適切な抗生剤を、ベシクル内に封入された抗生剤と同等な濃度（すなわち、５０／５０の封入調製物：遊離調製物）で含有する、適切な緩衝液中に再懸濁させた。

ＮＩＳＶは、２４．８ｍｇのモノパルミトイルグリセロール、８．２ｍｇのジセチルリン酸、および２３．２ｍｇのコレステロールを１３０℃で溶融させ、加熱されたＰＢＳ ５ｍｌを添加し、２分間にわたりボルテクシングすることにより作った。超音波処理ベシクルは、同じベシクル成分を５ｍｌのＰＢＳ中で混合し、６０分間にわたり９０℃に加熱することにより作った。その後、プローブ型超音波処理装置を使用して最大能力の２０％で４分間にわたり超音波処理した。無菌性を確保するため、Ｘ２２５照射装置を毎分２．２Ｇｙで１０Ｇｙの最終線量まで使用して、全てのベシクル試料を照射した。

Ｎ−パルミトイルグルコサミン（ＮＰＧ）の合成
８６．３ｍｇのグルコサミンを９３μｌのトリエタノールアミンおよび１５ｍｌのジメチルスルホキシド中で溶解させた。次いで、この混合物を２８３ｍｇのパルミチン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに添加し、４ｍｌのクロロホルム中で溶解させた。溶液を暗所内、室温で４８時間にわたり攪拌した。ミックスを冷却し、氷冷水を添加することにより、パルミトイル化グルコサミンを析出させた。次いで、ミックスを真空フィルターに適用して、析出物を分離した。個別の水、クロロホルム、およびエタノールによる洗浄をパルミトイル化グルコサミンに適用してから、４０℃で、４８時間にわたり乾燥させた。

ヒトホロトランスフェリンによるチオール化
トランスフェリンを１０倍モル過剰量のトラウト試薬と、２５℃で１時間にわたり混合することにより、ヒトホロトランスフェリンをチオールで修飾した。過剰量のトラウト試薬は、分子量カットオフを５ｋＤａとするＶｉｖａｓｐｉｎ ６カラムを使用して除去した。

マイクロフルイディクスを使用する、ベシクルの調製
ベシクルは、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）ｂｅｎｃｈｔｏｐ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｔｅｍｓ）を、６０℃の温度で保持された、３００μｍのＳＨＭ（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｈｅｒｒｉｎｇｂｏｎｅ ｍｉｃｒｏｍｉｘｅｒ）チップと共に使用して調製した。ベシクル成分：パルミチン、コレステロール、およびリン酸ジセチルを、メタノール（ｍｅｎｔｈｏｌ）中に、５．６２ｍｇ／ｍｌの総濃度、５：４：１の比で可溶化させ、６０℃に加熱した。抗体（ウサギＩｇＧ、ｍＡｂである、Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７、またはヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ）を、ＰＢＳ中に、２ｍｇ／ｍｌで可溶化させた。水流と、溶媒流とを、１２ｍｌ／分の組合せ流量、３：１の比で混合した。薬物のカプセル化と、ベシクルの製剤化は、マイクロフルイディクスチップ内で、同時に生じる。メタノールおよび封入されなかった薬物は、分子量カットオフを３００ｋＤａとする、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）スピンカラムを使用して除去した。封入された抗体の濃度は、標準的なブラッドフォードアッセイを使用して決定した。ｇＮＩＳＶは、６．４ｍｇのパルミトイル化グルコサミンを、メタノール中に溶解させたベシクル成分に添加して、同様に調製した。ｔＮＩＳＶは、ＰＥＧ−マレイミドを、ＮＩＳＶミックス中に組み入れることにより合成した。メタノールおよび封入されなかったカーゴを除去した後、ベシクルを、チオール化トランスフェリンと共に、２５℃で、１時間にわたりインキュベートした。次いで、過剰量のトランスフェリンは、分子量カットオフを１００ｋＤａとする、Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０カラムを使用して除去した。

ベシクル製剤のための凍結乾燥
スクロースをＮＩＳＶ調製物に１００ｍＭの濃度まで添加した。２４時間後、Ｃｈｒｉｓｔ Ｅｐｓｉｌｏｎ ２−４ＬＤ Ｆｒｅｅｚｅ Ｄｒｙｅｒ内で凍結乾燥させる前に、調製物を−８０℃で静置し、復水器温度を−７０℃として、−４０℃で４８時間にわたり乾燥させた。
ビロソームの、生物物理的特徴付け
ビロソーム調製物の大型バッチを凍結乾燥および保管のために製剤化およびアリコート分割した。アリコートを要求される通りに回収し、逆浸透水中に再懸濁させるのに続き、十分に振とうした。ベシクルサイズおよびゼータポテンシャルは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａ−ｓｉｚｅｒ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３００００ＨＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．、ＵＫ）を使用して決定した。遠心分離によりベシクルをペレット化させ、ＨＰＬＣを使用して、封入された抗生剤含量を決定した。

ＨＰＬＣ法
ＨＰＬＣ解析は、５０℃で維持されたＣ１８カラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、５μｍ）を使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ ＨＰＬＣ上で実行した。抗生剤（ドキシサイクリン、レボフロキサシンおよびシプロフロキサシン）のための移動相は、Ｈ₃ＰＯ₄およびアセトニトリルまたはメタノールにより、ｐＨ２とした、０．０２ＭのＮａ₂ＨＰＯ₄からなった。
安定性研究
ＮＩＳＶ調製物およびビロソーム調製物の各々の大型バッチを製剤化し、アリコートを−２０℃、４℃、室温、および３７℃で、液体製剤または凍結乾燥調製物として静置した。アリコートを多様な時点において回収し、凍結乾燥調製物を逆浸透水中に再懸濁させるのに続き、十分に振とうした。ベシクルサイズおよびゼータポテンシャルは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａ−ｓｉｚｅｒ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ３００００ＨＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．、ＵＫ）を使用して決定した。遠心分離により、ベシクルをペレット化させ、ＨＰＬＣを使用して、封入された抗生剤含量を決定した。
ＰＫ／ＰＤ研究
ＮＩＳＶ製剤化抗生剤およびビロソーム製剤化抗生剤（５０〜１００ｍｇ／ｋｇ）の凍結乾燥調製物を、逆浸透水中に再懸濁させ、腹腔内経路または強制経口投与により、動物に投与した。他のマウス群は、同一濃度の抗生剤を、溶液として施された。初期実験では、血液を、２４時間後までの時点において、浅静脈切開から得た。後続の実験では、マウスを終末麻酔により屠殺し、血液を心臓および肺から回収し、肝臓および脾臓を摘出した。各組織を秤量し、ホモジナイゼーションの前に、４倍容量の生理食塩液を添加した。試料を除タンパク質処理し、０．２μｍのＰＦＴＥフィルターに通した。

最小阻害濃度（ＭＩＣ）
抗生剤製剤についてのＭＩＣは、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）ガイドラインに従い、培養液微量希釈法を使用して、鼻疽菌株であるＫ９６２４３、および野兎病菌であるＳｃｈｕＳ４について決定した。アッセイは、９６ウェルマイクロ滴定プレート内のアイソセンシテスト培養液（ＢＳＡＣ）もしくはミュラーヒントン培養液（ＣＬＳＩ）、または病原体の要求に適する培養液中の抗生剤濃度を６４ｍｇ／Ｌ〜０．０３ｍｇ／Ｌの範囲とし、細菌の最終濃度を１ｍＬ当たり約５×１０⁵ＣＦＵとして実施した。３７℃で、２４時間にわたるインキュベーション後、プレートの光学濃度（ＯＤ）を自動式プレートリーダー内、５９０ｎｍの波長で読み取った。ＭＩＣは、細菌の増殖のうちの＞８０％を阻害する濃度として決定した。

