DE69914563T2

DE69914563T2 - Azaindol derivate und ihre Verwendung als antithrombotische Wirkstoffe

Info

Publication number: DE69914563T2
Application number: DE69914563T
Authority: DE
Inventors: Jolie Anne Beech Grove Bastian; Matthew Joseph Carmel Fisher; Richard Waltz Indianapolis Harper; Ho-Shen Indianapolis Lin; Jefferson Ray Indianapolis McCowan; Daniel Jon Greenwood Sall; Gerald Floyd Greenwood Smith; Kumiko Indianapolis Takeuchi; Michael Robert Indianapolis Wiley; Minsheng Warren Zhang
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1998-10-30
Filing date: 1999-10-27
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2019-10-28
Also published as: US6359136B1; ES2213984T3; EP0997465B1; JP2000143663A; US6265416B1; CA2288386A1; EP0997465A1; ATE258934T1; DE69914563D1

Description

Die Erfindung betrifft Thrombininhibitoren, die als Antikoagulationsmittel bei Säugern brauchbar sind. Insbesondere betrifft sie 5- und 6-Azaindolderivate mit einer hohen Antikoagulansaktivität und einer antithrombotischen Aktivität. Daher betrifft die Erfindung neue Thrombininhibitoren, pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Verbindungen als Wirkstoffe enthalten und die Verwendung der Verbindungen zur Herstellung von Antikoagulantien zur Prophylaxe und Behandlung von Lungenembolie, arterieller Thrombose, insbesondere Myokardischämie, Myokardinfarkt und cerebraler Thrombose, allgemeinen Hyperkoagulationszuständen und lokalen Hyperkoagulationszuständen, wie nach einer Angioplastie und koronaren Bypass-Operationen, und allgemeiner Gewebeverletzung, da sie mit dem Entzündungsprozess zusammenhängt. Zusätzlich sind die antithrombotischen Mittel als Antikoagulantien bei in vitro Anwendungen brauchbar.
Der Vorgang der Blutgerinnung, die Thrombose, wird durch eine komplexe proteolytische Kaskade ausgelöst, die zur Bildung von Thrombin führt. Thrombin entfernt proteolytisch die Aktivierungspeptide von den Aα und Bβ-Ketten von Fibrinogen, das in Blutplasma löslich ist, was die Bildung von unlöslichem Fibrin auslöst.
Die Antikoagulation wird derzeit durch die Verabreichung von Heparinen und Kumarinen erreicht. Die parenterale pharmakologische Kontrolle der Koagulation und der Thrombose basiert auf der Hemmung von Thrombin durch die Verwendung der Heparine. Heparine wirken indirekt auf Thrombin durch die Beschleunigung der hemmenden Wirkung von endogenem Antithrombin III (der hauptsächliche physiologische Inhibitor von Thrombin). Da die Antithrombin III Spiegel im Plasma variieren können und da oberflächengebundenes Thrombin gegenüber diesem indirekten Mechanismus resistent zu sein scheint, können Heparine eine ineffektive Behandlung darstellen. Da man glaubt, dass Gerinnungstests mit Wirksamkeit und Sicherheit zusammenhängen, müssen die Heparinspiegel mit Gerinnungstests überwacht werden (insbesondere mit dem aktivierten partiellen Thromboplastinzeittest (APTT)). Kumarine verhindern die Bildung von Thrombin durch die Blockierung der posttranslationalen gamma-Carboxylierung bei der Synthese von Prothrombin und anderen Proteinen dieses Typs. Aufgrund ihres Wirkmechanismus kann die Wirkung von Kumarinen sich nur langsam entwickeln, nämlich 6–24 Stunden nach der Verabreichung. Ferner sind sie keine selektiven Antikoagulantien. Kumarine erfordern ebenfalls die Überwachung mit Gerinnungstests (insbesondere dem Prothrombinzeittest (PT)).
Antithrombotische Diamine sind in der WO 97/25033 A beschrieben.
Obwohl die Heparine und Kumarine wirksame Antikoagulantien sind und bis jetzt kein allgemein anerkanntes kommerzielles Arzneimittel trotz der anhaltenden Versprechungen aus dieser Verbindungsklasse hervorging, existiert ein Bedarf für Antikoagulantien, die selektiv auf Thrombin wirken und unabhängig von Antithrombin III sind, eine schnelle Hemmwirkung nach der Verabreichung, vorzugsweise einem oralen Weg, hervorrufen, und nicht mit der Lyse von Blutgerinnseln wechselwirken, wie dies zur Erhaltung der Hämostase erforderlich ist.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen, wie sie im folgenden definiert sind, starke Thrombininhibitoren sind, die nach einer oralen Verabreichung eine hohe orale Bioverfügbarkeit und bevorzugte Pharmakokinetiken aufweisen.
Die EP 0 668 279 A beschreibt 1-Benzylazaindole, die an Cycloalkylringe fusioniert sind und ihre Verwendung als antiatherosklerotische Mittel und auch als antithrombotische Mittel. Die EP 0 705 831 A beschreibt 6-Azaindole, die an der Position 1 durch Carboxyalkylgruppen substituiert sind und die zur Behandlung von Thrombose brauchbar sein sollten. Die EP 0 802 183 A beschreibt substituierte 1-Benzyl-2-phenylindole, die als östrogene Mittel wirken. Die WO 98/48797 A beschreibt substituierte 1-Benzyl-2-phenylindole als Thrombininhibitoren.
Gemäß der Erfindung wird eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon bereitgestellt
worin
eines von X und Y für N steht und das andere von X und Y für CH steht,
R^e für Wasserstoff, Methyl, Methoxy oder Halogen steht,
R¹ für Carboxy, C₁-C₄ Alkoxycarbonyl, Hydroxymethyl, -CO-NR^sR^t oder -X¹-(CH₂)_s-NR^sR^t steht, worin X¹ für eine direkte Bindung, Methylen oder O steht, s für 1 oder 2 steht mit der Maßgabe, dass wenn s für 1 steht, X¹ für eine direkte Bindung steht und R^s und R^t unabhängig für Wasserstoff oder C₁-C₃ Alkyl stehen oder die Gruppe NR^sR^t für Pyrrolidino, Piperidino oder Morpholino steht, und
R² für -X²-(CH₂)_m-NR^aR^b steht, worin X² für eine direkte Bindung, Methylen, O oder S steht, m für 1, 2, 3, 4 oder 5 steht, mit der Maßgabe, dass wenn m für 1 steht, X² dann für eine direkte Bindung steht und R^a und R^b unabhängig für Wasserstoff oder C₁-C₃ Alkyl stehen oder die Gruppe NR^aR^b für Pyrrolidino, Piperidino oder Morpholino steht, oder
R² für -X²-(CH₂)_n-R_f steht, worin X² für eine direkte Bindung, Methylen oder O steht, n für 1, 2 oder 3 steht und R^f für 5-Tetrazolyl, Carboxy, C₁-C₄ Alkoxycarbonyl oder Hydroxymethyl steht, und
mit der Maßgabe, dass zumindest eines von R¹ und R² einen basischen Aminorest -NR^sR^t oder -NR^aR^b enthält.
In dieser Beschreibung werden die folgenden Definitionen verwendet, falls nichts anderes angegeben ist: Halogen steht für Fluor, Chlor, Brom oder Iod, Alkyl, Alkoxy usw. stehen beide für gerade und verzweigte Gruppen, aber der Bezug auf einen einzelnen Rest, wie "Propyl", umfasst nur den geradkettigen ("normalen") Rest, wobei ein verzweigtkettiges Isomer, wie "Isopropyl", spezifisch erwähnt wird.
Es ist ersichtlich, dass bestimmte Verbindungen der Formel I (oder Salze oder Prodrugs usw.) in isomeren Formen vorkommen und so isoliert werden können, einschließlich cis- oder trans-Isomeren, wie auch als optisch aktive razemische oder diastereomere Formen. Es ist auch verständlich, dass die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel I als Diastereomerengemisch wie auch in Form eines einzelnen Diastereomers umfasst und dass die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel I als Enantiomerengemisch wie auch in Form eines einzelnen Enantiomers umfasst, wobei alle diese Gemische oder Formen eine hemmende Aktivität gegenüber Thrombin aufweisen, wobei es in der Technik bekannt ist, wie man bestimmte Formen herstellt oder isoliert und wie man die hemmenden Eigenschaften gegen Thrombin durch Standardtests bestimmt, einschließlich der unten beschriebenen.
Zusätzlich kann eine Verbindung der Formel I (oder ein Salz oder Prodrug usw.) einen Polymorphismus zeigen oder kann ein Solvat mit Wasser oder einem organischen Lösemittel bilden. Die vorliegende Erfindung umfasst alle solchen polymorphen Formen, jedes Solvat oder jedes Gemisch hiervon.
Besondere Bedeutungen sind im folgenden für Reste, Substituenten und Bereiche nur zur Erläuterung angegeben und sie schließen nicht andere definierte Bedeutungen oder andere Bedeutungen innerhalb der definierten Bereiche für die Reste und Substituenten aus.
Eine bestimmte Bedeutung für beispielsweise eine C₁-C₃ Alkylgruppe ist Methyl, Ethyl, Propyl oder Isopropyl und für eine C₁-C₄ Alkoxygruppe Methoxy, Ethoxy, Isopropoxy oder t-Butoxy.
Eine besondere unabhängige Bedeutung für R^e ist Methyl, Methoxy oder Brom, für R¹ -CO-NR^sR^t oder -X¹-(CH₂)_s-NR^sR^t und für R² -X²-(CH₂)_m-NR^aR^b oder -X²-(CH₂)_n-R^f, worin X² für O steht, n für 3 steht und R^f für Carboxy, C₁-C₄ Alkoxycarbonyl oder Hydroxymethyl steht.
Eine besonderere unabhängige Bedeutung für R^e ist Methoxy, für R¹ Pyrrolidinocarbonyl oder Pyrrolidinomethyl und für R² 2-Pyrrolidinoethoxy.
Eine bestimmte Verbindung der Formel I ist eine, worin R^e für Methoxy steht und R¹ für Pyrrolidinomethyl steht.
Spezifische Verbindungen der Formel I sind in den begleitenden Beispielen beschrieben.
Ein pharmazeutisch annehmbares Salz eines antithrombotischen Mittels der vorliegenden Erfindung umfasst eines, worin ein Säureadditionssalz mit einer Säure hergestellt wird, die ein pharmazeutisch annehmbares Anion liefert. Daher liefert ein Säureadditionssalz einer oben bereitgestellten neuen Verbindung der Formel I, das mit einer Säure hergestellt wird, die ein pharmazeutisch annehmbares Anion liefert, einen bestimmten Aspekt der Erfindung. Beispiele für solche Säuren werden hierin später bereitgestellt. Zusätzlich bildet eine Verbindung der Formel I, die einen sauren Rest enthält, ein mit einer Base hergestelltes Salz, das ein pharmazeutisch annehmbares Anion liefert.
Als zusätzlicher Aspekt der Erfindung wird eine pharmazeutische Formulierung geliefert, die eine Verbindung der Formel I (oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon) zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff enthält, wie dies in einer der obigen Beschreibungen bereitgestellt wird.
Eine Verbindung der Formel I kann durch Verfahren hergestellt werden, die Verfahren umfassen, welche in der Chemie zur Herstellung der Verbindungen bekannt sind oder durch ein neues hierin beschriebenes Verfahren. Ein Verfahren für eine neue Verbindung der Formel I (oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon), neue Verfahren für eine Verbindung der Formel I und neue Zwischenprodukte zur Herstellung einer Verbindung der Formel I gemäß obiger Definition stellen weitere Merkmale der Erfindung dar und werden durch die folgenden Verfahren erläutert, worin die Bedeutungen der allgemeinen Reste wie oben definiert sind, falls nichts anderes angegeben ist. Es ist ersichtlich, dass es bevorzugt oder erforderlich ist, eine Verbindung der Formel I herzustellen, worin eine funktionelle Gruppe durch eine herkömmliche Schutzgruppe geschützt wird, und die Schutzgruppe anschließend unter Bildung der Verbindung der Formel I zu entfernen.
Im allgemeinen kann eine Verbindung der Formel I gemäß einer der in Schema I angegebenen Wege, die auch in den Beispielen beschrieben sind, hergestellt werden, worin jedes von Q¹, Q² und Q^e jeweils für eine der Bedeutungen der Gruppen R¹, R² und R^e, eine geschützte Version einer solchen Gruppe oder einen Rest steht, der weiter zu einer solchen Gruppe umgewandelt werden kann. Bequemerweise wird die Verbindung der Formel (A) mittels einer starken Base deprotoniert und das entstehende Dianion wird mit einem Benzamid, wie dem gezeigten Weinreb-Amid, kondensiert und unter Bildung eines Azaindols der Formel (B) cyclisiert. Das 1-substitierte Azaindol der Formel (C) wird durch Alkylierung des Azaindols der Formel (B) mit einem Reagenz der Formel (D) erhalten. Die schließliche Umwandlung einer Gruppe Q¹, Q² oder Q^e in R¹, R² oder R^e wird an einer bequemen Stelle in Übereinstimmung mit der verwendeten Chemie ausgeführt.
Schema I
Somit wird ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon bereitgestellt, wie dies in einem der obigen Beschreibungen bereitgestellt wird, das ausgewählt ist aus:

(a) Alkylierung der Position 1 eines Azaindols der Formel II
mittels einer Verbindung der Formel III
worin L für eine herkömmliche Abgangsgruppe steht, beispielsweise mittels eines Verfahrens, das in Beispiel 1-D beschrieben ist,
(b) für eine Verbindung der Formel I, worin R¹ für -CO-NR^sR^t steht, Amidierung eines Esters der Formel I, worin R¹ für C₁-C₄ Alkoxycarbonyl steht (wie dies beispielsweise in Beispiel 1-E beschrieben ist) oder einer Säure der Formel I, worin R¹ für Carboxy oder ein aktiviertes Derivat hiervon steht, mit einem Amin der Formel H-NR^sR^t, und
(c) für eine Verbindung der Formel I, worin R¹ für -CH₂-NR^sR^t steht, Reduktion des Carbonyls einer Verbindung der Formel I, worin R¹ für -CO-NR^sR^t steht (beispielsweise unter Verwendung eines Verfahrens, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist),

¹

²

^e

Wie hierin verwendet, ist eine Abgangsgruppe ein Rest, der in einer nukleophilen Substitutionsreaktion abgespalten wird, beispielsweise eine Halogengruppe (wie Chlor, Brom oder Iod), eine Sulfonatestergruppe (wie Methylsulfonyloxy, p-Toluylsulfonyloxy oder Trifluormethylsulfonyloxy) oder reaktive Gruppen, die aus einer Behandlung eines Alkohols mit Triphenylphosphin, Diethylazodicarboxylat und Triethylamin (in einer Mitsunobureaktion) resultieren. Ein aktiviertes Derivat einer Carbonsäure umfasst beispielsweise einen Ester (wie einen Methylester), ein Säurehalogenid (wie ein Säurechlorid), einen aktivierten Ester (wie mit 1-Hydroxy-7-azobenzotriazol, 1-Hydroxybenzotriazol oder N-Hydroxysuccinimid), ein Anhydrid mit einer Carbonsäure (wie es durch die Umsetzung mit Butylchlorformiat gebildet wird) oder ein aktiviertes Derivat, das durch die Reaktion eines Kupplingsmittels gebildet wird (wie mit einem Carbodiimid, beispielsweise mit Dicyclohexylcarbodiimid oder mit 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid).
Neue Zwischenprodukt- oder Ausgangsverbindungen, wie ein Azaindol der Formel II, liefern weitere Aspekte der Erfindung.
Wie oben erwähnt, umfasst die Erfindung pharmazeutisch annehmbare Salze der Thrombinhemmenden Verbindungen, die durch die obige Formel I definiert sind. Eine Verbindung der Formel I, die einen sauren Rest trägt, bildet Salze mit pharmazeutisch annehmbaren Basen. Ein solches pharmazeutisch annehmbares Salz kann mit einer Base hergestellt werden, die ein pharmazeutisch annehmbares Kation liefert, wobei dies Alkalimetallsalze (speziell Natrium und Kalium), Erdalkalimetallsalze (speziell Calcium und Magnesium), Aluminiumsalze und Ammoniumsalze, wie auch Salze umfasst, die aus physiologisch annehmbaren organischen Basen stammen, wie Triethylamin, Morpholin, Piperidin und Triethanolamin. Die Kalium- und Natriumsalzformen sind besonders bevorzugt.
Eine bestimmte Verbindung der Formel I, die eine oder mehrere ausreichend basische funktionelle Gruppen aufweist, um mit einer von mehreren anorganischen und organischen Säuren zu reagieren, die ein physiologisch annehmbares Gegenion liefern, bildet ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz. Säuren, die herkömmlich zur Bildung pharmazeutisch annehmbarer Säureadditionssalze verwendet werden, sind anorganische Säuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Iodwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen, wie auch organische Säuren, wie p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Oxalsäure, p-Brombenzolsulfonsäure, Kohlensäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Essigsäure und dergleichen. Beispiele für solche pharmazeutisch annehmbaren Salze sind daher Sulfat, Pyrosulfat, Bisulfat, Sulfit, Bisulfit, Phosphat, Monohydrogenphosphat, Dihydrogenphosphat, Metaphosphat, Pyrophosphat, Chlorid, Bromid, Iodid, Acetat, Propionat, Decanoat, Caprylat, Acrylat, Formiat, Isobutyrat, Caproat, Heptanoat, Propiolat, Oxalat, Malonat, Succinat, Suberat, Sebacat, Fumarat, Maleat, Butin-1,4-dioat, Hexin-1,6-dioat, Benzoat, Chlorbenzoat, Methylbenzoat, Dinitrobenzoat, Hydroxybenzoat, Methoxybenzoat, Phthalat, Sulfonat, Xylolsulfonat, Phenylacetat, Phenylpropionat, Phenylbutyrat, Citrat, Lactat, γ-Hydroxybutyrat, Glycolat, Tartrat, Methansulfonat, Propansulfonat, Naphthalin-1-sulfonat, Naphthalin-2-sulfonat, Mandelat und dergleichen. Bevorzugte pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze umfassen die, die mit Mineralsäuren gebildet werden, wie Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure und Schwefelsäure.
Falls sie nicht im Handel erhältlich sind, können die erforderlichen Ausgangsmaterialien zur Herstellung einer Verbindung der Formel 1 durch Verfahren hergestellt werden, die aus Standardtechniken der organischen Chemie ausgewählt werden, einschließlich aromatischer und heteroaromatischer Substitution und Transformation, aus Techniken, die zur Synthese von bekannten, strukturell ähnlichen Verbindungen analog sind, und Techniken, die analog zu den oben beschriebenen Verfahren oder zu den in den Beispielen beschriebenen Verfahren analog sind. Es ist dem Fachmann bekannt, dass eine Vielzahl an Sequenzen zur Herstellung der Ausgangsmaterialien erhältlich ist. Ausgangsmaterialien, die neu sind, liefern einen weiteren Aspekt der Erfindung.
Im allgemeinen werden die erfindungsgemäßen Verbindungen am besten in Form der Säureadditionssalze isoliert. Salze der Verbindungen der Formel I, wie die, die mit den oben erwähnten Säuren gebildet werden, sind als pharmazeutisch annehmbare Salze zur Verabreichung der antithrombotischen Mittel und zur Herstellung von Formulierungen dieser Mittel brauchbar. Es können andere Säureadditionssalze hergestellt und zur Isolierung und Reinigung der Verbindungen verwendet werden.
Wie oben erwähnt werden die optisch aktiven Isomere und Diastereomere der Verbindungen der Formel I auch als Teil der Erfindung betrachtet. Solche optisch aktiven Isomere können aus ihren jeweiligen optisch aktiven Vorläufern durch die oben beschriebenen Verfahren oder durch die Auftrennung der razemischen Gemische hergestellt werden. Diese Auftrennung kann durch Derivatisierung mit einem chiralen Reagenz ausgeführt werden, gefolgt von einer Chromatographie oder durch wiederholte Kristallisation. Die Entfernung des chiralen Auxiliars durch Standardverfahren ergibt im wesentlichen optisch reine Isomere der Verbindungen der vorliegenden Erfindung oder ihrer Vorläufer. Weitere Details in Bezug auf Auftrennungen können von Jaques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions, John Wiley & Sons 1981 erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen dürften ohne deutliche Beeinflussung der natürlichen Gerinnselauflösungsfähigkeit des Körpers (die Verbindungen weisen eine geringe hemmende Wirkung auf die Fibrinolyse auf) Thrombin selektiv gegenüber anderen Proteinasen und Nichtenzymproteinen hemmen, die in der Blutgerinnung beteiligt sind. Ferner dürfte eine solche Selektivität die Verwendung mit thrombolytischen Mitteln erlauben, ohne die Thrombolyse und Fibrinolyse wesentlich zu beeinträchtigen.
Die Erfindung liefert eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon nach der Definition von Anspruch 1 zur Verwendung bei der Antikoagulationstherapie. Beispielsweise können die erfindungsgemäßen Verbindungen bei der Hemmung von Thrombin bei einem Säuger oder bei einem Verfahren zur Behandlung einer thromboembolischen Störung bei einem Säuger verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch in einem Verfahren zur Hemmung der Koagulation bei Säugern verwendet werden.
Die Behandlung der Thrombinhemmung, Gerinnungshemmung und thromboembolischen Störung, die durch das vorliegende Verfahren beschrieben wird, umfasst die medizinisch-therapeutische und/oder prophylaktische Behandlung, wie dies geeignet ist.
In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von Zuständen bei einem Menschen oder einem anderen Säuger verwendet werden, bei denen die Hemmung von Thrombin erforderlich ist. Die erfindungsgemäßen Verbindungen dürften bei Säugern, einschließlich dem Menschen, zur Behandlung oder Prophylaxe von Thrombose und Hyperkoagulabilität in Blut und Geweben brauchbar sein. Krankheitszustände, bei denen die Verbindungen eine potentielle Brauchbarkeit aufweisen, sind bei der Behandlung oder Prophylaxe von Thrombose und Hyperkoagulabilität in Blut und Geweben gegeben. Krankheitszustände, bei denen die Verbindungen eine potentielle Brauchbarkeit bei der Behandlung und/oder Prophylaxe haben, sind unter anderem venöse Thrombose und pulmonale Embolie, arterielle Thrombose, wie myokardiale Ischämie, Myokardinfarkt, instabile Angina, auf Thrombosen beruhender Schlaganfall und periphere arterielle Thrombose. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Behandlung oder Prophylaxe von arteriosklerotischen Störungen (Erkrankungen), wie koronarer arterieller Erkrankung, cerebraler arterieller Erkrankung und peripherer arterieller Erkrankung. Ferner dürften die Verbindungen zusammen mit Thrombolytika beim Myokardinfarkt brauchbar sein. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Prophylaxe einer Reokklusion nach einer Thrombolyse, einer perkutanen transluminalen Angioplastie (PTCA) und koronaren Bypassoperationen. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Prävention der Rethrombose nach einer Mikrooperation. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Antikoagulationsbehandlung in Zusammenhang mit künstlichen Organen und Herzklappen. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei der Antikoagulationsbehandlung bei einer Hämodialyse und disseminierter intravaskulärer Koagulation. Eine weitere erwartete Brauchbarkeit ist beim Waschen von Kathetern und mechanischen Vorrichtungen, die in Patienten in vivo verwendet wurden und als ein Antikoagulans zur Konservierung von Blut, Plasma und anderen Blutprodukten in vitro. Ferner haben die Verbindungen eine erwartete Brauchbarkeit bei anderen Krankheiten, bei denen die Blutgerinnung ein fundamentaler beitragender Prozess oder eine Quelle einer sekundären Pathologie sein könnte, wie bei Krebs, einschließlich Metastasierung, entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Arthritis, und Diabetes. Die Antikoagulationsverbindung wird oral, parenteral, beispielsweise durch intravenöse Infusion (iv), intramuskuläre Injektion (im) oder subkutan (sc) verabreicht.
Die bestimmte Dosis einer erfindungsgemäß verabreichten Verbindung zur Erlangung von therapeutischen und/oder prophylaktischen Wirkungen wird natürlich durch die bestimmten, den Fall umgebenden Umstände bestimmt, beispielsweise der verabreichten Verbindung, der Verabreichungsgeschwindigkeit, des Verabreichungswegs und des zu behandelnden Zustands.
Eine typische Tagesdosis für jede der obigen Anwendungen liegt zwischen etwa 0,01 mg/kg und etwa 1000 mg/kg. Der Dosisplan kann variieren, beispielsweise kann zur prophylaktischen Verwendung eine einzelne Tagesdosis verabreicht werden oder es können mehrere Dosen, wie drei- oder fünfmal täglich, geeignet sein. Bei kritischen Gesundheitszuständen wird eine erfindungsgemäße Verbindung durch i. v. Infusion mit einer Geschwindigkeit zwischen etwa 0,01 mg/kg/h und etwa 20 mg/kg/h und vorzugsweise zwischen etwa 0,1 mg/kg/h und etwa 5 mg/kg/h verabreicht.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zusammen mit einem gerinnselauflösenden Mittel, beispielsweise Gewebsplasminogenaktivator (tPA), modifiziertem tPA, Streptokinase oder Urokinase verwendet werden. In Fällen, bei denen eine Gerinnselbildung aufgetreten ist und eine Arterie oder Vene entweder teilweise oder völlig blockiert ist, wird gewöhnlich ein gerinnselauflösendes Mittel verwendet. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann vor oder zusammen mit dem Lysemittel oder anschließend an dessen Verwendung verabreicht werden, und wird ferner vorzugsweise zusammen mit Aspirin verabreicht, um das Wiederauftreten der Gerinnselbildung zu vermeiden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zusammen mit einem Blutplättchenglykoproteinrezeptor (IIb/IIIa) Antagonisten verwendet werden, der die Blutplättchenaggregation hemmt. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann vorher oder zusammen mit dem IIb/IIIa Antagonisten oder anschließend an dessen Verwendung verabreicht werden, um das Auftreten oder Wiederauftreten der Gerinnselbildung zu vermeiden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch zusammen mit Aspirin verwendet werden. Eine erfindungsgemäße Verbindung kann vorher oder zusammen mit Aspirin oder anschließend an dessen Verwendung verabreicht werden, um das Auftreten oder das Wiederauftreten der Gerinnselbildung zu vermeiden. Wie oben erwähnt, wird vorzugsweise eine erfindungsgemäße Verbindung zusammen mit einem gerinnselauflösenden Mittel und Aspirin verabreicht.
Die Erfindung liefert auch pharmazeutische Formulierungen zur Verwendung im oben beschriebenen therapeutischen Verfahren. Erfindungsgemäße pharmazeutische Formulierungen umfassen eine wirksame Thrombin-hemmende Menge einer Verbindung der Formel I zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Hilfsstoff oder Verdünnungsmittel. Zur oralen Verabreichung wird die antithrombotische Verbindung in Gelatinekapseln oder Tabletten formuliert, die Hilfsstoffe enthalten können, wie Bindemittel, Gleitmittel, Zerfallshilfsmittel und dergleichen. Zur parenteralen Verabreichung wird das Antithrombotikum in einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel formuliert, beispielsweise. physiologische Kochsalzlösung (0,9 Prozent), 5 Prozent Glucose, Ringerlösung und dergleichen.
Die erfindungsgemäße Verbindung kann in Einheitsdosierungsformulierungen formuliert werden, die eine Dosis zwischen etwa 0,1 mg und etwa 1000 mg umfassen. Vorzugsweise liegt die Verbindung in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes vor, wie beispielsweise dem Sulfatsalz, Acetatsalz oder Phosphatsalz. Ein Beispiel für eine Einheitsdosierungsformulierung umfasst 5 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung als pharmazeutisch annehmbares Salz in einer sterilen 10 ml Glasampulle. Ein weiteres Beispiel für eine Einheitsdosierungsformulierung umfasst etwa 10 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung als pharmazeutisch annehmbares Salz in 20 ml isotonischer Kochsalzlösung, die in einer sterilen Ampulle enthalten sind.
Die Verbindungen können auf eine Vielzahl an Arten verabreicht werden, einschließlich oral, rektal, transdermal, subkutan, intravenös, intramuskulär und intranasal. Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden vorzugsweise vor der Verabreichung formuliert. Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Formulierung, die eine wirksame Menge einer neuen Verbindung der Formel 1 oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat hiervon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff hierfür enthält.
Der Wirkstoff umfasst in solchen Formulierungen 0,1 bis 99,9 Gewichtsprozent der Formulierung. Mit "pharmazeutisch annehmbar" ist gemeint, dass der Träger, das Verdünnungsmittel oder der Hilfsstoff mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel sein muss und für den Empfänger hiervon nicht schädlich sein darf.
Die vorliegenden pharmazeutischen Formulierungen werden durch gut bekannte Verfahren und mit bekannten und leicht verfügbaren Inhaltsstoffen hergestellt. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können unter Verwendung von in der Technik gut bekannten Verfahren so formuliert werden, dass sie eine schnelle, anhaltende oder verzögerte Freisetzung des Wirkstoffs nach der Verabreichung an den Patienten bereitstellen. Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wird der Wirkstoff gewöhnlich mit einem Träger gemischt oder mit einem Träger verdünnt oder in einem Träger eingeschlossen, der in Form einer Kapsel, eines Sachets, eines Papiers oder eines anderen Behälters vorliegen kann. Wenn der Träger als Verdünnungsmittel dient, kann dies ein festes, halbfestes oder flüssiges Material sein, das als Vehikel, Hilfsstoff oder Medium für den Wirkstoff dient. Daher können die Zusammensetzungen vorliegen in Form von Tabletten, Pillen, Pulvern, Lonzetten, Sachets, Cachets, Elixieren, Suspensionen, Emulsionen, Lösungen, Sirupen, Aerosolen (als Feststoff oder in einem flüssigen Medium), Weich- und Hartgelatinekapseln, Zäpfchen, sterilen injizierbaren Lösungen, sterilen verpackten Pulvern und dergleichen.
Die folgenden Formulierungsbeispiele sind nur erläuternd und sollen den Schutzumfang der Erfindung in keiner Weise beschränken. "Wirkstoff" meint natürlich eine Verbindung gemäß Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Solvat hiervon. Formulierung 1 Hartgelatinekapseln werden unter Verwendung folgender Inhaltsstoffe hergestellt

Menge (mg/Kapsel)

