DE69835695T2

DE69835695T2 - Kombinatorische bibliotheken heteromerer cytotoxischer proteine

Info

Publication number: DE69835695T2
Application number: DE69835695T
Authority: DE
Inventors: Ontario Cancer Inst. Jean Toronto GARIEPY; Robert Mark Toronto BRAY
Original assignee: University Health Network; University of Health Network
Current assignee: University Health Network; University of Health Network
Priority date: 1998-02-04
Filing date: 1998-12-08
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2018-12-09
Also published as: EP1051482A1; WO1999040185A1; JP2002503453A; CA2222993A1; ATE337396T1; JP4339511B2; US7713915B1; AU769824B2; DE69835695D1; EP1051482B1; AU1553099A

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Identifizieren neuer therapeutischer oder diagnostischer Proteine, die in der Lage sind, an eine Zielzelle zu binden, und Verwendungen dieser Verfahren.
Hintergrund der Erfindung
Die meisten Chemotherapeutika unserer Zeit, die eingesetzt werden, um die Proliferation eukaryontischer Zellen zu kontrollieren (wie z.B. Anti-Krebs- und Anti-Pilz-Mittel), sind eher kleine Moleküle, die in der Lage sind, eine einzelne Aufgabe relativ gut zu erfüllen, d.h. Abtöten oder Anhalten der Proliferation von sich schnell teilenden Zellen. Leider besitzen die meisten dieser Chemotherapeutika eine minimale Gewebespezifität und nicht-optimale Bioverteilungsprofile. Außerdem kommt es durch die Verwendung von cytotoxischen oder cytostatischen Arzneistoffen in Dosierungen, die ausreichend sind, um das Wachstum maligner Zellen zum Stillstand zu bringen, zu einem Selektionsdruck, der zum Auftreten von Arzneistoffresistenz-Mechanismen führen kann.
Zahlreiche Pflanzen- und Bakterientoxine stellen erfolgreiche Entwürfe von Proteinen dar, die in der Lage sind, in Säugerzellen einzudringen und sich in zellulären Kompartimenten einzufinden. Diese Proteine sind sehr wirksam darin, Zielzellen auszulöschen oder nicht-letale zelluläre Prozesse zu aktivieren. Das Wissen über die Konstruktion solcher Proteine hat in den letzten Jahren entscheidende Fortschritte gemacht.
Eine große Zahl von Pflanzen- und Bakterientoxinen kann als eine Gruppe unter dem gemeinsamen Thema der strukturellen Organisation zusammengefasst werden. Sie sind heteromerer Natur mit zwei oder mehr Polypeptid-Domänen oder Untereinheiten, die für bestimmte Funktionen verantwortlich sind (1). In solchen Proteinen könnten die zwei oder mehreren Untereinheiten oder Domänen als A und B und die Toxine als AB_x-Toxine bezeichnet werden, wobei x die Zahl von identischen oder homologen B-Untereinheiten in dem Toxin darstellt. Diese Familie von im Gerüst verwandten Toxinen umfasst Beispiele wie Shiga- und Shiga-ähnliche Toxine, hitzelabile Enterotoxine von E. coli, Cholera-Toxin, Diphtherie-Toxin, Pertussis-Toxin, Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A (2,3) und außerdem Pflanzentoxine wie Ricin und Abrin. Aufgrund ihrer Fähigkeit, die Proteinsynthese zu blockieren, wurden Proteine wie Shiga- und Shiga-ähnliche Toxine sowie Ricin, Abrin, Gelonin, Crotin, antivirales Protein der Kermesbeere, Saporin, Momordin, Modeccin, Sarcin, Diphtherie-Toxin und Exotoxin A als Ribosomen-inaktivierende Proteine (RIP) bezeichnet.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung nutzt das Konzept, ein Multitasking-fähiges heteromeres Protein-Toxin wie Shiga-Toxin oder ein anderes verwandtes Ribosomen-inaktivierendes Protein (RIP) als eine molekulare Matrize für die Entwicklung starker cytotoxischer Mittel einzusetzen, welche die Fähigkeit besitzen, spezifisch an Zielzellen zu binden. Durch das Modifizieren von Resten, welche lediglich die Rezeptor-Bindespezifität der Toxinmatrize beeinflussen, ist es gemäß der Erfindung möglich, die toxische A-Untereinheit, die in allen mutierten Toxinen vorliegt, als eine molekulare Suchmaschine zum Durchmustern kombinatorischer Proteinbanken der Matrize des Toxins zu verwenden, um mutierte Toxine zu finden, welche spezifische Zellen oder Zelltypen abtöten.
Die Erfinder haben somit ein Verfahren zum Identifizieren cytotoxischer mutierter Proteine, die fähig sind, an eine Zielzelle zu binden, entwickelt, indem ein heteromeres Protein-Toxin ausgewählt wird, eine Bank von Mikroorganismus-Clonen, welche variante Protein-Toxine produzieren, durch Einführen von Mutationen in die DNA, welche die bindende Untereinheit des Toxins codiert, erzeugt wird und die Bank gegen eine Zielzelle durchgemustert wird, indem Clone oder Pools von Clonen isoliert werden, welche die varianten Protein-Toxine produzieren, Präparate der Zielzelle mit den durch die Clone oder Pools von Clonen hergestellten varianten Protein-Toxinen behandelt werden und ein cytotoxisches mutiertes Protein oder ein Pool von cytotoxischen mutierten Proteinen ausgewählt wird, welches/welcher die Zielzelle hemmt oder abtötet. In bevorzugten Ausführungsformen können die Mutationen durch die Verwendung eines kombinatorische-Kassetten-Verfahrens oder anhand eines Einzelposition-Eliminierungsverfahrens in die bindende Untereinheit eingeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Bank somit gentechnisch veränderte Bakterien oder Bakterienüberstände, welche die varianten Protein-Toxine enthalten. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht die Bank aus gentechnisch veränderten Hefen oder Hefeüberständen, welche die varianten Protein-Toxine enthalten.
Das Toxin kann z.B. aus einer Gruppe ausgewählt werden, die prokaryotische oder eukaryontische Proteine oder Protein-Fusionskonstrukte umfasst, die fähig sind, die Proteinsynthese zu blockieren. In bevorzugten Ausführungsformen wird das Toxin aus einer Gruppe ausgewählt, die Shiga-Toxin, Shiga-ähnliche Toxine, Ricin, Abrin, Gelonin, Crotin, antivirales Protein der Kermesbeere, Saporin, Momordin, Modeccin, Sarcin, Diphtherie-Toxin und Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A umfasst. In weiteren bevorzugten Ausführungsformen stammt die bindende Untereinheit von der B-Untereinheit-Matrize entweder von dem Shiga-Toxin oder von verwandten Shiga-ähnlichen Toxinen oder homologen Gegenstücken von hitzelabilen Enterotoxinen von E. coli, Cholera-Toxin, Pertussis-Toxin oder der Rezeptor-Bindedomäne von Ricin. Die Zielzelle kann eine Tumorzelle, z.B. eine Brustkrebszelle, sein.
Somit wurde in einer Ausführungsform der Erfindung gezeigt, dass eine Familie von verwandten mutierten kombinatorischen Toxinen aus z.B. dem Shiga-Toxin oder dem Shiga-ähnlichen Toxin 1 hergeleitet werden kann, die Brustkrebszellen abtöten können, welche vorher gegenüber dem nativen Toxin unempfindlich waren.
Außerdem stellt die Erfindung ein in vitro-Verfahren zum Abtöten oder Hemmen einer Zielzelle bereit, wobei die Zielzelle mit einem cytotoxischen mutierten Protein oder mit einem Pool von Proteinen, ausgewählt durch die Verfahren der Erfindung, behandelt wird.
In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren zum Identifizieren therapeutischer Proteine mit einer Bindespezifität für eine Zielzelle bereit, indem ein heteromeres Protein-Toxin ausgewählt wird, eine Bank von Mikroorganismus-Clonen, welche variante Protein-Toxine produzieren, erzeugt wird, die Bank durch die Verfahren der Erfindung gegen die Zielzelle durchgemustert wird und die cytotoxischen mutierten Proteine noch weiter gegen Nicht-Zielzellen durchgemustert werden, um ein therapeutisches mutiertes Protein oder einen Pool von therapeutischen mutierten Proteinen auszuwählen, die im Hemmen oder Abtöten der Nicht-Zielzellen weniger wirksam sind als im Hemmen oder Abtöten der Zielzellen.
Weiterhin offenbart die Erfindung ein Verfahren zum Konstruieren diagnostischer Sonden zum Nachweisen des Vorliegens eines Zelloberflächen-Markers, indem ein mutiertes heteromeres Protein-Toxin durch die Durchmusterungsverfahren der Erfindung ausgewählt wird, aus der Bank von Mikroorganismus-Clonen ein Clon, der das cytotoxische mutierte Protein produziert, ausgewählt wird, eine diagnostische DNA-Sequenz durch Einführen einer Marker-DNA, welche einen nachweisbaren Marker codiert, in die DNA-Sequenz einer bindenden Untereinheit in dem selektierten Clon hergestellt wird und diagnostische Sonden aus der diagnostischen DNA-Sequenz erzeugt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform codiert die Marker-DNA grünes fluoreszierendes Protein (GFP).
Außerdem offenbart die Erfindung Verfahren zum Konstruieren eines Medikaments, das eine Bindespezifität besitzt, z.B. indem das cytotoxische mutierte Protein durch die Verfahren der Erfindung ausgewählt wird und aus der Bank von Mikroorganismus-Clonen ein Clon ausgewählt wird, der das cytotoxische mutierte Protein produziert. Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin das Herstellen einer Medikamenten-DNA-Sequenz, indem eine medizinische Polypeptid-DNA, welche ein medizinisches Polypeptid codiert, in die DNA-Sequenz einer bindenden Untereinheit in dem ausgewählten Clon eingeführt wird und aus der Medikamenten-DNA ein Medikament erzeugt wird. Die Medikamente der Erfindung können zum Behandeln eines Zustandes eingesetzt werden, bei dem es erforderlich ist, ein Medikament zielgerichtet zu einer in einem Wirtsorganismus vorkommenden Zielzelle hinzubringen.
In anderen Ausführungsformen stellt die Erfindung Kits bereit, die zum Durchführen der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, wobei die Kits ein ausgewähltes heteromeres Protein-Toxin und geeignete Träger einschließen, die zum Durchführen eines Verfahrens der Erfindung verwendet werden können.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt die Aminosäuresequenzen der A-Untereinheit (1A; entsprechend SEQUENZ ID NO: 1) und B-Untereinheit (1B; entsprechend SEQUENZ ID NO: 2) des Shiga-ähnlichen Toxin 1 dar.