最小殺菌濃度（ＭＢＣ）
抗生剤製剤についてのＭＢＣは、増殖を示さない、１００μＬのＭＩＣ希釈液アリコートをＬ−寒天プレートまたはＢＣＧＡプレートに三連で播種し、３７℃で４８時間にわたりインキュベートすることにより決定した。ＭＢＣは、元の接種物中の細菌のうちの９９．９％を死滅させる抗生剤の最低濃度として記録した。
ハチノスツヅリガ感染
ハチノスツヅリガ（Ｇ．ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）の幼虫を暗所で保管した。全てのアッセイで体重０．２〜０．３ｇの幼虫を利用した。１０ｍｌのハミルトンシリンジを使用して、左最後部腹脚を介して、接種物（幼虫１匹当たり３×１０⁶ＣＦＵの野兎病菌ＬＶＳ）のアリコート１０ｍｌを、各幼虫の血体腔に注射した。感染の後、幼虫をプラスチック製容器内でインキュベートした。１０ｍｌのハミルトンシリンジはまた、感染の２４時間後において、抗微生物剤（レボフロキサシン１５ｍｇ／ｋｇ）および対照（ＰＢＳ）を注射するのにも使用した。幼虫は、接触に応答した動きを提示しなくなったら、死んだと考えた。

ミクロビオーム研究および毒性研究
ＢＡＬＢ／ｃマウスをマウス１２匹ずつの群に割り付け、１〜７日目に経口経路（１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、毎日０．１ｍｌ）を介してＰＢＳ、空のビロソーム、空のＮＩＳＶ、抗生剤、ＮＩＳＶ−抗生剤、またはビロソーム−抗生剤で処置した。糞便試料を処置の３日前、最終投与の２４時間後（８日目）、処置の停止の１４日後（２２日目）、および２８日後（３６日目）に回収した。動物の体重および状態を、毎日記録した。８日目に、各群内の半分のマウスを屠殺し、血清、小腸、および大腸を回収した。血清試料は、−８０℃で凍結させて保管し、大腸および小腸は、内容物を除去し、渦巻き状に巻き、１０％ホルマリン中で固定した。残りのマウスは、さらに２８日間にわたり、秤量および観察してから、８日目に屠殺したマウスについて記載した通りに、屠殺し、血清および組織を採取した。

ＤＮＡの抽出およびｂＴＥＦＡＰ（登録商標）
製造元の指示書に従い、ＰｏｗｅｒＳｏｉｌ（登録商標）ＤＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ゲノムＤＮＡを糞便試料から単離した。推奨される、２５０ｍｇの土壌に対する代替物として、細胞の溶解を経るように、約２００ｍｇの糞便試料をＰｏｗｅｒＢｅａｄチューブに添加した。５０ｕＬのＣ６液を使用して、精製ＤＮＡをスピンフィルターから溶出させ、ＰＣＲ増幅まで、−２０℃で保管した。
１６Ｓのユニバーサル真正細菌プライマーである、５１５Ｆ ＧＴＧＣＣＡＧＣＭＧＣＣＧＣＧＧＴＡＡおよび８０６Ｒ ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴを利用して、ｂＴＥＦＡＰ（登録商標）ＤＮＡ解析サービスを介する方法により、各試料の微生物環境を、ＨｉＳｅｑ ２５００上で査定した。各試料は、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑ Ｐｌｕｓ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を、以下の条件：９４℃で３分間に続き、９４℃で３０秒間；５３℃で４０秒間；および７２℃で１分間の２８サイクル下で使用する、単一ステップの、３０サイクルのＰＣＲを受け；この後、７２℃で５分間にわたる、最終的な伸長ステップを実施した。ＰＣＲの後、異なる試料からの、全ての単位複製配列産物を、等濃度で混合し、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ａｍｐｕｒｅ ｂｅａｄｓ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して精製した。製造元のプロトコールに従い、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ化学反応を利用して、試料をシーケンシングした。

特許権のある解析パイプライン（ｗｗｗ．ｍｒｄｎａｌａｂ．ｃｏｍ、ＭＲ ＤＮＡ、Ｓｈａｌｌｏｗａｔｅｒ、ＴＸ）を使用して、シーケンシングから導出された、Ｑ２５配列データを加工した。配列から、バーコードおよびプライマーを取り外し、次いで、＜２００ｂｐの短い配列を除去し、塩基判定が不明確な配列を除去し、６ｂｐを超えるホモポリマーの連なりを伴う配列も除去した。次いで、配列を脱ノイズ化し、キメラ配列を除去した。ＯＴＵ（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔ）は、３％の多様性（９７％の類似性）でクラスター化し、シングルトン配列を除去した後で規定した。次いで、ＢＬＡＳＴｎを、ＧｒｅｅｎＧｅｎｅｓ／ＲＤＰ／ＮＣＢＩから導出され、集成されたデータベースに対して使用して、ＯＴＵを、分類学的に分類し、各分類学的レベルの、「カウント」ファイルおよび「百分率」ファイルの両方にコンパイルした。カウントファイルが、各試料中で、指定された分類学的分類にマップされる配列の、実際の配列数を含有するのに対し、パーセントファイルは、これらの相対百分率（比率）を含有する。

ＸＬｓｔａｔ、ＮＣＳＳ ２００７、「Ｒ」、およびＮＣＳＳ ２０１０を含む、様々なコンピュータパッケージを使用して統計学的解析を実施した。アルファ多様性解析およびベータ多様性解析は、既に記載されている通り、Ｑｉｉｍｅ（ｗｗｗ．ｑｉｉｍｅ．ｏｒｇ）を使用して行った。

樹状細胞の活性化
骨髄細胞は、８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿骨から得、ＧＭ−ＣＳＦエンリッチ完全ＤＭＥＭ（ＤＭＥＭ１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２ｍＭのＬ−グルタミン）を使用して、樹状細胞に分化させた。これは、規定的に、８０％のＣＤ１１ｃ＋細胞を結果としてもたらす。次いで、ＢＭＤＣを、２４ウェル組織培養プレート上、完全ＲＰＭＩ（ＲＰＭＩ１６４０、１０％のウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および２ｍＭのＬ−グルタミン）中に、ウェル１つ当たりの細胞１×１０⁶個で播種し、ＬＰＳ（３μｇ／ｍｌ）で刺激するか、または対照として、非刺激のまま放置した。同時に、細胞を、溶融法により作製されたＮＩＳＶ、もしくは超音波処理法により作製されたＮＩＳＶで処置するか、非処置のまま放置した。２４時間後に、細胞を採取し、フローサイトメトリーによる解析の前に、抗ＣＤ４０−ＡＰＣ、抗ＣＤ８０−ＰｅｒＣＰ、および抗ＣＤ８６−ＰＥ−Ｃｙ７の１／１００希釈液で染色した。補償電圧および光電子倍増管電圧は、単一染色対照を使用して設定した。ＦＭＯ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｉｎｕｓ ｏｎｅ）対照は、適正なゲーティング戦略を同定するために使用し、陰性対照を作製するために使用した。

動物感染研究
６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ、ＵＫ）を、クラスＩＩＩ高格納精度の堅固なアイソレーターに移し、そこで、不断の給餌および給水を施し、少なくとも５日間にわたり馴致させた。マウスを、処置群（群１つ当たり１５匹）に割り付け、５つのケージで飼育した。コンピュータ制御型送達プラットフォーム（Ｂｉａｅｒａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、マウスに、鼻腔限定曝露システムにより、エアロゾル経路を介して、５０〜１００ＣＦＵ（１０ＭＬＤ）の、鼻疽菌であるＫ９６２４３、または野兎病菌であるＳｃｈｕＳ４を抗原投与した。抗生剤投与を、感染の６時間後に開始する、最適用量未満の治療研究デザインを使用し、毎日１回７日間だけにわたり投与して、治療有効性について調べた。抗生剤であるレボフロキサシンおよびドキシサイクリンを、５０ｍｇ／ｋｇで、毎日、経口経路により送達し、処置を、７日間にわたり継続した。処置群は、ビロソーム送達型抗生剤または非製剤化抗生剤を含んだ。処置群１つ当たりのマウス５匹ずつの亜群を、感染後３日目に殺処分して、肺、脾臓、および肝臓における細菌負荷を決定した。Ｂｉａｅａｒａエアロゾルデバイスを使用して、マウスに、エアロゾルによるＶＥＥＶ Ｔｒｉｎｉｄａｄ Ｄｏｎｋｅｙ Ｓｔｒａｉｎを抗原投与した。マウスを、毎日２回ずつチェックし、臨床症状について評定し、マウスを、毎日秤量した。所定の客観的臨床徴候のセットに基づき、人道的限界に達したマウスは、速やかに殺処分した。異なる時点において、一部のマウスについては、生存時間を記録し、他のマウスは、組織を解析するために殺処分した。全ての手順および飼育は、ＵＫ Ａｎｉｍａｌ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ）Ａｃｔ（１９８６）に準拠した。