Wirkstoff 250

Stärke, getrocknet 200

Magnesiumstearat 10

Gesamt 460 mg

Formulierung 2 Eine Tablette wird unter Verwendung der folgenden Inhaltsstoffe hergestellt

Menge (mg/Tablette)

Wirkstoff 250

mikrokristalline Cellulose 400

pyrogen hergestelltes Siliciumdioxid 10

Stearinsäure 5

Gesamt 665 mg
Die Bestandteile werden vermischt und unter Bildung von Tabletten gepresst, wobei jede 665 mg wiegt. Formulierung 3 Eine Aerosollösung, die die folgenden Bestandteile enthält, wird hergestellt

Gewicht

Wirkstoff 0,25

Ethanol 25,75

Propellant 22 (Chlordifluormethan) 70,00

Gesamt 100,00

Der Wirkstoff wird mit Ethanol gemischt und das Gemisch wird zu einem Teil Propellant 22 gegeben, auf –30°C abgekühlt und in ein Abfüllgerät gegeben. Die erforderliche Menge wird anschließend in einen Edelstahlbehälter gefüllt und mit dem Rest des Propellants verdünnt. Die Ventileinheiten werden anschließend am Behälter angebracht. Formulierung 4 Tabletten, die jeweils 60 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt

Wirkstoff	60 mg
Stärke	45 mg
Mikrokristalline Cellulose	35 mg
Polyvinylpyrrolidon (als 10% Lösung in Wasser)	4 mg
Natriumcarboxymethylstärke	4,5 mg
Magnesiumstearat	0,5 mg
Talkum	1 mg
Gesamt	150 mg

Der Wirkstoff, die Stärke und die Cellulose werden durch ein Nr. 45 Mesh U.S. Sieb gegeben und sorgfältig vermischt. Die wässrige Lösung, die Polyvinylpyrrolidon enthält, wird mit dem entstehenden Pulver vermischt und das Gemisch wird anschließend durch ein Nr. 14 Mesh U.S. Sieb gegeben. Die so hergestellten Granula werden bei 50°C getrocknet und durch ein Nr. 18 Mesh U.S. Sieb gegeben. Die Natriumcarboxymethylstärke, das Magnesiumstearat und das Talkum werden, nachdem sie vorher durch ein Nr. 60 Mesh U.S. Sieb gegeben wurden, zu den Granula gegeben und nach dem Mischen in einer Tablettenmaschine unter Bildung von Tabletten gepresst, die jeweils 150 mg wiegen. Formulierung 5 Kapseln, die jeweils 80 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt

Wirkstoff 80 mg

Stärke 59 mg

Mikrokristalline Cellulose 59 mg

Magnesiumstearat 2 mg

Gesamt 200 mg
Der Wirkstoff, die Cellulose, die Stärke und das Magnesiumstearat werden gemischt, durch ein Nr. 45 Mesh U.S. Sieb gegeben und in Hartgelatinekapseln in 200 mg Mengen abgefüllt. Formulierung 6 Zäpfchen, die jeweils 225 mg des Wirkstoffs enthalten, werden folgendermaßen hergestellt

Wirkstoff 225 mg

Gesättigte Fettsäureglyceride 2 000 mg

Gesamt 2 225 mg
Der Wirkstoff wird durch ein Nr. 60 Mesh U.S. Sieb gegeben und in den gesättigten Fettsäureglyceriden suspendiert, die vorher bei möglichst geringer Hitze geschmolzen werden. Das Gemisch wird anschließend in eine Zäpfchenform mit einer nominalen Kapazität von 2 g gegossen und abgekühlt. Formulierung 7 Suspensionen, die jeweils 50 mg des Wirkstoffs pro 5 ml Dosis enthalten, werden folgendermaßen hergestellt

Wirkstoff 50 mg

Natriumcarboxymethylcellulose 50 mg

Sirup 1,25 ml

Benzoesäurelösung 0,10 ml

Geschmacksstoff q. v.

Farbstoff q. v.

Gereinigtes Wasser auf gesamt 5 ml
Der Wirkstoff wird durch ein Nr.45 Mesh U.S. Sieb gegeben und mit Natriumcarboxymethylcellulose und Sirup vermischt, um eine glatte Paste zu erhalten. Die Benzoesäurelösung, der Geschmacksstoff und der Farbstoff werden mit einem Anteil Wasser vermischt, und unter Rühren zugegeben. Anschließend wird ausreichend Wasser zugegeben, um das erforderliche Volumen zu erhalten. Formulierung 8 Eine intravenöse Formulierung kann folgendermaßen hergestellt werden