2 zeigt Gerüst-Darstellungen von Shiga-Toxin (ShT; Abbildung A, Seitenansicht) und seiner B-Untereinheit (Abbildung B und C, Ansicht von unten).
3 stellt die Oligonucleotidsequenzen von Primer A (3A; entsprechend SEQ ID NO: 3) und Primer B (3B; entsprechend SEQ ID NO: 4) dar, die zum Erzeugen der ShT-Banken synthetisiert wurden.
4 ist eine grafische Darstellung von Cytotoxizitätskurven, welche die Fähigkeit der ShT-Variante 506 zeigen, SK-BR-3-Zellen in der Passage 34 (♦), 40 (∎), 56
und 68
abzutöten; und für die Wirkung des nativen ShT auf die Passagen 40 (❒), 56 (∆) und 59 (❍).
5 ist eine grafische Darstellung, welche den Unterschied in der Lebensfähigkeit von Zellen zeigt, der beobachtet wurde, wenn SK-BR-3-Zellen mit einer 14 nM Lösung von entweder dem nativen ShT (⦁) oder der ShT-Variante 506 (❍) bei verschiedener Anzahl von Zellpassagen in Kontakt gebracht wurden.
6 ist eine grafische Darstellung, welche die Fähigkeit von drei identifizierten ShT-Varianten (natives Toxin (Δ); ShT-Variante 122 (♦); ShT-Variante 126 (⦁); ShT-Variante 824 (∎)) zeigt, welche CAMA-1-Zellen abtöten.
Genaue Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die hier genannten Erfinder haben kombinatorische Proteinbanken, die auf der strukturellen Matrize eines heteromeren Protein-Toxins beruhen, für die Verwendung zum Herleiten von Toxinmutanten mit Rezeptorspezifitäten konstruiert, die auf Ziele gerichtet sind, welche gegenüber dem nativen Toxin resistent sind. Die Stärke dieser neuen Vorgehensweise kommt durch die Tatsache zustande, dass alle Mitglieder dieser Banken cytotoxischer Natur sind. Diese gemeinsame Eigenschaft aller Toxinvarianten kann somit als eine Suchmaschine eingesetzt werden, um in diesen Banken Mutanten mit einer neuen Rezeptorspezifität zu finden. Die Durchmusterungsstrategie umfasst die Verwendung einfacher Cytotoxizitäts-Tests, welche optimierte Therapeutika und auch diagnostische Mittel unmittelbar identifizieren, so dass es nicht mehr erforderlich ist, erneut irgendwelche Leitverbindungen zu entwerfen, um ihre zelluläre Aufnahme, intrazelluläre Prozessierung und/oder Cytotoxizität zu steigern.
Heteromere Pflanzen- und Bakterien-Toxine haben eine strukturelle Organisation mit zwei oder mehreren Polypeptid-Domänen oder -Untereinheiten, die für bestimmte Funktionen verantwortlich sind und als A und B bezeichnet werden. Die Toxine können als AB_x-Toxine bezeichnet werden, wobei x die Zahl von identischen oder homologen B-Untereinheiten im Toxin angibt. Diese Familie von im Gerüst verwandten Toxinen schließt Beispiele wie Shiga- und Shiga-ähnliche Toxine, die hitzelabilen Enterotoxine von E. coli, Cholera-Toxin, Diphtherie-Toxin, Pertussis-Toxin, Exotoxin A von Pseudomonas aeruginosa (2, 3) und außerdem Pflanzentoxine wie Ricin und Abrin ein.
Aufgrund ihrer Fähigkeit, die Proteinsynthese zu blockieren, wurden Proteine, wie Shiga- und Shiga-ähnliche Toxine, außerdem Ricin, Abrin, Gelonin, Crotin, antivirales Protein der Kermesbeere, Saporin, Momordin, Modeccin, Sarcin, Diphtherie-Toxin und Exotoxin A, als Ribosomen-inaktivierende Proteine (RIP) bezeichnet. Die Wirksamkeit von RIPs ist außerordentlich hoch; es wurde gezeigt, dass ein Molekül der A-Kette des Diphtherie-Toxins (99) oder der A-Kette von Ricin (100) ausreicht, um eine eukaryontische Zelle abzutöten. Nun wurden die Kristallstrukturen für viele dieser Moleküle ermittelt (4-12), und bei der Aufklärung ihrer Funktionen hat man sich meist auf die Identifizierung von Resten, die an der katalytischen Aktivität von A-Ketten beteiligt sind, und auf die Kartierung von Resten der B-Untereinheit konzentriert, die an der Rezeptor-Bindeaktivität beteiligt sind.
Die hier dargestellten Daten untermauern das breite Potential von kombinatorischen Shiga-Toxin-Banken (oder Banken eines beliebigen heteromeren cytotoxischen Mitglieds) als Quellen möglicherweise zellspezifischer cytotoxischer und diagnostischer Mittel. Da das Rezeptor-Bindepotential von kombinatorischen Proteinen wie Shiga-Toxin (B-Untereinheiten-Pentamer) von ihrer cytotoxischen A-Untereinheit abgetrennt werden kann, stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zum Entwickeln nicht-cytotoxischer diagnostischer Sonden zum Nachweisen des Vorliegens geeigneter Zelloberflächen-Marker bereit, die bei der Auswahl therapeutischer Strategien helfen können. Da weiterhin die bindende Einheit kombinatorischer Proteine von der Toxin-Untereinheit genetisch getrennt ist, können ausgewählte mutierte bindende Einheiten unabhängig von der Toxin-Untereinheit hergestellt werden, und sie können mit Marker-DNA oder einer therapeutischen DNA versehen werden, um diagnostische Sonden oder zellspezifische therapeutische Proteine herzustellen.
Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zum Identifizieren und Produzieren therapeutischer oder diagnostischer Proteine bereit, die fähig sind, spezifisch an eine Zielzelle zu binden, wobei diese Proteine von einem heteromeren Wildtyp-Protein hergeleitet sind, das eine Zelloberflächen-bindende Untereinheit und eine cytotoxische Untereinheit aufweist, umfassend die Schritte: a) Erzeugen von Banken von mutierten heteromeren Proteinen, in denen die Zell-bindende Untereinheit zufällig mutiert worden war; und b) Durchmustern der Bank unter Verwendung der cytotoxischen Domäne, die in allen mutierten Toxinen vorliegt, als eine eingebaute Suchmaschine gegen eine Zielzelle, der Rezeptoren fehlen oder die geringere Spiegel von Rezeptoren aufweist, welche Empfindlichkeit gegenüber dem Wildtypprotein verursachen, und Identifizieren derjenigen Mutanten, welche die Zelle abtöten.
Außerdem stellt die Erfindung ein Verfahren zum Konstruieren und Durchmustern therapeutisch nützlicher Toxinvarianten bereit, die an Oberflächenmarker (z.B. Glycolipide, Glycoproteine oder Proteine) binden werden, welche, im Vergleich zu normalen Zellen, bevorzugt auf menschlichen Tumorzellen exprimiert werden. Die Erfindung offenbart ferner ein Verfahren zum Konstruieren und Durchmustern von Toxinvarianten, welche gezielt zu definierten eukaryontischen Zellpopulationen wie pathogenen Pilzen hinsteuern oder welche eingesetzt werden können, um das Wachstum von schnell proliferierenden Zellen zu kontrollieren (die z.B. an der Ausbildung von Narben, an der Gewebemodellierung oder an Hautkrankheiten beteiligt sind). Weiterhin offenbart die Erfindung ein Verfahren zum Konstruieren und Durchmustern therapeutisch nützlicher, nicht-cytotoxischer diagnostischer Sonden zum Nachweisen des Vorliegens geeigneter Zelloberflächen- Marker, die bei der Auswahl therapeutischer Strategien helfen können. Shiga-Toxinvarianten können anschließend durch Abtrennen der Variante von ihrer cytotoxischen Untereinheit oder durch Inaktivieren der cytotoxischen Untereinheit der Variante modifiziert werden, oder die DNA, welche die bindende Untereinheit ausgewählter Varianten codiert, kann eingesetzt werden, um verschiedene diagnostische oder therapeutische Werkzeuge zu konstruieren.
Die Konstruktion von heteromeren Protein-Toxin-Banken ermöglicht es dem Fachmann, neue cytotoxische/diagnostische Sonden mit veränderten Eigenschaften zum zielgerichteten Ansteuern eines Rezeptors rasch zu identifizieren. Da der natürliche Rezeptor für die B-Untereinheit von Shiga-Toxin ein Glycolipid ist, kann es sein, dass die Spezifität von aus Shiga-Banken hergeleiteten mutierten B-Untereinheiten, die ein niedriges Niveau an Degeneration in der Sequenz ihrer Schleifen beinhalten (wobei es sich um Strukturen handelt, die an der Rezeptorspezifität beteiligt sind), auf einmalige Kohlenhydratstrukturen gerichtet ist, die auf Glycoproteinen oder Glycolipiden liegen. Im Fall von Toxinbanken, welche innerhalb der zwei Schleifenregionen stark degenerierte Sequenzen enthalten, von denen man weiß, dass sie die Bindung vermitteln, kann man erwarten, dass die möglichen Oberflächenstrukturen, die erkannt werden, sehr vielfältig sein werden. Wie es bei Antikörper-Bindungsstellen der Fall ist, können Varianten der B-Untereinheit eher an ein Spektrum von molekularen Einheiten wie Proteinen, Peptiden, Nucleinsäuren oder sogar organischen Einheiten als an Zucker oder Glycolipide binden.
Die Konstruktion von cytotoxischen heteromeren Banken bietet mehrere verschiedene Vorteile. Erstens liegen die Banken dauerhaft vor und können unendlich oft durchgemustert werden, so dass eine kontinuierliche Quelle für neue therapeutische oder diagnostische Mittel bereitgestellt wird. Zweitens macht es der letale Charakter der resultierenden Toxinmutanten gegenüber eukaryontischen Zellen einem möglich, einfach nach nützlichen Konstrukten durchzumustern, welche eine Spezifität für einmalige Zellzielen (wie Krebszellen) besitzen. Drittens können geeignete mutierte B-Untereinheiten in Abwesenheit einer cytotoxischen A-Kette hergestellt werden, wodurch es möglich gemacht wird, nicht-cytotoxische diagnostische Mittel unmittelbar zu erzeugen, die eingesetzt werden können, um das Vorliegen von einmaligen Markern auf Zelltypen entweder in in vitro- oder in in vivo-Ansätzen nachzuweisen.