組織内のウイルスの滴定
マウス組織（脳、肺、肝臓、および脾臓）内に存在するＶＥＥＶ株であるＴｒＤの量は、Ｖｅｒｏ細胞内の滴定により決定した。組織を除去し、７０μｍのナイロン製の細胞ストレイナー（ＢＤ Ｆａｌｃｏｎ）に通すことにより、２ｍｌのＬ１５ＭＭ中でホモジナイズした。次いで、細胞懸濁液を、Ｌ１５ＭＭ中で、系列希釈（１：１０）した。希釈されたホモジネート（１００μｌ）を、単層コンフルエントのＶｅｒｏ細胞を含有する、２４ウェルプレートのウェルに添加した。細胞を、７２時間にわたりインキュベートし、この時間の後、１０％（容量／容量）のホルマール生理食塩液を添加することにより、単層を固定し、０．１％（重量／容量）のクリスタルバイオレットで染色した。

サイトカイン解析
サイトカイン解析のために、細胞懸濁液の２００ｍｌアリコートを、２０００ｒｐｍで、５分間にわたり遠心分離した。サイトカイン解析のために、上清を除去し、−８０℃で保管した。サイトカインのレベルは、製造元の指示書に従い使用される、２３プレックスマウスＬｕｍｉｎｅｘアレイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を介して測定した。加えて、洗浄ステップのために、磁気プレート洗浄機（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用し、最終的に、ＰＢＳ中に４％のパラホルムアルデヒドを、４℃で、少なくとも２４時間にわたり使用して、試料を固定した。

免疫組織化学
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織試料を使用して、組織中のウサギＩｇＧを位置特定するプロトコールを標準化した。キシレンならびにエタノールおよび水の段階系列を使用し、最後に、ＴＢＳで処理して、組織切片を、脱パラフィン化および再水和させた。プロテイナーゼＫによる酵素的消化（ＤＡＫＯ）、ならびにｐＨ６．０およびｐＨ９．０の緩衝液（ＤＡＫＯ）による高温抗原賦活化（ＨＴＡＲ）を含む、いくつかの方法を使用して、４μｍの組織切片内の抗原を賦活化させた。プロテイナーゼＫ前処理により、最良の結果が得られた。酵素的消化を停止させた（ＴＢＳ中で３回の洗浄）のに続き、ポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ５６８標識抗体を伴うインキュベーション（室温および１：１００の希釈率で３０分間にわたる）を行った。ＴＢＳにより３回にわたる洗浄の後、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ ｈａｒｄｓｅｔ封入剤（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、スライドに封入し、Ｎｉｋｏｎ Ｎｉ−ＳＥ顕微鏡内の蛍光下で研究した。
同様に、同じ抗原賦活化法（プロテイナーゼＫ）を使用して、光学顕微鏡による、ウサギＩｇＧの免疫組織学的検出のためにも、組織切片を使用した。脱ろう／再水和プロトコールは、メタノール中の過酸化水素溶液を使用して、内因性ペルオキシダーゼをクエンチングするステップを含んだ。ビオチニル化ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）（室温で、１：２００に希釈して、３０分間にわたる）に続き、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体反応（Ｐｉｅｒｃｅ）を行った。ＮＯＶＡＲＥＤ（Ｖｅｃｔｏｒ）を使用して、反応を生じさせた。
デジタル画像解析のために、ＦＦＰＥ切片を、免疫組織化学で染色した。画像解析ソフトウェア（Ｎｉｋｏｎ Ｂｒ−ＮＩＳ）を使用して、平均値強度を計算した。最大強度を１００とする。

統計学的解析
プログラムである、ＳＰＳＳ Ｖ２１．０（ＩＢＭ）またはＧｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭ Ｖ６．０を使用して、様々な統計学的解析を実施した。Ｇｒａｐｈｐａｄ ＰＲＩＳＭ Ｖ６．０を使用して、グラフを構築した。ログランク検定を使用して、生存データを比較した。連続データは、条件が満たされる場合（ガウス分布、および不等分散のためのルビーン／バートレット検定について評価するＱＱプロット）は、パラメトリック解析（ＡＮＯＶＡ、Ｔ検定、ＧＬＭ）により解析し、これらの基準が満たされない場合は、ノンパラメトリック検定（クラスカル−ワリス、マン−ホイットニー、ムード）により解析した。場合によって、対数変換などの変換を使用して、パラメトリック基準に達することも可能であった。二値データについては、分割表を使用した。ファミリーワイズエラーのための多重検定補正は、解析との個別の比較時に実施した。これらは、ボンフェローニ補正およびダン補正を含んだ。

結果
カプセル化の効率および安定性についての評価
カプセル化の効率は、遠心分離により、封入されなかった抗生剤を除去し、ＨＰＬＣを介する、速やかな解析のために、ペレットを、適切な緩衝液中に再懸濁させることにより決定した。生成された値は、ベシクルに封入された抗生剤の量を表す。定量のために、ＨＰＬＣを使用して、単相性製剤および二相性製剤の両方を、時間経過にわたる、抗生剤の、各製剤型中の貯留により決定される安定性について調べた。ＮＩＳＶ試料およびビロソーム試料の、ゼータポテンシャルおよびサイズもまた測定した。

これらの解析は、二相性製剤が、単相性製剤より、遙かに優れていることを決定したので、最初の２つの時点の後、二相性製剤だけを、引き続き安定性アッセイにかけた。ＮＩＳＶおよびビロソームの両方の二相性製剤を、液体調製物および凍結乾燥調製物の両方として、ある範囲の温度（３７℃、室温、４℃、および−２０℃）で調べた。最適の安定性は、凍結乾燥させて保管された、二相性ビロソームにより裏付けられたが、二相性製剤の全ては、抗生剤貯留の点で、研究において経過した時間（３カ月間）にわたり、比較的安定であった。レボフロキサシンおよびドキシサイクリンの二相性製剤についての代表的データを、図１に示す（時間経過にわたる、初期に封入された抗生剤の百分率）。二相性抗生剤製剤は、既に記載されている通りに作り、溶液として放置するか、または、その後、凍結乾燥（ＦＤ）させた。いずれの製剤も、様々な、異なる保管温度（３７℃、室温、４℃、または−２０℃）で放置し、製造後複数の時点（１週間後、１カ月後、３カ月後）においてアッセイして、ベシクル内の内部化を維持した抗生剤のレベルを決定した。ＦＤ製剤は、各時点において、アッセイのために再水和させた。データは、初期に封入された抗生剤の百分率として提示する）。

レボフロキサシンおよびドキシサイクリンを封入する、ビロソーム製剤技術の適合の成功についてさらに例示するために、ｍｇ／ｍｌ単位の、各製剤により送達された総抗生剤を、封入された総抗生剤の百分率と合わせて、表１に記録する。各製剤について、総抗生剤のうちの、５０％を超える抗生剤が封入された。抗生剤カーゴを伴う、ビロソームの平均値サイズは、２７００〜３４００ｎｍの範囲であり、ゼータポテンシャルは、−３０〜−２３の範囲であり、ここで、ゼータポテンシャルについての負の値は、製剤の安定性を指し示す。

表1:ビロソーム製剤の総ローディング、封入百分率、およびゼータポテンシャル。表中に提示される値は、遊離抗生剤の除去後において、HPLCを介して決定される封入濃度により、溶融法を介してビロソームを作ることから生成する。サイズおよびゼータポテンシャルの測定値は、Malvern Zeta-sizerにより決定し、データは、3例の独立試料についての生の値として提示する。平均値およびSEMを強調する。

ビロソーム製剤の安定性（ゼータポテンシャルを介して決定される）を、凍結乾燥調製物として、ある範囲の温度（室温、＋４℃、および−２０℃）、およびある範囲の製造後時間（１週間後、１カ月後、および３カ月後）において調べた（表２）。ビロソームのゼータポテンシャルは、全ての時点および全ての温度にわたり、比較的一定を維持した。室温で保持された場合の、ビロソームによるドキシサイクリン製剤では、わずかなばらつきが見られたが、これらの研究で使用された、全ての製剤は、−２０℃で保管され、製造から１カ月以内に使用された。

