DE69737126T2 - Hbv mutanten und methoden für deren nachweis - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Virusvarianten, die eine reduzierte Empfindlichkeit gegenüber bestimmten Agentien zeigen. Insbesondere richtet sich die vorliegende Erfindung auf Hepatitis-B-Varianten, die eine vollständige oder teilweise Resistenz gegen Nukleosidanaloge zeigen. Ferner werden in der vorliegenden Erfindung Tests zum Nachweis solcher Virusvarianten betrachtet, wobei sich die Tests zur Überwachung antiviraler Therapien eignen.
  • Bibliographische Einzelheiten zu den in der vorliegenden Beschreibung mit Ziffern bezeichneten Veröffentlichungen sind am Ende der Beschreibung zusammengestellt. Die Sequenzidentitätsnummern (SEQ ID NOs) für die Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen, auf die in der Beschreibung verwiesen wird, werden im Anschluß an die Literaturliste definiert.
  • In der gesamten Beschreibung wird, falls der Zusammenhang nicht anderes erfordert, das Wort "umfassen" bzw. werden Variationen, wie beispielsweise "umfaßt" oder "umfassend" bzw. der Ausdruck "beinhaltet" oder Variationen davon so verstanden, daß ein angegebenes Element oder eine angegebene ganze Zahl oder Gruppe aus Elementen oder ganzen Zahlen umfaßt ist, jedoch nicht unter Ausschluß eines beliebigen anderen Elements oder einer beliebigen anderen ganzen Zahl oder Gruppe aus Elementen oder ganzen Zahlen. Diesbezüglich wird bei der Auslegung des Anspruchsumfangs eine Ausführungsform, bei der ein oder mehrere Merkmale einem beliebigen Anspruch hinzugefügt werden, als innerhalb des erfindungsgemäßen Umfangs liegend angesehen, da die wesentlichen erfindungsgemäßen Merkmale wie beansprucht in einer solchen Ausführungsform enthalten sind.
  • Spezifische Mutationen in einer Aminosäuresequenz sind hier als "Xaa1nXaa2" dargestellt, wobei Xaa1 für den ur sprünglichen Aminosäurerest vor der Mutation steht, n die Nummer des Rests bedeutet und Xaa2 für die mutante Aminosäure steht. Bei der Abkürzung "Xaa" kann es sich um den Drei-Buchstaben- oder den Ein-Buchstaben-Aminosäurecode handeln. Die Aminosäurereste für die DNA-Polymerase des Hepatitis-B-Virus sind so numeriert, daß der Rest Methionin im Motiv Tyr Met Asp Asp (YMDD) den Rest Nummer 550 darstellt. Im Prioritätsdokument, der australischen Patentanmeldung Nr. PO3519, eingereicht am 8. November 1996, wurde das gleiche Methionin als Rest 530 bezeichnet. Die Aminosäurereste für die DNA-Polymerase, auf die in dieser Beschreibung verwiesen wird, sind entsprechend neu numeriert worden.
  • Das Hepatitis-B-Virus (HBV) kann schwächende Krankheitszustände auslösen und zu akutem Leberversagen führen. Bei HBV handelt es sich um ein DNA-Virus, das über eine RNA-Zwischenstufe repliziert und bei seiner Replikationsstrategie die reverse Transkription einsetzt (1). Das HBV-Genom ist komplett aufgebaut und weist eine teilweise doppelsträngige DNA-Struktur mit überlappenden offenen Leserastern auf, die für Oberflächen-, Kern-, Polymerase- und X-Gene codieren. Der komplexe Aufbau des HBV-Genoms ist in 1 dargestellt.
  • Das Vorhandensein einer HBV-DNA-Polymerase führte zu dem Vorschlag, daß Nukleosidanaloge als wirksame antivirale Agentien fungieren könnten. Nukleosidanaloge, die zur Zeit getestet werden, sind beispielsweise Penciclovir und seine orale Form Famciclovir (2, 3, 4, 5) sowie Lamivudin (6, 7). Derartige Agentien können potentiell bei der Behandlung einer chronischen HBV-Infection zum Einsatz kommen.
  • Kürzlich konnte gezeigt werden, daß Penciclovir eine starke Hemmaktivität gegenüber der DNA-Synthese von Enten-HBV in vitro aufweist und die HBV-DNA-Polymerasereverse-Transkriptaseaktivität in vitro hemmt (8, 9). In ähnlicher Weise konnte gezeigt werden, daß das orale Famciclovir die intrahepatische Replikation des Enten-HBV-Virus in vivo hemmt (10). Beim Menschen konnte gezeigt werden, daß Famciclovir die HBV-DNA-Replikation in einem Patienten mit schwerer Hepatitis B nach orthotopischer Lebertransplantation (OLT) reduziert (11). Es konnte gezeigt werden, daß Peniciclovir Mutationen im Bereich B der HBV-Polymerase induziert (18). 3TC wird mit Mutationen im hochkonservierten YMDD-Motiv der HBV-Polymerase in Zusammenhang gebracht (16).
