DE69836977T2 - Chlamydia pneumoniae genomische sequenzen und polypeptiden, fragmenten und anwendungen davon für nachweis, prevention und heilung - Google Patents

Chlamydia pneumoniae genomische sequenzen und polypeptiden, fragmenten und anwendungen davon für nachweis, prevention und heilung Download PDF

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Description

  • Gegenstand der Erfindung sind die genomische Sequenz und die Nukleotidsequenzen, die Polypeptide von Chlamydia pneumoniae kodieren, wie zum Beispiel Polypeptide der Zellhülle, die sezerniert werden oder spezifisch sind oder die am Stoffwechsel, am Replikationsprozess oder an der Virulenz beteiligt sind, und Polypeptide, die durch derartige Sequenzen kodiert werden. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zum Nachweisen dieser Nukleinsäuren und Kits zum Diagnostizieren einer Infektion durch Chlamydia pneumoniae. Die Erfindung betrifft auch einen Durchmusterungs-Assay unter Verwendung der Nukleotidsequenzen oder der Polypeptide.
  • Eine vergleichende Analyse der Sequenz des die ribosomale 16S RNA kodierenden Gens ist zur phylogenetischen Untersuchung von Prokaryoten verwendet worden. Dieser Ansatz hat es möglich gemacht, die Chlamydien unter die Eubakterien zu klassifizieren, unter denen sie eine gut isolierte Gruppe mit einer gleichwohl sehr schwachen Verbindung zu den Planctomyceten darstellen. Die Chlamydien zeigen somit einige einzigartige Kennzeichen innerhalb der Eubakterien, insbesondere ihren Enwicklungszyklus und die Struktur ihrer Membranen. Sie weisen einen einzigartigen Zweiphasen-Zellzyklus auf: das Elementarkörperchen, eine kleine extrazelluläre Form, lagert sich an den Wirt an und wird durch Phagozytose aufgenommen; im Phagosom wird es in die replikative intrazelluläre Form, das Netzkörperchen, umgewandelt. Die Chlamydien sind obligat intrazelluläre Bakterien, die sich in eukaryotischen Zellen auf Kosten von deren Energiereserven und Nukleotidpools vermehren; sie sind für eine breite Vielfalt von Erkrankungen bei Säugern und Vögeln verantwortlich. Die Chlamydien sind die einzigen Mitglieder der Ordnung Chlamydiales, der Familie der Chlamydiaceae und der Gattung Chlamydia. Innerhalb der Gattung Chlamydia werden zurzeit vier Arten beschrieben: Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci, Chlamydia pneumoniae und Chlamydia pecorum. Diese Bakterien werden zusammen gruppiert und teilen biologische und biochemische Eigenschaften. Unter ihnen infizieren nur die ersten drei Menschen, bei Chlamydia pecorum handelt es sich um ein Pathogen der Wiederkäuer.
  • Die Art Chlamydia psittaci infiziert viele Tiere, insbesondere Vögel, und ist auf Menschen übertragbar. Sie ist für eine atypische Lungenentzündung, für Leber- und Nierendysfunktion, für Endokardentzündung und für Bindehautentzündung verantwortlich.
  • Die Art Chlamydia trachomatis ist die am besten charakterisierte. Außer einem Mausstamm ist sie in zwei Gruppen eingeteilt, die durch die Beschaffenheit der Erkrankungen, für die sie verantwortlich sind, unterscheidbar sind: Trachom, Befall der Genitalien und venerische Lymphogranulomatose. Es gibt fünfzehn menschliche Serotypen von Chlamydia trachomatis (A, K) und LGV (L1, L2, L3). Die Stämme A bis C werden vor allem bei Augeninfektionen gefunden, wohingegen die Stämme D bis K und LGV im Wesentlichen für Infektionen des Genitaleingangs verantwortlich sind. Es sollte erwähnt werden, dass die LGV-Stämme für systemische Erkrankungen verantwortlich sind. Historisch gesehen war es im Jahr 1906, dass Halberstaeder und von Provaseck bei Patienten mit Trachom die Anwesenheit von Einschlüssen im Cytoplasma der Zellen, die von Bindehautabschabungen abgeleitet waren, entdeckten. Im Jahr 1940 beschrieben Rake und Jones diese gleichen Einschlüsse in bestimmten Zellen, die durch Punktieren der Ganglien eines Patienten, der an venerischer Granulomatose litt, erhalten wurden. Die Charakterisierung des Mikroorganismus Chlamydia trachomatis wurde erst im Jahr 1957, nach einer Reihe von Isolierungen in Zellkultur, erfolgreich ausgeführt.
  • Es war im Jahr 1983, dass Chlamydia pneumoniae als menschliches Pathogen erkannt wurde (Grayston JT et al., 1986); seitdem ist diesem Bakterium besondere Aufmerksamkeit zuteil geworden, und es wird geschätzt (Gaydos CA et al., 1994), dass 10% der Lungenentzündungen und 5% der Bronchitis-Erkrankungen und Sinusitis-Erkrankungen Chlamydia pneumoniae zuschreibbar sind (Aldous MB et al., 1992). Seit kurzem ist der Zusammenhang von diesem Bakterium mit der Pathogenese von asthmatischer Erkrankung und von Herz-Kreislaufbeeinträchtigungen zunehmend von Interesse.
  • Serologische Untersuchungen haben es möglich gemacht zu beobachten, dass eine Infektion durch Chlamydia pneumoniae bei Kindern im Alter zwischen 5 und 16 Jahren üblich ist. Vor diesem Alter findet man selten Antikörper; die steigende Zahl von Einzelpersonen, die Antikörper tragen, korreliert dann bis zu 20 Jahren mit dem Alter. Demgemäss sind 50% der Erwachsenen Träger von Antikörpern, wobei es möglich ist, dass diese Prävalenz bis zu 75% beträgt. Diese Zahlen sind umso beachtlicher, da eine Erstinfektion Antikörperspiegel induziert, von denen die Persistenz im Zeitablauf auf 3 oder höchstens auf 5 Jahre beschränkt ist, was eine häufige erneute Infektion während der gesamten Lebenszeit nahe legt. Die jährliche Serokonversionsrate beträgt zwischen 8 und 12 Jahren etwa 8% und zwischen 12 und 16 Jahren etwa 6% (Haidl et al., 1994). Vor dem Alter von 15 Jahren ist die Seroprävalenz der Erkrankung bei beiden Geschlechtern identisch. Nach diesem Alter werden Männer häufiger als Frauen infiziert; dies stimmt für alle Regionen weltweit, wo derartige Untersuchungen ausgeführt worden sind.
  • Diese Infektionen sind geographisch äußerst weit verbreitet, wie durch zahlreiche weltweit ausgeführte Untersuchungen gezeigt wurde (Kanamoto Y et al., 1991; Tong CY et al., 1993). Entwickelte Länder des Nordens, wie zum Beispiel Kanada, Dänemark und Norwegen weisen die niedrigsten Infektionsraten auf; im Gegensatz dazu werden die höchsten Prävalenzraten in den weniger entwickelten Ländern der tropischen Regionen gefunden, wo die Infektion vor dem Alter von 5 Jahren stattfinden kann.
  • Menschen sind das einzig bekannte Reservoir für Chlamydia pneumoniae und es ist wahrscheinlich, dass die Infektion durch direkte Übertragung verursacht wird, wobei für diese Übertragung mit niedriger Ausbeute wahrscheinlich Atemwegssekretionen verantwortlich sind (Aldous et al., 1992). Die Übertragungskette mag auch indirekt erscheinen (Kleemola M et al., 1988), wobei nahe gelegt wird, dass die Infektion durch eine wirksame Übertragung verursacht wird, dass aber auch asymptomatische Träger existieren, was die hohe Prävalenz der Erkrankung erklären könnte. Andere Untersuchungen (Mordhorst CH et al., 1992) zeigen, dass die Übertragungseffizienz mit den Einzelpersonen variiert, und listen Fälle von Infektionen auf, die alle oder die Mehrzahl der Mitglieder einer Familie oder einer Gruppe von Familien betreffen. Der Inkubationszeitraum beträgt einige Wochen, in dieser Hinsicht signifikant länger als der vieler anderer pathogener Atemwegsagenzien. Obwohl unter Bedingungen hoher relativer Luftfeuchtigkeit die Ansteckungsfähigkeit von Chlamydia pneumoniae an der freien Luft schnell sinkt, was eine direkte Übertragungsart unter diesen Bedingungen nahe legt, ist es wahrscheinlich, dass die Übertragung in einigen Fällen indirekt stattfindet, da der Mikroorganismus bis zu 30 Stunden lang in einer feindlichen Umgebung überleben kann (Falsey et al., 1993).
  • Klinische Manifestationen aufgrund von Chlamydia pneumoniae sind im Wesentlichen Atemwegserkrankungen. Lungenentzündung und Bronchitis sind die häufigsten, da sie klinisch offenkundig sind: da eine ätiologische Diagnose in diesem Fall hervorgerufen wird, wird das infektiöse Agens identifiziert. Die asymptomatischen Erkrankungen sind wahrscheinlich zahlreich (Grayston JT et al., 1992; Grayston JT et al., 1986; Thom DH et al., 1990). Die Erkrankung schreitet dann über Bronchitis oder Lungenentzündung fort; Fieber ist zur Zeit der Untersuchung abwesend, wird aber manchmal vom Patienten berichtet. Der Schweregrad der Erkrankung ist veränderlich und bei Patienten, die im Krankenhaus sind, ist es üblich, einen Pleuraerguss zu beobachten; eine generalisierte Infektion kann auch beobachtet werden und in schweren Fällen zeigt eine pathologisch-anatomische Untersuchung Erkrankungen durch Chlamydia pneumoniae.
  • Andere Syndrome wie zum Beispiel Sinusitis (Hashiguchi K et al., 1992), eitrige Mittelohrentzündung (Ogawa H et al., 1992) oder Pharyngitis (Huovinen P et al., 1989), sowie Infektionen mit Atemwegsbeeinträchtigungen, die dem Asthma ähneln (Hahn DL et al., 1991), sind beschrieben worden. Chlamydia pneumoniae ist auch mit Sarkoidose, mit Erythema nodosum (Sundelof et al., 1993) in Zusammenhang gebracht worden und sogar ein Fall des Guillain-Barre-Syndroms ist beschrieben worden (Haidl et al., 1992). Die Beteiligung von Chlamydia pneumoniae beim Reiter-Syndrom ist auch ausgewertet worden (Braun J et al., 1994).
  • Der Zusammenhang von Chlamydia pneumoniae mit Koronarerkrankungen und mit Myokardinfarkt wurde zuerst aus der Beobachtung der hohen Antikörperspiegel in 71 % der Patienten mit einer Herzerkrankung (Shor A et al., 1992; Kuo CC et al., 1993; Puolakkainen M et al., 1993; Thomas GN et al., 1997) vermutet. Untersuchungen, die in einigen Ländern ausgeführt worden sind, haben ähnliche Ergebnisse bei Patienten mit atheromatösen Beeinträchtigungen (Shor A et al., 1992; Kuo CC et al., 1993; Puolakkainen M et al., 1993; Grayston JT et al., 1996; Casas-Ciria J et al., 1996; Thomas GN et al., 1997; Jackson LA et al., 1997) und bei Patienten mit Beeinträchtigungen der Halsschlagader gezeigt. Pathologisch-anatomische und mikrobielle Untersuchungen haben Chlamydia pneumoniae in den Gefäßen nachgewiesen. Das Elektronenmikroskop hat es möglich gemacht, das Bakterium sichtbar zu machen (Ladany S et al., 1989), was in der Tat durch andere Techniken wie zum Beispiel PCR (Campbell L A et al., 1992; Kuo CC et al., 1993; Kuo CC et al., 1988) demonstriert worden ist. Es erscheint auch, dass das Bakterium in alten atheromatösen Läsionen häufiger gefunden wird. Andere Untersuchungen, die an jungen Testpersonen mit 15 bis 35 Jahren ausgeführt wurden, haben die Gelegenheit ergeben, die Koronararterien von Leuten ohne Atherosklerose zu untersuchen, wobei diese Beobachtung bei älteren Testpersonen nicht möglich ist (der Ausbruch der atheromatösen Erkrankung ist früh). Bei diesen jungen Testpersonen fand man durch PCR-Untersuchungen keine Chlamydia pneumoniae bei Testpersonen ohne atheromatöse Erkrankung, man enthüllte aber die Anwesenheit von Chlamydia pneumoniae bei zwei von elf Testpersonen, die frühe Läsionen zeigten und bei sechs von sieben Testpersonen, die atheromatöse Plaques entwickelten. Diese Untersuchungen zeigen daher, dass der atheromatöse Plaque sehr stark mit der Anwesenheit von Chlamydia pneumoniae korreliert ist, aber die vom Bakterium bei der vaskulären Pathologie gespielte Rolle ist noch nicht definiert.
  • Die Daten, die kontrollierte klinische Untersuchungen betreffen, welche die Wirkung von Behandlungen bei Infektionen mit Chlamydia pneumoniae analysieren, sind in der Zahl beschränkt. Im Unterschied zu Penizillin, Ampizillin oder den Sulfamiden zeigen Erythromycin, Tetracyclin oder Doxycyclin in vitro eine antibiotische Aktivität gegen Chlamydia pneumoniae. Allerdings sollte eine Behandlung einige Wochen lang bei hohen Dosen fortgeführt werden, um ein Wiederauftreten der Infektion zu vermeiden. Demgemäss wird heutzutage die Verwendung von zwei neuen Makroliden, Clarithromycin und Azithromycin, deren Diffusion, Bioverfügbarkeit und Halbwertszeit kürzere und besser tolerierte Kuren ermöglichen, bevorzugt. In Abwesenheit eines eindeutigen Beweises, beruhend auf den Ergebnissen von klinischen Untersuchungen, bleibt eine wirksame, und gut tolerierte Behandlung von Infektionen mit Chlamydia pneumoniae ohne erneutes Auftreten daher wünschenswert.
  • Ein sogar noch wichtigerer, bis jetzt bestehender Bedarf betrifft eine spezifische und empfindliche Diagnose, die zweckmäßig und schnell ausgeführt werden kann, die ein frühes Durchmustern auf die Infektion hin ermöglicht. Verfahren, die auf einer Kultur aus Chlamydia pneumoniae beruhen, sind langsam und erfordern wegen der an der Sammlung, Konservierung und Aufbewahrung des Stammes unter passenden Bedingungen beteiligten Schwierigkeit ein beträchtliches Fachwissen. Verfahren, die auf einem Antigennachweis (EIA, DFA) oder einer Nukleinsäureamplifikation (PCR) beruhen, stellen Tests bereit, die für die Durchführung im Labor geeigneter sind. Ein zuverlässiger, empfindlicher und zweckmäßiger Test, der eine Unterscheidung zwischen Serogruppen und erst recht zwischen Arten von Chlamydia pneumoniae ermöglicht, ist daher äußerst wünschenswert.
  • Dies ist umso wichtiger, da die Symptome einer Infektion durch Chlamydia pneumoniae langsam erscheinen, da noch nicht alle Pathologien, die mit diesen Infektionen in Zusammenhang gebracht werden, identifiziert worden sind, und da, wie vorstehend erwähnt worden ist, ein Zusammenhang zwischen diesen Infektionen und ernsten chronischen Infektionen, Asthma oder Atherosklerose vermutet wird.
  • Noch ist keine Impfung gegen Chlamydia pneumoniae erhältlich: dies ist auf die unbeständige Beschaffenheit der gegen den Stamm spezifischen Antigene zurückzuführen, die bis jetzt ihre spezifische Identifikation verhindert hat.
  • Obwohl die Anzahl der Untersuchungen und der entwickelten Tiermodelle groß ist, haben die verwendeten Antigene keine ausreichend schützende Immunität induziert, um zur Entwicklung von Impfstoffen für den Menschen zu führen. Im Fall von Chlamydia pneumoniae sollte die Rolle der Immunabwehr bei der Physiologie und Pathologie der Erkrankung wahrscheinlich verstanden werden, um befriedigende Impfstoffe zu entwickeln.
  • Eine detailliertere Information, welche die Biologie dieser Stämme, ihre Wechselwirkungen mit ihren Wirten, die damit zusammenhängenden Phänomene der Ansteckungsfähigkeit und insbesondere jene, der Immunabwehr des Wirts zu entgehen, und schließlich ihre Beteiligung an der Entwicklung von diesen damit zusammenhängen den Pathologien betrifft, wird ein besseres Verstehen dieser Mechanismen ermöglichen. Angesichts des vorangegangenen Textes, der insbesondere die Beschränkungen der Mittel zum Kontrollieren einer Infektion durch Chlamydia pneumoniae zeigt, ist es daher gegenwärtig wesentlich, einerseits molekulare Werkzeuge zu entwickeln, insbesondere aus einem besseren genetischen Wissen über Chlamydia pneumoniae heraus, aber auch neue vorbeugende und therapeutische Behandlungen, neue diagnostische Verfahren und neue Impfstrategien, die spezifisch und wirksam sind und toleriert werden, zu entwickeln. Dies ist genau die Aufgabe der vorliegenden Erfindung.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Nukleotidsequenz mit der Sequenz SEQ ID No. 1 des Genoms von Chlamydia pneumoniae. Allerdings ist die Erfindung nicht auf SEQ ID No. 1 beschränkt, sondern umspannt Genome und Nukleotide, welche die Polypeptide von Varianten des Stamms kodieren, Polymorphismen, allelische Varianten und Mutanten.
  • Somit umspannt der Gegenstand der vorliegenden Erfindung Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie gewählt sind aus:
    • a) der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1, einer Nukleotidsequenz, die mindestens 99,9% Identität mit der Sequenz SEQ ID No. 1, der Nukleotidsequenz der in der ATCC-Hinterlegung No. 1360-VR enthaltenen genomischen DNA, aufweist;
    • b) einer Nukleotidsequenz, die mindestens 80% Identität zu der Sequenz SEQ ID No. 1 aufweist;
    • c) einer Polynukleotidsequenz, die unter Bedingungen hoher Stringenz an die Gesamtheit der Nukleotidsequenz von a) hybridisiert.
  • (i) Als Beispiel und nicht als Beschränkung sind Verfahren unter Verwendung von Bedingungen hoher Stringenz wie folgt: Prähybridisierung von DNA enthaltenden Filtern wird 8 Std. lang über Nacht bei 65 °C in einem Puffer, der aus 6 × SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA und 500 μg/ml denaturierter Lachssperma-DNA besteht, ausgeführt. Die Filter werden 48 Std. lang bei 65 °C, der bevorzugten Hybridisierungstemperatur, im Prähybridisierungsgemisch, das 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA und 5–20 × 106 cpm 32P-markierte Sonde enthält, hybridisiert. Alternativ dazu kann der Hybridisierungsschritt bei 65 °C in Anwesenheit von SSC Puffer, 1 × SSC, was 0,15 M NaCl und 0,05 M Na-Citrat entspricht, durchgeführt werden. Anschließend können einstündige Filterspülungen bei 37 °C in einer Lösung, die 2 × SSC, 0,01 % PVP, 0,01 % Ficoll und 0,01 % BSA enthält, getätigt werden, gefolgt von einer 45 min langen Spülung in 0,1 × SSC bei 50 °C. Alternativ dazu können die Filterspülungen in einer Lösung, die 2 × SSC und 0,1% SDS, oder 0,5 × SSC und 0,1% SDS, oder 0,1 × SSC und 0,1% SDS enthält, bei 68 °C in Intervallen von 15 Minuten durchge führt werden. Nach den Spülschritten sind die hybridisierten Sonden durch Autoradiographie nachweisbar. Andere Bedingungen hoher Stringenz, die verwendet werden können, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden, wie in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Press, N.Y., S. 9.47–9.57; und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y. angeführt, hierin in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
  • (ii) Als Beispiel und nicht als Beschränkung sind Verfahren unter Verwendung von Bedingungen mittlerer Stringenz wie folgt: DNA enthaltende Filter werden prähybridisiert und dann bei einer Temperatur von 60 °C in Anwesenheit eines 5 × SSC Puffers und einer markierten Sonde hybridisiert. Anschließend werden Filterspülungen bei 50 °C in einer Lösung, die 2 × SSC enthält, durchgeführt und die hybridisierten Sonden sind durch Autoradiographie nachweisbar. Andere Bedingungen mittlerer Stringenz, die verwendet werden können, sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und werden, wie in Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Press, N.Y., S. 9.47–9.57; und Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N.Y. angeführt, hierin in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
  • Unter Nukleotidsequenz, Polynukleotid oder Nukleinsäure gemäß der vorliegenden Erfindung versteht man, dass sie entweder eine Doppelstrang-DNA, eine Einzelstrang-DNA oder Transkriptionsprodukte der DNAs bedeuten.
  • Es sollte selbstverständlich sein, dass die vorliegende Erfindung nicht die in ihrer natürlichen Umwelt, das heißt in ihrem natürlichen Zustand, genommenen genomischen Nukleotidsequenzen von Chlamydia pneumoniae betrifft. Es sind Sequenzen, die durch Trennungsverfahren, wie zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie, Molekülgröße-Ausschlußchromatographie oder Affinitätschromatographie oder alternativ dazu durch Fraktionierungstechniken, die auf der Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln beruhen, oder durch gentechnische Verfahren, wie zum Beispiel Amplifikation, Klonieren oder Subklonieren isoliert, gereinigt oder partiell gereinigt worden sein können, wobei es möglich, dass die Sequenzen der Erfindung von Vektoren getragen werden.
  • Die Nukleotidsequenz SEQ ID No. 1 wurde durch Sequenzieren des Genoms von Chlamydia pneumoniae durch das Verfahren des gerichteten Sequenzierens nach automatisiertem Fluoreszenz-Sequenzieren der Inserts von Klonen und Zusammensetzen dieser Nukleotidfragmentsequenzen (Inserts) mittels Software (vgl. Beispiele) erhalten. Trotz der hohen Genauigkeit der Sequenz SEQ ID No. 1 ist es möglich, dass sie die Nukleotidsequenz des Genoms von Chlamydia pneumoniae nicht perfekt zu 100% darstellt und dass in der Sequenz SEQ ID No. 1 noch wenige, seltene Sequenzierfehler oder Unsicherheiten bleiben. In der vorliegenden Erfindung wird die Anwesenheit einer Unsicherheit für ein Nukleotid im nachstehenden Sequenzprotokoll mit „N" bezeichnet. Diese wenigen, seltenen Fehler oder Unsicherheiten könnten durch Fachleute unter Verwendung des gesamten erfindungsgemäßen Chromosoms und Standard-Amplifikations-, Klonier- und Sequenzierverfahren leicht nachgewiesen und korrigiert werden, wobei es möglich ist, dass die erhaltenen Sequenzen leicht verglichen werden, insbesondere mittels einer Computersoftware und unter Verwendung von computerlesbaren Medien zur Aufzeichnung der erfindungsgemäßen Sequenzen, wie zum Beispiel nachstehend beschrieben wird. Nach dem Korrigieren dieser möglichen seltenen Fehler oder Unsicherheiten würde die korrigierte erhaltene Nukleotidsequenz immer noch mindestens 99,9% Identität mit der Sequenz SEQ ID No. 1 aufweisen. Derartige seltene Sequenzierunsicherheiten liegen in der DNA, die in der ATCC-Hinterlegung No. 1360-VR enthalten ist, nicht vor und welche seltenen Sequenzunsicherheiten in der SEQ ID No. 1 auch immer existieren, sie können routinemäßig unter Benutzung der DNA der ATCC-Hinterlegung korrigiert werden.
  • Unter einer homologen Nukleotidsequenz für die Zwecke der vorliegenden Erfindung versteht man, dass sie eine Nukleotidsequenz mit einer prozentuellen Identität von mindestens 80%, vorzugsweise 90% und 95% mit den Basen der Nukleotidsequenz SEQ ID No. 1 bedeutet, wobei dieser Prozentsatz rein statistisch ist und es möglich ist, dass die Unterschiede zwischen den beiden Nukleotidsequenzen zufällig und über die gesamte Länge verteilt sind. Die homologen Sequenzen, die eine prozentuelle Identität von mindestens 80%, vorzugsweise 90% und 95% mit den Basen der SEQ ID No. 1 aufweisen, können zum Beispiel die Sequenzen, die der genomischen Sequenz oder den Sequenzen der repräsentativen Fragmente eines zur Chlamydia-Familie gehörenden Bakteriums entsprechen, einschließlich der vorstehend erwähnten Arten Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci und Chlamydia pecorum, sowie die Sequenzen, die der genomischen Sequenz oder den Sequenzen der repräsentativen Fragmente eines zu Varianten der Art Chlamydia pneumoniae gehörenden Bakteriums entsprechen, umfassen. In der vorliegenden Erfindung sind die Begriffe Familie und Gattung gegenseitig austauschbar, die Begriffe Variante, Serotyp, Stamm und Unterarten sind auch gegenseitig austauschbar. Diese homologen Sequenzen können somit Variationen, die mit Mutationen innerhalb der gleichen Art oder zwischen Arten verbunden sind, entsprechen und können insbesondere Verkürzungen, Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen von mindestens einem Nukleotid entsprechen. Die homologen Sequenzen können auch Variationen entsprechen, die mit der Degeneriertheit des genetischen Kodes oder einer Bevorzugung im genetischen Kode, der für die Familie, die Art oder die Variante spezifisch ist, verbunden sind und die wahrscheinlich in Chlamydia vorliegen.
  • Protein- und/oder Nukleinsäuresequenzhomologien können unter Verwendung jedweder Art von Sequenzvergleichsalgorithmen und Programmen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, ausgewertet werden. Derartige Algorithmen und Programme schließen TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA und CLUSTALW (Pearson und Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (8): 2444–2448; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403–410; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22 (2): 4673–4680; Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266: 383–402; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403–410; Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3: 266–272) ein, sind aber keinsfalls darauf beschränkt.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Protein- und Nukleinsäuresequenzhomologien unter Verwendung des Basic Local Alignment Search Tool ("BLAST"), das auf dem Fachgebiet wohlbekannt ist, ausgewertet (siehe z. B. Karlin und Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2267–2268; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403–410; Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3: 266–272; Altschul et al., 1997, Nuc. Acids Res. 25: 3389–3402). Insbesondere werden fünf spezifische BLAST-Programme verwendet, um die folgende Aufgabe durchzuführen:
    • (1) BLASTP und BLAST3 vergleichen eine Abfrage-Aminosäuresequenz gegen eine Proteinsequenzdatenbank;
    • (2) BLASTN vergleicht eine Abfrage-Nukleotidsequenz gegen eine Nukleotidsequenzdatenbank;
    • (3) BLASTX vergleicht die konzeptionellen Translationsprodukte einer Abfrage-Nukleotidsequenz in sechs Leserahmen (beide Stränge) gegen eine Proteinsequenzdatenbank;
    • (4) TBLASTN vergleicht eine Abfrage-Proteinsequenz gegen eine Nukleotidsequenzdatenbank, die in allen sechs Leserahmen translatiert wurde (beide Stränge); und
    • (5) TBLASTX vergleicht die Translationen einer Abfrage-Nukleidsequenz in sechs Leserahmen gegen die Translationen einer Nukleotidsequenzdatenbank in sechs Leserahmen.
  • Die BLAST-Programme identifizieren homologe Sequenzen durch das Identifizieren ähnlicher Segmente, die hierin als „Segmentpaare mit hoher Punktezahl" bezeichnet werden, zwischen einer Abfrage-Amino- oder Nukleinsäuresequenz und einer Testsequenz, die vorzugsweise aus einer Protein- oder Nukleinsäuresequenzdatenbank erhalten wurde. Segmentpaare mit hoher Punktezahl werden vorzugsweise mittels einer Punktezahlmatrix, wovon auf dem Fachgebiet viele bekannt sind, identifiziert (d. h. abgeglichen). Vorzugsweise ist die verwendete Punktezahlmatrix die Matrix BLOSUM62 (Gonnet et al., 1992, Science 256: 1443–1445; Henikoff und Henikoff, 1993, Proteins 17: 49–61). Weniger bevorzugt können die Matrizen PAM oder PAM250 auch verwendet werden (siehe z. B. Schwartz und Dayhoff, Hsg., 1978, Matrices for Detecting Distance Relationships: Atlas of Protein Sequenz and Structure, Washington: National Biomedical Research Foundation).
  • Die BLAST-Programme werten die statistische Signifikanz aller identifizierter Segmentpaare mit hoher Punktezahl aus und wählen vorzugsweise jene Segmente aus, die einem durch den Anwender gegebenen Signifikanzschwellenwert, wie zum Beispiel einem durch den Anwender angegebenen Prozentsatz der Homologie, genügen. Vorzugsweise wird die statistische Signifikanz eines Segmentpaares mit hoher Punktezahl unter Verwendung der Formel zur statistischen Signifikanz von Karlin ausgewertet (siehe z. B. Karlin und Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2267–2268).
  • Unter einer Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer Sequenz der Erfindung ist, versteht man, dass sie jedwede DNA bedeutet, deren Nukleotide komplementär zu jenen der Sequenz der Erfindung sind und deren Orientierung rückwärts gerichtet ist (antiparallele Sequenz).
  • Die vorliegende Erfindung offenbart ferner Fragmente der vorstehenden Sequenzen von a) bis f). Unter repräsentativen Fragmenten der erfindungsgemäßen Sequenzen versteht man, dass sie jedwedes Nukleotidfragment mit mindestens 8 aufeinanderfolgenden Nukleotiden, vorzugsweise mindestens 12 aufeinanderfolgenden Nukleotiden und noch stärker bevorzugt mindestens 15 oder mindestens 20 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der Sequenz, von der es abgeleitet ist, bedeuten. Es ist selbstverständlich, dass derartige Fragmente sich nur auf Teilstücke von SEQ ID No. 1, die zurzeit nicht in einer öffentlich erhältlichen Datenbank aufgelistet sind, beziehen.
  • Unter diesen repräsentativen Fragmenten können jene, die fähig sind, unter stringenten Bedingungen mit einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz zu hybridisieren, angeführt werden. Hybridisierung unter stringenten Bedingungen bedeutet, dass die Temperatur- und Ionenstärkebedingungen so gewählt werden, dass sie das Aufrechterhalten der Hybridisierung zwischen zwei komplementären DNA-Fragmenten ermöglichen.
  • Veranschaulichend hinzugefügt sind vorteilhafterweise die folgenden Bedingungen hoher Stringenz für den Hybridisierungsschritt zum Zweck des Definierens der vorstehend beschriebenen Nukleotidfragmente.
  • Die Hybridisierung wird bei einer bevorzugten Temperatur von 65 °C in Anwesen heit von SSC Puffer, 1 × SSC, was 0,15 M NaCl und 0,05 M Nacitrat entspricht, ausgeführt. Die Spülschritte können zum Beispiel die Folgenden sein:
    2 × SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur, gefolgt von drei 15 Minuten langen Spülungen bei 68 °C mit 1 × SSC, 0,1% SDS; 0,5 × SSC, 0,1% SDS; 0,1 × SSC, 0,1% SDS. Bedingungen mittlerer Stringenz, die zum Beispiel eine Temperatur von 60 °C in Anwesenheit eines 5 × SSC Puffers verwenden, bzw. niedriger Stringenz, die zum Beispiel eine Temperatur von 50 °C in Anwesenheit eines 5 × SSC Puffers verwenden, erfordern eine geringere Gesamtkomplementarität für die Hybridisierung zwischen den beiden Sequenzen.
  • Die vorstehend beschriebenen stringenten Hybridisierungsbedingungen für ein Polynukleotid mit einer Größe von etwa 300 Basen werden von Fachleuten für Oligonukleotide, die größer oder kleiner sind, gemäß der Lehre von Sambrook et al., 1989, angepasst.
  • Unter den repräsentativen Fragmenten können jene, die als Primer oder Sonde bei Verfahren verwendet werden können, die es möglich machen, homologe Sequenzen oder ihre repräsentativen Fragmente zu erhalten oder ein genomisches Fragment zu rekonstituieren, von dem festgestellt wird, dass es in der Sequenz SEQ ID No. 1 unvollständig ist oder einen Fehler oder eine Unsicherheit trägt, auch angeführt werden, wobei diese Verfahren, wie zum Beispiel die Polymerasekettenreaktion (PCR), das Klonieren und Sequenzieren von Nukleinsäure Fachleuten wohlbekannt sind. Diese homologen Nukleotidsequenzen entsprechen Mutationen oder Variationen innerhalb der Art oder zwischen Arten, sowie der vollständigen genomischen Sequenz oder einem ihrer repräsentativen Fragmente, die fähig sind, rekonstituiert zu werden.
