DE69815380T2

DE69815380T2 - N,n'-bis (sulfonyl) hydrazine die als antineoplastische mittel nützlich sind

Info

Publication number: DE69815380T2
Application number: DE69815380T
Authority: DE
Inventors: C. Alan SARTORELLI; Krishnamruthy Shyam; G. Philip PENKETH; Shu-Hui Chen
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 1997-11-03
Filing date: 1998-10-21
Publication date: 2004-05-13
Anticipated expiration: 2018-10-22
Also published as: AU735349B2; EP1028721A1; JP2001521893A; ES2200383T3; KR20010031708A; CN1278169A; CA2308315A1; JP4331889B2; US6040338A; AU1110399A; EP1028721A4; CA2308315C; CN1124846C; DE69815380D1; EP1028721B1; HK1032916A1; BR9813923A; WO1999022726A1; ATE241976T1; KR100566688B1

Description

Die Erfindung betrifft N,N'-Bis(sulfonyl)hydrazine und genauer gesagt Alkoxy- und Aryloxycarbonylderivate von N,N'-Bis(sulfonyl)hydrazinen, welche antineoplastische Aktivität besitzen.
Feste Tumoren sind durch chemotherapeutische und strahlentherapeutische Vorgehensweisen schwierig zu behandeln. Die ineffiziente Vaskularisierung des festen Tumors während seiner Entwicklung führt zu hypoxischen (das heißt sauerstoffdefizienten) Bereichen innerhalb der Tumormasse (Moulder, J. L., und Rockwell, S., Cancer Met. Rev. 5: 313–341, 1987; Sartorelli, A. C., Cancer Res. 48: 775–778 (1988)). Diese ineffiziente Vaskularisierung führt zur Entstehung von einzigartigen Problemen bei der Behandlung von Tumoren. Beispielsweise führt die ineffiziente Vaskularisierung fester Tumoren zu Zellen, welche hinsichtlich Sauerstoff und Nährstoffen ausgezehrt sind und sich entweder nicht im Zyklus befinden oder langsam durch den Zellzyklus bewegen. Somit sind diese Zellen verhältnismäßig resistent gegen Zellzyklusspezifische Chemotherapie und schwieriger mit angemessenen Arzneimittelkonzentrationen zu versorgen. Der Sauerstoffmangel dieser Zellen macht sie weiterhin resistent gegen Sauerstoffaktivierte Mittel, wie Bleomycin und Streptonigrin, welche die Bildung von O₂-abgeleiteten Spezies erfordern, um wirksam zu sein, und gegen ionisierende Strahlung, deren Toxizität von der Sauerstoffkonzentration abhängig ist. Somit schränken die ineffiziente Vaskularisierung fester Tumoren und die resultierende Subpopulation hypoxischer Zellen die Auswahl nützlicher und wirksamer Chemotherapiebehandlungen ein.
Die Resistenz von Tumorzellen gegen eine große Anzahl von chemotherapeutischen Krebsmitteln ist auch mit erhöhten intrazellulären Spiegeln der Glutathion(GSH)- und/oder Glutathion-S-Transferase (GST)-Aktivität in Zusammenhang gebracht worden (Stewart, D. J., und Evans, W. K., Cancer Treat. Rev. 16: 1–40 (1989)). Viele neoplastische Zelllinien, welche keinen Arzneimittel-Selektionsdrücken unterworfen worden sind, besitzen auch intrinsisch hohe Spiegel an GSH, und relativ hohe Spiegel an GST-Aktivität sind in einer Vielzahl von menschlichen Tumoren gefunden worden. Es wird angenommen, dass die schutzgebenden Effekte auf spontanen und enzymkatalysierten Wechselwirkungen zwischen der Sulfhydrylgruppe des Glutathion-Moleküls und dem chemotherapeutischen Mittel beruhen. Folglich ist, zusätzlich zur Hypoxie, die Resistenz verschiedener Zelllinien und humaner Tumoren gegen eine Vielzahl von chemotherapeutischen Mitteln ihren hohen Nicht-Protein-Thiol- und GST-Gehalten zugeschrieben worden.
Auch Strahlentherapiebehandlungen sind in großem Maße bei der Behandlung von festen Tumoren erfolglos gewesen. Insbesondere hypoxische Zellen haben sich als resistent gegen ionisierende Strahlung erwiesen, weil die Empfindlichkeit gegenüber ionisierender Strahlung abhängig von der Sauerstoffkonzentration ist.
Feste Tumoren sind viele Jahre lang mit Chemotherapie und Strahlentherapie mit begrenztem Erfolg behandelt worden. Es sind neue potenzielle Arzneimittel entwickelt worden, um das Problem der chemotherapeutischen und radiotherapeutischen Resistenz zu lösen. Beispielsweise sind mehrere Klassen von Nitro-enthaltenden synthetischen Hypoxie-selektiven Mitteln entwickelt worden, einschließlich Analogen von Nitroimidazolen (Jenkins, T. C., The Chemistry of Antitumor Agents, Wilman, Hrsg., S. 342–369, Blackie, Glasgow (1990)), Nitroacridinen (Wilson, W. R., Denny, W. A., Twigden, S. J., Baguely, B. C., und Probert, J. C., Brit. J. Cancer 49: 215–223 (1984)), Benzotriazin-N-Oxiden (Zeman, E. M., Brown, J. M., Lemmon, M. J., Hirst, V. K., und Lee, W. W., Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 12: 1239–1242 (1986)), Nitrobenzylhalogeniden und Carbamaten (reicher, B. A., und Sartorelli, A. C., J. Med. Chem. 23: 955960 (1980); Kirkpatrick, D. L., Johnson, K. E., und Sartorelli, A. C., J. Med. Chem. 29: 2048–2052 (1986)), quaternären Nitrobenzyl-Senf-Salzen (Tercel, M., Wilson, W. R., und Denny, W. A., J. Med. Chem. 36: 2578–2579 (1993); Tercel, M., Wilson, W. R., Anderson, R. F., und Denny, W. A., J. Med. Chem. 39: 1084– 1094 (1996)), und Nitrobenzylphosphordiamidaten (Mulcahy, R. T., Gipp, J. J., Schmidt, J. P., Joswig, C., und Borch, R. F., J. Med. Chem. 37: 1610–1615 (1994)). Alle diese Verbindungsklassen unterliegen angenommenermaßen einer präferenziellen reduktiven Aktivierung in hypoxischen Zellen unter Erzeugung wirkungsvoller Cytotoxine.
Es sind die in der Formel (1) gezeigten 1,2-Bis(sulfonyl)-1-methyl- und -1-(2-chlorethyl)hydrazin-Verbindungen identifiziert worden, welche antineoplastische Aktivität besitzen (Shyam, K., Hrubiec, R. T., Furubayashi, R., Cosby, L. A., und Sartorelli, A. C., J. Med. Chem. 30: 2157–2161 (1987); Shyam, K., Penketh, P. G., Divo, A. A., Zoomis, R. H., Patton, C. L., und Sartorelli, A. C., J. Med. Chem. 33: 2259–2264 (1990)).
In der Formel (1) sind R¹ und R² Alkylgruppen oder Arylgruppen, und R ist -CH₃ oder -CH₂CH₂Cl. Diese Verbindungen durchlaufen angenommenermaßen eine spontane Zersetzung in wässrigen Medien unter Erzeugung der vermutlich alkylierenden Spezies RN=NSO₂R². Die aktivste Verbindung dieser Klasse ist 1,2- Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)hydrazin (Verbindung 2) und wird im U.S.-Patent Nr. 4 892 887 von Sartorelli et al. beschrieben:
Von der Verbindung 2 wurde gezeigt, dass sie 40% Heilungen bei Mäusen, welche die L1210-Leukämie aufweisen, bei Verabreichung als intraperitoneale Einzel-Dosis erzeugt (Shyam, K., Penketh, P. G., Divo, A. A., Zoomis, R. H., Patton, C. L., und Sartorelli, A. C., J. Med. Chem. 33: 2259–2264 (1990)). Allerdings ist die Verbindung 2 lediglich über einen schmalen Dosierungsbereich hinweg aktiv. Darüber hinaus weist die Verbindung 2 eine relativ kurze Halbwertzeit (30 bis 40 Sekunden bei pH 7,4 und 37°C) auf und zeigt eine beträchtliche Wirtstoxizität. Diese Nachteile beschränken die Verwendung der Verbindung 2 als ein Antikrebsmittel.
Pro-Arzneimittel der Verbindung 2 sind als die Verbindungen 3 und 4 synthetisiert worden (Shyam, K., Penketh, P. G., Zoomis, R. H., Rose, W. C., und Sartorelli, A. C., J. Med. Chem. 39: 796– 801 (1996); Shyam, K., Penketh, P. G., Divo, A. A., Zoomis, R. H., Rose, W. C., und Sartorelli, A. C., J. Med. Chem. 36: 3496–3502 (1993)) und werden in den U.S.-Patenten Nrn. 5 256 820 und 5 637 619 offenbart:
Die Verbindungen 3 und 4 besitzen beide eine Breitband-Antitumor-Aktivität und sind gegenüber Wirtstieren beträchtlich weniger toxisch als die Verbindung 2. Allerdings unterliegt die Verbindung 3 einer spontanen Zersetzung in wässrigen Medien, ähnlich derjenigen, welche bei Verbindung 2 gefunden wird. Die Verbindung 4 ist resistenter gegen eine spontane Zersetzung in wässrigen Medien, ist aber anfällig für eine nicht-spezifische Thiol-, Protease- und Plasmakatalysierte Aktivierung, was einen Hauptnachteil für die therapeutische Nützlichkeit dieser Verbindung darstellt.
Zusätzliche N,N'-Bis(sulfonyl)hydrazine und verwandten chemotherapeutischen Verbindungen werden offenbart in den U.S.-Patenten Nrn. 5 281 715; 5 214 068; 5 101 072; 4 962 114; 4 849 563 und 4 684 747.