  • In der vorliegenden Erfindung vorangehenden Arbeiten wurde eine antivirale Therapie mit Nukleosidanalogen verwendet, um das Wiederauftreten einer schweren HBV-Infektion nach OLT zu kontrollieren (12). Dabei ist eine Langzeittherapie obligatorisch, bei der Patienten eine Immunsuppression durchmachen und die Geschwindigkeit der HBV-Replikation sehr hoch ist. Allerdings besteht unter derartigen Bedingungen, wie bei jeder Langzeit-Chemotherapie infektiöser Agentien, ein Potential für die Entwicklung von Resistenz oder einer reduzierten Empfindlichkeit gegenüber den eingesetzten Therapeutika.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wurden von den Erfindern Varianten von HBV identifiziert, die Mutationen im HBV-DNA-Polymerase-Gen aufweisen, die in unterschiedlichen Ausmaßen die Empfindlichkeit von HBV gegenüber Nukleosidanalogen reduzieren. Die Identifikation dieser HBV-Varianten ist für die Entwicklung von Tests zur Überwachung therapeutischer Schemata mit Nukleosidanalogen sowie zum Screening für Agentien, die Auswirkungen der Mutation maskieren können, bedeutsam. Darüber hinaus kann eine Nukleotidmutation in einem offenen Leseraster die Translationsprodukte in einem anderen offenen Leseraster betreffen, da das HBV-Genom eine Reihe überlappender offener Leseraster umfaßt.
  • Dementsprechend richte sich die vorliegende Erfindung auf eine Variante eines isolierten HBV-Virus, das über eine RNA-Zwischenstufe repliziert, wobei die Variante eine Nukleotidmutation in einem für eine DNA-Polymerase codierenden Gen umfaßt, was zu wenigstens einer Aminosäuresubstitution von Leu zu Met an Position 526 der DNA-Polymerase führt.
  • Die Mutation in der DNA-Polymerase führt zu einer verminderten Empfindlichkeit des HBV gegenüber einem Nukleosidanalog.
  • Bereiche der HBV-Polymerase zeigen eine Aminosäureähnlichkeit zu anderen RNA-abhängigen DNA-Polymerasen und RNA-abhängigen Polymerasen (13). In dieser Beschreibung wird auf die von Poch et al (13) als Domänen B und C definierten konservierten Bereiche verwiesen.
  • Vorzugsweise führt die Mutation zu einer veränderten Aminosäuresequenz in der B-Domäne der HBV-DNA-Polymerase.
  • Es wird eine HBV-Variante bereitgestellt, die eine Mutation in der für eine DNA-Polymerase codierenden Nukleotidsequenz umfaßt, was zu einem Aminosäureaustausch von Leu gegen Met in der DNA-Polymerase in deren B-Domäne an Position 526 führt und wobei die Variante eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber einem Nukleosidanalog zeigt.
  • Dabei umfassen die von der vorliegenden Erfindung betrachteten Nukleosidanaloge Penciclovir und seine orale Form Famciclovir ebenso wie Lamivudin (3TC).
  • Es wird davon ausgegangen, daß die B-Domäne die Aminosäurereste 505 bis 529 der HBV-DNA-Polymerase umfaßt. Diese Sequenz wird wie folgt dargestellt:
    S/A H PI I/V LGFRK I/L PMG V/G GLSPFLLAQF (SEQ ID NO 24)
  • Die Bezugnahme auf die B-Domäne beinhaltet die Bezugnahme auf benachbarte Bereiche, die bis zu 20 Aminosäuren auf jeder Seite der Domäne beinhalten. Vorzugsweise erfolgt die Mutation bei einer oder mehreren der folgenden Aminosäuren:
    Q/K T Y/F G R/W KLHL Y/L S/A HPI I/V LGFRK I/L PMG V/G GLSPFLLAQFTSAI C/LS (SEQ ID NO 25)
  • Die C-Domäne umfaßt die Aminosäuren 546 bis 556 wie folgt:
    A/V F S/A YMDD V/L/M VLG (SEQ ID NO 26)
  • Diese beinhaltet die YMDD-Domäne (SEQ ID NO 30), in der der Methioninrest als Rest 550 angesehen wird (formal als Rest Nummer 530 betrachtet). Die Restnumerierung in dieser Beschreibung wurde gemäß dem neuen Numerierungssystem angepaßt, bei dem das Methionin von YMDD die Nummer 550 aufweist.
  • Die Bezugnahme auf die C-Domäne beinhaltet auch benachbarte Bereiche von bis zu 20 Aminosäuren auf jeder Seite der Domäne.
  • Der Begriff "Resistenz" wird im allgemeinsten Sinn verwendet und beinhaltet die Gesamtresistenz oder Teilresistenz oder eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber einem Nukleosidanalog.
  • Die Varianten liegen vorzugsweise in isolierter Form vor, so daß sie wenigstens einen Reinigungsschritt weg von der natürlich vorkommenden Körperflüssigkeit durchgemacht haben. Als Alternative können die Varianten in einer isolierten Körperflüssigkeit gehalten werden oder können in DNA-Form vorliegen. In der vorliegenden Erfindung werden auch infektiöse molekulare Klone betrachtet, die das Genom aus einer HBV-Variante oder Teile davon umfassen.
  • Bei der Mutation in der HBV-DNA-Polymerase handelt es sich um Glu Leu526Met, wobei das YMDD-Motiv in der C-Domäne nicht mutiert ist. Die Identifizierung der Varianten der vorliegenden Erfindung gestattet die Erzeugung einer Reihe von Tests zum Nachweis solcher Varianten. Der Nachweis solcher Varianten kann bei der Identifizierung resistenter Varianten zur Bestimmung der geeigneten Chemotherapieform und/oder zur Überwachung von Impfprotokollen bedeutsam sein.