  • Unter den repräsentativen Fragmenten können auch jene angeführt werden, die als Primer oder Sonde in Verfahren verwendet werden können, welche die Diagnose der Anwesenheit von Chlamydia pneumoniae oder eines der damit zusammenhängenden Mikroorganismen, wie nachstehend definiert, ermöglichen.
  • Die repräsentativen Fragmente, die zum Modulieren, Regulieren, Inhibieren oder Induzieren der Expression eines Gens von Chlamydia pneumoniae oder eines der damit zusammenhängenden Mikroorganismen fähig sind und/oder zum Modulieren des Replikationszyklus von Chlamydia pneumoniae oder eines der damit zusammenhängenden Mikroorganismen in der Wirtszelle und/oder dem Organismus fähig sind, können auch angeführt werden. Der Replikationszyklus soll Invasion, Multiplikation, intrazelluläre Lokalisierung, insbesondere Retention in der Vakuole und Inhibition des Fusionsvorgangs mit dem Lysosom, und Vermehrung von Chlamydia pneumoniae oder eines der damit zusammenhängenden Mikroorganismen von Wirtszelle zu Wirtszelle bezeichnen.
  • Unter den repräsentativen Fragmenten werden schließlich jene beschrieben, die offenen Leserahmen entsprechenden Nukleotidsequenzen entsprechen, die ORF-Sequenzen genannt werden (ORF für offener Leserahmen) und Polypeptide kodieren.
  • Die repräsentativen Fragmente können zum Beispiel durch spezifische Amplifikation wie zum Beispiel PCR oder nach der Verdauung von erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen mit passenden Restriktionsenzymen erhalten werden; diese Verfahren sind insbesondere im Handbuch von Sambrook et al., 1989 beschrieben. Die repräsentativen Fragmente können, wenn sie nicht zu groß sind, auch durch chemische Synthese und gemäß Verfahren, die Fachleuten wohlbekannt sind, erhalten werden. Zum Beispiel können derartige Fragmente durch Isolieren von Fragmenten genomischer DNA von der ATCC-Hinterlegung No. 1360-VR oder des Inserts eines Klons, der bei dieser ATCC-Hinterlegung No. 1360-VR vorliegt, erhalten werden.
  • Die repräsentativen Fragmente können zum Beispiel als Primer verwendet werden, um einige der repräsentativen Fragmente, insbesondere jene, bei denen ein Teilstück der Sequenz wahrscheinlich fehlt oder mangelhaft ist, durch Fachleuten wohlbekannte Verfahren, wie zum Beispiel Amplifikation, Klonieren oder Sequenziertechniken, zu rekonstituieren.
  • Unter einer modifizierten Nukleotidsequenz versteht man, dass sie jedwede Nukleotidsequenz bedeutet, die durch Mutagenese gemäß Techniken, die Fachleuten wohlbekannt sind, erhalten wurde und die Modifikationen in Bezug auf die normalen Sequenzen aufweist, zum Beispiel Mutationen in den regulatorischen und/oder Promotor-Sequenzen zur Expression eines Polypeptids, die insbesondere zu einer Modifikation des Expressionsspiegels des Polypeptids oder zu einer Modulation des replikativen Zyklus führen.
  • Unter einer modifizierten Nukleotidsequenz versteht man auch, dass sie jedwede Nukleotidsequenz bedeutet, die ein modifiziertes Polypeptid wie nachstehend definiert kodiert.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt auch Nukleotidsequenzen von Chlamydia pneumoniae, die aus einer Nukleotidsequenz eines offenen Leserahmens (ORF), das heißt den Sequenzen von ORF2 bis ORF1297, gewählt sind.
  • Die Nukleotidsequenzen von ORF2 bis ORF1297 werden in den nachstehenden Tabellen 1 und 2 durch ihre Position auf der Sequenz SEQ ID No. 1 definiert. Zum Beispiel wird die Sequenz ORF2 durch die Nukleotidsequenz zwischen den Nukleotiden an den Positionen 42 und 794 auf der Sequenz SEQ ID No. 1 definiert, wobei die Enden eingeschlossen sind. ORF2 bis ORF1297 sind über Homologieanalysen sowie über Analysen potenzieller ORF-Startstellen, wie nachstehend in den Beispielen diskutiert, identifiziert worden. Es soll selbstverständlich sein, dass jeder identifizierte ORF eine Nukleotidsequenz umfasst, welche die zusammenhängende Nukleotidsequenz vom unmittelbar 3' des Stopp-Kodons des vorangegangenen ORFs liegenden Stopp-Kodon des ORFs und durch das 5'-Kodon bis zum nächsten Stopp-Kodons von SEQ ID No. 1 im Leserahmen der Nukleotidsequenz des ORFs umspannt. Die nachstehende Tabelle 2 listet den Anfang, das Ende und die potenzielle Startstelle von jedem der ORFs 1–1297 auf. In einer Ausführungsform umfasst der ORF die zusammenhängende Nukleotidsequenz, die sich von der potenziellen Startstelle des ORFs stromabwärts (das heißt 3') bis zum Stopp-Kodon des ORFs (oder des unmittelbar benachbarten und stromaufwärts des Stopp-Kodons des ORFs liegenden ORF-Kodons) erstreckt. ORF2 bis ORF1297 kodieren die Polypeptide von No. 2 bis No. 1291 bzw. von No. 6844 bis No. 6849.
  • Nach Einführung von kleineren Leserasterverschiebungen können bestimmte einzelne ORFs größere „kombinierte" ORFs umfassen. Eine Liste derartiger mutmaßlicher „kombinierter" ORFs wird in der nachstehenden Tabelle 3 gezeigt. Zum Beispiel kann ein kombinierter ORF ORF 25, ORF 26 und ORF 27 einschließlich dazwischenliegender, sich im Leserahmen befindender Nukleotidsequenzen umfassen. Die Reihenfolge der ORFs (5' zu 3') innerhalb jedes „kombinierten" ORFs ist wie aufgelistet. Es soll selbstverständlich sein, dass, wenn auf ORF2 bis ORF1297 hierin Bezug genommen wird, eine derartige Bezugnahme auch „kombinierte" ORFs einschließen soll.
  • Tabelle 3
    • ORF 25, ORF 26, ORF 27;
    • ORF 28, ORF 29, ORF 30;
    • ORF 31, ORF 32;
    • ORF 33, ORF 35;
    • ORF 466, ORF 467;
    • ORF 468, ORF 469;
    • ORF 477, ORF 476, ORF 474;
    • ORF 480, ORF 482;
    • ORF 483, ORF 485, ORF 486, ORF 500;
    • ORF 503, ORF 504, ORF 505;
    • ORF 506, ORF 507;
    • ORF 1211, ORF 647;
    • ORF 1286, ORF 1039;
    • ORF 691, ORF 690;
    • ORF 105, ORF 106;
    • ORF 170, ORF 171; ORF 394, ORF 393;
    • ORF 453, ORF 452, ORF 451;
    • ORF 526, ORF 525;
    • ORF 757, ORF 756, ORF 755;
    • ORF 856, ORF 855;
    • ORF 958, ORF 957;
    • ORF 915, ORF 914, ORF 913;
    • ORF 543, ORF 544;
    • ORF 1266, ORF 380;
    • ORF 745, ORF 744;
    • ORF 777, ORF 776;
    • ORF 343, ORF 1297 und repräsentative Fragmente.
  • Tabelle 1 stellt auch die Ergebnisse von Homologiesuchen anschaulich dar, welche die Sequenzen der Polypeptide, die von jedem der ORFs kodiert werden, mit den in öffentlichen, veröffentlichen Datenbanken vorliegenden Sequenzen verglichen haben.
  • Die Erfindung führt auch die Polypeptide an, umfassend ein Polypeptid, das gewählt ist aus:
    • a) einem Polypeptid, das durch eine Polynukleotidsequenz in SEQ ID No. 1 kodiert wird (z. B. jedwedes Polypeptid, das durch eine Polynukleotidsequenz, die ORF2 bis ORF1297 entspricht, und/oder repräsentative Fragmente davon kodiert wird);
    • b) einem Polypeptid, das zu einem wie in a) definierten Polypeptid homolog ist;
    • c) einem Polypeptid, das durch eine Polynukleotidsequenz, die an SEQ ID No. 1 oder ORF2 bis ORF1297 unter hoher oder mittlerer Stringenz hybridisiert, kodiert wird;
    • d) einem Fragment mit mindestens 5 Aminosäuren eines wie in a), b) oder c) definierten Polypeptids;
    • e) einem biologisch aktiven Fragment eines wie in a), b), c) oder d) definierten Polypeptids; und
    • f) einem modifizierten Polypeptid eines wie in a), b), c), d) oder e) definierten Polypeptids.
  • In der vorliegenden Beschreibung sind die Begriffe Polypeptid, Peptid und Protein austauschbar.
  • Unter homologen Polypeptiden versteht man, dass sie die Polypeptide, die in Bezug auf das natürliche Polypeptid bestimmte Modifikationen aufweisen, wie zum Beispiel insbesondere eine Deletion, Addition oder Substitution von mindestens einer Aminosäure, eine Verkürzung, eine Verlängerung, eine chimäre Fusion und/oder eine Mutation, oder Polypeptide, die posttranslationale Modifikationen aufweisen, bezeichnen. Unter den homologen Polypeptiden werden jene, deren Aminosäuresequenz mindestens 80%, vorzugsweise 90% Homologie oder Identität mit den Aminosäuresequenzen der natürlichen Polypeptide aufweist, bevorzugt. Im Fall einer Substitution werden eine oder mehrere aufeinander folgende oder nicht aufeinander folgende Aminosäuren durch „äquivalente" Aminosäuren ersetzt. Der Ausdruck „äquivalente" Aminosäure soll hier jedwede Aminosäure bezeichnen, die fähig ist, für eine der Aminosäuren in der Grundstruktur substituiert zu werden, ohne allerdings die biologischen Aktivitäten der entsprechenden Peptide wesentlich zu modifizieren, und so wie es später definiert wird.
  • Protein- und/oder Nukleinsäuresequenzhomologien können unter Verwendung jedweder Art von auf dem Fachgebiet bekannten Sequenzvergleichsalgorithmen und Programmen ausgewertet werden. Derartige Algorithmen und Programme schließen TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA und CLUSTALW (Pearson und Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (8): 2444–2448; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403–410; Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22 (2): 4673–4680; Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266: 383–402; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403–410; Altschul et al., 1993, Nature Genetics 3: 266–272) ein, sind aber keinesfalls darauf beschränkt.
  • Äquivalente Aminosäuren können entweder beruhend auf ihrer Strukturhomologie mit den Aminosäuren, für die sie substituiert werden, oder beruhend auf Ergebnissen von zwischen den verschiedenartigen Polypeptiden vergleichenden Tests der biologischen Aktivität, die ausgeführt werden können, bestimmt werden.
  • Als Beispiel können die Möglichkeiten von Substitutionen, die ausgeführt werden können, ohne zu einer wesentlichen Modifikation der biologischen Aktivität der entsprechenden modifizierten Polypeptide zu führen, erwähnt werden; die Ersetzungen von zum Beispiel Leucin mit Valin oder Isoleucin, von Aspararaginsäure mit Glutaminsäure, von Glutamin mit Asparagin, von Arginin mit Lysin und dergleichen, wobei die umgekehrten Substitutionen natürlich unter den gleichen Bedingungen zulässig sind.
  • Die homologen Polypeptide entsprechen auch den Polypeptiden, die durch die homologen, wie vorstehend definierten, Nukleotidsequenzen kodiert werden, und umfassen somit in der vorliegenden Definition die mutierten Polypeptide oder Polypeptide, die den Variationen innerhalb der Art oder zwischen Arten entsprechen, die bei Chlamydia vorliegen können, und die insbesondere Verkürzungen, Substitutionen, Deletionen und/oder Additionen von mindestens einem Aminosäurerest entsprechen.
  • Unter einem biologisch aktiven Fragment eines Polypeptids versteht man insbesondere, dass es ein Polypeptidfragment, wie nachstehend definiert, bezeichnet, das mindestens eines der Kennzeichen der Polypeptide zeigt, insbesondere indem es:
    • – fähig ist, eine Immunantwort, die gegen Chlamydia pneumoniae gerichtet ist, auszulösen; und/oder
    • – fähig ist, von einem Antikörper, der spezifisch für ein erfindungsgemäßes Polypeptid ist, erkannt zu werden; und/oder
    • – fähig ist, an ein Polypeptid oder eine Nukleotidsequenz von Chlamydia pneumoniae zu binden; und/oder
    • – fähig ist, die Expression eines Gens von Chlamydia pneumoniae oder eines der damit zusammenhängenden Mikroorganismen zu modulieren, zu regulieren, zu induzieren oder zu inhibieren, und/oder fähig ist, den Replikationszyklus von Chlamydia pneumoniae oder eines der damit zusammenhängenden Mikroorganismen in der Wirtszelle und/oder in dem Organismus zu modulieren; und/oder
    • – fähig ist, eine sogar partielle physiologische Aktivität allgemein auszuüben, wie zum Beispiel eine strukturelle Aktivität (Zellhülle, Ribosom), eine enzymatische (metabolische) Aktivität, eine Transportaktivität, eine Aktivität bei der Sekretion oder bei der Virulenz.
  • Unter einem Polypeptidfragment versteht man, dass es ein Polypeptid bezeichnet, das ein Minimum von 5 Aminosäuren, vorzugsweise 10 Aminosäuren oder vorzugsweise 15 Aminosäuren umfasst. Es soll selbstverständlich sein, dass derartige Fragmente sich nur auf von ORF2 bis ORF1297 kodierte Teilstücke von Polypeptiden beziehen, die zurzeit nicht in einer öffentlich erhältlichen Datenbank aufgelistet sind.
  • Die Polypeptidfragmente können isolierten oder gereinigten Fragmenten entsprechen, die in Chlamydia pneumoniae natürlich vorliegen oder die von Chlamydia pneumoniae sezerniert werden, oder sie können Fragmenten entsprechen, die fähig sind, durch Spalten des Polypeptids mit einem proteolytischen Enzym, wie zum Beispiel Trypsin oder Chymotrypsin oder Kollagenase, oder mit einem chemischen Reagens, wie zum Beispiel Bromcyan (CNBr), oder alternativ dazu durch Platzieren des Polypeptids in eine sehr saure Umgebung, zum Beispiel bei einem pH-Wert von 2,5, erhalten werden zu können. Derartige Polypeptidfragmente können gleich gut durch eine chemische Synthese unter Verwendung von Wirten hergestellt werden, die mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure enthält, welche die Expression der unter die Kontrolle von passenden Elementen zur Regulation und/oder Expression gestellten Fragmente ermöglicht, transformiert sind.
  • Unter einem „modifizierten Polypeptid" eines Polypeptids versteht man, dass es ein Polypeptid bezeichnet, das durch genetische Rekombination oder durch chemische Synthese, wie nachstehend beschrieben werden wird, erhalten wird, das mindestens eine Modifikation in Bezug auf die normale Sequenz aufweist. Diese Modifikationen können insbesondere Aminosäuren betreffen, die für eine Spezifität oder für die Effizienz der Aktivität verantwortlich sind oder für die strukturelle Konformation, für die Ladung oder für die Hydrophobizität und für die Fähigkeit zur Multimerisierung und für die Insertion des Polypeptids in die Membran verantwortlich sind. Es ist somit möglich, Polypeptide mit einer äquivalenten, einer erhöhten oder einer verringerten Aktivität und mit einer äquivalenten, einer engeren oder einer breiteren Spezifität zu schaffen. Unter den modifizierten Polypeptiden können die Polypeptide erwähnt werden, bei denen bis zu 5 Aminosäuren modifiziert, am N- oder C-terminalen Ende verkürzt, oder alternativ dazu deletiert oder ansonsten hinzugefügt sein können.
  • Wie angegeben ist, können die Modifikationen des Polypeptids insbesondere die Aufgabe haben:
    • – es fähig zu machen, die Expression eines Gens von Chlamydia, insbesondere von Chlamydia pneumoniae und dessen Varianten oder eines der damit zusammenhängenden Mikroorganismen zu modulieren, zu regulieren, zu inhibieren oder zu induzieren und/oder es fähig zu machen, den Replikationszyklus von Chlamydia, insbesondere von Chlamydia pneumoniae und dessen Varianten oder eines der damit zusammenhängenden Mikroorganismen in der Wirtszelle und/oder dem Organismus zu modulieren,
    • – seine Verwendung bei Verfahren zur Biosynthese oder zum Bioabbau, oder seine Aufnahme in Impfstoffzusammensetzungen zu ermöglichen,
    • – das Modifizieren seiner Bioverfügbarkeit als eine Verbindung zur therapeutischen
    Verwendung zu ermöglichen.
  • Die modifizierten Polypeptide können auch an jeder Zelle oder jedem Mikroorganismus verwendet werden, bei dem die modifizierten Polypeptide fähig sein werden, die Genexpression zu modulieren, zu regulieren, zu inhibieren oder zu induzieren oder das Wachstum oder den Replikationszyklus der Zelle oder des Mikroorganismus zu modulieren. Diese Verfahren, die eine Demonstration der Modulationen an eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen ermöglichen, sind Fachleuten wohlbekannt. Die Zellen oder Mikroorganismen werden insbesondere aus Tumorzellen oder infektiösen Mikroorganismen gewählt und die modifizierten Polypeptide können zur Vorbeugung oder Behandlung von Pathologien, die mit der Anwesenheit der Zellen oder der Mikroorganismen verbunden sind, verwendet werden. Es ist auch eindeutig klar, dass die Nukleotid sequenzen, welche die modifizierten Polypeptide kodieren, für die Modulationen, zum Beispiel durch das Zwischenschalten von erfindungsgemäßen Vektoren und die nachstehend beschrieben werden, verwendet werden können, um die Pathologien zu verhindern oder sie zu behandeln.
  • Die vorstehenden modifizierten Polypeptide können unter Verwendung von kombinatorischer Chemie erhalten werden, bei der es möglich ist, Teilstücke des Polypeptids vor deren Testen an zum Beispiel Modellen, Zellkulturen oder Mikroorganismen systematisch zu variieren, um die Verbindungen, welche die aktivsten sind oder welche die gewünschten Eigenschaften aufweisen, auszuwählen.
  • Eine chemische Synthese hat auch den Vorteil, dass sie in der Lage ist,
    • – nicht natürliche Aminosäuren oder
    • – Bindungen, bei denen es sich nicht um Peptidbindungen handelt, zu verwenden. Demgemäss kann es, um die Haltbarkeit der Polypeptide zu verlängern, vorteilhaft sein, nicht natürliche Aminosäuren, zum Beispiel in der D-Form, oder alternativ dazu Aminosäureanaloga, insbesondere zum Beispiel Schwefel-enthaltende Formen, zu verwenden.
  • Schließlich kann die Struktur der Polypeptide, ihrer homologen oder modifizierten Formen, sowie der entsprechenden Fragmente in chemische Strukturen des Polypeptid-Typs und dergleichen integriert werden. Demgemäss kann es vorteilhaft sein, an den N- und C-terminalen Enden Verbindungen bereitzustellen, die nicht von Proteasen erkannt werden.
  • Nachstehend werden ORF Nukleotidsequenzen, die besonders bevorzugte Kennzeichen aufweisende Polypeptide kodieren, beschrieben. Für jede Gruppe von bevorzugten nachstehend beschriebenen ORFs ist es selbstverständlich, dass zusätzlich zu den einzelnen aufgelisteten ORFs in Fällen, bei denen derartige ORFs als Teil von „kombinierten" ORFs vorliegen, die „kombinierten" ORFs auch in die bevorzugte Gruppe eingeschlossen werden sollen.
  • Ganz besonders beschreibt die Erfindung Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polypeptid der Zellhülle, vorzugsweise der äußeren Zellhülle von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, wie zum Beispiel die vorherrschenden Proteine der äußeren Membran, die Adhäsionsproteine oder die Proteine, welche in die Zusammensetzung der Wand von Chlamydia eintreten. Unter diesen Sequenzen werden die Sequenzen, die eine Nukleotidsequenz umfassen, die aus den folgenden Sequenzen gewählt wird, am meisten bevorzugt:
    ORF15; ORF25; ORF26; ORF27; ORF28; ORF29; ORF30; ORF31; ORF32; ORF33; ORF35; ORF68; ORF124; ORF275; ORF291; ORF294; ORF327; ORF342; ORF364; ORF374; ORF380; ORF414; ORF439; ORF466; ORF467; ORF468; ORF469; ORF470; ORF472; ORF474; ORF476; ORF477; ORF478; ORF479; ORF480; ORF482; ORF485; ORF500; ORF501; ORF503; ORF504; ORF505; ORF506; ORF520; ORF578; ORF580; ORF581; ORF595; ORF596; ORF597; ORF737; ORF830; ORF834; ORF836; ORF893; ORF917; ORF932; ORF976; ORF1035; ORF1045; ORF1090 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Struktur der cytoplasmatischen Membranen von Bakterien und der Bakterienwand ist von den damit zusammenhängenden Proteinen abhängig. Die Struktur der cytoplasmatischen Membran macht sie für Wasser, wasserlösliche Substanzen und Moleküle kleiner Größe (Ionen, kleine anorganische Moleküle, Peptide oder Proteine) undurchlässig. Um in die Zelle oder ein Bakterium einzudringen oder sie zu beeinträchtigen, muss ein Ligand eine spezielle Beziehung zu einem in der cytoplasmatischen Membran verankerten Protein (dem Rezeptor) aufbauen. Diese Proteine, welche auf der Membran verankert sind, spielen beim Stoffwechsel eine wichtige Rolle, da sie die Austausche in dem Bakterium kontrollieren. Diese Austausche treffen auf Moleküle, die für das Bakterium von Interesse sind (kleine Moleküle, wie zum Beispiel Zuckermoleküle und kleine Peptide), sowie Moleküle, die für das Bakterium unerwünscht sind, wie zum Beispiel Antibiotika oder Schwermetalle, zu.
  • Die Doppellipid-Schichtstruktur der Membran erfordert, dass die Proteine, die darin eingefügt werden, hydrophobe Domänen von etwa zwanzig Aminosäuren, die eine alpha-Helix bilden, aufweisen. Vorherrschend hydrophobe und potenzielle Transmembranregionen können aus der Primärsequenz der Proteine vorhergesagt werden, welche selbst von der Nukleotidsequenz hergeleitet ist. Die Anwesenheit einer oder mehrerer mutmaßlicher Transmembrandomänen erhöht für ein Protein die Möglichkeit, mit der cytoplasmatischen Membran in Zusammenhang zu stehen und in der Lage zu sein, eine wichtige metabolische Rolle darin zu spielen oder alternativ dazu für das somit exponierte Protein, in der Lage zu sein, potenzielle Schutzepitope aufzuweisen.
  • Falls die Proteine, die in die Membran eingefügt werden, mehrere Transmembrandomänen aufweisen, die fähig sind, über elektrostatische Bindungen miteinander in Wechselwirkung zu treten, dann wird es für diese Proteine möglich, Poren zu bilden, die quer durch die Membran gehen, die für etliche Substanzen durchlässig wird. Es sollte angemerkt werden, dass Proteine, welche keine Transmembrandomänen haben, durch das Zwischenschalten von Fettsäuren auch in der cytoplasmatischen Membran verankert sein können, wobei es möglich ist, dass das Brechen der Bindung zwischen dem Protein und seinem Anker in einigen Fällen für die Freisetzung des Peptids außerhalb des Bakterium verantwortlich ist.
  • Die Erfindung beschreibt Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Transmembranpolypeptid von Chlamydia pneumoniae mit zwischen 1 und 3 Transmembrandomäne oder eines seiner repräsentativen Fragmenten kodieren, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF2; ORF3; ORF6; ORF9; ORF10; ORF11; ORF13; ORF14; ORF16; ORF18; ORF19; ORF20; ORF21; ORF22; ORF25; ORF27; ORF28; ORF29; ORF30; ORF31; ORF32; ORF33; ORF34; ORF35; ORF37; ORF39; ORF41; ORF42; ORF44; ORF45; ORF46; ORF47; ORF48; ORF49; ORF50; ORF53; ORF54; ORF56; ORF57; ORF59; ORF60; ORF61; ORF62; ORF63; ORF64; ORF65; ORF66; ORF69; ORF72; ORF73; ORF74; ORF76; ORF77; ORF78; ORF79; ORF80; ORF82; ORF84; ORF85; ORF86; ORF88; ORF89; ORF90; ORF91; ORF92; ORF93; ORF95; ORF96; ORF98; ORF99; ORF100; ORF101; ORF102; ORF103; ORF104; ORF105; ORF106; ORF107; ORF108; ORF114; ORF117; ORF118; ORF122; ORF123; ORF124; ORF125; ORF129; ORF130; ORF131; ORF132; ORF133; ORF134; ORF135; ORF137; ORF138; ORF139; ORF140; ORF141; ORF142; ORF143; ORF145; ORF146; ORF147; ORF150; ORF151; ORF152; ORF156; ORF157; ORF158; ORF159; ORF160; ORF161; ORF162; ORF164; ORF166; ORF167; ORF170; ORF173; ORF175; ORF176; ORF178; ORF179; ORF180; ORF182; ORF183; ORF184; ORF185; ORF186; ORF187; ORF188; ORF189; ORF190; ORF191; ORF192; ORF194; ORF195; ORF196; ORF197; ORF198; ORF199; ORF200; ORF201; ORF202; ORF205; ORF207; ORF208; ORF209; ORF210; ORF212; ORF215; ORF219; ORF220; ORF224; ORF226; ORF227; ORF228; ORF231; ORF232; ORF233; ORF234; ORF235; ORF236; ORF238; ORF239; ORF240; ORF241; ORF242; ORF244; ORF247; ORF251; ORF252; ORF253; ORF255; ORF256; ORF257; ORF258; ORF260; ORF262; ORF263; ORF266; ORF267; ORF268; ORF269; ORF270; ORF273; ORF274; ORF276; ORF278; ORF279; ORF280; ORF281; ORF282; ORF283; ORF284; ORF286; ORF287; ORF289; ORF290; ORF291; ORF293; ORF294; ORF297; ORF304; ORF305; ORF307; ORF308; ORF309; ORF310; ORF311; ORF313; ORF314; ORF315; ORF316; ORF318; ORF319; ORF320; ORF321; ORF322; ORF323; ORF324; ORF325; ORF326; ORF331; ORF332; ORF336; ORF338; ORF339; ORF341; ORF344; ORF345; ORF346; ORF350; ORF352; ORF353; ORF356; ORF357; ORF358; ORF359; ORF360; ORF362; ORF365; ORF366; ORF367; ORF370; ORF372; ORF373; ORF376; ORF377; ORF378; ORF379; ORF381; ORF382; ORF383; ORF384; ORF385; ORF386; ORF387; ORF390; ORF392; ORF393; ORF394; ORF396; ORF398; ORF399; ORF400; ORF404; ORF408; ORF410; ORF411; ORF413; ORF416; ORF417; ORF418; ORF420; ORF422; ORF424; ORF427; ORF428; ORF429; ORF430; ORF431; ORF433; ORF434; ORF437; ORF440; ORF441; ORF442; ORF443; ORF444; ORF445; ORF447; ORF450; ORF451; ORF452; ORF455; ORF456; ORF459; ORF460; ORF461; ORF462; ORF463; ORF464; ORF465; ORF467; ORF469; ORF471; ORF474; ORF475; ORF476; ORF477; ORF479; ORF482; ORF483; ORF484; ORF485; ORF486; ORF487; ORF488; ORF491; ORF493; ORF494; ORF497; ORF498; ORF499; ORF503; ORF508; ORF509; ORF510; ORF512; ORF514; ORF515; ORF516; ORF517; ORF518; ORF520; ORF521; ORF523; ORF525; ORF527; ORF528; ORF529; ORF530; ORF531; ORF533; ORF534; ORF535; ORF536; ORF537; ORF540; ORF541; ORF543; ORF544; ORF545; ORF546; ORF548; ORF549; ORF551; ORF553; ORF554; ORF555; ORF556; ORF557; ORF558; ORF559; ORF560; ORF562; ORF563; ORF564; ORF565; ORF566; ORF569; ORF571; ORF573; ORF576; ORF577; ORF581; ORF583; ORF584; ORF585; ORF586; ORF588; ORF591; ORF592; ORF594; ORF595; ORF596; ORF597; ORF599; ORF600; ORF603; ORF605; ORF608; ORF614; ORF615; ORF620; ORF621; ORF622; ORF623; ORF624; ORF625; ORF629; ORF630; ORF631; ORF633; ORF634; ORF637; ORF642; ORF644; ORF645; ORF647; ORF648; ORF652; ORF654; ORF655; ORF657; ORF658; ORF659; ORF660; ORF661; ORF664; ORF665; ORF666; ORF667; ORF670; ORF671; ORF672; ORF673; ORF674; ORF676; ORF679; ORF681; ORF684; ORF687; ORF688; ORF689; ORF690; ORF693; ORF694; ORF695; ORF696; ORF697; ORF698; ORF699; ORF700; ORF701; ORF703; ORF705; ORF706; ORF707; ORF708; ORF710; ORF712; ORF715; ORF716; ORF717; ORF718; ORF719; ORF721; ORF722; ORF723; ORF725; ORF726; ORF727; ORF728; ORF729; ORF730; ORF731; ORF733; ORF736; ORF737; ORF738; ORF740; ORF741; ORF742; ORF743; ORF747; ORF748; ORF750; ORF752; ORF754; ORF755; ORF756; ORF757; ORF759; ORF760; ORF761; ORF762; ORF763; ORF764; ORF765; ORF766; ORF767; ORF768; ORF772; ORF774; ORF775; ORF777; ORF781; ORF783; ORF788; ORF791; ORF792; ORF793; ORF794; ORF795; ORF796; ORF797; ORF798; ORF799; ORF802; ORF803; ORF806; ORF807; ORF808; ORF809; ORF810; ORF811; ORF813; ORF814; ORF815; ORF816; ORF817; ORF819; ORF820; ORF821; ORF823; ORF824; ORF827; ORF829; ORF830; ORF831; ORF833; ORF834; ORF835; ORF837; ORF844; ORF845; ORF846; ORF847; ORF848; ORF849; ORF850; ORF851; ORF852; ORF854; ORF855; ORF856; ORF857; ORF859; ORF860; ORF862; ORF865; ORF866; ORF868; ORF869; ORF870; ORF871; ORF872; ORF874; ORF877; ORF878; ORF879; ORF880; ORF881; ORF882; ORF884; ORF885; ORF888; ORF889; ORF890; ORF891; ORF892; ORF894; ORF895; ORF896; ORF897; ORF899; ORF900; ORF902; ORF903; ORF904; ORF905; ORF909; ORF910; ORF912; ORF913; ORF914; ORF915; ORF917; ORF918; ORF919; ORF921; ORF923; ORF924; ORF926; ORF927; ORF928; ORF929; ORF930; ORF931; ORF937; ORF938; ORF939; ORF941; ORF943; ORF948; ORF951; ORF952; ORF953; ORF958; ORF960; ORF963; ORF964; ORF965; ORF968; ORF970; ORF974; ORF975; ORF977; ORF979; ORF980; ORF981; ORF983; ORF984; ORF985; ORF987; ORF989; ORF992; ORF993; ORF997; ORF998; ORF999; ORF1001; ORF1002; ORF1004; ORF1005; ORF1009; ORF1013; ORF1014; ORF1015; ORF1016; ORF1019; ORF1021; ORF1023; ORF1024; ORF1029; ORF1031; ORF1033; ORF1034; ORF1039; ORF1041; ORF1042; ORF1045; ORF1047; ORF1049; ORF1051; ORF1052; ORF1053; ORF1054; ORF1056; ORF1059; ORF1061; ORF1062; ORF1063; ORF1064; ORF1065; ORF1067; ORF1075; ORF1077; ORF1078; ORF1079; ORF1080; ORF1081; ORF1089; ORF1095; ORF1097; ORF1098; ORF1099; ORF1101; ORF1102; ORF1103; ORF1106; ORF1107; ORF1108; ORF1109; ORF1110; ORF1113; ORF1116; ORF1118; ORF1119; ORF1121; ORF1123; ORF1124; ORF1126; ORF1128; ORF1130; ORF1131; ORF1133; ORF1134; ORF1136; ORF 1137 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt die Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Transmembranpolypeptid von Chlamydia pneumoniae mit zwischen 4 und 6 Transmembrandomänen oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORFS; ORF7; ORF8; ORF15; ORF36; ORF38; ORF51; ORF55; ORF58; ORF67; ORF70; ORF81; ORF97; ORF110; ORF111; ORF115; ORF119; ORF126; ORF128; ORF148; ORF155; ORF163; ORF165; ORF168; ORF169; ORF171; ORF172; ORF174; ORF177; ORF181; ORF193; ORF203; ORF213; ORF214; ORF216; ORF217; ORF221; ORF222; ORF225; ORF229; ORF243; ORF246; ORF248; ORF254; ORF261; ORF285; ORF288; ORF292; ORF296; ORF298; ORF299; ORF301; ORF303; ORF317; ORF328; ORF329; ORF351; ORF354; ORF355; ORF364; ORF371; ORF374; ORF375; ORF391; ORF395; ORF401; ORF403; ORF405; ORF409; ORF414; ORF419; ORF421; ORF423; ORF425; ORF438; ORF448; ORF453; ORF458; ORF466; ORF468; ORF470; ORF480; ORF489; ORF490; ORF496; ORF501; ORF504; ORF505; ORF506; ORF511; ORF513; ORF519; ORF526; ORF532; ORF538; ORF539; ORF547; ORF550; ORF561; ORF568; ORF570; ORF574; ORF578; ORF579; ORF580; ORF582; ORF589; ORF593; ORF598; ORF601; ORF604; ORF610; ORF613; ORF617; ORF626; ORF632; ORF635; ORF638; ORF640; ORF641; ORF646; ORF649; ORF650; ORF651; ORF686; ORF711; ORF724; ORF732; ORF734; ORF744; ORF745; ORF749; ORF751; ORF769; ORF770; ORF771; ORF773; ORF776; ORF779; ORF780; ORF785; ORF787; ORF789; ORF801; ORF805; ORF812; ORF822; ORF825; ORF826; ORF839; ORF841; ORF843; ORF853; ORF861; ORF875; ORF876; ORF886; ORF893; ORF898; ORF906; ORF907; ORF908; ORF920; ORF922; ORF925; ORF933; ORF935; ORF936; ORF944; ORF946; ORF947; ORF954; ORF959; ORF961; ORF966; ORF967; ORF972; ORF978; ORF995; ORF996; ORF1000; ORF1003; ORF1010; ORF1011; ORF1012; ORF1017; ORF1020; ORF1030; ORF1036; ORF1038; ORF1043; ORF1046; ORF1048; ORF1050; ORF1058; ORF1071; ORF1073; ORF1084; ORF1085; ORF1086; ORF1087; ORF1091; ORF1092; ORF1094; ORF1096; ORF1100; ORF1104; ORF1111; ORF1112; ORF1114; ORF1117; ORF1122; ORF1125 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt auch die Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Transmembranpolypeptid von Chlamydia pneumoniae mit mindestens 7 Transmembrandomänen oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF17; ORF52; ORF68; ORF83; ORF87; ORF109; ORF112; ORF113; ORF120; ORF121; ORF127; ORF153; ORF204; ORF211; ORF218; ORF223; ORF275; ORF277; ORF295; ORF300; ORF302; ORF306; ORF327; ORF335; ORF342; ORF343; ORF347; ORF349; ORF361; ORF363; ORF369; ORF380; ORF388; ORF389; ORF397; ORF415; ORF432; ORF439; ORF446; ORF449; ORF472; ORF478; ORF500; ORF522; ORF524; ORF567; ORF575; ORF602; ORF606; ORF609; ORF636; ORF639; ORF643; ORF653; ORF668; ORF692; ORF702; ORF704; ORF713; ORF720; ORF778; ORF784; ORF800; ORF836; ORF838; ORF842; ORF864; ORF867; ORF883; ORF901; ORF916; ORF932; ORF934; ORF940; ORF942; ORF950; ORF956; ORF971; ORF973; ORF976; ORF988; ORF994; ORF1018; ORF1028; ORF1035; ORF1037; ORF1044; ORF1055; ORF1057; ORF1068; ORF1069; ORF1070; ORF1072; ORF1082; ORF1088; ORF1105; ORF1132; ORF1135 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt die Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein der Oberfläche ausgesetztes Polypeptid (z. B. ein Protein der äußeren Membran) von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, wobei die Nukleotidsequenzen eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF 15, ORF 25, ORF 26, ORF 27, ORF 28, ORF 29, ORF 30, ORF 31, ORF 32, ORF 33, ORF 35, ORF 36, ORF 1257, ORF 280, ORF 291, ORF 314, ORF 354, ORF 380, ORF 1266, ORF 466, ORF 467, ORF 468, ORF 469, ORF 470, ORF 472, ORF 474, ORF 476, ORF 477, ORF 478, ORF 479, ORF 480, ORF 482, ORF 483, ORF 485, ORF 486, ORF 500, ORF 501, ORF 503, ORF 504, ORF 505, ORF 506, ORF 507, ORF 1268, ORF 1269, ORF 543, ORF 544, ORF 578, ORF 579, ORF 580, ORF 581, ORF 595, ORF 596, ORF 597, ORF 1271, ORF 633, ORF 637, ORF 699, ORF 706, ORF 737, ORF 744, ORF 1273, ORF 751, ORF 775, ORF 776, ORF 777, ORF 793, ORF 815, ORF 830, ORF 1221, ORF 849, ORF 851, ORF 852, ORF 874, ORF 891, ORF 922, ORF 940, ORF 1231, ORF 1281, ORF 1035, ORF 1079, ORF 1087, ORF 1108 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt die Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Lipoprotein von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, wobei die Nukleotidsequenzen eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF 3, ORF 10, ORF 11, ORF 16, ORF 1254, ORF 1255, ORF 38, ORF 1256, ORF 62, ORF 85, ORF 1258, ORF 115, ORF 1151, ORF 151, ORF 1259, ORF 173, ORF 1261, ORF 186, ORF 194, ORF 205, ORF 214, ORF 216, ORF 217, ORF 238, ORF 1177, ORF 280, ORF 291, ORF 317, ORF 327, ORF 354, ORF 364, ORF 367, ORF 414, ORF 432, ORF 1192, ORF 460, ORF 1267, ORF 1268, ORF 520, ORF 536, ORF 1270, ORF 576, ORF 597, ORF 603, ORF 609, ORF 637, ORF 1272, ORF 652, ORF 1213, ORF 699, ORF 705, ORF 706, ORF 708, ORF 711, ORF 727, ORF 1274, ORF 800, ORF 814, ORF 825, ORF 829, ORF 830, ORF 831, ORF 844, ORF 849, ORF 1275, ORF 1276, ORF 1277, ORF 872, ORF 878, ORF 880, ORF 891, ORF 892, ORF 1278, ORF 1279, ORF 1280, ORF 941, ORF 942, ORF 1282, ORF 1283, ORF 952, ORF 988, ORF 998, ORF 1009, ORF 1285, ORF 1235, ORF 1028, ORF 1056, ORF 1070, ORF 1287, ORF 1087, ORF 1288, ORF 1289, ORF 1098, ORF 1246, ORF 1291, ORF 1108, ORF 1109, ORF 1112, ORF 1133 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt die Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polypeptid von Chlamydia pneumoniae, das an der Biosynthese von Lipopolysaccharid (LPS) beteiligt ist, kodieren, wobei die Nukleotidsequenzen eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen: ORF 316, ORF 564, ORF 610, ORF 647, ORF 1211, ORF 688, ORF 924 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt zusätzliche, mit LPS verwandte Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie kodieren:
    • (a) ein mit KDO (3-Desoxy-D-manno-octulosonsäure) verwandtes Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente, wobei die Nukleotidsequenzen eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen: ORF 177, ORF 1156, ORF 245, ORF 767 und eines ihrer repräsentativen Fragmente;
    • (b) ein mit Phosphomannomutase verwandtes Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente, wobei die Nukleotidsequen zen eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen: ORF 74 und eines seiner repräsentativen Fragmente;
    • (c) ein mit Phosphoglucomutase verwandtes Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente, wobei die Nukleotidsequenzen eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen: ORF 1286, ORF 1039 und eines ihrer repräsentativen Fragmente; und
    • (d) ein mit der Lipid A Komponente verwandtes Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente, wobei die Nukleotidsequenzen eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen: ORF 689, ORF 690, ORF 691, ORF 1037 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polypeptid, das RGD (Arg-Gly-Asp) Anlagerungsstellen von Chlamydia pneumoniae enthält, oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren.