表2:ゼータポテンシャルにより測定される時点および保管条件に伴うビロソームの安定性。ビロソーム抗生剤製剤は、既に記載した通りに作り、その後、凍結乾燥(FD)させた。製剤を様々な異なる保管温度(37℃、室温、4℃、または-20℃)で放置し、製造後複数の時点(1週間後、1カ月後、および3カ月後)においてアッセイして、ベシクルのゼータポテンシャルを決定した。FD製剤は、各時点においてアッセイのために再水和させた。測定値は、Malvern Zeta-sizerにより決定し、データは、時点および保管条件ごとに3例ずつの独立試料についての生の値(ゼータポテンシャル)として提示する。平均値およびSEMを太字で強調する。

封入される抗生剤を低減せずに、抗生剤を含有する凍結乾燥ベシクルを、室温で、なおまたは３７℃で保管する能力は、この製剤技術の著明な利益であり、低温保管を不要とする。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、製剤の、最小阻害濃度（ＭＩＣ）および最小殺菌濃度（ＭＢＣ）についての評価
抗生剤の、ＮＩＳＶまたはビロソームによる製剤が、抗微生物機能に有害な影響を及ぼす可能性を除外するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、製剤の、野兎病菌および鼻疽菌に対するＭＩＣおよびＭＢＣについて調べた。これらのアッセイの各々では、ＮＩＳＶ製剤化抗生剤およびビロソーム製剤化抗生剤は、非製剤化抗生剤と同等の抗微生物性活性を及ぼした（表３）ことから、製剤化の工程が、抗生剤カーゴに、有害な影響を及ぼさなかったことを指し示す。

製剤化抗生剤についてのｉｎ ｖｉｔｒｏ評価に付随して、本発明者らはまた、簡単なモデルにおいて、多少とも予備的な、ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングも実行した。野兎病菌ＬＶＳを抗原投与されたミツバチガ幼虫（ハチノスツヅリガ）モデルを使用して、製剤化抗生剤は、野兎病菌ＬＶＳに感染させたハチノスツヅリガの、生存および罹患までの時間の両方を延長する、すなわち、非製剤化抗生剤と比較した、抗微生物性活性の著明な増強を及ぼすことが裏付けられた（図２Ａおよび２Ｂ；グラフに表されたデータは、群１つ当たりのハチノスツヅリガを１０匹とする、４つの独立の実験から作成された、カプランマイヤープロットである（群１つ当たりのＮの合計＝４０））。さらに、本発明者らは、蛍光標識されたＮＩＳＶが、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、マクロファージに、３０分以内に、迅速に取り込まれ、そこで、さらに９０分間にわたり、蓄積を持続することを示した。Ｉｍａｇｅ Ｓｔｒｅａｍ技術を使用して、本発明者らは、ＮＩＳＶが、個々の細胞内で、たやすく可視化されることを示した。

表3:MICおよびMBCの決定によるin vitroにおける製剤化抗生剤の抗微生物特性の評価。表において表された値は、各実験において3回ずつの技術的反復を伴う、3つの独立の実験から生成される中央値である。MICとは、増殖を阻害する最低濃度である、すなわち、値は、ODにより測定される増殖が、陽性対照の10%未満である場合に記録される。MBCとは、陽性対照の増殖のうちの99.9%を防止する最低濃度である、すなわち、寒天プレート上の、10μlの液滴に由来する細菌コロニーは存在しない。

ｉｎ ｖｉｖｏにおける、見本ＮＩＳＶ製剤および見本ビロソーム製剤の、非経口投与または経口投与の後における、組織分布の薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）についてのスクリーニング
レボフロキサシンを組み込むＮＩＳＶおよびビロソームを、ｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＰＫ／ＰＤ解析のための、見本製剤として選択した。時間経過研究では、雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（群１つ当たりのｎ＝５）に、それぞれ、腹腔内経路または経口投与経路により、ＮＩＳＶまたはビロソームを投与し、血液および組織を、２４時間中に複数の間隔で回収した。血液試料および組織試料を、ＨＰＬＣによる抗生剤濃度についての解析のために加工した。二相性のＮＩＳＶ内またはビロソーム内で製剤化され、凍結乾燥したレボフロキサシン、または遊離レボフロキサシンについての、Ｃｍａｘ（投与間隔中の最大薬物濃度）、Ｔｍａｘ（Ｃｍが観察される時点）、および曲線下面積（ＡＵＣ、すなわち、総薬物濃度−時間経過曲線下面積）の計量を、血液（パネル１）、肝臓（パネル２）、または脾臓（パネル３）について、表４に示す。ビロソーム内で経口投与されたレボフロキサシンは、肝臓貯留についてのＡＵＣ値を、２倍に増大させ、最高の効能を裏付けた。

表4:NISV内およびビロソーム内のレボフロキサシンの二相性製剤についてのPK/PD解析。遊離レボフロキサシン製剤、NISVによるレボフロキサシン製剤、およびビロソームによるレボフロキサシン製剤の腹腔内経路または経口経路を介する投与後における、血液中、肝臓内、および脾臓内の鍵となるPK/PD計量についての概要。Balb/cマウス5匹ずつの群に投与し、処置の0.25、0.5、1、2、4、8、16、および24時間後に、これらを殺処分した。ナイーブマウスを対照として使用した。Cmaxデータ、Tmaxデータ、およびAUCデータは、標準式を使用して生データから計算した。

ビロソーム製剤についての、安全性／毒性研究
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１４日間にわたり、毎日施される、シプロフロキサシン製剤、レボフロキサシン製剤、およびドキシサイクリン製剤の忍容性を査定する研究を実施した。１２０匹の雌Ｂａｌｂ／ｃマウスを、マウス１０匹ずつ、１２の群に割り付け、１〜１４日目において、方法で示した通りに処置した。動物の体重および状態を、毎日記録した。この研究中に、マウスは死ななかった。しかし、処置経路間および抗生剤製剤間で、体重の変化が見られた（図３に示される結果）。

腹腔内経路または経口経路を介して投与されたシプロフロキサシンは、実験が進行するにつれて、体重の減少を、著明に誘導することが示された（Ｐ＜０．００１）。しかし、シプロフロキサシンの、ＮＩＳＶおよびビロソームへのカプセル化は、この体重減少作用を、著明に、それぞれ、約２５％および４０％失効化させた（Ｐ＝０．００２）。腹腔内経路および経口経路の両方を介する、レボフロキサシンの、体重の減少全体に対する作用は、最小限であり、ＮＩＳＶおよびビロソームによるカプセル化は、効果を及ぼさなかった（それぞれ、Ｐ＝０．４９９およびＰ＝０．６１６）。両方の経路を介して投与された場合、実験の進行につれて、ドキシサイクリンベースの体重の減少について、強い徴候が観察された（Ｐ＜０．００１）。ビロソーム内のカプセル化は、体重の減少を、それほど変更しなかったが、ドキシサイクリン（ｄｅｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）の、ＮＩＳＶへのカプセル化は、わずかながら、肯定的な効果を及ぼした（Ｐ＝０．０９１）。

１５日目に、各群内、半分のマウスを屠殺し、剖検を実施した。残りのマウスは、剖検を実施する前に、さらに７日間にわたり、秤量および観察した。シプロフロキサシンまたはレボフロキサシンの、任意の抗生剤製剤により処置された群では、１５日目にまたは２２日目に、異常な所見が注目されなかった。ドキシサイクリン処置群では、一部の軽微な病理学的観察がなされた。１５日目に、ドキシサイクリンを経口で施されるマウスでは、異常な所見が見られなかったが、腹腔内注射を介して、ドキシサイクリンを施されるマウスは、肝臓の外縁が丸くなり、腹壁および腸（大腸および小腸）に及ぶ、腹膜の癒着が見られた。これらの所見は、全ての動物で、腹腔内群の両方（ＮＩＳＶ群およびＰＢＳ群）で一貫していた。