Für den Fachmann wird klar sein, dass die Verfahren der vorliegenden Erfindung auf Immuntoxine und verwandte Wachstumsfaktor-Toxin-Konjugate angewendet werden können, um Multitasking-fähige Mittel zu entwickeln, die in der Lage sind, gezieltere Therapien bereitzustellen, oder die als diagnostische Werkzeuge für Krebs- oder andere Patienten genutzt werden können.
Bezüglich therapeutischer Werkzeuge stellt die vorliegende Erfindung z.B. ein Verfahren zum Identifizieren therapeutischer Proteine mit Bindespezifität für eine Zielzelle für den Zweck zum Entwickeln neuer Peptid- oder Protein-Arzneistoff-Verabreichungsvehikel und Systeme zum zielgerichteten Hinsteuern bereit. Nachdem ein geeignetes heteromeres Protein-Toxin mit einer toxischen Untereinheit und einer bindenden Untereinheit ausgewählt wurde, können die hier offenbarten und gegebenenfalls durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, angepasste Mittel eingesetzt werden, um eine Bank von Mikroorganismus-Clonen zu erzeugen, welche variante Protein-Toxine produzieren, indem Mutationen in die DNA der bindenden Untereinheit eingeführt werden, welche das Toxin in einem Mikroorganismus codiert. Danach wird die Bank durch Verfahren durchgemustert, wie solchen, die vorstehend angegeben sind, um Clone oder Pools von Clonen auszuwählen, welche die cytotoxischen mutierten Proteine produzieren, welche eine Zielzelle hemmen oder abtöten. Die ausgewählten cytotoxischen mutierten Proteine können gegebenenfalls noch weiter gegen Zellen von einem Patienten durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, durchgemustert werden, indem Präparate solcher Zellen mit Clonen oder Pools von Clonen, welche cytotoxische Mutanten produzieren, behandelt werden und ein cytotoxisches mutiertes Protein oder ein Pool von cytotoxischen mutierten Proteinen ausgewählt wird, die darin wirksam sind, Zielzellen zu hemmen oder abzutöten, und die für den Patienten sicher ist/sind.
Als weiteres Beispiel könnte die toxische Untereinheit modifiziert oder durch eine andere toxische Untereinheit ersetzt werden, die so ausgewählt oder gentechnisch verändert wurde, dass das Toxin einen Cofaktor oder dergleichen benötigt, um aktiviert zu werden. Auf diese Weise kann das therapeutische Protein an einen Wirt verabreicht werden, und nachdem eine ausreichende Zeit vergangen ist, in der das therapeutische Protein sich an die Zielzellen anheften konnte, kann der Cofaktor in den Wirt eingeführt werden, wodurch die Zielzellen abgetötet oder gehemmt werden.
Hinsichtlich der Konstruktion von diagnostischen Werkzeugen dienen die Verfahren der Erfindung zum Auswählen eines heteromeren Protein-Toxins und zum Erzeugen einer Bank von Mikroorganismus-Clonen, welche variante Protein-Toxine des heteromeren Protein-Toxins produzieren, zum Durchmustern und zum Auswählen eines mutierten Toxins mit einer erhöhten Empfindlichkeit und Selektivität. Danach wird die Bank durch die erfindungsgemäßen Verfahren gegen eine Zielzelle durchgemustert, d.h. indem Clone oder Pools von Clonen, welche die varianten Protein-Toxine produzieren, isoliert werden, Präparate der Zielzelle mit den varianten Protein-Toxinen behandelt werden und ein cytotoxisches mutiertes Protein oder ein Pool von cytotoxischen mutierten Proteinen ausgewählt wird, welches/welcher die Zielzelle hemmt oder abtötet. Sofern die Toxizität abgeschwächt werden soll, wenn z.B. das ausgewählte diagnostische Werkzeug in vivo eingesetzt werden soll, kann der Fachmann das cytotoxische mutierte Protein oder den Pool von Proteinen durch Abtrennen der bindenden Untereinheit von der toxischen Untereinheit oder durch Inaktivieren einer toxischen Untereinheit des cytotoxischen mutierten Proteins modifizieren. Außerdem kann man gegebenenfalls das cytotoxische mutierte Protein oder den Pool von Proteinen mit einem nachweisbaren Marker markieren. Alternativ werden die Gene, welche das cytotoxische mutierte Protein oder den Pool von Proteinen produzieren, so manipuliert, dass sie nachweisbare Marker endogen produzieren. Z.B. wird die Erfindung eingesetzt, um diagnostische Sonden zu konstruieren, mit denen das Vorliegen eines Zelloberflächen-Markers nachgewiesen werden kann, wobei zuerst ein cytotoxisches mutiertes Protein oder ein Pool von Proteinen durch die hier beschriebenen Verfahren identifiziert wird und anschließend eine diagnostische DNA-Sequenz hergestellt wird, indem durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, eine Marker-DNA, welche einen nachweisbaren Marker codiert, in die DNA-Sequenz(en) der bindenden Untereinheit des cytotoxischen mutierten Proteins oder des Pools von Proteinen eingeführt wird und diagnostische Sonden aus der diagnostischen DNA-Sequenz erzeugt werden. Beispiele von nachweisbaren Markern, die dem Fachmann bekannt sind, schließen verschiedene Enzyme, fluoreszierende Stoffe, lumineszierende Stoffe und radioaktive Stoffe ein. Beispiele von geeigneten Proteinen schließen Meerrettich-Peroxidase, Varianten von grünen fluoreszierenden Proteinen, Luciferase, alkalische Phosphatase oder Acetylcholinesterase ein. Beispiele von geeigneten fluoreszierenden Stoffen schließen Umbelliferon, Fluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin ein. Ein Beispiel eines geeigneten lumineszierenden Stoffs schließt Luminol ein. Beispiele von geeigneten radioaktiven Stoffen schließen ³²P, ³⁵S, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Ga, ⁸⁹Zr, ⁹⁷Ru, ^99mTc, ¹¹¹In, ¹²³I,¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re und ¹⁹⁹Au ein. Die Proteine können auch mit dem einen Partner eines Liganden-Bindungspaars markiert oder konjugiert werden. Repräsentative Beispiele schließen Avidin-Biotin- und Riboflavin-Riboflavin-bindende Proteine ein. Verfahren zum Konjugieren oder Markieren der vorstehend angesprochenen Proteine mit den vorstehend dargestellten repräsentativen Markierungen können einfach unter Verwendung herkömmlicher Techniken durchgeführt werden.
Weiterhin stellt die Erfindung eine Verwendung der Zusammensetzungen der Erfindung für die Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln eines Zustandes bereit, bei dem es erforderlich ist, ein Medikament gezielt zu einer in einem Wirtsorganismus vorkommenden Zielzelle hinzuführen. Dies kann durch die Verwendung der vorstehend angegebenen Verfahren erreicht werden, wobei ein therapeutisches Protein, das eine Bindespezifität besitzt, ausgewählt wird, das therapeutische Protein anschießend durch Konjugieren einer Medizin (z.B. eines Toxins) mit der bindenden Untereinheit des Proteins, so dass ein Peptid/Protein-Arzneistoff-Verabreichungsvehikel gebildet wird, modifiziert wird und dieses an einen Wirtsorganismus, der an einer mit der Zielzelle assoziierten Krankheit leidet, in einer wirksamen Menge dieses Arzneistoffs verabreicht wird. Bei der Verwendung der vorliegenden Erfindung zum Behandeln eines Zustandes kann der Fachmann gegebenenfalls das therapeutische Protein durch verschiedene, hier besprochene Verfahren noch weiter modifizieren.
Außerdem umfasst die Erfindung Kits, um das Durchführen der Verfahren der Erfindung zu erleichtern. Reagenzien, die zur Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, können in herkömmliche Kits, welche die erforderlichen Stoffe bereitstellen, verpackt werden, und sie können in geeignete Behälter verpackt werden, die gegebenenfalls geeignete Träger enthalten, welche zum Durchführen der Verfahren der Erfindung geeignet sind.
Wirkweise von Shiga- und Shiga-ähnlichen Toxinen
Das Siga-Toxin (ShT) und Shiga-ähnliche Toxine (SLT) sind strukturell verwandte Bakterientoxine, die an der Pathogenese der bakteriellen Dysenterie (Bakterienruhr), hämorrhagischen Kolitis, des hämolytischen Urämiesyndroms und der thrombotischen thrombocytopenischen Purpura beteiligt sind (19-21). Das Shiga-Toxin, das erste Mitglied dieser Familie von Cytotoxinen, das im Jahr 1903 beschrieben wurde (22, 23), wird durch Shigella dysenteriae 1 produziert. Shiga-ähnliche Toxine wurden kürzlich als Virulenzfaktoren identifiziert, welche durch enterohämorrhagische Stämme von E. coli gebildet werden (24-28). Insbesondere der E. coli-Stamm O157:H7, der das Shiga-ähnliche Toxin 1 produziert, wurde kürzlich als das verursachende Agens für kürzlich aufgetretene massenhafte Ausbrüche von Lebensmittelvergiftung in Japan und den Vereinigten Staaten identifiziert.
Shiga- (ShT) und Shiga-ähnliche Toxine (SLT) besitzen die kleinste bekannte B-Untereinheit (weniger als 70 Reste) von allen AB_x-Toxinen, und ihre A-Untereinheit hat eine identische katalytische Aktivität wie die entsprechende Untereinheit in Ricin. 1 zeigt die Aminosäuresequenzen der A- und B-Untereinheiten des Siga-ähnlichen Toxins 1. Abbildung A (entsprechend SEQUENZ ID NO: 1) zeigt die katalytische A-Untereinheit. Abbildung B (entsprechend SEQUENZ ID NO: 2) zeigt die B-Untereinheit mit den drei mit Kästchen versehenden Regionen, welche Schleifen darstellen, die Reste enthalten, für die postuliert wurde, dass sie am Ausbilden einer Rezeptor-Bindungsspalte für CD77 beteiligt sind.