  • Dementsprechend wird in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Potentials eines HBV, eine reduzierte Empfindlichkeit gegenüber einem Nukleosidanalog zu zeigen, betrachtet, wobei man in dem Verfahren DNA oder entsprechende mRNA aus dem HBV isoliert und ein Screening auf eine Mutation in der für HBV-DNA-Polymerase codierenden Nukleotidsequenz durchführt, wobei wenigstens ein Aminosäureaustausch von Leu gegen Met in der B-Domäne der DNA-Polymerase in Position 526 erfolgt, wobei das Vorhandensein einer solchen Mutation ein Zeichen für die Wahrscheinlichkeit einer Resistenz gegen das Nukleosidanalog ist.
  • In dem Test wird eine Mutation bestimmt, die zu einem Leu526Met-Austausch Glu führt.
  • Die DNA oder entsprechende RNA kann getestet oder alternativ die DNA-Polymerase oder ein Oberflächenantigen einem Screening auf die Mutation unterzogen werden.
  • Bei dem Nachweis gemäß diesem erfindungsgemäßen Aspekt kann es sich um ein beliebiges Nachweismittel auf Nukleinsäurebasis handeln, beispielsweise Nukleinsäure-Hybridisierungstechniken oder Polymerasekettenreaktion (PCR). Ferner umfaßt die Erfindung die Verwendung unterschiedlicher Testformate der genannten Nachweismittel auf Nukleinsäurebasis einschließlich u. a. Restriktionsfragment-Mengenpolymorphismus (RFLP), Amplifikationsfragment-Mengenpolymorphismus (AFLP), Einzelstrang-Ketten-Polymorphismus (SSCP), Amplifikations- und Mismatchnachweis (AMD), unterbrochene repetitive Sequenzpolymerasekettenreaktion (IRS-PCR), inverse Polymerasekettenreaktion (iPCR) sowie reverse Transkription-Polymerasekettenreaktion (RT-PCR).
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auf eine Reihe von Tests auf immunologischer Basis zum Nachweis der HBV-DNA-Polymerase-Variante. Diese Tests beruhen auf Antikörpern, die gegen natürlich vorkommende HBV-DNA-Polymerase gerichtet sind und die nicht bzw. im wesentlichen nicht mit der HBV-DNA-Polymerase-Variante interagieren. Als Alternative werden Antikörper gegen eine HBV-DNA-Polymerase-Variante verwendet, die nicht bzw. im wesentlichen nicht mit natürlich vorkommender HBV-DNA-Polymerase interagieren.
  • Es können monoklonale oder polyklonale Antikörper verwendet werden, doch sind monoklonale Antikörper bevorzugt, da sie in großer Menge und in homogener Form produziert werden können. Dabei steht eine große Bandbreite an Immuntesttechniken zur Verfügung, wie sie beispielsweise in den US-Patenten 4,016,043, 4,424,279 und 4,018,653 beschrieben sind.
  • Der Nachweis von Aminosäurevarianten der DNA-Polymerase wird zweckmäßigerweise unter Bezugnahme auf die in 4 dargestellte Konsensus-Aminosäuresequenz bewerkstelligt. Dabei repräsentieren die dargestellten Polymorphismen die in verschiedenen Datenbanken für pathogene HBV-Stämme dargestellten Variationen. Umfaßt eine HBV-Variante eine andere Aminosäure als dargestellt, so wird ein solches Isolat als mutmaßliche HBV-Variante mit einer veränderten DNA-Polymeraseaktivität angesehen.
  • Dementsprechend wird in einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung, ob ein HBV-Isolat eine DNA-Polymerase-Variante codiert, betrachtet, wobei man in dem Verfahren die Aminosäuresequenz seiner DNA-Polymerase an Position 526 direkt oder über eine Nukleotidsequenz bestimmt und diese mit der unten angegebenen Aminosäuresequenz vergleicht:
    Figure 00080001
    wobei das Vorhandensein einer von der Konsensussequenz verschiedenen Aminosäure eine mutmaßliche HBV-Variante anzeigt.
  • Ferner werden in der vorliegenden Erfindung Agentien betrachtet, die Nukleosidanalogresistenzmutation maskieren. Derartige Agentien eignen sich insbesondere bei der Langzeitbehandlung mit Nukleosidanalogen. Bei den Agentien kann es sich um DNA oder RNA oder proteinhaltige oder nichtproteinhaltige chemische Moleküle handeln. Ein Screening von Naturprodukten, wie beispielsweise aus Pflanzen, Korallen und Mikroorganismen, wird ebenso als geeignete potentielle Quelle für Maskie rungsagentien angesehen. Die Agentien können dabei in isolierter Form oder in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorliegen und nacheinander oder gleichzeitig mit dem Nukleosidanalog verabreicht werden.
  • Die vorliegende Erfindung erstreckt sich auch auf Kits für Tests auf HBV-Varianten. Solche Kits können beispielsweise die Reagentien aus einer PCR oder einer anderen Nukleinsäurehybridisierungstechnik oder Reagentien für Nachweistechniken auf immunologischer Basis enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die folgenden, nichteinschränkenden Figuren und Beispiele beschrieben.
  • Dabei zeigt:
  • 1 in Form einer schematischen Darstellung das teilweise doppelsträngige DNA-Genom von HBV, wobei die für die Gene S (surface [Oberfläche]), C (core [Kern], P (Polymerase) und X codierenden überlappenden offenen Leseraster dargestellt sind.