    • (a) RGD-enthaltende Proteine, die Proteine der äußeren Membran sind, spielen mit größerer Wahrscheinlichkeit eine Rolle bei der Zellanlagerung. ORFs, die ein eine RGD-Sequenz enthaltendes Protein kodierten, und auch als Proteine der äußeren Membran klassifiziert wurden, sind ORF 468 und seine repräsentativen Fragmente.
    • (b) Ein RGD-enthaltender ORF, der Homologie zu den Virulenzloci cds1, cds2 und copN Typ III in Chlamydia psittaci zeigt (Hsia, R. et al. (1997), Typ III secretion genes identity a putative virulence locus of Chlamydia. Molecular Microbiology 25: 351–359), ist ORF 350 und seine repräsentativen Fragmente.
    • (c) Die äußere Membran von Chlamydia besteht aus cysteinreichen Proteinen, die ein Netzwerk von sowohl intra- als auch intermolekularen Disulfidbindungen bilden. Diese tragen zur Integrität der Membran bei, da Chlamydia die Peptidoglycanschicht, die andere gramnegative Bakterien haben, fehlt. Cysteinreiche Proteine, welche die RGD-Sequenz haben, gelten auch als potenzielle Impfstoffkandidaten. Cysteinreiche Proteine wurden als Proteine definiert, die in ihrer primären Aminosäuresequenz mehr als 3,0% Cystein über dem mittleren genomischen Cysteingehalt der ORFs hatten. Die entsprechenden ORFs sind: ORF 1290, ORF 1294, ORF 1296 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
    • (d) Die äußere Membran von Chlamydia kann auch kleine Moleküle enthalten, die in ihrem N- und C-Terminus Cysteine haben, die zu dem Netzwerk beitragen können, das aus Disulfidbindungen gebildet ist. Diese Proteine können über ihren N-Terminus in der äußeren Membran verankert sein und können ihren C-Terminus ausgesetzt haben, der dann mit den Wirtszellen eine Wechselwirkung eingehen kann. Alternativ dazu können diese Proteine über sowohl den N- als auch den C-Terminus in der äußeren Membran verankert sein und können in der Mitte Regionen haben, die ausgesetzt sein können, die wiederum mit den Wirtszellen eine Wechselwirkung eingehen können. ORFs, die Polypeptide kodieren, die in ihren ersten 30 Aminosäuren Cysteine enthalten und auch eine RGD-Sequenz enthalten, sind: ORF 105, ORF 106, ORF 114, ORF 170, ORF 171, ORF 1264, ORF 268, ORF 1265, ORF 350, ORF 393, ORF 394, ORF 451, ORF 452, ORF 453, ORF 473, ORF 499, ORF 515, ORF 519, ORF 525, ORF 526, ORF 538, ORF 611, ORF 645, ORF 686, ORF 700, ORF 746, ORF 755, ORF 756, ORF 757, ORF 789, ORF 814, ORF 855, ORF 856, ORF 878, ORF 957, ORF 958, ORF 989, ORF 1290 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
    • (e) RGD-enthaltende ORFs, die zu RGD-enthaltenden ORFs aus Chlamydia trachomatis homolog sind, sind: ORF 114, ORF 468, ORF 755, ORF 756, ORF 757, ORF 855, ORF 856, ORF 905, ORF 913, ORF 914, ORF 915 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein sezerniertes Polypeptid des Typs III oder ein anderes, nicht vom Typ III, von Chlamydia pneumoniae oder eines ihrer repräsentativen Fragmente kodieren, wobei die Nukleotidsequenzen eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF 25, ORF 28, ORF 29, ORF 33, ORF 308, ORF 309, ORF 343, ORF 344, ORF 345, ORF 367, ORF 414, ORF 415, ORF 480, ORF 550, ORF 579, ORF 580, ORF 581, ORF 597, ORF 699, ORF 744, ORF 751, ORF 776, ORF 866, ORF 874, ORF 883, ORF 884, ORF 888, ORF 891, ORF 1293 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein in der Zellwand verankertes Oberflächenpolypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, wobei die Nukleotidsequenzen eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF 267, ORF 271, ORF 419, ORF 590, ORF 932, ORF 1292, ORF 1295 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie Polypeptide von Chlamydia pneumoniae, die in Chlamydia trachomatis nicht gefunden werden (Blastp. P > e–10), kodieren, wobei die Nukleotidsequenzen eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen: ORF 7, ORF 8, ORF 9, ORF 16, ORF 17, ORF 18, ORF 19, ORF 20, ORF 21, ORF 22, ORF 1254, ORF 23, ORF 1255, ORF 24, ORF 1139, ORF 1140, ORF 46, ORF 47, ORF 51, ORF 60, ORF 1256, ORF 61, ORF 62, ORF 63, ORF 64, ORF 1257, ORF 65, ORF 66, ORF 67, ORF 68, ORF 1143, ORF 1145, ORF 83, ORF 84, ORF 1146, ORF 85, ORF 86, ORF 87, ORF 1258, ORF 116, ORF 117, ORF 125, ORF 1148, ORF 143, ORF 1150, ORF 1151, ORF 144, ORF 145, ORF 147, ORF 148, ORF 149, ORF 150, ORF 152, ORF 1259, ORF 162, ORF 166, ORF 1154, ORF 167, ORF 1261, ORF 1156, ORF 1157, ORF 178, ORF 179, ORF 1158, ORF 182, ORF 183, ORF 184, ORF 185, ORF 1159, ORF 186, ORF 1160, ORF 187, ORF 188, ORF 189, ORF 190, ORF 1161, ORF 1162, ORF 191, ORF 192, ORF 194, ORF 195, ORF 1163, ORF 196, ORF 201, ORF 202, ORF 209, ORF 212, ORF 221, ORF 224, ORF 1167, ORF 226, ORF 227, ORF 228, ORF 229, ORF 230, ORF 231, ORF 232, ORF 1169, ORF 1170, ORF 1171, ORF 234, ORF 235, ORF 236, ORF 1172, ORF 243, ORF 251, ORF 252, ORF 1176, ORF 253, ORF 255, ORF 254, ORF 256, ORF 1177, ORF 1178, ORF 262, ORF 263, ORF 1264, ORF 278, ORF 279, ORF 1180, ORF 280, ORF 290, ORF 291, ORF 292, ORF 296, ORF 1181, ORF 297, ORF 298, ORF 300, ORF 1265, ORF 322, ORF 324, ORF 325, ORF 370, ORF 1186, ORF 371, ORF 372, ORF 1187, ORF 373, ORF 378, ORF 1266, ORF 382, ORF 383, ORF 384, ORF 385, ORF 386, ORF 1188, ORF 1189, ORF 391, ORF 392, ORF 398, ORF 400, ORF 403, ORF 1191, ORF 423, ORF 435, ORF 445, ORF 450, ORF 1193, ORF 456, ORF 460, ORF 461, ORF 465, ORF 1196, ORF 471, ORF 473, ORF 475, ORF 481, ORF 484, ORF 487, ORF 488, ORF 489, ORF 490, ORF 491, ORF 492, ORF 493, ORF 494, ORF 495, ORF 496, ORF 497, ORF 498, ORF 499, ORF 502, ORF 1267, ORF 1268, ORF 508, ORF 510, ORF 509, ORF 512, ORF 515, ORF 519, ORF 1197, ORF 521, ORF 1198, ORF 522, ORF 524, ORF 528, ORF 534, ORF 537, ORF 1269, ORF 1270, ORF 548, ORF 551, ORF 557, ORF 1201, ORF 1203, ORF 562, ORF 566, ORF 593, ORF 595, ORF 600, ORF 1271, ORF 604, ORF 611, ORF 612, ORF 614, ORF 616, ORF 625, ORF 627, ORF 628, ORF 629, ORF 631, ORF 641, ORF 1272, ORF 648, ORF 1212, ORF 663, ORF 685, ORF 707, ORF 714, ORF 715, ORF 716, ORF 717, ORF 722, ORF 746, ORF 1273, ORF 761, ORF 764, ORF 770, ORF 1217, ORF 783, ORF 1274, ORF 803, ORF 815, ORF 1220, ORF 835, ORF 1221, ORF 844, ORF 845, ORF 846, ORF 847, ORF 848, ORF 849, ORF 850, ORF 851, ORF 1275, ORF 852, ORF 862, ORF 1276, ORF 1277, ORF 873, ORF 1223, ORF 892, ORF 919, ORF 1225, ORF 1278, ORF 926, ORF 1228, ORF 1229, ORF 1230, ORF 1279, ORF 1281, ORF 1282, ORF 1283, ORF 948, ORF 950, ORF 949, ORF 951, ORF 980, ORF 982, ORF 1233, ORF 999, ORF 1000, ORF 1001, ORF 1002, ORF 1008, ORF 1285, ORF 1235, ORF 1016, ORF 1019, ORF 1027, ORF 1036, ORF 1241, ORF 1048, ORF 1049, ORF 1050, ORF 1053, ORF 1054, ORF 1064, ORF 1076, ORF 1091, ORF 1288, ORF 1093, ORF 1289, ORF 1101, ORF 1103, ORF 1245, ORF 1246, ORF 1247, ORF 1290, ORF 1291, ORF 1115, ORF 1116, ORF 1118, ORF 1120, ORF 1249, ORF 1121, ORF 1250, ORF 1126, ORF 1251, ORF 1127, ORF 1128, ORF 1130, ORF 1129, ORF 1131, ORF 1136, ORF 1253, ORF 1292, ORF 1294, ORF 1295, ORF 1296, und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt auch Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, das am Intermediärstoffwechsel, insbesondere am Stoffwechsel von Zuckern und/oder Cofaktoren beteiligt ist, wie zum Beispiel Triosephosphatisomerase oder Pyruvatkinase, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF2; ORF55; ORF56; ORF69; ORF75; ORF80; ORF100; ORF110; ORF114; ORF120; ORF121; ORF157; ORF160; ORF161; ORF172; ORF180; ORF181; ORF198; ORF200; ORF225; ORF248; ORF249; ORF276; ORF277; ORF318; ORF319; ORF320; ORF323; ORF331; ORF347; ORF375; ORF376; ORF381; ORF393; ORF394; ORF395; ORF396; ORF409; ORF446; ORF447; ORF448; ORF449; ORF513; ORF516; ORF571; ORF647; ORF662; ORF697; ORF718; ORF793; ORF794; ORF808; ORF809; ORF838; ORF839; ORF840; ORF853; ORF854; ORF918; ORF923; ORF929; ORF931; ORF938; ORF939; ORF958; ORF959; ORF960; ORF966; ORF995; ORF1021; ORF1040; ORF1041; ORF1042; ORF1085; ORF1100; ORF1102; ORF1117; ORF1118; ORF1119; ORF1120; ORF1135 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt auch Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, das am Intermediärstoffwechsel von Nukleotiden oder Nukleinsäuren beteiligt ist, wie zum Beispiel CTP-Synthetase oder GMP-Synthetase, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF77; ORF78; ORF138; ORF189; ORF190; ORF233; ORF246; ORF338; ORF412; ORF421; ORF438; ORF607; ORF648; ORF657; ORF740; ORF783; ORF967; ORF989; ORF990; ORF992; ORF1011; ORF1058; ORF1059; ORF1073; ORF1074 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt auch Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, das am Stoffwechsel von Nukleinsäuren beteiligt ist, wie zum Beispiel DNA-Polymerasen oder DNA-Topoisomerasen, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF14; ORF59; ORF70; ORF71; ORF97; ORF113; ORF137; ORF141; ORF169; ORF285; ORF287; ORF288; ORF313; ORF326; ORF358; ORF411; ORF443; ORF548; ORF569; ORF601; ORF651; ORF654; ORF658; ORF659; ORF664; ORF665; ORF694; ORF698; ORF704; ORF760; ORF762; ORF763; ORF786; ORF787; ORF788; ORF801; ORF802; ORF812; ORF819; ORF822; ORF870; ORF897; ORF898; ORF902; ORF908; ORF916; ORF954; ORF955; ORF961; ORF983; ORF996; ORF1007; ORF1012; ORF1013; ORF1014; ORF1015; ORF1038; ORF1137 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt auch Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, das am Stoffwechsel von Aminosäuren oder Polypeptiden beteiligt ist, wie zum Beispiel Serinhydroxymethyltransferase oder die Proteine, welche Aminosäuren auf Transfer-RNAs laden, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF99; ORF111; ORF127; ORF134; ORF140; ORF174; ORF175; ORF176; ORF353; ORF377; ORF404; ORF523; ORF539; ORF559; ORF561; ORF586; ORF598; ORF609; ORF636; ORF687; ORF700; ORF701; ORF759; ORF790; ORF857; ORF861; ORF904; ORF936; ORF952; ORF962; ORF963; ORF964; ORF965; ORF991; ORF1003; ORF1004; ORF1005; ORF1018; ORF1067; ORF1110; ORF1111; ORF1112; ORF1114; ORF1121; ORF1122; ORF1123; ORF1124; ORF1125 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt auch Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, das am Stoffwechsel von Polypeptiden beteiligt ist, wie zum Beispiel Proteinkinasen oder Proteasen, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF4; ORF44; ORF45; ORF48; ORF54; ORF112; ORF130; ORF155; ORF163; ORF212; ORF257; ORF307; ORF343; ORF405; ORF416; ORF458; ORF540; ORF541; ORF542; ORF543; ORF544; ORF560; ORF594; ORF652; ORF699; ORF723; ORF747; ORF817; ORF827; ORF871; ORF909; ORF910; ORF911; ORF912; ORF1023; ORF1051; ORF1052; ORF1081 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt auch Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, das am Stoffwechsel von Fettsäuren beteiligt ist, wie zum Beispiel Succinyl-CoA synthetisierende Proteine oder Phosphatidylserinsynthetase, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF76; ORF284; ORF308; ORF309; ORF310; ORF311; ORF312; ORF425; ORF433; ORF565; ORF688; ORF690; ORF691; ORF767; ORF797; ORF894; ORF895; ORF994; ORF1020; ORF1030; ORF1033; ORF1034; ORF1046; ORF1047; ORF1057 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt auch Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, das an der Synthese der Wand beteiligt ist, wie zum Beispiel die KDO-Transferase und die Proteine, die für die Anlagerung bestimmter Zucker an die ausgesetzten Proteine verantwortlich sind, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF49; ORF50; ORF177; ORF178; ORF245; ORF610; ORF972; ORF974; ORF978; ORF1037 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt auch Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, das an der Transkription, Translation und/oder am Reifungsprozess beteiligt ist, wie zum Beispiel Initiationsfaktoren, RNA Polymerasen oder bestimmte Chaperonproteine und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF90; ORF92; ORF131; ORF151; ORF199; ORF333; ORF334; ORF336; ORF379; ORF589; ORF590; ORF619; ORF630; ORF649; ORF739; ORF741; ORF806; ORF821; ORF843; ORF968; ORF971; ORF1061 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt auch Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein ribosomales Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, wie zum Beispiel die ribosomalen Proteine L21, L27 und S10, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF93; ORF94; ORF95; ORF136; ORF259; ORF332; ORF348; ORF583; ORF584; ORF588; ORF591; ORF592; ORF663; ORF666; ORF667; ORF669; ORF670; ORF671; ORF672; ORF673; ORF674; ORF675; ORF676; ORF677; ORF678; ORF679; ORF680; ORF681; ORF683; ORF684; ORF738; ORF781; ORF1008; ORF1024; ORF1025; ORF1066 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt auch Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Transportpolypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, wie zum Beispiel die Proteine zum Transportieren von Aminosäuren, Zuckern und bestimmten Oligopeptiden, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF40; ORF41; ORF52; ORF105; ORF106; ORF107; ORF109; ORF133; ORF210; ORF211; ORF214; ORF215; ORF216; ORF217; ORF218; ORF219; ORF220; ORF223; ORF242; ORF260; ORF293; ORF299; ORF366; ORF369; ORF575; ORF602; ORF638; ORF639; ORF640; ORF643; ORF653; ORF702; ORF703; ORF724; ORF732; ORF855; ORF856; ORF901; ORF906; ORF933; ORF942; ORF1043; ORF1086; ORF1105 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt auch Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, das am Virulenzvorgang beteiligt ist, wie zum Beispiel die zum Protein vacB von Escherichia coli analogen Proteine, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF546; ORF550; ORF778; ORF779; ORF886 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt auch Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, das am Sekretionssystem beteiligt ist und/oder das sezerniert wird, wie zum Beispiel zu Proteinen im Sekretionssystem bestimmter Bakterien, wie zum Beispiel Salmonellen oder Yersinien, homologe Proteine, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfassen:
    ORF751; ORF874; ORF875; ORF876; ORF883; ORF884; ORF885 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Die Erfindung beschreibt auch eine Nukleotidsequenz, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie ein für Chlamydia pneumoniae spezifisches Polypeptid oder eines seiner repräsentativen Fragmente (mit einem Blast E Wert von > 10–5) kodiert, und dadurch, dass sie eine Nukleotidsequenz, die aus den folgenden Sequenzen gewählt ist, umfasst:
    ORF7; ORF8; ORF17; ORF18; ORF19; ORF20; ORF22; ORF23; ORF24; ORF51; ORF60; ORF63; ORF65; ORF66; ORF67; ORF83; ORF84; ORF86; ORF87; ORF125; ORF143; ORF144; ORF179; ORF182; ORF184; ORF185; ORF187; ORF221; ORF252; ORF254; ORF278; ORF279; ORF387; ORF388; ORF397; ORF1048; ORF1049; ORF1050; ORF1128; ORF1130; ORF1131 und eines ihrer repräsentativen Fragmente.
  • Im Allgemeinen kann in der vorliegenden Erfindung die funktionelle Gruppe, zu der ein Polypeptid gehört, sowie die ihm entsprechende Nukleotidsequenz entweder durch vergleichende Analogie mit schon bekannten Sequenzen oder durch die Verwendung von Standardtechniken der Biochemie, der Cytologie, kombiniert mit den Techniken der Gentechnik, wie zum Beispiel Immunaffinität, Lokalisierung durch Immunmarkierung, differenzielle Extraktion, Messung enzymatischer Aktivität, Untersuchung der die Expression induzierenden oder reprimierenden Aktivität oder Untersuchung der Expression in E. coli, bestimmt werden.
  • Es ist einerseits eindeutig klar, dass in der vorliegenden Erfindung die Nukleotidsequenzen (ORF) und die Aminosäuresequenzen (No. 2 bis No. 1291 und No. 6844 bis No. 6848), die anhand der funktionellen Gruppen aufgelistet sind, innerhalb der betrachteten Gruppe nicht vollständig sind. Darüber hinaus ist auch eindeutig klar, dass in der vorliegenden Erfindung eine Nukleotidsequenz (ORF), die innerhalb einer gegebenen funktionellen Gruppe erwähnt wird, auch Teil einer anderen Gruppe sein kann, wobei zum Beispiel die Beziehung zwischen den aufgelisteten Gruppen berücksichtigt wird. Demgemäss und als ein Beispiel dieser Beziehung kann ein exportiertes und/oder sezerniertes Polypeptid sowie seine kodierende Nukleotidsequenz durch Modifizieren des Verteidigungsmechanismus der infizierten Wirtszelle auch am Virulenzvorgang von Chlamydia pneumoniae beteiligt sein oder ein Transmembranpolypeptid oder seine kodierende Nukleotidsequenz ist auch Teil der Polypeptide oder kodierenden Nukleotidsequenzen der Zellhülle.
  • Die vorliegende Erfindung beschreibt auch die angeführten Nukleotid- und/oder Polypeptidsequenzen, die auf einem Medium, das Aufnahmemedium genannt wird, aufgenommen wurden, dessen Art und Beschaffenheit das Ablesen, die Analyse und die Verwertung der Sequenzen erleichtern. Diese Medien können natürlich auch eine andere Information, die aus der vorliegenden Erfindung extrahiert wurde, enthalten, wie zum Beispiel insbesondere die Analogien mit schon bekannten Sequenzen, wie zum Beispiel die in Tabelle 1 der vorliegenden Erfindung erwähnten, und/oder können zusätzlich eine Information, welche die Nukleotid- und/oder Polypeptidsequenzen anderer Mikroorganismen betrifft, enthalten, um die vergleichende Analyse und die Verwertung der erhaltenen Ergebnisse zu erleichtern.
  • Unter diesen Aufnahmemedien werden insbesondere computerlesbare Medien, wie zum Beispiel magnetische, optische, elektrische und Hybridmedien, wie zum Beispiel Floppydisketten, CD-ROMs oder Aufnahmekassetten bevorzugt.
  • Die Erfindung beschreibt auch Nukleotidsequenzen, die als Primer oder Sonde zum Nachweis und/oder zur Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen verwendet werden können.
  • Diese Nukleotidsequenzen können somit verwendet werden, um Nukleotidsequenzen zu amplifizieren, insbesondere durch die PCR-Technik (Polymerasekettenreaktion) (Erlich, 1989; Innis et al., 1990; Rolfs et al., 1991 und White et al., 1997).
  • Diese Oligodesoxyribonukleotid- oder Oligoribonukleotidprimer entsprechen repräsentativen Nukleotidfragmenten und sind vorteilhafterweise mindestens 8 Nukleotide, vorzugsweise mindestens 12 Nukleotide, 15 Nukleotide und noch stärker bevorzugt mindestens 20 Nukleotide lang.
  • Andere Techniken zum Amplifizieren der Zielnukleinsäure können vorteilhafterweise als Alternativen zur PCR verwendet werden.
  • Diese Nukleotidsequenzen, insbesondere die Primer, können auch bei anderen Verfahren zum Amplifizieren einer Zielnukleinsäure verwendet werden, wie zum Beispiel:
    • – der TAS-Technik (auf Transkription beruhendes Amplifikationssystem), die im Jahr 1989 von Kwoh et al. beschrieben wurde;
    • – der 3SR-Technik (sich selbst unterhaltende Sequenzreplikation), die im Jahr 1990 von Guatelli et al. beschrieben wurde;
    • – der NASBA-Technik (auf der Nukleinsäuresequenz beruhende Amplifikation), die im Jahr 1991 von Kievitis et al. beschrieben wurde;
    • – der SDA-Technik (Strangverdrängungsamplifikation) (Walker et al., 1992);
    • – der TMA-Technik (Transkriptions-vermittelte Amplifikation).
  • Diese Polynukleotide können auch bei Techniken zum Amplifizieren oder zum Modifizieren der als Sonde dienenden Nukleinsäure verwendet werden, wie zum Beispiel:
    • – der LCR-Technik (Ligasekettenreaktion), die im Jahr 1988 von Landegren et al. beschrieben und im Jahr 1991 von Barany et al. perfektioniert wurde, die eine thermostabile Ligase verwendet;
    • – der RCR-Technik (Reparaturkettenreaktion), die im Jahr 1992 von Segev beschrieben wurde;
    • – der CPR-Technik (Cycling Probe-Reaktion), die im Jahr 1990 von Duck et al. beschrieben wurde;
    • – der Q-beta-Replikase-Amplifikationstechnik, die im Jahr 1983 von Miele et al. beschrieben und insbesondere im Jahr 1986 von Chu et al., im Jahr 1988 von Lizardi et al. und dann im Jahr 1996 von Burg et al. sowie von Stone et al. perfektioniert wurde.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart sowohl Hybridisierungssonden als auch Primer. Im Allgemeinen sollten die komplementären Sonden eine Länge aufweisen, die ausreicht, um einen stabilen Hybridkomplex mit den Zielsequenzen zu bilden. Solange Primer zu den Zielsequenzen komplementär sind, müssen sie keine stabilen Hybridisierungskomplexe mit den Zielsequenzen allein bilden. Stattdessen bilden Primer in Anwesenheit von Polymerase stabile Komplexe mit den Zielsequenzen, um die Verlängerung des Primers zu gestatten.