Wirkstoff 100 mg

Isotonische Kochsalzlösung 1 000 ml
Die Lösung der obigen Inhaltsstoffe wird im allgemeinen einem Patienten mit einer Geschwindigkeit von 1 ml pro Minute intravenös verabreicht.
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Verbindungen, ein effektiver und oral wirksamer Thrombininhibitor zu sein, wird in einem oder mehreren der folgenden Tests evaluiert.
Die durch die Erfindung bereitgestellten Verbindungen (Formel I) hemmen selektiv die Wirkung von Thrombin bei Säugern. Die Hemmung von Thrombin wird durch die in vitro Hemmung der Amidaseaktivität von Thrombin gezeigt, wie dies in einem Test gemessen wird, worin Thrombin das chromogene Substrat N-Benzoyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-arginyl-p-nitroanilid, N-Benzoyl-L-Phe-L-Val-L-Arg-p-nitroanilid hydrolysiert.
Der Test wird in 50 μl Puffer (0,03 M Tris, 0,15 M NaCl, pH 7,4) mit 25 μl humaner Thrombinlösung (gereinigtes Humanthrombin, Enzyme Research Laboratories, South Bend, Indiana mit 8 NIH Einheiten/ml) und 25 μl der Testverbindung in einem Lösemittel (50% wäßriges Methanol (V : V)) durchgeführt. Dann werden 150 μl einer wäßrigen Lösung des chromogenen Substrats (mit 0,25 mg/ml) zugegeben und die Hydrolyseraten des Substrats werden gemessen, indem man die Reaktionen bei 405 nm auf die Freisetzung des p-Nitroanilids verfolgt. Es werden Standardkurven durch die Auftragung der freien Thrombinkonzentration gegen die Hydrolyserate erstellt. Die mit den Testverbindungen beobachteten Hydrolyseraten werden dann in "freie Thrombinwerte" in den jeweiligen Tests durch die Verwendung der Standardkurven umgewandelt. Das gebundene Thrombin (an die Testverbindung gebunden) wird durch Subtraktion der Menge an freiem Thrombin, die in jedem Test beobachtet wird, von der bekannten Anfangsmenge an Thrombin, die in jedem Test beobachtet wird, errechnet. Die Menge an freiem Inhibitor in jedem Test wird durch Subtraktion Anzahl der Mole an gebundenem Thrombin von der Anzahl der Mole an zugegebenem Inhibitor (Testverbindung) errechnet.
Der Kass Wert ist die hypothetische Gleichgewichtskonstante für die Reaktion zwischen Thrombin und der Testverbindung (I).
Kass wird für einen Konzentrationsbereich der Testverbindungen errechnet und der Mittelwert wird in Einheiten Liter pro Mol angegeben. Im allgemeinen zeigt eine Thrombin-hemmende Verbindung der Formel I der vorliegenden Erfindung einen Kass von 0,1 × 10⁶ l/mol oder viel größer.
Indem man im wesentlichen die oben für Humanthrombin beschriebenen Verfahren befolgt und andere Serinproteasen des humanen Blutgerinnungssystems und Serinproteasen des fibrinolytischen Systems mit den geeigneten chromogenen Substraten verwendet, wie sie unten angegeben sind, wird die Selektivität der erfindungsgemäßen Verbindung in Bezug auf die Koagulationsfaktorserinproteasen und die fibrinolytischen Serinproteasen, wie auch die im wesentlichen fehlende Beeinträchtigung der Gerinnselfibrinolyse in Humanplasma ermittelt.
Die Humanfaktoren X, Xa, IXa, XIa und XIIa werden von Enzyme Research Laboratories, South Bend, Indiana bezogen, humane Urokinase von Leo Pharmaceuticals, Denmark und rekombinantes aktiviertes Protein C (aPC) wird von Eli Lilly und Co. im wesentlichen gemäß US 4 981 952 A hergestellt. Chromogene Substrate: N-Benzoyl-Ile-Glu-Gly-Arg-p-nitroanilid (für Faktor Xa), N-Cbz-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilid (für den Faktor IXa Test als Substrat für den Faktor Xa), Pyroglutamyl-Pro-Arg-p-nitroanilid (für Faktor XIa und für aPC), H-D-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilid (für Faktor XIIa) und Pyroglutamyl-Gly-Arg-p-nitroanilid (für Urokinase) werden von KabiVitrum, Stockholm, Schweden oder von Midwest Biotech, Fishers, Indiana bezogen. Rindertrypsin wird von Worthington Biochemicals, Freehold, New Jersey, und Humanplasmakallikrein von Kabi Vitrum, Stockholm, Schweden bezogen. Das chromogene Substrat H-D-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilid für Plasmakallikrein wird von Kabi Vitrum, Stockholm, Schweden bezogen. N-Benzoyl-Phe-Val-Arg-p-nitroanilid, das Substrat für Humanthrombin und für Trypsin, wird gemäß den oben für die erfindungsgemäßen Verbindungen beschriebenen Verfahren mittels bekannter Methoden der Peptidkupplung aus im Handel erhältlichen Reaktanden synthetisiert oder von Midwest Biotech, Fishers, Indiana bezogen.
Das Humanplasmin wird von Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana bezogen, nt-PA wird als einkettige Aktivitätsreferenz von American Diagnostica, Greenwich, Connecticut bezogen, modifiziertes t-PA6 (mt-PA6) wird bei Eli Lilly und Company durch das in der Technik bekannte Verfahren hergestellt (siehe Burck et al., J. Biol. Chem., 265, 5120–5177 (1990)). Das chromogene Substrat für Plasmin H-D-Val-Leu-Lys-p-nitroanilid und das Substrat für den Gewebsplasminogenaktivator (t-PA) H-D-Ile-Pro-Arg-p-nitroanilid werden von Kabi Vitrum Stockholm, Schweden bezogen.
In den oben beschriebenen chromogenen Substraten werden die Dreibuchstabensymbole Ile, Glu, Gly, Pro, Arg, Phe, Val, Leu und Lys verwendet, um jeweils die entsprechende Aminosäuregruppe Isoleucin, Glutaminsäure, Glycin, Prolin, Arginin, Phenylalanin, Valin, Leucin und Lysin zu bezeichnen.
Thrombininhibitoren sollten vorzugsweise die durch Urokinase, Gewebsplasminogenaktivator (t-PA) und Streptokinase ausgelöste Fibrinolyse schonen. Dies wäre für die therapeutische Verwendung solcher Mittel als Zusatz zu einer thrombolytischen Therapie mit Streptokinase, t-PA oder Urokinase wichtig und für die Verwendung solcher Mittel als endogene Fibrinolyse-sparende (in Hinblick auf t-PA und Urokinase) antithrombotische Mittel. Zusätzlich zur fehlenden Beeinflussung mit der Amidaseaktivität der fibrinolytischen Proteasen, kann ein Sparen am fibrinolytischen System durch die Verwendung von humanen Plasmagerinnseln und ihrer Lyse durch die jeweiligen fibrinolytischen Plasminogenaktivatoren untersucht werden.
Materialien
Hundeplasma wird von bewusst gemischt gekreuzten Jagdhunden (beider Geschlechts Butler Farms, Clyde, New York, USA) durch eine Venenpunktion in 3,8 Prozent Citrat erhalten. Das Fibrinogen wird aus frischem Hundeplasma präpariert und das humane Fibrinogen wird von humanem nicht abgelaufenem ACD Blut bei der Fraktion I-2 gemäß bekannter Verfahren und Spezifikationen präpariert. Smith, Biochem. J., 185, 1–11 (1980) und Smith et al., Biochemistry, 11, 2958–2967, (1972). Humanes Fibrinogen (98 Prozent rein/plasminfrei) stammt von American Diagnostica, Greenwich, Connecticut. Die radioaktive Markierung von Fibrinogen 1–2 Präparationen wird wie vorher beschrieben durchgeführt. Smith et al., Biochemistry, 11, 2958–2967 (1972). Die Urokinase wird von Leo Pharmaceuticals, Denmark mit 2200 Ploug Einheiten/Gläschen bezogen. Die Streptokinase wird von Hoechst-Roussel Pharmaceuticals, Somerville, New Jersey bezogen.
Verfahren – Wirkungen auf die Lyse der humanen Plasmagerinnsel durch t-PA
Humane Plasmagerinnsel werden in Mikroteströhrchen durch die Zugabe von 50 μl Thrombin (73 NIH Einheiten/ml) zu 100 μl humanem Plasma gebildet, das 0,0229 μCi 125-Iod-markiertes Fibrinogen enthält. Die Gerinnselauflösung wird durch die Überschichtung der Gerinnsel mit 50 μl Urokinase oder Streptokinase (50, 100 oder 1000 Einheiten/ml) und einer Inkubation für 20 Stunden bei Raumtemperatur untersucht. Nach der Inkubation werden die Röhrchen in einer Beckman Microfuge zentrifugiert. 25 μl Überstand werden in ein Volumen von 1,0 ml 0,03 M Tris/0,15 M NaCl Puffer für die Gammazählung gegeben. Zählkontrollen mit 100% Lyse werden durch das Weglassen von Thrombin (und den Ersatz durch Puffer) erhalten. Die Thrombininhibitoren werden auf die mögliche Wechselwirkung mit der Fibrinolyse getestet, indem man die Verbindungen in die Überschichtungslösungen in Konzentrationen von 1, 5 und 10 μg/ml einarbeitet. Grobe Annäherungen der HK₅₀ Werte werden durch lineare Extrapolationen von Datenpunkten zu einem Wert abgeschätzt, der 50 Prozent Lyse für diese bestimmte Konzentration des fibrinolytischen Mittels darstellen würde.
Antikoagulationsaktivität
Materialien