  • 2 in einer graphischen Darstellung das biochemische (ALT) und virologische (HBV-DNA) Serumprofil im Transplantationspatienten sowie die auf die Einführung verschiedener antiviraler Behandlungsprogramme folgenden Reaktionen. Die Behandlung GCV + PFF, GCV und FCV[I] sowie FCV[II] sind ausführlich in den Beispielen beschrieben. Bei der Behandlung GCV + PFF handelt es sich um eine Kombination aus Ganciclovir plus Foscamet (12), Bei der Behandlung GCV um eine Therapie mit parenteraler Ganciclovir-Aufrechterhaltung und bei der Behandlung FCV[I] bzw. FCV[II] um eine orale Famciclovir-Therapie mit einer Dosis von zweimal täglich 250 mg bzw. 500 mg. Die Tage, an denen die Therapie begonnen wurde, sind jeweils in Klammern angegeben. Die ALT-(∙-∙) und HBV-DNA-(☐-☐) Reaktionen sind gegen den Zeitraum vom Beginn der antiviralen Therapie bis sechs Monate nach OLT aufgetragen. Dabei sind die fünf Schlüsselzeitpunkt für die Sequenzanalyse vor der Behandlung (PRE-) sowie an Tag 87, 600, 816 und 1329 nach der antiviralen Behandlung dargestellt.
  • 3 die vergleichende Gegenüberstellung (Alignment) von Aminosäuren der Sequenzmotive der RNA-abhängigen DNA-Polymerase aus HBV, vor Behandlung mit Famciclovir sowie 370 Tage nach Behandlung (Gesamtdauer der antiviralen Therapie: 816 Tage) mit dem WHV (woodchuck hepatitis virus), HIV (human immunodeficiency virus) und den vergleichbaren Bereichen bei der DNA-Polymerase von HSV (herpes simplex virus) (13, 14) (SEQ ID NOs 31–35 und 50–57). Die konservierten Asparagin (D)- und Glycin (G)-Reste innerhalb der Polymerasemotive sind in Fettdruck dargestellt, und die nach Behandlung mit Famciclovir angetroffenen Aminosäureänderungen sind in Fettdruck dargestellt und unterstrichen. Die Lage der mutierten Aminosäurereste innerhalb der HBV-Polymerase ist dargestellt. Der in Fettdruck dargestellte und unterstrichene Glycin (G)-Rest in der HSV-Polymerase wird während der Behandlung mit Penciclovir zu einem Cystein (C) (15).
  • 4 eine Darstellung konservierter Bereiche der Domäne A bis E (unterstrichen) von HBV. Dabei wird M in YMDD mit der Aminosäurenummer 550 bezeichnet. * deutet mehr als drei mögliche Aminosäuren an dieser Position der Consensussequenz an (SEQ ID NO 29).
  • 5 eine Darstellung der vergleichenden Gegenüberstellung von Aminosäuren der Sequenzmotive der RNA-abhängigen DNA-Polymerase aus HBV, wobei die Aminosäureänderungen, auf die in Gegenwart von Famciclovir und 3TC selektioniert wurde, festgehalten sind (SEQ ID NO 36–41 und 45–49). Die HBV-Consensussequenz wurde aus veröffentlichten Sequenzen in Genebank/Entrez erhalten. Die konservierten Asparagin (D)- und Glycin (G)-Reste innerhalb der Polymerasemotive sind in Fettdruck dargestellt. Die nach Behandlung mit Famciclovir vorgefundenen Aminosäureänderungen sind in grünem Fettdruck dargestellt sowie unterstrichen und die nach 3TC-Behandlung in blauem Fettdruck sowie unterstrichen. Die Aminosäuresequenz des aus Patient A und Patient B während der Behandlung mit Famciclovir sowie aus Patient C, der nicht auf Famciclovir ansprach und später mit 3TC behandelt wurde, isolierten HBV ist dargestellt, wobei darin eines Resistenzmutation selektioniert wurde. Die von Ling et al (16) nachgewiesenen veröffentlichten 3TC-Änderungen sind in 3TC 1 dargestellt.
  • 6 eine Darstellung der Nukleotidsequenz (SEQ ID NO 17) einer HBV-Variante und entsprechender Aminosäuresequenzen für HBV-DNA-Polymerase und HBV-Oberflächenantigen, wobei die Mutationen RIW499 in der Polymerase sowie D144E und G145R im Oberflächenantigen in Fettdruck dargestellt sind.
  • BEISPIEL 1
  • FALLSTUDIE
  • 1. PATIENT A
  • Von den Erfindern wurden die offenen Leseraster für HBV-Polymerase und X von einer Reihe von Isolaten aus einem Patienten, der im Anschluß an ein Wiederauftreten einer HBV-Infektion nach Lebertransplantation fast vier Jahr lang eine antivirale Therapie erhalten hatte, sequenziert (2).
  • Der Patient (männlich, 42 Jahre alt) erhielt ein Transplantat wegen Leberversagens im Endstadium aufgrund einer chronischen HBV-Infektion. Der Verlauf nach der Transplantation war zunächst unauffällig, doch gab es nach fünf Monaten Hinweise auf ein Wiederauftreten der Infektion sowie sehr hohe Spiegel an viraler Replika tion und eine Verschlechterung der Leberfunktion (12). Das histologische Bild entsprach einer fibrosierenden cholestatischen Hepatitis. Mit der antiviralen Behandlung wurde ungefähr sechs Monate nach OLT begonnen. Zunächst erhielt der Patient intravenös (iv) Ganciclovir (GCV; 10 mg/kg/Tag) in Kombination mit iv Foscarnet (PFF; 50–125 mg/kg/Tag; die Dosis hängt von der Nierenfunktion ab) (12). Hierbei handelt es sich um die in 2 beschriebene Behandlung mit GCV + PFF, die 86 Tage andauert. Mit iv Aufrechterhaltung von GCV (3,3–6,7 mg/kg/Tag) dreimal pro Woche wurde an Tag 87 der antiviralen Behandlung begonnen (GCV in 2). Mit oralem Famciclovir (250 mg, zweimal täglich) wurde an Tag 446 der Therapie begonnen (FCV[I] in 2), wobei am Tag 500 auf 500 mg zweimal täglich erhöht wurde (FCV[I] in 2). Der Patient durchläuft zur Zeit dieses Behandlungsschema. Die klinischen und virologischen Einzelheiten zu diesem Patienten vor der Famciclovir-Therapie wurden mitgeteilt (12).