  • Im Fall, dass das nachzuweisende Zielpolynukleotid möglicherweise eine RNA, zum Beispiel eine mRNA, ist, wird es möglich sein, vor der Verwendung einer Amplifikationsreaktion mit Hilfe von mindestens einem Primer oder vor der Verwendung eines Nachweisverfahrens mit Hilfe von mindestens einer Sonde, ein Enzym vom Typ der reversen Transkriptase zu verwenden, um aus der RNA, die in der biologischen Probe enthalten ist, eine cDNA zu erhalten. Die erhaltene cDNA wird dann als Ziel für den/die im Amplifikations- oder Nachweisverfahren verwendeten Primer oder Sonde(n) dienen.
  • Die Nachweissonde wird so gewählt, dass sie mit der Zielsequenz oder dem aus der Zielsequenz erzeugten Amplikon hybridisiert. Eine derartige Nachweissonde wird als Sequenz vorteilhafterweise eine Sequenz von mindestens 12 Nukleotiden, insbesondere mindestens 20 Nukleotiden und vorzugsweise mindestens 100 Nukleotiden haben.
  • Die Erfindung führt auch die Nukleotidsequenzen an, die, markiert mit einer radioaktiven Verbindung oder mit einer nicht radioaktiven Verbindung, als Sonde oder Primer verwendet werden können.
  • Die nicht markierten Nukleotidsequenzen können direkt als Sonden oder Primer verwendet werden; allerdings sind die Sequenzen im Allgemeinen mit einem radioaktiven Element (32P, 35S, 3H, 125I) oder mit einem nicht radioaktiven Molekül (Biotin, Acetylaminofluoren, Digoxigenin, 5-Bromdesoxyuridin, Fluoreszein) markiert, um Sonden zu erhalten, die bei zahlreichen Anwendungen verwendet werden können.
  • Beispiele für nicht radioaktives Markieren von Nukleotidsequenzen werden zum Beispiel im französischen Patent No. 78,10975 oder von Urdea et al. oder von Sanchez-Pescador et al. im Jahr 1988 beschrieben.
  • Im letzteren Fall kann eines der Markierungsverfahren, die in den Patenten FR-2 422 956 und FR-2 518 755 beschrieben werden, auch verwendet werden.
  • Die Hybridisierungstechnik kann auf verschiedene Weisen durchgeführt werden (Matthews et al., 1988). Das üblichste Verfahren besteht aus dem Immobilisieren der Nukleinsäure, die aus Zellen von Chlamydia pneumoniae extrahiert wurde, auf einem Träger (wie zum Beispiel Nitrocellulose, Nylon, Polystyrol) und aus dem Inkubieren der Zielnukleinsäure mit der Sonde unter wohldefinierten Bedingungen. Nach der Hybridisierung wird die überschüssige Sonde entfernt und die gebildeten Hybridmoleküle werden durch das passende Verfahren (Messung der Radioaktivität, der Fluoreszenz oder der enzymatischen Aktivität, die mit der Sonde verbunden ist) nachgewiesen.
  • Die Erfindung führt auch diese Nukleotidsequenzen an, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie kovalent oder nicht kovalent auf einem Träger immobilisiert sind. Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Nukleinsequenzen können Letztere auf einem Träger immobilisiert verwendet werden und können somit dazu dienen, durch spezifische Hybridisierung die Zielnukleinsäure, die aus der zu testenden biologischen Probe erhalten wird, einzufangen. Falls notwendig, wird der feste Träger von der Probe getrennt und der Hybridisierungskomplex, der sich zwischen der sogenannten Einfangsonde und der Zielnukleinsäure bildet, wird dann mittels einer zweiten, mit einem leicht nachweisbaren Element markierten Sonde, die Nachweissonde genannt wird, nachgewiesen.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können auch bei neuen analytischen Systemen, den DNA-Chips, verwendet werden, die das Sequenzieren, die Untersuchung von Mutationen und der Expression von Genen ermöglichen, und die zurzeit angesichts ihrer sehr kleinen Größe und ihrer hohen Kapazität im Hinblick auf die Analyseanzahlen von Interesse sind.
  • Das Arbeitsprinzip dieser Chips beruht auf molekularen Sonden, meistens Oligonukleotiden, die auf einer miniaturisierten Oberfläche, im Allgemeinen in der Größenordnung von wenigen Quadratzentimetern, befestigt sind. Während einer Analyse wird eine Probe, die Fragmente einer zu analysierenden Zielnukleinsäure enthält, zum Beispiel DNA oder RNA, die zum Beispiel nach der Amplifikation markiert wurde, auf dem DNA-Chip deponiert, bei dem der Träger vorher mit Sonden beschichtet worden ist. Das In-Kontakt-Bringen der markierten Zielsequenzen mit den Sonden führt durch Hybridisierung gemäß der Paarbildungsregel, die von J. D. Watson und F. Crick definiert wurde, zur Bildung eines Duplexes. Nach einem Spülschritt ermöglicht die Analyse der Chipoberfläche, die wirksamen Hybridisierungen mittels der durch die Markierungen, mit denen das Ziel versehen wurde, emittierten Signale zu lokalisieren. Ein Hybridisierungs-Fingerabdruck ergibt sich aus dieser Analyse, die es durch passende Computerverarbeitung möglich macht, eine Information, wie zum Beispiel die Anwesenheit spezifischer Fragmente in der Probe, die Bestimmung von Sequenzen und die Anwesenheit von Mutationen, zu bestimmen.
  • Der Chip besteht aus einer Vielzahl von molekularen Sonden, die auf einem festen Träger, dessen Oberfläche miniaturisiert ist, exakt organisiert oder angeordnet sind. Er befindet sich im Zentrum eines Systems, wo andere Elemente (Bildgebungssystem, Mikrocomputer) die Erfassung und Interpretation eines Hybridisierungs-Fingerabdrucks ermöglichen.
  • Die Hybridisierungsträger werden in Form von flachen oder porösen Oberflächen (in die Vertiefungen gestanzt sind), die aus verschiedenen Materialien bestehen, bereitgestellt. Die Wahl eines Trägers wird durch seine physikochemischen Eigenschaften bestimmt, oder genauer gesagt, durch das Verhältnis zwischen Letzteren und den Bedingungen, unter die der Träger während der Synthese oder der Befestigung der Sonden oder während der Verwendung des Chips platziert wird. Es ist daher notwendig, vor dem in Betracht ziehen der Verwendung eines bestimmten Trägers (R. S. Matson et al., 1994) Kennzeichen, wie zum Beispiel dessen pH-Stabilität, dessen physikalische Festigkeit, dessen Reaktivität und dessen chemische Stabilität, sowie dessen Fähigkeit, Nukleinsäuren unspezifisch zu binden, zu erwägen. Materialien wie zum Beispiel Glas, Silikon und Polymere werden üblicherweise verwendet. Ihre Oberfläche wird in einem ersten Schritt, der „Funktionalisierung" genannt wird, für die Gruppen, von denen gewünscht wird, dass sie daran befestigt werden, reaktiv gemacht. Nach der Funktionalisierung werden sogenannte Spacermoleküle auf die aktivierte Oberfläche verpflanzt. Als Zwischenglieder zwischen der Oberfläche und der Sonde verwendet, machen diese Moleküle variabler Größe die Oberflächeneigenschaften der Träger unwichtig, die sich häufig für die Synthese oder für die Befestigung der Sonden und für die Hybridisierung als problematisch erweisen.
  • Unter den Hybridisierungsträgern kann Glas erwähnt werden, welches zum Beispiel beim Verfahren der in situ Synthese von Oligonukleotiden durch photochemisches Adressieren, das von der Firma Affymetrix (E. L. Sheldon, 1993) entwickelt wurde, verwendet wird, wobei die Glasoberfläche durch Silan aktiviert wird. Das Genosensor Consortium (P. Merel, 1994) verwendet auch Objektträger aus Glas, die Vertiefungen im Abstand von 3 mm tragen, wobei dieser Träger durch Epoxysilan aktiviert wird.
  • Polymere oder Silikon können auch unter diesen Hybridisierungsträgern erwähnt werden. Zum Beispiel hat das Team von Andrein Mirzabekov einen Chip entwickelt, der aus Polyacrylamidquadraten, die auf eine silanisierte Glasoberfläche polymerisiert wurden, besteht (G. Yershov et al., 1996). Einige Teams verwenden Silikon, insbesondere das IFOS Labor der Ecole Centrale von Lyon, das ein Siliziumhalbleitersubstrat verwendet, das durch das Einführen von Atomen, deren Wertigkeit sich von der des Siliziums unterscheiden, in seine Kristallstruktur p-dotiert wird. Verschiedene Arten von Metallen, insbesondere Gold und Platin, können auch als Träger verwendet werden (Genosensor Consortium (K. Beattie et al., 1993)).
  • Die Sonden können direkt auf den Trägern der DNA-Chips in situ synthetisiert werden. Diese in-situ-Synthese kann durch photochemisches Adressieren (von der Firma Affymax (Amsterdam, Holland) entwickelt und durch ihr Tochterunternehmen Affymetrix (Vereinigte Staaten) industriell verwertet) oder, beruhend auf der VLSIPS-Technologie (immobilisierten Polymersynthese in sehr großem Maßstab) (S. P. A. Fodor et al., 1991) ausgeführt werden, die auf einem Verfahren der photochemisch gerichteten kombinatorischen Synthese beruht und deren Prinzip Festphasenchemie, die Verwendung von photolabilen Schutzgruppen und Photolitographie kombiniert.
  • Die Sonden können auf verschiedene Weisen, wie zum Beispiel durch elektrochemisches Adressieren, automatisiertes Adressieren oder die Verwendung von Sondendruckern (T. Livache et al., 1994; G. Yershov et al., 1996; J. Derisi et al., 1996 und S. Borman, 1996) an den DNA-Chips befestigt werden.
  • Das Aufdecken der Hybridisierung zwischen den Sonden, die auf den Trägern der DNA-Chips deponiert oder in situ synthetisiert werden, und der zu analysierenden Probe kann zum Beispiel durch die Messung von Fluoreszenzsignalen, durch radioaktives Zählen oder durch elektronischen Nachweis bestimmt werden.
  • Die Verwendung von fluoreszierenden Molekülen, wie zum Beispiel Fluoreszein, macht das üblichste Verfahren zur Markierung der Proben aus. Es ermöglicht ein direktes oder indirektes Aufdecken der Hybridisierung und ermöglicht die Verwendung verschiedener Fluorochrome.
  • Affymetrix stellt zurzeit ein Gerät oder einen Scanner bereit, das/der dafür bestimmt ist, ihre GENE CHIP Chips abzulesen. Dies macht es möglich, die Hybridisierungen durch Scannen der Chipoberfläche in konfokaler Mikroskopie nachzuweisen (R. J. Lipshutz et al., 1995). Andere Verfahren zum Nachweisen fluoreszierender Signale sind getestet worden: Koppeln eines Epifluoreszenzmikroskops und einer CCD-Kamera (G. Yershov et al., 1996), die Verwendung eines Sammelsystems für optische Fasern (E. L. Sheldon, 1993). Ein übliches Verfahren besteht aus dem Ausführen einer Endmarkierung der Zielsequenzen mit Phosphor 32 mittels eines passenden Geräts, des Phosphorimagers (vertrieben von Molecular Dynamics). Der elektronische Nachweis beruht auf dem Prinzip, dass die Hybridisierung von zwei Nukleinsäuremolekülen von physikalischen Phänomenen begleitet wird, welche unter bestimmten Bedingungen quantifiziert werden können (das System wurde von der Ecole Centrale von Lyon entwickelt und wird GEN-FET (GEN Feldeffekttransistor) genannt). Das Genosensor Consortium und die Firma Beckman Instruments, die einen elektronischen Chip oder Permittivity CHIPSTM entwickeln, können auch erwähnt werden (K. Beattie et al., 1993).
  • Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können somit bei DNA-Chips verwendet werden, um die Analyse von Mutationen auszuführen. Diese Analyse beruht auf der Herstellung von Chips, die fähig sind, jede Base einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz zu analysieren.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können auch bei DNA-Chips verwendet werden, um die Analyse der Expression der Gene von Chlamydia pneumoniae auszuführen. Diese Analyse der Expression der Gene von Chlamydia pneumoniae beruht auf der Verwendung von Chips, bei denen Sonden der Erfindung, vorliegen, die wegen ihrer Spezifität, ein gegebenes Gen zu kennzeichnen, gewählt wurden (D. J. Lockhart et al., 1996; D. D. Shoemaker et al., 1996). Für die Verfahren zur Analyse der Genexpression unter Verwendung der DNA-Chips kann zum Beispiel eine Bezugnahme auf die Verfahren, die von D. J. Lockhart et al. (1996) und Sosnowsky et al. (1997) für die Synthese von Sonden in situ oder für das Adressieren und das Befestigen zuvor synthetisierter Sonden beschrieben werden, gemacht werden. Die zu analysierenden Zielsequenzen werden markiert und im Allgemeinen in Sequenzen von etwa 50 bis 100 Nukleotide fragmentiert, bevor sie auf den Chip hybridisiert werden. Nach dem Spülen, wie zum Beispiel von D. J. Lockhart et al. (1996) beschrieben, und der Anwendung unterschiedlicher elektrischer Felder (Sosnowsky et al., 1997) werden die markierten Verbindungen nachgewiesen und quantifiziert, wobei die Hybridisierungen mindestens in zweifacher Ausführung ausgeführt werden. Vergleichende Analysen der Signalintensitäten, die hinsichtlich der gleichen Sonde für unterschiedliche Proben und/oder für unterschiedliche Sonden mit der gleichen Probe erhalten werden, bestimmen die von der Probe abgeleitete differenzielle Expression von RNA oder von DNA.
  • Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können zusätzlich bei DNA-Chips verwendet werden, wo andere Nukleotidsonden, die für andere Mikroorganismen spezifisch sind, auch vorliegen, und können das Ausführen eines serienmäßigen Tests ermöglichen, der die rasche Identifikation der Anwesenheit eines Mikroorganismus in einer Probe ermöglicht.
  • Demgemäss handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie auf einem Träger eines DNA-Chips immobilisiert sind, auch um einen Gegenstand der Erfindung.
  • Die DNA-Chips, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens eine erfindungsgemäße Nukleotidsequenz, die auf dem Träger des Chips immobilisiert ist, enthalten, bilden auch einen Teil der Erfindung.
  • Die Chips werden vorzugsweise mehrere Sonden oder Nukleotidsequenzen der Erfindung mit unterschiedlicher Länge und/oder die unterschiedlichen Genen entsprechen enthalten, um die Spezifität der Zielsequenzen oder der gewünschten Mutation in der zu analysierenden Probe mit größerer Sicherheit zu identifizieren.
  • Demgemäss werden die Analysen, die mittels Primern und/oder Sonden, die auf Trägern wie zum Beispiel DNA-Chips immobilisiert sind, ausgeführt werden, es zum Beispiel möglich machen, in Proben Mutationen zu identifizieren, die mit Variationen verbunden sind, wie zum Beispiel Variationen innerhalb einer Art. Diese Variationen können mit Pathologien, die für die identifizierte Variante spezifisch sind, korreliert oder in Zusammenhang gebracht werden und werden es möglich machen, die passende Behandlung auszuwählen.
  • Die Erfindung führt auch einen erfindungsgemäßen DNA-Chip an, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er zusätzlich mindestens eine Nukleotidsequenz eines Mikroorganismus enthält, der sich von Chlamydia pneumoniae unterscheidet, die auf dem Träger des Chips immobilisiert ist; vorzugsweise wird der andere Mikroorganismus aus einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus, einem Bakterium der Chlamydia-Familie und einer Variante der Art Chlamydia pneumoniae gewählt.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart einen Vektor zum Klonieren und/oder zur Expression einer Sequenz, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er eine Nukleotidsequenz enthält, die ein Polypeptid der zellulären, vorzugsweise äußeren Hülle von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodiert. In einer spezifischen Ausführungsform enthalten die Vektoren eine Nukleotidsequenz, die ein sezerniertes Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodiert oder ein Transportpolypeptid, ein der Oberfläche ausgesetztes Polypeptid, ein Lipoprotein oder eines seiner repräsentativen Fragmente, ein Polypeptid, das an der Biosynthese von Lipopolysaccharid (LPS) beteiligt ist, ein sezerniertes Polypeptid des Typs III und nicht vom Typ III, ein Polypeptid, das RGD-Anlagerungsstellen enthält, ein Polypeptid, das in der Zellwand verankert ist, ein Polypeptid, das nicht in Chlamydia trachomatis gefunden wird, ein ribosomales Polypeptid oder ein Polypeptid, das an der Sekretion, Transkription, Translation, Reifung von Proteinen beteiligt ist, ein Polypeptid, das an der Synthese der Wand beteiligt ist, ein Polypeptid, das an der Virulenz beteiligt ist, ein Polypeptid, das am Intermediärstoffwechsel, insbesondere am Stoffwechsel von Zuckern und/oder Cofaktoren, beteiligt ist, ein Polypeptid, das am Stoffwechsel von Nukleotiden, von Aminosäuren, von Nukleinsäuren oder von Fettsäuren von Chlamydia pneumoniae beteiligt ist oder eines ihrer repräsentativen Fragmente, oder ein für Chlamydia pneumoniae spezifisches Polypeptid kodiert.
  • Diese Vektoren umfassen die Elemente, die notwendig sind, um die Expression und/oder die Sekretion der Nukleotidsequenzen in einer gegebenen Wirtszelle zu ermöglichen. Der Vektor sollte in diesem Fall einen Promotor, Signale zur Initiiation und zur Termination der Translation, sowie passende Regionen für die Regulierung der Transkription umfassen. Er sollte fähig sein, stabil in der Wirtszelle erhalten zu werden und kann gegebenenfalls besondere Signale besitzen, welche die Sekretion des translatieren Proteins spezifizieren. Diese unterschiedlichen Elemente werden gemäß der verwendeten Wirtszelle gewählt. Um dies zu bewirken, können die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen in autonom replizierende Vektoren innerhalb des gewählten Wirts oder in integrative Vektoren im gewählten Wirt eingefügt werden.
  • Jedes Standardverfahren zur Einfügung von DNA-Fragmenten in einen Vektor, das Fachleuten bekannt ist, kann verwendet werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, die ein chimäres Gen, das aus passenden transkriptionellen/translationalen Kontrollsignalen und den Protein kodierenden Sequenzen besteht, enthalten. Diese Verfahren können rekombinante DNA- und synthetische in-vitro-Techniken und in-vivo-Rekombinanten (genetische Rekombination) einschließen.
  • Die Expression eines Polypeptids, Peptids oder Derivats oder eines Analogons davon, das durch eine Polynukleotidsequenz in SEQ ID No. 1 oder ORFs, die in SEQ ID No. 1 enthalten sind, kodiert wird, kann durch eine zweite Nukleinsäuresequenz reguliert werden, sodass das Protein oder Peptid in einem Wirt, der mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist, exprimiert wird. Zum Beispiel kann die Expression eines Proteins oder Peptids durch jedweden auf dem Fachgebiet bekannten Promotor/Enhancer kontrolliert werden. Promotoren, die zum Kontrollieren der Expression verwendet werden können, schließen den CMV-Promotor, die frühe Promotorregion von SV40 (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304–310), den Promotor, der in der langen 3'-terminalen Wiederholung des Rous-Sarcomvirus enthalten ist (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787–797), den Thymidinkinase-Promotor von Herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39–42), prokaryotische Expressionsvektoren, wie zum Beispiel den β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727–3731) oder den tac-Promotor (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21–25), siehe auch „Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242: 74–94, Pflanzenexpressionsvektoren, umfassend die Promotorregion der Nopalinsynthetase (Herrera-Estrella et al., 1983, Nature 303: 209–213) oder den 35S RNA-Promotor aus Blumenkohlmosaikvirus (Gardner, et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 2871) und den Promotor des photosynthetischen Enzyms Ribulosebisphosphat-Carboxylase (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature 310: 115–120); Promotorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen, wie zum Beispiel den Gal 4 Promotor, den ADC (Alkoholdehydrogenase) Promotor, den PGK (Phosphoglycerin-Kinase) Promotor, den Promotor der alkalischen Phosphatase und die folgenden tierischen transkriptionellen Kontrollregionen, die Gewebespezifität aufweisen und bei transgenen Tieren benutzt worden sind: die Kontrollregion des Gens für Elastase I, die in pankreatischen Acinuszellen aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38: 639–646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399–409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425–515); die Kontrollregion des Insulingens, die in pankreatischen Betazellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315: 115–122), die Kontrollregion des Immunoglobulingens, die in Lymphoidzellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647–658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533–538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436–1444), die Kontrollregion des Maus-Brusttumorvirus, die in Hoden-, Brust-, Lymphoid- und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45: 485–495), die Kontroll region des Albumingens, die in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268–276), die Kontrollregion des Gens für alpha1-Fetoprotein, die in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639–1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53–58), die Kontrollregion des Gens für alpha 1-Antitrypsin, die in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161–171), die Kontrollregion des Gens für beta-Globin, die in Knochenmarkszellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338–340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89–94), die Kontrollregion des Gens für Myelin Basic Protein, die in den Oligodendrocytenzellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703–712), die Kontrollregion des Gens 2 für die leichte Myosinkette, die im Skelettmuskel aktiv ist (Sani, 1985, Nature 314: 283–286) und die Kontrollregion des Gens für Gonadotropin-releasing-Hormon, die im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234: 1372–1378) ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Die Vektoren sind zum Beispiel Vektoren von Plasmid- oder Virusursprung. In einer spezifischen Ausführungsform wird ein Vektor verwendet, der einen Promotor umfasst, der funktionell mit einer Nukleinsäuresequenz in SEQ ID No. 1, die ein Protein oder ein Peptid kodiert, oder mit ORFs, die in SEQ ID No. 1 enthalten sind, einem oder mehreren Replikationsursprüngen und wahlweise einem oder mehreren auswählbaren Markern (z. B. einem Antibiotikaresistenzgen) verbunden ist. Expressionsvektoren umfassen regulatorische Sequenzen, welche die Genexpression, einschließlich der Genexpression in einer gewünschten Wirtszelle, kontrollieren. Bevorzugte Vektoren für die Expression der Polypeptide der Erfindung schließen Plasmidvektoren des pET-Typs (Promega) oder pBAD Plasmidvektoren (Invitrogen) ein. Darüber hinaus sind diese Vektoren für das Transformieren von Wirtszellen nützlich, um die Nukleotidsequenzen der Erfindung zu klonieren oder zu exprimieren.
  • Die Expression kann auch unter Verwendung von gezielter homologer Rekombination erreicht werden, um Gene von Chlamydia pneumoniae, die in der klonierten genomischen DNA vorliegen, zu aktivieren. Ein heterologes regulatorischen Element kann, unter Verwendung von Techniken, wie zum Beispiel gezielter homologer Rekombination, die Fachleuten wohlbekannt sind (siehe z. B. Chappel, US-Patent No. 4.215.051 und Skoultchi, WO 91/06667), so in eine stabile Zelllinie oder einen klonierten Mikroorganismus eingefügt werden, dass es mit einem endogenen Gen von Chlamydia pneumoniae, das im klonierten Genom vorliegt, funktionell verbunden ist.
  • Expressionsvektor-/Wirtszellensysteme, die Inserts von Polynukleotidsequenzen in SEQ ID No. 1 oder von ORFs innerhalb der SEQ ID No. 1, die Polypeptide, Peptide oder Derivate oder Analoga davon kodieren, enthalten, können durch drei allgemeine Ansätze identifiziert werden: (a) Nukleinsäurehybridisierung, (b) Anwesenheit oder Abwesenheit von „Marker-Genfunktionen und (c) Expression eingefügter Sequenzen. Im ersten Ansatz kann die Anwesenheit einer Polynukleotidsequenz, die in einen Expressionsvektor eingefügt ist, durch Nukleinsäurehybridisierung unter Verwendung von Sonden, die Sequenzen umfassen, die zu einer eingefügten Polynukleotidsequenzen homolog sind, nachgewiesen werden. Im zweiten Ansatz kann das rekombinante Vektor/Wirtssystem beruhend auf Anwesenheit oder Abwesenheit bestimmter „Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidinkinase-Aktivität, Resistenz gegen Antibiotika, Transformationsphänotyp, Einschlusskörperbildung bei Baculovirus usw.), verursacht durch das Einfügen einer Polynukleotidsequenz in den Vektor, identifiziert und ausgewählt werden. Zum Beispiel können, falls die Polynukleotidsequenz in SEQ ID No. 1 oder ORFs in SEQ ID No. 1 innerhalb der Markergensequenz des Vektors einfügt ist, Rekombinanten, die das Insert enthalten, durch die Abwesenheit der Markergenfunktion identifiziert werden. Im dritten Ansatz können rekombinante Expressionsvektoren durch Analysieren des Produkts der durch den Rekombinanten exprimierten Polynukleotidsequenz identifiziert werden. Derartige Assays können zum Beispiel auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des exprimierten Polypeptids in in-vitro-Assaysystemen, z. B. Binden mit einem Antikörper, Förderung der Zellproliferation, beruhen.
  • Sobald ein bestimmtes rekombinantes DNA-Molekül identifiziert und isoliert ist, können mehrere auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet werden, um es zu vermehren. Die identifizierten Klone können durch Standardverfahren wie zum Beispiel Lipofektion, Elektroporation und Hitzeschock in eine passende Wirtszelle eingeführt werden. Sobald ein geeignetes Wirtssystem und geeignete Wachstumsbedingungen etabliert sind, können rekombinante Expressionsvektoren vermehrt und serienmäßig hergestellt werden.
  • Die Erfindung führt auch die Wirtszellen an, die durch diese Vektoren transformiert sind. Diese Zellen können durch Einführen einer Nukleotidsequenz, die in einen wie vorstehend definierten Vektor eingefügt ist, und dann durch Züchten der Zellen unter Bedingungen, welche die Replikation und/oder die Expression der transfizierten Nukleotidsequenz ermöglichen, erhalten werden.
  • Die Wirtszelle kann aus eukaryotischen oder prokaryotischen Systemen gewählt werden, wie zum Beispiel Bakterienzellen (Olins und Lee, 1993), aber auch Hefezellen (Buckholz, 1993), sowie Tierzellen, insbesondere Kulturen von Säugerzellen (Edwards und Aruffo, 1993) und insbesondere Eierstockzellen vom Chinesischen Hamster (CHO), aber auch Insektenzellen, bei denen zum Beispiel Verfahren unter Verwendung von Baculoviren verwendet werden können (Luckow, 1993).
  • Darüber hinaus kann ein Wirtszellstamm gewählt werden, der die Expression der eingefügten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt auf die spezifische gewünschte Weise modifiziert oder prozessiert. Die Expression von bestimmten Promotoren aus kann in Anwesenheit bestimmter Induktoren erhöht werden; somit kann die Expression des gentechnisch veränderten Polypeptids kontrolliert werden. Darüber hinaus haben unterschiedliche Wirtszellen kennzeichnende und spezifische Mechanismen für das translationale und post-translationale Prozessieren und Modifizieren (z. B. Glycosylierung, Phosphorylierung) von Proteinen. Passende Zelllinien oder Wirtssysteme können gewählt werden, um die gewünschte Modifikation und das Prozessieren des fremden exprimierten Proteins sicherzustellen. Zum Beispiel kann, um ein nicht-glycolysiertes Core-Proteinprodukt herzustellen, Expression in einem Bakteriensystem verwendet werden. Expression in Hefe wird ein glycolysiertes Produkt herstellen. Expression in Säugerzellen kann verwendet werden, um eine „native" Glycosylierung eines heterologen Proteins sicherzustellen. Darüber hinaus können unterschiedliche Vektor-/Wirtsexpressionssysteme Prozessierreaktionen in unterschiedlichen Ausmaßen bewirken.
  • Eine bevorzugte Wirtszelle zur Expression der Proteine besteht aus prokaryotischen Zellen, wie zum Beispiel Gram-negative Bakterien. Eine weitere bevorzugte Wirtszelle ist ein Bakterium, das zur Chlamydia-Familie gehört, stärker bevorzugt gehört es zur Art Chlamydia pneumoniae oder es wird aus einem mit der Art Chlamydia pneumoniae zusammenhängenden Mikroorganismus gewählt.
  • In anderen spezifischen Ausführungsformen können die Polypeptide, Peptide oder Derivate oder Analoga davon als ein Fusions- oder chimäres Proteinprodukt (umfassend das Protein, Fragment, Analogon oder Derivat, das über eine Peptidbindung mit einer heterologen Proteinsequenz (eines anderen Proteins) verbunden ist) exprimiert werden. Ein derartiges chimäres Produkt kann gemacht werden, indem die passenden Nukleinsäuresequenzen, welche die gewünschten Aminosäuresequenzen kodieren, durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren und Exprimieren des chimären Produkts durch Verfahren, die auf dem Fachgebiet üblicherweise bekannt sind, im richtigen Leserahmen aneinander ligiert werden. Alternativ dazu kann ein derartiges chimäres Produkt durch Proteinsynthesetechniken gemacht werden, z. B. durch die Verwendung eines Peptidsynthesegeräts.
  • Genomische Sequenzen können als translationale Genprodukte (d. h. Peptide, Polypeptide und Proteine) oder transkriptionelle Genprodukte (d. h. Antisense und Ribozyme) kloniert und exprimiert werden.
  • Die Erfindung führt ferner die intrazelluläre Herstellung einer Antisense-Nukleinsäuresequenz von SEQ ID No. 1 durch Transkription von einer exogenen Sequenz aus an. Zum Beispiel kann ein Vektor in vivo so eingeführt werden, dass er durch eine Zelle aufgenommen wird, wobei in dieser Zelle der Vektor oder ein Teilstück davon transkribiert wird, wodurch eine Antisense-Nukleinsäure (RNA) der Erfindung hergestellt wird. Ein derartiger Vektor würde eine Sequenz enthalten, die eine Antisense-Nukleinsäure kodiert. Ein derartiger Vektor kann episomal bleiben oder ins Chromosom integriert werden, so lange er transkribiert werden kann, um die gewünschte Antisense-RNA herzustellen. Derartige Vektoren können durch Verfahren der rekombinanten DNA-Technologie, die auf dem Fachgebiet Standard sind, konstruiert werden. Vektoren können Plasmide, Viren und andere auf dem Fachgebiet bekannte sein, die zur Replikation und Expression in Säugerzellen verwendet werden. Eine Expression der Sequenz, die eine Antisense-RNA kodiert, kann durch jeden Promotor erfolgen, von dem auf dem Fachgebiet bekannt ist, dass er in Säuger-, vorzugsweise menschlichen, Zellen wirkt. Derartige Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Derartige Promotoren schließen den CMV-Promotor, die frühe Promotorregion von SV40 (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304–310), den Promotor, der in der langen 3'-terminalen Wiederholung des Rous-Sarcomvirus enthalten ist (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787– 797), den Thymidinkinase-Promotor von Herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothioneingens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39–42), usw. ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • In einer spezifischen Ausführungsform umfasst das Antisense-Oligonukleotid katalytische RNA oder ein Ribozym (siehe z. B. Internationale PCT Offenlegungsschrift WO 90/11364, veröffentlicht am 4. Okt. 1990; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222–1225). In einer anderen Ausführungsform ist das Oligonukleotid ein 2N-O-Methylribonukleotid (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131 – 6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327–330).
  • In einer anderen Ausführungsform umfassen die Antisense-Nukleinsäuren eine Sequenz, die zu mindestens einem Teilstück eines RNA-Transkripts einer Polynukleotidsequenz in SEQ ID No. 1 komplementär ist. Allerdings ist eine völlige Komplementarität, obwohl bevorzugt, nicht erforderlich. Eine Sequenz, die, wie hierin bezeichnet, „zu mindestens einem Teilstück einer RNA komplementär" ist, bedeutet eine Sequenz mit ausreichender Komplementarität, um in der Lage zu sein, mit der RNA zu hybridisieren, wobei sich eine stabiler Duplex bildet; im Fall einer doppelsträngigen Antisense-Nukleinsäuresequenz kann somit ein einzelner Strang der Duplex-DNA getestet werden, oder Triplex-Bildung kann analysiert werden. Die Fähigkeit zu hybridisieren wird von sowohl dem Grad der Komplementarität als auch der Länge der Antisense-Nukleinsäure abhängen. Im Allgemeinen können, je länger die hybridisierende Nukleinsäure ist, desto mehr Basen-Fehlpaarungen mit einer aus SEQ ID No. 1 transkribierten RNA enthalten sein und es wird sich noch ein stabiler Duplex (oder Triplex, wie es der Fall sein kann) bilden. Ein Fachmann kann einen tolerierbaren Grad der Fehlpaarung durch die Verwendung von Standardverfahren zum Bestimmen des Schmelzpunktes des hybridisierten Komplexes festlegen.