２２日目にもまた、ドキシサイクリンビロソームを経口で施されるマウスでは、異常な所見が見られなかった。ドキシサイクリンを、ＰＢＳ中に、経口で施される群では、２匹のマウスの肝葉が、わずかに丸くなった。腹腔内経路を介して、ドキシサイクリンで処置された群では、ＮＩＳＶカプセル化群のうちの一部に、軽微な腹膜癒着が見られたが、ＰＢＳ−ドキシサイクリン製剤で処置された、全てのマウスは、脾臓、膵臓、腸、および腎臓に及ぶ腹膜癒着を示した。全体として、これらの所見は、抗生剤のＮＩＳＶ製剤およびビロソーム製剤が、忍容性を著明に改善し、抗生剤の反復投与のための組織保護効果をもたらすことを示唆する。

反復投与の安全性／毒性研究を実行して、ビロソームによる抗生剤製剤の忍容性を査定した。マウス１０匹の群に、０．１ｍｌの（マウス１匹当たり１ｍｇの濃度の）各抗生剤を、毎日投与した。ビロソーム製剤は、経口経路により投与した。全ての群に、適切な対照（ＰＢＳ中の、遊離抗生剤）を組み入れた。マウスを、毎日秤量し、データを、出発体重からの百分率の変化として記録した。
生理食塩液中またはビロソーム内に製剤化された、異なる抗生剤による処置の、体重の増加、ミクロビオーム組成物、小腸組織学、および血清セロトニンレベルに対する効果を査定した。レボフロキサシン、ドキシサイクリン、またはシプロフロキサシンを、経口において、７日間にわたり施し、半分のマウスを、８日目に屠殺して、処置の直接的な影響を査定した。糞便ペレットを、８日目に屠殺したマウスから回収した。残りのマウスは、処置の停止後、２８日間にわたりモニタリングし、２２日目に、糞便ペレットを回収し、３６日目に、終了時の試料を回収した。

死亡は見られず、全ての動物において、小腸組織学は正常であり、群間で、血清セロトニンレベルの統計学的有意差は見られなかった（データは示さない）。しかし、処置群間で、体重増加の統計学的有意差が注目された（図４（ＰＢＳ対照群および空のビロソーム対照群）；図５（レボフロキサシン製剤）；図６（ドキシサイクリン（ｄｅｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）製剤）；図７（シプロフロキサシン製剤）；各動物についての、毎日の体重変化の百分率、および各処置群についての平均値を計算した。誤差バーは、平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す）。

ＰＢＳにより処置された群では、マウスは、８日目までに、それらの出発体重に対する、０．６％の平均値体重減少を示し、３６日目に、３．８％の平均値体重増加を示した。空のビロソームで処置されたマウスは、８日目までに、それらの出発体重に対して、平均０．３％減少し、３６日目に、７．５％の平均値体重増加を示した。ＰＢＳ中のレボフロキサシンで処置されたマウスは、８日目までに、それらの出発体重に対して、平均３．３％減少し、３６日目に、３．２％の平均値体重増加を示した。レボフロキサシンビロソームにより処置された群では、マウスは、８日目までに、それらの出発体重に対する、０．９％の平均値体重減少を示し、３６日目に、６．６％の平均値体重増加を示した。ＰＢＳ中のドキシサイクリンにより処置された群では、マウスは、８日目までに、それらの出発体重に対する、５．２％の平均値体重減少を示し、３６日目に、１．７％の平均値体重増加を示した。ドキシサイクリンビロソームで処置されたマウスは、８日目までに、それらの出発体重に対して、平均０．９％減少し、３６日目に、１．５％の平均値体重増加を示した。ＰＢＳ中のシプロフロキサシンで処置されたマウスは、８日目までに、それらの出発体重に対して、平均４．４％減少し、３６日目に、２．４％の平均値体重増加を示した。シプロフロキサシンビロソームにより処置された群では、マウスは、８日目までに、それらの出発体重に対する、０．１％の平均値体重増加を示し、３６日目に、９．１％の平均値体重増加を示した。

特に、処置の９、１０、１１、１５、２３、２７、および３６日後において、ビロソームレボフロキサシン群は、体重減少が、非製剤化レボフロキサシンで処置されたマウスより、著明に小さかった（ｐ＜０．０５）。興味深いことに、治療は、８日目に終了し、これは、３日間連続して、群間で、体重の有意差が観察されたときである。ビロソームドキシサイクリン処置群と、遊離ドキシサイクリン処置群との間では、有意差が見られなかった。
体重の増加において見られる有意差を査定するために、各動物の、百分率による体重変化についての曲線下面積（ＡＵＣ）を計算し、一元ＡＮＯＶＡ検定を使用して、群を比較した。この解析では、データを、８日目の、投与期間の終了時まで査定し、屠殺された動物については、３６日目に査定した。８日目までのデータについての解析では、ＡＮＯＶＡ検定は、群間で有意差が見られることを指し示し（ｐ＝０．０００１）、３６日目までのデータでもまた、ＡＮＯＶＡ検定は、有意差を指し示した（ｐ＝０．００２０）。データに対して群間比較を実施して、単一変数の影響を査定した。この解析が、ＰＢＳ中のシプロフロキサシンにより処置された群と、シプロフロキサシンビロソームにより処置された群との間で、統計学的有意差が見られることを指し示した（ｐ＝０．０１５２）ことは重要である。同様の正の傾向は、ＰＢＳ中のレボフロキサシンを、レボフロキサシンビロソームと対比して比較する場合、およびＰＢＳを、空のビロソームと対比して比較する場合にも見られた。

ミクロビオーム解析
ビロソームが、抗生剤誘導性の体重減少を改善する能力について探索するために、マウスのミクロビオームを、遊離抗生剤またはビロソームカプセル化抗生剤による処置後３６日間にわたりモニタリングした。マウスに抗生剤を投与し、ミクロビオームを、次世代シーケンシングにより特徴付けした。属データを、それらが属する、具体的な門に類別し、各処置群についての、百分率による存在度を計算した。データは、面グラフ／積み重ね棒グラフ上でグラフ化した。
結果は、ビロソームが、ミクロビオームに対して、有害作用を及ぼさなかったことを裏付ける（図８）。一般に、抗生剤処置の効果は、８日目に、グラム陰性菌である、バクテロイデス門（Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｔｅｓ）を低減し、グラム陽性菌である、フィルミクテス門（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）を増大させ、３６日目までに、処置前の比への、漸進的な回復をもたらす。しかし、これらの変化は、ビロソーム処置群内で、少量のウェルコミクロビウム門（Ｖｅｒｕｃｏｍｉｃｒｏｂｉａ）種の出現を伴ったが、これは、ミクロビオーム内で、有益な効果を及ぼすと考えられる。

合計５９の属を、高頻度（標本のうちの、少なくとも７５％において存在する）として規定した。これらの５９の属の、ベースライン試料中の存在には、ある程度の変動が見られたが、少なくとも５７の属は、全ての群内に存在した。８および２２日目に、わずかな表出の低減が見られたが、一部は、３６日目までに回復した。ドキシサイクリンビロソーム群の含量は、全ての時点において、他の全ての群より、実質的に少なかった。データを査定したところ、これは、他の全ての群では、高レベル存在する、クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）配列の、この群における、ほぼ完全な非存在に起因することが明らかとなった。８および２２日目における全ての試料を含む、ドキシサイクリンビロソーム群内の大半の試料が、クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）を欠いたのに対し、クロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）を有した試料は、少数であり、他の群に由来する試料の、１００〜１０００分の１のクロストリジウム綱（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ）を有した。

合計８１の属を、低頻度（標本のうちの、２５％未満において存在する）として規定した。これらの８１の属のうちの１５以下の属は、任意の時点において、任意の１つの群内に存在したが、大半の属は、大半の標本において非存在であった。全体で、これらの属は、微生物相補性の全体を、ごくわずかしか説明しないが、データは、ビロソームレボフロキサシン処置群が、これらの低頻度属について、より多様な微生物叢を有したことを示唆する。
したがって、全体として、ミクロビオーム解析は、ビロソームプラットフォームが、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、忍容良好であり、抗生剤による撹乱後の腸内において、バクテロイデス門の回復、および有益な細菌（ウェルコミクロビウム門）の増殖を促しうることを裏付けた。