  • Serumproben wurde routinemäßig gesammelt und bei –70°C gelagert. Der Patient gab nach Unterrichtung sein Einverständnis, diese Proben für Forschungszwecke zu verwenden. In 2 sind die Spiegel von Alaninaminotransferase (ALT) und HBV-DNA über den gesamten Verlauf der antiviralen Behandlung dargestellt. Dabei decken die fünf für zusätzliche Untersuchungen gewählten Proben einen Zeitraum von fast vier Jahren ab.
  • 2. PATIENT B
  • Patient B wurde wegen des Verlusts des Allotransplantats in Verbindung mit einer "pre-core"-Mutante assoziierten HBV 14 Monate nach der ersten Lebertransplantation einer erneuten Transplantation unterzogen. Dabei wurde 10 Monate lang eine antivirale Behandlung mit GCV (7,5 mg/kg/Tag) gegeben und dann gestoppt. Daran schloß sich eine oral verabreichte Famciclovir-Therapie an (500 mg, dreimal täglich).
  • Das gesamte HBV-Polymerase-Gen aus Patient B wurde aus einer nach der Transplantation und 850 Tagen FCV-Therapie entnommenen HBV-Serumprobe sequenziert. Die die katalytischen Domänen der HBV-Polymerase umschließenden Bereiche wurden aus einer Serumprobe vor Transplantation und vor der FCV-Behandlung sequenziert.
  • 3. PATIENT C
  • Dieser Patient sprach nicht auf Famciclovir an und wurde später mit Lamivudin (3TC) (6, 7) behandelt, wobei eine Resistenzmutation selektioniert wurde.
  • 4. PATIENT D
  • Dieser Patient wird mit Famciclovir behandelt, wobei eine Resistenzmutation selektioniert wird.
  • BEISPIEL 2
  • VIRALE MARKER IM SERUM
  • HbsAg (Hepatitis B surface antigen), HbeAg (hepatitis B e antigen), anti-HBe, HbcAg (hepatitis B core antigen)-spezifisches IgG und IgM, Hepatitis-A-spezifisches IgM, Hepatitis-delta-Antigen und -Antikörper sowie Anti-Hepatitis-C-Virus-Antikörper wurden mit im Handel erhältlichen Immuntests (Abbott Laboratories, North Chicago, IL) gemessen. Dabei waren lediglich die HBV-Marker positiv. Die Hepatitis-B-Virus-DNA-Spiegel wurden unter Verwendung eines Einfang-Hybridisierungstests nach den Anweisungen des Herstellers (Digene Diagnostics Inc., Beltsville, MD) gemessen und quantifiziert. Dieser Patient wurde mit einer "pre-core"-HBV-Mutante vor OLT infiziert (12), wobei sich dieser Status nach OLT nicht änderte.
  • BEISPIEL 3
  • SEQUENZIERUNG UND KLONIERUNG VON HBV-DNA
  • 1. Extraktion von DNA aus Seren:
  • Portionen von jeweils 50 μl Serum wurden mit 150 μl TE (10 mmol/l Tris HCl (pH 7,5), 2 mmol/l EDTA), 1% (w/v) Natriumdodecylsulfat und 1 mg/ml Pronase gemischt und zwei Stunden bei 37°C inkubiert. Die DNA wurde mit Phenol/Chloroform deproteinisiert, mit Isopropanol gefällt und in 25 μl nukleasefreiem Wasser gelöst.
  • 2. Amplifikation der viralen Gene für Polymerase und X mittels Polymerasekettenreaktion (PCR):
  • Oligonukleotide wurden von der Firma Bresatec, Adelaide, Australien synthetisiert. Bei dem Sense-Primer zur Amplifikation des Polymerase-Gens handelte es sich um 5'-GGA GTG TGG ATT CGC ACT CC-3' [SEQ ID NO 1] (Nukleotide [Nt] –40 bis –21) und bei dem Antisense-Primer um 5'-GCT CCA AAT TCT TTA TA-3' [SEQ ID NO 2] (Nt 2831 bis 2847). Beim Sense-Primer für die Amplifikation des X-Gens handelte es sich um 5'-CCT TTA CCC CGT TGC CCG GC-3' [SEQ ID NO 3] (Nt 2055 bis 2074) und beim Antisense-Primer um 5'-GCT CCA AAT TCT TTA TA-3' [SEQ ID NO 4] (Nt 2831 bis 2847). Alle Nt werden vom Start des Polymerase-Gens her numeriert. Die Reaktionen wurden jeweils unter Verwendung von 5 μl der extrahierten DNA als Matrize, 1,5 U Taq-Polymerase (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT), 1 μmol/l Sense- und Antisense-Primer, jeweils 200 μmol/l Desoxynukleosidtriphosphat, 50 mmol/l KCl, 3,5 mmol/l MgCl2, 10 mmol/l Tris-HCl (pH 8,3) und 0,01 (w/v) Gelatine durchgeführt. Die Amplifikation wurde mit 40 Zyklen aus Denaturierung (1 min bei 94°C), Annealing (1 min bei 55°C) und Verlängerung (1,5 min bei 72°C) sowie einem abschließendem Verlängerungsschritt von 7 min erreicht (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT). Das PCR-Produkt wurde mittels Gelelektrophorese in einem 1,5% (w/v) Agarosegel analysiert und nach Anfärbung mit Ethidiumbromid durch UV-Bestrahlung sichtbar gemacht.