Hundeplasma und Rattenplasma werden von bewusst gemischt gekreuzten Jagdhunden (beider Geschlechts Butler Farms, Clyde, New York, USA) oder von anaesthesierten männlichen Sprague-Dawley Ratten (Harlan Sprague-Dawley, Inc., Indianapolis, Indiana, USA) durch eine Venenpunktion in 3,8 Prozent Citrat erhalten. Das Fibrinogen wird von humanem nicht abgelaufenem ACD Blut bei der Fraktion 1–2 gemäß vorheriger Verfahren und Spezifikationen präpariert. Smith, Biochem. J., 185, 1–11 (1980) und Smith et al., Biochemistry, 11, 2958–2967, (1972). Humanes Fibrinogen wird 98 Prozent rein/plasminfrei von American Diagnostica, Greenwich, Connecticut bezogen. Die Koagulationsreagentien ACTIN, Thromboplastin, Innovin und humanes Plasma werden von Baxter Healthcare Corp., Dade Division, Miami, Florida erhalten. Rinderthrombin von Parke-Davis (Detroit, Michigan) wird für Koagulationstests im Plasma verwendet.
Verfahren
Antikoagulationsbestimmungen
Die Koagulationstestverfahren laufen wie vorher beschrieben. Smith et al., Thrombosis Research, 50, 163–174 (1988). Ein CoA-Screener-Koagulationsgerät (American LABor, Inc.) wird für alle Koagulationstestmessungen verwendet. Die Prothrombinzeit (PT) wird durch die Zugabe von 0,05 ml Kochsalzlösung und 0,05 ml Thromboplastin-C Reagenz oder rekombinantem Humangewebefaktorreagenz (Innovin) zu 0,05 ml Testplasma gemessen. Die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) wird durch die Inkubation von 0,05 ml Testplasma mit 0,05 ml Actinreagenz für 120 Sekunden gefolgt von 0,05 ml CaCl₂ (0,02 M) gemessen. Die Thrombinzeit (TT) wird durch die Zugabe von 0,05 ml Kochsalzlösung und 0,05 ml Thrombin (10 NIH Einheiten/ml) zu 0,05 ml Testplasma gemessen. Die Verbindungen der Formel I werden zu Human- oder Tierplasma über einen weiten Konzentrationsbereich gegeben, um die Verlängerungswirkungen auf die APTT, PT und TT Tests zu bestimmen. Es werden lineare Extrapolationen durchgeführt, um die Konzentrationen zu bestimmen, die zur Verdoppelung der Gerinnungszeit für jeden Test erforderlich sind.
Tiere
Männliche Sprague Dawley Ratten (350–425 g, Harlan Sprague Dawley Inc., Indianapolis, IN) werden mit Xylazin (20 mg/kg, s. c.) und Ketamin (120 mg/kg, s. c.) anaesthesiert und auf einem mit Wasser geheizten Kissen gehalten (37°C). Die Jugularvene wird kanüliert, um Infusionen zu ermöglichen.
Arterio-venöses Shuntmodell
Die linke Jugularvene und die rechte Arteria carotis werden mit 20 cm langen Polyethylen PE 60 Schläuchen kanüliert. Ein 6 cm langer zentraler Abschnitt eines größeren Schlauchs (PE 190) wird mit einem Baumwollfaden (5 cm) im Lumen zwischen den längeren Abschnitten per Reibung befestigt, um den arterio-venösen Shuntkreislauf zu vervollständigen. Das Blut zirkuliert für 15 Minuten durch den Shunt bevor der Faden sorgfältig entfernt und gewogen wird. Das Gewicht eines nassen Fadens wird vom Gesamtgewicht des Fadens und des Thrombus abgezogen (siehe J. R. Smith, Br. J. Pharmacol., 77: 29, 1982). In diesem Modell verringern die bevorzugten Verbindungen der vorliegenden Erfindung das Nettogerinnselgewicht auf etwa 25–30% der Kontrolle oder sogar weiter bei einer i. v. Dosis von 33,176 μmol/kg/h.
FeCl₃ Modell einer arteriellen Verletzung
Die Carotisarterien werden über eine ventrale cervikale Inzision entlang der Mittellinie isoliert. Ein Thermoelement wird unter jede Arterie plaziert und die Gefäßtemperatur wird kontinuierlich auf einem Bandschreiber aufgezeichnet. Ein Cuff eines Schlauchs (0,058 ID × 0,077 OD × 4 mm, Baxter Med. Grade Silicone), der längs aufgeschnitten ist, wird um jede Carotis direkt über dem Thermoelement plaziert. FeCl₃ Hexahydrat wird in Wasser gelöst und die Konzentration (20 Prozent) wird als tatsächliches Gewicht des isolierten FeCl₃ angegeben. Um die Arterie zu verletzen und eine Thrombose zu induzieren werden 2,85 μl in den Cuff pipettiert, um die Arterie über der Thermoelementsonde zu benetzen. Die arterielle Okklusion wird durch einen rapiden Temperaturabfall angezeigt. Die Zeit bis zur Okklusion wird in Minuten angegeben und stellt die vergangene Zeit zwischen der Verabreichung des FeCl₃ und des rapiden Abfalls der Gefäßtemperatur dar (siehe K. D. Kurz, Thromb. Res. 60: 269, 1990)
Modell für die spontane Thrombolyse
In vitro Daten legen nahe, dass die Thrombininhibitoren Thrombin und in höheren Konzentrationen andere Serinproteasen hemmen, wie Plasmin und den Gewebsplasminogenaktivator. Um zu ermitteln, ob die Verbindungen die Fibrinolyse in vivo hemmen, wird die Geschwindigkeit der spontanen Thrombolyse durch die Implantation eines markierten Gesamtblutgerinnsels in die pulmonale Zirkulation bestimmt. Rattenblut (1 ml) wird schnell mit Rinderthrombin (4 IE, Parke Davis) und ¹²⁵I Humanfibrinogen (5 μCi, ICN) gemischt, unmittelbar in einen Silastikschlauch gezogen und bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Der gereifte Thrombus wird aus dem Schlauch herausgenommen, in 1 cm Segmente geschnitten, 3 × in normaler Kochsalzlösung gewaschen und jedes Segment wird in einem Gammazähler ausgezählt. Ein Segment mit einer bekannten Aktivität wird in den Katheter gesaugt, der anschließend in die Jugularvene implantiert wird. Die Katheterspitze wird in die Nähe des rechten Vorhofs vorgeschoben und das Gerinnsel befreit, um in den Lungenkreislauf zu flotieren. Eine Stunde nach der Implantation werden das Herz und die Lungen entnommen und getrennt ausgezählt. Die Thrombolyse wird als Prozentsatz ausgedrückt, wobei folgendes gilt:
Die fibrinolytische Auflösung des implantierten Gerinnsels tritt zeitabhängig auf (siehe J. P. Clozel, Cardiovas. Pharmacol., 12: 520, 1988).
Koagulationsparameter
Die Plasmathrombinzeit (TT) und die aktivierte partielle Thromboplastinzeit (APTT) werden mit einem Fibrometer gemessen. Das Blut wird aus einem Jugularkatheter entnommen und in Spritzen gesammelt, die Natriumcitrat enthalten (3,8 Prozent, 1 Teil auf 9 Teile Blut). Um TT zu messen, wird Rattenplasma (0,1 ml) mit Kochsalzlösung (0,1 ml) und Rinderthrombin (0,1 ml, 30 E/ml in Tris-Puffer, Parke Davis) bei 37°C gemischt. Für die APTT werden Plasma (0,1 ml) und APTT Lösung (0,1 ml Organon Teknika) für 5 Minuten inkubiert (37°C) und CaCl₂ (0,1 ml, 0,025 M) wird zum Starten der Koagulation zugegeben. Die Tests werden doppelt ausgeführt und gemittelt.
Index der Bioverfügbarkeit
Ein Maß der Bioaktivität, die Plasmathrombinzeit (TT), dient als Stellvertreter für den Test der Ursprungsverbindung mit der Annahme, dass die Zunahme der TT nur von der Thrombinhemmung durch die Ursprungsverbindung kommt. Der Zeitverlauf der Wirkung des Thrombininhibitors auf TT wird nach einer i. v. Bolusverabreichung an anaesthesierten Ratten und nach einer oralen Verabreichung an gefasteten Ratten bei Bewußtsein bestimmt. Aufgrund von Beschränkungen im Blutvolumen und der Anzahl an Meßpunkten, die zur Bestimmung des Zeitverlaufs vom Zeitpunkt der Behandlung bis zum Zeitpunkt, wenn die Reaktion zu Werten vor der Behandlung zurückkehrt, erforderlich sind, werden zwei Rattenpopulationen verwendet. Jede Probenpopulation stellt alternierende aufeinanderfolgende Zeitpunkte dar. Die mittlere TT über den Zeitverlauf wird zur Berechnung der Fläche unter der Kurve verwendet (AUC). Der Index der Bioverfügbarkeit wird durch die unten gezeigte Formel errechnet und wird als prozentuale relative Aktivität ausgedrückt.
Die Fläche unter der Kurve (AUC) des Plasma TT Zeitverlaufs wird bestimmt und die Dosis eingestellt. Dieser Index der Bioverfügbarkeit wird "% Relative Aktivität" genannt und wird folgendermaßen errechnet
Verbindungen
Die Lösungen der Verbindungen werden täglich frisch in normaler Kochsalzlösung hergestellt und werden als Bolus injiziert oder 15 Minuten vor und während der experimentellen Pertubation infundiert, die im arteriovenösen Shuntmodell 15 min und im FeCl₃ Modell der arteriellen Verletzung und im spontanen Thrombolysemodell 60 min beträgt. Das Bolusinjektionsvolumen beträgt 1 ml/kg für i. v. und 5 ml/kg für p. o. und das Infusionsvolumen beträgt 3 ml/h.
Statistiken
Die Ergebnisse werden als Mittel ± SEM ausgedrückt. Es wird eine Einwegsanalyse der Varianz verwendet, um statistisch signifikante Unterschiede festzustellen und dann wird der Dunnett's Test angewendet, um zu bestimmen, welche Mittel unterschiedlich sind. Die Signifikanzgrenze für die Zurückweisung der Nullhypothese von gleichen Mittelwerten ist P < 0,05.