Was im Fachgebiet benötigt wird, ist eine Klasse von chemotherapeutischen Mitteln, welche neoplastische Zellen mit Resistenz gegenüber herkömmlichen chemotherapeutischen Mitteln effizient und wirksam behandelt, relativ stabil ist, und welche die Wirts-Toxizität minimiert. Die vorliegende Erfindung bietet eine Lösung für diese Anforderungen.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel
worin R¹ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Niederalkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen und ungesättigten Alkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen; R² gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Niederalkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen und ungesättigten Alkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen; R³ eine substituierte oder unsubstituierte Niederalkylgruppe mit 1–6 Kohlenstoffatomen ist; und R⁴ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus substituierten oder unsubstituierten Niederalkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen und ungesättigten Alkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen.
Gemäß eines weiteren Aspektes betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorzellen, umfassend ein antineoplastisches Mittel in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wobei das antineoplastische Mittel die Formel
aufweist, worin R¹ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Niederalkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen und ungesättigten Alkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen; R² gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Niederalkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen und ungesättigten Alkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen; R³ eine substituierte oder unsubstituierte Niederalkylgruppe mit 1–6 Kohlenstoffatomen ist; und R⁴ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus substituierten oder unsubstituierten Niederalkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, einer substituierten oder unsubstituierten Arylgruppe und einer ungesättigten Alkylgruppe.
Gemäß noch eines anderen Aspektes betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Inhibieren des Wachstums von L1210-Leukämie oder EMT6-Brustkarzinom in Wirtsorganismen, umfassend den Schritt des Verabreichens an den Wirtsorganismus einer wachstumsinhibierenden effektiven Menge eines antineoplastischen Mittels in einem Träger, wobei das antineoplastische Mittel die Formel
aufweist, worin R gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Methyl, 2-Chlorethyl, Vinyl, Phenyl, p-Tolyl, p-Chlorphenyl, p-Methoxyphenyl, p-Nitrobenzyl, Benzyl, 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl, 1-(4-Nitrophenyl)ethyl und einem Substituent mit der Formel
oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon
Diese und andere Aspekte werden beim Lesen der nachfolgenden ausführlichen Beschreibung der Erfindung offensichtlich werden.
Die Erfindung wird vollständiger aus der folgenden ausführlichen Beschreibung verstanden, welche in Verbindung mit den begleitenden Zeichnung heranzuziehen ist, worin:
1 eine Grafik des Überlebens von EMT6-Zellen ist, welche verschiedenen Konzentrationen der Verbindung 10h während einer Stunde unter hypoxischen oder aeroben Bedingungen in vitro exponiert wurden;
2 ist eine Grafik des Überlebens von EMT6-Zellen ist, welche verschiedenen Konzentrationen an Verbindung 11 während einer Stunde unter hypoxischen oder aeroben Bedingungen in vitro exponiert wurden;
3 ist eine Grafik der Zytotoxizität der Verbindung 10h, ausgewertet in aeroben und hypoxischen Chinesischen-Hamster-Ovar(CHO-K1/dhfr^–)-Zellen, welche mit cDNAs für NADPH:Cytochrom-P₄₅₀-Reduktase transfiziert waren und selbige überexprimierten;
4 ist eine Grafik der Zytotoxizität von Verbindung 10h, ausgewertet in aeroben und hypoxischen Chinesischen-Hamster-Ovar(CHO-K1/dhfr^–)-Zellen, welche mit cDNAs für DT-Diaphorase transfiziert waren und selbige überexprimierten;
5 ist eine Grafik, welche das Überleben von EMT6-Zellen zeigt, welche verschiedenen Konzentrationen an Verbindung 12 eine Stunde lang unter hypoxischen oder aeroben Bedingungen in vitro ausgesetzt waren;
6 ist eine Grafik, welche das Überleben von aeroben und hypoxischen CHO-K1/dhfr^–-Zellen und eines NADPH:Cytochrom-P₄₅₀-Reduktase-cDNA-transfizierten Klons zeigt, welche eine Stunde lang verschiedenen Konzentrationen der Verbindung 12 ausgesetzt waren; und
7 ist eine Grafik, welche das Überlegen von EMT6-Zellen zeigt, welche verschiedenen Konzentrationen von Verbindung 14 eine Stunde lang unter hypoxischen oder aeroben Bedingungen in vitro ausgesetzt waren.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Lösung für das Problem der effizienten und effektiven Behandlung von neoplastischen Zellen mit Resistenz gegen herkömmliche chemotherapeutische Mittel vorgesehen. Genauer gesagt, stellen erhöhte Thiol- und/oder GST-Spiegel oder Bereiche der Hypoxie in festen Tumoren Stellen der Verwundbarkeit bereit, welche unter Einsatz der Mittel der vorliegenden Erfindung präferenziell angezielt werden können. Unter Verwendung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können aktive antineoplastische Mittel aus Stamm-Molekülen erzeugt werden, welche wirksam gegen neoplastische Zellen sind, die hohe Spiegel an Nicht-Protein-Thiolen oder GSH/GST aufweisen oder hypoxisch sind.
Toxizität gegen Tumorzellen, welche diese Merkmale aufzeigen, wird festgestelltermaßen signifikant durch Einschließen einer Alkoxy- oder Aryloxycarbonylgruppe (-COOR) in N,N'-Bis(sulfonyl)hydrazine verstärkt, wodurch ein Carbamatester erhalten wird:
Vorzugsweise sind R¹ und R² jeweils unabhängig Niederalkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe oder eine ungesättigte Alkylgruppe. R¹ und R² sind am stärksten bevorzugt Methylgruppen.
R³ ist eine substituierte oder unsubstituierte Niederalkylgruppe mit 1–6 Kohlenstoffatomen. Vorzugsweise ist R³ eine Methylgruppe (-CH₃) oder eine 2-Halogenethylgruppe (-CH₂-CH₂-X), worin X ein Halogenatom ist (z. B. 2-Chlorethyl).
R⁴ ist vorzugsweise eine substituierte oder unsubstituierte Niederalkylgruppe mit 1–6 Kohlenstoffatomen, eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe oder eine ungesättigte Alkylgruppe. Beispiele von Substituenten für, R⁹ schließen Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Halogenalkyl (z. B. 2-Chlorethyl, 2-Bromethyl), Vinyl, Phenyl, p-Tolyl, Halogenphenyl (z. B. p-Chlorphenyl), Alkoxyphenyl (z. B. p- Methoxyphenyl, p-Ethoxyphenyl), Nitrophenyl, Benzyl, Nitrobenzyl, 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl, Halogennitrobenzyl (z. B. 4-Halogen-2-nitrobenzyl, 5-Halogen-2-nitrobenzyl), 3-Methoxy-4-nitrobenzyl, 5-Methyl-2-nitrobenzyl, 1-(4-Nitrophenyl)ethyl, einen Substituent der Formel
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon, oder einen Substituent der Formel
oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon ein. Die am stärksten bevorzugten Substituenten für R⁴ sind p-Nitrobenzyl, 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl und 1-(4-Nitrophenyl)ethyl.
Es ist festgestellt worden, dass eine Carbamat-Bindung nützliche Vorteile an N,N'-Bis(sulfonyl)hydrazine vermittelt. Die Alkoxy- und Aryloxycarbonyl-abgeleiteten N,N'-Bis(sulfonyl)hydrazine sind anfällig gegenüber Thiolyse, wie im nachstehenden Schema I gezeigt wird.
Wenn R³ eine Methylgruppe ist, ist die Rate der Aktivierung durch GSH/GST stark abhängig von der Natur der 2-Alkoxy- oder 2-Aryloxycarbonyleinheit an der R⁴-Position. Die Tabelle 1 zeigt die relativen Aktivierungsraten von 1 mM 2-Alkoxycarbonyl-1,2-bis(methylsulfonyl)-1-methylhydrazinen der Formel CH₃SO₂N(CH₃)N(COOR⁴)SO₂CH₃ in vitro in Gegenwart von GSH (1 mM) und GST (400 μg/ml). Je stärker elektronenabziehend die R⁴-Gruppe, desto größer ist die relative Aktivierungsrate durch GSH/GST, wie in der Tabelle 1 gezeigt wird.
Tabelle 1 CH₃SO₂N(CH₃)N(COOR₄)SO₂CH₃
Die Rate der Aktivierung von 2-(2-Bromethoxyl)carbonyl-1,2-bis(methylsulfonyl)-1-methylhydrazin (Verbindung 8) wurde in vitro ungefähr 18-fach durch die Gegenwart von GSH (1 mM) und GST (400 μg/ml), verglichen zu Puffer allein, erhöht.
Im allgemeinen sind die N,N'-Bis(sulfonyl)hydrazine der vorliegenden Erfindung auch in wässrigen Medien stabiler als äquivalente Verbindungen, welche Acylbindungen enthalten. Beispielsweise beliefen sich die anfänglichen Hydrolyseraten von 2-Acetyl-1,2-bis(methylsulfonyl)-1-methylhydrazin (ein Acylderivat, gezeigt in der Strukturformel 5) und 1,2-Bis(methylsulfonyl)-2-methoxycarbonyl-1-methylhydrazin (eine Carbamatverbindung, gezeigt in Strukturformel 6) auf 0,3 bzw. 0,007% pro Minute bei einem pH-Wert von 7,4 und 37°C.
Weiterhin wurde die Zersetzungsrate von Verbindung 6 durch Spiegel an Proteinase K oder Serum, welche die Rate der Aktivierung von Verbindung 5 nahezu zehnfach erhöhten, nicht merklich erhöht.