  • 3. Sequenzierung der HBV-DNA-Gene für Polymerase und X:
  • Das spezifische amplifizierte Produkt wurde unter Verwendung von Geneclean II (BIO 101 Inc., La Jolla, CA) aufgereinigt und direkt mit Sequenase Version 2.0 (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) sequenziert. Die PCR-Primer wurden als Sequenzierprimer verwendet, wobei interne Primer zusätzlich synthetisiert wurden, um die innen liegenden Bereiche der PCR-Produkte zu sequenzieren. Dabei wurden die folgenden internen Primer und Sequenzier-Primer verwendet: 5'-GCC GCG TCG CAG AAG ATC TCA AT-3' [SEQ ID NO 5] (Nt 104–126), 5'-GGT TCT ATC CTA ACC TTA CC-3' [SEQ ID NO 6] (Nt 341–360), 5'-GCC TCA TTT TGT GGG TCA CCA TA-3' [SEQ ID NO 7] (Nt 496–518), 5'-TGG GGG TGG AGC CCT CAG GCT-3' [SEQ ID NO 8] (Nt 731–751), 5'-CAC AAC ATT CCA CCA AGC TC-3' [SEQ ID NO 9] (Nt 879–899), 5'-AAA TTC GCA GTC CCC AAC-3' [SEQ ID NO 10] (Nt 1183–1195), 5'-GTT TCC CTC TTC TTG CTG T-3' [SEQ ID NO 11] (Nt 1429–1447), 5'-TTT TCT TTT GTC TTT GGG TAT-3' [SEQ ID NO 12] (Nt 1683–1703) 5'-CCA ACT TAC AAG GCC TTT CTG-3' [SEQ ID NO 13] (Nt 1978–1999), 5'-CAT CGT TTC CAT GGC TGC TAG GC-3' [SEQ ID NO 14] (Nt 2239–2262)
  • 4. Klonierung des HBV-Polymerasegens in pUC18:
  • Aufgrund der geringen Menge an HBV-DNA in den Proben wurde der nt 1429 bis 1703 umfassende Bereich aus dem HBV-Polymerase-Gen mittels PCR unter Verwendung der Primer 5'-GTT TCC CTC TTC TTG CTG T-3' [SEQ ID NO 15] (Nt 1429–1447) und 5'ATA CCC AAA GAC AAA AGA AAA-3' [SEQ ID NO 16] (Nt 1703–1683) vor der Klonierung amplifiziert. Die DNA wurde mit Geneclean II aufgereinigt und unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England Biolabs, Beverly, MA) in ein mit SmaI verdautes dephosphoryliertes pUC18-Plasmid (Pharmacia Biotech, NJ) ligiert. Die Klone wurden wie oben direkt sequenziert.
  • BEISPIEL 4
  • DNA-POLYMERASE-TEST
  • Serumproben (100 μl) wurden auf ein 20% (w/v) Saccharosekissen in TNE (20 mmol/l Tris-HCl pH 7,4, 150 mmol/l NaCl2, 1 mmol/l EDTA) aufgetragen und 3 Std. bei 10°C unter Verwendung eines SW41-Rotors in einer Beckman-Ultrazentrifuge, Modell L8, bei 200 000 g zentrifugiert. Das Sediment wurde in 50 mmol/l TRIS-HCl, pH 7,5 mit 1,5 Vol.-% Triton-X100, 100 mmol/l KCl und 0,01 Vol-% 2-Mercaptoethanol resuspendiert und über Nacht bei 4°C stehen gelassen. Kleine Portionen der Suspensionen wurden im wesentlichen wie bei Price et al (16) beschrieben auf endogene HBV-DNA-Polymeraseaktivität getestet. Dabei wurden die Tests jeweils in einem Gesamtvolumen von 30 μl, das 20 μl des teilgereinigten HBV sowie 30 mmol/l Tris-HCl pH 7,5, 30 mmol/l MgCl2, jeweils 10 μmol/l dATP, dTTP und dGTP sowie 0,01 μM [a-32P]-dCTP (3000 Ci/mmol) (Dupont NEN, Boston, MA) (jeweils Endkonzentrationen) enthielt, durchgeführt. Zum Testen auf Empfindlichkeit gegenüber Penciclovir-Triphosphat (PCV-TP) wurden an jeder Probe gepaarte Tests durchgeführt, wobei in einem Test eines jeden Paars ein Überschuß von 100 μmol/l Penciclovir-Triphosphat im Reaktionsgemisch enthalten war. Nach 2 Std. bei 37°C wurden die Reaktionen gestoppt, indem Portionen von jeweils 20 μl Reaktionsgemisch auf Glasfaserscheibchen mit einem Durchmesser von 25 mm (Advantex, Tokio, Japan), die zuvor in 10% (w/v) Trichloressigsäure (TCA) eingeweicht worden waren, punktförmig aufgetragen. Die Scheibchen wurden getrocknet und anschließend in eiskalter 10% (w/v) TCA mit 10 mmol/l Natriumpyrophosphat gewaschen. Danach wurde noch dreimal für jeweils 10 min in kalter (5 Vol.-%) TCA gewaschen. Die gewaschenen Scheibchen wurden in absolutem Ethanol gespült, an der Luft getrocknet und hinsichtlich Radioaktivität ausgezählt. Die Hemmung der HBV-DNA-Polymeraseaktivität durch PCV-TP wurde als prozentualer Unterschied der Aktivität im Testansatz mit PCV-TP gegenüber der entsprechenden Kontrolle ausgedrückt. Aufgrund der begrenzten Probenmengen war es nicht möglich, die Enzymaktivität zu standardisieren oder Wiederholungstests durchzuführen. Trotz der innewohnenden Variabilität des Tests zeigte sich eine allgemeine zeitliche Verringerung der Empfindlichkeit der HBV-DNA-Polymerase gegenüber PCV-TP (siehe Tabelle 1).