免疫調節特性
骨髄細胞を、８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿骨から得、ＧＭ−ＣＳＦエンリッチ培地を使用して、骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）に分化させた。これは、規定通りに、８０％のＣＤ１１ｃ＋細胞を、結果としてもたらした。ＢＭＤＣを、９６ウェル組織培養マイクロ滴定プレート上に、ウェル１つ当たりの細胞５×１０⁵個で播種し、ＬＰＳ（３ｕｇ／ｍｌ）で刺激するか、または対照として、非刺激のまま放置した。同時に、細胞を、溶融法により作製されたＮＩＳＶ、もしくは超音波処理法により作製されたＮＩＳＶで処置するか、非処置のまま放置した。２４時間後に、細胞を採取し、フローサイトメトリーによる解析の前に、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６に対する抗体で染色した。いずれかのＮＩＳＶ製剤で処置された、ＬＰＳ非刺激細胞内では、ＣＤ４０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６のレベルは、影響を受けなかった（図９；^*ｐ＜０．０５、^**ｐ＜０．０１）。しかし、いずれかのＮＩＳＶ製剤で処置された、ＬＰＳ刺激細胞内では、ＣＤ４０およびＣＤ８０のレベルは、下方調節された（図９）。これに対し、いずれかのＮＩＳＶ製剤で処置された、ＬＰＳ刺激細胞内では、ＣＤ８６レベルが上昇したが、これは、骨髄性ＤＣの成熟に典型的である（図９）。

ｉｎ ｖｉｖｏにおける、鼻疽菌および野兎病菌による感染を処置するビロソーム製剤についての評価
抗生剤投与を、感染の６時間後に開始する、最適用量未満の治療研究デザインを使用して、類鼻疽のエアロゾルモデルにおいてレボフロキサシンおよびドキシサイクリンのビロソーム製剤の有効性について調べ、毎日１回７日間だけにわたり経口経路を介して投与して、治療有効性について調べた。処置群は、ビロソーム送達型抗生剤または非製剤化抗生剤を含み、対照群は、ＰＢＳまたは空のビロソームを施された。正確に同じデザイン、条件、および同一な処置群により、この研究を、２回にわたり反復し、解析のために、データを、層別化し、組み合わせて、ビロソームによるカプセル化についての、遊離レボフロキサシンと対比した、生存に対する有意な利点（ｐ＝０．０１４）（図１０）、およびビロソームによるカプセル化についての、遊離ドキシサイクリンと対比した、生存に対する有意な利点（ｐ＜０．００１）（図１１）を示した。グラフ上に表されたデータは、群１つ当たりのマウスを１０匹とする、カプランマイヤープロットである。いずれの図も、実験１（左上パネル）、実験２（右上パネル）、および組合せ（下パネル）の層別化データの結果を示す。ＰＢＳ処置群および空のビロソーム処置群を、対照として組み入れた。

ビロソーム内でレボフロキサシンを送達することにより付与される、遊離レボフロキサシンを上回る生存の利点に加えて、ビロソーム−レボフロキサシン処置群の体重減少は、レボフロキサシンと比較して、有意に小さかった（図１２）。表示されるデータは、個々のマウスについてのプロット（実験１（左上パネル）；実験２（右上パネル）；および箱髭図を、四分位範囲内で使用する、組合せ（下パネル）のデータ）である。ＰＢＳ処置群および空のビロソーム処置群を、対照として組み入れた。ビロソーム−レボフロキサシン処置群に由来する組合せデータが、体重減少の高度な有意差（ｐ＜０．００１、図１２）を示したように、レボフロキサシン処置群では、ビロソーム製剤を施されるマウスにおける、抗生剤誘導性の体重減少に対する保護が、極めて顕著であった。

鼻疽菌と同様に、野兎病菌の感染後においても、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ビロソーム送達型レボフロキサシンで処置した。１００ｃｆｕのエアロゾル化野兎病菌である、ＳｃｈｕＳ４（約２０ＭＬＤ）への曝露の７２時間後において、抗生剤療法（２０ｍｇ／ｋｇ）を開始し、マウス１５匹の群に、毎日、３日間だけにわたり送達した。ビロソーム送達型レボフロキサシンを、経口経路により施される動物は、死亡までの時間を、遊離レボフロキサシンを施される動物と比較して、有意に（ｐ＜０．０５）延長した（図１３）。この結果は、抗生剤のビロソーム送達の利点についての、さらなる証拠をもたらす。

細菌学的解析、免疫学的解析、および血液化学的解析は、ビロソーム抗生剤処置群と、遊離抗生剤処置群との間の変化の裏書きを示す。鼻疽菌の感染後３日目に、肺、脾臓、および肝臓の組織試料についてのサイトカイン解析は、ビロソーム−レボフロキサシン処置群において、炎症促進性サイトカインの減少を示し、これは、肝臓損傷と関連する酵素である、ＡＬＴおよびＧＧＴの低減と相関した。
ビロソームによる抗生剤送達の有益な効果についての他の証拠は、ビロソーム封入レボフロキサシンを投与されたマウスが、一部の、鍵となる炎症性サイトカインのレベルを、非製剤化レボフロキサシンを施されるマウスと比較して、有意に（ｐ＜０．０５：肺におけるＩＬ−６、脾臓におけるＩＬ−１３、肝臓におけるエオタキシン、肺および肝臓におけるＧＭ−ＣＳＦ、肝臓におけるＭＩＰ１ｂ）低減した、野兎病菌研究から導出された。バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）感染マウスにおけるサイトカインレベルの解析も、同様の傾向を示した。

全体として、データは、ビロソームによる抗生剤の送達が、有意な生存の利点をもたらすだけでなく、また、抗生剤投与の反復と関連する副作用も低減し、免疫応答をモジュレートして、これらの感染において、通常明らかな、サイトカイン誘導性の死亡率も低減することを指し示す。
ある範囲の抗ウイルス剤の、改変ＮＩＳＶ内の封入
脳炎ウイルス（例えば、ＶＥＥＶ）に効果的な治療を開発するために、ＮＩＳＶを、それらの血液脳関門（ＢＢＢ）を越える通過を容易とするように改変した。この手法は、パルミトイル化グルコサミンでコーティングするか、またはＮＩＳＶ製剤内のコレステロール部分をトランスフェリンに共有結合的に連結して、それぞれ、ｇＮＩＳＶおよびｔＮＩＳＶ（「ブレインソーム」）を創出することにより達成した。ｉｎ ｖｉｖｏにおける、Ｇｌｕｔ−１受容体（ＢＢＢの内皮組織内でよく見られる）への結合を目的として、パルミトイル化グルコサミンを、ｇＮＩＳＶに組み込んだ。同様に、ヒトホロトランスフェリンのチオール化により、ｔＮＩＳＶを調製して、ＮＩＳＶ内に含まれる、通常のコレステロールのうちの一部（２９％）を置換した、マレイミド修飾コレステロール成分への結合を可能とした。

抗体の、ＮＩＳＶおよびブレインソームへの封入を最適化するために、とりわけ、ＶＥＥＶ ｍＡｂのためのモデルとして、本発明者らは、非特異的ウサギＩｇＧを使用した。これは、ＮＩＳＶ、ｇＮＩＳＶ、およびｔＮＩＳＶへの、高効率の（２５〜３２％の封入を達成する）封入に成功した（表５）。これらの条件を使用して、ＶＥＥＶ ｍＡｂを、ｇＮＩＳＶに、同様の高効率で組み込み、ｔＮＩＳＶに製剤化した（表５）。ＩＦＮα２βもまた、優れた効率（４３％）で、ＮＩＳＶへの封入に成功した。

表5:抗ウイルスカーゴ(または代理物)をロードされたNISV変異体についての生物物理的特徴付け

自動式（スケールアップ型）ＮＩＳＶ調製についての特徴付け
ナノベシクルの作製（ブレインソームおよびビロソーム）は、選択されたコーティングを伴い、サイズ範囲を最適化したナノベシクルを調製するように、規定通りに自動化され、かつ、一貫した製造工程を達成することを目的とする、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）により、スケールアップに成功している。ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（登録商標）を使用して、ＮＩＳＶ、ブレインソーム、およびビロソームの全てを作ることに成功している（表６）。ブレインソームをもたらすための、ＮＩＳＶの改変は、ゼータポテンシャルまたはベシクルサイズの特性に対して、非コーティングＮＩＳＶと比較して、著明な影響を及ぼさなかった。