Basierend auf diesen Daten sind 2-Alkoxycarbonyl-1,2-bis(methylsulfonyl)-1-alkylhydrazine in wässrigen Medien bei nahezu neutralen pH-Werten und in Serum stabil und können Tumorzellen mit erhöhten GSH- und/oder GST-Spiegeln präferenziell anzielen. Somit besitzen diese Verbindungen signifikante Vorteile gegenüber ihren Acyl-Gegenstücken, welche durch andere Mechanismen leichter aktiviert werden, Im allgemeinen sind chlorethylierende Mittel cytotoxischer als methylierende Mittel und werden für eine Krebs-Chemotherapie bevorzugt. Folglich sind die bevorzugten Verbindungen der Erfindung 2-Alkoxycarbonyl- und 2-Aryloxycarbonyl-1,2-bis(alkylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)hydrazine. Besonders bevorzugte 2-Alkoxycarbonyl- und 2-Aryloxycarbonyl-1,2-bis(alkylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)hydrazine schließen die folgenden Verbindungen, welche auf Verbindung 10 basieren, ein:
worin R eine substituierte oder unsubstituierte Alkylgruppe, eine substituierte oder unsubstituierte Arylgruppe oder eine ungesättigte Alkylgruppe ist. Bevorzugte Substituenten für R werden aus Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Halogenalkyl (z. B. 2-Chlorethyl, 2-Bromethyl), Vinyl, Phenyl, p-Tolyl, Halogenphenyl (z. B. o-, m- oder p-Chlorphenyl), Alkoxyphenyl (z. B. o-, m- oder p-Methoxyphenyl, o-, m- oder p-Ethoxyphenyl), Nitrophenyl, Benzyl, Nitrobenzyl (z. B. 2-Nitrobenzyl und 4-Nitrobenzyl), 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl, Halogennitrobenzyl (z. B. 4-Halogen-2-nitrobenzyl, 5-Halogen-2-nitrobenzyl), 3-Methoxy-4-nitrobenzyl, 5-Methyl-2-nitrobenzyl, 1-(4-Nitrophenyl)ethyl, einem Substituenten der Formel
oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon, oder einem Substituenten der Formel
oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz hiervon, und dergleichen gewählt. Bevorzugte pharmazeutisch annehmbare Salze der letztgenannten zwei Verbindungen schließen Aminsalze, wie Triethanolaminsalz, Triethylaminsalz, Lutidinsalz oder andere, im Fachgebiet bekannte, pharmazeutisch annehmbare Aminsalze ein.
Wie obenstehend angegeben, sind besonders bevorzugte Substituenten für R p-Nitrobenzyl, 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl und 1-(4-Nitrophenyl)ethyl. Solche Derivate der Verbindung der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich bei der Behandlung von Zellen in hypoxischen Regionen der Tumormasse. Diese besonderen Verbindungen haben das Potential, unter hypoxischen Bedingungen durch einen reduktiven Mechanismus aktiviert zu werden, wobei die Labilität der Carbamat-Einheit durch die enzymatische Umwandlung der elektronenabziehenden Nitrogruppe zu der elektronenabgebenden Aminogruppe induziert werden kann.
Von den Verbindungen der Erfindung ist festgestellt worden, dass sie alkylierende Mittel mit antineoplastischer Aktivität in Mäusen, welche die L-1210-Leukämie tragen, und gegenüber EMT6-Brustkarzinomzellen in Kultur sind. Diese Verbindungen zeigen eine ausgesprochene Anti-Tumoraktivität.
Die Verbindungen der Erfindung werden vorzugsweise intern, z. B. intravenös, in der Form herkömmlicher pharmazeutischer Präparate verabreicht, beispielsweise in herkömmlichen enteralen oder parenteralen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten, enthaltend organische und/oder anorganische inerte Träger, wie Wasser, Gelatine, Laktose, Stärke, Magnesiumstearat, Talkum, Pflanzenöle, Gummis, Alkohol, Vaseline oder dergleichen. Die pharmazeutischen Präparationen können in herkömmlichen festen Formen, beispielsweise Tabletten, Dragees, Supposatorien, Kapseln oder dergleichen, oder herkömmlichen flüssigen Formen, wie Suspensionen, Emulsionen oder dergleichen, vorliegen. Falls gewünscht, können sie sterilisiert sein und/oder herkömmliche pharmazeutische Hilfsstoffe enthalten, wie Konservierungsstoffe, Stabilisierungsmittel, Benetzungsmittel, Emulgiermittel, Puffer oder Salze, welche für die Einstellung des osmotischen Drucks verblendet werden Die pharmazeutischen Präparationen können auch andere therapeutisch wirksame Materialien enthalten.
Die pharmazeutische Präparation der Erfindung sollte eine Menge der Verbindung der Erfindung beinhalten, welche für eine antineoplastische Aktivität effektiv ist. Die effektive Dosierung wird von der antineoplastischen Aktivität und der Toxizität der jeweiligen verwendeten Verbindung abhängen, und es liegt daher innerhalb der gewöhnlichen Kenntnisse auf dem Fachgebiet, selbige für einen beliebigen besonderen Wirts-Säuger oder anderen Wirts-Organismus zu bestimmen. Geeignete Dosierungen können beispielsweise im Bereich von etwa 0,5 bis 15 mg pro kg für einen Menschen liegen. Alternativ dazu können die beanspruchten Verbindungen verwendet werden, um die Proliferation neoplastischer Zellen in vitro zu steuern, oder sie können als antineoplastische Mittel in nicht menschlichen Säugetieren verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung wird ferner ausführlich auf dem Wege der folgenden Beispiele beschrieben. Alle Teile und Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht, es sei denn, es ist explizit anderweitig angegeben. Schmelzpunkte wurden mit einem Thomas-Hoover-Schmelzpunkt-Gerät bestimmt und sind unkorrigiert. ¹H-NMR-Spektren wurden auf einem Varian EM-390-Spektrometer mit Tetramethylsilan als internem Standard aufgezeichnet. Elementanalysen (C, H, N) wurden durch die Baron Consulting Co., Orange, CT, durchgeführt und lagen innerhalb von + 0,5% der berechneten Werte für alle berichteten Verbindungen, außer den Verbindungen 10h (C: berechnet 33,5; gefunden 34,2) und 12 (C: berechnet 34,3, gefunden 34,9).
Beispiele 1–4
Synthese von 2-Alkoxycarbonyl- und 2-Aryloxycarbonyl-1,2-bis(methylsulfonyl)-1-methylhydrazinen
Beispiel 1
1,2-Bis(methylsulfonyl)-2-(methoxycarbonyl)-1-methylhydrazin (Verbindung 6) wurde wie folgend synthetisiert: Eine Mischung aus 1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-methylhydrazin (Shyam et al., J. Med. Chem. 30 2157–2161 (1987)) (1,00 g, 0,005 mol), wasserfreiem Natriumcarbonat (1,9 g, 0,018 mol), Methylchlorformiat (1,23 g, 0,013 mol) und Aceton (30 ml) wurde unter Rückfluss 18 Stunden lang erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert und das Filtrat wurde im Vakuum bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand, ein dickes Öl, wurde mit Methanol (5 ml) gerührt und in Eis gekühlt. Der Feststoff, welcher sich abtrennte, wurde filtriert und aus Ethanol-Petroleumether umkristallisiert (0,63 g, 48,9%) Der Schmelzpunkt (Schmp.) dieser Verbindung belief sich festgestelltermaßen auf ungefähr 88–89°C. Eine Analyse der Verbindung durch ¹H-NMR (CDCl₃) zeigte die folgenden Ergebnisse: δ 4,0 (3H, s, OCH₃), 3,5, 3,4, 3,1 (9H, 3s, 2 CH₃SO₂ und NCH₃).
Beispiel 2
1,2-Bis(methylsulfonyl)-2-ethoxycarbonyl)-1-methylhydrazin (Verbindung 7) wurde aus 1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-methylhydrazin und Ethylchlorformiat unter Anwendung eines Vorgehens hergestellt, welches zu dem für Verbindung 6 beschriebenen ähnlich war. Das Umkristallisierungs-Lösungsmittel war Ether-Petroleumether. Die Ausbeute betrug 51,0%, und der Schmp. belief sich auf ungefähr 89–90°C. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 4,4 (2H, q, OCH₂), 3,5, 3,3 und 3,1 (9H, 3s, 2 CH₃SO₂ und NCH₃), 1,4 (3H, t, OCCH₃).
Beispiel 3
1,2-Bis(methylsulfonyl)-2-(2-bromethoxycarbonyl)-1-methylhydrazin (Verbindung 8) wurde wie folgend synthetisiert: Triethylamin (1,45 g, 0,014 mol) wurde in Portionen zu einer gerührten Lösung von 1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-methylhydrazin (2,02 g, 0,01 mol) und 2-Bromethylchlorformiat (3,49 g, 0,019 mol) in Aceton (100 ml) über eine Dauer von 15 Minuten zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde weitere 18 Stunden gerührt, filtriert, und das Filtrat wurde im Vakuum bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde in Chloroform (100 ml) aufgenommen und mit Wasser gewaschen (3 × 20 ml). Die Chloroformschicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, und das Filtrat wurde zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde mit Petroleumether trituriert, bis sich ein Feststoff abtrennte. Der Feststoff wurde filtriert und aus Ethanol umkristallisiert (1,52 g, 43,0%). Der Schmp. belief sich ungefähr auf 81–82°C. ¹H-NMR (CDCl₃) δ 4,7 und 3,6 (4H, 2t, CH₂CH₂Br), 3,5, 3,3 und 3,1 (9H, 3s, 2CH₃SO₂ und NCH₃).
Beispiel 4
1,2-Bis(methylsulfonyl)-2-[(4-methoxyphenoxy)carbonyl]-1-methylhydrazin (Verbindung 9) wurde wie folgend synthetisiert: Triethylamin (0,269 g, 0,0029 mol) wurde zu einer gerührten Lösung von 1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-methylhydrazin (0,50 g, 0,0025 mol) und 4-Methoxyphenylchlorformiat (0,63 g, 0,0033 mol) in Aceton (30 ml) zugesetzt, und die Mischung wurde 1 Stunde lang gerührt. Die Reaktionsmischung wurde filtriert, und das Filtrat im Vakuum bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde mit Petroleumether (5 ml) trituriert und die Petroleumetherschicht wurde dekantiert. Eine Säulenchromatographie des Rückstands auf Silikagel (70–270 mesh, 60 Ängstrom, CHCl₃), gefolgt von Kristallisierung aus Ethanol, ergab 0,14 g (16,1%) der gewünschten Verbindung. Der Schmp. belief sich auf ungefähr 101–102°C. ¹H-NMR (Aceton-d₆): δ 7,3 und 7,0(4H, 2d, aromatisch H), 3,9(3H, s, OCH₃), 3,6, 3,4 und 3,2 (9H, 3s, 2 CH₃SO₂ und NCH₃).