2 zeigt Gerüst-Darstellungen von Shiga-Toxin (ShT; Abbildung A, Seitenansicht) und seiner B-Untereinheit (Abbildung B und C, Ansicht von unten). Wie in 2 zu sehen ist, haben ShT und SLT-1 identische B-Untereinheiten. Die katalytische A-Untereinheit (12, Abbildung A) hat ihren C-Terminus in das zentrale Loch des B-Untereinheiten-Pentamers eingeführt (14). Das B-Untereinheiten-Pentamer (14, Abbildung B) wird durch Intra- und Inter-Untereinheiten-Grenzflächen, umfassend β-Faltblätter, stabilisiert. Zwei der drei in 1 mit Kästen versehenen Schleifenregionen der B-Untereinheit (Reste 15-19 und 30-33) sind dunkel dargestellt (16), um die Orientierung und Lage dieser Schleifen in Bezug auf die β-Strang-Struktur der B-Untereinheit und die A-Kette selbst zu zeigen. Die Schleife 58-66 liegt in der gleichen Nachbarschaft wie die Schleifen 15-19 und 30-33 und wurde aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht hervorgehoben. In Abbildung C ist jede identische B-Untereinheit anders schattiert, um die symmetrische Anordnung dieser Einheiten zu erläutern, durch die ein Pentamer entsteht.
Diese Toxine sind Proteine, die aus sechs Untereinheiten zusammengesetzt sind; einer katalytischen A-Untereinheit (293 Aminosäuren, MG 32 317), die an der Blockierung der Proteinsynthese beteiligt ist, und fünf B-Untereinheiten (69 Aminosäuren; jeweils MG 7600), die für die Anlagerung des Toxins an Zellen erforderlich sind (29-35; 2). Die B-Untereinheiten lagern sich in Lösung spontan zu einem Pentamer zusammen (2, Abbildung B und C). Die Struktur dieser Toxine ist ein typisches Beispiel für ein gebräuchliches Motiv, das bei anderen größeren bakteriellen Toxinen vorkommt, wie Cholera-Toxin und hitzelabilen Enterotoxinen von E. coli (6, 7) und Pertussis-Toxin (8).
Die Zellspezifität von ShT und SLT-1 wird durch seine B-Untereinheit codiert, welche das Glycolipid Globotriaosylceramid erkennt (bezeichnet als CD77 oder Gb₃; Galα1→4Galβ1→4Galβ1→1Ceramid; Ref. 36, 37). CD77 hat eine relativ begrenzte Gewebeverteilung und wird in einer Reihe von menschlichen Krebsarten exprimiert (13, 102-105). Kürzlich wurde gezeigt, dass das native Toxin wirksam war, ein menschliches Lymphom aus dem Knochenmark zu entfernen (13). Das Shiga-Toxin wird nach seiner Anlagerung an empfängliche Zellen aus Stachelsaumgruben („coated pits") durch Endocytose aufgenommen (38-40). Die A-Kette wird zu einem kleineren 27 kDa-A₁-Fragment prozessiert, indem die native Kette selektiv gespalten und reduziert wird. Das A₁-Fragment ist für die Inaktivierung von eukaryontischen Ribosomen verantwortlich (29), wobei es als eine hoch-spezifische N-Glycosidase wirkt, die einen einzelnen Adeninrest von der 28S-rRNA abspaltet (41, 42). Eine Depurinierung an dieser Stelle hemmt die Verlängerung des Peptids, indem die EF- 1-abhängige Bindung von Aminoacyl-tRNA an die ribosomale 60S-Untereinheit verhindert wird (43-45).
Beispiel 1
Entwerfen von Shiga-Toxin-Banken zum Herleiten geeigneter diagnostischer und therapeutischer Mittel die auf definierte eukaryontische Zellpopulationen abzielen
Gemäß der Erfindung wurde die Rezeptorspezifität des Toxins, welche durch seine B-Untereinheit codiert ist, durch zufällige Mutagenese verändert. Mutationen in der B-Untereinheit wurden bei einem Minimum gehalten, um jegliche negativen Effekte auf andere Funktionen des Toxins zu verringern, wie die Toxizität seiner A-Kette und die richtige Faltung und Zusammenlagerung des Holotoxins (d.h. die Pentamerisierung der B-Untereinheit, das Einfügen der A₂-Domäne in das B-Pentamer, die Exposition und Orientierung der Protease-empfindlichen Schleife und die Verpackungumgebung der Translokationsdomäne).
Das Shiga- und das Shiga-ähnliche Toxin 1 haben identische B-Untereinheiten. Die B-Untereinheit ist ein kleines, aus nur 69 Aminosäuren zusammengesetztes Protein, das in Lösung spontan pentamerisiert. Seine Kristallstruktur (als ein Pentamer von B-Untereinheiten) wurde in Gegenwart und in Abwesenheit der A-Untereinheit aufgeklärt (4, 5), und es wurde gezeigt, dass sie in beiden Fällen identisch ist. Jedes B-Untereinheiten-Monomer innerhalb der pentameren Struktur besteht aus sechs β-Strängen (β1, Reste 3-8; β2, Reste 9-14; β3 Reste 20-24; β4, Reste 27-31; β5, Reste 49-53; β6, Reste 65-68), enthaltend 31 seiner 69 Aminosäuren (45 %; 2). Eine einzelne α-Helix (Reste 36 bis 46) ist für 16 % der restlichen Struktur verantwortlich. Diese Elemente der Sekundärstruktur scheinen für die Aufrechterhaltung der Integrität des Pentamers und für seine Assoziation mit der A₂-Domäne der A-Kette essentiell zu sein (2). Somit kann es sein, dass beliebige Störungen dieser Regionen zu Problemen bei der Faltung führen. Drei Schleifenregionen sind noch übrig, die aus mehr als zwei Aminosäuren bestehen. Sie sind durch die Reste 15 bis 19, 32 bis 35 bzw. 54 bis 64 begrenzt. Mutagenesestudien der B-Untereinheit haben gezeigt, dass Substitutionen an den Positionen 16, 17, 30, 33 und 60 das cytotoxische Potential des resultierenden Toxins entweder ganz zum Verschwinden brachten oder reduzierten, während eine Asp-zu-Asn-Substitution an Position 18 die Rezeptorspezifität des Toxins veränderte (85 bis 89). Untersuchungen zur Molekülmodellierung, umfassend das Andocken von CD77 (Gb₃) an die B-Untereinheit, haben die in diesen Schleifen liegenden Reste damit in Verbindung gebracht (90, 91). Die Hypothese wurde aufgestellt, dass es zwei mögliche Bindungsstellen für CD77 auf dem B-Untereinheiten-Pentamer gibt, nämlich die Stellen I und II (90, 91). Reste, die in den Regionen 15 bis 19 und 30 bis 33 liegen, insbesondere Asn15, Asp16, Asp17 und Phe30, bilden den Großteil der mutmaßlichen Bindungsstelle I (91). Die berechnete Wechselwirkungs-Energie, die aus Modellierungsuntersuchungen hergeleitet wurde, legte nahe, dass die Stelle I wahrscheinlich die maßgebende Stelle beim Vermitteln der CD77-Wechselwirkung ist (91). Somit legen die Ergebnisse sowohl aus positionsgerichteten Mutagenese- als auch aus Andock-Experimenten nahe, dass die in Schleifenregionen vorliegenden Reste Stellen sind, an denen eine zufällige Mutagenese möglicherweise zu einer veränderten Rezeptorspezifität führt. Wie hier beschrieben, werden Reste innerhalb von zwei Schleifenregionen verändert, nämlich die Reste 15 bis 19 (Schleife 1) und die Reste 30 bis 33 (Schleife 2; im technischen Sinn ist diese Region keine Schleife, sie stellt vielmehr eher das Ende des β4-Strangs und den Beginn der zweiten Schleife dar). Auch durch eine zufällige Mutation in Schleife 3 (Reste 58 bis 64; 2) lässt sich möglicherweise das Ziel der Erfindung effektiv erreichen. Obwohl sich die einleitenden Untersuchungen auf die vorstehend erwähnten Regionen des Moleküls konzentriert haben, schließt diese Abgrenzung keinesfalls die Möglichkeit aus, bei Versuchen zum Ändern der Spezifität des Toxins auf einen beliebigen der B-Untereinheiten-Reste zu zielen.
Neun Reste sind an den Schleifen 1 und 2 beteiligt, wodurch eine Komplexität der möglichen Bank in der Größenordnung von 20⁹ erzeugt wird (5 × 10¹¹ verschiedene mutierte Proteine, wenn alle neun Reste vollständig randomisiert sind und alle möglichen Kombinationen gewonnen werden). Deshalb ist es von Vorteil, das Ausmaß an Komplexität der Toxinbank zu reduzieren, so dass die neun Reste von Interesse nicht vollständig randomisiert sind. Dieses Ziel wurde erreicht, indem Oligonucleotide für die Verwendung in der Mutageneseprozedur synthetisiert wurden, die steigende Niveaus an Nucleotid-„Doping" aufwiesen. Anschließend ist anhand der Auswahl eines Oligonucleotids mit dem gewünschten Doping-Niveau für die Mutagenese eine direkte Kontrolle über das Ausmaß an Diversität in der aus diesem bestimmten Oligonucleotid-Pool hergestellten Bank möglich. Z.B. würden Mutationen an fünf von neun Aminosäurepositionen in der Zielregion eine Diversität in der Größenordnung von 20⁵ (3,2 × 10⁶ mutierte Toxine) ergeben, dies ist schon eher ein zufriedenstellendes Ausmaß an Diversität. Tatsächlich hat es sich früher bei chemischen oder Peptid-Banken als nicht erforderlich erwiesen, Banken mit mehr als 10⁶ Verbindungen durchzumustern, wenn geeignete „Leit"-Verbindungen identifiziert werden sollten (wobei in dem Durchmusterungsprozess entweder Bindungstests oder Funktionstests verwendet wurden). Außerdem wird die Zahl möglicher Zielstellen auf Zelloberflächen groß sein und damit wird sich der Bedarf für weitere Durchmusterungsschritte noch erhöhen.
Beispiel 2
Mutagenese und Konstruktion kombinatorischer Banken heteromerer cytotoxischer Proteine Das Shiga- und das Shiga-ähnliche Toxin 1 unterscheiden sich in der Sequenz nur in einer Aminosäure in ihrer A-Untereinheit und haben identische B-Untereinheiten. Obwohl bei den hier beschriebenen Verfahren der zufälligen Mutagenese das SLT-1-Gen verwendet wird, wurde die einfachere Bezeichnung „Shiga-Toxin-Bank", und nicht „Shiga-ähnliches Toxin 1-Bank" verwendet, wenn eine Gesamtheit von mutierten Proteinen aus der strukturellen Matrize des Shiga-Toxins definiert wurde.