  • BEISPIEL 5
  • EFFEKT DER ANTIVIRALEN THERAPIE
  • Mit Beginn der antiviralen Behandlungsstrategie GCV + PFF verringerte sich der HBV-DNA-Spiegel nach OLT von über 100 000 pg/ml auf 10 800 pg/ml an Tag 87 (2). Diese Reduktion der Virämie war mit einer klinischen, biochemischen und histologischen Verbesserung verbunden (12). Die Therapie unter Aufrechterhaltung von Famciclovir (Behandlung GCV) führte zu schwankenden HBV-DNA-Spiegeln während der folgenden 359 Tage, wobei zwei Spitzenwerte für HBV-DNA beobachtet wurden. Der Wechsel zu oralem Famciclovir an Tag 446 war ebenso mit einem Anstieg der HBV-DNA verbunden, doch lag dies eher an einer unzureichenden Dosierung (FCV[I] in 2) als an einem Durchbruch bei der Behandlung. Nach Erhöhung der Dosis auf FCV[II] an Tag 500 nahm die HBV-DNA ab. Allerdings stieg der HBV-DNA-Spiegel allmählich mit der Zeit von 3 000 pg/ml an Tag 600 (154 Tage mit Famciclovir) auf 8 800 pg/ml an Tag 816 (370 Tage mit Famciclovir) an, wobei ein Spitzenwert von 29 000 pg/ml an Tag 1302 (856 Tage mit Famciclovir) auftrat, und stabilisierte sich dann bei ungefähr 12 000 pg/ml an Tag 1329 (883 Tage mit Famciclovir). Ein Students-Test der DNA-Spiegel während des Behandlungszeitraums von Tag 816 bis Tag 1329 zeigte einen statistisch signifikanten Anstieg. Es lag ein 1,5 bis 2facher Anstieg der ALT-Spiegel über dem gleichen Zeitraum (2) vor, wobei keine Änderung des klinischen Status erfolgte.
  • BEISPIEL 6
  • NUKLEOTIDÄNDERUNGEN
  • Die Gene für X und die Polymerase des HBV wurden zu fünf Zeitpunkten sequenziert (2). Über einen Zeitraum von fast vier Jahren antiviraler Therapie gab es keine Änderungen im X-Gen im Vergleich mit der Sequenz vor der Behandlung. Allerdings wurden fünf Nt-Änderungen im Polymerase-Gen aus Proben von Tag 816 und Tag 1329 nachgewiesen (Tabelle 1). Diese Änderungen wurden in getrennten unabhängigen PCR-Amplifikationen nachgewiesen; weiterhin wurden die Mutationen durch Sequenzierung beider Stränge nachgewiesen, wodurch es unwahrscheinlich ist, daß sie durch in der PCR erzeugte Fehler entstanden sind. Die Nt-Änderungen im Polymerase-Gen wurden zuerst nach 816 Tagen Behandlung nachgewiesen, als der Patient 370 Tage mit Famciclovir behandelt worden war. Dabei führten allerdings nur zwei Nt-Änderungen, und zwar an Positionen 1498 und 1519, zu Aminosäureänderungen, nämlich Val 519-Leu bzw. Leu 526-Met. Diese beiden Nt-Änderungen traten gleichzeitig auf. An Tag 816 wurden drei verschiedene Nt (C, G, T) an Position 1498 nachgewiesen (wobei alle zu einer Änderung von Val nach Leu führen würden). Nach 1329 Tagen nach der Behandlung war Thymidin die dominante Spezies bei Nt 1498. Die Aminosäureänderungen an Tag 816 und 1329 nach der Behandlung fielen mit einer reduzierten Serum-HBV-DNA-Polymeraseempfindlichkeit gegenüber PCV-TP zusammen (Tabelle 1). Diese Nt-Änderungen fanden sich nicht in sechs Patienten mit einer nach OLT wiederauftretenden HBV-Infektion, die keine FCV-Therapie durchmachten.