  • Die Erfindung führt auch Tiere, mit Ausnahme von Menschen, an, die eine der vorstehend beschriebenen Zellen umfassen.
  • Die Herstellung von transgenen Tieren, die eines oder mehrere der Gene von Chlamydia pneumoniae überexprimieren, wird vorzugsweise an Ratten, Mäusen oder Kaninchen gemäß Fachleuten wohlbekannten Verfahren, wie zum Beispiel virale oder nichtvirale Transfektionen, ausgeführt. Die transgenen Tiere, die eines oder mehrere der Gene überexprimieren, können durch Transfektion mehrerer Kopien der Gene unter der Kontrolle eines starken Promotors von ubiquitärer Beschaffenheit, oder eines, der selektiv für eine Gewebeart ist, erhalten werden. Die transgenen Tiere können auch durch homologe Rekombination an embryonalen Stammzellen, Übertragen dieser Stammzellen auf Embryonen, Auswahl der Chimären, die auf der Ebene der reproduzierenden Linien betroffen sind, und Wachstum der Chimären erhalten werden.
  • Die transformierten Zellen sowie die transgenen Tiere können bei Verfahren zum Herstellen des rekombinanten Polypeptids verwendet werden.
  • Nun ist es möglich, rekombinante Polypeptide durch gentechnisches Verändern unter Verwendung der mit Expressionsvektoren transformierten Zellen oder unter Verwendung transgener Mäuse in einer relativ großen Menge herzustellen.
  • Es werden auch Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids in rekombinanter Form, wie vorstehend definert, offenbart, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie einen Vektor und/oder eine mit einem Vektor transformierte Zelle und/oder ein transgenes Tier, umfassend eine der transformierten Zellen, verwenden.
  • Unter den Verfahren zum Herstellen eines derartigen Polypeptids in rekombinanter Form werden die Herstellungsverfahren, die einen Vektor und/oder eine mit dem Vektor transformierte Zelle und/oder ein transgenes Tier verwenden, umfassend eine der transformierten Zellen, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die ein Polypeptid der Zellhülle von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner Fragmente kodiert, bevorzugt.
  • Unter den Verfahren zum Herstellen eines derartigen Polypeptids in rekombinanter Form werden die Herstellungsverfahren, die einen Vektor und/oder eine mit dem Vektor transformierte Zelle und/oder ein transgenes Tier verwenden, umfassend eine der transformierten Zellen, die eine Nukleotidsequenz enthalten, die ein sezerniertes Polypeptid von Chlamydia pneumoniae oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodiert oder die ein Transportpolypeptid, ein der Oberfläche ausgesetztes Polypeptid, ein Lipo protein oder eines seiner repräsentativen Fragmente, ein Polypeptid, das an der Biosynthese von Lipopolysaccharid (LPS) beteiligt ist, ein sezerniertes Polypeptid vom Typ III und eines anderen Typs, ein Polypeptid, das RGD-Anlagerungsstellen enthält, ein Polypeptid, das in der Zellwand verankert ist, ein Polypeptid, das nicht in Chlamydia trachomatis gefunden wird, ein ribosomales Polypeptid oder ein Polypeptid, das an der Sekretion, Transkription, Translation, Reifung von Proteinen beteiligt ist, ein Polypeptid, das an der Synthese der Wand beteiligt ist, ein Polypeptid, das an der Virulenz beteiligt ist, ein Polypeptid, das am Intermediärstoffwechsel, insbesondere am Stoffwechsel von Zuckern und/oder Cofaktoren, beteiligt ist, ein Polypeptid, das am Stoffwechsel von Nukleotiden, von Aminosäuren, von Nukleinsäuren oder von Fettsäuren von Chlamydia pneumoniae beteiligt ist oder eines ihrer repräsentativen Fragmente, oder ein für Chlamydia pneumoniae spezifisches Polypeptid kodiert, auch bevorzugt.
  • Das wie vorstehend angegeben erhaltene rekombinante Polypeptid kann entweder in glycosylierter oder nicht glycosylierter Form bereitgestellt werden und kann die natürliche Tertiärstruktur aufweisen oder nicht.
  • Eine bevorzugte Variante besteht aus dem Herstellen eines rekombinanten Polypeptids, das an ein „Träger"-Protein fusioniert ist (chimäres Protein). Der Vorteil dieses Systems ist, dass es eine Stabilisierung und eine Verringerung der Proteolyse des rekombinanten Produkts, eine Erhöhung der Löslichkeit während der Renaturierung in vitro und/oder, wenn der Fusionspartner eine Affinität für einen spezifischen Liganden hat, eine Vereinfachung der Reinigung ermöglicht.
  • Genauer gesagt wird ein Verfahren zum Erzeugen eines Polypeptids der Erfindung offenbart, umfassend die folgenden Schritte:
    • (a) Züchten der transformierten Zellen unter Bedingungen, welche die Expression eines rekombinanten Polypeptids mit einer wie vorstehend definierten Nukleinsäuresequenz ermöglichen;
    • (b) gegebenenfalls Gewinnung des rekombinanten Polypeptids.
  • Wenn das Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids ein transgenes Tier verwendet, wird das rekombinante Polypeptid dann aus dem Tier extrahiert.
  • Es wird auch ein Verfahren zum Herstellen eines synthetischen Polypeptids unter Verwendung einer Aminosäuresequenz eines derartigen Polypeptids angeführt. Polypeptide, wie vorstehend definiert, können auch durch auf dem Gebiet der Peptidsynthese übliche Techniken unter Bedingungen hergestellt werden, die für das Herstellen der Polypeptide, die durch das Polynukleotid der Erfindung kodiert sind, geeignet sind. Diese Synthese kann in einer homogenen Lösung oder auf einer festen Phase ausgeführt werden und daraus gewonnen werden.
  • Zum Beispiel kann die von Houbenweyl im Jahr 1974 beschriebene Synthesetechnik in einer homogenen Lösung verwendet werden.
  • Dieses Syntheseverfahren besteht aus aufeinander folgendem paarweisem Kondensieren der aufeinander folgenden Aminosäuren in der erforderlichen Reihenfolge oder aus dem Kondensieren von Aminosäuren und Fragmenten, die zuvor gebildet wurden und schon einige Aminosäuren in der passenden Reihenfolge enthalten, oder alternativ dazu von einigen so zuvor erzeugten Fragmenten, wobei es selbstverständlich ist, dass Vorsicht geboten ist, um im Voraus alle reaktiven funktionellen Gruppen zu schützen, die durch diese Aminosäuren oder Fragmente getragen werden, mit Ausnahme der funktionellen Amingruppen des einen und der funktionellen Carboxylgruppen der anderen oder umgekehrt, welche normalerweise an der Bildung der Peptidbindungen teilnehmen sollten, insbesondere nach Aktivierung der funktionellen Carboxylgruppe gemäß den wohlbekannten Verfahren bei der Peptidsynthese.
  • Gemäß einer anderen bevorzugten Technik der Erfindung wird die von Merrifield beschriebene verwendet.
  • Um eine Peptidkette gemäß dem Merrifield-Verfahren herzustellen, wird ein hochporöses Harz verwendet, auf welchem die erste C-terminale Aminosäure der Kette befestigt wird. Diese Aminosäure wird über seine Carboxylgruppe an einem Harz befestigt und seine funktionelle Amingruppe ist geschützt. Die Aminosäuren, welche die Peptidkette ausmachen, werden somit eine nach der anderen auf der jedes Mal vorher entschützte Amingruppe des Teilstücks des Peptids, das schon gebildet wurde, und das am Harz befestigt ist, befestigt werden. Wenn die gesamte gewünschte Peptidkette gebildet ist, werden die Schutzgruppen von den verschiedenen Aminosäuren, welche die Peptidkette ausmachen, entfernt, und das Peptid wird mit Hilfe einer Säure vom Harz abgelöst.
  • Die Erfindung führt zusätzlich Hybrid- (Fusions-) Polypeptide mit mindestens einem Polypeptid oder einem seiner repräsentativen Fragmente, wie vorstehend definiert, und einer Sequenz eines Polypeptids, das fähig ist, eine Immunantwort bei Menschen oder Tieren auszulösen, an.
  • Vorteilhafterweise ist die antigene Determinante so, dass sie fähig ist, eine humorale und/oder zelluläre Antwort auszulösen. Eine antigene Determinante kann durch Durchmustern von Expressionsbanken des Genoms von Chlamydia pneumoniae mit Antikörpern, die im Serum von mit einem Bakterium, das zur Art Chlamydia pneumoniae gehört, infizierten Patienten enthalten sind, identifiziert werden. Eine antigene Determinante kann ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder eines seiner repräsentativen Fragmente in glycosylierter Form umfassen, das verwendet wird, um immunogene Zusammensetzungen zu erhalten, die fähig sind, die Synthese von Antikörpern, die gegen mehrere Epitope gerichtet sind, zu induzieren.
  • Diese Hybridmoleküle können erfindungsgemäß teilweise aus einem Trägermolekül für Polypeptide oder für ihre repräsentativen Fragmente bestehen, kombiniert mit einem Teilstück, das immunogen sein kann, insbesondere einem Epitop des Diphtherietoxins, des Tetanustoxins, eines Oberflächenantigens von Hepatitis B Virus (Patent FR 79 21811 ), des Antigens von Poliomyelitisvirus VP1 oder jedwedes anderen Virus- oder Bakterientoxins oder -antigens.
  • Die Verfahren zum Synthetisieren der Hybridmoleküle schließen die Verfahren ein, die in der Gentechnik verwendet werden, um Hybridnukleotidsequenzen, welche die gewünschten Polypeptidsequenzen kodieren, zu konstruieren. Vorteilhafterweise kann eine Bezugnahme auf zum Beispiel die von Minton im Jahr 1984 beschriebene Technik zum Herstellen von Genen, die Fusionsproteine kodieren, gemacht werden.
  • Die Polypeptide, die nachstehend beschriebenen Antikörper und die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen können vorteilhafterweise bei in-vitro- und/oder in-vivo-Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Bakterien, die zur Art Chlamydia pneumoniae gehören, in einer biologischen Probe (biologisches Gewebe oder biologische Flüssigkeit), die sie wahrscheinlich enthalten, verwendet werden. Diese Verfahren können insbesondere, abhängig von der Spezifität der Polypeptide, der Antikörper und der Nukleotidsequenzen, die verwendet werden, die Bakterienvarianten nachweisen und/oder identifizieren, die zur Art Chlamydia pneumoniae gehören, sowie die damit zusammenhängenden Mikroorganismen, die fähig sind, durch die Polypeptide, die Antikörper und die Nukleotidsequenzen, die gewählt werden, nachgewiesen zu werden. Es kann zum Beispiel vorteilhaft sein, ein Polypeptid, einen Antikörper oder eine Nukleotidsequenz zu wählen, das/der/die fähig ist, jedwedes Bakterium der Familie Chlamydia durch Wählen eines Polypeptids, eines Antikörpers und/oder einer Nukleotidsequenz, die für die Familie spezifisch ist, nachzuweisen oder es wird im Gegenteil ganz besonders vorteilhaft sein, auf eine Variante der Art Chlamydia pneumoniae, die zum Beispiel für die Induktion oder die Verschlechterung von Pathologien, die spezifisch für die gezielte Variante sind, durch Wählen eines Polypeptids, eines Antikörpers und/oder einer Nukleotidsäuresequenz, die für die Variante spezifisch ist, abzuzielen.
  • Die wie vorstehend definierten Polypeptide können vorteilhafterweise bei einem Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Bakterien, die zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus gehören, in einer biologischen Probe (biologisches Gewebe oder biologische Flüssigkeit), die sie wahrscheinlich enthalten, verwendet werden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) In-Kontakt-Bringen dieser biologischen Probe mit einem derartigen Polypeptid oder einem seiner repräsentativen Fragmente (unter Bedingungen, die eine immunologische Reaktion zwischen dem Polypeptid und den Antikörpern, die in der biologischen Probe vorliegen können, ermöglichen;
    • (b) Nachweisen der Antigen-Antikörper-Komplexe, die sich bilden können. Vorzugsweise besteht die biologische Probe aus einer Flüssigkeit, zum Beispiel aus menschlichem oder tierischem Serum, Blut oder menschlichen oder tierischen Biopsien.
  • Jedwedes übliche Verfahren kann verwendet werden, um einen derartigen Nachweis der Antigen-Antikörper-Komplexe, die sich bilden können, auszuführen.
  • Als Beispiel verwendet ein bevorzugtes Verfahren immunenzymatische Verfah ren, die auf der ELISA Technik, auf Immunfluoreszenzverfahren oder radioimmunologischen Verfahren (RIA) und dergleichen beruhen.
  • Demgemäss führt die Erfindung auch Polypeptide, wie vorstehend definiert, an, die mit Hilfe einer geeigneten Markierung, wie zum Beispiel einer Markierung des enzymatischen, fluoreszierenden oder radioaktiven Typs, markiert wurden.
  • Derartige Verfahren umfassen zum Beispiel die folgenden Schritte:
    • – Deponierung definierter Mengen einer derartigen Polypeptidzusammensetzung in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte,
    • – Einführung von ansteigenden Verdünnungen von Serum oder einer anderen wie vorstehend definierten biologischen Probe, die analysiert werden muss, in die Vertiefungen,
    • – Inkubation der Mikroplatte,
    • – Einführung von markierten Antikörpern, die gegen menschliche oder tierische Immunglobuline gerichtet sind, in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte, wobei diese Antikörper mit Hilfe eines Enzyms makiert worden sind, das aus jenen ausgewählt ist, die zum Hydrolysieren eines Substrats fähig sind, wobei dabei die Absorption der Strahlung des Letzteren mindestens bei einer definierten Wellenlänge, zum Beispiel bei 550 nm, modifiziert wird,
    • – Nachweis der Menge an hydrolysiertem Substrat durch Vergleich mit einer Kontrolle.
  • Die Erfindung offenbart auch einen Kit oder ein Set zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Bakterien, die zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus gehören, der/das dadurch gekennzeichnet ist, dass er/es die folgenden Komponenten umfasst:
    • – ein Polypeptid, wie vorstehend definiert,
    • – gegebenenfalls die Reagenzien zum Aufbauen des für die immunologische oder spezifische Reaktion passenden Mediums,
    • – die Reagenzien, welche den Nachweis des durch die immunologische Reaktion zwischen den Polypeptid(en) der Erfindung und den Antikörpern, die in der biologischen Probe vorliegen können, hergestellten Antigen-Antikörper-Kompexes ermöglichen, wobei es möglich ist, dass diese Reagenzien auch eine Markierung tragen oder fähig sind, wiederum durch ein markiertes Reagens erkannt zu werden, genauer gesagt in dem Fall, dass das erfindungsgemäße Polypeptid nicht markiert ist,
    • – gegebenenfalls eine biologische Referenzprobe (negative Kontrolle), frei von Antikörpern, die von erfindungsgemäßen Antikörpern erkannt werden,
    • – gegebenenfalls eine biologische Referenzprobe (positive Kontrolle), die eine vorherbestimmte Menge an von einem erfindungsgemäßen Polypeptid erkannten Antikörper enthält.
  • Die Polypeptide, Peptide, Fusionsproteine oder anderen Derivate oder Analoga davon, die durch eine Polynukleotidsequenz in SEQ ID No. 1 kodiert sind, können als Immunogen zum Erzeugen von Antikörpern, die immunspezifisch ein derartiges Immunogen binden, verwendet werden. Derartige Antikörper können polyklonale und monoklonale Antikörper, humanisierte oder chimäre Antikörper, einkettige Antikörper, Fab-Fragmente, F(ab')2-Fragmente, durch eine Fab-Expressionsbank hergestellte Fragmente, anti-Idiotyp- (anti-Id) Antikörper und an ein Epitop bindende Fragmente von jedem der vorstehenden einschließen, sind aber nicht darauf beschränkt. In einer spezifischen Ausführungsform ist der Antikörper gegen ein Polypeptid, Peptid oder anderes Derivat oder Analogon davon, das durch eine Polynukleotidsequenz in SEQ ID No. 1 kodiert ist, ein bispezifischer Antikörper (siehe allgemein z. B. Fanger und Drakeman, 1995, Drug News and Perspectives 8: 133–137). Ein derartiger bispezifischer Antikörper wird gentechnisch verändert, um sowohl (1) ein Epitop als auch (2) eines von einer Vielzahl von „Trigger"-Molekülen zu erkennen, z. B. Fc-Rezeptoren auf Myeloidzellen und CD3 und CD2 auf T-Zellen, die als fähig identifiziert wurden, eine cytotoxische T-Zelle dazu zu veranlassen, ein bestimmtes Ziel zu zerstören. Derartige bispezifische Antikörper können entweder durch chemische Konjugation, Hybridom- oder rekombinante molekularbiologische Techniken, die Fachleuten bekannt sind, hergestellt werden.
  • Verechiedene auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können für die Herstellung polyklonaler Antikörper gegen ein Polypeptid, Peptid oder anderes Derivat oder Analogon davon, die durch eine Polynukleotidsequenz in SEQ ID No. 1 kodiert sind, verwendet werden. Für die Herstellung eines Antikörpers können verschiedene Wirtstiere durch Injektion eines Polypeptids, Peptids oder anderen Derivats oder Analogons davon, immunisiert werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Kaninchen, Mäuse, Ratten usw. Verschiedene Hilfsstoffe können, abhängig von der Wirtsart, verwendet werden, um die immunologische Antwort zu erhöhen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf STIMULONTM QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA), MPLTM (3-O-deacyliertes Monophosphoryllipid A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), Aluminiumphosphat, IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA), Freund's (vollständiges und unvollständiges), Mineralgele, wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie zum Beispiel Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Keyhole-Limpet-Hämocyanine, Dinitrophenol, BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum. Alternativ dazu können polyklonale Antikörper durch Reinigen auf einer Affinitätssäule, auf die ein Polypeptid, wie vorstehend definiert, zuvor angelagert worden ist, hergestellt werden, wobei die Antikörper, die im Serum von Patienten enthalten sind, mit einem Bakterium, das zur Art Chlamydia pneumoniae gehört, infiziert sind.
  • Zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die gegen ein Polypeptid, Peptid oder anderes Derivat oder Analogon gerichtet sind, kann jedwede Technik, die die Herstellung von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur gewährleistet, verwendet werden. Zum Beispiel die Hybridomtechnik, die ursprünglich von Kohler und Milstein (1975, Nature 256: 495–497) entwickelt wurde, sowie die Triom-Technik, die menschliche B-Zell-Hybridomtechnik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72) und die EBV-Hybridomtechnik, um menschliche monoklonale Antikörper herzustellen (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antikörper and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96). In einer zusätzlichen Ausführungsform können monoklonale Antikörper in keimfreien Tieren unter Benutzung einer in PCT/US90/02545 beschriebenen Technik hergestellt werden.
  • In einer anderen Ausführungsform können transgene nicht-menschliche Tiere unter Benutzung einer in WO 98/24893 und WO 96/33735 beschriebenen Technik für die Herstellung von menschlichen Antikörpern verwendet werden. Menschliche Antikörper können unter Verwendung von menschlichen Hybridomen (Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 2026–2030) oder durch Transformieren menschlicher B-Zellen mit dem EBV-Virus in vitro (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, S. 77–96) verwendet werden und erhalten werden. In der Tat können Techniken verwendet werden, die zur Herstellung von „chimären Antikörpern" (Morrison et al., 1984, PROC. NATL. ACAD. SCI. U.S.A. 81: 6851–6855; Neuberger et al., 1984, Nature 312: 604–608; Takeda et al., 1985, Nature 314: 452–454) durch Spleißen der Gene von einem Antikörper aus Maus, der für ein Polypeptid, Peptid oder anderes Derivat oder Analogon spezifisch ist, zusammen mit Genen von einem menschlichen Antikörpermolekül der passenden biologischen Aktivität entwickelt wurden. Techniken, die für die Herstellung von einkettigen Antikörpern (US-Patent No. 4.946,778) beschrieben wurden, können angepasst werden, um Polypeptid- oder Peptidspezifische einkettige Antikörper herzustellen. Eine zusätzliche Ausführungsform benutzt die für die Konstruktion von Fab-Expressionsbanken beschriebenen Techniken (Huse et al., 1989, Science 246: 1275–1281), um eine schnelle und leichte Identifikation monoklonaler Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität für Polypeptide, Derivate oder Analoga zu ermöglichen.
  • Antikörperfragmente, die den Idiotyp des Moleküls enthalten, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Zum Beispiel schließen derartige Fragmente das F(ab')2-Fragment, welches durch Verdauen des Antikörpermoleküls mit Pepsin hergestellt werden kann, die Fab'-Fragmente, die durch Reduzieren der Disulfidbrücken des F(ab')2-Fragments erzeugt werden können, die Fab-Fragmente, die durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können und die Fv-Fragmente ein, sind aber nicht beschränkt darauf.
  • Zusätzlich sind Techniken für die Herstellung von chimärisierten (siehe z. B. Boss, M. et al., US-Patent No. 4.816.397; und Cabilly, S. et al., US-Patent No. 5.585.089) humanisierten Antikörper (siehe z. B. Queen, US-Patent No. 5.585,089) entwickelt worden. Eine variable Region der leichten oder schweren Kette eines Immunglobulins besteht aus einer „Gerüst"-Region, die durch drei hypervariable Regionen unterbrochen ist, die als Komplementaritäts-bestimmende Regionen (CDRs) bezeichnet werden. Das Ausmaß der Gerüstregion und der CDRs ist exakt definiert worden (siehe „Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E. et al., U.S. Department of Health und Human Services (1983)). Kurz gesagt sind humanisierte Antikörper Antikörpermoleküle aus einer nicht menschlichen Art mit einer oder mehreren CDRs aus der nicht menschlichen Art und einem Gerüst aus einem menschlichen Immunglobulinmolekül.
  • Die Antikörper können auch auf die gleiche Weise, wie vorstehend für die Nukleinsonden beschrieben, markiert werden, wie zum Beispiel mit einer Markierung des enzymatischen, fluoreszierenden oder radioaktiven Typs.
  • Die Erfindung offenbart zusätzlich ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Bakterien in einer biologischen Probe, die zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus gehören, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) In-Kontakt-Bringen der biologischen Probe (biologisches Gewebe oder biologische Flüssigkeit) mit einem mono- oder polyklonalen Antikörper, wie vorstehend definiert, (unter Bedingungen, die eine immunologische Reaktion zwischen den Antikörpern und den Polypeptiden des Bakteriums, das zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismen gehört, die in der biologischen Probe vorliegen können, ermöglichen, das heißt unter Bedingungen, die für die Bildung von Immunkomplexen geeignet sind);
    • (b) Nachweisen des Antigen-Antikörper-Kompexes, der gebildet werden kann.
  • Die Erfindung offenbart auch einen Kit oder ein Set zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Bakterien, die zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus gehören, der/das dadurch gekennzeichnet ist, dass er/es die folgenden Komponenten umfasst:
    • – einen polyklonalen oder monoklonalen Antikörper, wie vorstehend definiert, der gegebenenfalls markiert ist;
    • – gegebenenfalls ein Reagens zum Aufbauen des passenden Mediums zum Ausführen der immunologischen Reaktion;
    • – ein Reagens, das den Nachweis des durch die immunologische Reaktion hergestellten Antigen-Antikörper-Kompexes ermöglicht, wobei es möglich ist, dass dieses Reagens auch eine Markierung trägt oder wiederum durch ein markiertes Reagens erkannt wird, ganz besonders in dem Fall, dass der monoklonale oder polyklonale Antikörper nicht markiert ist;
    • – gegebenenfalls Reagenzien zum Ausführen der Lyse der Zellen in der getesteten Probe.
  • Das Prinzip des DNA-Chips, das vorstehend erklärt wurde, kann auch verwendet werden, um Protein-„Chips" herzustellen, auf denen der Träger anstelle der DNA mit einem Polypeptid oder einem Antikörper oder Arrays davon beschichtet ist. Diese Protein-„Chips" machen es zum Beispiel möglich, die biomolekularen Wechselwirkungen (BIA), die durch das Affinitätseinfangen von Zielanalyten auf einem mit zum Beispiel Proteinen beschichteten Träger induziert wurden, durch Oberflächenplasmaresonanz (SPR) zu analysieren. Eine Bezugnahme kann zum Beispiel auf die Techniken zum Kuppeln von Proteinen auf einen festen Träger, die in EP 524 800 beschrieben werden, oder auf die Verfahren, welche die Verwendung von Protein-Chips vom Biosensor-Typ wie zum Beispiel die Technik des BIAcore-Typs (Pharmacia) (Arlinghaus et al., 1997, Krone et al., 1997, Chatelier et al., 1995) beschreiben, gemacht werden. Diese Polypeptide oder Antikörper, die fähig sind, Antikörper oder Polypeptide spezifisch zu binden, die von der zu analysierenden Probe abgeleitet sind, können somit bei Protein-Chips zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Proteinen in Proben verwendet werden. Die Protein-Chips können insbesondere für die Diagnose einer Infektion verwendet werden und können vorzugsweise pro Chip mehrere Polypeptide und/oder Antikörper der Erfindung mit unterschiedlicher Spezifität und/oder Polypeptide und/oder Antikörper enthalten, die zum Erkennen von Mikroorganismen, die sich von Chlamydia pneumoniae unterscheiden, fähig sind.
  • Die Erfindung führt zusätzlich einen Protein-Chip, wie vorstehend definiert, an, der zusätzlich, auf dem Träger des Chips immobilisiert, mindestens ein Polypeptid eines sich von Chlamydia pneumoniae unterscheidenden Mikroorganismus oder mindestens einen Antikörper, der gegen eine Verbindung eines sich von Chlamydia pneumoniae unterscheidenden Mikroorganismus gerichtet ist, enthält.
  • Die Erfindung führt zusätzlich einen Kit oder ein Set zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Bakterien, die zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus gehören an, der/das einen Protein-Chip, wie vorstehend definiert, enthält.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart auch ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Bakterien in einer biologischen Probe, die zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus gehören, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Nukleotidsequenz, wie vorstehend definiert, verwendet.
  • Ganz besonders offenbart die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Bakterien, die zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus gehören, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) gegebenenfalls Isolierung der DNA aus der zu analysierenden biologischen Probe oder wahlweise Herstellung einer cDNA aus der RNA in der biologischen Probe;
    • (b) spezifische Amplifikation der DNA von Bakterien, die zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus gehören, mit Hilfe von mindestens einem Primer, wie vorstehend definiert;
    • (c) Nachweis der Amplifikationsprodukte.
  • Diese können zum Beispiel durch die molekulare Hybridisierungstechnik unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsonde nachgewiesen werden. Diese Sonde wird vorteilhafterweise mit einem nicht radioaktiven (kalte Sonde) oder mit einem radioaktiven Element markiert werden.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung versteht man unter „DNA in der biologischen Probe" oder „DNA, die in der biologischen Probe enthalten ist", dass dies entweder die in der betrachteten biologischen Probe vorliegende DNA oder wahlweise die cDNA, die nach der Wirkung eines Enzyms vom Typ der Reversen Transkriptase auf die in der biologischen Probe vorliegende RNA erhalten wird, bedeutet.
  • Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung besteht aus einem derartigen Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) In-Kontakt-Bringen einer Nukleotidsonde, wie vorstehend definiert, mit einer biologischen Probe, wobei die in der biologischen Probe enthaltene DNA gegebenenfalls zuvor der Hybridisierung zugänglich gemacht worden ist, unter Bedingungen, welche die Hybridisierung der Sonde an die komplementären Basenpaare der DNA eines Bakteriums, das zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus gehört, ermöglicht;
    • (b) Nachweisen des Hybridisierungskomplexes, der zwischen der Nukleotidsonde und der DNA in der biologischen Probe gebildet wird.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart auch ein derartiges Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:
    • (a) In-Kontakt-Bringen einer auf einem Träger immobilisierten Nukleotidsonde, wie vorstehend definiert, mit einer biologischen Probe, wobei die DNA in der Probe gegebenenfalls zuvor der Hybridisierung zugänglich gemacht worden ist, unter Bedingungen, welche die Hybridisierung der Sonde an die DNA eines Bakteriums, das zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus gehört, ermöglichen;
    • (b) In-Kontakt-Bringen des gebildeten Hybrids zwischen der auf einem Träger immobilisierten Nukleotidsonde und der DNA, die in der biologischen Probe enthalten ist, gegebenenfalls nach Entfernung der DNA in der biologischen Probe, die nicht mit der Sonde hybridisiert hat, mit einer erfindungsgemäßen markierten Nukleotidsonde;
    • (c) Nachweis des neuen in Schritt b) gebildeten Hybrids.
  • Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens zum Nachweis und/oder zur Identifikation, wie vorstehend definiert, ist es dadurch gekennzeichnet, dass die DNA in der biologischen Probe vor dem Schritt a) mit einem Primer verlängert wird und/oder vorher mit Hilfe von mindestens einem erfindungsgemäßen Primer amplifiziert wird.
  • Die Erfindung offenbart zusätzlich einen Kit oder ein Set zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Bakterien, die zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus gehören, der/das dadurch gekennzeichnet ist, dass er/es die folgenden Komponenten umfasst:
    • a) eine Nukleotidsonde, wie vorstehend definiert;
    • b) gegebenenfalls die Reagenzien, die zum Ausführen einer Hybridisierungsreaktion notwendig sind;
    • c) gegebenenfalls mindestens einen erfindungsgemäßen Primer, sowie die für eine DNA-Amplifikationsreaktion notwendigen Reagenzien (z. B. Polymerase und/oder Desoxynukleotidtriphosphate).
  • Die Erfindung offenbart auch einen Kit oder ein Set zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Bakterien, die zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus gehören, der/das dadurch gekennzeichnet ist, dass er/es die folgenden Komponenten umfasst:
    • a) eine Nukleotidsonde, wie vorstehend definiert, die Einfangsonde genannt wird;
    • b) eine erfindungsgemäße Oligonukleotidsonde, die Nachweissonde genannt wird;
    • c) gegebenenfalls mindestens einen erfindungsgemäßen Primer, sowie die für eine DNA-Amplifikationsreaktion notwendigen Reagenzien (z. B. Polymerase und/oder Desoxynukleotidtriphosphate).
  • Die Erfindung offenbart zusätzlich einen Kit oder ein Set zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Bakterien, die zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus gehören, der/das dadurch gekennzeichnet ist, dass er/es die folgenden Komponenten umfasst:
    • a) mindestens einen Primer, wie vorstehend definiert;
    • b) gegebenenfalls die Reagenzien, die zum Ausführen einer DNA-Amplifikationsreaktion notwendig sind;
    • c) gegebenenfalls eine Komponente, die es möglich macht, die Sequenz des amplifizierten Fragments zu überprüfen, ganz besonders eine erfindungsgemäße Oligonukleotidsonde.
  • Die Erfindung offenbart zusätzlich einen Kit oder ein Set zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Bakterien, die zur Art Chlamydia pneumoniae oder zu einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus gehören, oder zum Nachweis und/oder zur Identifikation eines Mikroorganismus, der/das dadurch gekennzeichnet ist, dass er/es einen DNA-Chip, wie vorstehend definiert, umfasst.
  • Die Erfindung offenbart auch ein Verfahren oder einen Kit oder ein Set zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Bakterien, die zur Art Chlamydia pneumoniae gehören, das (der) dadurch gekennzeichnet ist, dass der oder die Primer und/oder die Sonde aus den für die Art Chlamydia pneumoniae spezifischen Nukleotidsequenzen gewählt werden, dass die Polypeptide aus den für die Art Chlamydia pneumoniae spezifischen Polypeptiden gewählt werden und dass die Antikörper aus den Antikörpern gewählt werden, die gegen die Polypeptide gerichtet sind, die aus den für die Art Chlamydia pneumoniae spezifischen Polypeptiden gewählt werden.
  • Vorzugsweise ist das vorstehende Verfahren oder der vorstehende Kit oder das vorstehende Set zum Nachweis und/oder zur Identifikation von Bakterien, die zur Art Chlamydia pneumoniae gehören, dadurch gekennzeichnet, dass der oder die Primer und/oder die Sonde oder die Polypeptide aus den Nukleotidsequenzen oder Polypeptiden gewählt werden, die als spezifisch für die Art Chlamydia pneumoniae identifiziert worden sind, und dass die Antikörper aus den Antikörpern gewählt werden, die gegen die Polypeptide gerichtet sind, die aus den Polypeptiden gewählt werden, die als für die Art Chlamydia pneumoniae spezifisch identifiziert worden sind.