Beispiele 5–24
Synthese von 2-Alkoxycarbonyl- und 2-Aryloxycarbonyl-1,2-bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)hydrazinen
2-Alkoxycarbonyl- und 2-Aryloxycarbonyl-1,2-bis(methylsulfonyl-1-(2-chlorethyl)hydrazine können im allgemeinen durch Umsetzen des passenden Alkyl- oder Arylchlorformiats mit 1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)hydrazin in einem passenden Lösungsmittel in Gegenwart einer Base, wie Triethylamin (TEA) oder wasserfreiem Natriumcarbonat, hergestellt werden, wie gezeigt in Schema 2.
Beispiele von Substituenten für R schließen Methyl (Verbindung 10a), 2-Chlorethyl (Verbindung 10b), Vinyl (Verbindung 10c), Phenyl (Verbindung 10d), p-Tolyl (Verbindung 10e), p-Chlorphenyl (Verbindung 10f), p-Methoxyphenyl (Verbindung 10g) oder p-Nitrobenzyl (Verbindung 10h) ein. Diese Verbindungen können wie folgend synthetisiert werden.
Beispiel 5
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-(methoxycarbonyl) hydrazin (Verbindung 10a) kann wie folgend synthetisiert werden: Triethylamin (1,45 g, 0,014 mol) wurde zu einer gerührten Lösung der Verbindung 2 (Shyam et al., J. Med. Chem. 33 2259–2264 (1990)) (1,25 g, 0,005 mol) und Methylchlorformiat (2,46 g, 0,026 mol) in Aceton (35 ml) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde weitere 16 Stunden lang gerührt, filtriert, und das Filtrat wurde im Vakuum bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (100 ml) aufgenommen und mit Wasser gewaschen (3 × 15 ml). Die Ethylacetatschicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, und das Filtrat wurde im Vakuum bis zur Trockenheit eingedampft. Eine Säulenchromatographie des Rückstands auf Silikagel (70–270 mesh, 60 Ängstrom, CHCl₃), gefolgt von Kristallisieren aus Chloroform-Petroleumether, ergab 0,45 g (29,2%) der gewünschten Verbindung. Der Schmp. betrug ungefähr 87–88°C. ¹H-NMR (Aceton-d₆): δ 4,0(3H, s, OCH₃), 3,7–4,2 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 3,5 und 3,3 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂).
Beispiel 6
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-(2-chlorethoxycarbonyl)hydrazin (Verbindung 10b) wurde wie folgend synthetisiert: Triethylamin (1,20 g, 0,012 mol) wurde zu einer gerührten Lösung der Verbindung 2 (1,25 g, 0,005 mol) und 2-Chlorethylchlorformiat (1,00 g, 0,007 mol) in trockenem Acetonnitril (10 ml) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde weitere 18 Stunden lang gerührt, filtriert, und das Filtrat wurde im Vakuum bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde in Petroleumether (2 × 10 ml) trituriert, und die Petroleumetherschicht wurde jedes Mal dekantiert. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (100 ml) aufgenommen und mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure (3 × 10 ml), gefolgt von Wasser (2 × 10 ml), gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, und das Filtrat wurde auf einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit eingedampft. Eine Säulenchromatographie des Rückstands auf Silikagel (70–270 mesh, 60 Ängstrom, CHCl₃), gefolgt von Kristallisieren aus Chloroform-Petroleumether, ergab 0,58 g (32,5%) der gewünschten Verbindung. Der Schmp. betrug ungefähr 73–74°C. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 4,6 (2H, t, OCCH₂Cl), 3,6–4,1 (6H, m, OCH₂ und NCH₂CH₂Cl), 3,5 und 3,2 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂).
Beispiel 7
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-(vinyloxycarbonyl) hydrazin (Verbindung 10c) wurde durch Umsetzen der Verbindung 2 mit Vinylchlorformiat unter Verwendung eines ähnlichen Vorgehens zu demjenigen, welches für Verbindung 10b beschrieben wurde, hergestellt. Das Produkt wurde aus Ethanol umkristallisiert, und die Ausbeute belief sich auf etwa 39,4 Gew.%. Der Schmp. des Produktes belief sich auf ungefähr 85– 86°C. 1H-NMR (CDCl₃): δ 7,0–7,3 (1H, m, CH=C), 4,8–5,3 (2H, m, C=CH₂), 3,6–4,2 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 3,5 und 3,2 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂).
Beispiel 8
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-(phenoxycarbonyl) hydrazin (Verbindung 10d) wurde durch Umsetzen der Verbindung 2 mit Phenylchlorformiat unter Anwendung eines ähnlichen Vorgehens zu demjenigen, welches für Verbindung 10b beschrieben wurde, hergestellt. Allerdings wurde die Reaktionszeit von 18 Stunden auf 3 Stunden verringert. Das Produkt wurde aus Ethanol umkristallisiert, und die Ausbeute belief sich auf ungefähr 27,0 Gew.%. Der Schmp. belief sich auf ungefähr 75–76°C. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,1–7,6 (5H, m, aromatisch H), 3,6–4,2 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 3,5 und 3,2 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂).
Beispiel 9
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-[(4-tolyloxy)carbonyl]hydrazin (Verbindung 10e) wurde durch Umsetzen der Verbindung 2 mit 4-Tolylchlorformiat unter Anwendung eines ähnlichen Vorgehens zu demjenigen, welches für Verbindung 10d beschrieben wurde, hergestellt. Das Produkt wurde aus Ethanol umkristallisiert, und die Ausbeute belief sich auf etwa 31,2 Gew.%. Der Schmp. belief sich auf ungefähr 85–86°C. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,3 und 7,1 (4H, 2d, aromatisch H), 3,7–4,2 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 3,5 und 3,2 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂), 2,4 (3H, s, ArCH₃).
Beispiel 10
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-[(4-chlorphenoxy) carbonyl]hydrazin (Verbindung 10f) wurde durch Umsetzen der Verbindung 2 mit 4-Chlorphenylchlorformiat unter Verwendung eines ähnlichen Vorgehens zu demjenigen, welches für Verbindung 10d beschrieben wurde, hergestellt. Das Produkt wurde aus Ethanol umkristallisiert, und die Ausbeute belief sich auf ungefähr 54,4 Gew.%. Der Schmp. belief sich auf ungefähr 124–125°C. ¹H-NMR (Aceton-d₆): δ 7,5 und 7,3(4H, 2d, aromatisch H), 3,9–4,2 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 3,6 und 3,3 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂).
Beispiel 11
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-((4-methoxyphenoxy)carbonyl]hydrazin (Verbindung 10g) wurde durch Umsetzen der Verbindung 2 mit 4-Methoxyphenylchlorformiat unter Anwendung eines ähnlichen Vorgehens zu demjenigen, welches für Verbindung 10d beschrieben wurde, hergestellt. Das Produkt wurde aus Ethanol umkristallisiert, und die Ausbeute D belief sich auf etwa 30,0 Gew.%. Der Schmp. des Produktes belief sich auf ungefähr 119–121°C. ¹H-NMR (CDCl₃): δ 7,1 und 6,9 (4H, 2d, aromatisch H), 3,6–4,2 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 3,8 (3H, s, OCH₃), 3,5 und 3,2 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂).
Beispiel 12
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-[(4-nitrobenzyloxy) carbonyl)hydrazin (Verbindung 10h) wurde durch Umsetzen der Verbindung 2 mit 4-Nitrobenzylchlorformiat unter Anwendung eines ähnlichen Vorgehens zu demjenigen, welches für Verbindung 10b beschrieben wurde, hergestellt. Das Produkt wurde aus Ethanol umkristallisiert, und die Ausbeute belief sich auf ungefähr 22,9 Gew.%. Der Schmp. belief sich auf ungefähr 132–133°C. ¹H-NMR (Aceton-d₆): δ 8,3 und 7,8 (4H, 2d, aromatisch H), 5,6 (2H, s, ArCH₂), 3,6–4,2 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 3,6 und 3,3 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂).
Beispiel 13
2-Benzyloxycarbonyl-1,2-bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl) hydrazin (Verbindung 11) wurde durch Umsetzen von Benzylchlorformiat mit Verbindung 2 mit unter Anwendung eines ähnlichen Vorgehens zu demjenigen, welches für Verbindung 10b beschrieben wurde, hergestellt. Die Verbindung wurde als ein dickes Öl bei einer Ausbeute von ungefähr 41,3 Gew.% isoliert. ¹H-NMR (Aceton-d₆): δ 7,2–7,6 (5H, m, aromatisch H), 5,4 (2H, s, ArCH₂), 3,5–4,0 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 3,4 und 3,1 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂).
Beispiel 14
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-[(4,5-dimethoxy-2-nitrobenzyloxy)carbonyl]hydrazin (Verbindung 12) wurde durch Umsetzen von 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzylchlorformiat mit Verbindung 2 mit unter Anwendung eines ähnlichen Vorgehens zu demjenigen, welches für Verbindung 10b beschrieben wurde, hergestellt. Das Produkt wurde aus Ethanol umkristallisiert, und der Schmp. belief sich auf etwa 154°C. Die Ausbeute betrug etwa 17,6 Gew.% ¹H-NMR (Aceton-d₆): δ 7,7 und 7,4 (2H, 2s, aromatisch H), 5,8 (2H, d, ArCH₂), 3,7–4,1 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 3,9–4,0 (6H, 2s, 2 OCH₃) und 3,5 und 3,2 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂).