Kurz gesagt wurde das rekombinante Plasmid pJLB28 (32) als Matrize für die Mutagenese verwendet. Dieses Konstrukt enthält ein BglII-BalI-Fragment des Bakteriophagen H-19B, eingefügt in pUC19, welches die Produktion des aktiven SLT-1-Holotoxins bestimmt. Ein weiteres Konstrukt wurde hergestellt, indem ein PCR-Produkt, das aus dem auf pJLB28 vorliegenden SLT-1-Gen bestand, in den prokaryontischen Expressionsvektor pTUG (92) cloniert wurde. Das letztere Konstrukt, pTGXH, codiert die Produktion von SLT-1 mit einer Hexa-Histidinsequenz, die am N-Terminus der A-Kette fusioniert ist, wodurch die Reinigung von Toxinvarianten erleichtert wird.
Zahlreiche Verfahren zum Erzeugen zufälliger Mutationen in DNA sind verfügbar. Die Mutagenese unter Verwendung synthetischer Oligonucleotide mit Regionen definierter Degeneration (93 bis 96) ist ein etabliertes und verlässliches Verfahren, das die Bedürfnisse der Erfindung erfüllt, d.h. ein starr definiertes mutagenes Fenster und das Erfordernis, die Häufigkeit und die Art der erzeugten Mutationen zu kontrollieren. Mutagene Oligonucleotide (98-mere) mit der in 3 angegebenen Sequenz wurden auf einem DNA-Synthesegerät Applied Biosystems 392 synthetisiert. Die Schleife 1 und die Schleife 2 stellen die Reste 15 bis 19 bzw. 30 bis 33 der B-Untereinheit dar. Primer A (3A; entsprechend SEQUENZ ID NO: 3) wurde so synthetisiert, dass er in den zwei Schleifen kontrollierte Ausmaße an Randomisierung aufwies, wie im Text beschrieben. Primer B (3B; entsprechend SEQUENZ ID NO: 4) überlappt den Primer A an seinem 3'-Ende um 15 Basen und wurde verwendet, um in Verbindung mit Primer A durch eine beidseitig gestartete („mutually primed") Synthese eine kombinatorische Kassette herzustellen. Die zum Clonieren der Banken verwendeten Restriktionsstellen sind in fetter Schrift angegeben. Die Primer wurden so entworfen, dass die beiden Schleifen 1 und 2 gleichzeitig mutagenisiert wurden. In den mutagenen Primer wurde eine stumme Mutation eingebaut, die eine neue SacI-Restriktionsstelle zwischen den zwei Zonen einführte, wodurch die Durchmusterung von Transformanten-DNA erleichtert und das „Vermischen" („shuffling") von Zonen zwischen Varianten möglich gemacht wurde. Fünf verschiedene (98-mere) mutagene Primer mit steigenden Ausmaßen an „Zufälligkeit" in den Schleifen 1 und 2 wurden synthetisiert, so dass Banken mit vorhersagbarer Größe erzeugt werden konnten. Diese Strategie wurde erreicht, indem Codons in den Schleifenregionen in der Form „NNS" synthetisiert wurden, wobei N eine zur wachsenden Kette zugegebene Base aus einem Gemisch der Wildtyp-Base, „gedopt" mit einem fixen Prozentsatz der drei anderen Basen, darstellt und S eine Base bedeutet, die aus einem 1:1-Gemisch aus Cytosin und Guanin zugegeben wird. Der letztere Aspekt des Verfahrens macht Codons möglich, die alle 20 Aminosäuren spezifizieren, wobei jedoch die Wahrscheinlichkeit, dass eine bestimmte Aminosäure festgestellt wird, näher bei 1:20 liegt, da die Degeneration des DNA-Codes reduziert wird. Außerdem kann unter Verwendung dieser Strategie nur das Amber-Stoppcodon TAG erzeugt werden; auf diese Weise wird die Produktion verkürzter Proteine minimiert.
Die fünf synthetisierten mutagenen Primer hatten Doping-Niveaus im Bereich von 1,2 % bis 75 %, wobei 75 % vollständig zufällige Codons darstellen (d.h. das zum Plazieren der bestimmten Base verwendete Phophoramidit-Gemisch enthielt 25 % Wildtyp-Basen und jeweils 25 % der anderen Basen). Für anfängliche Untersuchungen wurde ein mit einem Doping-Niveau von 12,5 % hergestellter mutagener Primer gewählt, um eine Bank zu erzeugen, wobei die Zahl von möglicherweise verschiedenen Sequenzen (3,2 × 10⁶ Mutanten oder eine Mutationsrate von etwa fünf Substitutionen aus neun pro Clon) gut innerhalb der Grenzen der Transformationseffizienz von Escherichia coli lag.
Zwei Strategien wurden bisher eingesetzt, um die mutagenen Oligonucleotide in das Toxin-Gen einzuführen, wodurch Banken varianter Proteine hergestellt wurden; wobei das Einzelposition-Eliminierungsverfahren (97) verwendet wurde oder eine kombinatorische Kassette erzeugt wurde. Einzelsträngige zufällige mutagene Primer wurden in doppelsträngige Plasmide eingebaut, indem das Einzelposition-Eliminierungs-(USE)Mutageneseverfahren (97) unter Verwendung des Pharmacia-USE-Kits eingesetzt wurde. Mit diesem Verfahren ist es möglich, die Mutagenese an einem beliebigen doppelsträngigen Plasmid in Abwesenheit von Restriktionsstellen durchzuführen (97).
Bei einem Versuch, die Effizienz des Mutageneseverfahrens zu erhöhen und die Diversität der erhaltenen Clone zu maximieren, wurde auch ein Verfahren für kombinatorische Kassetten verwendet, um Toxinbanken herzustellen. In diesem Verfahren wurden die gleichen Oligonucleotid-Pools, die in 3A angegeben sind, an eine in 3B dargestellte überlappende Oligosequenz anneliert. Eine doppelsträngige Kassette wurde durch beidseitig gestartete Synthese hergestellt, d.h. indem DNA-Polymerase und dNTPs zusammen mit dem überlappenden Paar zu einem Reaktionsgemisch zugegeben wurden, so dass jedes Oligonucleotid für die Bildung des gegenüberliegenden Sense-Strangs codierte. Danach wurde die Kassette unter Verwendung von PCR amplifiziert und direkt in den Vektor, enthaltend das Toxin-Gen, an den Stellen AccI und PstI cloniert.
Weitere Feinheiten des Mutageneseprozesses sind dem Fachmann bekannt. Z.B. können Banken erzeugt werden, indem ein vollkommen Ligierungs-freies System verwendet wird, wobei das Uracil-DNA-Glycosylase-Verfahren eingesetzt wird (101). Vor allem unterstreicht die dargestellte Möglichkeit, die gleichen zufälligen Oligonucleotid-Pools in einer Vielzahl verschiedener Mutageneseverfahren einzusetzen, die Flexibilität des Systems und seine hohe Kapazität für eine Adaption und schnelle Verbesserung.
Beispiel 3
Durchmustern einer kombinatorischen Bank heteromerer cytotoxischer Proteine gegen die Brustkrebszelle SK-BR-3
Eine anfängliche Bank wurde unter Verwendung des USE-Verfahrens mit einem mutagenen Oligonucleotid mit einem Doping-Niveau von 12,5 % konstruiert. Nach der Transformation des E. coli-Stamms JM101 mit der Vektor-DNA, in welche das randomisierte Oligonucleotid eingeführt worden war, wurden Kolonien, die von Agarplatten entnommen worden waren, in Platten mit 96 Vertiefungen mit konischen Vertiefungsböden gezüchtet, und aus den Isolaten wurden einzelne Clone herausgegriffen. Um zu bestätigen, dass die Varianten ein Toxin mit einer A-Kette, welche zum Inaktivieren von Ribosomen fähig war, produzierten, wurden die aus 17 zufällig ausgewählten Clonen produzierten Extrakte gewonnen und auf ihre Fähigkeit getestet, die eukaryontische Proteinsynthese zu hemmen. Für diesen Test wurde das TnT gekoppelte Transkriptions/Translations-Retikulocytenlysat-System von Promega verwendet, wobei der Test daraus besteht, das Produkt eines Luciferase-Gens in Gegenwart und in Abwesenheit von Bakterienextrakten zu messen. Die Extrakte von allen getesteten Clonen hemmten die Translation des Luciferase-Proteins. Fünf dieser Varianten wurden sequenziert, wobei die Nucleotidsequenzen der randomisierten Schleifenregionen in Tabelle 1 angegeben sind. Die getesteten Clone spiegelten die gewünschte Mutationsrate von etwa fünf Aminosäureänderungen aus neun pro Clon wieder.
Tabelle 1 Nucleotid- und Aminosäuresequenzen von ShT-Mutanten-Clonen und Wildtyp-Shiga-Toxin
Tabelle 1: Vergleich von Nucleotid- und Aminosäuresequenzen zwischen mutagenen Schleifen von fünf ShT-Mutanten-Clonen, gewonnen aus einer unserer kombinatorischen ShT-Banken (12,5 % Doping-Niveau), und Wildtyp-Shiga-Toxin. Die Schleifen 1 und 2 stellen die Reste 15 bis 19 bzw. 30 bis 33 der B-Untereinheit von ShT (oder SLT-1) dar.
Die Fähigkeit einer ShT-Variante, Zellen abzutöten, stellt die direkteste und praktischste Möglichkeit dar, ihren Nutzen zu bestimmen. Diese Funktion (die von allen Toxinvarianten beibehaltene cytotoxische Eigenschaft) stattet jede Mutante mit einer eingebauten Suchmaschine aus, die es möglich macht, jede beliebige kombinatorische ShT-Bank gegen beliebige eukaryontische Zellen durchzumustern, um neue mutierte Toxine, welche solche Zellen abtöten, zu identifizieren.
In einem Beispiel wird die Brustkrebs-Zelllinie SK-BR-3 als anfängliches eukaryontisches Ziel verwendet. SK-BR-3-Zellen wurden von der American Type Culture Collection erhalten. Die Zellen wurden in α-MEM-Medien, angereichert mit 10 % fetalem Kälberserum, gezüchtet und gehalten. Die Zellen wurden bei 37°C, 5 % CO₂, gezüchtet und die Medien alle zwei Tage ausgetauscht. Die Zelldichten wurden so gewählt, dass sichergestellt wurde, dass jede Zelllinie zu Beginn eines Cytotoxizitäts-Tests mit etwa dem gleichen Konfluenzgrad vorlag.