表6:自動式(スケールアップ型)NISV調製についての特徴付け

ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏにおける、ＢＢＢ−ＣＮＳへの送達の評価を含む、ＮＩＳＶ貯留の特徴付け
まず、染料は、通常の状況下では、ＢＢＢを越えることができないので、ｇＮＩＳＶを、モデルカーゴとしてのヘキスト染料で染色した。染色されたｇＮＩＳＶを、Ｂａｌｂ／ｃマウスに静脈内注射し、９０分後に、脳組織を摘出した。予測される通り、ヘキスト染料は、単独では、ＢＢＢを越えず、脳内では検出されなかった。ヘキスト染料をカプセル化したｇＮＩＳＶが、ＢＢＢを越えて、細胞の核を染色したのに対し、ヘキスト染料をカプセル化する、非改変ＮＩＳＶでは、核染色は、ほとんど検出されなかった。これらのデータは、ｇＮＩＳＶが、ＢＢＢを越え、それらのカーゴを放出することが可能であることを指し示す。
ｇＮＩＳＶが、このモデルカーゴを送達することを裏付けたので、その後、最終的に、ヒト化抗ＶＥＥＶモノクローナルＩｇＧである、Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７をカプセル化する意図で、ｇＮＩＳＶを使用して、ポリクローナルウサギ抗体（分子量：１５０ｋＤａ）をカプセル化した。

ｇＮＩＳＶ内にカプセル化されたウサギＩｇＧを、マウスへの静脈内注射により、単回において送達した初期研究は、９０分後における、マウス脳内の抗体の存在を明らかにした（図１４；組織切片を、ウサギＩｇＧについて蛍光染色し、組織切片内の全蛍光を、画像解析ソフトウェアで測定した。表示されるデータは、時点１つ当たり、群１つ当たり、３匹ずつのマウスの平均値である。遊離ＩｇＧ抗体は、対照として使用した）。脳内の抗体レベルが、４時間後までに減衰したのに対し、ｇＮＩＳＶにより送達された抗体レベルの著明な増強は、この時点においても、肝臓内および肺内に存在した。
Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７の、ｇＮＩＳＶおよびｔＮＩＳＶへのカプセル化を試みた。ウサギＩｇＧの、ｇＮＩＳＶ内の静脈内送達の後における、マウス脳についての免疫組織化学解析は、非製剤化ウサギ抗体を注射されたマウスに由来する脳組織とは対照的に、これらのマウスに由来する脳血管系と関連するだけでなく、また、脳組織内に広がったウサギ抗体の存在も裏付けた。
エアロゾル化ＶＥＥＶの感染後における、見本ＮＩＳＶ製剤についての、詳細な評価
ＶＥＥＶ ｍＡｂである、Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７（S.A. Goodchild, L.M. O’Brien, J. Steven, M.R. Muller, O.J. Lanning, C.H, Logue, R.V. D’Elia, R.J. Phillpotts, S.D. Perkins. A humanised murine monoclonal antibody with broad serogroup specificity protects mice from challenge with Venezuelan equine encephalitis virus. Antiviral Res., 90(2011), 1-8；ＷＯ２０１１０３６４３５Ａ１において、さらに開示されている）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける感染研究時に使用される、えり抜きの抗ウイルス剤であった。ＶＥＥＶ感染についての、致死性のエアロゾルモデルを、約３００ＰＦＵのＶＥＥＶ Ｔｒｉｎｉｄａｄ Ｄｏｎｋｅｙ Ｓｔｒａｉｎに曝露される、ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して使用した。この抗原投与は、感染の約２日後に、死亡までの時間を、５〜６日間の間とする、感染の臨床徴候を引き起こす。

カプセル化および凍結乾燥の工程は、ｍＡｂの活性に対して、有害な作用を及ぼさず、プラークアッセイは、遊離ｍＡｂと、ｍＡｂのＮＩＳＶ製剤およびｇＮＩＳＶ製剤とについて、同様の結果をもたらすことが裏付けられた。空のベシクル対照は、抗ウイルス活性を有さないことが示され、培地だけの対照と同じく作用した（データは示さない）。
小スケールの予備研究を行って、ＩＶ経路を介して、治療を施すことの有用性について調べた（表７）。エアロゾル経路を介して、群（ＰＢＳ対照群、空のベシクル対照群、ＶＥＥＶ Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ｍＡｂ群、ＮＩＳＶ Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ｍＡｂ群、およびｇＮＩＳＶ Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ｍＡｂ群）１つ当たり５匹ずつのＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＶＥＥＶに曝露し、静脈内処置を、感染の２４時間後に、１回施した。対照マウスが、疾患に斃れる前の、感染後５日目に、全てのマウスを殺処分した。ウイルス力価のために、脳組織および肺組織を摘出し、加工した。静脈内送達されたＮＩＳＶプラットフォームは、肺内および脳内のウイルス負荷を、著明に減少させた（ＰＢＳ対照と比較して、Ｐ＝０．００１であり、遊離ｍＡｂと比較して、Ｐ＝０．００７であり；データは示さない）。

表7:エアロゾルによるVEEV感染のNISVおよびgNISV mAbによる静脈内処置のための動物研究計画

ＮＩＳＶプラットフォーム製剤と、遊離化合物との差違を、より十分に特徴付けるために、腹腔内処置モデルを使用した（表８）。この経路は、Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ｍＡｂの有効性について評価するために、より一貫し、より適することが既に示されている。

表8:エアロゾルによるVEEV感染のNISVおよびgNISV mAbによる腹腔内処置のための動物研究計画

エアロゾルＶＥＥＶモデルを使用して、同一の処置群（ＰＢＳ対照、空のベシクル対照、ＶＥＥＶ Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ｍＡｂ、ＮＩＳＶ Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ｍＡｂ、およびｇＮＩＳＶ Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ｍＡｂ）について評価し、腹腔内経路を介して、治療を、ここでもまた、２４時間後において１回施した。これらの研究では、処置群１つ当たりのマウス合計１５匹ずつを使用し、５匹のマウスを、感染後５日目に、ウイルス学解析のために殺処分し、残る１０匹のマウスを、生存についてモニタリングした。

同一のデザインの、２つの独立の研究を実行し、全ての処置群について、同様の結果を示した。実験１では、Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ｍＡｂを封入された、ＮＩＳＶおよびｇＮＩＳＶのいずれも、肺内のウイルス負荷を、ＰＢＳ処置群と比較して低減した（それぞれ、ｐ＜０．００１およびＰ＝０．００３）。ＮＩＳＶ封入ｍＡｂはまた、遊離Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ｍＡｂと、肺内のウイルス力価の点でも、有意に異なった（ｐ＜０．００１）。ＮＩＳＶ封入ｍＡｂはまた、脾臓内でも、ＰＢＳおよび遊離Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂと比較して良好な効能を示した（それぞれ、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０５）。脳をターゲティングするように特異的にデザインされた、ｇＮＩＳＶカプセル化ｍＡｂの効能が、脳内で、他の全ての製剤および対照より、有意に良好であったことは重要である。これは、ＮＩＳＶ処置群およびｇＮＩＳＶ処置群における生存の延長をもたらし、ＮＩＳＶは、遊離Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂより、有意に良好である（ｐ＝０．００８）。

実験２では、ｇＮＩＳＶの効能は、肺内で、ＰＢＳ対照より良好であり（ｐ＝０．００３１）、脳内でも、全ての製剤と比較して、有意に良好であった。ＮＩＳＶ製剤およびｇＮＩＳＶ製剤の効能は、脾臓組織内で、ＰＢＳ対照より、有意に良好であった（それぞれ、ｐ＝０．０１４３およびＰ＜０．００１）。興味深いことに、遊離Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂもまた、脾臓内で、有益な効果を示したことから、低量のＶＥＥＶ特異的活性成分にもかかわらず、治療が効果的であったことを指し示す。この実験では、ｇＮＩＳＶ ｍＡｂは、生存を、遊離Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂと比較して、有意に（ｐ＝０．００３６）改善し、ＮＩＳＶ ｍＡｂ群も、同様の傾向を示した。