Beispiel 15
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-[(2-nitrobenzyloxy) carbonyl]hydrazin (Verbindung 13a) wurde wie folgend hergestellt: Eine Lösung von 2-Nitrobenzylalkohol (2,0 g, 0,013 mol) in trockenem Dioxan (5 ml) wurde zu einer gerührten Lösung von Phosgen in Toluol (20% w/v, 20 ml) bei –15°C zugesetzt. Die Mischung wurde dann 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde bei < 40°C im Vakuum bis zur Trockenheit eingedampft. Zum Rückstand wurden wasserfreies Acetonitril (15 ml), gefolgt von Verbindung 2 (1,0 g, 0,004 mol) und Triethylamin (1,3 ml, 0,009 mol) zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde 16 Stunden lang bei 0–5°C gerührt und auf einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat (150 ml) 10 Minuten lang gerührt. Die Mischung wurde mit 2 × 15 ml Chlorwasserstoffsäure (5% w/v) gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert, und das Filtrat wurde auf einem Rotationsverdampfer bis zur Trockenheit eingedampft. Eine Säulenchromatographie auf Silikagel (70–270 mesh, 60 Ängstrom, Chloroform), gefolgt von Umkristallisieren aus Ethanol, ergab 0,48 g (28,1 Gew.) der gewünschten Verbindung. Der Schmelzpunkt wurde als Schmp. von etwa 111–113°C bestimmt. ¹H-NMR (Aceton-d₆): δ 8,1 und 7,5–8,0 (4H, d, m, aromatisch H), 5,8 (2H, d, ArCH₂), 3,6–4,1 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 3,5 und 3,2 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂).
Beispiel 16
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-[(4-chlor-2-nitrobenzyloxy)carbonyl]hydrazin (Verbindung 13b) wurde hergestellt aus 4-Chlor-2-nitrobenzylalkohol unter Anwendung einer Vorgehensweise, ähnlich zu derjenigen, welche für Verbindung 13a beschrieben wurde. Der Schmp. belief sich auf etwa 120– 121°C, und die Ausbeute betrug ungefähr 40,0 Gew.% nach Umkristallisieren aus Alkohol. ¹H-NMR (Aceton-d₆): δ 8,2 und 7,7–8,0 (3H, s, m, aromatisch H), 5,8 (2H, d, ArCH₂), 3,6–4,1 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 3,5 und 3,2 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂).
Beispiel 17
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-[(5-chlor-2-nitrobenzyloxy)carbonyl]hydrazin (Verbindung 13c) wurde hergestellt aus 5-Chlor-2-nitrobenzylalkohol unter Anwendung einer Vorgehensweise, ähnlich zu derjenigen, welche für Verbindung 13a beschrieben wurde. Der Schmp. betrug ungefähr 100–102°C, und die Ausbeute belief sich auf ungefähr 14,6 Gew.% nach Umkristallisieren aus Ethanol. ¹H-NMR (Aceton-d₆): δ 8,2, 8,0 und 7,7 (3H, 2d, s, aromatisch H), 5,8 (2H, d, ArCH₂), 3,6– 4,1 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 3,5 und 3,2 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂).
Beispiel 18
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-[(3-methoxy-4-nitrobenzyloxy)carbonyl]hydrazin (Verbindung 13d) wurde hergestellt aus 3-Methoxy-4-nitrobenzylalkohol unter Anwendung einer Vorgehensweise, ähnlich zu derjenigen, welche für Verbindung 13a beschrieben wurde. Der Schmp. wurde als etwa 56–57°C bestimmt, und die Ausbeute belief sich auf etwa 29,4 Gew.% nach Umkristallisieren aus Ethanol. ¹H-NMR (Aceton-d₆): δ 7,8, 7,5 und 7,2 (3H, 2d, s, aromatisch H), 5,8 (2H, d, ArCH₂), 3,6–4,1 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 4,0 (3H, s, OCH₃) 3,6 und 3,3 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂).
Beispiel 19
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-[(5-methyl-2-nitrobenzyloxy)carbonyl]hydrazin (Verbindung 13e) wurde hergestellt aus 5-Methyl-2-nitrobenzylalkohol unter Anwendung einer Vorgehensweise, ähnlich zu derjenigen, welche für Verbindung 13a beschrieben wurde. Es wurde herausgefunden, dass der Schmp. 112–113°C betrug, und die Ausbeute belief sich auf etwa 24,3 Gew.% nach Umkristallisieren aus Ethanol. ¹H-NMR (Acetond₆): δ 8,1, 7,8 und 7,4 (3H, 2d, s, aromatisch H), 5,8 (2H, d, ArCH₂), 3,6–4,1 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 3,6 und 3,3 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂), 2,5 (3H, s, ArCH₃).
Beispiel 20
1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)-2-[[1-(4-nitrophenyl) ethoxy]carbonyl]hydrazin (Verbindung 14) wurde wie folgend hergestellt: 1-(4-Nitrophenyl)ethanol wurde unter Anwendung einer Vorgehensweise hergestellt, analog zu derjenigen, welche in der Literatur für die Synthese von 3-Nitrobenzylalkohol aus 3-Nitrobenzaldehyd berichtet wird (Furniss, B. S., Hannaford, A. J., Rogers, V., Smith, P. W. G. und Tatchell, A. R. Cognate preparation: m-nitrobenzyl alcohol. In: Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry, 4. Auflage, Longman, London, S. 357 (1978)). Kurz gesagt, wurde 4-Nitroacetophenon (15,1 g) in Methanol (300 ml) gelöst und wurde in 1-(4-Nitrophenyl)ethanol (13,2 g) durch Reduktion mit Natriumborhydrid (1,4 g) in 0,2 M wässrigem Natriumhydroxid (25 ml) umgewandelt. Eine Lösung von 1-(4-Nitrophenyl)ethanol (2,4 g, 0,014 mol) in Tetrahydrofuran (5 ml) wurde tropfenweise zu einer gerührten, eiskalten Lösung von Phosgen in Toluol (20% w/v, 30 ml) zugesetzt. Der Kolben wurde dann in Aluminiumfolie eingewickelt, bei Raumtemperatur äquilibrieren gelassen, und die Reaktionsmischung wurde weitere 24 Stunden lang gerührt. Es wurde ein dunkles Öl im Anschluss an das Eindampfen der Reaktionsmischung im Vakuum bei einer Temperatur, welche 30°C nicht überschritt, erhalten. Zu diesem Öl wurden wasserfreies Acetonitril (20 ml) und Verbindung 2 (1,5 g, 0,006 mol) zugesetzt. Nach Abkühlen dieser Mischung in einem Eisbad wurde Triethylamin (1,7 ml, 0,012 mol) tropfenweise zugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde 17 Stunden lang bei 4°C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde auf einem Rotationsverdampfer bei einer Temperatur, welche 30°C nicht überschritt, eingedampft. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (150 ml) aufgenommen und mit 2 × 50 ml und 1 × 100 ml Chlorwasserstoffsäure (5% w/v) gewaschen. Die vereinigten wässrigen Schichten wurden mit Ethylacetat (50 ml) extrahiert, und der Extrakt wurde mit der organischen (Ethylacetat-)Schicht aus dem vorangehenden Extraktionsschritt vereinigt. Die vereinigten Ethylacetat-Schichten wurden mit Kochsalzlösung (100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wurde zur Trockenheit eingedampft, wodurch ein viskoses Öl erhalten wurde. Die gewünschte Verbindung wurde durch Säulenchromatographie auf Silikagel (70–270 mesh, 60 Ängstrom, Chloroform-Methylenchlorid), gefolgt von Umkristallisieren aus Ethanol, erhalten. Die Ausbeute belief sich auf etwa 35,0 Gew.%. Der Schmp. betrug etwa 94–95°C. ¹H-NMR (Aceton-d₆): δ 8,3 und 7,8,(4H, 2d, aromatisch H), 6,2 (1H, m, ArCH), 3,6– 4,1 (4H, m, CH₂CH₂Cl), 3,5 und 3,2 (6H, 2s, 2 CH₃SO₂), 1,7 (3H, dd, C-CH₃).
Beispiel 21
O-Dibenzylphosphat-Methylcarbamat (Verbindung 15) wurde wie folgend hergestellt:
(A) Herstellung von O-Chlormethyl-S-butylthiocarbonat:
Eine Lösung von 1-Butanthiol(BuSH) (12,1 ml, 113,6 mmol) und Triethylamin (15,75 ml, 113,6 mmol) in Diethylether (45 ml) wurde zu einer Diethyletherlösung (220 ml) von Chlormethylchlorformiat (10,0 ml, 113,6 mmol) über 30 Minuten hinweg bei 0°C zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde weitere 30 Minuten lang bei 0°C und danach 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde filtriert und konzentriert, wodurch ein öliges Rohprodukt erhalten wurde, welches direkt für die nächste Reaktion verwendet wurde.
(B) Herstellung von O-Iodmethyl-S-butylthiocarbonat:
Das Rohprodukt aus obenstehendem (A) wurde in Aceton (140 ml) gelöst, und NaI (24,8 g, 165 mmol) wurde zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde drei Stunden lang bei 40°C erwärmt. Die Reaktionsmischung wurde dann filtriert, und das unlösliche Material wurde mit Aceton und Ether gespült. Das Filtrat wurde eingedampft, und der Rückstand zwischen Pentan (300 ml) und Wasser (100 ml) geteilt bzw. partitioniert. Die organische Schicht wurde mit 5% NaHCO₃ (50 ml), gesättigtem Na₂S₂O₃ (50 ml) und Wasser (2 × 50 ml) gewaschen. Die resultierende organische Schicht wurde getrocknet, filtriert und eingedampft, wodurch 22,8 g (76 %) des gewünschten Produktes als eine farblose Flüssigkeit erhalten wurden.