Toxin-enthaltende Extrakte wurden durch Einfrieren-Auftauen [B. H. Johnson, M. H. Hecht, Bio/Technology 12: 1357 (1994)] von Pellets aus Übernacht-Kulturen einzelner Clone des E. coli-Stamms JM101, der mit mutagenisierter Vektor-DNA transformiert war, hergestellt. Die Clone wurden entweder in 200 μl (Clone auf SK-BR-3 durchgemustert) oder in 800 μl (Clone auf CAMA-1 durchgemustert) Terrific-Bouillon, angereichert mit 100 mg/ml Carbenicillin (TB-carb), gezüchtet. Man ließ die Extrakte 48 Stunden auf die Brustkrebszellen toxisch einwirken, danach wurde die Lebensfähigkeit der Zellen gemessen, indem entweder das Tetrazoliumsalz WST-1 (4-[3-(4-Jodphenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzoldisulfonat; Boehringer Mannheim) verwendet wurde oder indem der gesamte zelluläre Proteingehalt unter Verwendung des Farbstoffs Sulforhodamin B (SRB) gemessen wurde [P. Skehan et al., J. Nat. Cancer Inst. 82: 1107 (1990)]. Das Durchmustern der ShT-Clone erfolgte unter Verwendung der Sib-Selektion [M. McCormick, Meth. Enzymol. 151: 445 (1987)]. Wenn Clone, welche die Zielzellen abtöteten, identifiziert worden waren, wurden sie in 3 ml TB-carb eingeimpft, über Nacht bei 37°C unter Schütteln bei 250 UpM gezüchtet und danach extrahiert und erneut auf Cytotoxizität gegen die Zelllinie getestet.
Ein Satz von 1000 Clonen wurde aus der Bank (12,5 % Doping) herausgegriffen, um die Durchmusterungsstrategie zu testen. Ein 8 × 8-Sib-Selektions-Gittersystem (98) wurde verwendet, wobei ein bestimmter Clon mit sieben anderen in einem System vereinigt wurde, wobei jeder getestete Clon in zwei getrennten Pools vorlag. Die 8-Clon-Pools wurden amplifiziert und danach Extrakte aus den Gemischen auf Cytotoxizität gegen Vero-Zellen (eine Zelllinie, die gegenüber dem Wildtyp-Toxin stark empfindlich ist) und gegen die menschliche Brustkrebs-Zelllinie SK-BR-3 (eine Zelllinie, die gegenüber dem Wildtyp-Toxin unempfindlich ist) getestet. Ein kolorimetrischer Test, der auf der Spaltung des Tetrazoliumsalzes WST-1 durch mitochondriale Dehydrogenasen in lebensfähigen Zellen beruhte, wurde eingesetzt, um die Lebensfähigkeit der Zellen quantitativ zu bestimmen. Durch die Spaltung von WST-1 entsteht ein wasserlösliches Formazan, das im sichtbaren Bereich (450 nm) unter Verwendung eines Formats von Platten mit 96 Vertiefungen und eines Platten-Lesegeräts einfach gemessen werden kann, so dass Durchmusterungsstrategien mit hohem Durchsatz verwendet werden können. Auch andere kolorimetrische Tests auf die Lebensfähigkeit von Zellen wurden verwendet oder könnten eingesetzt werden, wie andere Tetrazoliumsalze XTT, MTT oder Farbstoffe wie Sulforhodamin B. Außerdem könnte eine Durchmusterung auch unter Verwendung von Zellproliferations-Tests durchgeführt werden, wobei die Ergebnisse anhand des Zählens von Zellkolonien oder durch den Einbau von radiomarkierten Nucleotiden oder Aminosäuren in Nucleinsäuren oder Proteine gemessen werden. Clone, bei denen die Produktion von zelltötenden Toxinen festgestellt wurde, wurden erneut einzeln auf den gleichen Zelllinien getestet. Dieser einleitende Satz von Clonen hat bisher mindestens 14 Clone ergeben, die im Vergleich zu dem Wildtyp-ShT eine dramatische Steigerung ihrer Fähigkeit, SK-BR-3-Zellen abzutöten, zeigen. Mehrere Lysate waren in der Lage, im Vergleich zu Kontrollvertiefungen, welche lebensfähige Zellen enthielten (wobei kein Toxin vorlag), ≥ 90 % der SK-BR-3-Zellen auszulöschen. Die Plasmid-DNA wurde aus den Isolaten, die in Cytotoxizitäts-Tests SK-BR-3-Zellen durchweg abtöteten, gewonnen und sequenziert. Die Sequenz-Alignments in den mutierten B-Untereinheiten-Schleifenregionen von 14 mutierten Toxinen sind in Tabelle 2 dargestellt.
Mehrere Clone zeigten eine reduzierte Cytotoxizität auf Vero-Zellen, jedoch eine gesteigerte SK-BR-3-Toxizität. Die letzteren Clone sind von signifikantem Interesse, da das Ziel der Erfindung darin besteht, die natürliche Spezifität des Toxins zu ändern, d.h. von dem Glycolipid CD77 zu einem anderen Zelloberflächen-Marker. Die Durchmusterungsstrategie kann optimiert werden, indem man die Durchmusterung in einen größeren Maßstab von mehr als 1000 einzelnen Clonen durchführt.
Die aus dieser Bank mit einem geringen Ausmaß an Degeneration identifizierten Clone zeigen eine deutliche Konservierung der ersten Schleife (Reste 15 bis 19), dies spiegelt möglicherweise eine „Verschiebung" („skewing") der gewonnenen Isolate zu ShT-Mutanten hin wieder, die in der Lage sind, an Rezeptor-Homologe von CD77 zu binden. Im Gegensatz dazu zeigten Clone, die aus der gleichen Bank nach dem Zufall herausgegriffen wurden, keinerlei Prädisposition gegenüber der Aufrechterhaltung der Wildtyp-Sequenz, und sie wiesen Aminosäuresubstitutionen in ihren Zielregionen mit der vorausgesagten Rate auf (Ergebnisse nicht dargestellt). Mehrere der cytotoxischen ShT-Varianten wurden überexprimiert, bis zur Homogenität gereinigt und sodann auf ihre Cytotoxizität gegen SK-BR-3-Zellen getestet.
Tabelle 2 SK-BR-3-Bank
Tabelle 2: Aminosäuresequenzen von Clonen, die eine cytotoxische Aktivität auf SK-BR-3-Zellen (gewonnen aus einer Bank mit einem Doping-Niveau von 12,5 %) und CAMA-1 (Clone gewonnen aus einer Bank mit einem Doping-Niveau von 75 %) zeigen. Die Schleifen 1 und 2 stellen die gleichen B-Untereinheiten-Reste dar, die in Tabelle 1 angegeben sind.
Beispiel 4
Durchmustern einer kombinatorischen Bank heteromerer cytotoxischer Proteine gegen die Brustkrebs-Zelllinie CAMA-1
Eine zweite Bank, dieses Mal unter Verwendung eines Oligonucleotid-Pools mit einem stärker degenerierten Doping-Niveau von 60 %, wurde unter Verwendung des früher beschriebenen Verfahrens für kombinatorische Kassette hergestellt. Die Bank wurde im Wesentlichen wie die erste unter Verwendung des Sulforhodamin-B-Tests auf Lebensfähigkeit von Zellen und unter Verwendung der Zelllinie CAMA-1 durchgemustert. Diese Zelllinie ist auch ein Mammakarzinom wie SK-BR-3, es wurde jedoch gezeigt, dass bei dieser Zelllinie der Marker CD77 fehlt und dass sie extrem resistent gegenüber dem nativen SLT-1-Toxin ist. CAMA-1-Zellen wurden aus der American Type Culture Collection erhalten. Die Zellen wurden in α-MEM-Medien, angereichert mit 10 % fetalem Kälberserum, gezüchtet und gehalten. Die Zellen wurden bei 37°C, 5 % CO₂, gezüchtet und die Medien alle zwei Tage ausgetauscht. Die Zelldichten wurden so gewählt, dass sichergestellt wurde, dass jede Zelllinie zu Beginn eines Cytotoxizitäts-Tests mit etwa dem gleichen Konfluenzgrad vorlag.
Eine Sammlung von 600 einzelnen SK-BR-3-Clonen aus der Kassetten-Bank wurde auf cytotoxische Wirkung gegen CAMA-1 durchgemustert, und wie im Fall von SK-BR-3 wurden mehrere vielversprechende Toxinvarianten identifiziert, deren Sequenzen in Tabelle 3 dargestellt sind. Es wurde gefunden, dass die aus dieser Bank mit hoher Diversität identifizierten Clone Aminosäuresequenzen in den Zielregionen aufwiesen, die von denjenigen im Wildtyp-Toxin fast vollständig verschieden waren. Die Sequenzdiversität dieser Bank ist sehr groß (bis zu 20⁹ Mutanten) und übersteigt die Grenzen der Transformationseffizienz von Escherichia coli (etwa 10¹⁰). In 6 sind Cytotoxizitätskurven für drei ShT-Mutanten dargestellt, die aus dieser Durchmusterung hergeleitet wurden. Für diese ShT-Varianten (Varianten 122, 126 und 824; Zellpassage # 13; Symbole: natives Toxin (Δ); ShT-Variante 122 (♦); ShT-Variante 126 (⦁); ShT-Variante 824 (∎)) wurden CD₅₀-Werte berechnet, die im Bereich von 100 bis 300 nM liegen. Jeder Punkt stellt die prozentuale Lebensfähigkeit der Zellen dar, die aus dem Durchschnitt der in dreifacher Ausführung durchgeführten Experimente errechnet wurde.
Tabelle 3 CAMA-1-Bank
Tabelle 3: Aminosäuresequenzen von Clonen, die eine cytotoxische Aktivität gegen CAMA-1 zeigen (die Clone wurden aus einer Bank mit einem Doping-Niveau von 60 % gewonnen). Die Schleifen 1 und 2 stellen die gleichen B-Untereinheiten-Reste dar, die in Tabelle 1 angegeben sind.