Tiere
Männliche Hunde (Beagles, 18 Monate – 2 Jahre, 12–13 kg, Marshall Farms, North Rose, New York 14516) läßt man über Nacht fasten und füttert sie mit zertifizierter Prescription Diet von Purina (Purina Mills, St. Louis, Missouri) 240 Minuten nach der Dosisverabreichung. Wasser ist frei verfügbar. Die Raumtemperatur wird zwischen 66–74°F gehalten, die Luftfeuchtigkeit beträgt 45–50 Prozent relative Luftfeuchte und es wird von 6 Uhr bis 18 Uhr beleuchtet.
Pharmakokinetisches Modell
Die Testverbindung wird unmittelbar vor der Dosierung formuliert, indem man sie in steriler 0,9 prozentiger Kochsalzlösung in einer 5 mg/ml Präparation auflöst. Den Hunden wird eine einzelne 2 mg/kg Dosis der Testverbindung durch orale Verabreichung gegeben. Blutproben (4,5 ml) werden aus der Vena cephalica 0,25, 0,5, 0,75, 1, 2, 3, 4 und 6 Stunden nach der Dosisverabreichung entnommen. Proben werden in citratisierten Vacutainerröhrchen gesammelt und vor der Reduzierung auf das Plasma durch Zentrifugation auf Eis gehalten. Die Plasmaproben werden durch HPLC MS analysiert. Die Plasmakonzentration der Testverbindung wird aufgezeichnet und zur Berechnung der pharmakokinetischen Parameter verwendet: Eliminationsgeschwindigkeitskonstante, Ke, totale Clearance, Clt, Verteilungsvolumen, V_D, Zeit der maximalen Plasmakonzentration der Testverbindung, T_max, maximale Konzentration der Testverbindung von T_max, C_max, Plasmahalbwertszeit, t_0,5, die Fläche unter der Kurve, A. U. C, und den Teil der Testverbindung, der absorbiert wurde, F.
Hundemodell der Koronararterienthrombose
Die operative Vorbereitung und instrumentelle Ausstattung der Hunde erfolgt, wie dies in Jackson et al., Circulation, 82, 930–940 (1990) beschrieben wurde. Gemischt-gekreuzte Jagdhunde (6–7 Monate alt, beider Geschlechts, Butler Frams, Clyde, New York) werden mit Natriumpentobarbital (30 mg/kg intravenös, i. v.) anaesthesiert, intubiert und mit Raumluft beatmet. Das Differenzvolumen und die Atemgeschwindigkeit werden eingestellt, um die PO₂, PCO₂ und pH Werte des Bluts innerhalb der normalen Grenzen zu halten. Subdermale Nadelelektroden werden zur Aufzeichnung eines Leit II EKG eingeführt.
Die linke Jugularvene und die Arteria carotis communis werden durch einen mediolateralen Halsschnitt auf der linken Seite isoliert. Der arterielle Blutdruck (ABP) wird kontinuierlich mit einem vorkalibrierten Millarwandler (Modell MPC-500, Millar Instruments, Houston, TX, USA) gemessen, der in die Arteria carotis eingeführt wurde. Die Jugularvene wird zur Blutprobenentnahme während des Experiments kanüliert. Zusätzlich werden die femoralen Venen beider Hinterbeine zur Verabreichung der Testverbindung kanüliert.
Es wird eine Thorakotomie auf der linken Seite im fünften intercostalen Raum durchgeführt und das Herz wird in einem perikardialen Drahtgestell aufgehängt. Es wird ein 1 bis 2 cm Segment der linken circumflexen Koronararterie (LCX) proximal zur ersten diagonalen ventrikulären Hauptverzweigung isoliert. Eine Anodenelektrode, die mit einer 26 Gauge Nadel versehen wurde (Teflon-beschichtet, silberbeschichteter 30 Gauge Kupferdraht), mit einer Länge von 3–4 mm wird in die LCX eingeführt und mit der Intimaoberfläche der Arterie in Kontakt gebracht (wird am Ende des Experiments bestätigt). Der stimulierende Kreislauf wird durch die Plazierung einer Kathode an einer subkutanen Stelle (s. c.) vervollständigt. Ein einstellbarer Plastikverschluß wird um die LCX über die Region der Elektrode plaziert. Eine vorkalibrierte elektromagnetische Flußsonde (Carolina Medical Electronics, King, NC, USA) wird um die LCX proximal zur Anode zum Messen des koronaren Blutflusses (CBF) plaziert. Der Verschluß wird zur Herstellung einer 40–50 prozentigen Hemmung der hyperämischen Blutflußreaktion eingestellt, die nach 10 Sekunden mechanischer Okklusion der LCX beobachtet wird. Alle hämodynamischen und EKG Messun gen werden mit einem Datenaufnahmesystem (Modell M3000, Modular Instruments, Malvern, PA, USA) aufgezeichnet und analysiert.
Thrombusbildung und Verabreichungplan der Verbindung
Eine elektrolytische Verletzung der Intima der LCX wird durch Anlegen eines Gleichstroms (DC) von 100 μA an die Anode hergestellt. Der Strom wird für 60 Minuten aufrechterhalten und dann abgebrochen, ob das Gefäß verschlossen ist oder nicht. Die Thrombusbildung läuft spontan bis die LCX total verschlossen ist (bestimmt als Null CBF und Anstieg im S-T Segment). Die Verabreichung der Verbindung wird begonnen, nachdem der verschließende Thrombus für eine Stunde reifen konnte. Eine 2 Stunden dauernde Infusion der erfindungsgemäßen Verbindungen in Dosen von 0,5 und 1 mg/kg/Stunde wird gleichzeitig mit einer Infusion eines thrombolytischen Mittels begonnen (beispielsweise Gewebsplasminogenaktivator, Streptokinase, APSAC). Die Reperfusion wird für 3 Stunden nach einer Verabreichung der Testverbindung verfolgt. Eine Reokklusion der Koronararterien nach einer erfolgreichen Thrombolyse, die für mehr als 30 Minuten anhält, wird als Null CBF definiert.
Hämatologie und Bestimmung der Zielblutungszeit
Bestimmungen der gesamten Blutzellen, des Hämoglobins und der Hämotokritwerte werden in einer 40 μl Probe citratisierten (3,8 Prozent) Bluts (1 Teil Citrat : 9 Teile Blut) mit einem Hämatologieanalysegerät bestimmt (Cell-Dyn 900, Sequoia-Turner, Mount View, CA, USA) Zahnfleischzielblutungszeiten werden mit einer Simplate II Blutungszeitvorrichtung bestimmt (Organon Teknika Durham, N. C., USA). Die Vorrichtung wird verwendet, um zwei horizontale Schnitte in das Zahnfleisch entweder des oberen oder des unteren Kiefers des Hundes zu machen. Jeder Schnitt ist 3 mm breit und 2 mm tief. Die Schnitte werden gemacht und es wird eine Stoppuhr zur Bestimmung verwendet, wie lange die Blutung dauert. Es wird ein Baumwolltupfer verwendet, um das Blut aufzusaugen, wenn es aus dem Schnitt sickert. Die Zielblutungszeit ist die Zeit vom Schnitt bis zur Beendigung der Blutung. Die Blutungszeiten werden direkt vor der Verabreichung der Testverbindung (0 min), 60 min bei der Infusion, bei Beendigung der Verabreichung der Testverbindung (120 min) und am Ende des Experiments bestimmt.
Alle Daten werden durch Einwegsanalyse der Varianz (ANOVA) gefolgt von einem Student-Neuman-Kuels post hoc T Test analysiert, um die Signifikanzgrenze zu bestimmen. Wiederholungs ANOVA Messungen werden zur Bestimmung der signifikanten Unterschiede zwischen den Zeitpunkten während der Experimente verwendet. Die Werte sind per Definition mindestens ab der Grenze von p < 0,05 statistisch unterschiedlich. Alle Werte sind Mittelwerte ± SEM. Alle Untersuchungen werden gemäß den Richtlinien der American Physiological Society durchgeführt. Weitere Details, die die Verfahren betreffen, sind in Jackson et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 21, 587–599 (1993) beschrieben.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die Erfindung weiter zu erläutern und sollen nicht als Beschränkung hiervon aufgefaßt werden.
Die in den Beispielen verwendeten Abkürzungen, Symbole und Ausdrücke haben die folgenden Bedeutungen:
Ac = Acetyl
AIBN = Azobisisobutyronitril
Anal. = Elementaranalyse
Bn oder Bzl = Benzyl
Bu = Butyl
n-BuLi = Butyllithium
DCC = Dicyclohexylcarbodiimid
DIBAL-H = Diisobutylaluminiumhydrid
DMF = Dimethylformamid
DMSO = Dimethylsulfoxid
Et = Ethyl
EtOAc = Ethylacetat
Et₃N = Triethylamin
Et₂O = Diethylether
EtOH = Ethanol
EtSH = Ethanthiol
FAB = Massenspektroskopie durch schnellen Atombeschuß
FDMS = Felddesorptionsmassenspektrum
Hex = Hexan
HOAt = 1-Hydroxy-7-azabenzotriazol
HPLC = Hochleistungsflüssigchromatographie
HRMS = Hochauflösungsmassenspektrum
i-PrOH = Isopropanol
IR = Infrarotspektrum
LAH = Lithiumaluminiumhydrid
Me = Methyl
Mel = Methyliodid
MeOH = Methanol
MPLC = Mitteldruckflüssigchromatographie
NBS = N-Bromsuccinimid
NMR = Kernmagnetresonanz
Ph = Phenyl
i-Pr = Isopropyl
Rochellesalz = Kaliumnatriumtartrat
RPHPLC = Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie
SiO₂ = Silicagel
TBS = tert-Butyldimethylsilyl