(C) Herstellung von O-Dibenzylphosphat-S-butylthiocarbonat:
Eine Tetrahydrofuran (THF)-Lösung (20 ml) des im obenstehenden (B) hergestellten Rohprodukts (11,0 g, ~40 mmol) wurde zu einer THF-Lösung (100 ml) von Tetrabutylammoniumdibenzylphosphat (hergestellt über die Reaktion von Tetrabutylammoniumhydroxid und Dibenzylphosphat) bei 0°C zugesetzt. Die resultierende Lösung wurde 24 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde durch ein Kissen von Celite filtriert, und das Filtrat wurde konzentriert und chromatographiert (10–20% Ethylacetat/Hexane), wodurch 8,5 g (50%) des gewünschten Produktes erhalten wurden.
(D) Herstellung von O-Dibenzylphosphat-methylchlorformiat:
Eine Dichlormethan-Lösung (25 ml) des in (C) obenstehend hergestellten Thiocarbonats (2,67 g, 6,30 mmol) wurde mit SO₂Cl₂ (0,60 ml, 7,56 mmol) bei –40°C behandelt. Die Reaktionsmischung wurde 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt. Das resultierende Rohprodukt wurde 1 Stunde lang unter Hochvakuum getrocknet, und dann ohne weitere Reinigung für die nächste Reaktion verwendet.
Zu einer Acetonlösung (7,9 ml) des in obenstehendem (D) hergestellten Roh-Chlorformiats (6,30 mmol) wurden (bei 0°C) Diisopropylethylamin (EtPr₂N) (1,10 ml, 6,30 mmol), gefolgt von einer Acetonlösung der Stammverbindung, 1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)hydrazin (1,05 g, 4,20 mmol), zugesetzt. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur erwärmt, und das Rühren wurde 15 Stunden lang bei Raumtemperatur beibehalten. An diesem Punkt wurde das Lösungsmittel teilweise im Vakuum entfernt, und die Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat (100 ml) verdünnt und dann mit Kochsalzlösung (2 × 15 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mit Silikagel- Chromatographie (40–50% Ethylacetat/Hexane) gereinigt, um 2,0 g (82%) des geschützten O-Dibenzylphosphat-Methylcarbamates vorzusehen. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 7,40 (m, 10H), 5,82–5,60 (m, 2H), 5,10 (m, 4H), 3,84 (m, 2H), 3,64 (m, 2H), 3,40 (s, 3H), 3,13 (s, 3H). FAB HRMS, berechnet für C₂₀H₂₇CIN₂O₁₀S₂P (MH⁺): 585, 0533; gefunden: 585,0533.
Beispiel 22
Herstellung von freier-Phosphorsäure von O-Dibenzylphosphat-Methylcarbamat
Die freie-Phosphorsäure von O-Dibenzylphosphat-Methylcarbamat (Verbindung 15) wurde wie folgend synthetisiert:
O-Dibenzylphosphat-Methylcarbamat (2,77 g, 4,74 mmol) wurde in Ethylacetat (60 ml) gelöst. Zu dieser Lösung wurde Palladiumauf-Cohlenstoff (1,0 g, 10% Palladium-Gehalt, 0,95 mmol) zugesetzt. Die resultierende Mischung wurde einer Hydrierung bei 30 psi Druck während 15 Stunden bei Raumtemperatur unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde durch ein Kissen von Celite mit Spülung (Ethylacetat) filtriert. Die vereinigten Filtrate wurden im Vakuum konzentriert, wodurch 1,92 g (100%) der gewünschten freien Säure vorgesehen wurden, welche die Formel
aufwies. ¹H-NMR (300 MHz, Aceton-d₆): δ 6,10–5,70 (bs, 2H), 3,95 (m, 2H), 3,78 (m, 2H), 3,55 (s, 3H), 3,26 (s, 3H). LRMS (EI) berechnet für C₆H₁₅CIN₂PO₁₀S₂ (MH⁺): 405, gefunden: 405.
Beispiel 23
Herstellung des Triethanolaminsalzes und des Triethylaminsalzes der freien Säure-Säure von O-Dibenzylphosphat-Methylcarbamat:
Das Triethanolaminsalz der freien Säure-Säure von O-Dibenzylphosphat-Methylcarbamat wurde wie folgend synthetisiert: Zu einer öligen Ethylacetat-Lösung (2 ml) der freien Säure-Verbindung, hergestellt im Beispiel 22 (946 mg, 2,34 mmol), wurde (bei 0°C) 0,1 M Triethanolamin in Ethylacetat (23,4 ml, 2,34 mmol) zugesetzt. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 0°C gerührt und über Nacht bei –20°C gehalten. Der weiße Niederschlag, welcher gebildet wurde, wurde durch Filtration aufgesammelt und mit gekühltem Ethylacetat gewaschen. Die erhaltenen, klebrigen Feststoffe wurden 1 Stunde lang bei Hochvakuum getrocknet, wodurch 900 mg (70%) des rohen Triethanolamin-Addukts (Verbindung 16) erhalten wurden.
Das Triethylaminsalz der freien Säure-Säure von O-Dibenzylphosphat-Methylcarbamat wurde wie folgend synthetisiert: Zu einer Ethylacetat-Lösung (14 ml) der freien Säureverbindung, hergestellt im obenstehenden Beispiel 22 (960 mg, 2,37 mmol), wurde eine Ethylacetat-Lösung (10 ml) von Triethylamin (0,33 ml, 2,37 mmol) bei 0°C zugesetzt. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 0°C gerührt und 15 Stunden lang bei –20°C gehalten. Das Lösungsmittel wurde dann entfernt, und der ölige Rückstand wurde unter Hochvakuum 1 Stunde lang getrocknet, wodurch 910 mg (76%) des rohen Triethylamin-Addukts (Verbindung 17) erhalten wurden.
Beispiel 24
Die Verbindung der Formel
wurde wie folgend hergestellt:

(A) Diethylphosphatbenzylalkohol (5,00 g, 40,32 mmol) wurde in wasserfreiem Acetonitril (160 ml) gelöst, und die resultierende Lösung wurde auf –10°C gekühlt. Zu dieser Lösung wurden dann CCl₄ (19,45 ml, 201,60 mmol), gefolgt von EtPr₂N (14, 76 ml, 84, 67 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (DMAP)(492 mg, 4,03 mmol) zugesetzt. Eine Minute später wurde reines Diethylphosphit (7,54 ml, 58,46 mmol) tropfenweise bei –10°C zu der obenstehenden Lösung zugegeben. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei –10°C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktion wurde mit 0,5 M KHP₂O₄ (100 ml) abgeschreckt. Das Lösungsmittel wurde dann im Vakuum teilweise entfernt. Die resultierende Reaktionsmischung wurde mit Ethylacetat (3 × 100 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen und dann mit Na₂SO₄ getrocknet. Eine Filtration und Eindampfung der organischen Schicht ergaben ein gelbliches Rohprodukt (~11 g, ~100%), welches ohne Reinigung in der nächsten Reaktion verwendet wurde.
(B) Zu einer Dichlormethanlösung (15 ml) des im obenstehenden (A) hergestellten Produktes (736 mg, 2,83 mmol) wurde bei 0°C p-Nitrophenylchlorformiat (684 mg, 3,40 mmol), gefolgt von EtPr₂N (0,59 ml, 3,40 mmol), zugesetzt. Die Reaktion wurde 1 Stunde lang bei 0°C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. An diesem Punkt wurde die Reaktionsmischung mit Dichlormethan (75 ml) verdünnt und dann mit H₂O (15 ml) und Kochsalzlösung (15 ml) gewaschen. Die resultierende organische Schicht wurde getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde chromatographiert (40–60% Ethylacetat in Hexanen), wodurch 800 mg (67%) des gewünschten Produktes als ein blassgelbes Öl erhalten wurden. ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ 8,26–8,22(d, 2H), 7,39–7,24 (m, 6H), 5,23 (s, 2H), 4,20 (m, 4H), 1,34 (m, 6H). FAB HRMS, berechnet für C₁₈HN₂₁O₉P (MH⁺): 426, 0954; gefunden: 426,0954.
(C) Zu einer Acetonlösung (12 ml) des im obenstehenden (B) hergestellten Produktes (800 mg, 1,88 mmol) wurde bei 0°C Ethylacetat (0,36 ml, 2,078 mmol) zugesetzt. Daran schloss sich eine langsame Zugabe einer Acetonlösung (4 ml) des Stamm-Alkylierungsmittels, 1,2-Bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)hydrazin (566 mg, 2,26 mmol), an. Das Rühren wurde eine Stunde lang bei 0°C fortgesetzt. An diesem Punkt wurde eine katalytische Menge an DMAP zugesetzt, und die Reaktionsmischung wurde 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde in Ethylacetat (100 ml) aufgenommen. Die resultierende Lösung wurde mit Kochsalzlösung (2 × 15 ml) gewaschen, und die organische Schicht wurde im Vakuum getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wurde chromatographiert (40– 60–70% Ethylacetat in Hexanen), wodurch 669 mg (66%) des gewünschten Produktes als ein klares Öl erhalten wurden.
(D) Zu einer Acetonitril-Lösung (50 ml) der im obenstehenden (C) hergestellten Verbindung (1,36 g, 2,53 mmol) wurden bei 0°C 2,4-Lutidin (1,46 ml, 12,66 mmol) zugesetzt, gefolgt von langsamer Zugabe von reinem Trimethylsilylbromid (TMSBr) (1,67 ml, 12,66 mmol). Die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang bei 0°C und dann über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum (mit einer Trockeneisfalle) entfernt, und der resultierende gelbliche Rückstand wurde mit Acetonitril (2 × 25 ml) co-eingedampft. Der resultierende blassgelbe Rückstand wurde mit Methanol (25 ml) gemeinsam eingedampft. Der resultierende ölige Rückstand wurde dann einer Silikagel-Chromatographie (Ethylacetat zu CH₃CN zu 10% H₂O in CH₃CN) unterzogen, um 1,08 g (89%) des gewünschten Phosphorsäure-Lutidinsalzes von

¹

₆

Aktivierung von 2-Alkoxycarbonyl- und 2-Aryloxycarbonyl-1,2-bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)hydrazinen
Die Tabelle 3 zeigt die Aktivierungsraten von 2-Alkoxycarbonyl- und 2-Aryloxycarbonyl-1,2-bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)hydrazinen (Verbindungen 10a–h) unter verschiedenen Bedingungen. Die Aktivierungsraten der Verbindungen 10a–h wurden in l mM Phosphatpuffer (pH 7,4, 37°C) allein, 1 mM Phosphatpuffer, enthaltend 5 mM GSH (pH 7,4, 37°C), und in 1 mM Phosphatpuffer, enthaltend 5 mM GSH und 17,5 U/ml GST (pH 7,4, 37°C) gemessen (Tabelle 3). Die Aktivierungsraten durch Hydrolyse, Thiolyse und GSTkatalysierte Thiolyse wurden aus diesen Daten berechnet.