Beispiel 5
Feststellung des zyklischen Auftretens von Zelloberflächenmolekülen, welche die Ziele von Toxinvarianten sind
Es wurde gefunden, dass sich die Empfindlichkeit von SK-BR-3-Zellen gegenüber den verschiedenen Mutanten als eine Funktion von Zellpassagen änderte. 4 zeigt dieses Phänomen für die von Clon 506 hergeleitete Toxinvariante. 4 zeigt die Wirkung der Variante 506 auf die Passage 34 (♦), 40 (∎), 56
und 68
und außerdem die Wirkung des nativen ShT auf die Passagen 40 (❒), 56 (∆) und 59 (❍). Die Passagenzahl stellt die Anzahl von Passagen der Zelllinie SK-BR-3 in Kultur dar, wobei mit der Passage # 24 begonnen wird, wie durch die American Type Culture Collection definiert ist. Jeder Punkt stellt die prozentuale Lebensfähigkeit der Zellen dar, die aus dem Durchschnitt der in dreifacher Ausführung durchgeführten Experimente errechnet wurde. Der CD₅₀-Wert für diese ShT-Mutante lag im Bereich von 3,5 nM bis > 290 nM, abhängig von der Anzahl der Passagen der Zelllinie SK-BR-3. Die Durchmusterung machte somit die schnelle und vorübergehende Natur von ausgewählten Oberflächenmarkern auf SK-BR-3-Zellen deutlich, und dies sogar im Fall einer relativ clonalen Population von Zellen. Interessanterweise ist die Änderung in der Empfindlichkeit von SK-BR-3-Zellen gegenüber ShT-506 in Bezug auf die Anzahl der Passagen ein zufälliges Ereignis (5). Die als Ziel dienende Zelllinie (beginnend bei Passage # 24; ATCC) verhielt sich zyklisch, wobei sie gegenüber der ShT-Variante 506 bei Passage # 32 resistent war, bei den Passagen # 34 und # 40 sensitiv war, bei der Passage # 56 wieder fast resistent war und schließlich bei den Passagen # 63 und # 68 gegenüber der Wirkung der ShT-Variante 506 wieder empfindlich war. Im Gegensatz dazu bleiben SK-BR-3-Zellen gegenüber der Wirkung des nativen Toxins über einen ähnlichen Bereich von Zellpassagen resistent, dies zeigt, dass das Zelloberflächenmolekül CD77 über die Zeit stabil bleibt. Z.B. erläutert 5 den Unterschied in der Lebensfähigkeit der Zellen, der festgestellt wurde, wenn SK-BR-3-Zellen einer 14 nM Lösung entweder des nativen ShT (⦁) oder der ShT-Variante 506 (❍) bei verschiedener Anzahl von Zellpassagen ausgesetzt wurden (jeder Punkt stellt die prozentuale Lebensfähigkeit der Zellen dar, die aus dem Durchschnitt der in dreifacher Ausführung durchgeführten Experimente errechnet wurde).
Dieses Phänomen legt nahe, dass die Oberflächenexpression von CD77 stärker reguliert ist als die des Markers, der durch die ShT-Variante 506 erkannt wird. Unterschiede in der Cytotoxizität von ShT-506 gegenüber SK-BR-3-Zellen wurden für mehr als 100 Passagen der Zelllinie festgestellt, die alle unter identischen Wachstumsbedingungen durchgeführt wurden (Ergebnisse nicht gezeigt). Das Durchmustern der Banken dieser Varianten stellte somit eine wertvolle Quelle von Sonden bereit, um die Expression und das schnelle zyklische Auftreten von Zelloberflächenmolekülen zu untersuchen. Durch andere Arten von Untersuchungen könnte dieses Merkmal der Banken der vorliegenden Erfindung noch weiter ausgenutzt werden. Z.B. könnten Sammlungen von ShT-Varianten dazu dienen, Differenzierungsereignisse phänotypisch zu definieren, die dazu führen, dass Tumorzellen sich ein metastatisches Potential zulegen, oder die Entwicklung hämatopoetischer Zellstammbäume zu untersuchen.
Die Tatsache, dass die meisten Tumoren heterogen sind, legt nahe, dass eine große Zahl von Toxin-Kandidaten identifiziert werden sollte, die dann in der Therapie vielleicht als ein Cocktail verabreicht werden können. Diese Tatsache unterstreicht die Leistungsfähigkeit der beschriebenen Vorgehensweise, da eine einzelne Toxinmatrize auf zahlreiche mögliche Spezifitäten durchgemustert werden kann, wohingegen andere Mittel wie Immuntoxine nur eine Spezifität für die Zellen besitzen, die ihren Zielrezeptor aufweisen. Das Konzept der Spezifität setzt auch voraus, dass die Expression eines als Ziel dienenden Zelloberflächen-Markers innerhalb einer Zellpopulation konstant bleibt. Die in 4 dargestellten Ergebnisse würden gegen die Gültigkeit dieser Hypothese sprechen. Die hier dargestellten Ergebnisse machen die Einfachheit deutlich, mit der man durch die Verwendung der vorliegenden Erfindung eine Sammlung von Toxinmutanten identifizieren kann, die gegenüber einer relativ homogenen Zellpopulation cytotoxisch sind. Die auf cytotoxischen Tests basierenden Suchverfahren können als Durchmusterungsstrategien mit hohem Durchsatz durchgeführt werden und erlauben somit möglicherweise eine gründlichere Untersuchung von Banken von varianten Toxinen, um solche Familien von Toxinmutanten zu finden. Im Zusammenhang mit ex vivo-Reinigungs-(„ex vivo purging")Situationen kann der Nutzen von Toxinvarianten einfach festgestellt werden, indem Knochenmarkzellen oder periphere Stammzellen diesen Mitteln ausgesetzt werden und das Ausmaß der Rekonstitution von hämatopoetischen Zellstammbäume unter Verwendung der Durchflusscytometrie in in vitro- oder in vivo-Ansätzen festgestellt wird (z.B. Transplantationsexperimente in SCID-, NOD/SCID-Mäusen; Ref. 14). Die anfängliche Auswahl der Brustkrebszelllinien SK-BR-3 und CAMA-1 als Ziel der ShT-Bank-Suchverfahren kommt durch die Tatsache zustande, dass die meisten autologen Knochenmarktransplantate (ABMTs) oder peripheren Stammzellen-Transplantate zurzeit bei Brustkrebspatienten durchgeführt werden und dass es sich bezüglich des langfristigen Überlebens des Patienten als günstig erweisen könnte, ihre Stammzellen einer ex vivo-Reinigung zu unterziehen (13, 106-107). Der Bedarf für ein einmaliges selektives Mittel für Krebszellen, ein Hauptanliegen beim Entwurf von Strategien für eine in vivo-Behandlung, ist stark zurückgegangen, da ein oder mehrere mutierte Toxine klinisch nützlich sein können, so lange der als Ziel dienende Oberflächenmarker auf menschlichen Stammzellen nicht vorliegt.
Analogien können zwischen der Struktur von Antikörpern und ShT-Varianten bezüglich ihrer Liganden-Bindeeigenschaften gezogen werden. Antikörper enthalten zwei Antigen-Bindungsstellen, während ShT-B-Untereinheiten-Pentamere mindestens fünf identische Liganden-bindende Domänen besitzen. Beide Struktureinheiten besitzen ein konserviertes Gerüst von β-Strängen, die durch Schleifenregionen verbunden sind, welche zusammen ihre Rezeptor-Bindedomänen definieren. Wie im Fall von Antikörper-Bindungsstellen können B-Untereinheiten-Varianten somit eher an ein Spektrum von molekularen Einheiten, wie Proteinen, Peptiden, Nucleinsäuren oder sogar an organischen Einheiten als an Zucker oder Glycolipide (wie CD77) binden. Jedoch wird die Diversität von Toxinen, die aus den Banken der Erfindung stammen, nicht durch genetische Rekombination und somatische Mutationen beeinflusst, welche das Antikörperrepertoire bestimmen. Das riesige Potential für die Diversität der in der Bank vorhandenen Rezeptorbindung unterstreicht die Tatsache, dass, wenn die Degeneration der Bank zunimmt, dies auch die Diversität von Molekülen auf der Zelloberfläche tut, die als Liganden für mutierte B-Untereinheiten verfügbar sind.
Beispiel 6
Verwendung eines mutierten Toxins für die Entwicklung eines diagnostischen Werkzeugs
Nach der Auswahl eines heteromeren Protein-Toxins und dem Herstellen einer Bank von Mikroorganismus-Clonen, welche variante Protein-Toxine des heteromeren Protein-Toxins produzieren, wird die Bank anschließend durch die Verfahren der Erfindung gegen eine Zielzelle durchgemustert, d.h. durch Isolieren von Clonen oder Pools von Clonen, welche die varianten Protein-Toxine produzieren, Behandeln von Präparaten der Zielzelle mit den varianten Protein-Toxinen und Auswählen eines cytotoxischen mutierten Proteins oder Pools von cytotoxischen mutierten Proteinen, welches/welcher die Zielzelle hemmt oder abtötet. Die Gene, welche das cytotoxische mutierte Protein oder den Pool von Proteinen produzieren, werden so manipuliert, dass sie nachweisbare Marker endogen produzieren. Auf diese Weise wird eine diagnostische Sonde konstruiert, mit der das Vorliegen eines Zelloberflächen-Markers nachgewiesen werden kann, indem eine Marker-DNA, welche einen nachweisbaren Marker codiert, durch ein beliebiges Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, in die DNA-Sequenz(en) der bindenden Untereinheit des cytotoxischen mutierten Proteins oder Pools von Proteinen eingeführt wird und diagnostische Sonden aus der diagnostischen DNA-Sequenz erzeugt werden. Die hier genannten Erfinder haben grünes fluoreszierendes Protein (GFP) aus der Qualle Aequorea victoria als fluoreszierenden Marker für solche diagnostischen Sonden verwendet. Dieser Marker kann in einer Vielzahl von Organismen eingesetzt werden, die von Bakterien bis zu höheren Pflanzen und Tieren reichen (Tsein, R. Y., 1998, Annu. Rev. Biochem. 67: 509-544; Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., und Prasher, D. C., 1994, Science 263: 802-805). Die Bildung der fluoreszierenden Chromophore ist Art-unabhängig, und das Genprodukt ist durch seine intensive Fluoreszenz einfach nachzuweisen (Prasher, D. C., 1995, Trends Genet., 1995, Aug., 11 (8): 320-323). Es eignet sich zum Überwachen der Genexpression in vivo, in situ und in Echtzeit (Rizzuto, R., et al., 1998, Trends Cell Biol., Jul., 8 (7): 288-292). Wenn GFP in eukaryontischen oder prokaryontischen Zellen exprimiert wird, ergibt es eine leuchtende grüne Fluoreszenz. GFP fluoresziert in Abwesenheit irgendwelcher anderer intrinsischer oder extrinsischer Proteine, Substrate oder Cofaktoren. Die Fluoreszenz ist stabil, Art-unabhängig und kann in einigen Fällen in lebenden Zellen und ganzen Tieren nicht-invasiv überwacht werden (Chalfie, M., et al., vorstehend).
Hinsichtlich des gezeigten Nutzens der Erfindung wird der Fachmann verstehen, dass das Verfahren auch auf andere Zellen angewendet werden kann, wobei man erwarten kann, dass dadurch geeignete therapeutische und diagnostische Moleküle identifiziert werden. Man kann davon ausgehen, dass man mit zahlreichen Zielstellen auf Zellen eine große Zahl von mutierten Toxinen mit cytotoxischer Aktivität finden wird.