  • Die Erfindung führt zusätzlich ein derartiges Verfahren oder einen Kit oder ein Set zur Diagnose von Veranlagungen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen oder von einem Zustand, der durch Herz-Kreislauf-Erkrankungen verursacht wird, die vorzugsweise mit der Anwesenheit eines Atheroms verbunden sind, die durch eine Infektion mit Chlamydia pneumoniae induziert oder verschlechtert werden, an.
  • Die Erfindung führt auch ein Verfahren oder einen Kit oder ein Set zur Diagnose von Veranlagungen für Erkrankungen der Atemwege oder von Zuständen, die durch Erkrankungen der Atemwege verursacht werden, die durch eine Infektion mit Chlamydia pneumoniae induziert werden oder verschlechtert werden; vorzugsweise ist die Erkrankung der Atemwege Asthma.
  • Gemäß einem anderen Aspekt führt die Erfindung die Verwendung von derartigen Polypeptiden, von mit einem Vektor transformierten Zellen und/oder von transformierten Tieren, wie vorstehend defninert, für die Biosynthese oder den Bioabbau organischer oder anorganischer Verbindungen an.
  • Wie zuvor erwähnt worden ist, wurden die Nukleotidsequenzen durch Homologie mit Sequenzen identifiziert, von denen bekannt ist, dass sie zum Beispiel Polypeptide oder Fragmente enzymatischer Polypeptide kodieren, die an der Biosynthese oder dem Bioabbau organischer oder anorganischer Moleküle beteiligt sind.
  • Es ist somit möglich, die Polypeptide auf ähnliche Weise für die Biosynthese oder den Bioabbau organischer oder anorganischer Verbindungen von industriellem oder therapeutischem Interesse (Verbindungen von Interesse genannt) zu verwenden.
  • Unter diesen Polypeptiden können insbesondere die Enzyme erwähnt werden, die am Stoffwechsel beteiligt sind, wie zum Beispiel die proteolytischen Enzyme, die Aminotransferasen, der Glucosestoffwechsel oder die Enzyme, die bei der Biosynthese von Zuckern, Aminosäuren, Fettsäuren, Polypeptiden, Nukleotiden, Nukleinsäuren oder jedweder anderen organischen oder anorganischen Verbindung, oder beim Bioabbau organischer oder anorganischer Verbindungen verwendet werden können.
  • Unter diesen Polypeptiden können zusätzlich die mutierten oder modifizierten Enzyme erwähnt werden, die mutierten oder modifizierten Polypeptiden entsprechen, die auch für die Biosynthese oder den Bioabbau organischer oder anorganischer Verbin dungen auf industriellem Niveau verwendet werden können, wie zum Beispiel für die Herstellung von Verbindungen von Interesse, für das auf die Nahrungsmittelindustrie, die papiererzeugende Industrie oder die chemischen oder pharmazeutischen Industrien angewandte Wiederaufarbeiten von Herstellungsüberresten.
  • Die Erfindung führt zusätzlich die Verwendung einer Nukleotidsequenz, eines Polypeptids, eines Antikörpers, einer Zelle und/oder eines transformierten Tieres, wie vorstehend definiert, zur Auswahl einer organischen oder anorganischen Verbindung an, die zum Modulieren, Regulieren, Induzieren oder Inhibieren der Expression von Genen und/oder zum Modifizieren der zellulären Replikation eukaryotischer oder prokaryotischer Zellen fähig ist, oder zum Induzieren, Inhibieren oder Verschlechtern der Pathologien, die mit einer Infektion durch Chlamydia pneumoniae oder eines der damit zusammenhängenden Mikroorganismen verbunden ist, fähig ist.
  • Die Erfindung umfasst auch Durchmusterungs-Assays, die Verfahren zum Auswählen von Verbindungen, die fähig sind, an eine Nukleotidsequenz der Erfindung zu binden, umfassen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie die folgenden Schritte umfassen:
    • a) In-Kontakt-Bringen der Verbindung mit der Nukleotidsequenz;
    • b) Bestimmen der Fähigkeit der Verbindung, an die Nukleotidsequenz zu binden.
  • Die wie vorstehend definierten transformierten Zellen und/oder Tiere können vorteilhafterweise als Modell dienen und können bei Verfahren zum Untersuchen, Identifizieren und/oder Auswählen von Verbindungen, die fähig sind, für die Pathologien, die durch Chlamydia pneumoniae induziert oder verschlechtert werden, verantwortlich zu sein, oder die fähig sind, diese Pathologien wie zum Beispiel Herz-Kreislauf-Erkrankungen oder Erkrankungen der Atemwege zu verhindern oder zu behandeln, verwendet werden. Insbesondere können die transformierten Wirtszellen, insbesondere Bakterien der Familie Chlamydia, deren Transformation mit einem Vektor zum Beispiel ihre Infektivität erhöhen oder inhibieren oder die Pathologien, die normalerweise durch die Infektion induziert oder verschlechtert werden, modulieren kann, verwendet werden, um Tiere, bei denen der Ausbruch von Pathologien überwacht werden wird, zu infizieren. Diese nicht transformierten Tiere, die zum Beispiel mit transformierten Chlamydia-Bakterien infiziert werden, können als Untersuchungsmodell dienen. Auf die gleiche Weise können die transformierten Tiere zum Beispiel Veranlagungen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und/oder Erkrankungen der Atemwege aufweisen und daher bei Verfahren zur Auswahl von Verbindungen, die fähig sind, die Erkrankungen zu verhindern und oder zu behandeln, verwendet werden.
  • Die Verbindungen, die fähig sind, ausgewählt zu werden, können organische Verbindungen, wie zum Beispiel Polypeptide oder Kohlenhydrate oder jedwede andere schon bekannte organische oder anorganische Verbindungen sein, oder neue organische Verbindungen, die unter Verwendung molekularer Modelling-Techniken hergestellt und durch chemische oder biochemische Synthese erhalten werden, wobei diese Techniken Fachleuten bekannt sind.
  • Die ausgewählten Verbindungen können verwendet werden, um das Wachstum und/oder die zelluläre Replikation von Chlamydia pneumoniae oder von jedwedem anderen damit zusammenhängenden Mikroorganismus zu modulieren und somit die Infektion durch diese Mikroorganismen zu kontrollieren. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auch verwendet werden, um das Wachstum und/oder die zelluläre Replikation von allen eukaryotischen oder prokaryotischen Zellen zu modulieren, insbesondere von Tumorzellen und infektiösen Mikroorganismen, für welche sich die Verbindungen als aktiv erweisen, wobei die Verfahren, die es möglich machen, die Modulationen zu bestimmen, Fachleuten wohlbekannt sind.
  • Unter einer Verbindung, die zum Modulieren des Wachstums eines Mikroorganismus fähig ist, versteht man, dass sie jedwede Verbindung bezeichnet, die es möglich macht, auf die Entwicklung, das Wachstum, die Proliferationsgeschwindigkeit und/oder die Überlebensfähigkeit des Mikroorganismus zu wirken, sie zu modifizieren, zu beschränken und/oder zu verringern.
  • Diese Modulation kann zum Beispiel durch ein Mittel erreicht werden, das zum Binden eines Proteins und somit zum Inhibieren oder zum Potenzieren von dessen biologischer Aktivität fähig ist, oder zum Binden an ein Membranprotein der äußeren Oberfläche eines Mikroorganismus und zum Blockieren des Eindringens des Mikroorganismus in die Wirtszelle oder zum Fördern der gegen den Mikroorganismus gerichteten Wirkung des Immunsystems des infizierten Organismus fähig ist. Diese Modulation kann auch durch ein Mittel erreicht werden, das zum Binden an eine Nukleotidsequenz einer DNA oder RNA eines Mikroorganismus und zum Beispiel zum Blockieren der Expression eines Polypeptids, dessen biologische oder strukturelle Aktivität für das Wachstum oder für die Reproduktion des Mikroorganismus notwendig ist, fähig ist.
  • Unter einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus versteht man, dass er in der vorliegenden Erfindung jedweden Mikroorganismus bezeichnet, dessen Genexpression durch eine derartige Verbindung moduliert, reguliert, induziert oder inhibiert werden kann, oder dessen Wachstum oder zelluläre Replikation auch durch eine derartige Verbindung moduliert werden kann. Unter einem damit zusammenhängenden Mikroorganismus versteht man auch, dass er in der vorliegenden Erfindung einen Mikroorganismus bezeichnet, der wie vorstehend definierte Nukleotidsequenzen oder Polypeptide enthält. Diese Mikroorganismen können in einigen Fällen Polypeptide oder Nukleotidsequenzen enthalten, die zu den in der Erfindung offenbarten identisch oder homolog sind, sie können auch durch die Nachweis- und/oder die Identifikationsverfahren oder den Kit, wie vorstehend definiert, nachgewiesen und/oder identifiziert werden und können auch als Ziel für diese Verbindungen dienen.
  • Die Erfindung offenbart auch eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung, die aus den folgenden Verbindungen gewählt wird:
    eine wie vorstehend definierte Nukleotidsequenz;
    ein wie vorstehend definiertes Polypeptid;
    ein wie vorstehend definierter Vektor;
    ein wie vorstehend definierter Antikörper; und
    eine Verbindung, die fähig ist, durch ein wie vorstehend definiertes Auswahlverfahren, wahlweise in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel, ausgewählt zu werden.
  • Unter einer wirksamen Menge versteht man, dass sie eine ausreichende Menge der Verbindung oder des Antikörpers oder eines Polypeptids bezeichnet, die es möglich macht, das Wachstum von Chlamydia pneumoniae oder eines damit zusammenhängenden Mikroorganismus zu modulieren.
  • Die Erfindung führt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung an, umfassend ein oder mehrere Polypeptide und/oder ein oder mehrere Fusionspolypeptide, wie vorstehend definiert. Derartige Zusammensetzungen umfassen ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel. Pharmazeutische Zusammensetzungen schließen Zusammensetzungen ein, die ein Polypeptid oder ein Fusionspolypeptid umfassen, das mit seropositivem Serum einer Einzelperson, die mit Chlamydia pneumoniae infiziert ist, immunreagiert. In einer Ausführungsform kann eine derartige pharmazeutische Zusammensetzung zur Vorbeugung oder zur Behandlung einer Infektion durch ein Bakterium, das zur Art Chlamydia pneumoniae gehört, oder durch einen damit zusammenhängenden Mikroorganismus benutzt werden.
  • Die Erfindung offenbart zusätzlich eine immunogene Zusammensetzung oder eine Impfstoffzusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie ein oder mehrere Polypeptide und/oder ein oder mehrere Hybrid- (Fusions-) Polypeptide, wie vorstehend definiert, umfasst. Derartige Zusammensetzungen umfassen ferner einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel. Immunogene Zusammensetzungen oder Fusionspolypeptide schließen Zusammensetzungen ein, die ein Polypeptid umfassen, das mit seropositivem Serum einer Einzelperson, die mit Chlamydia pneumoniae infiziert ist, reagiert.
  • Immunogene Zusammensetzungen oder Impfstoffzusammensetzungen können auch immunogene Zusammensetzungen oder Impfstoffzusammensetzungen aus DNA umfassen, die Polynukleotidsequenzen, die funktionell mit einer regulatorischen Sequenz zusammenhängen, welche die Genexpression kontrolliert, umfassen. Derartige Zusammensetzungen schließen Zusammensetzungen ein, welche die Expression eines neutralisierenden Epitops von Chlamydia pneumoniae steuern.
  • Die Erfindung führt auch die Verwendung einer wie vorstehend definierten transformierten Zelle zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung an.
  • Die Erfindung führt auch eine Impfstoffzusammensetzung an, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine Nukleotidsequenz, einen Vektor und/oder eine transformierte Zelle, wie vorstehend definiert, enthält.
  • Die Erfindung führt auch Impfstoffzusammensetzungen, wie vorstehend definiert, zur Vorbeugung oder zur Behandlung einer Infektion durch ein Bakterium, das zur Art Chlamydia pneumoniae gehört, oder durch einen damit zusammenhängenden Mikroorganismus an.
  • Die Erfindung offenbart auch die Verwendung von DNA, die Polypeptide von Chlamydia pneumoniae, insbesondere antigene Determinanten, kodiert, die als Impfstoffzusammensetzungen formuliert werden soll. In Übereinstimmung mit diesem Aspekt wird die DNA von Interesse unter der Kontrolle von regulatorischen Elementen, welche die Expression der DNA fördern, d. h. Promotor- und Enhancerelementen, in einen Expressionsvektor gentechnisch eingefügt. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Promotorelement zellspezifisch sein und eine wesentliche Transkription der DNA nur in vorbestimmten Zellen gestatten. Die DNA kann entweder als nackte DNA (US-Patent No. 5.679.647) oder in Zusammensetzungen mit anderen Mitteln formuliert, welche die Aufnahme der DNA erleichtern können, einschließlich Virusvektoren, d. h. Adenovirusvektoren, oder mit Mitteln, welche die Immunisierung erleichtern, wie zum Beispiel Bupivicain und anderen lokalen Anästhetika (US-Patent No. 5.593.972), Saponinen (US-Patent No. 5.739.118) und kationischen Polyaminen (veröffentlicht in der internationalen Anmeldung WO 96/10038), direkt in den Wirt eingeführt werden.
  • Die DNA-Sequenz, die das antigene Polypeptid und das regulatorische Element kodiert, kann unter Verwendung von Techniken, wie zum Beispiel gezielter homologer Rekombination, die Fachleuten wohlbekannt sind, und z. B. in Chappel, US-Patent No. 4.215.051; Skoultchi, WO 91/06667 beschrieben sind, in eine stabile Zelllinie oder einen geklonten Mikroorganismus eingefügt werden.
  • Derartige Zelllinien und Mikroorganismen können für Impfstoffzwecke formuliert werden. In noch einer anderen Ausführungsform kann die DNA-Sequenz, die das antigene Polypeptid und das regulatorische Element kodiert, an einen Säugerwirt abgegeben werden und über homologe Rekombination in das Wirtsgenom eingeführt werden (siehe Chappel, US-Patent No. 4.215.051; Skoultchi, WO 91/06667).
  • Vorzugsweise werden die immunogenen Zusammensetzungen und/oder Impfstoffzusammensetzungen, die für die Vorbeugung und/oder Behandlung einer Infektion durch Chlamydia pneumoniae oder durch einen damit zusammenhängenden Mikroorganismus gedacht sind, aus den immunogenen Zusammensetzungen und/oder Impfstoffzusammensetzungen, umfassend ein Polypeptid oder eines seiner repräsentativen Fragmente, die einem Protein der Zellhülle von Chlamydia pneumoniae oder einem seiner repräsentativen Fragmente entsprechen, gewählt werden. Die Impfstoffzusammensetzungen, umfassend Nukleotidsequenzen, werden auch vorzugsweise Nukleotidsequenzen umfassen, die ein Polypeptid oder eines seiner repräsentativen Fragmente kodieren, die einem Protein der Zellhülle von Chlamydia pneumoniae oder einem seiner repräsentativen Fragmente entsprechen.
  • Unter diesen bevorzugten immunogenen Zusammensetzungen und/oder Impfstoffzusammensezungen sind die am meisten bevorzugten jene, die ein Polypeptid oder eines seiner repräsentativen Fragmente oder eine Nukleotidsequenz oder eines ihrer repräsentativen Fragmente umfassen, deren Sequenzen aus den Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen, die in dieser funktionellen Gruppe identifiziert und vorstehend aufgelistet sind, gewählt werden.
  • Die Polypeptide der Erfindung oder ihre repräsentativen Fragmente, welche in die immunogenen Zusammensetzungen eintreten, können durch Fachleuten bekannte Techniken ausgewählt werden, wie zum Beispiel auf die Fähigkeit der Polypeptide hin, T-Zellen zu stimulieren, was zum Beispiel zu ihrer Vermehrung oder der Sekretion von Interleukinen führt und was zur Herstellung von Antikörpern, die gegen die Polypeptide gerichtet sind, führt.
  • In Mäusen, denen eine Gewichtsdosis der Impfstoffzusammensetzung verabreicht wird, die der in Menschen verwendeten Dosis vergleichbar ist, wird die Antikörperreaktion durch Sammeln des Serums, gefolgt von einer Untersuchung der Bildung eines Komplexes zwischen den im Serum vorliegenden Antikörpern und dem Antigen der Impfstoffzusammensetzung gemäß den gebräuchlichen Techniken getestet.
  • Bei den Impfstoffzusammensetzungen handelt es sich vorzugsweise um eine Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel und gegebenenfalls mit einem oder mehreren passenden Immunitätshilfsstoffen.
  • Verschiedene Arten von Impfstoffen sind zurzeit zum Schützen von Menschen gegen Infektionserkrankungen erhältlich: abgeschwächte lebende Mikroorganismen (M. bovis – BCG für Tuberkulose), inaktivierte Mikroorganismen (Influenzavirus), azelluläre Extrakte (Bordetella perfussis für Keuchhusten), rekombinante Proteine (Oberflächenantigen des Hepatitis B Virus), Polysaccharide (Pneumokokken). Experimente an Impfstoffen, die aus synthetischen Proteinen oder aus genetisch modifizierten Mikroorganismen, die heterologe Antigene exprimieren, hergestellt werden, laufen. Erst ganz kürzlich wurden rekombinante Plasmid-DNAs, die Schutzantigene kodierende Gene tragen, als alternative Impfstrategie vorgeschlagen. Diese Art der Impfung wird mit einem bestimmten Plasmid ausgeführt, das von einem E. coli Plasmid, das in vivo nicht repliziert und das nur das Impfprotein kodiert, abgeleitet ist. Tiere wurden durch einfaches Injizieren nackter Plasmid-DNA in den Muskel immunisiert. Diese Technik führt zur Expression des Impfproteins in situ und zu einer Immunantwort des zellulären Typs (CTL) und des humoralen Typs (Antikörper). Diese Doppelinduktion der Immunantwort ist eine der Hauptvorteile der Impftechnik mit nackter DNA.
  • Die Impfstoffzusammensetzungen können in vitro und in vivo vor der Verabreichung an einen Wirt, z. B. den Menschen, in Tiermodellen ausgewertet werden. Zum Beispiel können in-vitro-Neutralisationsassays, wie zum Beispiel jene von Peterson et al. (1988) beschriebenen, benutzt werden. Der von Peterson et al. (1988) beschriebene Assay ist für das Testen von Impfstoffzusammensetzungen, die gegen entweder Chlamydia pneumoniae oder Chlamydia trachomatis gerichtet sind, geeignet.
  • Kurz gesagt, werden als Komplementquelle Hyperimmun-Antiseren in PBS, das 5% Meerschweinchenserum enthält, verdünnt. Chlamydien (104 IFU; infektiöse Einheiten) werden zu den Verdünnungen der Antiseren gegeben. Die Antigen-Antikörpergemische werden 45 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und in zweifacher Ausfertigung in konfluente einschichtige Hep-2- oder HeLa-Zellen, die in Glasfläschchen (z. B. 15 mal 45 mm) enthalten sind, die vor der Animpfung zweimal mit PBS gewaschen worden sind, angeimpft. Die einschichtigen Zellen werden durch Zentrifugation bei 1000 × g 1 Stunde lang infiziert, gefolgt von einstündiger stationärer Inkubation bei 37 °C. Infizierte Einzelschichten werden 48 oder 72 Stunden lang inkubiert, fixiert und mit einem für Chlamydia spezifischen Antikörper, wie zum Beispiel anti-MOMP für C. trachomatis, usw. gefärbt. Die IFUs werden bei einer 200-fachen Vergrößerung in zehn Feldern gezählt. Der Neutralisationstiter wird, beruhend auf der Verdünnung, die 50% Inhibition im Vergleich zu Kontrolleinzelschichten/IFU gibt, zugeordnet.
  • Die Effizienz von Impfstoffzusammensetzungen kann in vivo durch Anregen von Tiermodellen für eine Infektion durch Chlamydia pneumoniae, z. B. Mäusen oder Kaninchen, mit den Impfstoffzusammensetzungen bestimmt werden. Zum Beispiel können in- vivo-Anregungsuntersuchungen mit einer Impfstoffzusammensetzung im Mausmodell für eine Infektion durch Chlamydia pneumoniae, beschrieben von Moazed et al. (1997), durchgeführt werden. Kurz gesagt werden männliche homozygote apoE-defiziente und/oder C57 BL/6J Mäuse mit Impfstoffzusammensetzungen immunisiert. Nach der Impfung werden die Mäuse durch die subkutane Injektion eines Gemisches aus Ketamin und Xylazin ein wenig sediert und mit einem Gesamtvolumen von 0,03–0,05 ml an Organismen, die in SPG-Medium suspendiert sind, oder mit SPG allein intranasal beimpft. Die Inokulationen mit Chlamydia pneumoniae betragen ungefähr 3 × 107 IFU/Maus. Die Mäuse werden in einem Alter von 8, 10 und 12 Wochen mit Chlamydia pneumoniae beimpft. 1–20 Wochen nach der ersten Animpfung werden dann Gewebe von der Lunge, der Milz, dem Herzen usw. entnommen. Die Anwesenheit von Organismen wird unter Verwendung von PCR, Histologie und Immuncytochemie oder durch quantitative Kultur/IFU nach der Gewebehomogenisierung bewertet.
  • Alternativ dazu können in-vivo-Untersuchungen der Anregung mit einer Impfstoffzusammensetzung im Kaninchenmodell für Chlamydia pneumoniae, das von Laitinen et al. (1997) beschrieben wird, durchgeführt werden. Kurz gesagt werden weiße New Zealand Kaninchen (5 Monate alt) mit den Impfstoffzusammensetzungen immunisiert. Nach der Impfung werden die Kaninchen mit Hypnorm, 0,3 ml/kg Körpergewicht intramuskulär, sediert und intranasal mit insgesamt 0,5 ml Chlamydia pneumoniae, die in SPG-Medium suspendiert sind, oder mit SPG-allein beimpft. Die Inokulationen mit Chlamydia pneumoniae betragen ungefähr 3 × 107 IFU/Kaninchen. Die Kaninchen werden 3 Wochen nach der ersten Inokulation auf die gleiche Weise und mit der gleichen Dosis erneut infiziert. 2 Wochen nach der ersten Infektion und 1, 2 und 4 Wochen nach der erneuten Infektion werden dann Gewebe entnommen. Die Anwesenheit von Chlamydia pneumoniae wird unter Verwendung von PCR, Histologie und Immuncytochemie oder durch quantitative Kultur/IFU nach der Gewebehomogenisierung bewertet.
  • Die Impfstoffzusammensetzungen, umfassend Nukleotidsequenzen oder Vektoren, in welche die Sequenzen eingefügt sind, werden insbesondere in der internationalen Anmeldung No. WO 90/11092 und auch in der internationalen Anmeldung No. WO 95/11307 beschrieben.
  • Die Nukleotidsequenz, welche die Impfstoffzusammensetzung ausmacht, kann in den Wirt injiziert werden, nachdem sie an Verbindungen gekoppelt worden ist, welche das Eindringen dieses Polynukleotids in das Innere der Zelle oder dessen Transport bis hin zum Zellkern fördern. Die sich ergebenden Konjugate können in polymere Mikroteilchen eingekapselt werden, wie in der Internationalen Anmeldung No. WO 94/27238 (Medisorb Technologies International) beschrieben ist.
  • Gemäß einer anderen Ausführungsform der Impfstoffzusammensetzung wird die Nukleotidsequenz, vorzugsweise eine DNA, mit dem DEAE-Dextran (Pagano et al., 1967) oder mit Kernproteinen (Kaneda et al., 1989), mit Lipiden (Felgner et al., 1987) komplexiert oder in Liposomen eingekapselt (Fraley et al., 1980) oder alternativ dazu in Form eines Gels eingeführt, wobei dadurch ihre Transfektion in die Zellen erleichtert wird (Midoux et al., 1993, Pastore et al., 1994). Das Polynukleotid oder der Vektor kann auch in einer Pufferlösung in Suspension vorliegen oder mit Liposomen kombiniert werden.
  • Vorteilhafterweise wird ein derartiger Impfstoff gemäß der Technik, die im Jahr 1996 von Tacson et al. oder Huygen et al. beschrieben wurde, oder alternativ dazu gemäß der von Davis et al. in der internationalen Anmeldung No. WO 95/11307 beschriebenen Technik hergestellt.
  • Ein derartiger Impfstoff kann auch in Form einer Zusammensetzung hergestellt werden, die einen Vektor enthält, der unter die Kontrolle von regulatorischen Elementen, die seine Expression in Menschen oder Tieren ermöglichen, gestellt ist. Es ist zum Beispiel möglich, als Vektor für die in-vivo-Expression des Polypeptidantigens von Interesse das Plasmid pcDNA3 oder das Plasmid pcDNA1/neo, beide durch Invitrogen R & D Systems, Abingdon, United Kingdom vertrieben, zu verwenden. Es ist auch möglich, das Plasmid V1Jns.tPA, das im Jahr 1995 von Shiver et al. beschrieben wurde, zu verwenden. Ein derartiger Impfstoff wird vorteilhafterweise zusätzlich zum rekombinanten Vektor eine Salzlösung, zum Beispiel eine Natriumchloridlösung, umfassen.
  • Die immunogenen Zusammensetzungen können auch als Teil von Immunisierungsverfahren benutzt werden, wobei derartige Verfahren das Verabreichen einer immunisierenden Menge der immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung an einen Wirt, z. B. einen menschlichen Wirt, umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Immunisierungsverfahren ein Verfahren zum Immunisieren gegen Chlamydia pneumoniae.
  • Unter einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel versteht man, dass es eine Verbindung oder eine Kombination von Verbindungen bezeichnet, die in eine pharmazeutische oder Impfstoffzusammensetzung eintreten, die keine Nebenwirkungen verursachen, und die es zum Beispiel möglich machen, die Verabreichung der wirksamen Verbindung zu erleichtern, seine Haltbarkeit und/oder seine Effizienz im Körper zu erhöhen, seine Löslichkeit in Lösung zu erhöhen oder alternativ dazu seine Konservierung zu steigern. Diese pharmazeutisch verträglichen Vehikel sind wohlbekannt und werden von Fachleuten gemäß der Beschaffenheit und der Verabreichungsart der gewählten wirksamen Verbindung angepasst.
  • Was die Impfstoff-Formulierungen betrifft, können diese die passenden Immunitätshilfsstoffe, die Fachleuten bekannt sind, umfassen, wie zum Beispiel Aluminiumhydroxid, einen Vertreter der Familie der Muramylpeptide, wie zum Beispiel eines der Peptidderivate von N-Acetyl-Muramyl, ein bakterielles Lysat oder alternativ dazu den unvollständigen Freund's Hilfsstoff, STIMULONTM QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA), MPLTM (3-O-deacyliertes Monophosphoryllipid A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT, Aluminiumphosphat, IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA).
  • Vorzugsweise werden diese Verbindungen auf dem systemischen Weg, insbesondere auf dem intravenösen Weg, auf dem intranasalen, intramuskulären, intradermalen oder auf dem subcutanen Weg oder auf dem oralen Weg verabreicht. Stärker bevorzugt wird die Impfstoffzusammensetzung, umfassend erfindungsgemäße Polypeptide, mehrere Male über die Zeit verteilt auf dem intradermalen oder subkutanen Weg verabreicht werden.
  • Ihre optimalen Verabreichungsarten, Dosierungen und galenischen Formen können gemäß den Kriterien bestimmt werden, die im Allgemeinen beim Etablieren einer an einen Patienten angepassten Behandlung in Betracht gezogen werden, wie zum Beispiel dem Alter oder dem Körpergewicht des Patienten, dem Schweregrad seines Allgemeinzustands, der Verträglichkeit der Behandlung und der beobachteten Nebenwirkungen.
  • Die Erfindung führt die Verwendung einer derartigen Zusammensetzung für die Behandlung oder Vorbeugung von vorzugsweise mit der Anwesenheit eines Atheroms verbundenen Herz-Kreislauf-Erkrankungen an, die durch Chlamydia pneumoniae induziert oder verschlechtert werden.
  • Schließlich führt die Erfindung die Verwendung einer derartigen Zusammensetzung für die Behandlung oder Vorbeugung von Erkrankungen der Atemwege an, die durch die Anwesenheit von Chlamydia pneumoniae induziert oder verschlechtert werden, vorzugsweise von Asthma.
  • Andere Kennzeichen und Vorteile der Erfindung erscheinen in den folgenden Beispielen und Abbildungen:
  • Legende zu den Abbildungen:
  • 1: Ablauf der Herstellung von Sequenzen von Chlamydia pneumoniae
  • 2: Analyse der Sequenzen und Zusammensetzen
  • 3: Abschließende Techniken
  • 3a): Zusammensetzungskarte
  • 3b): Bestimmung und Verwendung der verwaisten Enden der Contigs
  • BEISPIELE
  • Experimentelle Verfahren
  • Zellen
  • Der von den Erfindern verwendete Chlamydia pneumoniae Stamm (CM1) wird von der ATCC (American Culture Type Collection) erhalten, wo er die Referenznummer ATCC 1360-VR hat.
  • Er wird auf HeLa 229-Zellen, die von der American Type Culture Collection unter der Referenz ATCC CCL-2.1 erhalten werden, gezüchtet.
  • Kultur der Zellen
  • Die HeLa-Zellen ATCC CCL-2.1 werden in 75-ml Zellkulturkolben (Corning) gezüchtet. Das Kulturmedium ist Dulbecco's modifiziertes Zellkulturmedium (Gibco BRL No. 04101965), das mit MEM-Aminosäuren (Gibco BRL No. 04301140) L (5 ml pro 500 ml Medium) und 5% fötalem Kälberserum (Gibco BRL No. 10270 Charge 40G8260K) ohne Antibiotika oder Antimykotika ergänzt wird.
  • Der Zellkulturvorrat wird auf folgende Weise aufrechterhalten. Die Zellkulturen werden unter einem invertierten Mikroskop geprüft. 24 Stunden nach Konfluenz wird jeder Zellrasen mit PBS (Gibco BRL No. 04114190) gespült, abgespült und dann 5 min lang in Anwesenheit von 3 ml Trypsin (Gibco BRL No. 25200056) in einen Ofen gestellt. Der Zellrasen wird dann abgelöst und dann in 120 ml Kulturmedium resuspendiert, wobei das Ganze gerührt wird, um die zelluläre Suspension homogen zu machen. 30 ml dieser Suspension werden dann pro Zellkulturkolben verteilt. Die Kolben werden in einem (CO2-Ofen (5%) 48 Stunden lang bei einer Temperatur von 37 °C gehalten. Der Zellvorrat wird aufrechterhalten, um täglich 16 Kolben von subkonfluenten Zellen erhältlich zu haben. Es sind diese subkonfluenten Zellen, die für das Infizieren mit Chlamydia verwendet werden. 25-ml Zellkulturkolben werden auch verwendet, diese Kolben werden auf ähnlich Weise hergestellt, aber die zur Aufrechterhaltung der Zellen verwendeten Volumina sind die Folgenden: 1 ml Trypsin, 28 ml Kulturmedium, um die Zellen zu resuspendieren, 7 ml Kulturmedium werden pro 25-ml Kolben verwendet.
  • Infektion der Zellen mit Chlamydia
  • Anfänglich werden die Chlamydien, in Suspension in einem Volumen von 1 ml, gefroren von der ATCC (–70 °C) erhalten. Dieses Präparat wird langsam aufgetaut, 500 μl werden entnommen und mit subkonfluenten Zellen, die wie vorstehend angegeben erhalten wurden, in einem 25-ml Zellkulturkolben, der zum Bedecken der Zellen 1 ml Medium enthält, in Kontakt gebracht. Der Kolben wird dann bei 2000 U/min in einem „Schaukel"rotor für Mikrotiterplatten zentrifugiert, wobei die Zentrifuge bei einer Temperatur von 35 °C gehalten wird. Nach der Zentrifugation werden die beiden Kolben drei Stunden lang in einen Ofen bei 35 °C gestellt. 6 ml Kulturmedium, das Cycloheximid (1 μg/ml) enthält, werden dann zugegeben und der Kolben wird bei 35 °C aufbewahrt. Nach 72 Stunden wird der Infektionsspiegel durch direkte Immunfluoreszenz und durch die cytopathogene Wirkung, die diesen Zellen zugefügt wurde, ausgewertet.