実験１および２からのデータを組み合わせると、遊離Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂの正の効果が明らかであるが、カプセル化製剤（ＮＩＳＶＳおよびｇＮＩＳＶ）によりもたらされる利点が際立っていることが、より重要なことである。ＮＩＳＶ ｍＡｂ製剤およびｇＮＩＳＶ ｍＡｂ製剤のいずれも、肺内のウイルス負荷を、ＰＢＳ対照および遊離Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂ対照と比較して、有意に低減した。さらに、ｇＮＩＳＶは、脳内のウイルス負荷も、両方の対照と比較して、有意に低減した。興味深いことに、脾臓データは、遊離Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂが、ウイルス負荷を、ＰＢＳ対照と比較して、著明に低減することにより、治療的利益をもたらすことを示したが、ＮＩＳＶ ｍＡｂ群およびｇＮＩＳＶ ｍＡｂ群の脾臓内のウイルス負荷は、遊離Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７群と、有意には異ならなかった（図１５；エアロゾル化ＶＥＥＶを抗原投与されたＢＡＬＢ／ｃマウス。処置群１つ当たりのマウス１０匹ずつを、感染後５日目に殺処分し、肺内、脳内、脾臓内、および肝臓内のウイルス力価を決定した。ＡＮＯＶＡおよび多重比較により生成されたＰ値）。

肺内および脳内の、遊離ｍＡｂの、限定的な効果は、調製物中の、ＶＥＥＶ特異的活性成分のレベルに起因する可能性が極めて高かった。しかし、これは、最適用量未満レベルの治療用化合物の有効性を増大させる能力を裏付けることにより、ＮＩＳＶカプセル化の利点をさらに強調する。これは、最適用量未満レベルの抗生剤を使用して、ＮＩＳＶ封入およびビロソーム封入の利点を裏付けた、抗生剤データと符合する。
実験１からの生存データと、実験２からの生存データとの組合せは、ＮＩＳＶ Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂ製剤およびｇＮＩＳＶ Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂ製剤のいずれの効能も、ＰＢＳおよび遊離Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡより、有意に良好であったことを示す（それぞれ、ｐ＝０．０２９４およびｐ＝０．００３０；図１６）。

全体として、このデータは、ＮＩＳＶおよびｇＮＩＳＶによる、Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂの送達が、遊離ｍＡｂと比較して有利であることを指し示す。いずれのプラットフォームも、肺内のウイルス負荷を低減し、生存を延長し、死亡率を低減する。ｇＮＩＳＶプラットフォームは、脳内のウイルス負荷を、著明に低減する。これは、医薬剤などのカーゴを、脳に送達するように、特異的にデザインされたベシクルが、この組織をターゲティングし、治療的に関与性である濃度のカーゴを送達することが可能であることを示唆するであろう。

本発明についての、上記の記載は、純粋に、例を目的としてなされたものであり、詳細の改変は、本発明の範囲内でなされうることが理解されるであろう。記載、および（適切な場合における）特許請求の範囲で開示される、各特色は、独立に提供される場合もあり、任意の適切な組合せで提供される場合もある。さらに、本発明についての記載は、方法、医薬組成物、および関連するキットを、具体的に参照してなされ、より具体的には、鼻疽菌、野兎病菌、およびＶＥＥＶに対する使用のための、医薬ベシクル製剤および関連する医薬キットを参照してなされた。当業者は、本発明のさらなる適用に想到するであろう。

Claims (29)

1. 医薬ベシクル製剤を調製するための方法であって、
   ａ）モノパルミトイルグリセロール、コレステロールおよびリン酸ジセチルを含むベシクル成分を５０℃〜１５０℃の範囲の温度で加熱するステップ；
   ｂ）医薬剤を薬学的に許容可能な担体中に溶解させ、得られた医薬剤−担体混合物を３０〜９９℃の範囲で加熱するステップ；
   ｃ）医薬剤−担体混合物をベシクル成分に添加して、製剤混合物をもたらすステップ；ならびに
   ｄ）製剤混合物を加工して、医薬剤と担体とが複数のベシクル内に封入された医薬ベシクル製剤を形成するステップ
   を含み、
   医薬ベシクル製剤が薬学的に許容可能な担体中に溶解した、既知数量の医薬剤に復元されて、二相性医薬ベシクル製剤をもたらす
   方法。
2. モノパルミトイルグリセロール、コレステロールおよびリン酸ジセチルが、それぞれ５：４：１のモル比で提供される、請求項１に記載の方法。
3. デオキシコール酸ナトリウムが、ベシクル成分中に、かつ／または医薬剤を薬学的に許容可能な担体中に溶解させる場合に提供される、請求項１〜２のいずれか１項に記載の方法。
4. ベシクル成分が、ｉｎ ｖｉｖｏにおける受容体媒介性輸送機構により認識されるリガンドをさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. リガンドが、グルコサミンおよび／もしくはトランスフェリン、またはこれらの任意の変異体もしくは断片である、請求項４に記載の方法。
6. グルコサミンが、パルミトイル化グルコサミンである、請求項５に記載の方法。
7. 共有結合が、チオール化リガンドと修飾コレステロールとの間に形成されるように、リガンドがチオール化され、コレステロール部分をコレステロール−ＰＥＧ−マレイミドにより置きかえることにより、コレステロールが修飾される、請求項４〜請求項６に記載の方法。
8. 医薬剤−担体混合物とベシクル成分とが、それぞれ３：１の比で提供される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 医薬ベシクル製剤が、加工後において、少なくとも１つの凍結乾燥および融解のサイクルを経る、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 医薬剤が、抗菌剤および／または抗ウイルス剤である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 抗菌剤が、フルオロキノロンおよびテトラサイクリンを含む群から選択される、請求項１０に記載の方法。
12. 抗菌剤が、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、およびドキシサイクリンを含む群から選択される、請求項１０〜請求項１１に記載の方法。
13. 抗菌剤が、３０ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１０〜請求項１２に記載の方法。
14. 抗ウイルス剤が、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、カルボジン、ＤＺ−１３、および抗ウイルス抗体、またはこれらの任意の変異体もしくは断片を含む群から選択される、請求項１０に記載の方法。
15. 抗ウイルス抗体が、Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂ、またはこの任意の変異体もしくは断片である、請求項１４に記載の方法。
16. ａ）モノパルミトイルグリセロール、コレステロールおよびリン酸ジセチルを含むベシクル；
    ｂ）医薬剤；ならびに
    ｃ）薬学的に許容可能な担体
    を含む医薬ベシクル製剤。
17. モノパルミトイルグリセロール、コレステロールおよびリン酸ジセチルが、それぞれ５：４：１のモル比で存在する、請求項１６に記載の医薬ベシクル製剤。
18. ｉｎ ｖｉｖｏにおける受容体媒介性輸送機構により認識されるリガンドをさらに含む、請求項１６〜請求項１７に記載の医薬ベシクル製剤。
19. リガンドが、グルコサミンおよび／もしくはトランスフェリン、またはこれらの任意の変異体もしくは断片である、請求項１８に記載の医薬ベシクル製剤。
20. ベシクルが、５０〜４０００ｎｍのサイズである、請求項１６〜請求項１９に記載の医薬ベシクル製剤。
21. 医薬剤が、抗菌剤および／または抗ウイルス剤である、請求項１６〜請求項２０に記載の医薬ベシクル製剤。
22. 抗菌剤が、フルオロキノロンおよびテトラサイクリンを含む群から選択される、請求項２１に記載の医薬ベシクル製剤。
23. 抗菌剤が、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、およびドキシサイクリンを含む群から選択される、請求項２２に記載の医薬ベシクル製剤。
24. 抗菌剤が、３０ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２１〜請求項２３に記載の医薬ベシクル製剤。
25. 抗ウイルス剤が、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、カルボジン、ＤＺ−１３、および抗ウイルス抗体、またはこれらの任意の変異体もしくは断片を含む群から選択される、請求項２１に記載の医薬ベシクル製剤。
26. 抗ウイルス抗体が、Ｈｕ１Ａ３Ｂ−７ ＶＥＥＶ ｍＡｂ、またはこの任意の変異体もしくは断片である、請求項２５に記載の医薬ベシクル製剤。
27. 請求項１６〜請求項２６に記載の医薬ベシクル製剤を含む医薬キット。
28. 医薬としての使用のための、請求項１６〜請求項２６に記載の医薬ベシクル製剤、または請求項２７に記載の医薬キット。
29. 類鼻疽菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ）、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、またはＶＥＥＶによる感染の防止または処置における使用のための、請求項１６〜請求項２６に記載の医薬ベシクル製剤、または請求項２７に記載の医薬キット。

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