TFA = Trifluoressigsäure
THF = Tetrahydrofuran
TIPS = Triisopropylsilyl
TLC = Dünnschichtchromatographie
Falls nichts anderes angegeben ist, werden die pH Einstellungen und die Aufarbeitung mit wässrigen Säure- oder Basenlösungen ausgeführt. PrepLC zeigt eine präparative Flüssigchromatographie mittels "Prep Pak^®" Silicakartuschen an, Radialchromatographie zeigt eine präparative Chromatographie mittels eines "Chromatotron^®" Geräts an.
Beispiel 1 Herstellung von 1-[2-Methoxy-4-(1-pyrrolidinylcarbonyl)-benzyl]-2-[4-[2-(1-pyrrolidinyl)ethoxy]phenyl]-5-azaindoloxalat
A. N-Methoxy-N-methyl-4-[2-(1-pyrrolidinyl)ethoxy]-benzamid
Eine Aufschlämmung aus 4-[2-(1-Pyrrolidinyl)ethoxy]benzoesäurehydrochlorid (30,0 g, 110,4 mmol) in 500 ml Dichlorethan wird mit 2 Tropfen DMF und (COCl)₂ (48 ml, 552 mmol) behandelt. Nach 2 Tagen bei Umgebungstemperatur ist die Säure vollständig gelöst. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum konzentriert, in Dichlorethan rückgelöst und erneut konzentriert. Das Säurechlorid wird sofort in 500 ml Dichlorethan gelöst und auf –10°C gekühlt. Die entstehende Lösung wird mit N,O-Dimethylhydroxylaminhydrochlorid (11,8 g, 121,4 mmol) behandelt. Das entstehende Gemisch kann sich auf Raumtemperatur erwärmen. Nach dem Rühren über Nacht wird das Reaktionsgemisch in 500 ml gesättigtes wässriges NaHCO₃ gegossen. Die Phasen werden getrennt und die wässrige Phase wird mit CHCl₃ (2 × 250 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über K₂CO₃ getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert. Eine Reinigung des rohen Rückstands durch Blitzchromatographie (SiO₂, Gradient 80 : 15 : 5 bis 70 : 25 : 5 Hexan/THF/TEA) ergibt 16,1 g (57,8 mmol, 52%) des Titel-Weinrebamids als blaßoranges Öl.
ISMS 279 (M + 1).
Analyse für C₁₅H₂₂N₂O₃ × 0,5 H₂O: Berechnet; C 62,70, N 8,07, N 9,75. Gefunden: C 62,63, H 7,68, N 9,55.
B. 2-[4-[2-(1-Pyrrolidinyl)ethoxy]phenyl]-5-azaindol
Die Titelverbindung wird mit 35% Gesamtausbeute aus dem Dianion aus 4-t-Butoxycarbonylamino-3-methylpyridin und N-Methoxy-N-methyl-4-[2-(1-pyrrolidinyl)ethoxy]benzamid auf ähnliche Weise zu der in Synthesis 1996, 877–882 beschriebenen, hergestellt.
ISMS 308 (M + 1), 306 (M – 1).
Analyse für C₁₉H₂₁N₃O: Berechnet: C 74,24, H 6,89, N 13,67. Gefunden: C 74,54, H 6,87, N 13,70.
C. Methyl-4-brommethyl-2-methoxybenzoat
Ein Gemisch aus 4-Methylsalicylsäure (20 g, 131,5 mmol) CH₃I (74,7 g, 526,3 mmol) und K₂CO₃ (36,2 g, 262 mmol) in 250 ml Aceton wird am Rückfluss für 4 Tage aufrecht erhalten. Nach der Filtration wird das Filtrat unter verringertem Druck konzentriert und der entstehende Rückstand wird in Et₂O aufgenommen und mit 2 N NaOH gewaschen. Der organische Extrakt wird unter verringertem Druck konzentriert. Aus diesem rohen Material werden 10 g (55,6 mmol) in 100 ml CCl₄ aufgenommen und N-Bromsuccinimid (10,8 g, 61,1 mmol) und eine katalytische Menge an AIBN werden zugegeben. Das Gemisch wird am Rückfluss für 4 h erhitzt und dann 10 fach mit Et₂O verdünnt. Die organischen Bestandteile werden mit 25% NaOH (wässrig) gewaschen und unter verringertem Druck konzentriert. Das rohe Produkt wird aus EtOAc-Hexan unter Bildung von 14,2 g (99%) des gewünschten Bromids umkristallisiert.
¹H NMR (CDCl₃) δ 7,77, (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,01 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,99 (s, 1H), 4,47 (s, 2H), 3,94 (s, 3H), 3,91 (s, 3H).
D. Methyl-2-methoxy-4-[[2-[4-[2-(1-pyrrolidinyl)ethoxy]-phenyl]-6-azaindol-1-yl]methyl]benzoat
Pulverisiertes KOH (730 mg, 13,0 mmol) wird zu 25 ml DMSO bei Umgebungstemperatur gegeben. Nach 10 min wird 2-[4-[2-(1-Pyrrolidinyl)ethoxy]phenyl]-5-azaindol (2,0 g, 6,5 mmol) zugegeben. Nach 45 min wird eine Lösung aus Methyl-4-brom-methyl-2-methoxybenzoat (1,69 g, 6,5 mmol) in 10 ml DMSO tropfenweise mittels einer Kanüle zugegeben. Das entstehende Gemisch wird über Nacht gerührt und dann in 100 ml H₂O gegossen. Die wässrige Lösung wird mit EtOAc (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über K₂CO₃ getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert. Eine Reinigung des rohen Rückstands durch Radialchromatographie (SiO₂, Gradient von 0–2% MeOH/CHCl₃, gesättigt mit NH₄OH) ergibt 550 mg (1,13 mmol, 17%) der Titelverbindung.
ISMS 486 (M – 1). FAB HRMS: m/e, berechnet für C₂₉H₃₂N₃O₄: 486,2393. Gefunden: 486, 2390 (M + 1).
Analyse für C₂₉H₃₁N₃O₄: Berechnet: C 71,73, H 6,44, N 8,65. Gefunden: C 72,33, H 6,92, N 8,11.
E. 1-[2-Methoxy-4-(1-pyrrolidinylcarbonyl)benzyl]-2-[4-[2-(1-pyrrolidinyl)ethoxy]phenyl]-5-azaindoloxalat
Eine Lösung aus Methyl-2-methoxy-4-[[2-[4-[2-(1-pyrrolidinyl)ethoxy]phenyl]-5-azaindol-1-yl]-methyl]benzoat (500 mg, 1,03 mmol) in 5 ml Pyrrolidin wird bei 120°C in einem verschlossenen Röhrchen für 2 Tage erhitzt. Das Reaktionsgemisch wird auf Umgebungstemperatur gekühlt, mit CHCl₃ verdünnt und im Vakuum konzentriert. Eine Reinigung des rohen Rückstands durch Radialchromatographie (SiO₂, Gradient von 1–3% MeOH/CHCl₃, gesättigt mit NH₄OH) ergibt 125 mg (0,238 mmol, 23%) der freien Base.
Eine Menge der freien Base gelöst in einer kleinen Menge EtOAc wird mit einem leichten Überschuss an Oxalsäure in EtOAc behandelt. Der entstehende weiße Niederschlag wird filtriert und im Vakuum unter Bildung des Titeloxalatsalzes als weißes Pulver getrocknet.
ISMS 525 (M + 1).
Analyse für C₃₂H₃₆N₄O₃ × 1,85 C₂H₂O₄: Berechnet: C 62,03, H 5,79, N 8,11. Gefunden: C 61,97, H 6,03, N 8,18.
Beispiel 2 Herstellung von 1-[3-Methoxy-4-(1-pyrrolidinyl)methyl]benzyl-2-[4-[2-(1-pyrrolidinyl)ethoxy]phenyl]-5-azaindoldioxalat
Eine Lösung bei 0°C aus 1-[2-Methoxy-4-(1-pyrrolidinylcarbonyl)benzyl]-2-[4-[2-(1-pyrrolidinyl)-ethoxy]phenyl]-5-azaindol (50 mg, 0,10 mmol) in 1 ml THF wird mit LAH (0,285 ml, 0,286 mmol, 1 M in THF) tropfenweise behandelt. Nach 2 Tagen bei Umgebungstemperatur wird das Reaktionsgemisch mit 5 ml kaltem H₂O gestoppt. Nachdem CHCl₃ und gesättigtes wässriges Rochelle's Salz (20 ml jeweils) zugegeben wurden, werden die Phasen getrennt und die wässrige Phase wird mit CHCl₃ (2 × 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über K₂CO₃ getrocknet, filtriert und im Vakuum konzentriert. Eine Reinigung des rohen Rückstands durch Radialchromatographie (SiO₂, Gradient von 1–3 MeOH/CHCl₃, gesättigt mit NH₄OH) ergibt 30 mg (0,059 mmol, 62%) der Titelverbindung, die durch ein Verfahren, das ähnlich zu dem von Beispiel 1, Teil E, beschriebenen ist, in das Dioxalatsalz umgewandelt wird.
IR (KBr) 3421 (br), 1612 cm^–1.
ISMS 511 (M + 1)
Analyse für C₃₂H₃₈N₄O₂ × 2,1 C₂H₂O₄ × 1,3 H₂O: Berechnet: C 60,12, H 6,24, N 7,75. Gefunden: C 60,29, H 5,93, N 7,35.
Beispiel 3 Herstellung von 1-[2-Methoxy-4-(1-pyrrolidinylcarbonyl)-benzyl]-2-[4-[2-(1-pyrrolidinyl)ethoxy]phenyl]-6-azaindoloxalat
A. 2-[4-[2-(1-Pyrrolidinyl)ethoxy]phenyl]-6-azaindol
Die Titelverbindung wird mit 36% Gesamtausbeute aus dem Dianion von 3-t-Butoxycarbonylamino-4-methylpyridin und N-Methoxy-N-methyl-4-[2-(1-pyrrolidinyl)ethoxy]benzamid auf ähnliche Weise zu der in Syntheses 1996, 877–882 beschriebenen, hergestellt.
ISMS 308 (M + 1), 306 (M – 1).
Analyse für C₁₉H₂₁N₃O × 0,5 H₂O: Berechnet: C 72,12, H 7,01, N 13,28. Gefunden: C 72,20, H 6,63, N 13,05.
B. Methyl-2-methoxy-4-[[2-[4-[2-(1-pyrrolidinyl)ethoxy]-phenyl]-6-azaindol-1-yl]methyl]benzoat
Die Titelverbindung wird mit 7% Ausbeute aus 2-[4-[2-(1-Pyrrolidinyl)ethoxy]phenyl]-6-azaindol und Methyl-4-brommethyl-2-methoxybenzoat durch das in Beispiel 1, Teil D, beschriebene Verfahren; ausgeführt.
IR (KBr) 1722, 1611, 1247 cm^–1.
ISMS 486 (M + 1). FAB HRMS: m/e, berechnet für C₂₉H₃₂N₃O₄: 486,2393. Gefunden: 486,2400 (M + 1).
Analyse für C₂₉H₃₁N₃O₄: Berechnet: C 71,73, H 6,44, N 8,65. Gefunden: C 70,82, H 6,23, N 8,03.
C. 1-[2-Methoxy-4-(1-pyrrolidinylcarbonyl)benzyl]-2-[4-[2-(1-pyrrolidinyl)ethoxy]phenyl)-6-azaindoloxalat
Die Titelverbindung wird mit 16% Ausbeute aus Methyl-2-methoxy-4-[[2-[4-[2-(1-pyrrolidinyl)-ethoxy]phenyl]-6-azaindol-1-yl]methyl]benzoat durch das in Beispiel 1, Teil E, beschriebene Verfahren, hergestellt.
IR (KBr) 3430 (br), 1632, 1610; 1476 cm^–1.
ISMS 525 (M + 1).
Analyse für C₃₂H₃₆N₄O₃ × 1,9 C₂H₂O₄: Berechnet: C 61,80, H 5,77, N 8,05. Gefunden: C 61,86, H 5,68, N 8,25.