  • Direkte Immunfluoreszenz
  • Ausgehend von infizierten Zellen, die wie vorstehend angegeben erhalten wurden, wird ein Zellabstrich mit einer Pasteurpipette auf einen Mikroskopobjektträger deponiert. Der Zellabstrich wird 10 min lang mit Azeton fixiert; nach Ablaufen des Azetons wird der Abstrich mit 30 μl monoklonalem Antikörper aus Maus, der gegen MOMP (das Hauptprotein der äußeren Membran) von Chlamydia gerichtet und mit Fluorsezeinisothiocyanat markiert ist (Syva, Biomerieux), bedeckt. Das Ganze wird dann in einer feuchten Kammer bei einer Temperatur von 37 °C inkubiert. Die Objektträger werden dann mit Wasser abgespült, leicht getrocknet und dann wird nach dem Deponieren eines Tropfens Eindeckmedium vor dem Ablesen ein Deckglas befestigt. Das Ablesen wird mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops, das mit den erforderlichen Filtern ausgestattet ist (Anregung bei 490 nm, Emission bei 520 nm), ausgeführt.
  • Ernte von Chlamydia pneumoniae
  • Nach dem Überprüfen der Infektion durch direkte Immunfluoreszenz, die so wie vorstehend angegeben ausgeführt wird, werden die Kulturkolben unter einer sterilen Haube geöffnet, sterile Glaskugeln mit einem Durchmesser in der Größenordnung eines Millimeters werden in den Kolben gegeben. Der Kolben wird verschlossen und dann heftig gerührt, während er mit dem Zellrasen am Boden horizontal gehalten wird, sodass die Glaskugeln eine mechanische Wirkung auf den Zellrasen haben können. Die meisten Zellen werden so abgelöst oder aufgebrochen; die Wirkung des Rührens wird unter einem optischen Mikroskop beobachtet, um die richtige Freisetzung der Chlamydien sicherzustellen.
  • Infektion der Zellkulturen im großen Maßstab
  • Das Produkt der Chlamydienernte (Kulturmedium und Zelltrümmer) wird mit einer Pipette entnommen und in drei Zellkulturkolben, die subkonfluente HeLa-Zellen ATCC CCL-2.1 enthalten, die wie vorstehend angegeben erhalten wurden, verteilt. Die so beimpften Zellen werden unter sanftem Rühren (Schaukeln) in einen Ofen bei 35 °C gestellt. Nach einer Stunde werden die Kolben horizontal in einem Ofen gehalten, sodass das Kulturmedium die Zellen 3 Stunden lang bedeckt. 30 ml Kulturmedium, das Actydion (1 μg/ml) enthält, werden dann zu jedem Kolben gegeben. Die Kulturkolben werden dann bei 35 °C 72 Stunden lang aufbewahrt. Die so infizierten Zellen werden nach 24 Stunden unter einem optischen Mikroskop geprüft, die cytopathogene Wirkung wird durch das Erscheinen von cytoplasmatischen Einschlüssen, die unter einem invertierten optischen Mikroskop sichtbar sind, ausgewertet. Nach 72 Stunden besetzen die Vakuolen, welche die Chlamydien enthalten, das Cytoplasma der Zelle und stoßen den Kern beiseite. In diesem Stadium werden zahlreiche Zellen spontan zerstört und haben freie Elementarkörperchen im Kulturmedium zurückgelassen. Die Chlamydien werden wie vorstehend beschrieben geerntet und werden entweder bei –80 °C eingefroren oder für eine weitere Vermehrung verwendet.
  • Reinigung der Chlamydien
  • Das Produkt der Chlamydia-Ernten wird bei –80 °C aufbewahrt und auf einem Wasserbad bei Raumtemperatur aufgetaut. Nach dem Auftauen wird jedes Röhrchen eine Minute lang heftig gerührt und eine Minute lang in ein Ultraschallbad eingetaucht (BRANSON 1200); die Röhrchen werden dann durch Umkehren gerührt, bevor sie 5 min lang bei 2000 U/min zentrifugiert werden. Der Überstand wird vorsichtig entfernt und bei kalter Temperatur (Eis) gehalten. Der Überstand wird heftig gerührt und dann auf Nylonfiltern mit Poren von 5 Mikron Durchmesser auf einem Träger (Nalgene) filtriert, wobei man zulässt, dass sich unter dem Nylonfilter ein schwaches Vakuum etabliert. Für jede Filtration werden drei Nylonfilter übereinandergelegt; diese Filter werden nach jeweils 40 ml Filtrat ersetzt. Zweihundert Milliliter Filtrationsprodukt werden bei kalter Temperatur gehalten und werden dann, nach Rühren durch Umkehren, bei 10.000 U/min 90 min lang zentrifugiert, der Überstand wird entfernt und das Pellet wird in 10 ml 10 mM Tris aufgenommen, heftig gevortext und dann bei 10.000 U/min 90 min lang zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und das Pellet wird in einem Puffer aufgenommen (20 mM Tris pH 8,0, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2), zu dem 800 Einheiten DNAse I (Boehringer) gegeben werden. Das Ganze wird eine Stunde lang bei 37 °C gehalten. Ein ml 0,5 M EDTA wird dann zugegeben, das Ganze wird gevortext und bei –20 °C eingefroren.
  • Herstellung der DNA
  • Die vorstehend gereinigten Chlamydien werden aufgetaut und einer Verdauung mit Proteinase K (Boehringer) in einem Endvolumen von 10 ml unterzogen. Die Verdauungsbedingungen sind die Folgenden: 0,1 mg/ml Proteinase K, 0,1 × SDS bei 55 °C, wobei alle 10 min gerührt wird. Das Produkt der Verdauung wird dann einer doppelten Extraktion mit Phenol-Chloroform unterzogen, zwei Volumina Ethanol werden zugege ben und die DNA wird direkt mit einer Pasteurpipette mit einem Ende in Form eines Hakens wiedergewonnen. Die DNA wird auf der Kante des Röhrchens getrocknet und dann in 500 μl 2 mM Tris pH 7,5 resuspendiert. Die DNA wird mindestens 24 Stunden lang bei 4 °C aufbewahrt, bevor sie zum Klonieren verwendet wird.
  • Klonieren der DNA
  • Nach der Fällung wird die DNA durch Messen der optischen Dichte bei 260 nm quantifiziert. Dreißig μg der DNA von Chlamydia werden in 10 1,5 ml-Röhrchen verteilt und in 300 μl Wasser verdünnt. Jedes dieser Röhrchen wird 10 Ultraschallanwendungen, die 0,5 s lang dauern, in einem Beschallungsgerät (Unisonix XL2020) unterzogen. Die Inhalte der 10 Röhrchen werden dann vereinigt und durch aufeinanderfolgende Extraktionen mit Butanol (Sigma B1888) auf folgende Weise konzentriert: zwei Volumina Butanol werden zu dem verdünnten DNA-Gemisch gegeben. Nach dem Rühren wird das Ganze fünf Minuten lang bei 2500 U/min zentrifugiert und das Butanol wird entfernt. Dieser Arbeitschritt wird wiederholt, bis das Volumen der wässrigen Phase weniger als 1 ml ist. Die DNA wird dann in Anwesenheit von Ethanol und 0,5 M Natriumacetat pH 5,4 gefällt und dann dreißig Minuten lang bei 15.000 U/min bei kalter Temperatur (4 °C) zentrifugiert. Das Pellet wird mit 75% Ethanol gespült, fünf Minuten lang bei 15.000 U/min zentrifugiert und bei Raumtemperatur getrocknet. Ein Zehntel des Präparats wird auf einem 0,8% Agarosegel analysiert. Typischerweise beträgt die Größe der so hergestellten DNA-Fragmente zwischen 200 und 8000 Basenpaare.
  • Um das Klonieren der erhaltenen DNA zu ermöglichen, werden die Enden repariert. Die DNA wird in einer Menge von 10 μg/Röhrchen im folgenden Reaktionsmedium verteilt: 100 μl Endvolumen, 1 × Puffer (Biolabs 201 L), 0,5 μl BSA 0,05 mg/ml, 0,1 mM dATP, 0,1 mM von jeweils dGTP, dCTP oder dTTP, 60.000 IU T4 DNA-Polymerase. Die Reaktion wird dreißig Minuten lang bei 16 °C inkubiert. Die Inhalte aller Röhrchen werden dann vereinigt, bevor eine Extraktion mit Phenol-Chloroform ausgeführt wird und dann die wässrige Phase wie vorstehend beschrieben gefällt wird. Nach diesem Schritt wird die so hergestellte DNA phosphoryliert. Dafür wird die DNA in einer Menge von 10 μg pro Röhrchen in Röhrchen verteilt und dann wird in einem Endvolumen von 50 μl die Reaktion auf folgende Weise vorbereitet: 1 mM ATP, 1 × Kinasepuffer, 10 IU T4 Polynukleotidkinase (Biolabs 201 L). Das Präparat wird dreißig Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Inhalte der Röhrchen werden kombiniert und eine Phenol-Chloroform-Extraktion und dann eine Fällung werden ausgeführt, um die DNA zu fällen. Letztere wird dann in 1 μl Wasser suspendiert und dann werden die DNA-Fragmente gemäß ihrer Größe auf einem 0,8% Agarosegel (1 × TAE) aufgetrennt. Die DNA wird einem elektrischen Feld von 5 V/cm unterzogen und dann auf einem UV-Tisch sichtbar gemacht. Die Fragmente, deren Größe zwischen 1200 und 2000 Basenpaaren variiert, werden durch Ausschneiden aus dem Gel ausgewählt. Das so isolierte Gelfragment wird in ein Röhrchen gegeben und dann wird die DNA mit dem Qiaex-Kit (20021 Qiagen) gemäß dem durch den Hersteller bereitgestellten Verfahren gereinigt.
  • Herstellung des Vektors
  • 14 μg des Klonierungsvektors pGEM-5Zf (Promega P2241) werden in ein Endvolumen von 150 μl verdünnt und werden einer Verdauung mit 300 IU des Restriktionsenzyms EcoRV (Biolabs 195S) gemäß dem Protokoll und mit den Reagenzien, die vom Hersteller bereitgestellt werden, unterzogen. Das Ganze wird 150 min lang auf 37 °C gestellt und dann in die Vertiefungen eines 0,8% Agarosegel verteilt, das einem elektrischen Feld von 5 V/cm unterzogen wird. Der linearisierte Vektor wird auf einem UV-Tisch sichtbar gemacht, durch Ausschneiden aus dem Gel isoliert und dann durch den Qiaex-Kit (Qiagen 20021) gemäß den Empfehlungen des Herstellers gereinigt. Die Reinigungsprodukte werden in einem Röhrchen vereinigt, das Volumen wird gemessen und dann wird die Hälfte des Volumens an Phenol zugegeben und das Ganze wird 1 min lang heftig gerührt. Ein halbes Volumen Chloroform-Isoamylalkohol 24 1 wird zugegeben und 1 min lang heftig gerührt. Das Ganze wird bei 4 °C 5 min lang bei 15.000 U/min zentrifugiert, die wässrige Phase wird gewonnen und in ein Röhrchen transferiert. Die DNA wird in Anwesenheit von 0,3 M Natriumacetat pH 5,4 und 3 Volumina Ethanol gefällt und 1 Stunde lang auf –20 °C gestellt. Die DNA wird dann bei 4 °C 30 min lang bei 15.000 U/min zentrifugiert, der Überstand wird entfernt, während das Pellet, das zweimal mit 70% Ethanol gewaschen wird, aufbewahrt wird. Nach Trocknen bei Raumtemperatur wird die DNA in 25 μl Wasser suspendiert.
  • Phosphorylierung des Vektors
  • 25 μl des im vorangegangen Schritt hergestellten Vektors werden auf ein Endvolumen von 500 μl des folgenden Reaktionsgemisches verdünnt:
    Nach der Reparatur wird die DNA einer Phenol-Chloroform-Extraktion und einer Fällung unterzogen, das Pellet wird dann in 10 μl Wasser aufgenommen, die DNA wird durch Messen der optischen Dichte bei 260 nm quantifiziert. Die quantifizierte DNA wird in den durch das Restriktionsenzym EcoRV vorbereiteten und dephosphorylierten (siehe Herstellung des Vektors) Vektor PGEm-5Zf(+) ligiert. Die Ligation wird unter drei Bedingungen ausgeführt, die im Verhältnis der Anzahl der Vektormoleküle zur Anzahl der Insert-Moleküle variieren. Typischerweise werden ein äquimolares Verhältnis, ein Verhältnis von 1 : 3 und ein Verhältnis von 3 : 1 für die Ligationen verwendet, die darüber hinaus unter den folgenden Bedingungen ausgeführt werden: Vektor PGEm-5Zf(+) 25 ng, geschnittene DNA, Ligationspuffer in einem Endvolumen von 20 μl mit T4 DNA Ligase (Amersham E70042X); das Ganze wird dann über Nacht in einen Kühlschrank gestellt und dann werden eine Phenol-Chloroform-Extraktion und eine Fällung auf übliche Weise ausgeführt. Das Pellet wird in 5 μl Wasser aufgenommen.
  • Transformation der Bakterien
  • Ausplattieren der Bakterien
  • Petrischalen, die Ampizillin (50 μg/ml), Xgal (280 μg/ml) [5-Brom-4-chlor-indolyl-beta-D-galactopyranosid (Sigma B-4252)], IPTG (140 μg/ml) [Isopropyl-beta-D-thiogalactosid (Sigma 1-6758)] enthaltendes LB-Agarmedium enthalten, werden verwendet, 50 und 100 μl Bakterien werden für jede der Ligationen ausplattiert. Die Petrischalen werden bei 37 °C 16 Stunden lang umgekehrt in einen Ofen gestellt. Die Anzahl der „rekombinanten" positiven Klone wird durch Zählen der weißen Kolonien und der blauen Kolonien, von denen angenommen wird, dass sie den Vektor alleine enthalten, ausgewertet.
  • Auswerten der „rekombinanten" positiven Klone
  • Vierundneunzig weiße Kolonien und zwei blaue Kolonien werden mit Hilfe von sterilen Kegeln genommen und werden am Boden der Vertiefungen von Platten, die dazu bestimmt sind, die Amplifikationstechniken auszuführen, deponiert. 30 μl des folgenden Reaktionsgemisches werden zu jeder Vertiefung gegeben: 1,7 mM MgCl2, jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, zwei synthetische Oligonukleotide, die den Sequenzen entsprechen, welche die Klonierungsstelle auf beiden Seiten flankieren und die DNA-Synthese auf konvergente Weise orientieren (0,5 μM Primer RP und PU, 1 U TAQ-Polymerase (GibcoBRL 18038-026)).
  • Die so hergestellten Kolonien werden 5 min lang einer Temperatur von 94 °C und dann 30 thermischen Zyklen unterzogen, die aus den folgenden Schritten bestehen: 40 s lang 94 °C, 30 s lang 50 °C, 180 s lang 72 °C. Die Reaktion wird dann 7 min lang bei 72 °C gehalten und dann bei 4 °C gehalten.
  • Die Amplifikationsprodukte werden auf einem Agarosegel (0,8%) deponiert, mit Ethidiumbromid gefärbt, einer Elektrophorese unterzogen und dann auf einem Ultraviolett-Tisch analysiert. Die Anwesenheit eines Amplifikationsfragments mit einer Größe von mehr als 500 Basenpaaren zeigt die Anwesenheit eines Inserts an. Die Bakterienklone werden dann hergestellt, um die Sequenz ihres Inserts zu untersuchen.
  • Sequenzieren
  • Um die Inserts der wie vorstehend erhaltenen Klone zu sequenzieren, wurden diese durch PCR an Bakterienkulturen amplifiziert, die über Nacht unter Verwendung der die Inserts flankierenden Primer für die Vektoren ausgeführt wurde. Die Sequenz an den Enden dieser Inserts (im Durchschnitt 500 Basen auf jeder Seite) wurde durch automati siertes Fluoreszenz-Sequenzieren auf einem ABI 377 Sequenziergerät, das mit der ABI Prism DNA Sequenzieranalysesoftware (Version 2.1.2) ausgestattet ist, bestimmt.
  • Analyse der Sequenzen
  • Die durch Sequenzieren in einem Ablauf mit hoher Ausbeute erhaltenen Sequenzen (1) werden in einer Datenbank aufbewahrt; dieser Teil der Herstellung ist unabhängig von jedweder Behandlung der Sequenzen. Die Sequenzen werden aus der Datenbank extrahiert, wobei alle Regionen mit inadäquater Qualität vermieden werden, das heißt, die Regionen, für die Unsicherheiten auf der Sequenz von mehr als 95% beobachtet werden. Nach der Extraktion werden die Sequenzen in einen Verarbeitungsablauf eingeführt, dessen Diagramm in 2 beschrieben wird. In einem ersten Weg dieses Verarbeitungsablaufs werden die Sequenzen durch die Gap4 Software von R. Staden (Bonfield et al., 1995) (OS UNIX/SUN Solaris) zusammengesetzt; die durch diese Software erhaltenen Ergebnisse werden in Form von zwei Dateien aufbewahrt, die für anschließendes Verarbeiten verwendet werden. Die erste dieser Dateien stellt Information über die Sequenz von jedem der erhaltenen Contigs bereit. Die zweite Datei stellt alle Klone, die an der Zusammensetzung aller Contigs teilhaben sowie ihre Positionen auf den entsprechenden Contigs dar.
  • Der zweite Verarbeitungsweg verwendet einen Sequenzassembler (TIGR-Asmg Assembler UNIX/SUN Solaris); die Ergebnisse dieses zweiten Verarbeitungswegs werden in Form einer Datei im Format TIGR-Asmg aufbewahrt, die eine Information über das Verhältnis, das zwischen den Sequenzen existiert, die für das Zusammensetzen ausgewählt wurden, bereitstellt. Dieser Assembler ist manchmal nicht fähig, Contigs, deren Enden über einige hundert Basenpaare hinweg überlappen, zu verbinden.
  • Die von diesen zwei Assemblern erhaltenen Ergebnisse werden mit Hilfe des BLAST-Programms verglichen, wobei jedes von einem Zusammensetzungs-Weg abgeleitete Contig mit den von einem anderen Weg abgeleiteten Contigs verglichen wird.
  • Für die beiden Verarbeitungswege werden die genauen Zusammensetzungsparameter fixiert (95% Homologie, 30 Überlagerungsnukleotide). Diese Parameter vermeiden, dass 3 bis 5% der Klone, die aus eukaryotischen Zellen abgeleitet wurden, mit Sequenzen, die von den aus Chlamydia pneumoniae abgeleiteten Klonen erhalten wurden, verwechselt werden. Die eukaryotischen Sequenzen werden allerdings während des Verlaufs dieses Projekts aufbewahrt; die eingeführte Strategie, die nachstehend beschrieben wird, wird unter anderem dazu bestimmt sein, nicht durch diese von kontaminierenden Klonen abgeleiteten Sequenzen behindert zu werden.
  • Die Ergebnisse von diesen zwei Assemblern werden in einer für dieses Projekt entwickelten Software verarbeitet. Diese Software arbeitet auf einer Windows NT Platt form und erhält als Daten die Ergebnisse, die von der STADEN-Software abgeleitet sind und/oder die Ergebnisse, die vom TIGR-Asmg-Assembler abgeleitet sind, die Software führt nach dem Verarbeiten der Daten zur Bestimmung einer Zusammensetzungskarte, welche das Näheverhältnis und die Orientierung der Contigs in Beziehung zueinander angibt (3a). Unter Verwendung dieser Zusammensetzungskarte bestimmt die Software alle Primer, die für das Beenden des Projekts benötigt werden. Diese Behandlung, auf welche nachstehend näher eingegangen wird, hat den Vorteil, die isolierten Sequenzen, die durch die DNA eukaryotischer Zellen aus den Kontaminationen abgeleitet sind, von den Sequenzen mit kleiner Größe, die durch die Verhältnisse, die sie mit den Contigs etablieren, klar in das Projekt integriert sind, zu unterscheiden. Um das Arrangement und die Orientierung der Contigs in Beziehung zueinander ohne jegliches Fehlerrisiko zu ermöglichen, wird eine statistische Auswertung der Genauigkeit der Namen (Benennung) „Benennung" der Sequenz aus den Ergebnissen des „Erstellens von Contigs" gemacht. Diese Auswertung macht es möglich, jeder der Klonplatten, sowie jedem Subset der Platten ein Gewicht zu geben, das zur wahrscheinlichen Fehlerrate, die beim „Benennen" der von dieser Platte oder einem Subset dieser Platte erhaltenen Sequenzen existiert, umgekehrt proportional ist. Trotz einer niedrigen Fehlerrate können Fehler während aller Herstellungsschritte der Klone und der Sequenzen auftreten. Diese Schritte sind zahlreich, repetitiv und obwohl die meisten von ihnen automatisiert sind, sind andere, wie das Hinterlegen in den Sequenziergeräten, manuell; es ist dann möglich, dass der Operator Fehler macht, wie zum Beispiel die Umkehrung von zwei Sequenzen. Dieser Fehlertyp hat eine Auswirkung auf das anschließende Verarbeiten der Daten, indem es zu Beziehungen (zwischen den Contigs), die in der Realität nicht existieren, dann zu Versuchen direkt zu sequenzieren führt, die in einem Fehlschlag enden. Deswegen ist die Auswertung der Benennungsfehler von besonderer Wichtigkeit, da sie das Etablieren einer wahrscheinlichkeitstheoretischen Zusammensetzungskarte ermöglicht, von der aus es möglich wird, all die Klone zu bestimmten, die als Matrize für das Erhalten von Sequenzen dienen, welche zwei benachbarte Contigs trennen. Die Tabelle 2 der Vorgänger-US-Anmeldung mit der Ser. No. 60/107.078, eingereicht am 4. Nov. 1998, und der französischen Anmeldung 97-14673, eingereicht am 21. Nov. 1997, gibt die Klone und die Sequenzen der anfänglich während der anfänglichen Arbeitschritte verwendeten Primer an.
  • Um den Schritt, der aus dem Bestellen und dann Herstellen der Klone durch übliche mikrobiologische Mittel besteht, zu vermeiden, werden äußere und innere Primer, die in Richtung der noch nicht sequenzierten Regionen gerichtet sind, durch die Software definiert. Die so bestimmten Primer machen es möglich, eine Matrize, welche die nicht sequenzierte Region abdeckt, durch PCR zu erzeugen. Es sind die sogenannten äußeren Primer (diejenigen, die von der zu sequenzierenden Region am weitesten entfernt sind), die verwendet werden, um diese Matrize zu erzeugen. Die Matrize wird dann gereinigt und von jedem der zwei Stränge wird während 2 Sequenzierreaktionen eine Sequenz erhalten, die je einen der 2 inneren Primer verwenden. Um die Verwendung dieses Ansatzes zu erleichtern, werden die zwei äußeren und die zwei inneren Primer hergestellt und dann auf der gleichen Position von vier unterschiedlichen Platten mit 96 Vertiefungen aufbewahrt. Die beiden die äußeren Primer enthaltenden Platten werden verwendet, um die PCRs durchzuführen, die zum Herstellen der Matrizen dienen werden. Diese Matrizen werden auf Reinigungssäulen, welche die Topographie der Platten konservieren, gereinigt. Jede der Sequenzen wird unter Verwendung von Primern, die sich auf einer und dann auf der anderen der die inneren Primer enthaltenden Platten befinden, erhalten werden. Diese Verteilung ermöglicht eine sehr ausgedehnte Automatisierung des Vorgangs und führt zu einem Verfahren, das für das Beenden der noch nicht sequenzierten Regionen einfach zu verwenden ist. Die Tabelle 3 der Vorgänger-US-Anmeldung mit der Ser. No. 60/107.078, eingereicht am 4. Nov. 1998, und der französischen Anmeldung 97-14673, eingereicht am 21. Nov. 1997, gibt die Namen und die Sequenzen der zum Beenden von Chlamydia pneumoniae verwendeten Primer an.
  • Schließlich existieren etliche Contigs in einer Konfiguration, wo eines ihrer Enden nicht durch eine verbindende Klonbeziehung mit einem anderen Contigende verbunden ist (3b) (ein verbindender Klon ist als Klon mit einem Sequenzende auf einem Contig und dem anderen Ende seiner Sequenz auf einem anderen Contig definiert; darüber hinaus muss dieser Klon von einer Platte oder einem Subset von Platten mit einer adäquaten Benennungsqualität abgeleitet sein). Für das Chlamydia pneumoniae Projekt fand dieser besondere Fall 24 Mal statt. Zwei benachbarte PCR-Primer, welche die Synthese der DNA in Richtung des Endes der Konsensussequenz orientieren, werden für jedes der verwaisten Enden der Konsensussequenz definiert. Der Primer, der dem Ende der Sequenz am nächsten ist, wird der innere Primer genannt, wohingegen der Primer, der vom Ende der Sequenz weiter entfernt ist, der äußere Primer genannt wird. Die äußeren Primer werden verwendet, um die gegenseitige Beziehung zwischen den verwaisten Enden der unterschiedlichen Contigs zu erforschen. Die Anwesenheit eines einzigen PCR-Produkts und die Möglichkeit, dieses Produkt unter Verwendung der inneren Primer eindeutig zu amplifizieren, ruft die wahrscheinliche Beziehung zwischen den Contigs, auf denen sich die Primer befinden, welche die Amplifikation ermöglichten, wach. Diese Beziehung wird durch Sequenzieren bestätigt und wird die Verbindung zwischen den verwaisten Enden der Konsensussequenzen ermöglichen. Diese Strategie hat es möglich gemacht, eine vollständige Karte des Chlamydia pneumoniae Chromosoms zu erhalten und dann das Projekt zu beenden.
  • Qualitätskontrolle
  • Alle Basen, die nicht mit Sicherheit in der chromosomalen Sequenz bestimmt wurden, wurden angegeben und die Unsicherheitendichte wurde auf dem gesamten Chromosom gemessen. Die Regionen mit einer hohen Unsicherheitendichte wurden angegeben und die PCR-Primer, welche diese Regionen umspannen, wurden herausgezogen und werden in Tabelle 4 der Vorgänger-US-Anmeldung mit der Ser. No. 60/107.078, eingereicht am 4. Nov. 1998, und der französischen Anmeldung 97-14673, eingereicht am 21. Nov., 1997, dargestellt.
  • Die Sequenz von jedem der PCR-Produkte wurde mit zwei funktionellen Primern, die sich von den Amplifikationsprimern unterscheiden, erhalten. Die Sequenzen wurden für alle PCRs in beiden Richtungen erhalten (100% Erfolg).
  • Datenbanken
  • Lokale Reorganisationen der öffentlichen Hauptbanken wurden verwendet. Die verwendete Proteinbank besteht aus der nichtredundanten Fusion der Genpept-Bank (automatisierte Translation von GenBank, NCBI; Benson et al., 1996).
  • Die gesamte BLAST Software (öffentliche Domäne, Altschul et al., 1990) zum Durchsuchen auf Homologien zwischen einer Sequenz- und einer Protein- oder Nukleindatenbank wurde verwendet. Die verwendeten Signifikanzniveaus hängen von der Länge und der Komplexität der getesteten Region sowie von der Größe der Referenzbank ab. Sie wurden auf jede Analyse eingestellt und angepasst.
  • Die Ergebnisse der Homologiesuche zwischen einer erfindungsgemäßen Sequenz und Protein- oder Nukleindatenbanken werden in der nachstehenden Tabelle 1 vorgelegt und zusammengefasst.
  • Tabelle 1: Liste kodierender Chromosomenregionen und Homologien zwischen diesen Regionen und den Sequenzbanken.
  • Legende zu Tabelle 1: Offene Leserahmen werden mit der GenMark Software Version 2.3A (GenePro) identifiziert, die verwendete Matrize ist Chlamydia pneumoniae der Ordnung 4 über eine Länge von 196 Nukleotiden mit einem Fenster von 12 Nukleotiden und einem minimalen Signal von 0,5. Die Leserahmen ORF2 bis ORF 1137 sind in der Reihenfolge ihrer Erscheinung auf dem Chromosom nummeriert, wobei von ORF2 (Spalte ORF) ausgegangen wird. Die Positionen des Anfangs und des Endes werden dann in der Spalte 2 (Position) angegeben. Wenn die Position des Anfangs größer als die Position des Endes ist bedeutet dies, dass die Region durch den zu der Sequenz, die in der Sequenz SEQ ID No. 1 angegeben wurde, komplementären Strang kodiert wird.
  • Alle mutmaßlichen Produkte wurden einer Suche auf Homologien auf GENPEPT (Veröffentlichung 102 für ORF No. 2 bis ORF No. 1137 und Veröffentlichung 108 für ORF No. 1138 bis ORF No. 1291 und ORF No. 6844 bis ORF No. 6849) mit der BLASTP-Software (Altschul et al. 1990) unterzogen. Mit den Standardparametern als Parameter, mit Ausnahme des erwarteten Werts E, eingestellt auf 10–5 (für ORF No. 2 bis ORF No. 1137) und des P-Werts, eingestellt auf e–10 (für ORF No. 1138 bis ORF No. 1291 und ORF No. 6844 bis ORF No. 6849). Anschließend wurden nur die Identitäten, die größer als 30% waren (Spalte I%), in Betracht gezogen. Die Beschreibung der homologsten Sequenz wird in der Spalte Homologie angegeben; das Identifikationszeichen für letztere Sequenz wird in der Spalte ID angegeben und die Tierart, zu welcher diese Sequenz gehört, wird in der Spalte Art angegeben. Die Homologie-Punktezahl wird durch die Summe der Blast-Punktezahlen für jede Homologieregion ausgewertet und in der Spalte Punktezahl angezeigt.
  • Materialien und Verfahren für Transmembrandomänen:
  • Die DAS-Software wurde wie von den Autoren empfohlen verwendet (Cserzo et al., 1997).
  • Dieses Verfahren verwendet, um die Transmembrandomänen vorherzusagen, Matrizen, die von einer Stichprobe ausgewählter Proteine abgeleitet sind. Alle Regionen, für die durch das Programm eine „Abgrenzung" von größer als 1,5 festgestellt wurde, wurden in Betracht gezogen.
  • Zusätzliche Programme zum Finden von ORFs
  • Für diese Analyse wurden zwei zusätzliche Programme zum Finden von ORFs verwendet, um potenzielle offene Leserahmen mit einer minimalen Länge von 74 Aminosäuren vorherzusagen; Glimmer (Salzberg, S. L., Delcher, A., Kasif, S. und W. White, 1998, Microbial gene identification using interpolated Markov models. Nucleic Acids Res. 26: 544–548) und ein betriebsintern geschriebenes Programm. Das betriebsinterne Programm verwendete einen sehr einfachen Suchalgorithmus. Die Analyse erforderte, dass der genomische DNA-Sequenztext in der 5' zu 3' Richtung sein soll, das Genom zirkulär ist, und dass TAA, TAG und TGA Stopp-Kodons sind. Die Suchparameter waren wie folgt:
    • (1) Eine Suche nach einem ORF, der mit einem GTG-Kodon startete, wurde durchgeführt. Falls keine GTG-Kodons gefunden wurden, wurde dann eine Suche nach einem ATG-Kodon durchgeführt. Allerdings wurde, falls ein GTG-Kodon gefunden wurde, dann stromabwärts eine Suche nach einem ATG-Kodon durchgeführt. Alle Positionen der Start- und Stoppnukleotide wurden aufgezeichnet.
    • (2) Eine Suche nach einem ORF, der mit einem TTG-Kodon startete, wurde durchgeführt. Falls keine TTG-Kodons gefunden wurden, wurde dann eine Suche nach einem ATG-Kodon durchgeführt. Allerdings wurde, falls ein TTG-Kodon gefunden wurde, dann stromabwärts eine Suche nach einem ATG-Kodon durchgeführt. Alle Positionen der Start- und Stoppnukleotide wurden aufgezeichnet.
    • (3) Die in den Schritten 1 und 2 beschriebenen Analysen wurden für den entgegengesetzten Strang der DNA-Sequenz wiederholt.
    • (4) Eine Suche nach ORFs, die alle ORF-Längen unter Verwendung der Start- und Stoppp-Positionen in den gleichen Leserahmen bestimmte, wurde durchgeführt.
    • (5) Alle ORFs, deren DNA-Länge weniger als 225 Nukleotide war, wurden aus der Suche entfernt.