Tabelle 3
Im allgemeinen folgte die Aktivierungsrate der Reihenfolge Hydrolyse (d. h. Puffer allein) < Thiolyse (d. h. GSH allein) < Thiolyse, welche von GST katalysiert wird. Die Verbindung 10h unterliegt gezeigtermaßen einer geringen oder gar keinen Hydrolyse in Phosphatpuffer bei physiologischem pH-Wert und einer äußerst langsamen Rate von Thiolyse bei Umsetzung mit GSH. Allerdings tritt eine relativ hohe Aktivierungsrate auf, wenn die Thiolyse durch GST katalysiert wird.
Antitumor-Aktivität von 2-Alkoxycarbonyl- und 2-Aryloxycarbonyl-1,2-bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)hydrazinen
Die Aszites- bzw. Bauchhöhlenflüssigkeits-Zellform der Leukämie L1210 wurde vom Frederick Cancer Research Facility, Division of Cancer Treatment Tumor Repository of the National Cancer Institute, erhalten und wurde durch serielle Passage in Gewebekultur aufrechterhalten. Alle 8 Wochen wurden Tumorzellen intraperitoneal in 5 Donor-CD₂F₁-Mäuse mit einem Alter von 8–10 Wochen injiziert und 7 Tage lang wachsen gelassen. Die Peritoneal-Flüssigkeit wurde abgezogen, und die Suspension wurde 5 Minuten lang bei 1600 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und 10⁵ Zellen/ml wurden in 10 ml RPMI-1640-Medium, das mit 10% fötalem Rinderserum und 1 L-Glutamin (200 mM) ergänzt war, eingesetzt und erneut in Kultur gehalten. Um die Antitumor-Aktivität zu testen, wurden 0,1 ml der Zellsuspension, enthaltend 10⁵ Leukämiezellen, in jede Empfänger-Maus injiziert. Die Testverbindungen wurden über einen breiten Bereich an Dosierungsspiegeln (12,5–60 mg/kg) verabreicht, beginnend 24 Stunden nach der Tumor-Implantierung, und während 6 aufeinanderfolgenden Tagen einmal täglich fortgesetzt. Jedes Arzneimittel wurde als eine Lösung in 100% Dimethylsulfoxid, in einem Volumen, welches 25 μl nicht überschritt, intraperitoneal verabreicht. In jedem Experiment wurden die Tiere in Gruppen von 5 Mäusen von vergleichbarem Gewicht eingeteilt und während des gesamten Verlaufes des Experimentes mit Purina Laboratory-Futter-Pellets und Wasser nach Belieben gehalten. Tumortragende Kontrollmäuse, welche vergleichbare Volumen an Vehikel erhielten, waren in jedem Experiment eingeschlossen. Die Mäuse wurden während des Verlaufes der Experimente gewogen, und die prozentuale Änderung des Körpergewichts vom Anfang bis zur Beendigung der Therapie wurde als eine Anzeige der Arzneistoff-Toxizität herangezogen. Die Bestimmung der Empfindlichkeit von Neoplasmen gegen diese Mittel basierte auf der Verlängerung der Überlebenszeit, welche durch die Arzneimittelbehandlungen gewährt wurde.
Die Antitumor-Aktivität der Verbindungen 10a–h und 16 wurde in Mäusen überprüft, welche die L1210-Leukämie trugen. Die Ergebnisse dieser Tests sind in den Tabellen 4 und 5 zusammengefasst, welche die Effekte von 2-Alkoxycarbonyl- und 2-Aryloxycarbonyl-1,2-bis(methylsulfonyl)-1-(2-chlorethyl)hydrazinen auf die Überlebenszeit von Mäusen, welche die L1210-Leukämie tragen, zeigen.
Tabelle 4
Tabelle 5
In der Tabelle 4 wurde die optimale tägliche Dosis während 6 aufeinanderfolgenden Tagen einmal täglich verabreicht, beginnend 24 Stunden nach der Tumor-Implantierung, wobei 5–10 Mäuse pro Gruppe verwendet wurden. In der Tabelle 5 sind Mehrfach-Dosierungen der Verbindung 16 angezeigt. "Durchschn. Δ Gew." bezieht sich auf die durchschnittliche prozentuale Änderung des Körpergewichts vom Anfang bis zur Beendigung der Therapie. "% T/C" bezieht sich auf die durchschnittliche Überlebenszeit von behandelten/Kontroll-Mäusen × 100. Heilungen (60-Tage-Überlebende) sind separat aufgelistet und sind in dieser Berechnung nicht eingeschlossen.
Die Verbindungen 10a bis 10h und 16 zeigten eine signifikante Aktivität gegen den L1210-Leukämie-Tumor. Die Verbindungen 10d bis 10 g, in welchen ein aromatischer Ring direkt an den Carbamat-Sauerstoff (R = Aryl) gebunden war, erzeugte die besten Ergebnisse. Die aromatischen Verbindungen 10d–g waren weniger toxisch als die aliphatischen Analoge 10a–c, wie durch die größeren Unterschiede im Verlust des Wirtskörpergewichtes bewiesen wird, welche durch diese zwei Gruppen von Verbindungen erzeugt werden. Wie in der Tabelle 4 gezeigt, riefen alle der aliphatischen Analoge Körpergewichtsverluste von > 10,0% bei ihren optimalen täglichen Dosierungsspiegeln hervor. Die Zwischenschaltung bzw. Einschiebung einer Methylen(-CH₂-)-Gruppe zwischen den aromatischen Ring und das Carbamat-Stickstoffatom führte zu einer geringfügigen Senkung der Anti-Leukämie-Aktivität. Die Verbindung 10h erzeugte ein Maximum im % T/C von 222 bei dem Optimum-Dosierungsspiegel von 30 mg/kg pro Tag während 6 aufeinanderfolgenden Tagen. Wie in der Tabelle 5 gezeigt, wies auch die Verbindung 16 eine signifikante Anti-Tumor-Aktivität auf.
Die Fähigkeit der Verbindungen 10h, 11, 12 und 14, eine präferenzielle Toxizität auf hypoxische Zellen auszuüben, wurde unter Verwendung des EMT6-Brustkarzinoms durch eine früher beschriebene Methodik ausgewertet (Rockwelt, S., Keyes, S. R., und Sartorelli, A. C., Rad. Res. 116: 100–113 (1988); Keyes, S. R., Rockwell, S., und Sartorelli A. C., Cancer Res. 45: 213–216 (1985)). Kurz gesagt, wurden exponentiell wachsende Monoschichten von EMT6 (oder CHO-K1/dhfr^–-Klon) einer kontinuierlich fließenden angefeuchteten Atmosphäre aus 95% N₂/5% CO₂ 2 Stunden lang ausgesetzt, um eine radiobiologische Hypoxie hervorzurufen. Parallel-Kolben wurden auf ähnliche Weise in angefeuchteter 95% Luft/5% CO₂ gehalten. Ohne die Hypoxie zu abzubrechen, wurden Zellen 1 Stunde lang an verschiedene Konzentrationen des Testmittels exponiert. Dann wurde das Zellüberleben durch Koloniebildung gemessen.
CHO-K1/dhfr^–-Zellen wurden verwendet, um die Rolle der reduktiven Enzyme NADPH:Cytochrom-P₄₅₀-Reduktase und DT-Diaphorase in der Aktivierung der Verbindungen 10h und 12 in situ zu untersuchen. Klone von CHO-K1/dhfr^–Zellen, welche mit CDNAs für jedes dieser Enzyme transfiziert waren und selbige überexprimierten wurden für diesen Zweck verwendet (Belcourt, M. F., Hodnick, W. F., Rockwell, S., und Sartorelli, A. C., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 456–460 (1996); Belcourt, M. F., Hodnick, W. F., Rockwell, S., und Sartorelli, A. C., Biochem. Pharmacol. 51: 1669–1678 (1996)).
Die Zytotoxizität der Verbindung 10h wurde in vitro gegen EMT6-Maus-Brustkarzinomzellen unter aeroben und hypoxischen Bedingungen unter Anwendung des obenstehend beschriebenen Koloniebildungs-Assays ausgewertet. Die 1 zeigt das Überleben von EMT6-Zellen, welche verschiedenen Konzentrationen der Verbindung 10h 1 Stunde lang unter hypoxischen oder aeroben Bedingungen in vitro ausgesetzt wurden. Die Punkte sind die geometrischen Mittelwerte von zwei oder mehreren unabhängigen Bestimmungen der überlebenden Fraktionen bzw. Anteile. Die Standardabweichungen vom Mittelwert (SEMs) sind gezeigt, wo n > 3 und wo der Fehler größer als die Punktgröße ist. Die offenen Dreiecke repräsentieren aerobe Datenpunkte, und gefüllte Dreiecke repräsentieren hypoxische Datenpunkte. Wie in der 1 gezeigt, führte, bei einer Konzentration von 40 μM, eine einstündige Exposition an Verbindung 10h 2 log-Einheiten der Abtötung von hypoxischen EMT6-Zellen bei verhältnismäßig geringfügiger Toxizität gegenüber entsprechenden aeroben Zellen herbei.