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Claims

Verfahren zum Identifizieren einer cytotoxischen mutierten Variante eines cytotoxischen Wildtyp-Proteins, wobei die mutierte Variante eine Rezeptor-Bindespezifität besitzt, die unterschiedlich zum Wildtyp-Protein ist, umfassend (a) das Auswählen eines heteromeren Protein-Toxins mit einer toxischen Domäne oder Untereinheit und einer bindenden Domäne oder Untereinheit; (b) das Einführen von Mutationen in DNA, die die bindende Domäne oder Untereinheit des heteromeren Protein-Toxins codiert, um eine Vielzahl von varianten Formen des heteromeren Protein-Toxins herzustellen; (c) das Erzeugen einer Bibliothek von Mikroorganismus-Clonen, die variante Formen des heteromeren Protein-Toxins produzieren; und (d) das Durchmustern der varianten Formen des heteromeren Protein-Toxins der Bibliothek gegen eine Zellpopulation, der die Sensitivität für das cytotoxische Wildtyp-Protein fehlt oder die geringere Grade an Sensitivität für das cytotoxische Wildtyp-Protein besitzt, durch: (i) das Isolieren von Clonen oder Pools von Clonen, die die varianten Formen des heteromeren Protein-Toxins produzieren; (ii) das Behandeln von Präparaten der Zellpopulation mit varianten Formen des heteromeren Protein-Toxins, das durch die isolierten Clone oder Pools von Clonen produziert wurde; und (iii) das Auswählen eines cytotoxischen mutierten Proteins oder eines Pools von cytotoxischen mutierten Proteinen, das\der in einem Ausmaß größer als das Wildtyp-Protein Proteinsynthese hemmt oder die Zellpopulation abtötet, wodurch eine Mutantenvariante mit einer Rezeptor-Bindespezifität, die unterschiedlich zum Wildtyp-Protein ist, identifiziert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Zellen in der Zellpopulation eukaryontisch sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Bibliothek Bakterien oder bakterielle Überstände oder Hefe oder Hefe-Überstände umfasst, die die varianten Formen des heteromeren Protein-Toxins enthalten.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die DNA der bindenden Domäne oder der Untereinheit in einem Plasmid in dem Mikroorganismus vorliegt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Mutation durch die Verwendung eines kombinatorische Kassette-Verfahrens in die bindende Domäne oder Untereinheit eingeführt wird, das umfasst (a) das Erstellen synthetischer mutierter Oligonucleotide, die fähig sind, sich mit einem entsprechenden Wildtyp-Oligonucleotid der bindenden Domäne oder Untereinheit zu verbinden; (b) das Annelieren des synthetischen Oligonucleotids der bindenden Domäne oder Untereinheit an ein überlappendes Wildtyp-Oligonucleotid, um eine Doppelstrang-Sequenz auszubilden; (c) das Erzeugen einer kombinatorischen Kassette durch beidseitig-gestartete („mutually primed") Synthese der doppelsträngigen Sequenz; und (d) das Einbringen der Kassette in einen Vektor, der ein Gen für das Toxin enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Mutation in die bindende Domäne oder Untereinheit mittels eines Einzelposition-Eliminierungsverfahrens eingeführt wird.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das heteromere Protein-Toxin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus prokaryontischen oder eukaryontischen Proteinen oder Protein-Fusionskonstrukten, die fähig sind, Proteinsynthese zu blockieren.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das heteromere Protein-Toxin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Shiga-Toxin, Shiga-ähnlichen Toxinen, Ricin, Abrin, Gelonin, Crotin, antiviralem Protein von der Kermesbeere, Saporin, Momordin, Modeccin, Sarcin, Diphterie-Toxin und Pseudomonas aeruginosa-Exotoxin A.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die bindende Domäne oder Untereinheit abgeleitet ist aus der B-Untereinheit-Matrize entweder des Shiga-Toxins oder der Shiga-ähnlichen Toxine oder homologen Gegenstücken aus E. Coli- hitzelabilen Enterotoxinen, Cholera-Toxin, Pertussis-Toxin oder der Rezeptor-bindenden Domäne von Ricin.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei Zellen in der Zellpopulation Tumorzellen sind.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Tumorzellen Brustkrebszellen sind.
Verfahren gemäß Anspruch 11, wobei die Brustkrebszellen SK-BR3 oder CAMA-I-Zellen sind.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das heteromere Protein-Toxin Shiga-Toxin oder Shiga-ähnliches Toxin 1 ist.
Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei die Mutation in eine oder mehrere Schleifen-Regionen an den Resten 15 bis 19, 30 bis 33 oder 58 bis 64 eingeführt wurde.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, ferner umfassend den Schritt der Bestimmung der Sequenz des identifizierten cytotoxischen mutierten Proteins.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Auswählen eines cytotoxischen mutierten Proteins oder eines Pools von cytotoxischen mutierten Proteinen das Auswählen eines cytotoxischen mutierten Proteins oder eines Pools von cytotoxischen mutierten Proteinen mit einer verstärkten Eigenschaft, eine ausgewählte Zubereitung der Zellpopulationen abzutöten, umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die erhöhte Fähigkeit abzutöten das Abtöten von ≥ 90% der ausgewählten Zubereitung umfasst.
Verfahren zum Herstellen eines cytotoxischen Proteins mit selektiver Bindeaffinität für einen Rezeptor, umfassend die Schritte: (a) des Identifizierens eines cytotoxischen mutierten Proteins unter Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei die Zellen in der Zellpopulation den Rezeptor exprimieren; und (b) des Anfertigens von zusätzlichen Kopien des identifizierten cytotoxischen mutierten Proteins.
Verfahren zum Abtöten oder Hemmen der Proteinsynthese einer Zielzelle in vitro, das das Behandeln der Zielzelle mit einem cytotoxischen Protein, das gemäß des Verfahrens von Anspruch 18 hergestellt wurde, umfasst, wobei die Zielzelle einen Rezeptor exprimiert, an den das cytotoxische Protein spezifisch bindet.
Verfahren zum Identifizieren therapeutischer Proteine mit Bindespezifität für eine Zielzelle, umfassend: (a) das Herstellen eines cytotoxischen mutierten Proteins oder eines Pools von Proteinen durch das Verfahren gemäß Anspruch 18; (b) das Durchmustern des cytotoxischen mutierten Proteins oder des Pools von Proteinen gegen die Zielzellen und gegen Nicht-Zielzellen durch Behandeln einer Zubereitung von Ziel- und Nicht-Zielzellen mit dem cytotoxischen mutierten Protein oder dem Pool von Proteinen; und (c) das Auswählen eines therapeutischen Proteins oder eines Pools von therapeutischen Proteinen, die darin wirksam sind, die Proteinsynthese der Zielzellen zu hemmen oder die Zielzellen abzutöten und die weniger wirksam sind im Hemmen der Proteinsynthese der Nicht-Zielzellen oder im Abtöten der Nicht-Zielzellen als im Hemmen der Proteinsynthese der Zielzellen oder im Abtöten der Zielzellen.
Verfahren zum Konstruieren einer diagnostischen Sonde zum Nachweisen der Anwesenheit eines Zelloberflächenmarkers, umfassend: (a) das Auswählen eines cytotoxischen mutierten Proteins, das spezifisch an den Zelloberflächenmarker bindet, durch das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15; und (b) das Erstellen einer diagnostischen Sonde durch Markieren des ausgewählten cytotoxischen mutierten Proteins auf eine Art und Weise, die die Fähigkeit der bindenden Domäne oder Untereinheit des ausgewählten cytotoxischen mutierten Proteins, spezifisch an den Zelloberflächenmarker zu binden, aufrecht erhält.
Verfahren gemäß Anspruch 21, wobei die diagnostische Sonde durch ein Verfahren hergestellt wird, das umfasst: (i) das Erstellen einer diagnostischen DNA-Sequenz, die eine Marker-DNA, die einen nachweisbaren Marker codiert, und eine DNA-Sequenz der bindenden Domäne oder Untereinheit, die die bindende Domäne oder Untereinheit des ausgewählten cytotoxischen mutierten Proteins codiert, umfasst; und (ii) das Exprimieren der diagnostischen DNA Sequenz, um eine diagnostische Sonde zu erzeugen.
Verfahren gemäß Anspruch 22, wobei die Marker-DNA das grüne fluoreszierende Protein (GFP) codiert.
Verfahren gemäß Anspruch 21, das ferner den Schritt des Modifizierens des cytotoxischen mutierten Proteins oder des Pools von Proteinen durch Abtrennung und Inaktivierung der toxischen Domäne oder Untereinheit des toxischen mutierten Proteins umfasst.
Verfahren zum Herstellen eines Zielproteins für die Verfrachtung zu einer Zielzelle mit einem Zelloberflächenmarker, wobei das Zielprotein einen bindenden Teil besitzt, umfassend den Schritt des Identifizierens einer bindenden Domäne oder Untereinheit, die an den Zelloberflächenmarker bindet, durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 und das Einbringen der bindenden Domäne oder Untereinheit als bindenden Teil oder das Einbringen der bindenden Domäne oder Untereinheit in den bindenden Teil.
Therapeutische oder diagnostische Zusammensetzung, die ein cytotoxisches heteromeres Protein umfasst, das eine cytotoxische Untereinheit und eine bindende Untereinheit umfasst, wobei das cytotoxische heteromere Protein durch Mutation von Shiga-Toxin oder einem Shiga-ähnlichem Toxin an einer oder mehreren Stelle(n) innerhalb der bindenden Untereinheit des Shiga-Toxins oder des Shiga-ähnlichen Toxins abgeleitet wird, wobei die Stelle in den Schleifen lokalisiert sind, die die Reste beherbergen, die an dem Ausbilden einer Rezeptor-Binde-Spalte für CD77 beteiligt sind, wobei, als ein Ergebnis der Mutation, das cytotoxische Protein nicht an CD77 bindet, aber mit cytotoxischem Effekt an einen oder mehrere andere Rezeptoren bindet.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 26, wobei das Shiga-ähnliche Toxin Shiga-ähnliches Toxin 1 ist und wobei die Mutationen in den Resten 15 bis 19, 30 bis 33 oder 58 bis 64 der bindenden Untereinheit lokalisiert sind.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 26 oder 27, die ein Arzneimittel ist.
Verwendung der Zusammensetzung gemäß Anspruch 27 oder 28 für die Herstellung eines Arzneimittels zum Behandeln eines Zustands, der das Dirigieren einer Medizin zu einer Zielzelle erfordert, oder zum Abtöten oder Hemmen der Proteinsynthese einer Zielzelle.