  • Der die zu Aminosäureänderungen führenden Nt-Mutationen umfassende Bereich aus der an Tag 1329 entnommenen Probe wurde kloniert und sequenziert. Dabei wurden drei Quasi-Spezies nachgewiesen. 75% (15/20) der Klone enthielten sowohl die 1498- als auch die 1519-Mutationen, die zusammen auftraten. Nicht mutierte Sequenzen ("vor der Behandlung") wurden in 3 von 20 der Klone nachgewiesen. Eine weitere Mutation bei Nt 1511, die zu einer Änderung von Prolin nach Leucin an Position 523 führen würde, wurde in 2 von 20 Klonen nachgewiesen. Diese Mutation wurde weder zusammen mit den beiden dominanten Mutationen 1498 (Val 519-Leu) und 1519 (Leu 526-Met) noch durch direkte PCR-Sequenzierung nachgewiesen, was darauf hindeutet, daß sie vermutlich mit einer geringeren Häufigkeit auftritt. Virus-DNA aus der an Tag 600 (150 Tage FCV-Behandlung) gewonnenen Probe wurde ebenso kloniert und sequenziert; allerdings wurden lediglich die Sequenzen "vor der Behandlung" nachgewiesen.
  • BEISPIEL 7
  • NUKLEOTIDÄNDERUNGEN IN PATIENTEN B, C UND D
  • Die Aminosäureänderungen in aus den Patienten B und C isolierten HBV sind in 5 und die aus Patient D in 6 dargestellt. Bei Patient A in 5 handelt es sich um den gleichen Patienten wie in 3. Patient B durchlief eine Langzeitbehandlung mit Famciclovir (> 850 Tage). Die während der Famciclovir-Behandlung selektionierte Aminosäureänderung ist in 5 als HBV (Patient B) dargestellt. Patient C sprach nicht auf Famciclovir an und wurde später mit 3TC (Lamivudin [6, 7]) behandelt. Das während der FCV-Behandlung aus Patient C isolierte HBV ist als HBV (Patient C-FCV) dargestellt. Alle 3TC-Resistenz-Mutationen, die sich während der Behandlung mit 3TC entwickelten, sind als HBV (Patient C-3TC) dargestellt. Die Sequenzanalyse zeigte eine Mutation (Thr-Ser-Austausch) im HBV-Polymerase-Gen in der Nähe der C-Domäne, doch wurde zunächst im YMDD-Motiv keine Mutation nachgewiesen. Eine Mutation von Met 550 nach Ile im YMDD-Motiv wurde aus 32 Tage (333 Tage Nachbehandlung), nachdem das den Thr-Ser-Austausch enthaltende HBV isoliert worden war, isoliertem HBV nachgewiesen.
  • Dem Fachmann ist ersichtlich, daß die hier beschriebene Erfindung weiteren Variationen und Modifikationen als den hier spezifisch beschriebenen zugänglich ist. Ebenso versteht es sich, daß die Erfindung alle derartigen Variationen und Modifikationen umfaßt. Ebenso umfaßt die Erfindung alle Schritte, Merkmale, Zusammensetzungen und Verbindungen, auf die in der vorliegenden Beschreibung einzeln oder gemeinsam Bezug genommen wird oder die darin angegeben sind, sowie jede Kombination bzw. alle Kombinationen aus mindestens zwei beliebigen der genannten Schritte oder Merkmale.
  • Figure 00210001
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (9)

  1. Isolierte HBV-Mutante, umfassend eine zu einer relativ zum Wildtyp-HBV verminderten Empfindlichkeit gegenüber einem HBV-Nukleosidanalog führenden Mutation im für die HBV-DNA-Polymerase codierenden Gen, wobei die Mutation zu einem Aminosäureaustausch Leu526Met am Aminosäurerest 526 in der B-Domäne der Wildtyp-HBV-Polymerase führt und die Mutante für ein nicht mutiertes YMDD-Motiv in der C-Domäne codiert.
  2. Isoliertes Polynukleotid, codierend für eine mutante, zu einer relativ zum Wildtyp-HBV verminderten Empfindlichkeit gegenüber einem HBV-Nukleosidanalog führende HBV-DNA-Polymerase und umfassend eine Mutation, die zu einem Aminosäureaustausch Leu526Met am Aminosäurerest 526 in der B-Domäne der Wildtyp-HBV-Polymerase führt, wobei die Mutante für ein nicht mutiertes YMDD-Motiv in der C-Domäne codiert.
  3. Isolierte mutante HBV-Polymerase, codiert von einem Polynukleotid nach Anspruch 2.
  4. Mutante, Polynukleotid oder Polymerase nach Anspruch 1 bis 3, wobei das Nukleosidanalog aus der Gruppe Famciclovir, Penciclovir und Lamivudin ausgewählt ist.
  5. Verfahren zur Bestimmung des Potentials eines HBV, eine relativ zu einem isolierten Wildtyp-HBV reduzierte Empfindlichkeit gegenüber einem HBV-Nukleosidanalog zu zeigen, wobei man in dem Verfahren DNA oder entsprechende mRNA aus dem HBV isoliert und ein Screening auf eine Mutation im Gen der HBV-Polymerase durchführt, wobei die Mutation zu einem Aminosäureaustausch Leu526Met am Aminosäurerest 526 in der B-Domäne der Wildtyp-HBV-Polymerase führt und wobei das Vorhandensein einer solchen Mutation ein Zeichen für das Potential einer reduzierten Empfindlichkeit des HBV gegenüber dem Antivirusmittel ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Nukleosidanalog aus der Gruppe Lamivudin, Famciclovir und Penciclovir ausgewählt ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 6, wobei das Screening auf eine Mutation die Sequenzierung der isolierten HBV-DNA oder entsprechenden mRNA umfaßt.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 6, wobei das Screening auf eine Mutation ein PCR-Verfahren oder auf PCR beruhendes Verfahren umfaßt.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 6, wobei das Screening auf eine Mutation ein Hybridisierungsverfahren umfaßt.
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