Um zu sicherzustellen, dass die Nitrogruppe in der Verbindung 10h wichtig für die präferenzielle Zytotoxizität gegen hypoxische Zellen ist, wurde das unsubstituierte Benzylderivat (Verbindung 11) gegen EMT6-Zellen unter aeroben und hypoxischen Bedingungen ausgewertet, wie obenstehend umrissen. Wie in der 2 gezeigt, war die Verbindung 11 unter beiden Oxygenierungsbedingungen im wesentlichen in gleichem Maße toxisch gegenüber EMT6-Zellen. Dieser Befund legt nahe, dass die Nitrogruppe für eine präferenzielle Toxizität gegen hypoxische Zellen wesentlich ist.
Die Zytotoxizität der Verbindung 10h wurde in aeroben und hypoxischen Chinesischen-Hamster-Ovar(CHO-K1/dhfr^–)-Zellen ausgewertet, transfiziert mit und überexprimierend CDNAs für NADPH:Cytochrom-Paso-Reduktase (27-fach höher als Elternzellen, 3) oder DT-Diaphorase (133-fach höher als Elternzellen,
4), wobei es sich um zwei Reduktasen mit dem Potential, die Verbindung 10h zu aktivieren, handelt. In den 3 und 4 sind die Punkte Mittelwerte von Zweifachbestimmungen. Offene Dreiecke sind parental-aerob, ausgefüllte Dreiecke sind parental-hypoxisch, offene Kreise sind NADPH:Cytochrom-P₄₅₀-Reduktase-transfiziert-aerob; gefüllte Kreise sind NADPH:Cytochrom-P₄₅₀-Reduktase-transfiziert-hypoxisch; offene Quadrate sind DT-Diaphorase-transfiziert-aerob; und gefüllte Quadrate sind DT-Diaphorase-transfiziert-hypoxisch. Wie in 3 und 4 gezeigt, waren CHO-K1/dhfr^– Zellen weniger empfindlich gegen die Verbindung 10h als EMT6-Zellen, und hypoxische CHO-K1/dhfr^–-Zellen waren empfindlicher gegen Verbindung 10h als ihre aeroben Gegenstücke. Eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber der Verbindung 10h trat in Zellen auf, welche NRDPH:Cytochrom-P₄₅₀-Reduktase überexprimierten, was anzeigt, dass dieses Enzym in der biologischen Aktivierung von 10h in intakten Zellen beteiligt war. Im Gegensatz dazu führte die Überexpression von DT-Diaphorase nicht zu einer Erhöhung in der Abtötung entweder hypoxischer oder oxygenierter Zellen, was nahe legt, dass DT-Diaphorase nicht bei der Aktivierung dieser Verbindung beteiligt war.
Die Verbindung 12 wurde hinsichtlich ihres Vermögens ausgewertet, eine präferenzielle Toxizität gegen hypoxische EMT6-Zellen im Verhältnis zu ihren aeroben Gegenstücken auszuüben. 5 zeigt das Überlegen von EMT6-Zellen, welche 1 Stunde lang verschiedenen Konzentrationen der Verbindung 12 unter hypoxischen oder aeroben Bedingungen in vitro ausgesetzt waren. Die Punkte sind geometrische Mittelwerte von zwei oder mehreren unabhängigen Bestimmungen der überlebenden Fraktionen. Die Standardabweichungen sind gezeigt, wo n > 3 und wo der Fehler größer als die Punktgröße ist. Offene Dreiecke sind aerobe Datenpunkte, und ausgefüllte Dreiecke sind hypoxische Datenpunkte. Die 6 zeigt die Überlebenden von aeroben und hypoxischen CHO-K1/dhfr^–-Zellen, wobei der mit NADPH:Cytochrom-P₄₅₀-Reduktase-CDNA transfizierte Klon 27-fach mehr NADPH:Cytochrom-P₄₅₀-Reduktase als parentale Zellen exprimiert. Die Punkte sind Mittelwerte von Zweifachbestimmungen. Offene Dreiecke sind parental-aerob; ausgefüllte Dreiecke sind parental-hypoxisch; offene Kreise sind NADPH:Cytochrom-P₄₅₀-Reduktase-transfiziert-aerob; gefüllte Kreise sind NADPH:Cytochrom-P₄₅₀-Reduktasetransfiziert-hypoxisch.
Wie in der 5 gezeigt, verursachte, bei einer Konzentration von 50 μM, eine einstündige Exposition an Verbindung 12 mehr als 3 log-Einheiten der Abtötung von hypoxischen EMT6-Zellen, mit einer relativ geringfügigen Toxizität gegen entsprechende aerobe Zellen. Eine Auswertung der Zytotoxizität dieses Mittels gegen aerobe und hypoxische CHO-K1/dhfr^–-Zellen (6) führte zu Ergebnissen, welche ähnlich zu denjenigen waren, welche für die Verbindung 10h beschrieben wurden. So war die Verbindung 12 > 3000mal zytotoxischer gegenüber hypoxischen CHO-K1/dhfr^–Zellen, transfiziert mit und überexprimierend CDNAs für NADPH-Cytochrom-P₄₅₀-Reduktase, als gegen deren aerobe Gegenstücke.
Um den Effekt der Ersetzung eines der Benzyl-Wasserstoffe durch eine Methylgruppe zu untersuchen, wurde die Verbindung 14 hinsichtlich ihres Vermögens untersucht, eine präferenzielle Toxizität gegenüber hypoxischen EMT6-Zellen im Verhältnis zu aeroben Zellen auszuüben (7). Die Verbindung 14 schien weniger toxisch gegen aerobe EMT6-Zellen zu sein als die Verbindung 10h, wohingegen ihre hypoxische Zelltoxizität im wesentlichen die gleiche wie jene von Verbindung 10h war (vgl. 1 und 7). Die Punkte in der
7 sind geometrische Mittelwerte von zwei oder mehreren unabhängigen Bestimmungen. Offene Dreiecke sind aerobe Datenpunkte und gefüllte Dreiecke repräsentieren hypoxische Datenpunkte.
Während die Erfindung obenstehend unter Bezugnahme auf spezifische Ausführungsformen davon beschrieben worden ist, ist es offensichtlich, dass viele Änderungen, Modifikationen und Variationen ohne Abweichung von dem hierin offenbarten Konzept der Erfindung vorgenommen werden können. Folglich wird es beabsichtigt, alle derartigen Änderungen, Modifikationen und Variationen einzuschließen, welche innerhalb des Sinngehaltes und weiten Umfangs der beigefügten Patentansprüche liegen.

Claims

Verbindung der Formel
dadurch gekennzeichnet, dass R¹ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Niederalkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen und ungesättigten Alkylgruppen mit 2–6 Kohlenstoffatomen; R² gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Niederalkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen und ungesättigten Alkylgruppen mit 2–6 Kohlenstoffatomen; R³ eine substituierte oder unsubstituierte Niederalkylgruppe mit 1–6 Kohlenstoffatomen ist; und R⁴ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus substituierten oder unsubstituierten Niederalkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen und ungesättigten Alkylgruppen mit 2–6 Kohlenstoffatomen.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ und R² individuell gewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R³ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus -CH₃ und -CH₂-CH₂-X, wobei X ein Halogenatom ist.
Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R⁴ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Halogenalkyl, Vinyl, Phenyl, p-Tolyl, Halogenphenyl, Alkoxyphenyl, Nitrophenyl, Benzyl, Nitrobenzyl, 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl, Halogennitrobenzyl, 3-Methoxy-4-nitrobenzyl, 5-Methyl-2-nitrobenzyl, 1-(4-Nitrophenyl)ethyl, einem Substituent mit der Formel
oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon, und einem Substituent mit der Formel
oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorzellen, gekennzeichnet durch ein antineoplastisches Mittel in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wobei das antineoplastisches Mittel die Formel
aufweist, worin R¹ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Niederalkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen und ungesättigten Alkylgruppen mit 2–6 Kohlenstoffatomen; R¹ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Niederalkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, substituierten oder unsubstituierten Arylgruppen und ungesättigten Alkylgruppen mit 2–6 Kohlenstoffatomen; R³ eine substituierte oder unsubstituierte Niederalkylgruppe mit 1–6 Kohlenstoffatomen ist; und R⁴ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus substituierten oder unsubstituierten Niederalkylgruppen mit 1–6 Kohlenstoffatomen, einer substituierten oder unsubstituierten Arylgruppe und einer ungesättigten Alkylgruppe mit 2–6 Kohlenstoffatomen.
Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass R¹ und R² individuell gewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl.
Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass R³ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus CH₃ und -CH₂-CH₂-X, wobei X ein Halogenatom ist.
Die pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass R⁴ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Halogenalkyl, Vinyl, Phenyl, p-Tolyl, Halogenphenyl, Alkoxyphenyl, Nitrophenyl, Benzyl, Nitrobenzyl, 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl, Halogennitrobenzyl, 3-Methoxy-4-nitrobenzyl, 5-Methyl-2-nitrobenzyl, 1-(4-Nitrophenyl)ethyl, einem Substituent mit der Formel
oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon, und einem Substituent mit der Formel
oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon.
Verwendung eines antineoplastischen Mittels mit der Formel
worin R gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus Methyl, 2-Chlorethyl, Vinyl, Phenyl, p-Tolyl, Chlorphenyl, p-Methoxyphenyl, p-Nitrobenzyl, Benzyl, 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl, 1-(4-Nitrophenyl)ethyl und einem Substituent mit der Formel
oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon, in einem Träger, für die Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren des Wachstums von L1210-Leukemia oder EMT6-Brustkarzinom in Wirtsorganismen.
Verbindung der Formel
worin R¹ und R² jeweils Methyl sind; R³ 2-Chlorethyl ist; und R⁴ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus p-Nitrobenzyl, 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl, 1-(4-Nitrophenyl)ethyl, und Kombinationen hiervon.
Pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von Tumorzellen, umfassend ein antineoplastisches Mittel in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, wobei das antineoplastisches Mittel die Formel
aufweist, worin R¹ und R² jeweils Methyl sind; R³ 2-Chlorethyl ist; und R⁴ gewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus p-Nitrobenzyl, 4,5-Dimethoxy-2-nitrobenzyl, 1-(4-Nitrophenyl)ethyl, und Kombinationen hiervon.