Claims

Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon
worin eines von X und Y für N steht und das andere von X und Y für CH steht, R^e für Wasserstoff Methyl, Methoxy oder Halogen steht, R¹ für Carboxy, C₁-C₄ Alkoxycarbonyl, Hydroxymethyl, -CO-NR^sR^t oder -X¹-(CH₂)_s-NR^sR^t steht, worin X¹ für eine direkte Bindung, Methylen oder O steht, s für 1 oder 2 steht mit der Maßgabe, daß wenn s für 1 steht, X¹ für eine direkte Bindung steht und R^s und R^t unabhängig für Wasserstoff oder C₁-C₃ Alkyl stehen oder die Gruppe NR^sR^t für Pyrrolidino, Piperidino oder Morpholino steht, und R² für -X²-(CH₂)_m-NR^aR^b stellt, worin X² für eine direkte Bindung, Methylen, O oder S steht, in für 1, 2, 3, 4 oder 5 steht, mit der Maßgabe, daß wenn m für 1 steht, X² dann für eine direkte Bindung steht und R^a und R^b unabhängig für Wasserstoff oder C₁-C₃ Alkyl stehen oder die Gruppe NR^aR^b für Pyrrolidino, Piperidino oder Morpholino steht, oder R² für -X²-(CH₂)_n-R_f steht, worin X² für eine direkte Bindung, Methylen oder O steht, n für 1, 2 oder 3 steht und R^f für 5-Tetrazolyl, Carboxy, C₁-C₄ Alkoxycarbonyl oder Hydroxymethyl steht, und mit der Maßgabe, daß zumindest eines von R¹ und R² einen basischen Aminorest -NR^sR^t oder -NR^aR^b enthält.
Verbindung oder Salz hiervon nach Anspruch 1, worin C₁-C₃ Alkyl für Methyl, Ethyl, Propyl oder Isopropyl steht, C₁-C₄ Alkoxy für Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, Butoxy oder tert-Butoxy steht und Halogen für Fluor, Chlor, Brom oder Tod steht.
Verbindung oder pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon der Formel I nach Anspruch 1, worin R^e für Methyl, Methoxy oder Brom steht, R¹ für -CO-NR^sR^t oder -X¹-(CH₂)_s-NR^sR^t steht, und R² für -X²-(CH₂)_m-NR^aR^b oder -X²-(CH₂)_n-R_f steht, worin X² für O steht, n für 3 steht und R^f für Carboxy, C₁-C₄ Alkoxycarbonyl oder Hydroxymethyl steht.
Verbindung oder pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon der Formel I nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin R^e für Methoxy steht, R¹ für Pyrrolidinocarbonyl oder Pyrrolidinomethyl steht, und R² für 2-Pyrrolidinoethoxy steht.
Verbindung oder pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon der Formel I nach Anspruch 4, worin R^e für Methoxy steht und R¹ für Pyrrolidinomethyl steht.
Salz nach einem der Ansprüche 1 bis 5, das ein Säureadditionssalz ist, welches mit einer Säure hergestellt wurde, die ein pharmazeutisch annehmbares Anion liefert oder für eine Verbindung der Formel I, die einen sauren Rest trägt, ein Salz ist, das mit einer Base hergestellt wurde, die ein pharmazeutisch annehmbares Kation liefert.
Pharmazeutische Formulierung, die eine Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Verdünnungsmittel oder Hilfsstoff enthält.
Thrombin hemmende Verbindung der Formel I oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz hiervon nach Anspruch 1 zur Verwendung in der Antikoagulanstherapie.
Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel I oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes hiervon nach Anspruch 1, ausgewählt aus (a) Alkylierung der Position 1 eines Azaindols der Formel II
mit einer Verbindung der Formel III
worin L für eine herkömmliche Abgangsgruppe steht, (b) für eine Verbindung der Formel I, worin R¹ für -CO-NR^sR^t steht, Amidierung eines Esters der Formel I, worin R¹ für C₁-C₄ Alkoxycarbonyl steht oder einer Säure der Formel I, worin R¹ für Carboxy steht oder eines aktivierten Derivats hiervon mit einem Amin der Formel H-NR^sR^t, und (c) für eine Verbindung der Formel I, worin R¹ für -CH₂-NR^sR^t steht, Reduktion des Carbonyls einer Verbindung der Formel I, worin R¹ für -CO-NR^sR^t steht, wonach für jedes der obigen Verfahren, wenn eine funktionelle Gruppe mittels einer Schutzgruppe geschützt wird, die Schutzgruppe entfernt wird, und wonach für jedes der obigen Verfahren, wenn ein pharmazeutisch annehmbares Salz einer Verbindung der Formel I erforderlich ist, es durch Umsetzung der basischen Form einer solchen Verbindung der Formel I mit einer Säure, die ein physiologisch annehmbares Gegenion liefert oder für eine Verbindung der Formel I, die einen sauren Rest trägt, Umsetzung der sauren Form einer Verbindung der Formel I mit einer Base, die ein pharmazeutisch annehmbares Gegenion liefert oder durch jedes andere herkömmliche Verfahren erhalten wird, und worin, falls nichts anderes angegeben ist, X, Y, R¹, R² und R^e die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben.
Azaindol der Formel II
worin X, Y und R² die in Anspruch 1 definierten Bedeutungen haben.