  • Suchkriterien für der Oberfläche ausgesetzte Proteine
  • Potenzielle Zelloberflächen-Impfstoffziele sind Proteine der äußeren Membran wie zum Beispiel Porine, Lipoproteine, Adhäsions- und andere nicht eingebaute Proteine. In Chlamydia psittaci sind die Hauptimmunogene eine Gruppe von mutmaßlichen Proteinen der äußeren Membran (POMPs) und durch eine traditionelle Analyse sind keine Homologien in Chlamydia pneumoniae und Chlamydia trachomatis gefunden worden (Longbottom, D., Russell, M., Dunbar, S. M., Jones, G. E. und A. J. Herring. 1998. Molecular Cloning and Characterization of the Genes Coding for the Highly Immunogenic Cluster of 90-Kilodalton Envelope Proteins from Chlamydia psittaci Subtype That Causes Abortion in Sheep. Infect Immun 66: 1317–1324). Einige mutmaßliche Proteine der äußeren Membran sind in Chlamydia pneumoniae identifiziert worden, die alle Impfstoffkandidaten darstellen können. Das Gen für das Hauptprotein der äußeren Membran (MOMP) (omp1) ist in verschiedenen Isolaten von Chlamydia pneumoniae gefunden worden (Jantos, CA., Heck, S., Roggendorf, R., Sen-Gupta, M. und Hegemann, JH. 1997. Antigenic and molecular analyses of different Chlamydia pneumoniae strains. J. Clin Microbiology 35(3): 620–623.) Verschiedene Kriterien, wie nachstehend aufgelistet, wurden zum Identifizieren mutmaßlicher ORFs, die der Oberfläche ausgesetzt sind, aus der genomischen DNA-Sequenz von Chlamydia pneumoniae (französische Anmeldung 97-14673, eingereicht am 21. Nov. 1997) verwendet. Jedweder ORF, der einem oder mehreren einzelnen Kriterien entsprach, wurde in dieser Kategorie aufgelistet.
  • Proteinhomologiesuchen wurden unter Verwendung des Blastp 2.0 Hilfsprogramms (Altschul, S. F., Madden, T.L., Schaffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. und D. J. Lipman. 1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) getätigt. Ein ORF-Produkt wurde als der Oberfläche ausgesetzt markiert, falls es eine Homologie zu einem bekannten oder hypothetischen oder mutmaßlichen der Oberfläche ausgesetzten Protein mit einer besseren P-Punktezahl als e–10 gab.
  • Die meisten, wenn nicht alle Proteine, die über einen Sekretionssignalweg an der Bakterienmembran lokalisiert werden, enthalten ein Signalpeptid. Ein Softwareprogramm, SignalP, analysiert die Aminosäuresequenz eines ORFs auf ein deratiges Signalpeptid hin (Nielsen, H., Engelbrecht. J., Brunak, S. und G. von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Engineering 10: 1–6.) Die ersten 60 N-terminalen Aminosäuren von jedem ORF wurden unter Verwendung der Gram-Negative Software Datenbank durch SignalP analysiert. Die Ausgabe erzeugt vier getrennte Werte: Maximales C, maximales Y, maximales S und mittleres S. Die S-Punktezahl, oder Signalregion, ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Position zum Signalpeptid gehört. Die C-Punktezahl, oder Spaltungsstelle, ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Position im reifen Protein die erste ist. Die Y-Punktezahl ist der geometrische Mittelwert der C-Punktezahl und eines geglätteten Derivats der S-Punktezahl. Ein Ergebnis von entweder Ja oder Nein wird neben jeder Punktezahl angegeben. Falls alle vier Ergebnisse Ja sind und die C-terminale Aminosäure entweder ein Phenylalanin (F) oder ein Tyrosin (Y) ist, wurde das ORF-Produkt als eines der äußeren Membran markiert (Struyve, M., Moons, M. und J. Tommassen. 1991. Carboxy-terminal Phenylalanine is Essential for the Correct Assembly of a Bacterial Outer Membrane Protein. J. Mol. Biol. 218: 141–148.) Das Psort genannte Programm bestimmt die Lokalisierung eines Proteins, beruhend auf seiner Signalsequenz, der Erkennung von Transmembransegmenten und der Analyse seiner Aminosäurezusammensetzung (Nakai, K. und M. Kanehisa. 1991. Expert system for predicting protein localization sites in gram-negative bacteria. Proteins 11: 95– 110). Ein ORF-Produkt wird als ein Protein der äußeren Membran betrachtet, falls die Ausgabedaten das Protein mit einem Sicherheitswert von 0,5 oder besser als eines der äußeren Membran vorhersagen und sein Wert mindestens zweimal so groß ist wie der nächste vorhergesagte lokalisierte Sicherheitswert.
  • Schließlich wurden ORF-Produkte, von denen, beruhend auf den vorstehenden Kriterien, nicht vorhergesagt wurde, dass sie zur äußeren Membran gehören oder der Oberfläche ausgesetzt sind, weiter analysiert. Die blastp Ausgabedaten für diese ORFs wurden unter Verwendung verschiedener allgemeiner und spezifischer Schlüsselwörter, die auf bekannte der Zelloberfläche ausgesetzte Proteine hindeuten, durchsucht. Ein ORF wurde als der Oberfläche ausgesetzt markiert, falls die passenden Schlüsselwörter einen Blastp Treffer ergaben, eine P-Punktezahl von besser als e–10 hatten und es keine besseren Daten gab, die anderweitiges anzeigten. Das Folgende ist eine Liste der durchsuchten Schlüsselwörter:
    Figure 00800001
  • Jene ORFs, welche der minimalen Erfordernis für ein Protein der äußeren Membran, beruhend auf den vorstehenden Suchkriterien, nicht entsprachen, die aber zu identifizierten ORFs der äußeren Membran bei Chlamydia trachomatis homolog waren, wurden eingeschlossen. Das Genom von Chlamydia trachomatis (französische Patentanmeldungen FR97-15041, eingereicht am 28. Nov. 1997, und 97-16034, eingereicht am 17. Dez. 1997) wurde unter Verwendung der vorstehenden Suchkriterien analysiert und etliche ORFs der äußeren Membran wurden identifiziert. Diese ORFs von Chlamydia trachomatis wurden dann unter Verwendung von Blastp gegen das Genom von Chlamydia pneumoniae getestet. Jedweder ORF von Chlamydia pneumoniae mit einem Blastp P-Wert von besser als e–10 gegen eine äußere Membran von Chlamydia trachomatis wurde in diesen Abschnitt eingeschlossen, falls es keine besseren Daten gab, die anderweitiges anzeigten. Eine Liste der ORFs im Genom von Chlamydia pneumoniae, die mutmaßliche der Oberfläche ausgesetzte Proteine kodieren, wird vorstehend in der Beschreibung dargelegt.
  • Identifikation von mutmaßlichen Lipoproteinen im Genom von Chlamydia pneumoniae
  • Bei Lipoproteinen handelt es sich um die am weitesten verbreiteten post-translational modifizierten bakteriellen sekretorischen Proteine (Pugsley, A. P. 1993. The complete general secretory pathway in Gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50– 108). Die kennzeichnenden Merkmale von Lipoproteinen sind ein Thiol-verbundenes Diacylglycerid und eine Amin-verbundene Monoacylgruppe an dem Cystein, das nach der Signalpeptidabspaltung durch Signal-Peptidase II zum aminoterminalen Rest wird (Pugsley, A. P. 1993. The complete general secretory pathway in Gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50–108). Die Identifikation von mutmaßlichen Lipoproteinen aus dem genomischen Sequenzieren von Chlamydia pneumoniae wurde durch Prüfen der hergeleiteten Aminosäuresequenz von identifizierten ORFs auf die Anwesenheit eines Signalpeptids mit einer Signal-Peptidase II Spaltungsstelle, die zur Konsensussequenz für Pro-Lipoproteinmodifikation und Prozessierreaktionen analog ist, getätigt (Hayashi, S. und H. C. Wu. 1992, Identification and characterization of lipid-modified proteins in bacteria, S. 261–285. In N. M. Hooper und A. J. Turner (Herausg.) Lipid modification of proteins: A practical approach. Oxford University Press, New York; Sutcliffe, I. C. und R. R. B. Russell. 1995. Lipoproteins of Gram-positive bacteria. J. Bacteriol. 177: 1123–1128).
  • ORFs von Chlamydia pneumoniae wurden anfänglich auf das grundlegendste Kennzeichen von Lipoproteinen hin durchgemustert, ein Cystein in den ersten 30 Aminosäuren des hergeleiteten Proteins. ORFs mit einem Standard-Startkodon (ATG, GTG oder TTG) und mit einem oder mehreren der folgenden Kennzeichen wurden für die direkte Analyse ihrer ersten 30 Aminosäuren ausgewählt:
    • (a) ein signifikanter P-Signal-Wert (mindestens zwei der vier Werte sind Ja),
    • (b) ein PSORT-Wert, der eine Membranpassage anzeigt (IM – innere Membran, Peri – Periplasma oder OM – äußere Membran),
    • (c) Identifikation des Wortes Lipoprotein im blastp Datensatz des ORFs,
    • (d) ein Blastp-Wert von < e–10 mit einem mutmaßlichem Lipoprotein von Chlamydia trachomatis (französische Anmeldungen 97-15041, eingereicht am 28. Nov. 1997, und 97-16034, eingereicht am 17. Dez. 1997).
  • Die ersten 30 Aminosäuren von jedem ORF in diesem Set wurden auf die üblicherweise bei Lipoproteinsignalpeptiden gefundenen Kennzeichen hin analysiert (Pugsley, A. P. 1993. The complete general secretory pathway in Gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50–108; Hayashi, S. und H. C. Wu. 1992, Identification and characterization of lipid-modified proteins in bacteria, S. 261–285. in N. M. Hooper und A. J. Turner (Herausg.) Lipid modification of proteins: A practical approach. Oxford University Press, New York; Sutcliffe, I. C. und R. R. B. Russell. 1995. Lipoproteins of Grampositive bacteria. J. Bacteriol. 177: 1123–1128). Von mutmaßlichen Lipoproteinsignalpeptiden war erforderlich, dass sie ein Cystein zwischen Aminosäure 10 und 30 hatten und dass sie eine minimale Punktezahl von drei, beruhend auf den folgenden Kriterien für Lipoproteinsignalpeptide, erreichten:
    • (a) Identifikation von spezifischen Aminosäuren an spezifischen Positionen rund um das Cystein, die Teil der Konsensusspaltungsstelle der Signal-Peptidase II sind (Hayashi, S. und H. C. Wu. 1992, Identification and characterization of lipidmodified proteins in bacteria, S. 261–285. In N. M. Hooper und A. J. Turner (Herausg.) Lipid modification of proteins: A practical approach. Oxford University Press, New York; Sutcliffe, I. C. und R. R. B. Russell. 1995. Lipoproteins of Grampositive bacteria. J. Bacteriol. 177: 1123–1128). Da die Identifikation der Spaltungsstelle der wichtigste Faktor beim Identifizieren von mutmaßlichen Lipoproteinen ist, trug jede korrekt positionierte Aminosäure zum Erreichen der minimalen Punktezahl von drei bei.
    • (b) Eine hydrophobe Region, die vor der Spaltungsstelle reich an Alanin und Leucin ist (Pugsley, A. P. 1993. The complete general secretory pathway in Gramnegative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50–108), trug zum Erreichen der minimalen Punktezahl von drei bei.
    • (c) Eine kleine Strecke hydrophiler Aminosäuren größer oder gleich 1, normalerweise Lysin oder Arginin, nach dem N-terminalen Methionin (Pugsley, A. P. 1993. The complete general secretory pathway in Gram-negative bacteria. Microbiol. Rev. 57: 50–108), trug zum Erreichen der minimalen Punktezahl von drei bei.
  • Eine Liste von ORFs im Genom von Chlamydia pneumoniae, die mutmaßliche Lipoproteine kodieren, wird vorstehend in der Beschreibung dargelegt.
  • Mit LPS verwandte ORFs von Chlamydia pneumoniae
  • Lipopolysaccharid (LPS) ist ein wichtiges Hauptoberflächenantigen von Chlamydienzellen. Gegen LPS von Chlamydia pneumoniae gerichtete monoklonale Antikörper (Mab) sind identifiziert worden, welche die Infektivität von Chlamydia pneumoniae sowohl in vitro als auch in vivo neutralisieren können (Peterson, E. M., de la Maza, L. M., Brade, L., Brade, H. 1998. Characterization of a Neutralizing Monoclonal Antibody Directed at the Lipopolysaccharide of Chlamydia pneumonia. Infect. Immun. Aug. 66(8): 3848–3855). LPS von Chlamydien besteht aus Lipid A und einem Core-Oligosaccharidteilstück und ist phänotypisch vom Rough-Typ (R-LPS) (Lukacova, M., Baumann, M., Brade, L., Mamat, U., Brade, H. 1994. Lipopolysaccharide Smooth-Rough Phase Variation in Bacteria of the Genus Chlamydia. Infect. Immun. June 62(6): 2270–2276). Die Lipid-A-Komponente ist aus Fettsäuren zusammengesetzt, die zum Verankern von LPS in der äußeren Membran dienen. Die Core-Komponente enthält Zucker und Zuckerderivate wie zum Beispiel ein Trisaccharid von 3-Desoxy-D-manno octulosonsäure (KDO) (Reeves, P. R., Hobbs, M., Valvano, M.A., Skumik, M., Whitfield, C., Coplin, D., Kido, N., Klena, J., Maskell, D., Raetz, C. R. H., Rick, P. D. 1996. Bacterial Polysaccharide Synthesis and Gene Nomenclature S. 10071–10078, Elsevier Science Ltd.). Das KDO-Genprodukt ist eine multifunktionelle Glycosyltransferase und stellt ein geteiltes Epitop unter den Chlamydien dar. Für einen Review der LPS-Biosynthese siehe z. B. Schnaitman, C. A., Klena, J. D. 1993. Genetics of Lipopolysaccharide Biosynthesis in Enteric Bacteria. Microbiol. Rev. 57: 655–682.
  • Eine Textsuche der blastp Ergebnisse der ORFs identifizierte mehrere Gene, die an der LPS-Produktion durch Chlamydia beteiligt sind, mit einer P-Punktezahl, die besser als e–10 ist. Die folgenden Schlüsselbegriffe wurden in der Textsuche verwendet: KDO, CPS (Biosynthese eines kapselförmigen Polysaccharids), Kapsel, LPS, rfa, rfb, rfc, rfe, rha, rhl, Core, Epimerase, Isomerase, Transferase, Pyrophosphorylase, Phosphatase, Aldolase, Heptose, Manno, Glucose, IpxB, Fibronectin, Fibrinogen, Fucosyltransferase, lic, lgt, pgm, tolC, rol, ChoP, Phosphorylcholin, waaF, PGL-Tb1. Eine Liste von ORFs im Genom von Chlamydia pneumoniae, die mutmaßliche an der LPS-Biosynthese beteiligte Polypeptide kodieren, wird in der Beschreibung dargelegt.
  • Sezernierte Produkte des Typs III und andere
  • Die Typ III Sekretion ermöglicht Gram-negativen Bakterien, Pathogenitätsproteine zu sezernieren und in das Zytosol eukaryotischer Wirtszellen zu injizieren (Hueck, C. J., 1998. Type III Protein Secretion Systems in Bacterial Pathogens of Animals and Plants. In Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62: 379–433). Diese sezernierten Faktoren ähneln häufig eukaryotischen Signalübertragungsfaktoren, die somit dem Bakterium ermöglichen, Wirtszellfunktionen umzulenken (Lee, C. A., 1997. Type III secretion systems: machines to deliver bacterial proteins into eukaryotic cells? Trends Microbiol. 5: 148–156). Bei einem Versuch, normale Zellfunktionen zu beschädigen, werden Pathogenitätsfaktoren von Chlamydia, die in das Cytosol des Wirts injiziert sind, nichtsdestotrotz als cytoplasmatische Bestandteile prozessiert und im Zusammenhang des Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC Klasse I) präsentiert. Als solches stellen diese Pathogenitätsproteine Antigene der MHC Klasse I dar und spielen eine wichtige Rolle bei der zellulären Immunität. Auch in diesem Set eingeschlossen sind sezernierte Produkte, die nicht vom Typ III sind, die eine Rolle als Impfstoffkomponenten spielen können.
  • Eine Textsuche der blastp Ergebnisse der ORFs identifizierte Gene, die an der Proteinsekretion von Chlamydia pneumoniae beteiligt sind, mit einer P-Punktezahl, die besser als e–10 ist. Die folgenden Schlüsselbegriffe wurden in der Textsuche bei der Bemühung verwendet, an der Oberfläche lokalisierte oder sezernierte Produkte zu identifizieren: Yop, Lcr, Ypk, Exo, Pcr, Pop, Ipa, Vir, Ssp, Spt, Esp, Tir, Hrp, Mxi, Hämolysin, Toxin, IgA Protease, Cytolysin, tox, hap, sezerniert und Mip.
  • ORFs von Chlamydia pneumoniae, welche die vorstehenden Schlüsselwort-Suchkriterien nicht erfüllten, aber in Chlamydia trachomatis Homologe haben, welche die Suchkriterien erfüllen, werden hierin eingeschlossen. Das Genom von Chlamydia trachomatis (französische Patentanmeldungen FR97-15041, eingereicht am 28. Nov. 1997, und 97-16034, eingereicht am 17. Dez. 1997) wurde unter Verwendung der vorstehenden Suchkriterien analysiert und etliche ORFs wurden identifiziert. Diese ORFs von Chlamydia trachomatis wurden unter Verwendung von Blastp gegen das Genom von Chlamydia pneumoniae getestet. Jedweder ORF von Chlamydia pneumoniae mit einem Blastp P-Wert < e–10 gegen ein Homolog von Chlamydia trachomatis, der unter Verwendung der vorstehenden Suchkriterien identifiziert wurde, wurde eingeschlossen. Eine Liste von ORFs im Genom von Chlamydia pneumoniae, die mutmaßliche sezernierte Proteine kodieren, befindet sich in der Beschreibung.
  • Chlamydia pneumoniae: RGD-Erkennungssequenz
  • Proteine, die eine Arg-Gly-Asp (RGD) Anlagerungsstelle enhalten, machen zusammen mit Integrinen, die als deren Rezeptor dienen, ein Haupterkennungssystem für die Zelladhäsion aus. Die RGD-Sequenz ist die Zellanlagerungsstelle einer großen Anzahl von Proteinen der adhäsiven extrazellulären Matrix, des Blutes und der Zelloberfläche und beinahe die Hälfte der bekannten Integrine erkennt diese Sequenz bei ihren Adhäsionsproteinliganden. Es gibt viele RGD-enthaltende mikrobielle Proteine, wie zum Beispiel das Pentonprotein von Adenovirus, dem Coxsackievirus, dem Maul- und Klauenseuchevirus, und Pertactin, ein Oberflächenprotein von Bordetella pertussis mit 69 kDa (Kilodalton), die als Liganden dienen, durch die diese Mikroben an Integrine auf den Zelloberflächen binden und Zugang in die Zelle gewinnen. Das Folgende stellt Hinweise bereit, welche die Wichtigkeit von RGD bei der mikrobiellen Adhäsion unterstützen:
    • a) Das Pentonbasisprotein aus Adenovirus hat eine Zellabrundungsaktivität und wenn die Pentonbase in E. coli exprimiert wurde, verursachte sie eine Zellabrundung und Zellen hafteten an Polystyrolvertiefungen, die mit dem Protein beschichtet waren, an. Eine Mutantenanalyse zeigte, dass diese beiden Eigenschaften eine RGD-Sequenz erforderten. Virusmutanten mit Aminosäuresubstitutionen in der RGD-Sequenz zeigten eine viel geringere Anhaftung an HeLa S3-Zellen und waren auch bei der Virusreproduktion verzögert (Bai, M., Harte, B. und Freimuth, P. 1993. Mutations That Alter an RGD Sequence in the Adenovirus Type 2 Penton Base Protein Abolish Its Cell-Rounding Activity and Delay Virus Reproduction in Flat Cells. J. Virol. 67: 5198–5205).
    • b) Es ist gezeigt worden, dass Anlagerung und Eindringen von Coxsackievirus A9 in GMK-Zellen von einem RGD-Motiv im Capsidprotein VP1 abhängig waren. Von VP1 ist auch gezeigt worden, dass es αvβ3-Integrin, das ein Vitronectin-Rezeptor ist, bindet (Roivainen, M., Piirainen, L., Hovi, T., Virtanen, I., Riikonen, T., Heino, J. und Hyypia, T. 1994. Entry of Coxsackievirus A9 into Host Cells: Specific Interactions with αvβ3-Integrin, the Vitronectin Receptor. Virology, 203: 357–65).
    • c) Während des Verlaufs von Keuchhusten geht Bordetella pertussis mit alveolären Makrophagen und anderen Leukocyten auf dem respiratorischen Epithel eine Wechselwirkung ein. Ganze Bakterien haften mittels zweier Proteine, filamentösem Hämagglutinin (FHA) und Pertussistoxin, an. FHA geht mit zwei Klassen von Molekülen auf Makrophagen, Galactose enthaltenden Glycokonjugaten und dem Integrin CR3 eine Wechselwirkung ein. Die Wechselwirkung zwischen CR3 und FHA bezieht die Erkennung der RGD-Sequenz an den Positionen 1097–1099 in FHA ein (Relman, D., Tuomanen, E., Falkow, S., Golenbock, D. T., Saukkonen, K. und Wright, S. D. "Recognitition of a Bacterial Adhesin by an Integrin: Macrophage CR3 Binds Filamentous Hemagglutinin of Bordetella pertussis." Cell, 61: 1375–1382 (1990)).
    • d) Von Pertactin, einem Protein der äußeren Membran von Bordetella pertussis mit 69 kDa, ist gezeigt worden, dass es die Anlagerung von Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) fördert. Diese Anlagerung wird durch die Erkennung einer RGD-Sequenz in Pertactin durch Integrine auf CHO-Zellen vermittelt und kann durch ein synthetisches, RGD-enthaltendes Peptid, das zu dem in Pertactin vorliegenden homolog ist, inhibiert werden (Leininger, E., Roberts, M., Kenimer, J. G., Charles, I. G., Fairweather, N., Novotny, P. und Brennan, M. J. 1991. Pertactin, an Arg-Gly-Asp containing Bordetella pertussis surface protein that promotes adherence of mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 345–349).
    • e) Im VP1-Protein des Maul- und Klauenseuchenvirus (FMDV) ist die RGD-Sequenz hoch konserviert. Von der Anlagerung von FMDV an Baby-Hamster-Nierenzellen (BHK) ist gezeigt worden, dass sie durch das VP1-Protein über die RGD-Sequenz vermittelt wird. Antikörper gegen die RGD-Sequenz von VP1 blockierten die Anlagerung des Virus an BHK-Zellen (Fox, G., Parry, N. R., Barnett, P. V., McGinn, B., Rowland, D. J. und Brown, F. 1989. The Cell Attachment Site on Foot-and-Mouth Disease Virus Includes the Amino Acid Sequence RGD (Arginine-Glycine-Aspartic Acid) J. Gen. Virol., 70: 625–637).
  • Es ist demonstriert worden, dass bakterielles Anhaften auf der Wechselwirkung einer bakteriellen RGD-Sequenz von Adhesin mit einem Integrin beruhen kann und dass bakterielle Adhesine mehrere Bindungsstellen, die für eukaryotische extrazelluläre Matrixproteine kennzeichnend sind, haben können. RGD-Erkennung ist einer der wichtigen Mechanismen, der von Mikroben verwendet wird, um Zutritt in eukaryotische Zellen zu gewinnen.
  • Die vollständige hergeleitete Proteinsequenz des Genoms von Chlamydia pneumoniae wurde auf das Vorliegen der RGD-Sequenz durchsucht. Es gab insgesamt 54 ORFs, die eine oder mehrere RGD-Sequenzen hatten. Nicht alle RGD-enthaltenden Proteine vermitteln Zellanlagerung. Es ist gezeigt worden, dass RGD-enthaltende Peptide, die ein Prolin unmittelbar nach der RGD-Sequenz haben, in Zellanlagerungsassays inaktiv sind (Pierschbacher & Ruoslahti. 1987. Influence of stereochemistry of the sequence Arg-Gly-Asp-Xaa on binding specificity in cell adhesion. J. Biol. Chem. 262: 17294–98). ORFs, die eine RGD mit Prolin als der Aminosäure nach der RGD-Sequenz hatten, wurden von der Liste ausgeschlossen. Auch kann es sein, dass eine RGD-Sequenz nicht an der Oberfläche des Proteins zugänglich ist, oder sie kann in einem Zusammenhang vorliegen, der mit dem Binden von Integrin nicht kompatibel ist. Da nicht alle RGD-enthaltenden Protein an der Zellanlagerung beteiligt sind, wurden einige andere Kriterien zum Verfeinern der Liste der RGD-enthaltenden Proteine verwendet. Eine Liste von ORFs im Genom von Chlamydia pneumoniae, die Polypeptide mit (einer) RGD-Erkennungssequenz(en) kodieren, befindet sich in der Beschreibung.
  • ORFs, die nicht denen von Chlamydia trachomatis entsprechen ORFs von Chlamydia pneumoniae wurden mit den ORFs im Genom von Chlamydia trachomatis (französische Patentanmeldungen FR97-15041, eingereicht am 28. Nov. 1997, und 97-16034 eingereicht am 17. Dez. 1997) unter Verwendung von Blastp verglichen. Jedweder ORF von Chlamydia pneumoniae mit einem Blastp P-Wert von schlechter als e–10 (d. h. > e–10) gegen ORFs von Chlamydia trachomatis wird in diesen Abschnitt eingschlossen. Eine Liste von ORFS im Genom von Chlamydia pneumoniae, die in Chlamydia trachomatis nicht gefunden werden, ist vorstehend in der Beschreibung dargelegt.
  • An der Zellwand verankerte Oberflächen-ORFs
  • Viele Oberflächenproteine sind über das konservierte LPXTG Motiv an der Zellwand von Gram-positiven Bakterien verankert (Schneewind, O., Fowler, A. und Faull, K. F. 1995. Structure of the Cell Wall Anchor of Surface Proteins in Staphylococcus aureus. Science 268: 103–106). Ein Durchsuchen der ORFs von Chlamydia pneumoniae wurde unter Verwendung des Motivs LPXTG getätigt. Eine Liste von ORFs im Genom von Chlamydia pneumoniae, die Polypeptide kodieren, die an der Zellwand verankert sind, befindet sich in der Beschreibung.
  • ATCC-Hinterlegungen
  • Proben von Chlamydia pneumoniae wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, am 19. Nov. 1998 hinterlegt und ihnen wurde die Hinterlegungsnummer 1360-VR wurde zugeteilt. Zellen können gezüchtet, geerntet und gereinigt werden und DNA kann wie vorstehend diskutiert hergestellt werden. Um die Gewinnung von spezifischen Fragmenten des Chromosoms zu ermöglichen, kann man gezielte PCR-Reaktionen laufen lassen, deren Amplifikationsprodukte dann gemäß Fachleuten bekannten Standardverfahren sequenziert und/oder in einen geeigneten Vektor kloniert werden können.
  • Zusätzlich wurden eine Probe von drei Klonpools, die chromosomale Regionen von Interesse abdecken, bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, am 19. Nov. 1998 hinterlegt. Jeder Klonpool enthält eine Serie von Klonen. Wenn sie zusammengenommen werden, decken die drei Pools in der Probe ein Teilstück des Chromosoms mit einer Redundanz von etwas mehr als zwei ab. Die Gesamtzahl an Klonen in der Probe ist 196.
  • Die Klone decken die folgenden drei Regionen von Interesse ab:
    • (i) Position 30.000 bis 40.000 von SEQ ID No. 1, als Region A bezeichnet;
    • (ii) Position 501.500 bis 557.000 von SEQ ID No. 1, als Region B bezeichnet; und
    • (iii) Position 815.000 bis 830.000 von SEQ ID No. 1, als Region C bezeichnet.
  • Tabelle 4 listet Gruppen von Oligonukleotiden auf, die zum Amplifizieren von jedem der ORFs 2–1291 gemäß Fachleuten bekannten Standardverfahren verwendet werden sollen. Derartige Oligonukleotide werden als No. 1292 bis 6451 angegeben. Für jeden ORF wird das Folgende angegeben: ein vorwärts gerichteter Primer, der 2.000 bp stromaufwärts vom Anfang des ORFs positioniert ist; ein vorwärts gerichteter Primer, der 200 bp stromaufwärts vom Anfang des ORFs positioniert ist; ein rückwärts gerichteter Primer, der 2.000 bp stromabwärts am Ende des ORFs positioniert ist, was auf dem komplementären Strang 2.000 bp stromaufwärts der Endstelle des ORFs ist; und ein rückwärts gerichteter Primer 200 bp stromabwärts am Ende des ORFs, was auf dem komplementären Strang 200 bp stromaufwärts der Endstelle des ORFs ist. Die entsprechenden No. für die Primer werden in Tabelle 4 aufgelistet, wobei Fp der proximale vorwärts gerichtete Primer ist, Fd der distale vorwärts gerichtete Primer ist, Bp der proximale rückwärts gerichtete Primer ist und Bd der distale rückwärts gerichtete Primer ist. Die Positionen der 5'-Enden von jedem dieser Primer auf der Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1 werden in Tabelle 5 gezeigt.
  • Tabelle 6 listet Oligonukleotide (No. 6452–6843) auf, die zum Amplifizieren der Inserts von jedem der 196 Klone, die in der vereinigten Probe vorliegen, gemäß Fachleuten wohlbekannten Standardverfahren verwendet werden sollen. Diese Primer können auch benutzt werden, um die chromosomale Region zu amplifizieren, die der Region A, B oder C, innerhalb welcher das bestimmte Insert liegt, entspricht. Ihre Positionen werden in Tabelle 7 angegeben.
  • Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt werden, werden hierin durch Bezugnahme im selben Ausmaß aufgenommen, als ob für jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und einzeln angegeben wäre, dass sie durch Bezugnahme aufgenommen wird.
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  • Tabelle 2
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  • Tabelle 4
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  • TABELLE 5
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Claims (6)

  1. Isoliertes Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz des Genoms von Chlamydia pneumoniae, umfassend: (a) die Nukleotidsequenz von SEQ ID No. 1; (b) die in der genomischen DNA von Chlamydia pneumoniae in der ATCC-Hinterlegung No. 1360-VR enthaltene Nukleotidsequenz; (c) eine Nukleotidsequenz, die mit der Gesamtheit der Nukleotidsequenz von (a) oder (b) unter Bedingungen hoher Stringenz hybridisiert, wobei die Hybridisierung bei einer Temperatur von 65 °C in Anwesenheit von SSC-Puffer ausgeführt wird, wobei 1 × SSC 0,15 M NaCl und 0,05 M Na-Citrat entspricht, die Spülschritte die folgenden sind: 2 × SSC, 0,1 % SDS bei Raumtemperatur, gefolgt von drei Spülungen mit 1 × SSC, 0,1 % SDS; 0,5 × SSC, 0,1 % SDS; 0,1 × SSC, 0,1 % SDS 15 Minuten lang bei 68 °C; (d) eine Nukleotidsequenz, die mindestens 99,9 % Identität mit der Sequenz von SEQ ID No. 1 aufweist; oder (e) eine Nukleotidsequenz, die mindestens 80 % Identität mit SEQ ID No. 1 aufweist.
  2. Isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1, umfassend die Nukleotidsequenzen ORF 2 bis ORF 1297.
  3. Verfahren zum Nachweis und/oder zur Identifizierung von Chlamydia pneumoniae in einer biologischen Probe, umfassend: (i) In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2 unter Bedingungen, welche die Hybridisierung komplementärer Basenpaare gestatten; und (ii) Nachweisen der Anwesenheit von Hybridisierungskomplexen in der Probe, wobei der Nachweis von Hybridisierungskomplexen die Anwesenheit von Chlamydia pneumoniae in der Probe anzeigt.
  4. DNA-Chip, der ein Array von Polynukleotiden enthält, umfassend mindestens eins der Polynukleotide nach Anspruch 1 oder 2.
  5. Screening-Assay, umfassend (i) In-Kontakt-Bringen einer Testverbindung mit einem isolierten Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, und (ii) Nachweisen, ob Bindung stattfindet.
  6. Kit, umfassend einen Behälter, der ein isoliertes Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2 enthält.
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